Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae, произрастающих на территории Республики Башкортостан

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae, произрастающих на территории Республики Башкортостан"

На правах рукописи 005009^

ПТИЦЫН КОНСТАНТИН ГЕОРГИЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ДИКОРАСТУЩИХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ ТРИБЫ У1С1ЕАЕ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0ЕЗ т

Уфа-2012

005009223

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждение науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: Кандидат биологических наук, доцент

Баймиев Андрей Ханифович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, доцент

Беньковская Галина Васильевна Кандидат биологических наук, доцент Маркушева Татьяна Вячеславовна Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и

микроорганизмов РАН, г. Саратов

Защита диссертации состоится «24 » февраля 2012 г. в «14 » часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом - на сайте ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан « 24 » января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Симбиотические взаимоотношения бобовых растений и клубеньковых бактерий являются актуальной проблемой современной биологии в рамках изучения процесса азотфиксации и служат объектом интенсивных исследований различных специалистов в течение нескольких десятков лет (Rivas et al., 2009). Решение этой проблемы важно как с научной, так и с практической точек зрения и связано с необходимостью повышения уровня усвоения атмосферного азота хозяйственно значимыми бобовыми растениями, большинство из которых в умеренных широтах относятся к трибе Vicieae ((Adans.) Bronn) сем. Fabaceae. Одной из актуальных задач современной биотехнологии и генетики в данном аспекте является исследование генетических ресурсов клубеньковых бактерий, особенно естественных природных популяций. Наиболее эффективным подходом для этих исследований является молекулярно-генетический анализ их генетического разнообразия, результатом которого может быть более полное понимание процессов возникновения новых генотипов за счет мутаций, генетических перестроек, горизонтального переноса генов.

Значение таких исследований велико, поскольку они дают материал для отбора наиболее удачных комбинаций геномов ризобий для использования при выращивании бобовых растений, а также могут быть использованы в качестве основы для направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для практики.

Начиная с 2000 годов, в систематике клубеньковых бактерий появились существенные изменения, так, были открыты неризобиальные виды, способные к образованию азотфиксирующих клубеньков (Sy et al., 2001; van Berkum et al., 2002; Chen et al., 2007; 2008). Данная способность во многом связана с горизонтальным переносом симбиотических генов (1111), который может происходить как между близкородственными видами (Sullivan et all., 1996), так и среди неродственных видов (Zhao et.al., 2008).

Исследование симбионтов дикорастущих видов бобовых растений является актуальной задачей, поскольку может способствовать расширению границ систематики клубеньковых бактерий и выявлению среди них наиболее

конкурентоспособных и эффективных в определенных экологических условиях штаммов для их последующего использования в сельском хозяйстве.

Цель работы заключалась в исследовании генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий бобовых трибы Vicieae, произрастающих на территории Республики Башкортостан.

Задачи исследования:

1) Сформировать коллекцию клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями трибы Vicieae, произрастающими в различных районах Республики Башкортостан.

2) Провести с помощью RAPD анализа исследование генетического разнообразия изолированных штаммов микроорганизмов.

3) Методом сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК бактерий определить их филогенетическое положение.

4) Провести филогенетический анализ симбиотических генов изолированных штаммов микроорганизмов.

Научная новизна. Впервые исследована филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к трибе Vicieae. Показано, что клубеньковые бактерии дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae характеризуются высоким уровнем полиморфизма последовательности ДНК, вызванным различиями в составе их плазмид. У некоторых представителей растений рода Lathyrus (чина) в клубеньках обнаружены не типичные для них виды клубеньковых бактерий: у чины L. vernus и L. sylvestris - бактерии Rhizobium tropici, у L. palustris - Agrobacterium sp., а у L. gmelinii - Phyllobacterium sp. Обнаруженные у данных микроорганизмов симбиотические гены имеют высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей с аналогичными генами R. leguminosarum bv. viciae, что предполагает приобретение sjwj-генов исследуемыми штаммами посредством горизонтального переноса, что и явилось причиной изменения их специфичности.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о генетическом разнообразии клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae, что может быть

использовано для выявления наиболее удачных комбинаций геномов ризобий, которые могут быть использованы в качестве основы для отбора и направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для сельскохозяйственной практики.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018-а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-1003.2006.4 и НШ-649.2008.4), ПС N02.740.11.0290 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013гг.»

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1-й и 2-й всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука 21 века» (Уфа, 2007,2011), XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009), II и Ш Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «СИМБИОЗ» (Пермь, 2009; Нижний Новгород, 2010), V Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), 14 международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)» (Москва, 2010), VI Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школе «Инновации в биологии доя развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 14 публикациях, из них 5 статей в журналах из перечня ВАК, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 странице, содержит 10 рисунков и 3 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов

исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 215 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования в данной работе служили бактерии, выделенные из клубеньков дикорастущих бобовых растений 9-ти видов рода Lathyrus (чшя) и 6-ти видов рода Vicia (горошек/ относящихся трибе Vicieae, собранных в 9-ти районах Республики Башкортостан (РБ) (рис. 1): чины Литвинова (Lathyrus litvinovii Iljin.), чины лесной (L. sylvestris L.), чины гороховидной (L. pisiformis L.), чины болотной (L. palustris L.), чины луговой (Z. pratensis L.), чины клубненосной (L. tuherosus L.), чины весенней (L. vernus L.), чины бледноватой (L. pallescens Bieb.), чины Гмелина (L gmelinii Fritsch), горошка мышиного (Vicia cracca L.), горошка тонколистного (V. tenuifolia Roth), горошка заборного (V. sepium L.), горошка лесного (V. sylvatica L.), горошка гороховидного (V. pisiformis L.), горошка волосистого (V. hirsuta L.).

