Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений как детерминанта специфичности взаимодействия с клубеньковыми бактериями
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Структура углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений как детерминанта специфичности взаимодействия с клубеньковыми бактериями"
□□3058371 #а правах рукописи
БАИМИЕВ АЛЕКСЕИ ХАНИФОВИЧ
СТРУКТУРА УГЛЕВОДСВЯЗЫВАЮЩИХ УЧАСТКОВ ЛЕКТИНОВ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ КАК ДЕТЕРМИНАНТА СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ
03 00 12 - физиология и биохимия растений 03.00 03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Уфа - 2007
003058371
Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук
Научный консультант
доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор Хайруллин Рамиль Магзинурович
доктор биологических наук, профессор Киселев Сергей Львович
доктор биологических наук, профессор Киреева Наиля Ахняфовна
Ведущая организация
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Защита состоится " 30 " мая 2007 г в_часов
на заседании диссертационного совета Д212013 11 при Башкирском государственном университете
Адрес 450074, г Уфа, ул Фрунзе, 32, биологический факультет БГУ
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета
Автореферат разослан " " _ _2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета, д б н , проф
Кузяхметов Г Г
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Усвоение атмосферного азота клубеньковыми микроорганизмами рода ЮпхоЬшт в симбиозе с бобовыми растениями во всем мире является объекгом пристального внимания ученых разных специальностей Изучение механизма образования подобного симбиоза, факторов специфичности, определяющих возможность формирования азотфиксирующих клубеньков штаммом ризобий на конкретном растении, имеет вместе с теоретическим также и огромный практический интерес. Одним из критических моментов становления бобово-ризобиального симбиоза является стадия взаимного "узнавания" микроорганизма и растения-хозяина. Этот процесс характеризуется сложным обменом сигналами между макро- и микросимбионтом в ризосфере растения-хозяина еще до инвазии клубеньковых бактерий Несомненно, что в данный процесс вовлечены лектины бобовых, которые, как показано, могут обеспечивать избирательные взаимодействия растений с ризобиями благодаря своим углеводсвязывающим свойствам (Вп11 й а1, 2004) В литературе содержатся сведения о расшифрованных последовательностях аминокислот лектинов бобовых, представленных преимущественно видами из различных родов тропических растений, произрастающих в разных географических регионах и обычно имеющих довольно широкий круг способных их инфицировать бактериальных микросимбионтов. Значительно больший интерес для изучения формирования специфичности азотфиксирующих симбиозов представляет выяснение строения лектинов бобовых растений умеренного климата, характеризующихся строгой специфичностью по отношению к своим ризобиальным партнерам.
Знания о ключевых аминокислотах углеводсвязывающего участка, закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, могут быть использованы в моделировании белков с новыми и заданными углеводсвязывающими свойствами Заменяя функционально значимые аминокислоты или области углеводсвязывающих участков можно создавать лектины с заданной специфичностью к сахаридам (а, следовательно, и физиологическими функциями), которые можно применять для решения целого ряда задач в том числе в области биотехнологии, таких как получение высокоочищенных углеводов, создание биочипов и т д Кроме этого, возможно,
что создание модифицированных или гибридных лектинов заметно облегчит исследование их роли в становлении бобово-ризобиального симбиоза
Интродукция чужеродных лектинов в другие бобовые растения может способствовать расширению группы клубеньковых бактерий, из которых макросимбионт в данных почвенно-климатических условиях сможет выбрать наилучшего партнера для симбиоза Это, в конечном счете, должно привести к более высокому уровню азотфиксации и, соответственно, к увеличению урожайности сельскохозяйственных культур
Эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов, позволяют оценивать роль этих белков, однако такого рода исследования довольно сложны и, кроме того, процедура трансформации бобовых растений представляет собой достаточно трудоемкий процесс Один из вариантов решения данной проблемы заключается в изучении симбиотической роли лектинов при экзогенной обработке ими растений и микроорганизмов Так, удобным инструментом для подобных исследований являются лектины бобовых, полученные с применением прокариотических экспрессионных систем Такие системы позволяют нарабатывать сконструированные гибридные лектины с заданными свойствами для исследования функционально значимых углеводсвязывающих областей, определяющих возможность формирования бобово-ризобиальных отношений
Цель работы заключалась в выявлении закономерностей строения углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений умеренного климата, создании на их основе гибридных лектинов и исследовании роли гибридных лектинов в становлении бобово-ризобиального симбиоза.
Задачи исследования 1 Амплификация, клонирование и секвенирование фрагментов генов лектинов
бобовых растений умеренного климата; 2. Анализ нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектинов, включающих углеводсвязывающий участок исследуемых видов бобовых растений,
3 Исследование взаимосвязи между строением углеводсвязывающего участка лектинов, их специфичностью к простым сахарам и таксономическим составом ризобий, вступающих в симбиоз с бобовым растением, несущим данный белок,
4 Конструирование гибридных лектинов с измененной специфичностью к углеводам на основе полноразмерного гена лектина гороха, путем замещения углеводсвязывающего участка этого белка гомологичными участками генов лектинов других бобовых растений,
5 Подбор условий для экспрессии гибридных генов лектинов в клетках Е coli, синтез и выделение функционально активных белков;
6 Исследование углеводсвязывающих свойств гибридных лектинов,
7 Исследование филогении и генетического разнообразия клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз со взятыми в исследование видами бобовых растений,
8 Разработка методов идентификации и паспортизации штаммов клубеньковых бактерий,
9. Оценка влияния природных и гибридных лектинов на становление симбиоза бобовых растений с различными ризобиями Научная новизна. Клонированы и секвенированы участки генов лектинов, кодирующие углеводсвязывающие последовательности (УСП) данного белка у 22 видов бобовых растений, относящихся к 17 родам На основании сравнительного анализа секвенированных нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных последовательностей лектинов построены древа сходства данных белков Выведена консенсусная последовательность Asp-Tre-Phe-Xxx-Asx-Xxx-Xxx-Trp-Asp-Pro-Xxx-Xxx-/«i/De/-Arg-His УСП лектинов бобовых растений умеренного климата У представителей рода Caragana обнаружено три класса различных генов лектина, причем внутри каждого из классов выявлен ряд генов, кодирующих более близкие лектины Существенно отличающиеся друг от друга гены лектинов секвенированы и у солодки голой. Показано, что гены одного класса лектинов разных растений могут быть филогенетически ближе, чем гены лектина разных классов у одного и того же вида растений. У клеверов Trifolium repens, Т pratense и Т trichocephalum, входящих в одну группу перекрестной инокуляции, секвенированы фрагменты генов лектинов, имеющие разные по аминокислотной последовательности УСП
Показано, что УСП лектинов, специфичных к одному и тому же моносахариду, могут существенно отличаться по последовательности и составу включенных в процесс связывания сахара аминокислот Обнаружено, что растения, вступающие в симбиоз с одними и теми же ризобиями, содержат
лектины со схожим строением УСП и сходной специфичностью к простым сахаридам. В УСП лектинов растений, входящих в одну группу инокуляции, показано наличие консервативных аминокислот, характерных только для данной группы лектинов бобовых
Установлено, что лектины близких видов растений козлятников восточного и лекарственного, вступающих, тем не менее, в симбиоз с разными биоварами клубеньковых бактерий Rhizobium galegae (bv orientalis и bv officinalis, соответственно), значительно различаются при высокой гомологии Nod-факторов их ризобий Данный факт можно рассматривать как свидетельство в пользу независимого влияния этих двух факторов специфичности на формирование бобово-ризобиального симбиоза Показана генетическая удаленность штаммов R. galegae, нодулирующих козлятник восточный, от штаммов, вступающих в симбиоз с козлятником лекарственным
С помощью специально разработанной оригинальной методики сайт-направленного мутагенеза созданы уникальные химерные конструкции, кодирующие полноразмерный лектин гороха Pisum sativum (PSL) с углеводсвязывающим участком, замещенным на таковые лектинов растений клевера лугового Trifolium pratense (psl/tpl), эспарцета песчаного Onobrychis arenaria (psl/оаГ), донника белого Melilotus albus (psl/mal) и астрагала солодколистного Astragalus glycyphyllos (psl/agl). Показано, что синтезируемые в клетках Е coll гибридные лектины способны связывать сахариды и вызывать агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их пространственной укладки и ассоциации субъединиц Замещение УСП лектина гороха на УСП лектинов М albus и A glycyphyllos привело к изменению специфичности к моно- и дисахаридам, что свидетельствует о формировании углеводсвязывающим пептидом лектинов аффинности к простым сахаридам Анализ углеводсвязывающих свойств гибридов показал, что специфичный к Man/Glc лектин PSL с участком лектина М albus приобрел слабую аффинность к Gal/GalNAc, а при замещении на таковой A glycyphyllos - к Gal, заметно ослабив аффинность к Man Таким образом, у гибридного белка PSL/AGL обнаружена совмещенная специфичность к Gal и Glc, что нехарактерно для лектинов бобовых растений
Впервые в клубеньках астрагала нутового Astragalus cicer обнаружены бактерии, филогенетически близкие по последовательностям генов 16S рРНК к Agrobacterium tumefaciens strain LAM 14 (GenBank Ac No D13294), а в
клубеньках эспарцета песчаного - к Phyllobacterium trifoln (GenBank Ac. No. AY786080).
Впервые показано, что лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, вызывающие специфические реакции симбиоза При обработке гибридным лектином PSL/AGL бактерий из клубеньков Astragalus cicer (филогенетически близких по генам 16S рРНК к Agrobactenum tumefaciens) в ризосфере люцерны, впервые наблюдали нетипичные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков Это свидетельствует о том, что лектин относится к критическим факторам в данной симбиотической системе
Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о строении молекул лектинов бобовых растений и демонстрируют неоднородность их углеводсвязывающих пептидов, а также способствуют более полному пониманию формирования специфичности данных белков к углеводам и принципов образования групп перекрестной инокуляции бобовых растений. Разработан и запатентован метод цифровой паспортизации микроорганизмов и создания по ним электронных баз данных. Исследована конкурентоспособность используемых в изготовлении промышленных препаратов ризоторфина штаммов ризобий козлятника восточного в почвенно-климатических условиях Башкортостана
Полученные новые сведения о закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, обусловленной их структурными особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с заданными углеводсвязывающими свойствами. Разработанная нами стратегия изменения углевосвязывающих свойств лектинов позволяет моделировать лектины с разнообразной специфичностью, что может найти применение в различных областях биотехнологии Гибридные лектины, полученные нами путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны вызывать симбиотические реакции у бобовых растений. Более того, они расширяют (например, PSL/AGL) специфичность растений к ризобиям, возможно за счет расширения у гибридов специфичности к углеводам. Исследования роли лектинов в бобово-ризобиальном симбиозе, благодаря созданию и использованию в них гибридных лектинов из разных растений с разными углеводсвязывающими свойствами, могут значительно упроститься и стать гораздо информативнее. Кроме того, гены таких гибридных лектинов как
РБЬ/АвЬ, можно интродуцировать в бобовые растения с целью увеличения группы клубеньковых бактерий, из которых растения в данных почвенно-климатических условиях могут выбрать наилучшего партнера для симбиоза, что, в конечном счете, может привести к более высокому уровню азотфиксации и, соответственно, к росту биологической урожайности сельскохозяйственных культур.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Углеводсвязывающие последовательности лектинов бобовых растений умеренного климата имеют консенсусную последовательность Авр-Тге-РЬе-Ххх-А8х-Ххх-Ххх-Тгр-А8р-Рго-Ххх-Ххх-/|и//?е/-Аг§-Н18.
