Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Искусственные ассоциации бактерий Rhizobium leguminosarum с корнями томата и табака, трансгенными по гену psl лектина гороха

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Искусственные ассоциации бактерий Rhizobium leguminosarum с корнями томата и табака, трансгенными по гену psl лектина гороха"

БЛАГОВА ДАРЬЯ КОНСТАНТИНОВНА

Искусственные ассоциации бактерий ШигоЫит иттоБагит с корнями томата и табака, трансгенными по гену лектина гороха

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7!

Уфа - 2013

005062267

005062267

Работа выполнена в Федеральном, государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской

академии наук

Научный руководитель: Баймиев Алексей Ханифовин

Доктор биологических наук, доцент

Официальные оппоненты: Маркушева Татьяна Вячеславовна

Доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра РАН руководитель тематической группы

Белимов Андрей Алексеевич

Доктор биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиоло1 ии РАСХН заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится «/*? » 0 0_2013 г. в « ! Ч » часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01

при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии Наук по адресу: Уфа, пр. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), e-mail: molgcn@anrb.ru

Автореферат разослан «1% » Of 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета —' Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность: В настоящее время важной задачей является увеличение эффективности использования аграрных ресурсов без ущерба для окружающей среды. Одним из возможных подходов для развития экологически-ориентированного земледелия может стать использование ростостимулирующих ризобактерий (Plant growth promoting rhizobacteria - PGPR). Исследования этой перспективной группы почвенных микроорганизмов вызывают большой интерес, как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. Обнаружены штаммы PGPR, способные улучшать рост и урожайность растений, защищать их от фитопатогенов и негативного воздействия окружающей среды (Dimkpa, 2009; Pliego et al., 2011; Glick, 2012).

К хозяйственно полезным видам PGPR в числе прочих относятся ризобии -почвенные грамм-отрицательные бактерии, способные вступать в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями. Хотя ризобии способны вступать в эндосимбиоз, за редким исключением, только с бобовыми растениями, существуют работы, выявляющие их потенциал в качестве ассоциативных микросимбионтов для небобовых культур (Mishra et al.,2006; Mehboob et al., 2012; Ashraf, 2013). Однако в естественных условиях искусственно интродуцированные ризобии с полезными признаками часто не выдерживают конкуренции и вытесняются более агрессивными микроорганизмами.

Для улучшения колонизации ризобиями корней небобовых растений и создания более стабильных ассоциативных симбиозов применяются различные методы, в том числе, получение трансгенных растений, синтезирующих вещества, участвующие в сигналинге на ранних этапах бобово-ризобиального симбиоза. (Sreevidya et al., 2006; Li et al,, 2011; Tirichine, 2012) Одними из таких веществ являются лектины - секретируемые белки, способные узнавать и избирательно связывать разнообразные углеводы. Они связываются с полисахаридами на клеточных стенках ризобии, тем самым фиксируя микроорганизмы на поверхности корневых волосков и вызывая у них перестройки, значимые для формирования симбиоза. (Карпунина и др., 2002; Садовникова и др., 2003; De Hoffet al., 2009)

Ранее в нашей лаборатории была исследована возможность использования лектинов для модификации процессов узнавания бобовыми растениями симбиотических партнеров и создания ассоциаций между ризобиями и такими небобовыми растениями как облепиха, рапс и табак (Вершинина, 2010). Дальнейшим направлением исследований, представленных в данной работе, стало

изучение характеристик искусственных симбиотических ассоциаций между небобовыми растениями, трансгенными по гену лектина гороха (psi) и ризобиями, обладающими различными полезными свойствами, с точки зрения их возможного практического применения.

Целью данной работы являлось создание искусственных ассоциаций клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями, трансгенными по гену psi лектина гороха, и исследование их свойств. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Получить маркированные флуоресцентными белками штаммы клубеньковых бактерий для их детекции in vivo и in vitro;

2. Исследовать возможность и характер колонизации ризосферы растений табака и томата, трансгенных по гену psi, флуоресцентно меченым штаммом клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum;

3. Изучить влияние колонизации ризобиями трансгенных по гену psi корней растений на их устойчивость к фитопатогенам (на примере возбудителей корневой гнили);

4. Исследовать возможность использования ассоциаций трансгенных по psi растений с ризобиями, вырабатывающими псевдофитохелатин, для биоремедиации земель, загрязненных кадмием;

5. Создать векторные конструкции с геном psi под контролем . корнеспецифичного промотора RB7 и испытать специфичность экспрессии

данного гена в растениях табака.

Научная новизна работы: Исследована возможность колонизации ризосферы томатов флуоресцентно меченым штаммом ризобактерий. Обнаружены штаммы бактерий с антагонистической активностью против фитопатогенных грибов рода Fusarium среди микросимбионтов дикорастущих бобовых растений Республики Башкортостан (РБ). Впервые получены ризобии, трансгенные по псевдофитохелатиновому гену, более устойчивые к большим концентрациям кадмия в почве, проанализировано их влияние на накопление кадмия трансгенными по psi растениями табака. На основе вектора pCambia 1301 созданы генетические конструкции, содержащие ген лектина гороха psi под управлением корнеспецифичного промотора RB7.

Научно-практическая значимость работы: Полученные результаты расширяют представление о возможных положительных эффектах при использовании лектина гороха как инструмента для создания ассоциативных симбиотических систем небобовых растений. Найденные штаммы бактерий с

антагонистической активностью в отношении фитопатогенов могут стать основой для получения биопрепаратов, защищающих растения от болезней. Симбиотические системы с трансгенными по psi растениями и ризобиями, продуцирующими псевдофитохелатин, могут использоваться в фиторемедиации. Полученная генетическая конструкция, содержащая корнеспецифичный промотор, может использоваться для создания трансгенных растений с тканеспецифичной экспрессией целевого гена.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов-2010), международной конференции «Актуальные проблемы науки» (Тамбов, 2011), 2 и 3-й школе-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской конференции «Инновационные направления современной физиологии растений (Москва, 2013).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 23 рисунка, 5 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 248 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом исследования в данной работе служили растения томата сорта «Дубок» и табака сорта Petit Havana линии SRI. В экспериментах был использован ген лектина семян гороха (psi) (Губайдуллин и др., 2006).