АСКИНСКМЙ L. tuberosus

УФИМСКИЙ L. vernus V. cracca V. sepium V. sylvatica V. hirsuta V. tenuifolia

ТАТЫШЛИНСКИИ L. sylvestris L. vernus V. cracca V. sylvatica

КУШНАРЕНКОВСКИИ L. litvinov» L palustris, L, pisiformis V. pisiformis

ТУЙМАЗИНСКИЙ L. pallescens L. pisiformis

АЛЬШЕЕВСКИЙ L. litvinovii

БЛАГОВЕЩЕНСКИМ L. iitvinovii L. sylvestris

БЕЛОРЕЦКИИ L. vernus L. pratensis L. gmelinii

ЗИАНЧУРИНСКИЙ L, pallescens

Рис. 1. Районы сбора клубеньков растений родов Vicia и Lathyrus на территории Республики Башкортостан.

Схема анализа клубеньковых бактерий. Клубеньки собирали с корней дикорастущих бобовых растений в естественных ареалах их произрастания. География сбора охватывала районы Республики Башкортостан, характеризующиеся большим разнообразием растительности, обусловленным

расположением данных территорий на стыке степной и лесной зон. На равнинных участках преобладают степная, лесостепная и лесная зоны. Широтная зональность растительности республики усложнена явлениями вертикальной поясности, которые вызваны наличием на ее территории крупной горной системы — Уральских гор.

При генетическом анализе клубеньковых бактерий мы придерживались следующей схемы. Вначале проводили общий анализ генетического разнообразия штаммов методом RAPD с использованием нескольких произвольных праймеров. Данный этап позволял выявить степень гетерогенности штаммов, вступающих в симбиоз с видами бобовых растений, а также объединить штаммы с идентичными RAPD-профилями в гомогенные группы, из которых в дальнейшем в работу брали только по одному образцу, поскольку полное совпадение RAPD-профилей по нескольким произвольным праймерам предполагает идентичность штаммов. Это давало возможность сократить количество образцов для дальнейшего анализа.

На следующем этапе проводили предварительные филогенетические исследования методами ПЦР-ЦЦРФ анализа генов 16S рРНК и 16S-23S межгенного транскрибируемого спейсера с использованием нескольких мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции, а также в некоторых случаях дополнительно методами ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-и BOX (повторяющаяся ДНК последовательность BOXA субъединицы BOX элемента Streptococcus pneumoniae)-PCR анализов на повторы в геномной ДНК. Данный этап позволил сгруппировать штаммы по филогенетически однородным группам (рис. 2).

Для определения филогенетического положения исследуемых штаммов клубеньковых бактерий были секвенированы нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК бактерий размером около 1400 п.н. и проведен их сравнительный анализ с уже известными аналогичными последовательностями из базы данных GenBank и RDP (http://rdp.crne.msu.edu/).

Сбор клубеньков Получение чистых культур

клубеньковых бактеоий

Секвенирование гена 16S РНК

Сравнительный анализ , нуклеотидных последовательностей

Рис. 2. Схема проведения генетического анализа клубеньковых бактерий.

Выделение высокомолекулярной бактериальной ДНК проводили с помощью 1% лизирующего раствора (l%Triton Х100, 1% Tween 20, 1% Chelex 100). Выделение плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Sambrook J. с соавт. (1989). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1» и секвенаторе GenomeLab фирмы Beckman Coulter, используя наборы для секвенирования «GenomeLab». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США) и программы «MEGA 5.0» фирмы Sudhir Kumar & MEGA Team Center for Evolutionary Medicine & Informatics Biodesign Institute and School of Life Sciences Arizona State University, Tempe, USA. ПНР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК с помощью приборов МС2 «Терцик» компании "ДНК-технология" (Россия). Кластерный

анализ проводили при помощи программы GelCompar П 6.5 компании «Applied-Maths».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

К дикорастущим видам растений трибы Vicieae (виковые) в умеренных широтах в основном относятся представители двух родов: Vicia L. - Горошек (или Вика) и Lathyrus L. - Чина (Алексеев и др., 1989). В рамках теории групп перекрестной инокуляции (ГПИ), в соответствии с которой виды бобовых разделяют на ряд групп, внутри которых растения могут свободно "обмениваться" микросимбионтами, считается, что растения трибы Vicieae образуют одну из истинных групп перекрёстной инокуляции, и данная группа вступает в симбиоз с различными штаммами бактерий вида Rhizobium leguminosarumbv. viciae (Проворов, 1992).

Анализ гетерогенности изолированных штаммов, исследованных с помощью RAPD-метода с применением нескольких «произвольных» олигонуклеотидных праймеров, показал, что клубеньковые бактерии, выделенные из растений трибы Vicieae отличаются относительно высоким полиморфизмом последовательности ДНК. В наших исследованиях наиболее гетерогенными оказались микросимбионты чины клубненосной, где индекс разнообразия Шеннона составил 0,84 (нормализованный коэффициент Шеннона: lis = -S gi * In (gi) / InN, где gi - частота i-го генотипа, a N - объём выборки). Менее разнородными оказались микросимбионты чины болотной и чины Литвинова, где данные индексы были равными 0,39 и 0,36, соответственно (рис. 3).

Филогенетический анализ клубеньковых бактерий бобовых трибы Vicieae. С целью предварительного исследования филогении исследуемых клубеньковых бактерий был проведен ПДРФ-анализ гена 16S рРНК с использованием мелкощепявцих рестрикгаз Kzo9\ и НаеШ. Было выявлено, что, несмотря на высокую гетерогенность штаммов бактерий, образующих клубеньки у одного вида растения, по ПДРФ-профилю гена 16S рРНК они достаточно однородны (табл. 1).

////У/////////

^ V' ^У V V' ^

Рис. 3. Оценка генетического разнообразия штаммов, изолированных из клубеньков растений трибы У1с1еае.