2. Бобовые растения, вступающие в симбиоз с одними и теми же ризобиями, характеризуются близким строением углеводсвязывающих участков лектинов со сходной специфичностью к простым сахаридам
3 В углеводсвязывающих последовательностях лектинов растений, инокулирующихся одними и теми же ризобиями, имеются консервативные, характерные только для данной группы лектинов, аминокислоты
4. Заменяя функционально значимые аминокислоты или области углеводсвязывающих участков, можно создавать лектины с измененной специфичностью к сахаридам
5. Лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, обеспечивающие специфические реакции симбиоза
6 Гибридные лектины, полученные путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны расширять круг перекрестной инокуляции бобовых растений Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 04-04-48884), РФФИ-Агидель (№ 02-04-97903) и грантами Программы поддержки ведущих научных школ РФ (96-15-98061, 00-15-97810, НШ-2217.2003 4; НШ-1003 2006 4)
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на 3-м ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), на Научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета БашГУ (Уфа, 1997), на Конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997), на XI Международном конгрессе Федерации европейского научного общества по
физиологии растений (Варна, Болгария, 1998), на 18-ой международной конференции "1п1ег1ес18" (Портсмут, Великобритания, 1999), на конференции молодых ученых «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), на 6-ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002), на Ш съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 5-ой Европейской конференции по фиксации азота (Норвич, Великобритания, 2002), на XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), на международной конференции «Наука и бизнес Поиск и использование новых биомолекул биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), на международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), на Ш Республиканской научно-практической конференции молодых ученых «Научное и экологическое обеспечение современных технологий» (Уфа, 2006); на международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН (Москва, 2006), на Ш Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006), на IV съезде Общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Пущино, 2006), на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И Алиханяна (Москва, 2006)
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 35 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных БВВ1/ЕМВЬ/ОепВапк
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах, содержит 45 рисунков и 10 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 419 работ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объектами исследования служили бобовые растения умеренного климата, а также некоторые представители тропических видов бобовых горох посевной (Pisum sativum L), мышиный горошек (Vicia cracca L), клевер луговой (Trifolium pratense L), клевер белый (Trifolium repens L), клевер волосистоголовый (Trifolium trichocephalum MBieb), донник белый (Mehlotus albus Medik ), донник лекарственный (Melilotus officinalis (L ) Pall ), люцерна посевная (Medicago sativa L), козлятник восточный (Galega orientalis Lam.), астрагал серпоплодный {Astragalus falcatus Lam.), астрагал солодколистный (Astragalus glycyphyllos L), астрагал нутовый (Astragalus cicer L), остролодочник волосистый (Oxytropis pilosa (L) DC), карагана древовидная (Caragana arborescens Lam ), карагана кустарниковая (Caragana frutex (L ) С Koch), копеечник альпийский (Hedysarum alpinum L), эспарцет песчаный (Onobrychis arenaria (Kit) DC ), дрок красильный (Genista tinctorta L ), аморфа кустарниковая (Amorpha fruticosa L), термопсис Шишкина (Thermopsis schischhnn Czefr ), солодка голая (Glycyrrhiza glabra L ), баугиния кандиканская (Bauhima candicans Benth ), софора японская (Sophora japonica L ), акация белая (Robinia pseudoacacia L ) А также козлятник лекарственный (Galega officinalis L ), проращенный из семян, полученных из коллекции North Central Regional Plant Introduction Station, из следующих географических ареалов Швеция (лот № 75ncai01)(G officinalis 2), Россия (лот № 68ncai01)(G officinalis 3) и Франция (лот № 85ncai01)(G officinalis 4)
В исследованиях информативности методов идентификации ризобий и конкурентоспособности клубенек-образующих штаммов использовали 9 штаммов Rhizobium galegae, полученных из Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (С -Петербург), не отличающихся по основным культурально-морфологическим признакам CIAM 0702, CIAM 0703, CIAM 0704, CIAM 0708, CIAM 0719, CIAM 0720, CIAM 0721, вступающие в эффективный симбиоз с козлятником восточным (Galega orientalis), CIAM 0716, нодулирующий растения козлятника лекарственного (Galega officinalis), и CIAM 0701, нодулирующий как растения козлятника восточного, так и лекарственного, но в обоих случаях не способный фиксировать азот
В работе использованы следующие методы Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями Выделение плазмидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, клонирование амплифицированной ДНК в векторе pBluescnpt П KS (-), подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидной ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их элюцию из легкоплавкой агарозы проводили по прописям, изложенным в лабораторном руководстве Сэмбрука с соавт (Sambrook et al, 1989) Для концевого мечения рестриктазных фрагментов ДНК метили Кленовским фрагментом ДНК полимеразы I с помощью набора «Multipnme» фирмы «Amersham Biosciences» (США) и [а-32Р] дАТФ как рекомендовано поставщиком RAPD-анализ проводили в амплификаторе «Т1 Thermocycler» фирмы «Biometra» (Германия) в течение 25 - 30 циклов при температурах отжига от 32°С до 48°С для разных праймеров. Одноцепочечные матрицы для секвенирования клонированных фрагментов ДНК нарабатывали при помощи хелперного фага М13К07 Секвенирование проводили ферментативным дидезокси-методом Сэнгера (Sanger et al., 1977) Анализ нуклеотидных последовательностей генов пектинов и выведенных на их основе аминокислотных последовательностей белков проводили с помощью компьютерных программ «DNASIS» (Япония), а также пакета компьютерных программ «Lasergene» (США) Наработку целевого белка проводили в штамме Е colt BL2ltrxB(DE3)pLysS Белок элюировали на никелевых колонках «HisTrap» по протоколу фирмы «Amersham Biosciences» (США) Тесты агглютинации лектином проводили в 25 мкл 2%-ного раствора эритроцитов на планшетах с U образными лунками в фосфатном буфере
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и амплификация участка гена лектина у различных представителей бобовых растений. Начало данной работы было связано с поиском зарегистрированных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей лектинов и кодирующих их генов бобовых растений по базам данных 20 выпуска SWISS-PROT и 41 выпуска EMBL Nucleotide Sequence Database, датированных декабрем 1994 года и представленных на компакт-дисках Сравнительный анализ обнаруженных на тот момент 16
аминокислотных и 5 нуклеотидных последовательностей, проведенный с помощью пакета прикладных программ DNASIS фирмы Hitachi Software Engineering, Co., показал определенный уровень их гомологии Для белковых цепей лектинов было выявлено наличие нескольких высококонсервативных участков, практически не отличающихся у сравниваемых видов по последовательностям составляющих их аминокислот. По известным нуклеотидным последовательностям генов лектина гороха посевного, люцерны посевной и акации белой были выведены консенсусные мотивы данных высококонсервативных областей уже на нуклеотидном уровне, к которым были подобраны несколько олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР, с таким расчетом, чтобы продукт амплификации включал последовательности, кодирующие углеводсвязывающий домен данных белков (рис. 1)
1 2
N —► —> __с
* УСП
<4—— <4-
Рис. 1. Схема отжига выбранных олигонуклеотидных праймеров к гомологичным им участкам гена лектина УСП - углеводсвязывающий пептид 1 — 5'-ОАТТТСТССОАСТТТТСАА-3' (Н948), 2 — 5'-ОТТОСАОТТОААТТТО АСАС-3' (Н523), 3 — 5'-ОТвОСТААООАГГСЮТТТС-З' (Н524), 4 — 5'-СТТГ СТТШТСГ1Т1ТСАТТС-3' (Н755)
При помощи различного сочетания подобранных праймеров (Н948+Н524, Н948+Н755, Н523+Н524 и Н523+Н755), проводилась ПЦР-реакция с использованием ДНК ряда бобовых растений, произрастающих на территории Республики Башкортостан, а также нескольких представителей бобовых, проращенных из семян, любезно предоставленных к.б н В И Сафроновой (ВНИИ СХМ, Санкт-Петербург), а также выписанных из различных ботанических садов При анализе образовавшихся ПЦР-продуктов у разных растений наблюдалось от одной до нескольких амплифицированных фрагментов ДНК различной длины.
Амплификат ДНК гороха посевного, содержащий всего лишь по одному нарабатываемому фрагменту ДНК при всех возможных сочетаниях праймеров, клонировали в специально приготовленном фагмидном векторе рВШевспр! П КБ (-) с выступающими с!Т-концами Секвенирование ДНК полученного клона
показало, что амплифицируемый участок является фрагментом гена лектина, нуклеотидная последовательность которого полностью идентична опубликованной ранее последовательности гена лектина PSL семян гороха (Gatehouse et al, 1987) Используя в качестве пробы полученный клон, содержащий фрагмент гена лектина гороха, была проведена блот-гибридизация фиксированных на мембранном фильтре амплификатов ДНК остальных исследуемых видов бобовых растений Гибридизирующиеся с клонированным фрагментом ДНК гена лектина гороха полосы обнаружились в продуктах ПЦР следующих бобовых растений мышиного горошка, клевера лугового, донника белого, донника лекарственного, люцерны посевной, козлятника восточного, астрагала серпоплодного, астрагала солодколистного, остролодочника волосистого, караганы древовидной, караганы кустарниковой, копеечника альпийского, эспарцета песчаного, дрока красильного, аморфы кустарниковой, термопсиса Шишкина, солодки голой. При проведении ПЦР с ДНК ракитника русского, стальника пашенного, лядвенца рогатого, вязеля разноцветного, леспедецы двухцветной фрагменты ДНК или не амплифицировались совсем или же не гибридизировались с используемым зондом
Те же комбинации праймеров применяли для проведения ПЦР с ДНК представителей родов Cassia и Bauhima подсемейства цезальпиниевых, родов Acacia и Albizia подсемейства мимозовых, а также некоторых представителей южных родов подсемейства мотыльковых. Из этой группы видов с выбранными олигонуклеотидными праймерами амплифицировались фрагменты ДНК, гибридизирующиеся с геном лектина гороха, у баугинии кандиканской, софоры японской и акации белой
Клонирование и секвенирование фрагментов гена лектина различных представителей бобовых растений. С целью клонирования и секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК исследуемых видов растений, полосы, гибридизирующиеся с геном лектина гороха, элюировали из агарозного геля. После соответствующей очистки элюированные амплификаты клонировали в векторе pBluescript II KS(-) с выступающими dT-концами и секвенировали с помощью ферментативного дидезокси-метода Сэнгера В случае, когда у одного и того же растения амплифицировалась гибридизирующаяся полоса в нескольких вариантах сочетаний пар праймеров, для клонирования выбирался
амплификат полученный при использовании такой пары праймеров, которая ограничивает фрагмент гена лектина наибольшей длины
Таким образом, были определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов лектина у следующих видов бобовых гороха посевного (Psativum.seq), гороха посевного афганской линии NGB 2150 (Psaafg.seq), мышиного горошка (Vcracca.seq), клевера лугового (Tpratens.seq), донника белого (Malbus.seq), донника лекарственного (Mofficin.seq), люцерны посевной (Msativa.seq), козлятника восточного (Gorienfcseq), астрагала серпоплодного (Afalcats.seq), астрагала солодколистного (Aglycyph.seq), остролодочника волосистого (Opilosa.seq), караганы древовидной (Carbore 1,2,3-seq), караганы кустарниковой (Cfrutex l,2,3,4.seq), копеечника альпийского (Halpinum.seq), эспарцета песчаного (Oarenari.seq), дрока красильного (Gtinctor.seq) аморфы кустарниковой (Afrutico.seq), термопсиса Шишкина (Tshischk.seq), солодки голой (Gglabra l,2.seq), баугинии кандиканской (Bcandics.seq), софоры японской (Sofora5.seq), акации белой (Rpseudo.seq)
У всех определенных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов лектинов бобовых растений обнаружены открытые рамки считывания, не нарушающиеся по всей длине клонированных фрагментов и не содержащие интронов
Секвенированные нуклеотидные, а также выведенные из них аминокислотные последовательности депонированы в международных банках данных EMBL/GenBank/DDBJ под регистрационными номерами Z92672, Z92673, AJ234377 - AJ234399, DQ319000, DQ319001 и доступны посредством Интернета на вебсайте NCBI (www.ncbi nlm nih gov)
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектина. Нуклеотидные последовательности секвенированных фрагментов генов лектинов анализировали с использованием пакета компьютерных программ "Lasergene" фирмы "DNASTAR" (США) С помощью множественного выравнивания и последующим более тонким ручным выравниванием показано, что гомология нуклеотидных последовательностей выбранного участка генов лектина у исследованных бобовых растений варьирует от 43,5% (в паре В candicans/G glabra) до 91,8 % (для Р sativum/V. cracca) Эти выбранные фрагменты генов лектина у исследованных бобовых характеризуются довольно
высоким содержанием АТ-пар, которое меняется от 53,2% у солодки голой до 68,2% у козлятника восточного. Построенное на основе множественного выравнивания древо сходства нуклеотидных последовательностей лектинов исследуемых бобовых растений показало, что оно, в целом, отражает принятую классификацию бобовых (рис 2)
63 6.
I
60
50
—Г" 40
I
30
20
Ма1Ьив вея Мо№сш вея МваЬуа Бед Трга1епв вея Рва^уит вея Psaэfg вея Усгасса вея вопет вея СагЬоге2 Бея CfrutexЗ веч С1пЛех2 вея СагЬогеЗ вея Оагепап вея СЬпйог вея АйгиЬсо вея ТвЬ1всЬк вея воЪгаб вея Сд1аЬга2 вея Ярвеийо вея г С(пЛех1 вея СЬи\ех4 вея '— СагЬоге1 вея На1ртит вея I— Afalcat8 8eя -П— Ад1усурИ вея
'- Ор|1ова вея
- Всапс11с8 8ея
- Сд1аЬга1 вея
10
Рис 2 Древо сходства нуклеотидных последовательностей секвени-рованных фрагментов генов лектинов бобовых растений, построенное с помощью программы "MegAlign" пакета "Ьавегдепе" ("БКА8ТАЛ", США) На горизонтальной оси приведен вес данного выравнивания, выраженный в количестве замен нуклеотидов
Сравнение нуклеотидных последовательностей лектиновых генов показало, что в отдельные ветви отчетливо выделяются гены лектинов у
представителей близких триб, таких как Viciae (горох посевной и мышиный горошек), и Tnfolieae (клевер луговой, донник белый, донник лекарственный и люцерна посевная) Близок по нуклеотидной последовательности гена пектина к этим двум трибам и козлятник восточный, входящий по классификации цветковых растений Тахтаджяна (1987) в трибу Galegae, к которой также относятся роды Caragana, Glycyrrhiza, Astragalus и Oxytropis При этом схожие нуклеотидные последовательности генов лектина двух последних родов образуют компактную ветвь из двух видов астрагалов и остролодочника (дивергенция между лектиновыми генами которых составляет всего 2%), достаточно филогенетически отдаленную от остальных генов лектинов бобовых умеренного климата. Так, например, у астрагала и остролодочника дивергенция с геном гороха достигает 39% У караганы древовидной, караганы кустарниковой и солодки голой (являющихся представителями двух родов, также входящих в трибу Galegae) обнаружено по несколько генов лектина У караганы кустарниковой секвенированы четыре различных гена лектина, причем два из них cfrutexl и cfrutex4 высокогомологичны друг другу (дивергенция 1,9%) и близки к гену carborel караганы древовидной (дивергенция 7,0 и 6,5%, соответственно) Остальные два гена лектина караганы кустарниковой cfrutex2 и cfrutex3 также близки по нуклеотидным последовательностям (дивергенция 7,4%) и образуют уже с другим геном лектина carbore2 караганы древовидной (дивергенция 5,4 и 5,8%, соответственно) отдельную ветвь на древе сходства генов, причем дивергенция между самими генами carborel и carbore2 составляет 31,3% У караганы древовидной при этом имеется еще третий ген лектина сагЬогеЗ, отличающийся от carborel и carbore2, соответственно, на 40,5 и 41% Таким образом, у караган обнаруживается три класса различных генов лектина, причем внутри каждого из классов имеется ряд генов, кодирующих более близкие лектины, формирующие своеобразные подклассы. Весьма характерным является то, что гены одного класса лектинов разных растений оказываются филогенетически ближе, чем гены лектина разных классов у одного и того же вида растений, что позволяет говорить о наличии у бобовых как ортологичных, так и паралогичных генов лектинов
Резко отличающиеся друг от друга гены лектинов обнаружены и у солодки голой У этого бобового растения гены gglabral и gglabra2 отличаются между собой на 65,2% При этом, если ген gglabra2 относительно близок к лектиновым
генам остальных бобовых растений умеренного климата, то филогенетическая отдаленность от них гена gglabral, больше, чем таковая у гена лектина баугинии кандиканской, относящейся к подсемейству цезалыганиевых Остальные секвенированные гены имеют между собой в среднем от 35 до 50% дивергенции и на древе сходства четко очерченных групп не образуют.