При проведении экспериментов по клонированию генов применяли штамм Е. coli XLl-Blue и плазмиды pJN105, pTurboGFP-B, pAL-TA. Для трансформации растений были использованы бинарные векторные конструкции pCambia 1305.1, pCambia 1281Z и pCambia 1301. Для получения композитных растений с «бородатыми корнями» и полностью трансгенных растений применяли штаммы A. rhizogenes 15834 и A. tumefaciens AGL0, соответственно. Для анализа колонизации корней растений использовали штамм Rhizobium leguminosarum 1078

из коллекции ВНИИСХМ. В работе также применяли штаммы из коллекции ИБГ УНЦ РАН бактерий, ассоциированных с корнями дикорастущих бобовых растений РБ. Для изучения антагонистических свойств бактерий использовали фитопатогенные грибы рода Fusarium: F. solani, F. oxysporum, Fusarium sp. D13 из коллекции Уфимского государственного нефтяного технического университета и F. oxysporum f.sp. lycopersici F-140 из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Методы исследования

Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК и растительной РНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, подготовку компетентных клеток, их трансформацию плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc .» (США). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. Для экспериментов по оценке экспрессии гена psl кДНК, получали при помощи фермента AMW ревертазы. Гистохимический gMi-анализ проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с небольшими модификациями (Kosugi et al., 1990). Получение «бородатых» корней проводили по методу, описанному Collier (2005). Проверку антагонистической активности бактерий по отношению к фитопатогенам проводили методом двойной культуры (Whipps, 1987). Способность бактерий синтезировать сидерофоры определяли на «синем агаре» (Schwynan, 1986). Синтез цианида определяли по методике Bakker (1987). Трансгенные растения табака получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок (Horsh and Fry, 1985). Содержание кадмия в растениях табака определяли методом полярографии на вольтамперометрическом анализаторе «Экотест-ВА».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение флуоресцентно меченых штаммов ризобактерий

При изучении взаимодействия микроорганизмов с корнями растений возникает необходимость отслеживать клетки исследуемого штамма, не влияя на их жизнеспособность. Нами были созданы генетические конструкции на основе вектора рЖ105, содержащие гены флуоресцентных белков серии ТигЬоСоЬге: ТигЬоОРР и ТигЬоЯРР (рис. 1) (Баймиев и др., 2011). В качестве основы для конструкций была взята плазмида широкого круга хозяев рЖ! 05.

Рис. 1. Схема получения экспрессирующей векторной конструкции, содержащей ген TurboGFP.

Полученными конструкциями были трансформированы штаммы бактерий. Rhizobium leguminosarum, R. tropici, R. galegae и Sinorhizobium meliloti (Баймиев и др., 2011). Для дальнейших экспериментов по изучению колонизации корней растений был использован штамм R. leguminosarum 1078 RFP (рис. 2).

Рис. 2. Бактерии Я 1е§иттозагит 1078 1*РР: а) общий вид культуры на чашке Петри; б) бактерии под микроскопом, увеличение х2000.

2. Получение трансгенных бородатых корней на растениях томата и анализ их колонизации клубеньковыми бактериями R. leguminosarum.

Оценку колонизации ризобиями трансгенных по psl корней проводили на композитных растениях томата, состоящих из нетрансгенной надземной части и трансгенных «бородатых корней». В экспериментах по получению «бородатых корней» был использован штамм Agrobacterium. rhizogenes 15834, содержащий бинарный вектор pCambia 1305.1 с геном psl лектина гороха под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Этот вектор в качестве маркерного содержит в области Т-ДНК ген ß-D-глюкоуронидазы (gus) (Вершинина, 2010).

Для создания композитных растений было использовано два способа: in vitro, в стерильной среде MS на чашках Петри, и ex vitro, с использованием минеральной ваты, пропитанной суспензией агробактерий.

При получении композитных растений in vitro «бородатые корни» появлялись приблизительно на 70% растений (рис. 3). Частота трансформации составила 31%.

При получении композитных растений данным способом некоторую сложность представляла необходимость последующего удаления питательной среды с корней и акклиматизация растений.

Рис. 3. Получение композитных растений томата in vitro:

а) общий вид растений; б) «бородатые корни» после 10 дней выращивания растений; в) «бородатые корни» после 3 недель выращивания.

При использовании минеральной ваты, пропитанной суспензией агробактерий, бородатые корни начинали образовываться также через 10-12 дней на 90% растений (рис. 4). Gus-окрашивающиеся корни были обнаружены у 53% растений. ПЦР-анализ бородатых корней показал наличие продукта гена лектина на уровне мРНК. Преимуществом последнего метода является отсутствие необходимости соблюдать стерильность и высокая степень выживаемости растений после пересаживания в почву, поскольку им не нужно адаптироваться к изменившимся условиям. Все дальнейшие эксперименты проводились на композитных растениях, полученных этим способом.

Рис. 4. Получение композитных растений томата ex vitro: а) растения в минеральной вате; б) «бородатые корни» после 10 дней выращивания растений; в) «бородатые корни» после 3 недель выращивания

Для проведения визуальных исследований взаимодействия клубеньковых бактерий с растениями был использован ранее полученный штамм R. leguminosarum 1078 RFP. Корни растений инокулировали в суспензии бактерий в течение ночи, после чего их отмывали и проводили визуальный анализ при помощи микроскопа. На трансгенных корнях томатов было обнаружено гораздо большее количество бактерий, чем на корнях контрольных растений, для получения которых применялся штамм A. rhizogenes, содержащий вектор pCambia 1305.1 без генаpsl (рис. 5).

Также проводилось определение количества бактерий, адгезированных на корнях композитных растений, полученных с использованием плазмиды рСашЫа 1305.1-/>5/ и контрольных. Для этого фрагменты корней, через 1 сутки инокуляции и после 1 месяц выращивания растений в почве, измельчали, ресуспендировали в питательной среде, рассевали на агаризованную среду с антибиотиком гентамицином и проводили подсчет выросших колоний. Обнаружено, что хотя со временем количество бактерий на корнях и снижается, все же оно остается на порядок выше, чем на корнях контрольных растений (рис. 6).

Рис. 5. Взаимодействие ризобий, меченых красным флуоресцентным белком с нетрансгенными (а) и трансгенными (б) корнями томата.

а

345,1

39,20

I psl- U psl+

«Ö

fe §

- 15 'S

б

I psl- El psl+

Рис. 6. Количество ризобий, адгезированных на корнях томата:

а) через сутки после инокуляции; б) после 1 месяца выращивания растений.

Ранее в нашей лаборатории были получены трансгенные растения табака, а также композитные растения рапса, экспрессирующие ген лектина гороха. На данных растениях было обнаружено увеличение количества бактерий R. leguminosarum в 37 и 14 раз соответственно, по сравнению с контрольными растениями. Таким образом, для трансгенных по гену psl корней томата также было показано усиление интенсивности колонизации клубеньковыми бактериями.

