Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СИМБИОТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ КЛЕВЕРА И ГОРОХА С РАСТЕНИЕМ-ХОЗЯИНОМ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СИМБИОТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ КЛЕВЕРА И ГОРОХА С РАСТЕНИЕМ-ХОЗЯИНОМ"

ОРДЕНА ЛЕНИНА, ti ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ ШД8ШЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗШЕНИ ИНСТИТУТ ШКРОБИОДОГНИ И ШРУСШОГШ Ям.Д.К. ЗАБОЛОТВОГО

СШШОТИЧВСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КДУЕЕНЫЮШХ БАКТЕРИИ КЖВЕРА H ГОРОХА С РАСТШИШ-ХОЗШШ

(03.00.07 - шкроОяодогяя)

Автореферат дяосвртадш на соискание учено! стевеш кандидата биологических наук

РАНГВЛОВА Вера Никсишавиа

УДК 579,841.32.022+ +582.736-071

Каев - 1982

7 (е ' С г?' ^

Работа выполнена в отделе общей я почвенной шкроОмииогиа ордена Трудового Красного Знамени Институте шцробвожогям к адрусологи* яи.Д. К. ЗаОолотного АН УССВ

Научный руководитель! заслуженный деятель ноуя* УССР»

чдей-корр. АН УССР, лрофеосор Андреяк Е.И.

Официальные оппонентыз доктор сЗяологяческЕх наук, профеооор

ДОрООЕВОКИЙ Л.

кандидат оясдоглчеояжх наук, старший научный сотрудник Мединская С.М.

Ведущая организация: Институт Зжзиологии растений АЛ УССР

Защита состоятся " 19В2 г. ъ10 чао,

яа заседании специализированного совета Д 016,06.01 по эацвте диссертаций на соискание ученой степени доктора бжояогаескях наук пра Институте микробиология к вирусологии ям.Д.К.ЭвСодот-вого АН УССР (252143| Квев-143, ул.Эвболотпого, 26, Институт инфоОислогии и вирусология вы.Д.К.Эабодотного АН УССР).

С дясоертацией можно ознакомиться в (Зяблиотеке Института микробиологии и вирусологии ки.Д.К.Эаболотного АН УССР,

Автореферат разослан

Ученый секретарь спедаалиэжрованяого совета кандидат биологически наук

Коваленко А.Г.

ОБШ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛБОШ

Актуальность пройден«. В реявший Ш1 сгвада ИКС, опрвдв-лявдях темой к направление раавятяя наше! страны на вврвод до 1990 года* в качестве одной аз основных задач выдвинуто увеличение производства кормового белка. Дхя ее решения намечено в мю-аггаСах страды расширить посевы бобовых культур в повысить кх урожайность. Это неизбежно связано о возрастанием рои биоюгнческо-го азота в азотном балансе лота.

Наибожее активными аэотояажмштелвмя среди симбжотжческих о организмов, фиксирующих атмосферный азот, являются клубввь-ковые бактерии, Интенсивность ах азотоусвоения в аяачятельвоД мере зависит от вида бобового растения ш характера его взаимоотношений с ьшкросиидионтом.

Среди бобовнх культур, возделываемых на Украине, ведувде несто по занимаемым шощадям принадлежит гороху я клеверу. Эти традиционные для республики сельскохозяйственные культуры обладает, как известно, ценными кормовыш, цродоводьственнымя иогро-ноиаческими свойствами. При благоприятных условиях кжубеяькавве бактерии гороха я мевера могут фиксировать соответственно 80 я 200 кг азота на I гектар в год. ^ .

В настоящее время в определенной мере равирита сукносп симбиоза Rta sobina с бобовым растешем. Фиксируя а вот атмосферы я образуя в процессе жизнедеятельности биологически активные вецества, клубеньковые бактерии оказывает п он ожж тельное влхихие на урожай растений я количество накашяв&емих в вях ааотвых соединений. Бобовое растение, в своп очередь, поставляет клубеньковым бактериям продукты фотосинтеза, обеспечивая ях »нергетяче-ским я структурным штериалом для азотфаксации (Ижжустин, Шжль-някова, 1373), Таковы основные принципа механизма взаимодействия

ГГ7--1 е/л .1- i г:. J :'.л t ¡ :

партнеров бобово-ризобиального симбиоза. Однако сведения, име-едяеся в литературе со втону волосу, не охватывает всего многообразия еямбиотячеехкх взаимоотношений и не дают четкого представления о путях повыиекия эффективности симбиоза. Все Солее актуальными в «тем направлении отановлтея исследования по селекция активных атаммв клубеньковых бактерий, способных вступать в снмбкотяческиа взаимоотношения о высокопродуктивными формами я сортам« бобовых растений.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является раскрытое некоторых сторон сямОиотвческого взаимодействия клубеньковых бактерий клевера в гороха с соответствуешьми расте-

нвями-хоаяевамя а изученде физиолого-биохямических особенностей

*

указанных мифооргаимяиоя; повел косвенных показателей их эффективности в получение активных штаммов дня использования в сельском хозяйстве*

В задачу исследований входило:

1. Выделение штаммов клубеньковых бактерий гороха в клевера яв клубеньков растений, выращиваемых в различных почвенно-хжяматкчеокях воках УССР; изучение вх морфолого-кульгур&дыоа

в симбяотяческях свойств.