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей пектинов бобовых растений. На основании секвенированных нуклеотидных последовательностей лектиновых генов исследуемых видов бобовых растений были выведены аминокислотные последовательности кодируемых ими пептидных цепей Компьютерный анализ с использованием программы множественного выравнивания MegAllgn пакета Ьавегдепе фирмы БИДвТАЯ выявил внутри сравниваемых фрагментов лектинов два гипервариабельных участка (рис 3)
Один из них приходится на последовательность аминокислот лектина, соответствующей пептиду, определяющему специфичность молекулы данного белка к моносахариду Подобный пептид ранее был описан у баугинии пурпурной и в дальнейшем обнаружен у всех изученных лектинов бобовых растений (Yamamoto е! а1, 1992) В лектине гороха углеводсвязывающий пептид соответствует последовательности аминокислот 122-ТРтаАА\\Т>Р8ЫШЖ-135 (Копали й а1, 1992) В экспериментах с использованием химерных молекул лектина показано, что последовательность аминокислот в УСП определяет специфичность молекулы белка к конкретному моносахариду и замена отдельных аминокислот в этом участке приводит к изменению или полной потере сродства к углеводу В то же время данный участок ответственен за связывание ионов Са2+ и Мп2+, находящихся в углеводсвязывающем кармане лектина и способствующих стабилизации его пространственной структуры (Ьот е1 а1,1998)
Вариабельный УСП лектинов бобовых растений умеренного климата, также как и у ранее секвенированных лектинов представителей тропиков, фланкирован высококонсервативными последовательностями аминокислот 116-УАУЕРБТ-122 и 136-НЮГОУ>Г-142 (здесь и далее для разных видов бобовых номер аминокислоты соответствует ее положению в последовательности лектина гороха), к первой из которых и подбирался олигонуклеотидный праймер Внутри УСП также обнаружен консервативный трипептид 128-\\ГОР-
130, включенный, так же как и предыдущие консервативные участки, в связывание ионов металлов С помощью кристаллографического анализа было показано, что в связывании ионов металлов лектином гороха принимают участие аминокислоты Aspl21, Phe(Tyr,Leu)123, Asnl25, Aspl29 - Ca2+, Glull9, Aspl21, Aspl29, His 136 - Mn2+ (Лахтин, 1994) Как видно из рис 3, все эти остатки аминокислот в секвенированных нами последовательностях высококонсервативны, что является косвенным доказательством необходимости присутствия ионов Са2+ и Мп2+ в углеводсвязывающих сайтах кодируемых ими лектинов Что же касается специфичности к углеводу, то считается, что в связывании D-маннозы молекулой лектина гороха непосредственно участвуют следующие аминокислотные остатки Phel23, Туг124, Asnl25, А1а126, А1а127, Trpl28, Argl33 и Vall41 (Young, Oomen, 1992) Проведенное нами множественное выравнивание показывает, что положение некоторых из этих аминокислот, например Asnl25, Тгр128 и Vall41, весьма консервативно, чего нельзя сказать о присутствии и локализации остальных аминокислотных остатков Вероятно, в связывании углеводной молекулы принимают участие консервативные инвариантные аминокислоты, обладающие высоким сродством к любым углеводам, но характеризующиеся при этом малой специфичностью Вариабельные аминокислоты, также участвующие в связывании, напротив, определяют специфичность УСП к тем или иным сахарам. Таким образом, в УСП можно выделить консервативные инвариантные аминокислоты, ответственные за связывание ионов металлов и более вариабельные аминокислоты, обеспечивающие сахароспецифичность молекулы лектина
Весьма примечательно, что разные бобовые растения характеризуются наличием в УСП как делеций, так и вставок (от одной до нескольких аминокислот), что способствует повышению вариабельности данного участка Вполне вероятно, что не только состав и последовательность, но и длина петли углеводсвязывающего пептида оказывает существенное влияние на сродство молекулы лектина к тому или иному сахару На основании множественного выравнивания нами выведена консенсусная последовательность УСП секвенированных лектинов бобовых растений умеренного климата Asp-Tre-Phe-Xxx-Asx-Xxx-Xxx-Trp-Asp-Pro-Xxx-Xxx-/ns/Z)e/-Arg-His, где Ins/Del обозначает место, характеризующееся наличием вставок или делеций
+ Сопэеп^иа * 1
Соп^спциз 11 Сопзепзиз Сопзепзиэ ^
1-й I ,1
у ш ЩЛ 1 1-я' : I' 1 *
У. II
V . . Е . |)Т......О
.«ПР. . -УЛУЕГВТЕУЫРЕИПРТС-
.(51......^.........Ы................J...........
- . ВНТОЮТЫЩКЯ. .Т. .VI. . .ИО..УАНУ. I .V . Л. Т. . !.. УЗР.УР-Э-
удкуутяуказтму'.ТУВ^УР -3-
............V.!........VR.tiF'
---. . ТРУ . Т. Б . УУ СТ.К П V1, Г' КМ те 1С }•"
■ - -нвтзу I ь® оуу рьр; иу ь реи у кIц р
10
20
30
чС
ьо
68
7 0
ас
Рззз fg. Усгасо^ . 1' р I п Т Г г. ^ .
. у Мо£ firji.Il.
Лf а! с-д*: 3 . А^ 1усурЬ. ор1.эе^ СагЪоье! . з**^ С1: гчгех 1 . С Г гиРехЗ . зе<ц СогЬоге>2.ае^
С£ гч^ехи. Са гЬосеЧ.як^ Но 1рзлит.зе^ АI" ги^ хсо . зе^ ТаИIэсЬк.scq Оагепаг1. я^ч Йс £огпТ>. Сд1 аЬгп-12 . яе-] Крйеиао.
------ЛЕТ ЗУ
---МЕТЭ
¡V ауеЕТ/ГРУМЛА^ эй - гйн I с I С'УН Ё АУЕР ЦТ Р. УР| АА*) Г) Е)- 3 ОН Пр!! I (3: ;>УМ„> 1 К^УЗ^ЗМКГЛ^ЦЕКмф'^А^М^ЖУЗДПУЗМ
у а тег от руУ у : ы о-т-нвшн I с I румзша! эт кзел'ьовд к\Й,' у и л к ги ддаы у&йуз щу ч—
V ау а к [л(у см рш р к—кпкн т о гНУмшк.тгг^к.чммЕи^к^««^^— уаук- р ит Инг-1 а-и □ ¡Кг — |УАУЕГОТИнЫЛ-)ЛРИК-1 - ОКНРС! 0УМ ГкфзЬрЗ>ГЛа^К1ПАНч|уда—
V а уе^ рт ^нМт -«к-у --да; 11 а гМ т к ЯI зэтг.Цу I, шйтцут^^г^нф! уЦ звди зу г|—
1УАУЕ РЕ1? У УО Р Ш Р ¡^ КН1 в! пуда7 К ¿ККУЗЭ^Э ГР^ИЕ Ы'^и ТУрРЗЗК?1|УАЗ!.|УУГ<-:3-КАУВРМЬЬЙЕЕМ-Та- У-ГС1Г-Л ОУНЗ
¡УАУВГп^ьт^Екир-Л-У-ф гс! о™з
УАУЕ ГОТ РРМ ЯН РРРТ---КШСПЛТОЗ 1 1На«КГ1|тСМСЕ^ВС(УА!г)У01 ф
■уа!герпт г гм рии орья ту и мн т г. т пум з I у;™ кГгг сл^ I к!у аш а г ф у аше гот рдарм^щшз ь ннф тс г о ум б 1Й йы р^т«7к|у;с] V щ ф
','ЛУр РР1'!, !7Ы р СМрI''ГГ, - |||ф{1 ЙХОУ^ЗЗ ТКЗК^ТУШНУШСТ1/л|о\Л||1 ф ^ГТН^Т^ГМУ^Й-Й
V А^гот —№.н I ОУЯЗ 1 кй 1 а^.' РЦМР ф и'ф'муЦ 1 АЗ] []-таувгот е'с^к си ов[ё—нкн I с I оумн 1-й ау^т^ян ьф] ^ иуА^Ыир й н|НУр)НЁ^.лУ у эсЫорЙ -
УАУЬ; ~СТ Г"[Т1РЕ>;ОРКС---и! IС IОУН5 ] КЗ Г КТТ--
УАУК РЦ'Г Е'Т!]А-1'Л)РдС---¡КНХБ! №N^11 КЗТКВ ^фз'ПЬУАУШУКЙ-б'
УО УЕ. Р ЩИ М - 0 РС Р---и I '31 Г.'.' N И IN ^ КА У ™ Щ/1ЬУ А1ЛГI ТУ й1лтгг К ГЬ'Т^/б 1, 1У! I -
УАУЕ Р РТ :р IМ Р-к ::> вк р к—м-'тглруд:; I каве^кг^! I ь^йфАкчетф тггтф Б^з^ру -н -УАУИ'отЬчЫ-ЕКЗРКТ---I иьиз ффт ктугиаи фКЕУШ1
УАУК РЕПЧТУОЕШСЛОС---ВКI ^ Т ОУ М ^У!^ У1СТ1ТС РТ.^АИ ПСЛ'АМУРТ; ^Йадщ К 1(1|Я АЬ V К!-
УАУ Р Р [)'[' Р1-Ч!УЛИ иР Р .Р---иМз «да ЬЧ^У
„круМрет'кгсе
. [-:(.; шо е'р з у и а\'V р^к р-У 1■</ р в м у р т о р -з—I ;и -ЕШ —утрцрр' '/ы;.ру р рек V р 1 с г -<; - р р-й у :Л'У рр к и г у рр.к V р рь, Р ~Сг~3 Р Ж у Р [ ЭНУ У РЫ< ГЯ У Р РИУ К I!г
—г ¡ЯАфоиЖтУРЕЖукхеР
у<=ич; кг ^ г V з ь и у с у ЗВД К'П ¡?У .4 ШУ 5' йАЗЭктада-йРУ^г Р!АГ. ЗК141МУ1 )1 ¡)№ с!^ 3 5 КТ^МУ 3 .^«¡У Е]—
■г V РТ+Л/Г) П V), Р ™ V Г! 1 ^ $УЕТУУ ОШЕК/ЬР ЕЙ УК I <31?
р—
р-----ы [ГТ д у! тм Е1 у V1)! Л' и Р ЕМУ к I (.; Р
-----С---ЕЗУ
IУ Т С(УУ 0Ш П1)р РЕЙУН! С Р
-а----мут ЗУ у оьк р! р
-в---Ей у; N УР ОУ V Р1ЬК Щ Р Р Р1ЧУ Р
---V АТ Е У'ЦУV: В Ь КЙУI. Г 1 а г
---У^ТИУМЬЭЙУУ|аЬ№УЬРЕ«УК1СЕ
---УА*Г ЗУ ур, йуч® Г. !. Р Е'(ГУ И 7 Е Н
—зк Р: улкекуо^КУ ЦР1:ЯУ я хае
---
---ет Р У1 ^ГГУ Р Р К ЧУР I и р
---3 У А ЗУ 01.кщ1 !, РР>/УН,1Ц'Р
----адр>ту;1ь:куу!41{су:оаяук:ок
----Б®;Р^1[Р£5ААУПРКЙ^ЬеЕИУК1СЙ
—кс ф " г удауу гл кру! РР.Р.' я КЗ н ------К КЙ Г РМ А ] у ОЬНкккР ЕЯУ В^Й Р
Рлс, 3. Множественное выравнивание выведенных аминокислотных последовательностей секвснированных фрагментов генов лектина бобовых растений умеренного климата. Области гомологии выделены линиями. Сверху приведены консенсусные последовательности аминокислот, соответствующие 50 и 100% гомологии, а также столбиками различной высоты показан уровень консервативности присутствия аминокислот в соответствующих положениях
Взаимосвязь между строением пектинов и хозяйской специфичностью бобового растения. При сопоставлении строения УСП лектинов с хозяйской специфичностью, проявляемой бобовым растением, несущим данный ген, и имеющей место при формировании симбиоза с клубеньковыми бактериями, прослеживается очевидная взаимосвязь этих двух факторов Лектины двух видов астрагалов и остролодочника, вступающих в симбиоз с одними и теми же штаммами ризобий, характеризуются полностью идентичной последовательностью УСП Также весьма похожи УСП лектинов донника лекарственного, донника белого и люцерны посевной Имеющиеся замены в УСП этих растений, входящих в одну группу перекрестной инокуляции, приходятся на подобные аминокислоты Leu—»-Ile и Ala—>Thr, не способные существенным образом повлиять на общие свойства данного пептида Единственная вариабельная позиция 134, где наблюдаются замены аминокислот (Gly - донник белый, Asp - донник лекарственный; Asn - люцерна посевная), способные изменить общую заряженность и полярность УСП, приходится на его С-концевую часть, замены аминокислот в которой в меньшей степени оказывают влияние на специфичность лектина Полностью идентичные УСП обнаружены также у гороха посевного и мышиного горошка, вступающих в симбиоз с ризобиями К leguminosarum bv viciae
Интересна последовательность УСП клевера лугового, представителя той же трибы Trifolieae, что и донник с люцерной, которые, в свою очередь, вступают в симбиоз с клубеньковыми бактериями Sinorhizobium mehloti Филогенетическая близость данных видов подтверждается при построении древ сходства нуклеотидных последовательностей генов их лектинов Тем не менее, растения клевера инокулируются ризобиями R, leguminosarum bv trtfolii, таксономически очень близкими к бактериям R leguminosarum bv viciae, вступающим в симбиоз с бобовыми трибы Vicieae При анализе УСП лектина клевера можно заметить его значительное сходство с УСП лектинов представителей трибы Vicieae и практически полное отсутствие гомологии с УСП лектинов представителей трибы Trifolieae. Данный результат косвенно доказывает причастность лектинов к формированию специфичности взаимодействия растение - микроорганизм при становлении азотфиксирующего симбиоза Однако необходимо отметить, что, несмотря на близость ризобий R, leguminosarum bv trtfolii и R. leguminosarum bv viciae, они достаточно строго специфичны к своим хозяевам Можно предположить, что факторы,
обеспечивающие специфичность данных биоваров ризобий, несколько отличаются между собой, так же как и УСП лектина клевера лугового не полностью идентичен УСП лектина гороха В то же время следует отметить, что донник и люцерна, УСП лектинов которых сильно отличаются от соответствующего участка лектинов клевера и гороха, способны специфически взаимодействовать уже с симбиотическими факторами ризобий S meliloti, в свою очередь, генетически сильно отличающейся от штаммов R. leguminosarum bv trifohi и R. leguminosarum bv viciae
Однако секвенирование генов лектинов Trifolium repens и T trichocephalum показало, что они имеют больше сходства с лектинами других бобовых растений, нежели между собой (рис 4) Отсюда, можно предположить наличие у клеверов нескольких классов лектинов, что вносит свои коррективы в обсуждение их свойств
Известно, что козлятник восточный и козлятник лекарственный не являются перекрестно инокулируемыми и вступают в симбиоз с разными биоварами клубеньковых бактерий Rhizobium galegae (bv orientahs и bv officinalis, соответственно) Секвенирование фрагментов генов, кодирующих углеводсязывающие участки лектинов этих морфологически близких видов растений, показало, что их лектины значительно различаются При этом показано, что Nod-факторы их ризобий, также являющиеся детерминантами специфичности бобово-ризобиальной системы Galega sp - R Galegae, имеют высокую гомологию между собой Этот факт указывает на то, что лектин может являться одним из критических факторов, обуславливающих существование двух групп инокуляции G officinalis - R. galegae bv officinalis и G orientalis -R. galegae bv. orientalis, но не является рецептором Nod-факторов ризобий
Анализ показывает, что УСП лектинов, даже специфичных к одному и тому же моносахариду, достаточно сильно отличаются по последовательности и составу включенных в процесс связывания сахара аминокислот При сопоставлении первичной структуры лектина с видовым составом ризобий, вступающих в симбиоз с бобовым растением, несущим данный белок, обнаружилось, что в УСП лектинов бобовых, входящих в одну группу инокуляции, наличествуют консервативные, характерные только для этой группы растительных лектинов, аминокислоты У представителей как одной, так и, как правило, разных групп их положение совпадает (рис 4)
R. galegae bv. officinalis
116 140
G officinalis 1 IAVKFDTfTNggWDL E7KD£HHIGIN
G officinalis 2 VAVKFDTJTN££WDL F/KDEHHIGIN
G officinalis 3 VAVKFDTFyN££WDLF/KD£HHIGIN
G officinalis 4 VAVKFDTJTNFffWDL F7KD£HHIGIN
R. galegae bv. orientalis
G orientalis 11 VGVEFDNYVNE-WDP—-KH-PHIGID
G orientalis 12 VAVEFDTYCNPGWDP—RDRHIGIN
R. leguminosarum bv. viciae Man/Glc
Vicia cracca VAVEFDTFYN/14WDPS'-/>RZ>RHIGID
Vicia faba VAVEFDTFyNA^ WDP^-jVGJTRHIGIG
Pisum sativum VAVEFDTFm^WDPS-jVRPRHIGID
Lathyrus ochrus VAVEFPTFUV TA WDPS'-A^GgRHIGID
Lathyrus sativum VAVEFDTfFNA4WDPS-M}j?RHIGID
Lens cuhnans VAVEFDTFm^WDPS-MCERHIGID
Lens ervoides AVEFPTFrn^ WDP5-MCPRHIGID
Lens lamottei VAVEFDTFrNA4WDPS-AKgRHIGID
Lens nigricans VAVEFDTFFM44WDPS-/VKj)RHIGID
Lens odemensis VAVEFDTF YSAA WD Pff-AKFRHIGI D
R. leguminosarum bv. trifolii
Trifolium pratense VAVEFDTfTN K/) WD- r-/VRPRHIGID
Trifolium trichocephalum VAVEFDTyiN-OWDPG—FQHIGID
Trifolium repens VAVEFDTLfflSM-WDP-Ä/GRHIGID
S. meliloti
Mehlotus albus VAVEFDTF//N/4-WDP—ATLGRHIGID
Meillotus officmalis VAVEFDTF//ISL4-WDP—«7DRHIGID
Man/Glc
Medicago sativa VAVEIDTFHNr-WDP—Ä7NRHIGIN
Medicago truncatula VAVEIDTFflNr-WDP—JONRHIGIN
PhyUobacterium trifolii Man/Glc
Onobrychis vicufolia VAVEFDTFSNR-WDPA—NSHIGIN
Rhizobium sp.22Al Man/Glc
Canavalia ensiformis VAVELDTYPNTDIGDP—SYPHIGID B.japonicum
Gal
Arachis hypogaea 4 VGVEFDTKSN5gYNPPP-TDHVGID
Arachis hypogaea 5 VGVEFPTKS^SEYNDPP—THHVGID
Arachis hypogaea 6 VGVEFD S KSNSiTFKDPP—YOHVGID
GalNAc
Cytisus scopanus VAVEFDTÎTN5/1WDPOT-NPHIGID
Vigna linearis 11 VAVEFDTLSNHHWDPET—G-HIGIN
Phaseolus lunatus VAVEFDTC//NÍ.DWDPK—GSHIGID
GalNAc/Gal
Glycine max VAVEFDTFBN^-WDPP—-NPHIGIN R.legunünosarum phaseoli
Gal
Phaseolus vulgaris VAVEFDTL FN КЯУУРРКР—RHIGID M. loti
Astragalus falcata VAVEFDT¿¿NEffWD-T-G- FPHIGID
Astragalus glycyphyllos VAVEFDTLLNggWD-T-G- E-PHIGID
Oxytropis pilosa VAVEFDT¿¿NEEWD-T-G-FPHIGID
Robinia pseudoacacia VAVEFDT№NVAWDPN-G-/-HMGID
M. amorphae
Amorpha fruticosa VA VEFDTFP-DAWDPQ-G-R-HIGID
Рис. 4 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей УСП лектинов бобовых растений, инокулирующихся одними и теми же штаммами ризобий Аминокислоты, участвующие в связывании ионов металлов, выделены жирным шрифтом Курсивом выделены аминокислоты, определяющие специфичность связывания лектина. Цифрами указаны положения аминокислот в лектине гороха
Эти консервативные аминокислоты, часть из которых вовлечена в
формирование специфичности к моносахаридам, видимо, и обеспечивают
тонкую специфичность связывания лектина с ризобиальными рецепторами
Некоторые же редкие замены по консервативным аминокислотам в УСП
лектинов растений, вступающих в симбиоз с одними и теми же штаммами
ризобий, как правило, почти всегда представляют из себя замены на подобные
аминокислоты Например, Leu <-> Ile <-» Val - неполярные (гидрофобные)
аминокислоты, Lys Arg <-» His - положительно заряженные аминокислоты;
Asp <-» Glu - отрицательно заряженные аминокислоты
Как видно из рис 4, лектины сходной сахароспецифичности могут
объединять группы растений, вступающих в симбиоз с различными ризобиями.