3. Изучение защитных свойств ризобий при заражении растений патогенными грибами

Поиск штаммов бактерий, обладающих фунгистатической активностью

Известно, что отдельные штаммы ризобий могут проявлять антагонистические свойства по отношению к фитопатогенам (Mehboob et al., 2012). Нами была исследована возможность использования данных свойств клубеньковых бактерий и повышенной степени колонизации ими трансгенных по гену psl корней для защиты растений.

Методом двойной культуры было исследовано 568 изолятов, ассоциированных с корнями четырнадцати видов дикорастущих бобовых растений трибы Vicea. В качестве культур фитопатогенов использовались грибы рода Fusarium. Антагонистическая активность в отношении исследуемых грибов обнаружена у 7 штаммов (табл. 1). Определение видовой принадлежности штаммов бактерий проводилось анализом последовательности гена 16S рРНК.

Растение-макросимбионт Микросимбионт Грибы

Fusarium sp. F. oxysporum f.sp. lycopersici F. solani F. oxysporum

Горошек гороховидный Vicia pisiformis L. Rhizobium leguminosarum 116 17 41 65 70

Горошек заборный Vicia sepium L. Pseudomonas sp. 2 0 0 25 0

Чина болотная Lathyrus palustris L. Pseudomonas sp. 102 40 29 53 53

Pseudomonas sp. 103 0 21 22 33

Чина луговая Lathyrus pratensis L. Pseudomonas sp. 15.2 0 13 17 19

Pseudomonas sp. 14M 0 25 19 25

Stenotrophomonas rhizophila 18 40 0 33 18

Исследование синтеза бактериями фунгистатических метаболитов

Одним из механизмов фунгистатической активности бактерий является выделение сидерофоров — белков, способных образовывать комплекс с ионами железа, таким образом, делая их недоступными для грибов. Скрининг для обнаружения продуцирования сидерофоров был проведен на «синем агаре» -агаризованной минимальной среде, содержащей комплекс Fe3+ и HDTMA с красителем хром-азуролом S (CAS), исходная окраска которой меняется на розовую, желтую или оранжевую при выделении бактериями сидерофоров и связывании ионов железа в составе питательной среды. Наиболее интенсивно изменялась окраска двух штаммов Pseudomonas, S. rhizophila 18 и R. leguminosarum 116 (табл. 2).

Некоторые штаммы PGPR способны выделять цианид водорода (HCN), что также оказывает отрицательное воздействие на рост грибов. Данный признак был обнаружен у двух штаммов Pseudomonas (14М и 103), а так же S. rhizophila 18 (табл. 3). Штаммы, обладающие наилучшей фунгистатической активностью (R. leguminosarum 116 и Pseudomonas sp. 102), синтезировали сидерофоры, но не цианид. Однако, степень ингибирования роста фитопатогенов штаммом S. rhizophila 18, синтезирующим оба этих вещества, была только 18-40%. Возможно, что фунгистатическая активность данных штаммов связана еще с какими-то механизмами, например, с синтезом антибиотиков.

Синтез фунгистатических метаболитов различными штаммами бактерий

Микросимбионт Синтез сидерофоров Синтез цианида

Rhizobium leguminosarum 116 + -

Pseudomonas sp. 2 + -

Pseudomonas sp. 102 + -

Pseudomonas sp. 103 - +

Pseudomonas sp. 14M - +

Stenotrophomonas rhizophila 18 + +

Совместная обработка растений К охузрогит ¡".ер. 1усорешс'1 и /?. итто$агит 116

Композитные растения томатов с трансгенными по гену лектина корнями и контрольными инокулировали в суспензии штамма Р. ^иттозагит 116, пересаживали в почву, содержащую споры гриба Р. охузрогит £зр. 1усорег$ш и выращивали течение трех суток. После окрашивания корней растений толуидиновым синим, их анализировали при помощи микроскопа. Клетки растений окрашивались в голубой цвет, а грибы - в фиолетовый (Пермяков, 1988) (рис. 7).

Рис. 7. Совместная обработка растений Г. охузрогит £^рЛусорегэШ и Р. /е^иттоэагит:

а) контрольные растения томата + Р. охузрогит ^рЛусорегзкг,

б) растения томата с трансгенными по рз1 корнями + Р. охузрогит {.ярЛусорета;

в) контрольные растения томата+ Р. охузрогит ^ърЛусореша + Я. 1е^ттозагит 116;

г) растения томата с трансгенными по рз1 корнями + К охузрогит {.ърЛусореЫа + Р. /е^иттозагит 116;

д) не зараженные контрольные растения

В результате проведенных экспериментов было выяснено, что обработка трансгенных по гену psl корней томата штаммом R. leguminosarum 116 с фунгистатическими свойствами уменьшает количество гиф патогена F. oxysporum f.sp. lycopersici в ризосфере данных растений. Такой же эффект, но в гораздо меньшей степени, наблюдается на корнях контрольных растений, на которых прикрепление ризобий происходит менее эффективно.

Ранее в ряде работ была показана способность ризобий ингибировать рост различных штаммов грибов in vivo и возможность использования данных бактерий для защиты небобовых растений от фитопатогенов (Ehteshamul-Haque and Ghaffar, 1993; Perveen et al., 1994; Siddqui et al., 1998; Chandra et al, 2007). Таким образом, использование лектинов в качестве трансгенов позволяет получать искусственные корневые ассоциации с ризобиями у несимбиотрофных растений, таких как томат, что в сочетании с использованием микроорганизмов с фунгистатической активностью может более эффективно защищать корневую систему растений от патогенов.

4. Изучение влияния ризобий на растения табака при загрязнении почвы кадмием Получение шталша ризобий с псевдофитохелатиновым геном

Белки, участвующие в детоксикации тяжелых металлов (ТМ) обнаружены как у про-, так и у эукариот. У растений такими соединениями являются короткие, богатые цистеином пептиды - фитохелатины с общей структурой [y-Glu(Cys)]«-Gly, где п = 2-11 (Clemens et al., 1999; Vatamaniuk, 2004). Звенья y-Glu-Cys связывают TM, образуя с ними комплексные соединения. Псевдофитохелатины со структурой Met[(aGlu(Cys)]«Gly (где п - количество повторяющихся мотивов Glu-Cys), которые кодируются специально синтезированными синтетическими "псевдофитохелатиновыми" генами, также способны к комплексообразованию с ТМ (Постригань и др., 2012). В эксперименте по клонированию псевдофитохелатинового гена был использован вектор pTurboGFP-B, содержащий ген флуоресцентного белка TurboGFP. Этот ген был вырезан по сайтам рестрикции ВатН\ и Hindill, и по этим же сайтам был клонирован синтетический псевдофитохелатиновый генpph (рис. 8).