2. Изучение влияния генетически измененного растения клевере в качестве селекционного агента ва кдубеяьковые бактерии клевера.

3. Определение дегкцрогеааэяой активности шЦгоьи» ш косвенного показателя эффективности при отборе лтамиов.

4. Исследование синтеза свободных аминокислот в некоторых витаминов группы В клубеньковыми бактериями резной активности как фактора их воздействия на бобовое растение.

5. Испытание эффективных штаммов клубеньковых бактерий клевера я гороха в п&яу проязводствеиных условиях (на опытных

станциях УССР) о цель» отбора луч них культур для яаготовлендя нитрагина.

Объекты исследования, Объектами исследования служила 272 штамма клубеньковых бактерия югевара « гороха, подученные на основе 400 иэодятов, выделенных жа кдуйеньхов соответотауодах видов растендЯ-хозяев на территория б областей, расположенных в трех почвенно-климатических зонах Украяни. В качестве шашоа-эталонов нспольаовали: кь.1»виа1юо«вгиа - 209а, 245а, 250а в Hh.trifoi.il - 311а, 330а, 348а, полученные на ШИН сельскохозяйственной микробиология,

Метдщ исследования, фльтуры кЫаоМи* язучаешх вядсш выделяй яз клубеньков бобовых растений в {азу бутонизация (Израильский с соавт., 1933).

Рост бактериальных культур Ш1.*г1*<>Ш. я еь.1«8ит1ио«а-тив поддерживался на бобовой среде Иаэе.

Для установления морфологиче с них различив язучаешх штаммов ШюЫи» проводили просмотр препаратов в световом (МШ-6) а электронном ( ^) мнфоскопах.

При исследовании культу рильных свойств выделенных итаммов изучали характер жх роста на минеральных в органических, агари-зованных я жидких средах, обычно используемых для идентификации клубеньковых бактерий (Красильняков, 1950),

ЭЗДежтввность клубеньковых бактерий кжевера я гороха определяла в шкровегетацаонных, вегетацяонных я полевых опытах. В качестве контроля помимо варианта без бактеризация семян в слечу опыта включался вариант с бактеризацией семян стандартным штаммом-эталоном. Для посева использовали семена районированных сортов гороха - "Рамонский-77", "Удадовский-206". "Ваггоряя Ц&н-дорфская" я клевера - "Носовский-5", "Уладовокий", "Глория", "Красный двуукосный" я др. Инокулят вносили в количестве до

I tut. клеток ризобяй на cauto семя. Повторное» опытов 4-5-краткая. Учет проводы* в фазу цветения иди полной зрел ост«. Определллж величину урожая, количество a массу клубеньков, содержание общего азота а эелекой массе растет Я.

Активность дегждрогеваэ выделенных штаммов определяли тет-раэожиевым метопом Дкамбор (J«abor, 1961) в модафвкацив Шяд-та (1964),

1родатографическое разделение свободных аминокислот в культурах клубемькових бактерий проводил! методом количественной походное! хроматографа* на бумаге (Пасхана, 1964) с модификациями, касдщкмшся процесса подготовка материала к анализу.

Содержание внеклеточного я внутриклеточного пкрхдоясяиа ■ вишкобахамаяа определяли шкробкологщческим методом с использованием соответствующих индикаторных культур - uebaríoejcee dl в fio rúa (Окжяцоаа, 1969) и Eechericbie coli (Куце »а, 1961)*

Давние »кспержментс® обработаны «тематически (Доспехов, 1971).

Ватчиэд доризнп. 11а большом фактическом материале (272 ■теме Rhisobli» > установлено влияние экалого-географических фавор«» ва распространение активных отаиюв клубеньковых бактерий клевера ж гороха в условжях УССР.

Цра сравнительном изучении синтеза свободных аминокислот Bb.txlfoUl -я 8ь.хввим11ю»гни In vitro i b условжях симби-ова вскрыш векоторое стороны механизма взаимодействия клубеньковых бактерий с реете нжем-хозяжном. Показано, что в условжях ежмбжоза сжятея свободных аминокислот протекает в 4-10 раз боле» активно, чем в чжстих культурах клубеньковых бактерий на f ттгт во питательной ценности средах. Впервые исследовано участке отдельных компонентов симбиотяческой системы (клубенька) в образовании свободных амжнокислот. Наибольшее количество свобод-

них аминокислот (90-97Í) обнаружено в растворимой фраюшж му-беньковоД ткана.

Э качестве селекционного агента для получения активных штаммов t rifoш предложено использовать растения

тетрадлоидно* формы клевера.

Практическая значимость работы. Путей последовательного отбора получено 18 высокоэффективных штаммов клубеньковых бак-теряй клевера к гороха. прибавку урожая на 10} в более

оо сравнении со штаммами-эталонами.

Штаммы muleguai.no ааruin 2086 ж 2506, прошедшие испытания в условиях Географической сети опытов, ре пени ем Межведомственной комиссии рекомеадовада и использованы для производства нитрагина.