Отсюда можно сделать вывод о том, что специфичность связывания лектинов с
ризобиями определяется не только их аффинностью к моносахаридам, но и
более тонкой аффинностью к сложным углеводам При этом, если корреляции
между группой МапЛ31с лектинов растений и их группой инокулируемости ризобиями почти не наблюдается, то по консервативным аминокислотам их УСП она легко прослеживается. Поскольку лектины растений одной группы инокуляции имеют сходную специфичность к простым сахаридам то, можно сказать, что это необходимое, но недостаточное условие для специфичного связывания лектинов с поверхностными полисахаридами ризобий
Остальные взятые в исследование бобовые растения в группы перекрестной инокуляции не входят, и, как можно видеть на рис. 3 и 4, УСП их лектинов также характеризуются существенными различиями, как по последовательности, так и по количеству входящих в состав данных участков аминокислот Однако, следует признать, что обнаружение нескольких лектинов в одном растении вносит определенные коррективы в обсуждение связи между образованием симбиоза с тем или иным штаммом ризобий и строением УСП его лектинов
Создание химерных конструкций гена лектина. С целью получения гибридных лектинов с измененными углеводсвязывающими свойствами нами был разработан оригинальный вариант метода сайт-направленного мутагенеза, позволяющий относительно легко манипулировать достаточно протяженными мутируемыми участками гена, особенно когда есть необходимость замены, удаления или вставки целых доменов в многофункциональных белках Суть метода состоит в следующем. За основу берется плазмидный вектор с клонированным в нем геном белка, являющимся исходным материалом для создания химерных конструкций. Как показано на рис 5, нефосфорилированными прайм ерами 1 и 2, которые подобраны так, что их 5'-концы точно до нуклеотида ограничивают подлежащий замещению участок А, проводится инвертированная ПЦР всего вектора, что ведет к образованию линейного вектора с фрагментами гена целевого белка, кодирующими его >1- и С-концевые участки за исключением фрагмента А.
При проведении инвертированной ПЦР желательно использовать Р& полимеразу, которая обладает 3'-5'-редактирующей активностью и гарантирует отсутствие в ампликоне ошибок синтеза ДНК и необходимое наличие у него тупых концов Параллельно фосфорилированными праймерами
Э|ам 1
Этап 2
Этап 3
)ип 4
5 3
Трансформация
Рис. 5 Схема проведения сайт-направленного мутагенеза
3 и 4 (также при помощи РШ полимеразы), приходящихся встык к первой паре, амплифицируется фрагмент Б из другого гена, на который ожидается произвести замену Обязательным условием при амплификации вставки является использование фосфорилированных праймеров, чтобы при лигировании первого и второго продукта амплификации могли образовываться кольцевые молекулы, представляющие собой исходный плазмидный вектор, несущий ген белка с замещенной областью
Полученная лигазная смесь готова для трансформации компетентных клеток Выросшие на селективной среде колонии скринируются с помощью ПЦР, используя детекционный праймер 5, находящийся в неизменяемой части клонированного гена (что позволяет также определить ориентацию вставки) и праймер 4, используемый при амплификации фрагмента Б
Поскольку инвертированная ПЦР проводится с обычными нефосфорилированными праймерами, исключается возможность циклизации
линейного вектора, что обеспечивает практически 100%-ную эффективность встраивания вставки. Таким образом, все выросшие на селективной среде колонии оказываются трансформированными вектором с рекомбинантным геном и остается только определить правильность ориентации вставки
С использованием данного метода нами были получены в экспрессирующем векторе рЕТ-15Ь химерные конструкции гена семенного лектина гороха (PSL), углеводсвязывающий участок которого был заменен на аналогичные фрагменты ДНК, кодирующие углеводсвязывающие домены лектинов астрагала нутового (PSL/AGL), эспарцета песчаного (PSL/OAL), донника белого (PSL/MAL) и клевера лугового (PSL/TPL) Последовательности химерных генов депонированы в GenBank/EMBL/DDBJ под регистрационными номерами DQ319003, DQ319004, DQ319002 и DQ319005, соответственно
Синтез лектинов в клетках К coli и их выделение. Поиск наиболее оптимального уровня синтеза лектина был проведен среди штаммов клеток Е coli BL21 (DE3)pLysS, BL21trxB(DE3)pLysS и OrigamiB(DE3)LysS Клетки трансформировали плазмидой рЕТ-15Ь с генами лектина кальциевым методом Синтез белка в клетках индуцировали добавлением IPTG
Хотя наиболее высокий уровень экспрессии гена лектина обнаружен в штамме OrigamiB(DE3)LysS, в котором образовывалось наименьшее количество нерастворимых белковых агрегатов, наработку белка проводили в BL21trxB(DE3)pLysS, поскольку с использованием именно данного штамма удалось добиться наилучшего выделения лектина аффинной хроматографией на колонках «HisTrap» фирмы «Amersham Biosciences» (США) Клетки-рекомбинанты с генами лектинов PSL/MAL и PSL/TPL при 0 7 мМ IPTG в процессе синтеза белка лизировались Это, по всей видимости, обусловлено не высоким уровнем экспрессии гена лектина, а скорее токсичным действием этих белков на клетки Данное явление дополнительно свидетельствовало о наработке белка в функциональной форме. Ни лектин Р sativum, имеющий аффинность к Man/Glc, ни гибридные лектины PSL/AGL и PSL/OAL не оказывали заметного ингибирующего или лизирующего действия на клетки Очевидно, причиной лизиса клеток являются углеводсвязывающие свойства лектинов PSL/MAL и PSL/TPL, проявившиеся при замещении УСП лектина Р sativum на таковой лектинов М albus и Т pratense В случае, когда белок токсичен, наработать его можно либо путем понижения уровня экспрессии,
либо инактивируя его агрегированием в процессе инкубации клеток. Наращивая клетки до OD,™ - 2 и индуцируя их 0.2 мМ 1PTG, мы добились оптимального выхода белка. По нашим оценкам, клетки BL21 (DE3)pLysS продуцируют примерно от 2 до 5 мг пектина на литр культу рал ыюй среды в поздней логарифмической фазе роста.
Как видно из рис. 6а, белка массой в 28 кДа нет в тотальной белковой фракции клеток бея гена лектина (дорожка 1) и в элюатах белка из этих клеток (дорожки 3 и 4). Напротив, в рекомбинантных клетках с геном лектина можно видеть целевой беаок и в тотальной белковой фракции (дорожка 2), и в его элюате (дорожки 5 и 6). Таким образом, элюируемыи белок массой н 28 кДз не принадлежит клеткам Е. coli, а является целевым белком, лектином. На рис. 66 показаны результаты аффинной хроматографии природных и гибридных лектинов, синтезированных в клетках BL2ltrxB(DE3)pLysS.
■'•Jim.
28 кЛа
- 97,4 к Да
•м 67 к Да
45 кДа — 29 к Да
i ; Ш Ш
Ш* ' .
v. --. + к.-
шшшч;
Щ т* Ц 8
12 3 4 5 6 7
Б.
1 2 3 4 5
Рис. 6. А. Электрофореграмма препаратов белка клеток Е. coli: 1 — тотальный белок (ТБ) клеток без гена лектина; 2 - ТБ клеток с гибридным геном лектина A. glycyphyllos; 3 и 4 — I и И фракция элюции белка из кле гок без гена лектина; 5 и 6 - I и ¡I фракция элюцми белка из клеток с геном лектина А. glycyphyllos; 7 -маркер молекулярного веса. Стрелкой показан лектин.
Б. Электрофореграмма лектинов, выделенных аффинной хроматографией из рекомбинантных клеток Е. coli, I — лектин P. sativum (PSL); 2 - лектин G. orientalis (GOL); 3 - гибридный лектин PSL/AGL, 4 - г ибридный лектин PSL/MAL; 5 - гибридный лектин PSL/OAL
Анализ специфичности пектинов. Анализ гибридных лектинов на специфичность их взаимодействия С моносахаридами проводили методом подавления гем агглютинации человеческих эритроцитов. Минимальная концентрации белка, при которой еще наблюдалась агглютинация, составила
приблизительно 40 мкг/мл Ингибирование реакции агглютинации сахаридами проводили в пределах от 10 до 100 мМ с двукратным разведением Все полученные нами гибриды были способны агглютинировать эритроциты человека, что свидетельствует о корректности их пространственной укладки и ассоциации субъединиц в димеры Однако, достоверно определить специфичность к сахарам удалось только у гибридов с УСП астрагала и донника Несмотря на несколько отличающиеся первичные структуры УСП лектинов PSL, PSL/MAL и PSL/AGL, они показали некоторое сходство по специфичности к сахаридам, но по силе аффинности к ним заметно различались (табл 1)
Таблица 1
Специфичность PSL (коммерческий препарат, "Serva", USA) и гибридных лектинов PSL/MAL, PSL/AGL к моно- и дисахаридам
Концентрация сахара (мМ), ингибирующая
Сахар реакцию агглютинации
гибридный гибридный лектин PSL
лектин лектин
PSL/MAL PSL/AGL
Glc 25 25 1
Man 10 100 1
Gal 100 25 н и
GlcNAc 100 н и 10
Fru 25 10 10
Lac 25 25 н.и
Mal н и. 50 5
Cel 50 50 н.и
Примечание, ни- нет ингибирования при концентрации сахара 100 мМ
Замещение УСП лектина PSL таковым A glycyphyllos привело к значительному ослаблению аффинности к Man и приобретению способности связываться с Gal Напротив, при замещении УСП лектина PSL соответствующим участком лектина М albus белок сохранил специфичность к Man и Glc и приобрел слабую аффинность к Gal и GlcNAc Действительно, на основании высокой гомологии УСП лектина М albus с УСП лектина М sativa, способного связывать Man и Glc, можно предположить схожесть их специфичности к простым сахарам, которую как раз и определяет углеводсвязывающий пептид При замене УСП лектина PSL на таковой как М albus, так и A glycyphyllos,
лектин сохранил сродство к Glc, из чего можно сделать предположение, что данная специфичность PSL, видимо, формируется преимущественно другими его областями Гибридный лектин PSL/AGL проявил совмещенную специфичность к Gal и Man/Glc, что нехарактерно для лектинов бобовых растений
Очевидно, что замена углеводсвязывающего участка лектина Р sativum участками лектинов A glycyphyllos и М albus, которая привела к изменению его специфичности к моносахаридам, должна изменить и его более тонкие углеводсвязывающие свойства Исходя из этого, надо полагать, что гибридные лектины PSL/AGL и PSL/MAL представляют большой интерес для исследований их свойств уже во взаимодействиях растения и бактерий
Филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с астрагалом нутовым и эспарцетом песчаным. Анализировали бактерии из клубеньков астрагала нутового и эспарцета песчаного, произрастающих на горе Чесноковская Уфимского района Республики Башкортостан С применением нескольких «произвольных» праймеров исследовали полиморфизм ДНК ризобий из более чем 100 клубеньков с каждого вида растений Обнаружено, что для исследуемых образцов характерно наличие большого количества (до 60% от общего числа для отдельных праймеров у астрагала нутового и до 90% у эспарцета песчаного) совпадающих полос в RAPD-профилях, что указывает на высокую степень однородности популяций ризобий, заражающих данные бобовые
Филогению исследуемых штаммов изучали секвенированием генов 16S рРНК Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы "Applied Biosystems" (США) Поиск сходных последовательностей в базе данных генов с помощью программы «Megablast», доступной на вебсайте "NCBI (www ncbi nlm mh gov), показал, что секвенированный фрагмент длиной 872 пн, совпадающий у трех выявленных групп клубеньковых бактерий астрагала, полностью идентичен гену 16S рРНК Agrobactenum tumefaciens strain IAM 14 (GenBank Ac No. D13294), описанному Yanagi и Yamasato, а фрагмент длиной 882 пн, совпадающий у всех трех секвенированных образцов клубеньковых бактерий эспарцета, имеет 99,9% гомологии с последовательностью гена 16S рРНК Phyllobacterium trifohi (GenBank Ac No AY786080), описанного Valverde с
соавт. Изначально род Phyllobacterium был представлен штаммами, вызывающими опухоли на листьях тропических растений, а род Agrobacterium почвенными сапротрофными формами (Agrobacterium radiobacter) и бактериями, вызывающими опухоли на двудольных растениях (Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes)
Схожесть генов 16S рРНК некоторых клубеньковых бактерий астрагалов и агробактерий отмечалась еще в работах Гао с соавторами (Gao et al., 2001) Этими авторами были обнаружены штаммы Rhizobium sp SDW052 и NM349, не получившие видового статуса, но тем не менее способные вступать в симбиоз с Astragalus adsurgens и идентичные по последовательностям генов 16S рРНК с Agrobacterium tumefaciens
Надо отметить, что, несмотря на различия в способе существования, род Agrobacterium входит в семейство Rhizobiaceae Более того, введение симбиотических плазмид различных ризобий в лишенные Ti-плазмиды штаммы Agrobacterium tumefaciens приводило к тому, что агробактерии приобретали способность заражать бобовые растения, даже с образованием «эффективных» клубеньков Отсюда можно предположить, что почвенные сапротрофные формы агробактерий (Agrobacterium radiobacter), не имеющие Ti-плазмиды, могут являться потенциальными реципиентами симбиотических плазмид и теоретически способны «становиться ризобиями».