Таблица 1

Результаты анализа штаммов бактерий, изолированных из клубеньков

Вид Количество Количество Индекс Кол-во Предполагаемый вид

растения- выделенных гомогенных разно- групп бактерий и их %-ное

хозяина штаммов (N) noRAPD образия штаммов, отношение к общему

групп Шеннона гомоген- кол-ву выявленных у

штаммов т ных по данного вида растения

(gl) 16S- штаммов

ПДРФ

V. tenuifolia 24 16 0,62 1 Я. ¡еёитШвагит 100 %

V. sepium 50 21 0,73 1 Я к^тгюхапип 100 %

V. sylvatica 60 42 0,78 2 Я к^иттозагит 100 %

V. pisiformis 30 23 0,53 2 Я к^гШпояагит 100 %

V. cracca 57 27 0,65 1 Я к&ттояагит 100 %

V. hirsuta 25 14 0,55 1 Я к^ттояагит 100 %

L. litvinovii 63 20 0,36 1 Я. к^ттояагит 100 %

L. palustris 42 13 0,39 3 Я 1е%иттоьагит 79%

1 А&оЬааегтт 5р. 21%

L. pallescens 77 40 0,51 3 Я. к&ттозагит 100 %

L. pisiformis 51 42 0,80 4 Я к^итто5агит 100 %

L. vernus 159 120 0,72 1 Я. и-орт 70%

4 Я \е^тШэагит 30%

L. sylvestris 78 59 0,70 1 Я. П-орШ 67%

1 Я к&птпо$агит 33%

L. tuberosus 49 40 0,84 2 Я 1е^итто5агит 100 %

L. pratensis 19 11 0,63 3 Я квшптояагит 100 %

L. gmelinii 5 - - 2 РИуНоЬаМеПит яр. 100 %

Определение филогенетического положения исследуемых штаммов клубеньковых бактерий по сравнительному анализу их секвенированных

фрагментов генов 16Б рРНК размером примерно 1400 п.н. с уже известными аналогичными последовательностями из базы данных вепВапк и МЭР (http://rdp.cme.тБи.сёиЛ показало, что последовательности гена 16Б рРНК у большинства исследованных микроорганизмов имеют высокое сходство с последовательностями аналогичных генов Л 1е^ттоБагит (>99,5% гомологии). Но наряду с этим у некоторых растений обнаружены микросимбионты, близкие по последовательности генов 16Б рРНК к другим видам бактерий. У чины весенней и чины лесной в клубеньках были обнаружены ризобии, близкие (99,7% гомологии) к Я Корт, у чины болотной - бактерии, близкие (98,2% гомологии) к -оЬаЫегшт а1Ъегйта^т, а у чины Гмелина - к РЬуИоЬааегтт тугвхпасеагит (99,9% гомологии).

В эволюционном плане триба виковых считается наиболее специализированной в семействе Г'аЬасеае, и это эволюционное продвижение в свою очередь сопровождалось увеличением специфичности и активности азотфиксирующего симбиоза (Парийская и др., 1979). Именно данное обстоятельство объясняет то, что «истинные» ГПИ состоят из эволюционно продвинутых бобовых умеренных широт. Как было сказано выше, большинство видов трибы виковых принято объединять в одну ГПИ, члены которой вступают в симбиоз с различивши штаммами Я ^иттояагит Ьу. \iciae (Проворов и др., 1992). Результаты, полученные нами, в целом подтверждают данную теорию. Показано, что все представители трибы УЫеае (кроме чины Гмелина, у которой мы обнаружили в клубеньках только бактерии, близкие к РЪу11оЪас1егтт тугзтасеагит), произрастающие на территории РБ, вступают в симбиоз со штаммами клубеньковых бактерий, хотя и отличающихся высоким полиморфизмом ДНК, но филогенетически родственных К lгguminosarum (>99,5% сходства по последовательности гена 168 рРНК). Тем не менее, обнаружение нами и другими авторами (МагЛеИп, 2006; Бш, 2009) среди микросимбионтов некоторых исследованных видов чин отличных от Я \eguminosarum клубеньковых бактерий показывает, что данные границы ГПИ не столь строги, и растения в некоторых исключительных случаях могут вступать в симбиоз с нехарактерными для них клубеньковыми бактериями.

Исследование плазмидного состава клубеньковых бактерий.

Несомненно, обращает на себя внимание высокий уровень полиморфизма ДНК штаммов, вступающих в симбиоз с растениями трибы Vicieae. Подобная высокая гетерогенность исследуемых штаммов при их относительно высокой филогенетической однородности дает возможность предположить, что штаммы имеют различия в мобильной части их генома.

Для проверки данного предположения были исследованы плазмидные профили клубеньковых бактерий. Обнаружено, что все полиморфные по ДНК штаммы микросимбионтов внутри филогенетически однородных групп действительно имеют различный состав плазмид. Разброс плазмид по количеству среди штаммов варьировал от 2 до 13 и по размеру от 150 до 1000 тпн (рис. 4.).

Рис. 4. Пульс-электрофореграмма плазмидных профилей штаммов ризобий, вступающих в симбиоз с чиной весенней, относящихся к одной филогенетически однородной группе. Размер указан в тысячах пар нуклеотидов.

Цифрами обозначены номера штаммов.

Значительные различия плазмидного состава штаммов филогенетически однородных бактерий указывают на довольно высокую трансмиссивность их плазмид, и свидетельствуют о высокой частоте генетической рекомбинации между ризосферными бактериями, приводящей к появлению большого количества высокополиморфных по ДНК штаммов.

Кластерный анализ КАРЮ-профилей ДНК клубеньковых бактерий. С целью выявления закономерности распределения штаммов филогенетически однородных бактерий в клубеньках растений одной популяции и сравнения их с бактериями, вступающими в симбиоз с этим же видом растений другой популяции, был проведен кластерный анализ КАРО-профилей ДНК

микроорганизмов. В качестве объекта были выбраны микросимбионты чины весенней (Хайуга? хетт), так как данное растение широко распространено, что делает возможным сбор клубеньков с географически разобщенных популяций растений. Клубеньки были собраны в двух районах РБ: Татышлинском и Белорецком.

В Татышлинском районе клубеньки были собраны у 15 растений, относящихся к одной популяции, отстоящих друг от друга на расстоянии 10 м по схеме, представленной на рис. 5, из которых в дальнейшем были выделены чистые культуры клубеньковых бактерий. От каждого растения было собрано от 5 до 15 клубеньков. Результаты КАРБ-профилей ДНК полученных штаммов были подвергнуты кластерному анализу. Так же в анализ были взяты ЯАРО-нрофили штаммов, полученных из клубеньков растений, произрастающих в Белорецком районе и КДРО-профили штаммов, полученных из клубеньков чины лесной, произрастающей совместно с чиной весенней в Татышлинском районе. Все взятые в анализ штаммы по последовательности 16Б рРНК являлись филогенетически однородными, и родственными А к^ттовагит (>99,5% сходства).