На основе штамма 206Й Киевским заводом бакпре паратов иаго-товлево ж использовано в условиях УССР 584000 гектаропорций нитрагина под горох. Материалы по этоцу штамму »кспонировались ка ВДНХ СССР Ж отмечены бронзовой медаль».

На основе втамт.2506, утвержденного ж производству в феврале 1981 rota, в первом квартале 1962 года Несвииским заводом кормового биомицина (БССР) изготовлено 23400 гектаропорций ри-зоторфиаа.

Апробация диссертационной работы состоялась на теоретическом семинаре по проблеме í« экологии ж биохимии микроорганизмов Института микробиологии ж вирусологии АН УССР. Материалы диссертаций докладывались на: Всесоюзной конференции по биологической фиксации азота (Киев, 1968); Всесоюзном совещании "Микроорганизмы - продуценты биологически активных вецзств" (Рига, 1969); У съезде Всесоюзного микробиологического общества (Ереван,1975); У Всесоюзном Валовском коллоквиуме во аэотфякваци (Канев,197б);

симпозиума "На крой ныв сообщества я их функционирование в почве* (Чернигов, 1979); рабочем совещания по проблеме биологической фиксация атмосферного азота (Пуияно-на-Оке, 1979); Ресцублжкан-оком семинаре "Элективное использование биологического азота в сельскохозяйственном производстве" (Киев, 1982); симпозиуме "Структура я йгнкцжя мякробиых сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой" (Чернигов, 1982).

ру^икАгуя материалов исследований. По материалам диссер-тащя опубликовано 12 статей.

Обгон я структур^ рабури Диссертация изложена на 165 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литература, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 32 таблицы и II иллюстраций. Список литературы влипает 242 источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССШОВАНИИ

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОШБЮТИЧЮКОГО взшедЕистша иаговиш С РАСТЕНИЕИ-ХОЗЯИВОЫ

Иорфолого-культуралыше признака клубеньковых бактерий клевера и гороха

Ыи крое копирование фиксированных препаратов штатов клубень-коша бактерий кивера к гороха показало* что »ти вида отличатся размерами а в меньшей степени формой, Клеткя обоих видов в«от форму слегка изогнутых палочек. Длина каетох кьлг1Го111 равна 2,7^0,2 6 мкм; длила клеток &Ь.1«дош1п»де:пш несколько бельке - 3,2±0,8 мкм.

Пря »леггрокно-иикроскопическом исследовании наиболее типичных «темпов кщубенькавых бактерий клевера я гороха не обнаружено меиуними каких-либо характерных раалячий. связанных с эф-

фектквностьв рязобяй.

В характере роста на различных средах у изучаемых видов ризобий наблцдались шгаммовые различия. Однако связи «тях свойств с эффективность» штаммов выявить ее удалое».

Проведенные исследования позволяли отобрать 197 наиболее типичных по корфолого-культуральным признакам штаммов кь.»г1Го-111 я 75 штаммов льл«£иш1ш>вахш, которые были использованы для опытов с растениями.

Влияние экологических факторов на распространение аффективных штаммов Ш»иш

Оценка эффективности штаммов клубеньковых бактерий клевера я гороха, проведенная последовательно в мякроввгетацжояных, вегетационных я полевых опытах, показала, что ваябохьшй отсев неэффективных ряэобий { 60£) происходил на первых двух этапах отбора (табл. I). Только 40£ штаммов от общего количества испытанных оказались активнее штаммов-эталонов. Окончательный ответ на вопрос об эффективности штамма девали полевые опито. Боле» 80? штаммов, прошедших полевые испытания, после отбора в вегетационных опытах били эффективнее эталонных.

В результате сайтов с соответствутхцими растенияж-хоаяива-мя било отобрано 16 штаммов клубеньковых бактерий клевера и гороха, показавших превышение урожая по сравнении со стандартными штамшши на 10? л более и отнесенных поэтому к категория высокоэффективных»

Некоторые показатели по этим штампам представлены в табл.2. Если принять урожай соответствугаах бобовых культур, получаемый при инокуляции семян стандартным штаммом, за Х00£, то при яяоку-ляцйи семян клевера отобранными штаммами его урока! повышался от 20 до 38$, а урожай гороха повышался от II до 30%*

Таблица I

Результаты аналитического отбора аффективных отаииов клубеньковых бактерий

Опыты ГКоличество! Испытано : опытов * шташоа • » * • ! ! | Отобрано активных штаммов ! Всего { » % от числа : ; испытанных

ШмЫш *г1*ои1

Микровегв- 10 197 76 36

ташюшше

Вегетаци- 72 26 36

онные 4

Полевые 7 26 22 84

БЬ1*оЫмп 1 #еип1по вагам

Ыжкровеге- 75 35 47

тационяые 4

Вегетаци- 35 16 46

онные 3

Полевые 3 16 13 61

Количество клубеньков на едко растение клевера колебалось от 166 до 320 I ори заражении отобранными нами штаммами било большим, чем в случае применякия стандартного штамма. Количество клубеньков на одно растение гороха колебалось от В6 до 219 и в большинстве случаев также превышало соответствующие показатели стандартного шташа.

Наряду с повышением урожая, наблюдалось увеличение содержания общего азота в растениях.