Ашр

Рис. 8. Клонирование псевдофитохелатинового гена (ррЬ) в плазмиде рТигЬоОРР-В.

Данной конструкцией методом электропорации трансформировали бактерии Я. /е£-иттоэагит 1078. ПЦР-анализ показал наличие псевдофитохелатинового гена в трансформированных бактериях (рис. 9).

12 3 4

мц т

66 п.н.

Рис. 9. Электрофореграмма продуктов ПЦР вставки псевдофитохелатинового гена в векторе рТигЬоОРР-В. 1 - Маркер, амплификат псевдофитохелатинового гена, 66 п.н.; 2, 3 - амплификаты исследуемых клонов, содержащих вставку гена; 4 - отрицательный контроль без генетического материала

Выращивание трансформированных и контрольных бактерий на среде, содержащей различные концентрации кадмия (0, 100, 200, 400 мкМ), показало, что ризобии, несущие псевдофитохелатиновый ген более устойчивы к высоким концентрациям данного тяжелого металла (рис. 10).

Рис. 10. Рост ризобий на среде с кадмием: а) штамм, трансформированный геном ррк, б) контрольный штамм.

Влияние ризобий на содержание кадмия в растениях табака

В эксперименте были использованы трансгенные по psl растения табака второго поколения (F2) (psl+), у которых экспрессию гена лектина определяли по маркерному белку GUS, и контрольные, полученные от трансформированных плазмидой pCambia 1305.1 (psl-). Оба варианта растений были инокулированы штаммом ризобий с pph и штаммом дикого типа (контроль). В качестве контроля также использовались неинокулированные растения. Для каждого варианта было взято по 5 растений. Их высаживали в почву с добавлением кадмия в виде 0,1М раствора ацетата кадмия до концентрации 300 мкМ. После выращивания в почве и измерения содержания кадмия в растениях методом полярографии были получены следующие результаты:

1. При выращивании растений в почве без добавления ацетата кадмия, содержание кадмия в растениях, инокулированных бактериями с pph незначительно повышалось (рис. 11), что, возможно, связано с изначальным наличием небольшого количества ТМ в почве.

12

Рис. 11. Содержание кадмия в растениях, выращенных без добавления ТМ в почву.

2. На почве, содержащей 300 мкМ ацетата кадмия, было отмечено понижение накопительных свойств трансгенных растений при инокуляции их штаммом бактерий дикого типа на 60% по сравнению с неинокулированными растениями. В нетрансгенных растениях содержание кадмия оставалось без изменений, как и в растениях, выращиваемых без ризобий (рис. 12).

Проведенные ранее эксперименты на бобовых растениях показали, что инокуляция ризобиями может снижать накопление в растениях тяжелых металлов. (\¥аш й а1., 2007, 2008). Вероятным механизмом такого влияния называется адсорбция ТМ бактериями (МатагП ег а1., 1997). Различные микроорганизмы могут связывать ионы металлов поляризованными группами клеточной стенки или капсулы (фосфатными, карбоксильными, гидроксильными и аминогруппами). Таким образом, возможно, ризобии, прикрепляясь к корням растений, трансгенных по р$1, могли препятствовать попаданию ТМ в растения.

Рис. 12. Содержание кадмия в растениях, выращенных на почве с добавлением 300 мМ ацетата кадмия.

3. При инокуляции растений штаммом, несущим псевдофитохелатиновый ген, количество кадмия в растениях значительно возрастало (рис. 12). В нетрансгенных растениях кадмия было в 2,7 раз больше по сравнению с растениями, выращиваемыми без инокуляции, а в растениях, трансгенных по гену лектина - в 3,4 раза. По сравнению с нетрансгенными растениями, в табаках с геном рэ1 содержание кадмия было больше на 31%.

Эти данные могут свидетельствовать о том, что комплексы, которые кадмий образует с псевдофитохелатинами, экскретируются в окружающую среду, что способствует накоплению кадмия в растениях.

4. Измерения сырой массы растений показали, что при выращивании растений в почве без добавления кадмия, инокуляция ризобиями оказывает положительное влияние на этот параметр (рис. 13). Масса контрольных растений при инокуляции контрольными и трансгенными по pph ризобиями увеличивалась на 51%. Масса же трансгенных по psl растений увеличивалась на 55% при инокуляции контрольными ризобиями и на 71% при обработке ризобиями, трансгенными по pph. Ранее в нашей лаборатории проводились эксперименты по изучению загрязнения субстрата кадмием на симбиоз козлятника восточного с Rhizobium galegae (Губайдуллин и др., 2005). Было выяснено, что добавление в почву следового количества кадмия стимулирует рост растений. Возможно, инокуляция растений бактериями, вырабатывающими псевдофитохелатин, оказывает на растения табака, трансгенные по psl, такое же влияние.

При выращивании растений на почве с добавлением кадмия, значимых отличий между различными комбинациями растений и бактерий обнаружено не было. Эти результаты так же согласуются с данными Ike (2007), где обработка растений астрагала накапливающими ТМ ризобиями не влияла на рост растений при выращивании их в среде с кадмием.

Рис. 13. Влияние инокуляции ризобиями на массу растений табака при выращивании на почве с добавлением и без добавления ацетата кадмия.

Таким образом, улучшенная колонизация ризобиями корней, трансгенных по р.?/ растений табака, способствует снижению количества в них кадмия, что может найти применение в защите растений от негативного воздействия ТМ. А использование ризобий, трансформированных генетическими конструкциями с псевдофитохелатиновым геном, наоборот, ведет к накоплению тяжелых металлов в растениях, что дает возможность использования данных симбиотических систем в фиторемедиации.

5. Создание векторных конструкций с геном лектина под контролем корнеспецифичного промотора КВ7.

К числу часто используемых корнеспецифичных промоторов относится ЯВ7. Он был выделен из растений табака и является промотором гена аквапорина -белка мембранного канала (УататоЮ еХ а1., 1991). Методом промотор-делеционного анализа (СопсНп§ й: а1., 1995) было показано, что наибольшей экспрессионной активностью обладает вариант данного промотора размером 713 п.н. (Ш37/1), а у варианта размером 1385 п.н. (Ш37/2) была зафиксирована наибольшая разница между экспрессией в корнях и листьях. Для клонирования в векторе рСатЫа 1281 г и проверки тканеспецифичности было решено взять оба этих участка промотора ЯВ7.