¡¡|||''11|.Щ §| #

в Чина весенняя • Чина лесная

Рис. 5. Схема расположения растений чины весенней и чины лесной, из клубеньков которых были выделены ризобии для кластерного анализа их КАРО-профилей. В кружках отмечены номера растений. А - растения, ризобии которых образуют кластер А в кластерном анализе, Б - растения, ризобии которых образуют кластер Б в кластерном анализе.

Из результатов кластерного анализа (рис. 6) видно, что штаммы, взаимодействующие с одним растением, на схеме образуют преимущественно отдельные кластеры.

Рис. 6. Кластерный анализ ЯАРО-профилей штаммов, выделенных из чины весенней и чины лесной в Гатышлинском (А и Б) и Белоредком районе (В). Одинаковым цветом указаны штаммы, полученные из клубеньков одного растения

Также на сходство ЯАРО-профилей имеет значительное влияние близость мест произрастаний растений, с клубеньков которых были получены штаммы. Так, у штаммов, выделенных из растений, произрастающих на более близком расстоянии, КАРО-лрофили сходны по сравнению со штаммами, выделенными у растений, произрастающих в большем отдалении друг от друга. Также на дендрограмме можно наблюдать, что все штаммы, полученные из клубеньков

растений, произрастающих в Татышлинском районе, образуют два больших отдельных кластера, обозначенные как А и Б.

Исходя из этого видно, что в клубеньках, а, скорее всего, и в ризосфере многолетних растений чины весенней, хотя и наблюдается преобладание в основном однородных штаммов, тем не менее, очевидна тенденция к их гетерогенизации, проявляющаяся в появлении отдельных отличающихся полос в ЯАРБ-профилях микросимбионтов одного растения. При сравнении симбионтов растений уже из соседних точек сбора наблюдаются более существенные изменения, которые имеют тенденцию к увеличению с увеличением расстояния между растениями. Исходя из этого можно предположить, что между штаммами происходит постоянный рекомбинативный процесс, скорее всего, из-за высокой трансмиссивности плазмид, что и приводит к появлению отличающихся фрагментов ДНК в КАРБ-профилях. Увеличение расстояния между растениями и, соответственно, между ризосферными бактериями приводит к уменьшению контактов между ними, что, в конечном счете, приводит к пространственной изоляции, приводящей к накоплению различий между штаммами. Это также подтверждается и тем, что НАРБ-профили штаммов, полученные из клубеньков растений, произрастающих в Белорецком районе, образуют отдельный кластер - В.

Однако нельзя объяснить пространственным разобщением распределение ИАРБ-профилей клубеньковых бактерий, полученных из клубеньков чины весенней в Татышлинском районе в два отдельных кластера - А и Б. В данном случае, скорее всего, мы имеем дело с биологическим барьером рекомбинативных процессов между этими штаммами, что также приводит к накоплению генетических различий. Ограничение горизонтального переноса генов между бактериями, образующими кластер А, и бактериями, образующими кластер Б, говорит о более глубоких отличиях данных бактерий, не отраженных в последовательности 16Б рибосомных генов.

Схожесть же КАРБ-профилей клубеньковых бактерий из клубеньков чины лесной с КАРБ-профилями клубеньковых бактерий из клубеньков чины весенней при совместном произрастании растений-хозяев, скорее всего, вызвана незначительностью влияния их видовой принадлежности на различия в

составе их микросимбионтов, если эти виды относятся к одной группе перекрестной инокуляции.

Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий. При исследовании клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими растениями рода Чина {Lathyrus), нами были обнаружены у некоторых видов растений в клубеньках помимо R. leguminosarum и другие виды ризобий, которые не являются типичными симбионтами для растений трибы Vicieae, хотя подобные случаи не уникальны. Ранее при исследовании клубеньковых бактерий растений рода Чин, произрастающих на территории Китая и Монголии, Sui X. H. с соавторами обнаружили R. tropici в клубеньках L. davidii. Кроме того, у L. quinquenervius и L. odoratus в клубеньках были обнаружены также клубеньковые бактерии рода Sinorhizobium (Sui et all, 2009). Все эти данные говорят о том, что растения рода Lathyrus в зависимости от почвенно-юшматических условий в некоторых исключительных случаях могут нодулироваться отличными от R leguminosarum bv. vicieae ризобиями, что выходит за рамки существующей теории ГПИ. Одним из объяснений причин данного явления может быть горизонтальный перенос симбиотических генов, вследствие которого бактерии могли изменить свою специфичность по отношению к растению-хозяину. Такая возможность показана в работах многих авторов. (Sullivan et al., 1995; Andam et al., 2007a,b; Barcellos et al., 2007; Zhao et al., 2008).

С целью выявления возможного влияния процесса горизонтального переноса sym генов на изменение специфичности микросимбионтов растений рода Lathyrus, относящихся по последовательностям генов 16S рРНК к R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., была исследована филогения их симбиотических генов.

В качестве кандидатов для филогенетических исследований были выбраны активно участвующие в образовании азотфиксирующего симбиоза и общие для всех клубеньковых бактерий симбиотические гены: nifH, rtifD и nodA.

С помощью сравнительного анализа уже известных нуклеотидных последовательностей генов nifH и nifD клубеньковых бактерий были выявлены консервативные участки данных генов, к которым в дальнейшем были

подобраны олигонуклеотидные праймеры. В случае с геном nodA подобрать универсальные праймеры не представлялось возможным ввиду высокой вариабельности данного гена у клубеньковых бактерий. В связи с этим были подобраны несколько пар видоспецифичных праймеров к последовательности гена nodA R leguminosarum bv. viciae (ViciaNodA F и ViciaNodA R), 11 leguminosarum bv. trifolii (TrifoNodA F и TrifoNodA R), R. tropici (RtropNodA F и RtropNodAR), Mesorhizobium spp. (MesoNodAF и MesoNodA R), Sinorhizobium spp. (SinoNodA F и SinoNodA R), Bradyrhizobium spp. (BraNodA F и BraNodA R). У исследуемых штаммов были амплифицированы и секвенированы фрагменты генов nifH.