Таким образом, под влиянием высоко аффективных штампов увеличивается количество клубеньков на корнях бактеризованных растения, повытется их урожай и содержание в нем азота.

Проведенные испытания позволили обнаружить определенную

Таблица 2

Показателя вффективности с»мбюза клубеньковых бактерий с растением-хоэяином

Горох

Клевер __, . , ,

Ц*гамми ¡Урожай \И аэота|Кол«че- | Штаммы!Урожай

:эеленой:в расте|ство * : зеленой; в :шесы ; никх гмубень-1 'шми * I : в ¡Г ; :ков на

; ! :Х ресте-

• • * ива

> : J_L

аэота'Колйчв-раоте4ство 1яях : клубеньков ва Ц расте-

; ш

6п 10д 20 п 42п ЗУ

15Г 8т

32т ХОх

138 120 128 121 137 132 130 £26 132

эталон 100

3,9 3,9 4,1 4,0 3,6 3,6 4,0 3,6 3,8

3,4

173 207 261 320 306 166 280 181 170

204

2Хк

69ц

и

13л

17л

Хо

7с

6х

1316

эталон

117 III 114

117 130 128

118 ИЗ 120

100

3.2

3.0 3,6 2,9

3.3

3.8

3.1 2,8

2.9

2,8

116 66 163 201 156 110 219 195 170

118

зависимость в распределении активных штаммов клубеньковых бактерий гороха я клевера в пределах акал ого-географических зон УССР. В областях, расположенных в зоне центральной Лесостепи, процент активных штаммов клевера (51?) я гороха (57^) был самым высоким. Это связано с тем, что по сравнения с другими зонами почвы Лесостепи характеризуются естественным плодородием, а климат - оптимальными величинами активных температур, инсоляция я осадков.

Влияние генетически измененного растения (тетраолоидного клевера) ва клубеньковые бактерия

Бобовое растение оказывает мощное селекционирующее воздействие на своего партнера по симбиозу. В процессе жизнедеятельности оно производит отбор определенных типов спонтанных мутантов клубеньковых бактерий, наиболее соответствующих его генотипу. Понев и селекция таких высокоэффективных симбиотяческих sap является актуальной задачей.

В УССР при помощи колхицина на диплоидного сорта "Уладов-скяй-ЗД" создана перспективная тетрадлоидная форма красного дву-укосного клевера "АН-тетра-1". Наубеньковые бактерия, выделенные из растений клевера »той формы, отличались выоокой активность», что подтвердили опыты по перекрестной инокуляции семян ди-я тетрадловдного клевера соответствующими штаммами клубеньковых бактерий,

Максимальную еффективность исследуемые птаиш шшЫш, выделенные is тетрашондной форьи клевера, проявили на тетра-плождних растениях,' но при* етом также повышали урожай диплоидных растений на 12,При использовании для инокуляция семян клубеньковых бактерий, выделенных иа клубеньков тетрапловдного клевера, количество клубеньков на корнях бактеризованных растений увеличивалось на 54i, а содержание общего азота возрастало до 4i, что свидетельствует о хорошей приживаемости я активности исследуемых штаммов.

Следовательно, являясь селекционным агентом, тетраплоадный клевер может служить одним из источников получения высокоэффективных отаиаов ШИвоЫша t rife Hi.

Активность дегядрогенаэ клубеньковых бактерий - косвенны* показатель эффективности отамюв

Известно, что высокоактивные ферменты энергетического обмена - дегидрогенаэы - служат поставщиками водорода и алектро-нов, необходимых для фиксация молекулярного азота.

Однако, несмотря на большой фактический материал, накопленный при изучений дегидрогенаэ клубеньковых бактерий, нет единого мнения о наличия четкой корреляции между дегядрогенаэяой активностью м эффективностью RMtobium. НесхЗходиш дальнейшие исследования на большом наборе штаммов разных видов клубеньковых бактерий (Олейников, 1971; Новикова, 1973 и др.). При изучении возможности отбора эффективных штаммов по даннопф признаку мы определяли активность дегидрогенаэ у 40 штаююв клубеньковьа -бактерий клевера и гороха, резко отличающихся по эффективности. В опытах использовали 5 субстратов, относящихся к трем различным классам органических соединений.

Проведенные исследования показали, что дегждрогевааяая активность зависела от вида клубеньковых бактерий, природы используемых субстратов ж активности штаммов.

Было установлено, что активность дегидрогенаэ клубеньковых бактерий клевера на одних и тех же субстратах в 2,8-3,0 pase выше, чем клубеньковых бактерий гороха (табл. 3).

Заслуживает внимания связь, прослеживаемая меилу активностью дегидрогенаэ изучаемых вждов клубеньковых бактерий ж количеством накапливаемого жмж азота. Tax, известно (Доросивский, 1970), что клубеньковые бактерии гороха в симбиозе с ростением-хозяином фиксируют и накапливают в год на одном гектаре почти • в 3 раза меньше азота, чем клубеньковые Сактерия клевера. Слабая ферментативная активность клубеньков гороха была отмечена ж другими авторами (Дубовенко с сотр. ,1971); Следовательно, срав-

иитвльно нязхая активность дэгядрогенаэ риэобий гороха в частой культур« не случайна. Она, вероятно, обусловлена более низким уровней общего метаболизма »тих бактерий.