Клонирование двух вариантов промотора ЛВ7 в векторе рСатЫа 12812 Были подобраны специфичные праймеры к двум делеционным вариантам промотора Ш37 (рис. 14). Данные участки амплифицировали с геномной ДНК табака и провели их секвенирование. Полученные последовательности нуклеотидов оказались идентичными последовательности для данного промотора в базе данных ТМСВ! (ОепВапк: 845406.1).

КБ 7.2

5'

1878 п.н.

КВ7/1

Рис. 14. Расположение праймеров, подобранных к двум вариантам промотора 11В7.

Оба варианта промотора клонировали в векторе рАЬ-ТА, а затем вырезали по сайту £соЮ и субклонировали в векторе рСатЫа 12812, содержащем полилинкер перед маркерным геном gus, для оценки тканеспецифичности (рис. 15). Плазмидными конструкциями с промоторами обоих типов методом электропорации трансформировали бактерии А. Шт1/аЫет АИД которые затем использовали для получения трансгенных растений табака.

CaMV 35S оголіоіег

HYG(Rj|

pCambia1281Z

Rb7 promoter

CaMV 35S promote^'

HYG(R)

Rb7 promoter

V

pCambia1281Z

Рис. 15. Клонирование промотора RB7 в плазмиде pCambia 1281Z.

Проверка специфичности функционирования вариантов промотора RB7в трансгенных растениях табака

Растения получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок табака (Horsh and Fry, 1985). После выращивания растений-регенерантов в течение месяца был проведен их гистохимический анализ (табл. 3).

Было обнаружено, что промотор RB7/2, обладает более высокой тканеспецифичностью по сравнению с более коротким вариантом данного регуляторного элемента, поскольку в части растений, полученных с использованием промотора RB7/2, gus-окрашивание наблюдалось только в корнях. В связи с этим именно вариант RB7/2 был использован для дальнейших экспериментов.

Количество полученных трансгенных растений табака

Таблица 3

Вариант Всего Gus+

промотора получено Всего Только Корни и Корни, стебли,

RB7 растений корни стебли листья

RB7/1 13 9 0 0 9

RB7/2 19 16 5 4 7

Клонирование гена рэ1 под контролем промотора К В 7/2 в векторе рСатЬіа 1301

Промотор ЇШ7/2 был вырезан по сайту рестрикции Есо^Л из плазмиды рАЬ-ТА, после чего встроен по тому же сайту в плазмиду рСатЬіа 1301. Был подобран праймер роїуА к сайту полиаденилирования гена ряі, ранее клонированного в плазмиде рВІиезсгірІ:. С помощью праймеров роїуА и Іесґог кодирующая область гена рэ1 была амплифицирована вместе с сайтом полиаденилирования и встроена в плазмиду рСатЬіа 1301 по сайту рестрикции Бта\ (рис. 16).

Рис. 16. Клонирование гена под контролем промотора ЮЗ 7/2 в плазмиде рСашЬіа 1301.

ПЦР-анализ подтвердил наличие, а также правильность порядка и ориентации кодирующей и регуляторных частей гена в собранной конструкции (рис. 17).

1 2 3 4 М

Рис. 17 Электрофореграмма продуктов ПЦР фрагментов конструкции рСатЫа 1301 -Ю37/2-рз1-ро1уА: 1) ген рэ1; 2) /м7 + ро1уА; 3) 11В7/2 +рБ1 + ро1уА; 4) отрицательный контроль без генетического материала; М) 100 Ьр+1.5 КЬ+3 КЬ ДНК маркер (ЗШепгут, Россия).

Полученной плазмидой трансформировали бактерии А. Шт1/ас1ет АйЬО, которые затем использовали для получения трансгенных растений табака.

Получение растений табака, экспрессирующих ген лектина под управлением промотора ИВ7/2

Для того чтобы выявить экспрессию гена лектина была проведена ОТ-ПЦР. РНК отдельно выделяли из листьев и из корней четырех трансгенных растений и одного контрольного (Р2 растений трансформированных плазмидой рСатЫа 1305.1). Было показано, что у всех опытных растений мРНК генарз1 присутствует только в корнях (рис. 18). Таким образом, данный промотор является хорошим инструментом для обеспечения направленной экспрессии различных генов в

корневой системе растений. Получение растений, у которых продукт целевого гена будет накапливаться только в строго определенных органах, является перспективным подходом для создания симбиотических систем, которые в дальнейшем могут найти применение в сельском хозяйстве.

Рис. 18. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР гена р.ч1 под контролем промотора Ю37/2: 1-4)трансгенные растения; 5) контрольное растение; л-листья, к-корни; 6) положительный контроль ПЦР; 7) отрицательный контроль без генетического материала; М) 100 Ьр+1.5 КЬ+3 КЬ ДНК маркер (Эйепгут, Россия).

Таким образом, нами были проведены эксперименты по созданию искусственных симбиотических ассоциаций небобовых растений с клубеньковыми бактериями Я. legитгпояагит, а также исследованы возможности их практического применения. Обнаружено значительное увеличение количества адгезировавшихся ризобий на трансгенных по рз/ корнях томатов, что при использовании штаммов с фунгистатической активностью, может способствовать защите растений от фитопатогенов. Было исследовано накопление кадмия в симбиотической системе, включающей растения табака, трансгенные по ря1 и ризобии с псевдофитохелатиновым геном (ррН). Получены растения табака, экспрессирующие ген рз1 под управлением корнеспецифичного промотора ЯВ7. Разработанный нами подход к созданию искусственных симбиозов с использованием генов лектинов в качестве трансгенов может быть использован в различных отраслях сельского хозяйства, а также как инструмент для фиторемедиации.

ВЫВОДЫ

1. Получены флуоресцентно меченые штаммы ризобий ЯЫгоЫит 1е&иттозагит, Я. ¡горю, Я. galegae и БтогЫгоЫит теШоИ, вступающих в симбиоз с дикорастущими и культурными видами бобовых растений.

2. Исследование колонизации трансгенных по гену рэ1 корней томата флуоресцентно меченым штаммом Я. иттозагит 1078 показало, что количество бактерий, адгезированных на трансгенных корнях после 1 суток инкубации, было на порядок больше по сравнению с контролем, и подобное соотношение сохранялось через месяц выращивания растений в почве.