Сравнительный анализ показал высокий уровень гомологии между секвенированными последовательностями всех исследуемых штаммов. Фрагменты генов nifH микроорганизмов независимо от видовой принадлежности отличались лишь некоторыми единичньми несовпадениями в нуклеотидных последовательностях. Поиск сходных последовательностей в базе данных генов показал, что секвенированные фрагменты генов nifH всех исследуемых штаммов клубеньковых бактерий имеют высокий уровень гомологии с аналогичными последовательностями бактерий вида R, leguminosarum bv. viciae, что показывает их филогенетическую близость (рис.

Рис. 7. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа последовательностей генов т[Н.

7).

iR. tropici ит, 1J (L. vernxjs) R. leguminosarum шт. 11 OUvemus) R. leguminosarum шт. 12 (L. vermis) Agrobacterinm sp. шт. 7 (L. palustris) R, legummosarum шт. CCBAU 73064 (EU177597) FL leguminosariiia шт. 1078 (P. sativum)

— Agrobacterium sp. шт.14 (L. palastrisj ~~ Phyllobacterlum sp» штД (L. gtneUnli)

— R. tropici ш iv S.2 (L. vermis) Г" K. tropici шт, 4.10 (L. verous)

R. tropici шт. 7.5 (L. verflus) R legraxroosarambv. vjciae щт, 3841 (KC_00838l)

— R. Icguramosarumbv,trifolii WSM1325 (NC_0l2848) "* Riiizobium tropici шх R?261 (DQ4D021)

— Sinorhizobium meliloti цп. 1021 (AE006469) Bradyrhizobium japonicum шт. USDA110 (BA000040.2)

зц.

30 25 20 15 10 5 0

Nucleotide Substitutions (xlOO)

У штаммов R tropici и R. leguminosarum, нодулирующих растения L. vernus, были амплифицированы и секвенированы также фрагменты генов nifD. Сравнительный анализ секвенированных фрагментов с аналогичными последовательностями других клубеньковых бактерий, депонированными в GenBank, также показал их высокий уровень гомологии с генами nifD R leguminosarum bv. viciae (рис. 8).

R. leguminosarum шт. 11 (L. vernus) R, leguminosarum шт. 12 (L. vernus) R. tropici tta; 5.2 (L. vernus) R. tropici ш r. 1.3 (L. vernus) R. tropici шт. 7.5 (L. vernus) R. leguminosarum urr. 1078 (P. sativum) Я. leguminosarum bv. viciae шт. 3841 (AM236084) R. leguminosarum bv. trjfolii шх ICC105 (EF165526) MesorliJzobium loti nir. R7A(AL672114) Smorhizobium mcliloti mt 1021 (NC.003037) Bradyrhkobium japonicum un. USDA135 (AF484262)

35 30 25 20 15 10 5 0 Nucleotide Substitutions (xlOO)

Рис. 8. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа последовательностей генов nifD.

Для исследования гена nodA выбранных штаммов был проведен IÏÏJP анализ ДНК образцов с использованием подобранных ранее видоспецифичных праймеров. Данный анализ показал, что у всех образцов ПЦР-продукт нужного размера нарабатывается только при использовании праймеров, подобранных к гену nodA R leguminosarum bv. viciae (рис. 9).

Для проверки и уточнения полученных результатов ПЦР-продукты размером 188 пн также были секвенированы. Сравнительный анализ с уже известными нуклеотидными последовательностями аналогичных генов из базы данных GenBank также показал, что секвенированные фрагменты ДНК действительно имеют 100% гомологию с геном nodA R leguminosarum bv. viciae.

38.3 .

—500пн —400пн —ЗООпн —*200пн

—ЮОпн

188 u.U.

M

—500nn —400ПН «~300пн —200ПН

—ЮОпн

Рис. 9. Электрофореграмма ПЦР-анализа ДНК штаммов клубеньковых бактерий с использованием праймеров, подобранных к гену nodA : A -R legiiminosarum bv. viciae, Б - К leguminosarum bv. trifolii, В- Mesorhizobium spp, Г- R. tropici. 1-4 - R. tropici из клубеньков L. vermis; 5, 6 - R. leguminosarum из клубеньков L. verms', 7, 8 - Agrobacterium sp. из клубеньков L. palustris; 9 -Phyllobacterium sp. из клубеньков L. gmelinii; 10- R. leguminosarum bv. viciae штамм 1078. M-100 п.н. маркер.

Для быстрорастущих клубеньковых бактерий Rhizobium и Sinorhizobium характерна плазмидная локализация симбиотических генов (Freiberg et al., 1997; Barnett et al., 2001; Galibert et al., 2001; Gonzalez et al., 2006). Для некоторых pSym плазмид документально подтверждена возможность передачи их в другие клетки ризобий посредством конъюгации (Freiberg et al., 1997; Bamett et al., 2001; Gonzalez et al., 2003; Brom et al., 2004; Perez-Mendoza et al., 2004). Многочисленные работы показывают, что горизонтальный перенос sym генов является неотъемлемой частью в эволюции симбиотических взаимоотношений ризобий и бобовых растений (Freiberg et al., 1997; Bailly et al., 2007; Estrella et al, 2009;; Marchetti et al., 2009). Полученные нами результаты, показывающие филогенетическую близость симбиотических генов исследуемых клубеньковых бактерий с аналогичными генами R. leguminosarum bv. viciae, скорее всего, также свидетельствуют об имевшем место горизонтальном переносе симбиотических генов R. leguminosarum bv. viciae в штаммы R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp.

* * *

Таким образом, было изолировано и генетически охарактеризовано 789 штаммов клубеньковых бактерий из клубеньков 15 видов дикорастущих бобовых трибы Vicieae, произрастающих на территории РБ. Были получены сведения об их генетическом разнообразии и филогенетической принадлежности. Показано, что основная часть исследованных бактерий филогенетически близка к бактериям вида R. leguminosarum bv. viciae, что подтверждает образование растениями данной трибы одной группы перекрёстной инокуляции.