Род Phyllobacterium до сих пор остается наименее изученным в семействе Rhizobiaceae. Изначально он был представлен штаммами, вызывающими опухоли на листьях некоторых тропических растений (чему собственно род и обязан названием), а также на корнях сахарного тростника, объединенные позже в один вид Phyllobacterium myrsmacearum Применение в микробиологии в последние годы методов молекулярной биологии, особенно секвенирование генов 16S рРНК показывает, что филогенетически очень близкие к Phyllobacterium штаммы микроорганизмов способны образовывать и настоящие клубеньки на корнях клевера ползучего, люпина белого (Phyllobacterium trifolii) (Valverde et al, 2005), а также других растений (P bourgognense, P ifriqiyense, P leguminum, P brassicacearum) (Mantelm et al, 2006). Таким образом, несмотря на различия в характере и месте заражения растения-хозяина, филогенетически эти микроорганизмы очень близки Кроме того, с описанием новых видов, все более нивелируется разница между родами Phyllobacterium и Mesorhizobium, и если раньше считалось, что к первым относятся бактерии,
заражающие листья, а ко вторым - образующие клубеньки на корнях бобовых, то сегодня вновь встает вопрос о реклассификации Phyllobacterium, поднятый еще в 1998 году (van Berkum, Eardly, 1998)
Rhizobium etli (AY117632) Rhizobium legummosarum (D14513) Rhizobium legum bv phaseoli (AY946012) Rhizobium legum bv trifolu (1131074) Agrobacterium rhizogenes (D14501) Rhizobium tropici (D11344) Rhizobium galegae (D11343) Rhizobium huauUenso (AF025852) Agrobacterium vitis (AB118158) Rhizobium from Astragalus clcart Agrobacterium tumefaciens (D13294) Sinorhizobium fredii (014516) Sinorhizobium saheli (X68390) Sinorhizobium meliloti (D14509) Sinorhizobium terangae (X68388) Phyllobacterium trifolu (AY78S080) Rhizobium from Onobtychls arañarla Phyllobacterium bourgognenso (AY785320) Phyllobacterium brassicacearum (AY785319) Phyllobacterium sp Tibet IIA25 (DQ177469) Phyllobacterium myrslnacearum (D12790) Phyllobacterium leguminum (AY785323) Mesorhizobium ciceri (AJ487829) Mesorhizobium loti (D14514) Mesorhizobium huakuii (D13431) Mesorhizobium tianshanense (AF041447) Bradyrhizobium canariense (AY577427) Bradyrhizobium |aponicum (X87272) Bradyrhizobium elkanu (AF239845) Azorhizobium caulmodans (D1134?)
Рис 7 Древо сходства нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК бактерий семейства ШигоЫасеае, построенное с помощью программы "Ме{*А11§п" пакета "Ьавегеепе" ("БКА8ТА1Г, США) На горизонтальной оси приведен вес данного выравнивания, выраженный в количестве замен нуклеотидов (х10) В скобках указаны номера регистрации нуклеотидных последовательностей в базах ЕМВЬЛЗепВапк/ЕЮВ!
Работы по секвенированию генов рРНК убедительно показывают, что способность вступать в симбиотические отношения с тем или иным бобовым растением, изначально являвшаяся критерием вида ризобий, в основном определяется набором симбиотических плазмид, а не их филогенетическим положением
Влияние загрязнения субстрата кадмием на симбиоз козлятника восточного с ЯЫюЫит ^а1ецае. Исследовали влияние ионов кадмия на рост растений козлятника восточного и образование азотфиксирующих клубеньков, а также влияние ризобий на устойчивость растений к повреждающему действию тяжелых металлов (ТМ) Предельные концентрации (минимальное ингибирование роста и летальные концентрации) для штаммов К %а1е%ае составили 5 мкМ и 110 мкМ
Для выявления влияния кадмия на нодуляцию козлятника ризобиями семена козлятника проращивали на агровермикулите в течение 15 дней и далее саженцы пересаживали на вермикулит насыщенный солями кадмия уксуснокислого до конечной концентрации 5, 10, 20, 30 и 40 мкМ (см табл 2) Растения в опытах 1-7 инфицировались клубеньковыми бактериями ЮагоЫит galegae 1мл суспензии с СЮ6оо -1,1
Таблица 2
Схема постановки опытов с кадмием
1-й опыт без обработки Сс!^, инфицированные ризобиями,
2-й опыт следовые количества кадмия уксуснокислого + ризобии
3-й опыт 5 мкМ кадмия уксуснокислого + ризобии
4-й опыт 10 мкМ кадмия уксуснокислого + ризобии
5-й опыт 20 мкМ кадмия уксуснокислого + ризобии
6-й опыт 30 мкМ кадмия уксуснокислого + ризобии
7-й опыт 40 мкМ кадмия уксуснокислого + ризобии
8-й опыт 30 мкМ кадмия без инфицирования ризобиями
9-й опыт без обработки Сё^, без инфицирования ризобиями,
Замеры массы растений и подсчет клубеньков проводились в течение 42 дней через каждые 6 дней. За этот отрезок времени растения набрали в среднем с 0,170 г до 0, 652 г сырой массы (рис 8) В образцах, где содержание Сё2+было минимальным, наблюдалось некоторое стимулирование роста растений В диапазоне концентраций ионов кадмия от 5 до 40 мкМ наблюдалось постепенное уменьшение массы растений, а также отношения массы подземной части к общей массе, что указывает на то, что Сё2+ заметно подавляет развитие корневой системы растения.
В том же диапазоне концентраций обнаружили уменьшение среднего числа
клубеньков на растениях. С ростом концентрации кадмия размер клубеньков уменьшался, а цвет становился более бледным. Данный феномен видимо, связан с инактивацией кадмием белков, связанных с двухвалентными ионами металлов, в число которых входят И леггемоглобины бобовых растений, придающие клубенькам розоватый оттенок. Эти белки, являясь переносчиками кислорода, обеспечивают его баланс в нитрагеназном комплексе, и от них зависит азотфиксирующая эффективность клубеньков.
Измерения общей массы растений
1 2 3 4 5 6 ?
недели
Q ;ГI ' 1 2 ОПЫТ 2 El ОПЫТ 3 В ОПЫТ 4 С ОПЫТ 5 G ОПЫТ 6 В ОПЫТ 7 0 РПЫТ 3 и опыт 9
Рис. 8. Динамика массы растений за 42 дня
Исследовании показывают, что почвенные микроорганизмы могут убирать из ризосферы часть ионов ТМ, уменьшая тем самым их вредоносное воздействие на растения. Так, показано, что растения пшеницы накапливали меньше кадмия при выращивании их на нестерильной почве по сравнению со стерильной (Küster, Grun, 1984). Также инокуляция рапса рнзобактериями повышала устойчивость, растений к Ni, Pb, Zn и Cd (Burd et al., 2000). В нашем же случае ризегаии, видимо, не успевали инактивироаать ТМ в вермикулите, а при инфицировании скорее оказывали негативное влияние вследствие повреждения корневых волосков при прорастании, тем самым, облегчая проникновение ионов кадмия а растение. Данное предположение подтверждается нашими исследованиями — в первые две недели инфицированные растения несколько отстают к роете от растений без инокуляции при концентрации кадмия в субстрате 30 мкМ.
В дальнейшем можно было ожидать, что система инактивации и выведения тяжелых металлов ризобий, локализованных в клубеньках, будет способствовать повышению устойчивости к кадмию растения-хозяина. Однако полученные нами данные не выявили достоверных различий между массой растения и его корневой системы у инфицированных и неинфицированных ризобиями растений Таким образом, бактерии рода Rhizobium, характеризующиеся относительно повышенной устойчивостью к кадмиевому шоку не способствовали повышению устойчивости к тяжелому металлу растения-хозяина.
Разработка метода идентификации и паспортизации микроорганизмов на примере штаммов ризобий R. galegae. Для выявления генетических расстояний между близкородственными штаммами ризобий, необходима разработка специальных подходов к их изучению и паспортизации В исследование были взяты 8 образцов штаммов R. galegae, не отличающихся по основным культурально-морфологическим признакам.
На основе метода Концевого Мечения Рестриктазных Фрагментов (КМРФ)(уап Steenbergen et al, 1995) нами был разработан и запатентован метод создания цифровых паспортов микроорганизмов и создания по ним базы данных (Digital identification of genetic materials and methods for acquiring data for it // Patent Cooperation Treaty PCT WO 03/066899) Одним из несомненных преимуществ данного метода является достаточно большое число (до 60 и более) выявляемых на радиоавтографах хорошо различающихся полос фрагментов ДНК, образованных под действием той или иной рестриктазы, благодаря чему существует возможность проводить филогенетический анализ исследуемых штаммов, при необходимости с применением нескольких рестриктаз Другим важным достоинством КМРФ анализа является хорошая воспроизводимость результатов, что делает данный метод весьма удобным для паспортизации штаммов микроорганизмов
Более того, данный подход позволяет идентифицировать полосы, принадлежащие фрагментам ДНК с точностью до одного нуклеотида, что позволяет представить информацию о микроорганизме в цифровом виде и имеет решающее значение для эффективной паспортизации штаммов
Ни один из ранее использовавшихся методов паспортизации не был универсальным, так как они не позволяли создавать истинно цифровые базы
данных с возможностью свободного и легкого доступа к хранящимся а них сведениям, как это происходит для нуклеотидных последовательностей секвенированных генов. Предложенные нами варианты цифровых записей полиморфизма ДНК бактерий являются первым шагом на пути создания подобных всемирных баз данных сходных с таковыми для аминокислотных и нуклеотидных последовательностей. Кроме того, для более привычного для человека восприятия, эти данные можно легко (дополнительно к цифровой записи) представить в форме графических изображений (рис. 9).
!Э лектрофорети чески й 12 3 4
- «й* 2« Ш- фЩ
й
ж
- - - г
«а» —~
Ж *
Цифровой
1 2 3 4
200 195 199 200
199 191 192 199
192 190 191 196
191 186 189 192
189 176 187 19!
187 175 186 187
186 160 182 186
182 157 181 175
181 156 !75 174
178 136 174 173
175 135 173 172
174 130 172 167
17? 128 17! 165
172 121 167 ¡61
167 120 165 160
165 116 161 159
161 111 160 158
159 154 154
154 153 153
153 151 146
146 146 143
143 143 141
¡34 142 134
133 134 133
129 133 129
128 128 ¡25
121 121 ¡24
120 120 122
а 2 109 121
109 106 120
106 105 112
¡05 104 109
104 106
Графический 12 3 4
— — Р\ — £\ —
1
•а §
I 1
33 й
Штаммы КШгоЫит £а1ецае\ 1 - С1ЛМ 0708;
2-СГАМ 0716;
3-С1АМ0719;
4-С1АМ 0720;
КМРФ Размеры рестриктазных Генетические фрагментов ДНК (в штрих-коды
нуклеотидах)
Рис. 9. Генетические "портреты" штаммов бактерий рода ЯЫгоЫит
Присвоение каждой полосе КМРФ анализируемой бактериальной ДНК соответствующего цифрового обозначения равного размеру рестриктазного фрагмента позволяет расположить полученную информацию об исследуемом штамме какого-либо микроорганизма в виде такого графического изображения как «генетический штрих-код»
Метод выявил генетическую отдаленность штаммов ризобий, нодулирующих козлятник восточный, от штамма 0716, формирующего азотфиксирующие клубеньки на козлятнике лекарственном.
Анализ влияния природных и гибридных пектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями. Для оценки влияния лектина на развитие бобово-ризобиального симбиоза были поставлены различные варианты опытов с инокуляцией растений астрагала нутового, козлятника восточного и люцерны посевной ризобиями люцерны, гороха, козлятника восточного и астрагала при обработке их природными PSL, GOL и гибридными лектинами PSL/MAL и PSL/AGL. В контрольных опытах на спонтанное образование клубеньков и контаминацию без обработки ризобиями и лектином, а также в опытах с инокуляцией растений гетерологичными штаммами ризобий без лектина, ни на козлятнике, ни на астрагале образования клубеньков не происходило При обработке растений «своими» штаммами наблюдали нормальную нодуляцию с образованием многочисленных инфицированных ризобиями клубеньков Наиболее заметные фенотипические проявления были обнаружены в следующих вариантах.