Таблица Э

Активность дегидрогэназ клубеньколых бактерий клевера и гороха (в мкг Я* на 2 млрд клеток) (средние данные по 10 штаммам каждой группы)

Клубеньковые бактерия вере :

Субстраты

клевере : гороха

■■■ 1,1 -" у—™ 1 | ■ 1 I I ■

активные | мало- : активные ! мало-

| активные • * активные

Глвкоаа 0,183^0,026 0,116^0,023 0,065±0,019 0,049^0,010

Сахароза 0,179*0,121 0,116*0,018 0,056*0,008 0,044^,007

Каяилт 0,101^0,016 0,109^0,020 0,060*0,017 0,045^.013 Этиловый

спирт 0,166*0,019 0,074^,016 0,055*0,012 0,025*0,004 Ассарагжво-

вая кислота 0.170*0,032 0,046*0,010 0,065*0,008 0,035*0,007

Эндогенное дегидрирование 0,110*0,026 0,062*0,015 0,033*0,010 0,025±0,0Х9

Субстратспецифвческие дегддрогенааы исследуемых отамюв ри-вобий в большинстве случаев проявили более высокую активность, чем бессубстратные*

Лучшими субстратами для дегидрирования были глюкоза и сахароза. Однако в случае применения трудно дегидрируемых субстратов, таких хах этиловый спирт и аспарагиновая кислота, резче проявлялась разница между испытуемыми штаммами. Так, при дегидрировании глхжоэы разнима в активности дегидрогеяаз меиду аффективным я малоэффективными штаммами кь^аюш составляла

ВДС, я вря дегидрировании этилового спирта - Пб£» Примерно та к зависимость наблюдалась я аналогичных опытах со ят&ммащ ВЬ. 1екша1повагиа>

В среднем дегядрогенаэная активность у аффективных вт&мкв ШмЫш была на 50-90$ вшив, чем у малоэффективных.

Существе®аняе связи меиду дегядрогеназной активностью хлу-беньковых бактерий ж их аффективностью было подтверждено яря статистической обработке полученных результатов* Наличие теской корреляционной зависимости (г - +0,82^0,98 ори уровне значимости р - 0,05) между указанными показателями позволяет подтвердить рекомеццацня по применение метода определения активности дегидрогеназ для первичного отбора аффективных штатов (Еершова с сотр., 1971; Новикова, 1973).

СИНТЕЗ ШОДОГИЧЕСКИ ШШШХ ВЕЩЕСТВ КАК ОДИН ИЗ ФАКТОРОВ

водайстшя шшшш шзди ш растение

Синтез свободных ашношсют клубеньковыми бактериями 1а *1Лго я в условиях симбиоза

Аминокислоты являются вторыми (после аммшяа) стабильными соединениями, куда замотается фиксированный азот после восета-аовятедьаого ашвирования хетошслот, Их накоплен« тесно свя»а-но с регулированием уровня аммиака в азотфяксирукщих системах я, следовательно, влияет аа активность азотфяксацяи. Образование этих биологически активных веществ клубеньковыми бактеряяш имеет своя особенности, т.к. в значительной мере определяет характер взаимоотношений ШмЫш с бобовым растением-хозяином.

Исследован синтез свободных аманожслот ш т1Ъто 12 штаммов клубеньковых бактерий клевера и гороха различной аффектя»-ности. Учитывалось накопление аминокислот в клетках я культурах ной жидкости при выращивании микроорганизмов на двух средах.

различавшихся по питательной ценности.

Обнаружено! что образование свободных аминокислот клубеньковыми бактериями в большой мере зависит от <?язи алогических особенностей исследуемых штаммов, их вида я условий культивирования.

При выращивания клубеньковых бактерий на оптимальной по питательной ценности Лобовой среде в большинстве случаев процессы потребления свободних аминокислот преобладали над их синтезом. Найлвдался также активный обмен аминокислот внутриклеточного пула и среди.

Валовые отличил изучаемых культур в образовании свободных аминокислот при культивировании на бобовой среде имели, в основном, количественный характер я проявлялись в суммарном содержании »тих соединений. В клетках клубеньковых бактерий гороха содержалось на 17-36%, а в культуральной жидкости - на 2I-68Í больше аминокислот, чем соответственно у клубеньковых бактерий клевера (табл. 4).

На синтетической среде Чапека, наоборот, клубеньковые бактерии клевера накапливали почти в 2 раза больше свободных аминокислот, чем клубеньковые бактерии гороха, хотя в делом суммарное содержание этих соединений било значительно ниже, чем на бобовой среде. Резкое снижеяле {в 4-6 раз) количества свободных аминокислот при выращивании клубеньковых бактерий гороха на среде Чапека по сравнению с бобовой средой, вероятно, связано с тем, что данному виду ШмЫиа необходимо наличие биостимуляторов в среде. В противополокность ям клубеньковые бактерия клевера обладает более высокими потенциальными способностями в отношении синтеза свободных аминокислот.