Но, тем не менее, у некоторых растений рода Lathyrus были обнаружены в клубеньках бактерии R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., считавшиеся для них нехарактерными. Предполагается, что данные микроорганизмы получили способность образовывать клубеньки на корнях растений рода Lathyrus вследствие получения ими симбиотических генов бактерий R. leguminosarum bv. viciae путем горизонтального их переноса.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что исследованные штаммы клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых трибы Vicieae характеризуются высоким уровнем полиморфности ДНК.

2. На основании сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК показано, что большинство штаммов клубеньковых бактерий филогенетически относятся к одному виду Rhizobium leguminosarum.

3. Выявлено, что высокая генетическая гетерогенность штаммов при их филогенетической однородности вызвана различиями в составе их плазмид.

4. В клубеньках некоторых представителей растений рода Lathyrus обнаружены не типичные для них виды клубеньковых бактерий: у чин L. vernus и L. sylvestris - бактерии Rhizobium tropici, у L. palustris -Agrobacterium sp., у L. gmelinii - Phyllobacterium sp.

5. Обнаруженные нетипичные для растений рода Lathyrus виды клубеньковых бактерий имеют в составе своего генома симбиотические

гены, филогенетически близкие к аналогичным генам бактерий R leguminosarum bv. viciae, что, возможно, является следствием горизонтального переноса генов, повлиявшим на изменение специфичности данных микросимбионтов

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Микросимбионты декоративных бобовых растений, применяемых в ландшафтном озеленении // Аграрная Россия. 2009. Специальный выпуск (февраль). С. 97.

2. Баймиев Ан. X., Птицын К. Г., Благова Д. К., Мулдашев А. А., Баймиев Ал. X. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с чиной весенней Lathyrus vermis (L.) Bernh. vermis (L.) Bemh. // Микробиология. 2011. T. 80, № 1. С. 100-104.

3. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Мулдашев A.A., Баймиев Ал.Х. Генетическая характеристика клубеньковых бактерий бобовых рода Lathyrus, произрастающих на территории республики Башкортостан // Экологическая генетика. 2011. Т. 9, № 2. С. 3-8.

4. Баймиев Ан. X., Иванова Е.С., Птицын К. Г., Чубукова О.В., Баймиев Ал. X. Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий растений рода Lathyrus (L.) (FABACEAE) // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011.№4. С. 14-17.

5. Баймиев Ан. X., Иванова Е.С., Птицын К. Г., Белимов A.A., Баймиев Ал. X. Генетическая характеристика клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых южного Урала // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. № 1. С. 2 9 - .

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ И СТАТЬИ В СБОРНИКАХ КОНФЕРЕНЦИЙ

6. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х. Определение филогении ризобиальных бактерий, вступающих в симбиоз с горошком заборным (Vicia sepium) // Школа-семинар молодых ученых УфНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века». Уфа. 2007. С. 109-110.

7. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х. Генетическое разнообразие клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с чиной лесной (Lathyrus sylvestris L.) //II Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009». Пермь. 2009. С. 241-242.

8. Птицын К.Г. Генетическая гетерогенность клубеньковых бактерий вступающих в симбиоз с чиной весенней lathyrus vernus (I.) bernh // Международный Молодежный Научный Форум «Ломоносов-2009» XVI Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ». Москва. 2009. С. 18.

9. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал. X. Генетическая гетерогенность и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими растениями рода чина {Lathyrus), произрастающими на территории республики Башкортостан // V Всероссийская конференция молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 2010. С. 29.

10. Птицын К.Г., Баймиев А.Х. Генетическое биоразнообразие клубеньковых бактерий вступающих в симбиоз с чиной гмелина (lathyrus gmelini fritschi) // III всероссийский с международным участием конгресс Студентов и аспирантов-биологов «СимбиозРоссия 2010». 2010. С. 68-69.

И. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Генетическая гетерогенность клубеньковых бактерий вступающих в симбиоз с чиной бледноватой (lathyrus pallescens (bieb.) с. koch) //14 международная пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века». Пущино. 2010. Т. 2. С. 255.

12. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Благова Д.К., Баймиев Ал.Х. Изменение видового состава клубеньковых бактерий чины весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh и чины лесной Lathyrus sylvestris L. в зависимости от почвенно-климатических условий // Общество физиологов растений России Всероссийский симпозиум «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)». Москва. 2010. С. 44-45.

13. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Генетическое разнообразие клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых южного Урала // Школа-

семинар молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века». Уфа. 2011. Биомика/Вюгтсэ/ Т. 1. С. 103-105.

Список сокращений

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов RAPD - random amplification of polymorphic DNA ГПИ- группа перекрёстной инокуляциия ГПГ - горизонтальный перенос генов

Подписано в печать 17.01.12 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 598. Гаршпура «ТшезКеи'Котап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Птицын, Константин Георгиевич, Уфа

61 12-3/652

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

На правах рукописи

Птицын Константин Георгиевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ДИКОРАСТУЩИХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ ТРИБЫ У1С1ЕАЕ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ

БАШКОРТОСТАН

03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с., доц.

Баймиев Андрей Ханифович

УФА-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и условных обозначений........................................4

Введение.......................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы.................................................................9

1.1. Бобовые трибы Ушеае.........................................................9

1.2. Симбиоз..........................................................................10

1.2.1. Понятие симбиоза...........................................................10

1.2.2. Биологическая фиксация азота...........................................13

1.3. Систематика клубеньковых бактерий....................................15

1.3.1. История систематики клубеньковых бактерий.......................15

1.3.2. Современное состояние систематики клубеньковых бактерий...21

1.3.3. Проблемы в систематике клубеньковых бактерий..................25

1.4. Организация генома клубеньковых бактерий...........................34

1.4.1. Особенности организации генетического аппарата клубеньковых бактерий..............................................................................34

1.4.2. Состав и организация симбиотических генов ризобий..............35

1.4.3. Роль горизонтального переноса в систематике клубеньковых бактерий..............................................................................42

Глава 2.Экспериментальная часть......................................................46

2.1. Объекты исследования...................... .................................46

2.2. Схема генетического анализа клубеньковых бактерий................46

2.3. Сбор клубеньков дикорастущих бобовых растений...................47

2.4. Выделение из клубеньков чистых культур клубеньковых бактерий.......................................................................................................48