При обработке ризобий R leguminosarum bv. viciae лектином гороха PSL на корнях люцерны были обнаружены неинфицированные клубеньки необычно больших размеров и имевшие гроздевидную форму, не наблюдавшиеся в других вариантах (рис. 10а). Клубеньки аналогичной формы наблюдали и Брилл с соавт при трансформации люцерны геном ее собственного лектина MsLECl в антисенс ориентации (Brill et al., 2004)
Таким образом, можно сказать, что лектин PSL способен инициировать симбиотическое взаимодействие М sativa с бактериями R leguminosarum bv viciae и его экзогенного влияния достаточно для развития неинфицированных клубеньков Кроме того, лектин, синтезированный в клетках Е coli, способен, подобно природному, вызывать специфические реакции клубенькообразования
Рис. 10. Клубеньки, сформировавшиеся на корня* люцерны при инокуляции:
а) ризобиями гороха R. leguminosarum bv. viciae и обработке яектином PSL;
б) бактериями из Astragalus cicer и обработке гибридным лектином PSL/AGL;
в) ризобиями люцерны S. meliloti - контрольный вариант
При инокуляции люцерны неспецифичными для нее бактериями A. cicer и обработке гибридным лектином PSL/AGL на ее корнях сформировались в небольшом количестве клубеньки {рис. 106). Рассев содержимого клубеньков на питательную среду выявил наличие в них бактерий, которые no RAPD ДНК-анализу оказались идентичны бактериям из клубеньков A. cicer. Таким образом, в данном варианте наблюдались нетипичные симбиотические отношения между люцерной и клубеньковыми бактериями астрагала с образованием инфицированных клубеньков.
Как уже отмечалось выше, замена в PSL/AGL углеводевязывающего участка лектина гороха участком лектина астрагалов привела к изменению его специфичности к моносахаридам, расширив их спектр. Отсюда можно предположить, что подобные гибридные лектины с «расшатанной» специфичностью к углеводам могут вызывать симбиотические реакции у более широкого круга ризобий, чем природные лектины, что мы, возможно, и наблюдали. Эксперименты с экзогенной обработкой лек-тинами позволили нам выявить их ключевую роль на первичных стадиях инициации симбиоза — на этапах активации ризобий и прикрепления их к корневым волоскам, хотя действие лектина этим, вероятно, не ограничивается.
Теоретически гибридные лектины с расширенным спектром сахароспецифичности могут связываться с более широким кругом ризобий, чем природные лектины и даже если сила связывания у них при этом будет низкой, она может оказаться достаточной для первичного прикрепления
бактерий к корневым волоскам Неудача с инфицированием люцерны при обработке РБЬ, скорее всего, заключается именно в его узкоспецифичности — связавшись с Л 1е^итто5агит он запустил реакцию закладки клубенька (как известно это происходит до инвазии бактерий), но не смог способствовать прикреплению ризобий к корневым волоскам люцерны Искусственный лектин РБЬ/АОЬ с необычной для бобовых комбинацией специфичности Оа1Л31с (а значит сочетающий в себе углеводсвязывающие качества нескольких лектинов) для нормального инфицирования должен был связать и растение и ризобии.
Таким образом, гибридные лектины, полученные путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны вызывать симбиотические реакции у бобовых растений Более того, как видно на примере РБЬ/АвЬ, они способны расширять специфичность растений к ризобиям, возможно, за счет расширения у гибридов специфичности к углеводам
Одним из основных препятствий на пути повышения продуктивности сельскохозяйственных культур является недостаточная обеспеченность растений соединениями азота В связи с этим большой интерес представляет изучение высокоэффективного азотфиксирующего симбиоза между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями Изучение факторов специфичности, определяющих возможность формирования азотфиксирующих клубеньков, к которым относятся лектины бобовых растений, имеет огромный практический интерес. Создание небобовых трансгенных растений, способных фиксировать азот атмосферы, позволит в какой то мере решить «проблему азота», являющуюся одной из основных препятствий на пути эволюции живого
С целью изучения строения углеводсвязывающих последовательностей нами амплифицированы, клонированы в фагмидных векторах и секвенированы нуклеотидные последовательности участков генов лектина протяженностью 261-379 пн из 22 видов бобовых растений относящихся к 17 родам 31 нуклеотидная и аминокислотная последовательности фрагментов генов лектинов зарегистрированы в международных банках данных ЕМВЬ/ОепВапкЛЖВ 1
Получены уникальные данные о строении углеводсвязывающих участков лектина ряда родов бобовых растений умеренного климата, характеризующихся большой вариабельностью и имеющих консенсусную
последовательность AspTrePheXxxAsxXxxXxxTrpAspProXxxXxx/ra'/De/ArgHis, в которой сосредоточено большинство как замен, так и вставок/делеций аминокислот Обнаружена некоторая взаимосвязь между образованием групп бобовых растений, подчас из разных родов и триб, вступающих в симбиоз с одним и тем же видом ризобий и схожестью строения углеводсвязывающих участков молекул лектина этих растений В углеводсвязывающей области лектинов растений одной группы инокуляции присутствуют консервативные, характерные только для данной группы растений, аминокислоты
С помощью оригинальной методики сайт-направленного мутагенеза созданы уникальные химерные конструкции, представляющие собой полноразмерный ген лектина гороха с областью, кодирующей УСП, замещенной соответствующими участками генов других бобовых растений Синтезируемые в клетках Е coll гибридные лектины вызывали агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их пространственной укладки и димеризации субъединиц Замещение УСП лектина гороха на УСП лектинов Melilotus albus и Astragalus glycyphyllos привело к изменению специфичности к моно- и дисахаридам Замещение углеводсвязывающего участка лектина Р sativum участком лектина A. glycyphyllos привело к значительному ослаблению аффинности к Man и приобретению свойства связываться с Gal. Таким образом, гибридный лектин PSL/AGL проявил совмещенную специфичность к Gal и Glc, что нехарактерно для природных лектинов бобовых растений.
При обработке данным лектином бактерий из A cicer, близких по генам 16S рРНК к A tumefaciens, наблюдали нехарактерные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков на корнях люцерны
Таким образом, гибридные лектины с измененной специфичностью к углеводам способны расширять круг микросимбионтов бобового растения, и их можно использовать для исследований физиологических свойств этих белков в бобово-ризобиальных взаимодействиях Кроме того, результаты исследований формирования углеводной специфичности лектинов, обусловленной их структурными особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с заданными углеводсвязывающими свойствами, которые можно применять для решения целого ряда задач биотехнологии
ВЫВОДЫ
1 Амплифицированы, клонированы и секвенированы участки генов лектинов протяженностью 261 — 379 пн, кодирующие углеводсвязывающие последовательности данного белка у 22 видов бобовых растений, относящихся к 17 родам.
2 На основании множественного выравнивания выведена консенсусная последовательность углеводсвязывающих пептидов лектинов бобовых растений умеренного климата, выражающаяся последовательностью аминокислот Asp-Tre-Phe-Xxx-Asx-Xxx-Xxx-Trp-Asp-Pro-Xxx-Xxx-Ins/Del-Arg-His.
3. Обнаружена взаимосвязь между образованием групп бобовых, вступающих в симбиоз с одним и тем же видом ризобий, и схожестью строения углеводсвязывающих последовательностей (УСП) молекул их лектинов В УСП этих растений показано наличие консервативных, характерных только для данной группы растительных лектинов, аминокислот
4 У караганы древовидной, караганы кустарниковой и солодки голой обнаружено по несколько различных генов лектина При этом у представителей рода Caragana выявлено три различных класса лектиновых генов, причем внутри каждого из классов имеется ряд генов, кодирующих более близкие лектины. Показано, что гены одного класса лектинов разных растений филогенетически ближе, чем гены лектина разных классов у одного и того же вида бобовых, что позволяет говорить о наличии у бобовых как ортологичных, так и паралогичных генов лектинов.
5. Лектины близких видов растений козлятников восточного и лекарственного значительно различаются при высокой гомологии Nod-факторов их ризобий Данные обстоятельства можно рассматривать как свидетельство в пользу независимого влияния этих двух факторов специфичности на формирование бобово-ризобиального симбиоза и что лектин является одной из критических молекул, обуславливающих существование двух групп инокуляции G officinalis - R galegae bv officinalis и G orientalis - R galegae bv orientahs
6. Созданы химерные конструкции на основе гена лектина гороха Pisum sativum (psl) с углеводсвязывающим участком, замещенным на таковые
лектинов Onobrychis arenaria (psl/oal), Trifolium pratense(psl/tpl), Astragalus glycyphyllos (psl/agl) и Melilotus albus (psl/mal)
7 Синтезируемые в клетках E coli гибридные лектины способны связывать сахариды и вызывать агглютинацию эритроцитов, что указывает на их корректную пространственную укладку и ассоциацию субъединиц Замещение УСП лектина Р sativum PSL на УСП лектинов A glycyphyllos (PSL/AGL) и М albus (PSL/MAL) привело к изменению специфичности к моно- и дисахаридам
8. В клубеньках астрагала нутового Astragalus cicer обнаружены бактерии, филогенетически близкие по последовательностям генов 16S рРНК к Agrobacterium tumefaciens strain IAM 14, а в клубеньках эспарцета песчаного - к Phyllobacterium trifolii
9. Выявлены генетические различия между штаммами Rhizobium galegae, нодулирующими козлятник восточный, и штаммами, вступающими в симбиоз с козлятником лекарственным
10 Разработан и запатентован метод цифровой паспортизации микроорганизмов и создания по ним электронных баз данных.
11 Обработка находящихся в ризосфере Medicago sativa ризобий R. leguminosarum bv viciae синтезированным в Е coli лектином PSL привела к образованию неинфицированных клубеньков, что свидетельствует о сохранении у лектинов, наработанных в прокариотической экспрессионной системе, симбиотических функций
12. При обработке гибридным лектином PSL/AGL клубеньковых бактерий Astragalus cicer в ризосфере М sativa обнаружены нетипичные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков Таким образом, гибридные лектины, полученные путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны вызывать симбиотические реакции у бобовых растений Более того, они расширяют (PSL/AGL) специфичность растений к ризобиям, возможно, за счет расширения у гибридов специфичности к углеводам.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Chemeris А V, Baymiev A1 Kh., Vakhitov V А, Safronova V Rhizobium DNA fingerprinting with the use of different approaches and probes // X International Congress on Nitrogen Fixation. - St Petersburg, 1995.
2 Chemeris A.V., Baymiev AIKh, Vakhitov VA., Safronova V DNA fingerprinting of rhizobia with the use of different approaches and probes // In Nitrogen Fixation- Fundamentals and Applications (Tikhonovich IA et al, Eds.) Dordrecht, Kluwer Academic Publishers. - 1995. - P. 682
3. Баймиев A.X., Чемерис A.B., Вахитов В А Сравнительный анализ генов лектина растений семейства бобовых // Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология 3-й ежегодный симпозиум, 27—28 июня - М , 1997. - С 46.
4. Баймиев А X, Чемерис А В Клонирование и секвенирование гена лектина гороха посевного // Научная конференция студентов и молодых ученых биологического факультета -Уфа, 1997 - С. 29
5 Чемерис А В., Баймиев А.Х , Вахитов В А. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности лектина и кодируемого им белка у представителей различных триб семейства бобовых и специфичность их узнавания микросимбионтом при формировании бобово-ризобиального симбиоза // Молекулярная биология -1998 -Т. 31, № 2. - С. 383
6. Baymiev Al.Kh., Chemeris А V , Vakhitov V.A Comparison of leguminous plant lectin sugar binding domain m connection with different host specificity during interaction with symbiotic rhizobium // Bulgarian Journal of Plant Physiology -1998 - Specialissue.-P.216
7. Баймиев Ал.Х., Чемерис A.B., Вахитов В А Анализ информативности некоторых современных методов идентификации полиморфизма ДНК микроорганизмов на примере симбиотических клубеньковых бактерий Rhizobium galegae И Генетика - 1999 - Т. 35, № 12. - С. 1613-1621
8. Baymiev Al.Kh, Chemens А V., Vakhitov V.A. The clonmg and sequencing of lectin gene fragments of some representatives of leguminous plants of moderate climate //18th Interlec Conference, Portsmouth, GB -1999 -P 53.
9. Баймиев Ал.Х., Чемерис A.B , Баймиев Ан X., Вахитов В А. Углеводсвязы-вающие пептиды лектинов бобовых растений в связи с различной хозяйской специфичностью макросимбионта при образовании симбиоза с клубеньковыми бактериями II Генетика. - 2001. - Т 37, № 2 - С. 215-222.
10 Губайдуллин И И, Баймиев Ал X Различия в строении углеводсвязывающих пептидов лектина у козлятников восточного и лекарственного определяют разницу выбора ими партнера при бобово-ризобиальном симбиозе // Материалы юбилейной научной конференции молодых ученых «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» -Уфа, 2001 -С 16-17
11 Губайдуллин И И., Баймиев Ал X. Специфичность симбиоза козлятников восточного и лекарственного со штаммами Rhizobium galegae определяется различиями в строении углеводсвязывающих пептидов их лектинов // 6-я Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века». Том 1. - Пущино, 2002. — С 237
12 Баймиев Ан X., Баймиев Ал X, Матниязов Р.Т, Гималов Ф Р Использование фракционирования по размеру рестрицированной ДНК для увеличения специфичности ПЦР // Ш съезд биохимического общества. — Санкт-Петербург, 2002 -С 276-277.
13.Губайдуллин ИИ., Баймиев АлХ. Химерные гены лектинов бобовых с измененной специфичностью к углеводам // Ш Съезд Биохимического общества - Санкт-Петербург, 2002. - С 285
H.Chemens A.V., Baymiev А К, Usanov N G, Vakhitov V.A Genetical bar-coding of rhizobia strains // 5-th European Nitrogen Fixation Conference, Norwich, 610 September 2002. Section 2,2 4
15.Baymiev Al Kh., Chemens A V, Chemeris D A, Korpela T, Usanov N G, Vakhitov V.A Digital identification of genetic materials and methods for acquring data for it // Patent Cooperation Treaty PCT WO 03/066899 Al. World Intellectual Property Organization 14 August - 2003. - P. 39.
16 Губайдуллин ИИ., Баймиев АлХ. Клонирование генов лектина Galega orientalis и Pisum sativum в бинарном векторе для трансформации растений pGreen 0229 (35S) // XVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». — Москва, 2004.-С 47
17 Чемерис А В, У санов Н Г, Баймиев Ал X, Губайдуллин И И, Корпела Т, Вахитов В А Генетическое штрих-кодирование микроорганизмов как способ изучения их биоразнообразия // Тезисы докладов международной конференции «Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» — Пущино, 2004 — С. 46-48
18 Губайдуллин ИИ, Баймиев АлХ, Муниров ХС, Чемерис AB Влияние загрязнения субстрата кадмием на симбиоз козлятника восточного с бактериями Rizobium galegae II Агрохимия —2005 -№12.-С 67-71
19.Баймиев АлХ, Губайдуллин ИИ, Чемерис А.В, Вахитов В А Вклад структуры углевод-связывающих пептидов лектина в определении специфичности бобово-ризобиального симбиоза у козлятника восточного и лекарственного//Молекулярная биология —2005.— Т. 39, №1 -С 103—111
20.Губайдуллин И И, Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х, Чемерис А В, Вахитов В А. Синтезированный в Е coli лектин гороха посевного {pst) способен инициировать клубенькообразование на люцерне посевной при ее инокуляции Rhizobium legummosarum bv. viciae II Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. - 2006 - Т. 2, № 2. — С. 11-16
21.Губайдуллин ИИ, Баймиев АлХ., Чемерис AB., Вахитов В А Создание гибридных лектинов с новыми углеводсвязывающими свойствами // ДАН — 2006.-Т 411,№5 -С 687-688.