Обнаружены значительные количественные различия в образовании свободных аминокислот в зависимости от эффективности яс-

>

Таблица 4

Суммарное содержала свободных ашномсяот в чистых культурах мубенькавых Оактерк! ж в условиях свмбвоза (кг% на сухую массу)

Среди

Анализируешь материал

Клубеньковые бактеряи

Клевера

Гороха

активные ¡малоактивные: £ т ! активные ,:иаловктивяве ; / 0 ■_____^-----_ £ _ ^ _---- -

Чапека

Бобовая

метш

культураль-кая жидкость

клетки

кулътураль-ная жидкость

ыубеяьп

121,1+5,6 56,5±4,9 10,2 53,7^5,6 23,9±3,4 7,3

83,0+3,1 46,0+2,1 9,7 43,6+2,6 19,5+4,1 5,1

167,7^1,8 107,2^3,8 9, в 2X4,5+5,8 125,4±7,3 10,6

130,0+9,8 57,0^3,7 8,0 168,0+5,1 96,0+3,2 6,5

1217,9^13,3 596,0*6,9 39,6 1055,5^6,7 685,9+4,6 12,4

¿р-2.« Р = 0,05

оледуешх вташов. Так, при культивировании из бобовой среде активные штаммы клутЗенькових бактерий клевера я гороха на капля валя в клетках соответственно на 47Í в 7IJÉ, а в культуральной жидкости на 14% я 75^ больше свободных аминокислот, чем малоактивные итанош. На среде Чапека содержанке свободных внеклеточных и в ну три кле точных аминокислот, синтезируемых активными штаммами ah.trlfolii, было соответственно на 80Í к II4Í, a Rb.ltguaino-

earu« - на 124% » 125% выше, чем малоактивными штаммами*

г

Вне зависимости от питательной ценности применяемой среда в метках в культуральной жидкости активных штаммов Rh.trifolii и Kb.l*sustlDoaerua преобладало накопление таких аминокислот как глгтаминовая, аспарагиновая, аланян, валян я лейцин. Вероятно, образовав» втих ашносоедкяений является необходимым этапом клеточного метаболизма кыюМив, связанным о их физиологической природой. >

При изучении синтеза свободных аминокислот в условиях симбиоза ваш впервне была предпринята попытка количественной оценка их содержания в отдельных фракциях клубеньковой ткани. С этой целы» проводилось дифференциальное центрифугирование гомогеката клубеньков.

Результаты показали, что вся масса свободных аминокислот (90-97^) сосредоточена; в основном, в растворимой фракции (рисЛ). Не значительное количество аминокислот найдено во фракции бактеро-щда» и ецо мекьжее - во фракции мембран. На их долю приходится от 3 до 10% всего количества аминокислот, синтезируемых в клубеньке. Вероятно, ио связано с тем, что ферменты ассимиляшш пшигнт сосредоточены, в основном, в растительной ткани клубенька.

Сушарное содержание свободных аминокислот в клубеньках в пересчете на сухое вещество примерно в 10 раз больше, чем их

m

IL.éuMí

wè ' ü

32

Ulli

t£

SaflT

9*9

ГС

M

fo

J £

£45

/8

A £

Ъ

Рже. I» Содержало ев ой cazuz вмяноовехог в р&здпшх фраяцкях ыуйежыюво! ткаях (кг % m cyiy» пассу)

к ~ акхжвт* втащи; Б - «ахоахгяввие вгакш;

I - Йаяероадаал фраком кфбеяыа; И - фращи "намаравшие фрагментов"; Ш - растворная франщя; 17 - суммарное содерханжв аыхяопехог

6SÇ

п

количество в чистах культурах, что косвенно свидетельствует об эффективности симбвотаческой азот^нксация х влиянии растений на этот процесс.

Что касается количественного содержания свободных аминокислот в клубеньках растений гороха и клевера, образованных активными штаммами клубеньковых бактерий, то оно в 1,5-2,0 раза выше, чем у шлоактивных.

Та хе зависимость в синтезе свободных аминокислот иабдвдд-ется, как было отмечено, и в чистых культурах клубеньковых бактерий.

Полученный экспериментальный материал дает основание предположить, что при благоприятно складывавдихся сямбиотических взаимоотношениях с бобовым растением, клубеньковые бактерии снабжаю его свободными аминокислотами, Активность этого процесса зависит от эффективности штаммов, что позволяет рассматривать показатель накопления свободных аминокислот клубеньковыми бактериями как косвенный критерий при первичном отборе штатов НЫдоМиа.

Образование витаминов ж В¡2 клубеньковыми бактеркяш клевера и гороха

По данным многих авторов (Ыайстер, 1961; ¿осквоп, Еуапа, 1968; Ыанорик, Дясоаа, 1969( Шемиханова, Сидоренко, 1971 я др.) азотный обмен клубеньковых бактерий тесно связан с синтезом витаминов грушш В, Особый иитерес в этом отношении представляют витамины Вц и т.к. их производные входят в состав ферментов, связанных с фиксацией и ассимиляцией азота.

Исследования показали, что все испытанные штаммы клубеньковых бактерий клевера и гороха синтезировали пиридоксин и цианко-баламин, накапливая их в клетках я кулыураяьной жидкости.