2.5. Выделение и очистка ДНК ризобий.......................................49

2.6. Исследование генетического разнообразия штаммов бактерий.....50

2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).....................................51

2.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК.................................52

2.9. ПЦР-ПДРФ анализ генов 168 рРНК и 168-238 межгенного транскрибируемого спейсера.....................................................53

2.10. Секвенирование гена 16Б рРНК и проведение сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей..................................54

2.11. Выделение и электрофоретическое разделение мегаплазмидной ДНКризобий........................................................................54

2.12. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.......56

2.13. Кластерный анализ НАРБ-профилей бактерий........................56

2.14. Реактивы и материалы......................................................57

2.15. Олигонуклеотидные праймеры использованые в работе...........59

2.16. Составы использованных стандартных водных растворов.........61

Глава 3. Результаты и обсуждение.....................................................62

3.1. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий бобовых трибы Ушеае..............................................................62

3.2. Филогенетический анализ клубеньковых бактерий бобовых трибы Ушеае................................................................................64

3.3. Исследование плазмидного состава клубеньковых бактерий........67

3.4. Кластерный анализ ИАРБ профилей ДНК клубеньковых бактерий.......................................................................................................69

3.5. Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий..............................................................................74

Заключение..................................................................................80

Выводы.......................................................................................81

Список литературы............................. ...........................................82

Список сокращений и условных обозначений

Нуклеотиды:

дАТФ (А) - дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ (G) - дезоксигуанозинтрифосфат дТТФ (Т) - дезокситимидинтрифосфат дЦТФ (С) - дезоксицитозинтрифосфат Методы:

RAPD -произвольная амплификация полиморфной ДНК ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ERIC-PCR - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus ПЦР - полимеразная цепная реакция Другое:

ТВЕ- трис-боратный-ЭДТА буфер

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА буфер

ТЕ - трис-ЭДТА буфер

пн - пара нуклеотидов

тпн - тысяча пар нуклеотидов

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ДДС натрия - додецилсульфат натрия

Kb - тысяча пар нуклеотидов

ГПИ - группа перекрёстной инокуляции

ГПГ - горизонтальный перенос генов

СО - симбиотический островок

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Симбиотические взаимоотношения бобовых растений и клубеньковых бактерий являются актуальной проблемой современной биологии и служат объектом интенсивных исследований различных специалистов в течение нескольких десятков лет (Rivas et al., 2009). Решение этой проблемы важно как с научной, так и практической точки зрения. И поэтому связано с необходимостью повышения симбиотического усвоения атмосферного азота хозяйственно значимыми бобовыми растениями, большинство которых в умеренных широтах относятся к трибе Vicieae ((Adans.) Bronn) семейства Fabaceae Lindl.

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является исследование генетических ресурсов клубеньковых бактерий, особенно естественных природных популяций. Наиболее эффективным подходом для этих исследований является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может быть понимание процессов возникновения новых генотипов за счет мутаций, генетических перестроек и горизонтального переноса генов.

Значение таких исследований велико, поскольку они дают материал для селекции наиболее удачных комбинаций геномов ризобий для использования при выращивании бобовых растений, а также могут быть использованы в качестве основы для направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для практики.

Цель работы заключалась в исследовании генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий бобовых трибы Vicieae, произрастающих на территории Республики Башкортостан.

Задачи исследования:

1) Сформировать коллекцию клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями трибы Vicieae, произрастающими в различных районах Республики Башкортостан.

2) Провести с помощью RAPD анализа исследование генетического разнообразия изолированных штаммов микроорганизмов.

3) Методом сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК бактерий определить их филогенетическое положение.

4) Провести филогенетический анализ симбиотических генов изолированных штаммов микроорганизмов.

Научная новизна работы. Впервые исследована филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к трибе Vicieae, таких как: чина Литвинова {Lathyrus litvinovii), чина лесная (L. sylvestris), чина гороховидная (L. pisiformis), чина болотная (L. palustris), чина луговая (.L. pratensis), чина клубненосная (L. tuberosus), чина весенняя (L. vernus), чина бледноватая (L. pallescens), чина Гмелина (L. gmelinii), горошек мышиный (Vicia cracca), горошек тонколистный (V. tenuifolia), горошек заборный (V sepium), горошек лесной (V. sylvatica), горошек гороховидный (V. pisiformis), горошек волосистый (V. hirsuta). Показано участие горизонтального переноса симбиотических генов в образовании штаммов бактерий с измененной специфичностью к своему макросимбионту.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о генетическом разнообразии клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae, что может быть использовано для выявления наиболее удачных комбинаций геномов ризобий, которые могут быть использованы в качестве основы для отбора и

направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для сельскохозяйственной практики.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018-а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-1003.2006.4 и НШ-649.2008.4), ГК N02.740.11.0290 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013гг.»

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1-й и 2-й всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика -наука 21 века» (Уфа, 2007, 2011), XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009), II и III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «СИМБИОЗ» (Пермь, 2009; Нижний Новгород, 2010), V Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), 14 международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)» (Москва, 2010), VI Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школе «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 14 публикациях, из них 5 статей в журналах из перечня ВАК, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 10 рисунков и 3 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 215 работ.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Бобовые трибы Vicieae

Семейство растений Fabaceae (бобовые) - самое большое семейство растений на земле, включающее около 19 тыс. видов (Allen, 1980). Они распространены по всему миру и по экономическому значению занимают второе место после злаковых растений (Спайнк и др., 2002). Бобовые растения являются хозяйственно значимыми видами, которые используются как зерновые, кормовые, овощные, декоративные, технические, лекарственные и сидерационные культуры (Рыжова и др., 2007).

Семейство Fabaceae подразделяется на 3 подсемейства Caesalpinioideae, Faboideae, Mimosoideae. Каждое подсемейство содержит трибы, которые состоят из 730 родов. Триба Vicieae (Fabeae) включает 5 родов: Lathyrus, Vicia, Lens, Pisum и Vavilovia, объединяющих около 400 видов (Рыжова и др., 2007). На территории Республики Башкортостан (РБ) дикорастущие бобовые трибы Vicieae представлены двумя родами: Lathyrus и Vicia (Алексеев и др., 1989).