3. В коллекции микросимбионтов дикорастущих бобовых растений трибы Viceae, обнаружены штаммы R. leguminosartim, Pseudomonas sp. и Stenotrophomonas rhizophila, обладающие фунгистатической активностью в отношении фитопатогенов Fusarium solani, F. oxysporum, Fusarium sp. и F. oxysporum f. sp. lycopersici. Максимальная антагонистическая активность выявлена у штамма R. leguminosarum по отношению к F. oxysporum f. sp. lycopersici.

4. Обнаружено, что колонизация корней томата, трансгенных по гену psl бактериями R. leguminosarum с фунгистатической активностью может способствовать защите растений от фитопатогенных грибов.

5. Показано, что штамм бактерий R. leguminosarum 1078, содержащий псевдофитохелатиновый ген, более устойчив к высоким концентрациям кадмия в среде. Колонизация данными ризобиями корней растений табака, трансгенных по гену psl приводила к накоплению кадмия в таких растениях в несколько раз больше по сравнению с неинокулированными трансгенными и на 30% больше по сравнению с инокулированными контрольными растениями. Обработка трансгенных по psl растений штаммом ризобий дикого типа, напротив, приводила к уменьшению количества в них кадмия по сравнению с неинокулированными растениями.

6. С использованием вектора pCambia 1281Z получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген gus под двумя вариантами корнеспецифичного промотора RB7. Выявлено, что более высокой тканеспецифичностью характеризуется вариант промотора длиной 1358 п.н. На трансгенных растениях табака показана тканеспецифичность экспрессии гена psl под управлением данного варианта промотора.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Баймиев, Ан.Х. Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro.l Ан.Х.Баймиев, Р.С.Ямиданов, Р.Т.Матниязов, Д.К.Благова, Ал.Х.Баймиев, А.В.Чемерис // Молекулярная биология. -2011. - Т. 45. - № 6. - С.984-991.

2. Баймиев, Ан.Х. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с чиной весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh / Ан.Х.Баймиев, К.Г.Птицын, Д.К.Благова, А.А.Мулдашев, Ал.Х.Баймиев // Микробиология. 2011. - Т. 80. - №1. - С. 100-104.

3. Вершинина, З.Р. Биоинженерия симбиотических систем: создание новых ассоциативных симбиозов с помощью лектинов на примере табака и рапса / З.Р. Вершинина, Ан.Х.Баймиев, Д.К.Благова, А.В.Князев, Ал.Х.Баймиев, А.В.Чемерис // Прикладная биохимия и микробиология. - 2011. - Т. 47. - №3. - С. 336-342.

4. Vershinina, Z.R. Lectins as a factor that allows the nonlegume plant to form associative symbiosis with rhizobia / Z.R.Vershinina, A.K.Baymiev, D.K.Blagova, O.V.Chubukova, A.K.Baymiev, A.V.Chemeris. // Proceedings of World Academy of Science, Engineering and Technology. - 2011- V. 60. - P. 1622-1623.

5. Vershinina, Z.R.Artificial Colonization of Non-symbiotic Plants Roots with the Use of Lectins / Z.R.Vershinina, An.K.Baymiev, D.K.Blagova, O.V.Chubukova, Al.K.Baymiev, A.V.Chemeris// Symbiosis. - 2012. - V. 56. - N.l. - P. 25-33.

6. Вершинина, З.Р. Лектины как инструмент для биоинженерии симбиотических систем / З.Р.Вершинина, Д.К.Благова // Материалы XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Москва. -2010. - Том I, подсекция 1. Стендовый доклад.

7. Благова, Д.К. Плазмидный состав штаммов клубеньковых бактерий, нодулирующих чину весеннюю Lathyrus vermis (I.) bernh / Д.К.Благова, А.Х.Баймиев // Материалы V всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» Саратов. -2010. -С. 21.

8. Благова, Д.К. Конструирование обладающей полезными свойствами «искусственной ризосферы» у несимбиотрофных видов культурных растений / Д.К.Благова // Материалы XVIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва. -2011. - Том I, подсекция 1.

9. Благова, Д.К. Трансгенные бородатые корни как модель для анализа ассоциативных симбиотических реакция томата с ризобиями / Д.К.Благова, З.Р.Вершинина, Ан.Х.Баймиев // Материалы международной конференции «Актуальные проблемы' науки». Тамбов. -2011. -С.26-27.

Ю.Благова, Д.К. «Химерные» растения томата с корнями, экспрессирующими ген лектина гороха и их колонизация клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum / Д.К.Благова, З.Р.Вершинина//Материалы II школы-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика - наука XXI века» Уфа -2011. -С.20-21.

П.Благова, Д.К. Трансгенные растения табака с геном psl под контролем корнеспецифичного промотора / Д.К.Благова // Материалы XIX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2012". Москва. 2012. -Том 1, подсекция 1.

12.Благова, Д.К. Поиск штаммов, обладающих фунгицидной активностью среди бактерий, ассоциированных с корнями дикорастущих бобовых растений / Д.К.Благова, Л.Р.Нигматуллина // Материалы всероссийской конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия растений и микроорганизмов с окружающей средой". Саратов. -2012. -С. 102.

13.Благова, Д.К. Колонизация корней трансгенных растений ризобиями с фунгицидной активностью / Д.К.Благова, Л.Р.Нигматуллина, А.М.Оркодашвили // Материалы III школы-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика-наука XXI века». Уфа. -2012. -С. 19-20.

14.Благова, Д.К. Устойчивость ассоциативных ризобиальных симбиотических систем к воздействию тяжелых металлов и перспективы их применения в фиторемедиации / Д.К.Благова, Б.Н.Постригань, В.В.Федяев // Материалы всероссийской конференции «Инновационные направления современной физиологии растений». Москва. -2013.