22.Губайдуллин И И., Баймиев Ал X, Баймиев Ан X. Получение лектинов с измененной углеводспецифичностью // Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего». - Санкт-Петербург, 2006. — С. 23—24.
23.Вершинина 3 Р, Дмитрюкова М Ю, Баймиев А X. Разработка метода получения трансгенных бородатых корней, несущих гибридные лектины бобовых, на облепихе, рапсе и люцерне // Ш Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых «Научное и экологическое обеспечение современных технологий» — Уфа, 2006 — С. 23
24 Баймиев Ал X, Баймиев Ан X, Губайдуллин И И, Чемерис А В Клубеньковые бактерии астрагала нутового и эспарцета песчаного: генетическое разнообразие и филогенетическое положение // Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН — Москва, 2006. — С. 12
25 Баймиев Ан X., Баймиев Ал X, Птицын К.Г, Чемерис A.B. Генетическая гетерогенность ризобий вступающих в симбиоз с дроком красильным и караганой древовидной // Международная конференция «Генетика в России и мире» посвященная 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН. - Москва, 2006 - С. 11.
26.Губайдуллин И И, Баймиев Ал. X, Баймиев Ан. X Различия в углеводсвязывающих пептидах лектинов клеверов Trifolium repens, Т pratense, Т trichocephalum, инокулирующихся сходными ризобиальными штаммами // Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН. — Москва, 2006. - С. 56
27.Губайдуллин И И, Баймиев Ал X, Баймиев Ан X. Экзогенная обработка
гибридными лектинами способна расширять круг перекрестной инокуляции бобовых растений ризобиями // Ш-я Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», 10-12 октября 2006 г — Саратов, 2006 — С 24.
28 Баймиев А X , Вершинина 3 Р , Дмитрюкова М Ю Получение облепихи с трансгенными корнями несущими химерные гены лектинов бобовых растений // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю А Овчинникова, 6—7 декабря 2006 г. — Пущино, 2006 — С 24
29 Баймиев Ан X , Баймиев Ал X, Вершинина 3 Р , Куликова О JI Генетическое биоразнообразие популяций ризобий Smorhtzobium meliloti, вступающих в симбиоз с бобовыми родов Medicago и Melilotas произрастающих в Башкортостане // Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С И. Алиханяна — Москва, 2006 — С 35
30 Губайдуллин И И, Баймиев Ал X, Баймиев Ан X, Чемерис А В. Углеводсвязывающие последовательности лектинов у клеверов Т repens, Т pratense и Т trichocephalum //Генетика 2007.-Т 43, №4 -С. 477-481
31.Баймиев АлХ, Губайдуллин ИИ, Баймиев АнХ., Чемерис А В., Баймиев Х.М, Вахитов В А Симбиоз козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium galegae специфичность и конкурентоспособность // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. — Т 43, № 3. — С. 311—317
32.Баймиев Ал X , Баймиев Ан.Х , Губайдуллин И И, Куликова О Л, Чемерис А В. Филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с астрагалом нутовым П Микробиология 2007 — Т 76, № 1 -С 129-131
33.Баймиев Ал X, Баймиев Ан X, Губайдуллин И И, Куликова О JL, Чемерис А В В клубеньках эспарцета песчаного обнаружены бактерии, близкие по гену 16S рРНК к Phyllobacterium trifoln // Генетика 2007 - Т. 43, № 5. -С 716-719
34.Баймиев Ал X, Губайдуллин И И, Баймиев Ан X., Чемерис А В Влияние природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями // Прикладная биохимия и микробиология. — 2007 — Т. 43, № 4
35 Баймиев Ал X, Губайдуллин И И, Баймиев Ан X., Чемерис А.В Сайт-направленный мутагенез нуклеотидных последовательностей, кодирующих углеводсвязывающие участки лектинов бобовых растений, с использованием инвертированной ПЦР // Молекулярная биология —2007 — Т 41, №5
Формат 60 х 84 1/|б Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Печать офсетная Тираж 100 экз Тип зак № 38
Отпечатано на оборудовании издательства «Гилем» Академии наук РБ 450077, г Уфа, Кирова, 15 Тел (347) 273-05-93,272-36-82
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Баймиев, Алексей Ханифович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Становление бобово-ризобиального симбиоза: 20 специфичность инфекции и клубенькообразования
1.1. Происхождение бобово-ризобиального симбиоза
1.2. Механизмы инфекции и клубенькообразования
1.3. Сигналлинг между ризобией и бобовым растением
Глава 2. Структура и функции лектинов бобовых растений
2.1. Общая характеристика лектинов растений
2.2. Структура лектинов бобовых растений
2.3. Функции лектинов
Глава 3. Роль лектина в бобово-ризобиальном симбиозе
Глава 4. Клубеньковые бактерии: современная систематика и 59 особенности организации генома.
4.1. Современная систематика клубеньковых бактерий
4.2. Особенности организации генома клубеньковых бактерий 82 ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 5. Объекты исследований 86 5.1. Краткая характеристика объектов исследований
Глава 6. Методы исследований
6.1. Выделение и очистка ДНК растений
6.2. Выделение ДНК растений для проведения ПНР
6.3. Выделение и очистка ДНК ризобий
6.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК
6.5. Выделение и электрофоретическое разделение мегаплазмидной 94 ДНК ризобий
6.6. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК
6.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
6.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 98 условиях
6.9. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 100 условиях
6.10. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей
6.11. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры
6.12. Радиоактивное мечение препаратов ДНК
6.13. Блот-гибридизация ДНК
6.14. Подготовка компетентных клеток Е.coli
6.15. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК
6.16. Секвенирование ДНК ферментативным методом
6.17. Электрофоретическое фракционирование ДНК в 109 полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез)
6.18. Радиоавтография
6.19. Секвенирование ДНК на автоматическом секвенаторе
6.20. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
6.21. Полимеразная цепная реакция
6.22. Клонирование амплифицированных фрагментов генов 116 лектинов бобовых растений
6.23. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и 117 полинуклеотидкиназой фага Т
6.24. Экспрессия белка в клетках Е. coli и его выделение
6.25. Электрофоретическое фракционирование белков в 120 денатурирующих условиях
6.26. Агглютинация эритроцитов лектинами и ее подавление моно- и 121 дисахарами
6.27. Закладка опытов по исследованию конкурентоспособности 122 штаммов Я. galegae
6.28. Экзогенная обработка лектинами клубеньковых бактерий в 123 ризосфере бобового растения
6.29. Идентификация клубенек-образующего штамма
Глава 7. Реактивы и материалы
7.1. Бактериальные штаммы, плазмидные и фагмидные векторы
7.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении 126 ПЦР и сайт-направленном мутагенезе генов лектинов
7.3. Реактивы и материалы
7.4. Составы использованных стандартных растворов 130 ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 8. Сравнение углеводсвязывающих пептидов лектина бобовых 132 растений в связи с их различной хозяйской специфичностью при образовании симбиоза с клубеньковыми бактериями
8.1. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных 133 последовательностей и амплификация участка гена лектина у различных представителей бобовых растений
8.2. Клонирование и секвенирование фрагментов гена лектина 136 различных представителей бобовых растений
8.3. Клонирование и секвенирование полноразмерного гена лектина 146 гороха посевного сорта «Неосыпающийся-1»
8.4. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 149 секвенированных фрагментов генов лектина
8.5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей 156 лектинов бобовых растений
8.6. Взаимосвязь между строением лектинов и хозяйской 165 специфичностью бобового растения
8.6.1. Углеводсвязывающие последовательности лектинов клеверов Trifolium repens, Т. pratense и Т. trichocephalum 8.6.2. Углеводсвязывающие последовательности лектинов козлятников восточного и лекарственного 8.7. Взаимосвязь между строением УСП лектина, его специфичностью к углеводам и видовым составом ризобий, вступающих в симбиоз с бобовым растением, несущим данный белок.
Глава 9. Создание гибридных белков лектинов и анализ их углеводсвязывающих свойств
9.1. Создание химерных конструкций гена лектина
9.2. Синтез лектинов в клетках E.coli и их выделение
9.3. Анализ углеводной специфичности гибридных лектинов
Глава 10. Филогения и генетическое разнообразие клубеньковых 214 бактерий
10.1. Филогения и генетическое разнообразие клубеньковых 215 бактерий, вступающих в симбиоз с астрагалом нутовым
10.2. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых 220 бактерий, вступающих в симбиоз с эспарцетом песчаным
10.3. Симбиоз козлятника восточного с клубеньковыми бактериями 226 Rhizobium galegae: специфичность и конкурентоспособность
10.3.1. Специфичность симбиоза козлятника восточного с 228 клубеньковыми бактериями R. galegae
10.3.2. Конкурентоспособность клубенек-формирующих 231 штаммов R. galegae, применяемых для производства промышленных препаратов ризоторфина
10.3.3. Влияние загрязнения субстрата кадмием на симбиоз 237 козлятника восточного с R. galegae
10.4. Разработка метода для идентификации и паспортизации 245 микроорганизмов на примере штаммов ризобий R. galegae
Глава 11. Анализ влияния природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями
11.1 Экзогенная обработка лектинами бактерий в ризосфере 257 бобовых растений
11.2 Влияние лектинов PSL, GOL и PSL/MAL на симбиоз Astragalus 262 cicer и Galega orientalis с ризобиями
11.3. Влияние лектинов PSL, PSL/AGL на симбиоз Medicago sativa с ризобиями
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений как детерминанта специфичности взаимодействия с клубеньковыми бактериями"
Актуальность темы. Усвоение молекулярного азота воздуха (азотфиксация) является одним из важнейших биологических процессов, от которых во многом зависит жизнь на нашей планете. Азот является важнейшим элементом, оказывающим огромное влияние на плодородие почвы и урожайность сельскохозяйственных культур. Химические азотные удобрения, применяемые обычно в качестве источника азота в сельском хозяйстве, могут быть вредны с точки зрения экологии, и, кроме этого их производство требует значительных затрат энергоресурсов. Организмы-азотфиксаторы усваивают свободный азот воздуха в процессе своей жизнедеятельности, используя, в том числе дармовую энергию солнца. Особый интерес представляет фиксация атмосферного азота бобовыми растениями в симбиозе с клубеньковыми бактериями. Проблема симбиотической азотфиксации привлекает внимание ученых всего мира в связи с возможностью практического применения результатов исследований в данной области, значение которых трудно переоценить (Тихонович, 1997; Спайнк и др., 2002). Одним из критических моментов становления бобово-ризобиального симбиоза является стадия взаимного "узнавания" микроорганизма и растения-хозяина. Этот процесс характеризуется сложным обменом сигналами между макро- и микросимбионтом в ризосфере растения-хозяина еще до инвазии клубеньковых бактерий. Показано, что специфичность образования бобово-ризобиального симбиоза определяется в первую очередь растением-хозяином, диктующим способ формирования, характеристику структуры и развития азотфиксирующего клубенька (ВгоищЫоп й а1., 2000; СиаШеп е1 а1., 2000). Однако в отличие от ризобиальных факторов клубенькообразования, растительные компоненты, участвующие в инициации симбиоза изучены не так хорошо.
Несомненно, что в данный процесс вовлечены лектины бобовых, которые, как показано, могут обеспечивать избирательные взаимодействия растений с ризобиями благодаря своим углеводсвязывающим свойствам (Brill et al., 2004). В литературе содержатся сведения о расшифрованных последовательностях аминокислот лектинов бобовых, представленных преимущественно видами из различных родов тропических растений, произрастающих в разных географических регионах и обычно имеющих довольно широкий круг способных их инфицировать бактериальных микросимбионтов. Значительно больший интерес для изучения формирования специфичности азотфиксирующего симбиоза представляет выяснение строения лектинов бобовых растений умеренного климата, характеризующихся строгой специфичностью по отношению к своим ризобиальным партнерам. Подавляющее большинство этих растений, как показано Проворовым (1992), не формирует группы перекрестной инокуляции, образуя строго специфичный симбиоз только с определенным штаммом ризобий. В свою очередь, клубеньковые бактерии, вступающие в симбиоз с этими бобовыми, также проявляют строгую специфичность по отношению к своему растению-хозяину.
Знания о ключевых аминокислотах углеводсвязывающего участка, закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, могут быть использованы в моделировании белков с новыми и заданными углеводсвязывающими свойствами. Заменяя функционально значимые аминокислоты или области углеводсвязывающих участков можно создавать лектины с заданной специфичностью к сахаридам (а, следовательно, и функциями) которые можно применять для решения целого ряда задач биотехнологии, таких как получение высокоочищенных углеводов, создание биочипов и т.д. Кроме этого, возможно, что создание модифицированных или гибридных лектинов заметно облегчит исследование их роли в становлении бобово-ризобиального симбиоза. и
Интродукция чужеродных лектинов в другие бобовые растения может способствовать расширению группы клубеньковых бактерий, из которых макросимбионт в данных почвенно-климатических условиях сможет выбрать наилучшего партнера для симбиоза. Это, в конечном счете, должно привести к более высокому уровню азотфиксации и, соответственно, к увеличению урожайности сельскохозяйственных культур.
Эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов, позволяют оценивать роль этих белков, однако такого рода исследования довольно сложны и, кроме того, процедура трансформации бобовых растений представляет собой достаточно трудоемкий процесс. Один из вариантов решения данной проблемы заключается в изучении симбиотической роли лектинов при экзогенной обработке ими растений и микроорганизмов. Так, удобным инструментом для подобных исследований являются лектины бобовых, полученные с применением прокариотических экспрессионных систем. Такие системы позволяют нарабатывать сконструированные гибридные лектины с заданными свойствами для исследования функционально значимых углеводсвязывающих областей, определяющих возможность формирования бобово-ризобиальных отношений.
Цель работы заключалась в выявлении закономерностей строения углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений умеренного климата, создании на их основе гибридных лектинов и исследовании роли гибридных лектинов в становлении бобово-ризобиального симбиоза.
Задачи исследования:
1. Амплификация, клонирование и секвенирование фрагментов генов лектинов бобовых растений умеренного климата;
2. Анализ нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектинов, включающих углеводсвязывающий участок исследуемых видов бобовых растений;
3. Исследование взаимосвязи между строением углеводсвязывающего участка лектинов, их специфичностью к простым сахарам и таксономическим составом ризобий, вступающих в симбиоз с бобовым растением, несущим данный белок;
4. Конструирование гибридных лектинов с измененной специфичностью к углеводам на основе полноразмерного гена лектина гороха, путем замещения углеводсвязывающего участка этого белка гомологичными участками генов лектинов других бобовых растений;
5. Подбор условий для экспрессии гибридных генов лектинов в клетках Е. coli, синтез и выделение функционально активных белков;
6. Исследование углеводсвязывающих свойств гибридных лектинов;
7. Исследование филогении и генетического разнообразия клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз со взятыми в исследование видами бобовых растений;
8. Разработка методов идентификации и паспортизации штаммов клубеньковых бактерий;
9. Оценка влияния природных и гибридных лектинов на становление симбиоза бобовых растений с различными ризобиями.