В эволюционном плане триба Vicieae считается наиболее специализированной в семействе. Представители трибы Vicieae обладают лианоподобной травянистой формой роста. Данная форма роста является вторичным усложнением, которое возникло из древних деревянистых тропических лиан в процессе их продвижения в умеренные области и считается вершиной эволюции (Серебряков, 1962; Вишнякова и др., 2008). С точки зрения описательной морфобиологии триба Vicieae считается одной из наиболее сложных триб. Выделяемые в настоящее время роды трибы характеризуются генетической однородностью и существованием слабо дифференцированных видов. Кроме того, наличие усиков, характерное только для этой трибы, позволяет ее представителям лучше, чем другим лазящим растениям, приспосабливаться к самым разнообразным биотопам.

Триба дифференцирована слабо, имеет огромный ареал и несколько центров первичного и вторичного происхождения (Вишнякова и др., 2008).

Представители трибы распространены в Евразии, северной Африке, Северной и Южной Америке, некоторые виды обитают в тропиках восточной Африки. Центрами наибольшего разнообразия трибы Vicieae считаются Средиземноморье и Ирано-Туранская флористическая провинция. Но до настоящего времени вопрос о месте зарождения трибы пока остается неясным (Рыжова и др., 2007).

К трибе Vicieae в умеренных широтах относятся большинство хозяйственно значимых видов бобовых растений. Это такие как горох посевной (Pisum sativum L.), вика посевная (Vicia sativa L.), чина посевная (Lathyrus sativus L.), чечевица пищевая (Lens culinaris Medik) и др. (Рыжова и др., 2007).

В рамках теории групп перекрестной инокуляции (ГПИ) в соответствии с которой виды бобовых разделяют на ряд групп, внутри которых растения могут свободно "обмениваться" микросимбионтами, по которой считается, что растения относящиеся к трибе Vicieae образуют одну ГПИ вступая в симбиоз с различными штаммами вида Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Проворов, 1992).

1.2. Симбиоз 1.2.1. Понятие симбиоза

Симбиоз - фундаментальное явление живой природы, определяющее ее облик. Это важнейшая стратегия адаптации, достигается путем объединения разных организмов. Почти все многоклеточные организмы существуют в тесном контакте с различными представителями микромира.

В широком понимании симбиозом называют любое взаимоотношение между двумя и более различающимися видами. Симбиоз разделяют на два вида: паразитизм - взаимоотношение, когда один из партнёров получает выгоду в ущерб второго партнёра; и мутуализм - взаимоотношение выгодное обоим партнёрам. Так же к симбиозу относят такие понятия как: комменсализм - взаимоотношения, выгодные одному, но безразличные другому партнёру, и аменсализм - взаимоотношения, вредные одному, но безразличные другому (Спайнк, и др. 2002).

Впервые термин «симбиоз» (от греч. symbiosis - совместная жизнь) был предложен немецким ботаником Anton de Вагу. Он был определён как феномен совместной жизнедеятельности двух и более организмов. При этом Anton de Вагу в рамках симбиоза рассматривал два явления: мутуализм и паразитизм. Вслед за Anton de Вагу так же излагал суть симбиоза немецкий биолог Hertwig. Hertwig в своем широко известном пособии по общей биологии охарактеризовал симбиоз уже иначе, сузив понятие до взаимовыгодных отношений. В такой трактовке понятие "симбиоз" было воспринято русскими учеными в начале XX века и с того времени прочно укоренилось в отечественной литературе. Мутуалистическая природа взаимодействий при симбиозе была связана с отсутствием понимания общности процессов паразитизма и мутуализма, а также отсутствием общего научного направления. Исследования симбиотических взаимодействий долгое время проводились в рамках разных дисциплин: паразитизм - в рамках фитопатологии; мутуализм - в отдельных разделах обшей физиологии растений и животных. Таким образом, понятие симбиоза изначально применялось только к мутуализму, но позднее было перенесено и к паразитизму. К настоящему времени сформулированы три основные симбиотические концепции: метаболическая, экологическая и регуляторная (Douglas, 1994; Юрков и др., 2007).

Согласно метаболической концепции в результате симбиоза между партнёрами происходит установление трофических связей сводящихся к передаче неспецифических метаболитов, которых сами не могут синтезировать, а так же приобретение одним из партнеров новой функции, котрую он не может выполнять самостоятельно (например, растения не способны фиксировать молекулярный азот). Метаболическая концепция не позволила разграничить паразитизм от хищничества, и это дало толчок к развитию экологической концепции.

Согласно экологической концепции внутренняя среда одного из партнёра является экологической нишей для другого. Определяющей его физиологическое состояние и репродуктивную активность при котором, тесно взаимодействующие микробные сообщества образуют внутри хозяина целостную систему - симбионтоценоз.

Регуляторная концепция рассматривает симбиоз как результат взаимного контроля партнерами численности, интенсивности метаболизма и репродуктивной активности друг друга (Douglas, 1994; Проворов, 2001; Юрков и др., 2007).

В современной биологии термин «симбиоз» часто используется в широком значении, как система взаимодействующих организмов принадлежащих к разным видам, результат, которого полезен хотя бы для одного из симбионтов, где происходит распределение жизненно-важных функций и их регуляторных механизмов. Одной из популярных значений симбиоза является длительное взаимодействие генетически неродственных организмов, создающих связанную надорганизменную структуру (Проворов, 2001; Юрков и др., 2007).

Образование мутуалистических симбиозов часто является основой качественных изменений в живом мире и причиной успешной эволюции тех

или иных групп организмов, при этом симбиозы могут быть образованы представителями различных подцарств живого мира, таких как прокариот и эукариот.

Взаимодействие симбионтов происходит за счёт сигнализации, выполняющей перекрёстную регуляцию генов, участвующих в развитии и поддержке симбиотических структур, а так же общего метаболизма симбионтов (Проворов, 2001). Одним из хозяйственно значимых мутуалистических взаимодействий является азотфиксирующий симбиоз.

1.2.2. Биологическая фиксация азота

При бобово-ризобиальном симбиозе достигается сопряжение двух глобальных биохимических процессов - азотфиксации и фотосинтеза, благодаря чему нормализуе