Отпечатано с готового оригинал — макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г.Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ №11. Подписано в печать 16.05.2013г. Формат 60x841/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 01,50. Уч.-изд. л. 0,98. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Благова, Дарья Константиновна, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра

Российской академии наук

П47П11ЧЯ91 ( тт

- - - — На правах рукописи

Благова Дарья Константиновна

ИСКУССТВЕННЫЕ АССОЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ

ктговшм ЬЕвимтозля им

С КОРНЯМИ ТОМАТА И ТАБАКА, ТРАНСГЕННЫМИ ПО ГЕНУ РЯЬ ЛЕКТИНА ГОРОХА

03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Баймиев Алексей Ханифович

уфа-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение........................................................................................................................................................................5

Глава 1 Обзор литературы............................................................................................................................9

1.1. Бактерии семейства ЯШгоЫасеае как РОРЯ и возможности их применения..................................................................................................................................................................9

1.1.1. Прямые механизмы влияния ризобий на рост растений......................................10

1.1.2. Контроль фитопатогенов..................................................................................................................15

1.1.3. Защитное действие ризобий при загрязнении почв тяжелыми металлами и использование их в биоремедиации........................................................................................................................................................19

1.1.4. Колонизация ризобиями корней небобовых растений и методы ее улучшения..................................................................................................................................................................22

1.2. Лектины бобовых растений и их роль в азотфиксирующем симбиозе......................................................................................................................................................................26

1.3. Растения, трансгенные по генам лектинов бобовых

растений........................................................................................................................................................................30

Глава 2. Материалы и методы....................................................................................................................33

2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и

векторы............................................................................................................................................................................33

2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении

ПЦР....................................................................................................................................................................................33

2.3. Реактивы и материалы............................................................................................................................34

2.4. Составы использованных стандартных водных растворов....................................36

2.5. Методы исследований............................................................................................................................37

2.5.1. Выделение и очистка ДНК растений....................................................................................37

2.5.2. Выделение и очистка РНК растений....................................................................................37

2.5.3. Синтез кДНК..................................................................................................38

2.5.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК..............................................................................38

2.5.5. Полимеразная цепная реакция....................................................................................................41

2.5.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами......................................42

2.5.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК..........................................................................43

2.5.8. Подготовка компетентных клеток Е. coli........................................................................43

2.5.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК................44

2.5.10. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом... 45

2.5.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей......................45

2.5.12. Приготовление электрокомпетентных клеток Agrobacterium sp..............45

2.5.13. Электропорация компетентных клеток Agrobacterium sp................................46

2.5.14. Получение композитных растений......................................................................................47

2.5.15. Анализ ß-глюкуронидазной (gus) активности............................................................48

2.5.16. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака............49

2.5.17. Оценка антагонистической активности бактерий..................................................50

2.5.18. Проверка штаммов бактерий на синтез сидерофоров........................................51

2.5.19. Проверка штаммов бактерий на синтез цианида (HCN)..................................51

2.5.20. Обработка «бородатых корней» микросимбионтами на томатах, микроскопирование и оценка количества адгезированных на корнях бактерий........................................................................................................................................................................51

2.5.21. Совместная обработка растений патогенным грибом Fusarium oxysporum f.sp lycopersicum и бактериями R. leguminosarum 116..............................52

2.5.22. Определение содержания кадмия в растениях табака........................................53

Глава 3. Результаты и обсуждение........................................................................................................55

3.1. Получение флуоресцентно меченых штаммов ризобактерий............................55

3.2..Получение трансгенных бородатых корней на растениях томата и

анализ их колонизации клубеньковыми бактериями R. leguminosarum..............57

3.3. Изучение защитных свойств ризобий при заражении растений

патогенными грибами........................................................................................................................................62

3.3.1. Поиск штаммов бактерий обладающих фунгистатической активностью................................................................................................................................................................62

3.3.2. Идентификация бактерий методом секвенирования гена 16S рРНК... 63

3.3.3. Исследование синтеза бактериями фунгистатических метаболитов... 65

3.3.4 Совместная обработка растений Т7. охуарогит /лр. \ycopersici и Я. ¡е^иттоБагит 116...................................................................... 67

3.4. Изучение влияния ризобий на растения табака при загрязнении почвы кадмием..................................................................................... 70

3.3.1. Получение штаммов ризобий с псевдофитохелатиновым геном........ 70

3.4.2. Влияние ризобий на содержание кадмия в растениях табака............ 73

3.5. Создание векторных конструкций с геном лектина под контролем корнеспецифичного промотора ЯВ7.................................................. 77

3.5.1. Клонирование двух вариантов промотора КВ7 в векторе рСатЫа 1281 Ъ........................................................................................ 78

3.5.2. Проверка специфичности промотора в трансгенных растениях

табака........................................................................................ 80

3.5.3. Клонирование гена рз1 под контролем промотора Ш37/2 в векторе рСатЫа 1301.............................................................................. 81

3.5.4. Получение растений табака, экспрессирующих ген лектина под управлением промотора ЯВ7/2. 82

Заключение................................................................................. 84

Выводы...................................................................................... 87

Список сокращений и условных обозначений...................................... 89

Список литературы....................................................................... 90

Введение

Актуальность: В настоящее время важной задачей является увеличение эффективности использования аграрных ресурсов без ущерба для окружающей среды. Одним из возможных подходов для развития экологически-ориентированного земледелия может стать использование ростостимулирующих ризобактерий (Plant growth promoting rhizobacteria - PGPR). Исследования этой перспективной группы почвенных микроорганизмов вызывают большой интерес, как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. Обнаружены штаммы PGPR, способные улучшать рост и урожайность растений, защищать их от фитопатогенов и негативного воздействия окружающей среды (Dimkpa, 2009; Pliego et al., 2011; Glick, 2012).

К хозяйственно полезным видам PGPR в числе прочих относятся ризобии -почвенные грамм-отрицательные бактерии, способные вступать в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями. Хотя ризобии способны вступать в эндосимбиоз, за редким исключением, только с бобовыми растениями, существуют работы, выявляющие их потенциал в качестве ассоциативных микросимбионтов для небобовых культур (Mishra et al., 20 06; Mehboob et al., 2012; Ashraf, 2013). Однако в естественных условиях искусственно интродуцированные ризобии с полезными признаками часто не выдерживают конкуренции и вытесняются более агрессивными микроорганизмами.

Для улучшения колонизации ризобиями корней небобовых растений и создания более стабильных ассоциативных симбиозов применяются различные методы, в том числе, получение трансгенных растений, синтезирующих вещества, участвующие в сигналинге на ранних этапах бобово-ризобиального симбиоза (Sreevidya et al., 2006; Li et al., 2011; Tirichine, 2012). Одними из таких веществ являются лектины - секретируемые белки, способные узнавать и избирательно связывать разнообразные углеводы. Они связываются с полисахаридами на клеточных стенках ризобий, тем самым фиксируя микроорганизмы на поверхности корневых волосков и вызывая у них перестройки, значимые для

формирования симбиоза (Карпунина и др., 2002; Садовникова и др., 2003; De Hoff et al., 2009).

Ранее в нашей лаборатории была исследована возможность использования лектинов для модификации процессов узнавания бобовыми растениями симбиотических партнеров и создания ассоциаций между ризобиями и такими небобовыми растениями как облепиха, рапс и табак (Вершинина, 2010). Дальнейшим направлением исследований, представленных в данной работе, стало изучение характеристик искусственных симбиотических ассоциаций между небобовыми растениями, трансгенными по гену лектина гороха {psl) и ризобиями, обладающими различными полезными свойствами, с точки зрения их возможного практического применения.