Суммарный синтез витаминов Вд я Вт,, активными и малоакгкв-

ннмя штаммамя клубеньковых бактерий гороха мало различался, однако при этом активные вгтаммы йй.1ек\ижл.цовагим накапливали па И% больше свободного этрхдоксика и на 27% болы» связанного ци-анкобаламина, чем малоактивные штаммы.

Четких различий в синтезе витамина В12 активными и малоактивными штаммами клубеньковых бактерий клевера на выявлено.Синтез оиридоксина этими же штатами имел некоторые особенности. Гак* на вторые сутки роста активные штаммы Rh.tr!. ^111 выделяли в среду 26«в мхг свободного оиридоксина на грамм сухой биомассы клеток, что на 44^ больше, чем малоактивные ятакш. Эта особенность, вероятно, имеет место я в симбиозе. Епагоддря этому свойству активные тгамш рязобий энергично снабжают растение-хозяин синтезируемыми витаминами.

Обнаруженные различия в синтезе витаминов В^ и Вц клубеньковыми бактериями клевера и гороха разной активности позволяв«, по нашему мнение, использовать данный показатель в качестве дополнительного косвенного признака цри отборе эффективных штаммов этих культур.

Испытание эффективных штаммов в полупроиэводственных условиях

Заверпшицш этапом работы в целы) наиболее достоверной оценки эффективности отобранных штаммов являлись полевые опыты, проведенные в разных почвенно-климатических зонах УССР, на опытных станциях, расположенных на территории Киевской, Черниговской, Львовской я Одесской областей*

В испытания были взяты активные штаммы клубеньковых бактерий соответствуем! бобовых культур, проходившие проверку в Географической сети опытов с нитрагином под номерами 3106, 3206, 3236, 2086 и 2506.

В качестве контроля в »тих опытах, помимо варианта "без инокуляции*, испытывал ось по 2 стандартных лташа.

Как показали результаты, клубеньковые бактерия клевере давали прибавку урожая зеленой шсси клевера до 29 ц/га к зерна до I ц/ш по отношению ж стандартный штатам.

Клубеньковые бактерии гороха обеспечивали прибавку урожая зеленой маосы на 20 ц/га, а верна на 3,9 ц/га по отношения к стачала*-эталонам.

Еще более высокие прибавки получены по сравнении с контролем без бактеризации семян. Так, во урожаю зерна клевера и гороха прибавки составляли соответственно 1,6 и 3,4 и/га, по урожаю зеленой массы - до 35 ц/га. Это свидетельствует об эффективности приема инокуляции в целом.

Таким образом* испытания эффективности селекционированных "»ми актив них ятяшюя в полу прои зводстве нных условиях показали прежцуцвство последних по сравнению со стандартными втаммами в условиях республики. На утверидеаном * производству штамме ьь. 1евиа1м>мхи* 2086 изготовлено и использовано 584000 гектаро-порций нитрагина под горох. Материалы по атому штамму экспонировались ка ВДНХ СССР я отмечены бронзовой мадальс.

В феврале 1981 г, на заседания Межведомственной кошссии во НИИ сельскохозяйственной »якробиологии второй штамм клубеньковых бактерий гороха 2506 также утвержден как производственный. На »тот всаж подучено положительное решение ГоскошэобретеняЙ о вкдзче авторского свидетельства по заявке А 3331029/30-15 от 31,716-1381 г. В первом квартале 1962 года Несвижским заводом кормового биомицина яа основе штамма иь. 1 egunLi.noмпа 2506 наготовлено 23400 гектаропорций ризоторфина под горох.

- 22 -ВЫВОДЫ

1. В умовжях УССР кз клубеньков растений клевер* в гороха выделены щ изучены 197 штаммов Kh.trlfoiii в 75 штаммов кь.

1 egvelnoил») различавшиеся фияхолого-биохимячеошми свойствами я величиной симбяотнческой аэотфяксацни. Из клубеиъков растений, растуцях в черноземах Лесостепи, выделяется значительно больше активных штаммов Rh.trifolii (до 5IJC) я Eh.iegu&lnoaa-пш (до 57£), чем яз дерново-псщзолистых почв Полесья (30 я 45JC соответственно).

2. Установлено селекционирующее влияние растений тетрапло-ддного Ktesepa сорта АН-тетра-I на клубеньковые бактерии. Из клубеньков растений этой форш клевера било выделено наибольшее количество (54Л) аффективных штаммов Rh.trifoiii.

3. Активность дегждрогекаэ наученных штамюв клубеньковых бактерий имела высокую степень корреляция о их сямбиотичеокой эффективностью ( г = ¿0,82^0,96 при уровне значимости р - 0,05), что позволило подтвердить рекомендация данного показателя для определения эффективности игташов в лабораторных условиях,

4. Суммарное содержание свободных аминокислот in vitro и in *1то у эффективных штаммов в 1,5-2,0 раза выше, чем у малоэффективных. Этот показатель монет быть срименея в качестве критерия при отборе эффективных штамюв ш*»Ыш,

5. В условиях симбиоза синтез свободных аминокислот протекает в 4-10 раз более активно, чем в чистых культурах яа разных по питательной ценности средах, что косвенно свидетельствует об активности симбяотяческой азотфиксации и влияния растения-хозяина на этот процесс. Наибольшее количество свободных аминокислот {90-9730 обнаружено в растворимой фракции клубеньковой ткани.