Целью данной работы являлось создание искусственных ассоциаций клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями, трансгенными по гену psl лектина гороха, и исследование их свойств. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Получить маркированные флуоресцентными белками штаммы клубеньковых бактерий для их детекции in vivo и in vitro;

2. Исследовать возможность и характер колонизации ризосферы растений табака и томата, трансгенных по гену psl, флуоресцентно меченым штаммом клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum;

3. Изучить влияние колонизации ризобиями трансгенных по гену psl корней растений на их устойчивость к фитопатогенам (на примере возбудителей корневой гнили);

4. Исследовать возможность использования ассоциаций трансгенных по psl растений с ризобиями, вырабатывающими псевдофитохелатин, для биоремедиации земель, загрязненных кадмием;

5. Создать векторные конструкции с геном psl под контролем корнеспецифичного промотора RB7 и испытать специфичность экспрессии данного гена в растениях табака.

Научная новизна работы

Исследована возможность колонизации ризосферы томатов флуоресцентно меченым штаммом ризобактерий. Обнаружены штаммы бактерий с антагонистической активностью против фитопатогенных грибов рода Fusarium

среди изолятов из клубеньков дикорастущих бобовых растений Республики Башкортостан (РБ). Впервые получены ризобии, трансгенные по псевдофитохелатиновому гену, более устойчивые к большим концентрациям кадмия в почве, проанализировано их влияние на накопление кадмия растениями табака. На основе вектора рСатЫа 1301 созданы генетические конструкции, содержащие ген лектина гороха /л?/ под управлением корнеспецифичного промотора 11В7.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о возможных положительных эффектах при использовании лектина гороха как инструмента для создания ассоциативных симбиотических систем небобовых растений. Найденные штаммы бактерий с антагонистической активностью в отношении фитопатогенов могут стать основой для получения биопрепаратов, защищающих растения от болезней. Симбиотические системы с трансгенными по лектину растениями и ризобиями, продуцирующими псевдофитохелатин могут использоваться в фиторемедиации. Полученная генетическая конструкция, содержащая корнеспецифичный промотор, может использоваться для создания трансгенных растений с тканеспецифичной экспрессией целевого гена.

Положения, выносимые на защиту:

1. Искусственные ассоциации несимбиотрофных растений, трансгенных по генам лектинов бобовых, со штаммами бактерий, обладающими фунгистатической активностью, позволяют усилить защиту корневой системы растений от фитопатогенных грибов.

2. Улучшенная колонизация ризобиями корней трансгенных по растений табака может способствовать снижению содержания в них кадмия при выращивании на почве, загрязненной данным металлом. Использование в этих же условиях ризобий, экспрессирующих псевдофитохелатиновый ген ведет к накоплению тяжелых металлов в растениях.

3. Использование тканеспецифичного промотора КВ7 позволяет добиться экспрессии генов лектинов бобовых исключительно в корневой системе несимбиотрофных растений.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов-2010), международной конференции «Актуальные проблемы науки» (Тамбов, 2011), 2 и 3-й школе-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской конференции «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 23 рисунка, 5 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 256 работ.

Конкурсная поддержка работы. Данная работа проводилась при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы» (Госконтракт 16.740.11.0671, Соглашение 8115), РФФИ (Соглашения 12-04-31277, 12-04-31284).

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Бактерии семейства Rhizobiaceae как PGPR и возможности их

применения

В настоящее время ризосферу определяют как слой почвы, окружающий корни растений, физические, химические и биологические свойства которого могут изменяться под воздействием роста и активности корней (McCully, 2005). Ризосфера характеризуется большим содержанием бактерий, которых может быть в 10 - 1000 раз больше, чем в остальной почве, поскольку корни растений выделяют различные вещества, служащие питательным субстратом для почвенных микроорганизмов. Зачастую такие бактерии образуют на корнях микроколонии. Ризосферные бактерии, обладающие совокупностью полезных для растений свойств, принято обозначать как PGPR (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризобактерии, способствующие росту растений) (Kloepper et al., 1980). Исследования этой перспективной для практического использования группы микроорганизмов вызывают большой интерес. За последнее время к PGPR было отнесено множество видов бактерий из различных родов, наиболее широко из которых изучены Azospirillum (Bashan et al., 2004), Pseudomonas (Kloepper et al., 1980; Cattelan et al., 1999; Adesemoye and Ugoji 2009), Bacillus (Probanza et al., 2001; Recep et al., 2009), Burkholderia (Joo et al., 2009).

Ризобии - почвенные грамм-отрицательные бактерии семейства Rhizobiaceae, включающего такие роды как Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium и Sinorhizobium. Они способны фиксировать атмосферный азот и вступать в симбиоз с бобовыми растениями, образуя на их корнях клубеньки. Данный симбиоз является специфичным, и каждый вид бобовых растений способен нодулироваться лишь ограниченным количеством видов бактерий. Инокуляция ризобиями бобовых растений широко применяется в сельском хозяйстве для увеличения эффективности усвоения растениями азота,

что в свою очередь приводит к повышению их урожайности (Тихонович, Круглов, 2006).

Несмотря на то, что в последнее время достигнут определенный прогресс в создании азотфиксирующих симбиотических систем небобовых растений с ризобиями, такие системы продолжают оставаться нестабильными, и их получение сопряжено с определенными трудностями. Однако было обнаружено, что некоторые штаммы ризобий способны вступать с небобовыми растениями (в основном, однодольными) в ассоциативный симбиоз. При этом они также оказывают положительное воздействие на растения. Высокая генетическая вариабельность, большое разнообразие штаммов и безвредность для растений делают ризобии перспективной группой РОРЯ.

1.1.1 Прямые механизмы влияния ризобий на рост растений

Механизмы улучшения бактериями роста растений условно делят на прямые и косвенные. К первым относится синтез бактериями ростостимулирующих соединений и облегчение усвоения растениями различных питательных веществ из окружающей среды (ОНск, 1995). Наиболее часто встречающимися механизмами такого типа являются фиксация атмосферного азота, продуцирование гормоноподобных соединений и растворение фосфатов (АзЬгаГ, 2013).

Несимбиотическая фиксация азота является одной из наиболее значимых черт РОРЯ, и некоторые исследователи полагают, что ризобии способны фиксировать азот и в ассоциативном симбиозе с небобовыми растениями. Например, 8аЬгу (1997) выявил высокий уровень нитрогеназно