6. Различая в синтезе витаминов Bg и В^ клубеньковыми бак-

терияыж кивера в гороха, обнаруженные у штаммов разное активности, даю» основание жсвольвовать давний признак как дополнительный показатель при отборе штаммов атвх вудьтур.

7, Отобрано 18 высокоэффективных кгашов клубеньковых бактерий клевера в гороха, дающих превышение урожая ва 1055 в более 'по сравнению со втаммаш-атадонамя.

На основе высокоэффективного штамма кь»1«£и*1ш>мгиш 2086, утвержденного к производству, наготовлено в использовано в условиях УССР 564 тысячи гектаропорций нитрагина под горох.

Высокоэффективный отамм ЕЬ.1«в<т1аоеагша 2506 рекомендовав для производства нитрагина решением Межведомственной комиссии Географической сети.опытов от февраля 1981 г. в 1-ом квартале 1982 г, на его основе Несвижский завод кормового биомицина (СССР) наготовил 23400 гектаропорций ризоторфава под горох.

По теме диссертации опубликованы следующие работы;

X. Рубенчи* 1.Й., Бершова О.И., Е^чеико В.Н. Клубеньковые бактерии тетраллоидного клевера. - ДАН СССР, 1967, Л 5, 0,1168-1169. " ,

2. Бервова ОЛ., Ерченко В.В,, Фролова О.И. Дегвдрогеназван активность как показатель эффективности штаммов клубеньковых бактерий. - В сб. 1 Биологическая фиксация атмосферного азота (Киев, 26-30 ноября 1968 г.); Тез. докл. Кяев, Х968, с,24.

3. Беряова О.И., (£ченко В.Ы. Бнологая клубеньковых бактерий тетраплоядкого клевера. - В об.: Биологическая фиксация атмосферного азота (Кяев, 26-30 ноября 1968 г.): Тез. дохл. КВев, 1968, о.38.

4. бервова О.И., Х^ченко В.Н., Прихсдько О.И. Свободные аминокислоты клеток актив них в неактивных штаммов клубеньковых бактерий. - В сО*: Иетоды микробиологического стимулирования

росте я развиты растений (Рига, декабрь 1969 г.): Тез.дом. Pira, 1969, о.56.

5. Бершова О.И., Ерченко В.Н., Приходько О.И. Дегедрогеиазвая активность как показатель эффективности штаммов клубеньковых бактерий, - В сб,; Новое в изучении биологической фиксашш азота. Москва: Наука, 1971, О.90-91.

6. Скочяяська H.H., Каицелярук P.M., Ран голова B.U. Синтез в(ри-доксяну t ко0алаи1ну бульбочкоммя бактер(нмя коввааки I люпину. - UI кроб!ол.журн., 1975, 37, вял. 4, с.433—438.

7. Бершова О.И., Мальцева H.H., Скочинская H.H., Рангелова В.Н., Каицелярук P.M., Долгополова Т.Т. Фяэиолого-биохямгсесхие особенности клубеньковых бактерий почв Украины. - В кн.:

У съезд Всесоюзного микробиологического общества (Ереван, 2-7 исия IS75 г.): Тез.док». Ереван, 1975, с.22-23.

8. Рангелова В.Н., Войтенко Л.Н. Свободные аминокислоты клубеньковых бактерий клевера в чистых культурах и в условиях симбиоза. - Мифобиоч.яуря., 1979, ¿I» * 6« с.6X3-619.

9. Рангелова В.Н. Образование свободных аминокислот клубеньковыми бактериямв гороха и клевера в чистых культурах и в уо-ловиях симбиоза. - D сб.: У съезд Украинского шкробиолотческого общества (Днепропетровск, февраль I960 г.): Тез.докл. Киев: Наукова думка, I960, с.56.

10.Мальцева H.H., Скочинская H.H., Войтенко J.H., Рангелова В.Н*, Каицелярук P.M. Клубеньковые бактерия и их роль в пешвевки урожайности бобовых культур. - в сб: Микробные сообщества я их функционирование в почве (Чернигов, октябрь Х979 г.). Киев': Hayкеша думка, 1У8Х, с.223-228.

И.Аздреяк Е.И., Антипчук А.Ф., Скочинекая H.H., Рангелова В.Н., Каицелярук P.M., Войтенко Л.Н. ЭДектявность клубеньковых бактерий в различных эколого-географических зонах УССР. -

6 ed.; Структура а функции микробных сообществ почв о различно!} антропогенно! нагрузкой. Доклады республ. конференции (Чернигов, 17-21 мая 1982 г.), с.134-14Г, [2. Аддревк E.H., Схочянская H.H., Войтенко JT.H., Рангелова В.Н., Канцеяярук P.U., Петерсон Н.В,, Гаренко Л.Т., Дихацхий В.Д., Письменный Д.Г, Эффективность местных штаммов клубеньковых бактерий в почвах Украины. - Еслл. ВШИСШ, Л 34, Ленинград. 1981, с.28-31.

Зак. епь.&ЬЦыб Формат 60x90/16'. Уч.-изд. л. 1,0 Подписано к печати 9.XI.1982 года. Тираж 100,

Офсетная лаборатория Института теоретической физики АН УССР