Научная новизна. Клонированы и секвенированы участки генов лектинов, кодирующие углеводсвязывающие последовательности (УСП) данного белка у 22 видов бобовых растений, относящихся к 17 родам. На основании сравнительного анализа секвенированных нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных последовательностей лектинов построены древа сходства данных белков. Выведена консенсусная последовательность УСП Asp-Tre-Phe-Xxx-Asx-Xxx-Xxx-Trp-Asp-Pro-Xxx-Xхх-Ins!Del-Аrg-Hi s лектинов бобовых растений умеренного климата. У представителей рода Caragana обнаружено три класса различных генов лектина, причем внутри каждого из классов выявлен ряд генов, кодирующих более близкие лектины. Существенно отличающиеся друг от друга гены лектинов секвенированы и у солодки голой. Показано, что гены одного класса лектинов разных растений могут быть филогенетически ближе, чем гены лектина разных классов у одного и того же вида растений. У клеверов Trifolium repens, Т. pratense и Т. trichocephalum, входящих в одну группу перекрестной инокуляции, секвенированы фрагменты генов лектинов, имеющих разные по структуре аминокислотной последовательности УСП.
Показано, что УСП лектинов, специфичных к одному и тому же моносахариду, могут существенно отличаться по последовательности и составу включенных в процесс связывания сахара аминокислот. Обнаружено, что растения, вступающие в симбиоз с одними и теми же ризобиями, содержат лектины со схожим строением УСП и сходной специфичностью к простым сахаридам. В УСП лектинов растений, входящих в одну группу инокуляции, показано наличие консервативных аминокислот, характерных только для данной группы лектинов бобовых.
Показано, что лектины близких видов растений козлятников восточного и лекарственного, вступающих тем не менее в симбиоз с разными биоварами клубеньковых бактерий Rhizobium galegae (bv. orientalis и bv. ojficinalis, соответственно), значительно различаются при высокой гомологии Nod факторов их ризобий. Данный факт можно рассматривать как свидетельство в пользу независимого влияния этих двух факторов специфичности на формирование бобово-ризобиального симбиоза. Показана генетическая удаленность штаммов R. galegae, нодулирующих козлятник восточный, от штаммов, вступающих в симбиоз с козлятником лекарственным.
С помощью специально разработанной оригинальной методики сайт-направленного мутагенеза созданы уникальные химерные конструкции, кодирующие полноразмерный лектин гороха Pisum sativum (PSL) с углеводсвязывающим участком, замещенным на таковые лектинов растений клевера лугового Trifolium pratense (psl/tpl), эспарцета песчаного Onobrychis arenaria (psl/oal), донника белого Melilotus albus {psl/mal) и астрагала солодколистного Astragalus glycyphyllos (psl/agl). Показано, что синтезируемые в клетках Е. coli гибридные лектины способны связывать сахариды и вызывать агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их пространственной укладки и ассоциации субъединиц. Замещение УСП лектина гороха на УСП лектинов М. albus и A. glycyphyllos привело к изменению специфичности к моно- и дисахаридам, что свидетельствует о формировании углеводсвязывающим пептидом лектинов аффинности к простым сахаридам. Анализ углеводсвязывающих свойств гибридов показал, что специфичный к Man/Glc лектин PSL с участком лектина М. albus приобрел слабую аффинность к Gal/GalNAc, а при замещении на таковой A. glycyphyllos - к Gal, заметно ослабив аффинность к Man. Таким образом, у гибридного белка PSL/AGL обнаружена совмещенная специфичность к Gal и Glc, что нехарактерно для лектинов бобовых растений.
Впервые в клубеньках астрагала нутового Astragalus cicer обнаружены бактерии, филогенетически близкие по последовательностям генов 16S рРНК к Agrobacterium tumefaciens strain IAM 14 (GenBank Ac. No. D13294), a в клубеньках эспарцета песчаного - к Phyllobacterium trifolii (GenBank Ac. No. AY786080).
Впервые показано, что лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, вызывающие специфические реакции симбиоза. При обработке гибридным лектином PSL/AGL бактерий из клубеньков Astragalus cicer (филогенетически близких по генам 16S рРНК к Agrobacterium tumefaciens) в ризосфере люцерны, впервые наблюдали нетипичные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков. Это свидетельствует о том, что лектин относится к критическим факторам в данной симбиотической системе.
Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о строении молекул лектинов бобовых растений и демонстрируют неоднородность их углеводсвязывающих пептидов, а также способствуют более полному пониманию формирования специфичности данных белков к углеводам и принципов образования групп перекрестной инокуляции бобовых растений. Разработан и запатентован метод цифровой паспортизации микроорганизмов и создания по ним электронных баз данных. Исследована конкурентоспособность используемых в изготовлении промышленных препаратов ризоторфина штаммов ризобий козлятника восточного в почвенно-климатических условиях Башкортостана.
Полученные новые сведения о закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, обусловленной их структурными особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с заданными углеводсвязывающими свойствами. Разработанная нами стратегия изменения углевосвязывающих свойств лектинов позволяет моделировать лектины с разнообразной специфичностью, что может найти применение в различных областях биотехнологии. Гибридные лектины, полученные нами путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны вызывать симбиотические реакции у бобовых растений. Более того, они расширяют (напримкр, Р8Ь/АСЬ) специфичность растений к ризобиям, возможно за счет расширения у гибридов специфичности к углеводам. Исследования роли лектинов в бобово-ризобиальном симбиозе, благодаря созданию и использованию в них гибридных лектинов из разных растений с разными углеводсвязывающими свойствами, могут значительно упроститься и стать гораздо информативнее. Кроме того, гены таких гибридных лектинов как PSrM.Gr, можно интродуцировать в бобовые растения с целью увеличения группы клубеньковых бактерий, из которых растения в данных почвенно-климатических условиях могут выбрать наилучшего партнера для симбиоза, что, в конечном счете, может привести к более высокому уровню азотфиксации, и, соответственно, к росту биологической урожайности сельскохозяйственных культур.
Положения, выносимые на защиту.
1. Углеводсвязывающие последовательности (УСП) лектинов бобовых растений умеренного климата имеют консенсусную последовательность Азр-Тге-РЬе-Ххх-Азх-Ххх-Ххх-Тгр-Азр-Рго-Ххх-Ххх-/я$/1)е/- А^-Кэ.
2. Бобовые растения, вступающие в симбиоз с одними и теми же ризобиями, характеризуются близким строением УСП лектинов со сходной специфичностью к простым сахаридам.
3. В УСП лектинов растений, инокулирующихся одними и теми же ризобиями, имеются консервативные, характерные только для данной группы лектинов, аминокислоты.
4. Заменяя функционально значимые аминокислоты или области углеводсвязывающих участков, можно создавать лектины с измененной специфичностью к сахаридам.
5. Лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, обеспечивающие специфические реакции симбиоза.
6. Гибридные лектины, полученные путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны расширять круг перекрестной инокуляции бобовых растений.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 04-04-48884), РФФИ-Агидель (№ 02-04-97903) и грантами Программы поддержки ведущих научных школ РФ (96-1598061; 00-15-97810; НШ-2217.2003.4; НШ-1003.2006.4).
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995); на 3-м ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997); на Научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета БашГУ (Уфа, 1997); на Конференции посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997); на XI Международном конгрессе федерации европейского научного общества по физиологии растений (Варна, Болгария, 1998); на 18-ой международной конференции "Мег1ес18" (Портсмут, Великобритания, 1999); на конференции молодых ученых «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001); на 6-ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002); на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); на 5-ой Европейской конференции по фиксации азота (Норвич, Великобритания, 2002); на XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004); на международной конференции «Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004); на международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006); на III Республиканской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Научное и экологическое обеспечение современных технологий» (Уфа, 2006); на международной конференции «Генетика в России и мире» посвященной
40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006); на III Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва, 2006).
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 35 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных БВВ1/ЕМВЬ/ОепВапк.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах, содержит 45 рисунков и 10 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 419 работ.
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Баймиев, Алексей Ханифович
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
1. Амплифицированы, клонированы и секвенированы участки генов лектинов протяженностью 261 - 379 пн, кодирующие углеводсвязывающие последовательности данного белка у 22 видов бобовых растений, относящихся к 17 родам.
2. На основании множественного выравнивания выведена консенсусная последовательность углеводсвязывающих пептидов лектинов бобовых растений умеренного климата, выражающаяся последовательностью аминокислот Asp Tre Phe Ххх Asx Ххх Ххх Тгр Asp Pro Ххх Ххх Ins/Del Arg His.
3. Обнаружена взаимосвязь между образованием групп бобовых, вступающих в симбиоз с одним и тем же видом ризобий, и схожестью строения углеводсвязывающих последовательностей (УСП) молекул их лектинов. В УСП этих растений показано наличие консервативных, характерных только для данной группы растительных лектинов, аминокислот.
4. На основании сравнительного анализа секвенированных нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных последовательностей лектинов построены древа сходства данных белков, отражающие родственные взаимоотношения несущих их бобовых растений.
5. У караганы древовидной, караганы кустарниковой и солодки голой обнаружено по несколько различных генов лектина. При этом у представителей рода Caragana выявлено три различных класса лектиновых генов, причем внутри каждого из классов имеется ряд генов, кодирующих более близкие лектины. Показано, что гены одного класса лектинов разных растений филогенетически ближе, чем гены лектина разных классов у одного и того же вида бобовых.
6. Лектины близких видов растений козлятника восточного и лекарственного значительно различаются при высокой гомологии Nod-факторов их ризобий. Данный факт можно рассматривать как свидетельство в пользу независимого влияния этих двух факторов специфичности на формирование бобово-ризобиального симбиоза, и что лектин является одним из критических факторов, обуславливающих существование двух групп инокуляции G. officinalis - R. ga/egae bv. officinalis и G. oriental is - R. galegae bv. oriental is.
7. Созданы химерные конструкции на основе гена лектина гороха Pisum sativum {psi) с углеводсвязывающим участком, замещенным на таковые лектинов Onobrychis arenaria {psl/oal), Trifolium pratense(psl/tpl), Astragalus glycyphyllos (psl/agl) и Melilotus albus (psl/mal).
8. Синтезируемые в клетках E.coli гибридные лектины способны связывать сахариды и вызывать агглютинацию эритроцитов, что указывает на их корректную пространственную укладку и ассоциацию субъединиц. Замещение УСП лектина Р. sativum PSL на УСП лектинов A. glycyphyllos (PSL/AGL) и M albus (PSL/MAL) привело к изменению специфичности к моно- и дисахаридам.
9. В клубеньках астрагала нутового Astragalus cicer обнаружены бактерии, филогенетически близкие по последовательностям генов 16S рРНК к Agrobacterium tumefaciens strain I AM 14, а в клубеньках эспарцета песчаного к Phyllobacterium trifolii.
10. Выявлена заметная генетическая удаленность штаммов Rhizobium galegae, нодулирующих козлятник восточный, от штаммов, вступающих в симбиоз с козлятником лекарственным.
11. На основе метода КМРФ разработан и запатентован метод цифровой паспортизации микроорганизмов и создания по ним электронных баз данных.
12. Обработка находящихся в ризосфере Medicago sativa ризобий R. leguminosarum bv. viciae синтезированным в Е. coli лектином PSL привела к образованию неинфицированных клубеньков, что свидетельствует о сохранении у лектинов, наработанных в прокариотической экспрессионной системе, симбиотических функций.
13. При обработке гибридным лектином PSL/AGL клубеньковых бактерий Astragalus cicer в ризосфере М. sativa обнаружены нетипичные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков. Таким образом, гибридные лектины, полученные путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны вызывать симбиотические реакции у бобовых растений. Более того, они расширяют (PSL/AGL) специфичность растений к ризобиям, возможно, за счет расширения у гибридов специфичности к углеводам.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Усвоение атмосферного азота клубеньковыми микроорганизмами рода ЯЫхвЫит в симбиозе с бобовыми растениями является объектом пристального внимания ученых всего мира. Изучение механизма образования подобного симбиоза, факторов специфичности, определяющих возможность формирования азотфиксирующих клубеньков штаммом ризобий на конкретном растении, имеет вместе с теоретическим, также и огромный практический интерес. Создание небобовых трансгенных растений, способных фиксировать азот атмосферы, позволит в какой то мере решить «проблему азота», являющуюся одним из основных препятствий на пути эволюции органического мира. Кроме того, результаты исследований формирования углеводной специфичности лектинов, обусловленной их структурными особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с новыми и заданными углеводсвязывающими свойствами, которые можно применять для решения ряда задач биотехнологии и фармакологии.
С целью изучения строения лектинов бобовых растений, являющихся одной из детерминант формирования специфичности симбиоза нами был проведен компьютерный анализ известных из литературы и баз данных на момент начала работы аминокислотных последовательностей лектинов бобовых растений. На протяжении белковых цепей лектинов было выявлено наличие нескольких высококонсервативных участков, практически не отличающихся у сравниваемых видов по последовательностям составляющих их аминокислот. Далее по нескольким известным нуклеотидным последовательностям генов лектина были выведены консенсусные мотивы данных высококонсервативных областей уже на нуклеотидном уровне, к которым были подобраны несколько олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР, с таким расчетом, чтобы продукт амплификации включал последовательности, кодирующие углеводсвязывающий пептид данных белков. С использованием подобранных праймеров нами амплифицированы, клонированы в фагмидных векторах и секвенированы нуклеотидные последовательности участков генов лектина протяженностью 261-379 пн из 22 видов бобовых растений относящихся к 17 родам. У представителей рода Caragana обнаружено три класса различных генов лектина, причем внутри каждого из классов имеется ряд генов, кодирующих более близкие лектины, формирующие подклассы. Весьма характерным является то, что гены одного класса лектинов разных растений оказываются филогенетически ближе, чем гены лектина разных классов у одного и того же вида растений. У солодки голой также секвенировано два гена лектина, сильно отличающиеся друг от друга. Проведенный компьютерный анализ последовательностей с помощью пакета прикладных программ Lasergene позволил построить филогенетическое древо исследуемых лектинов, отражающее их родственные и эволюционные взаимоотношения и предсказать аминокислотные последовательности данного участка молекулы белка. Получены уникальные данные о строении углеводсвязывающих участков лектина ряда родов бобовых растений умеренного климата, характеризующихся большой вариабельностью и имеющих консенсусную последовательность Asp Tre Phe Ххх Asx Ххх Ххх Lrp Asp Pro Ххх Ххх Ins!Del Arg His, в которой сосредоточено большинство как замен, так и вставок/делеций аминокислот. 31 нуклеотидная и аминокислотная последовательности фрагментов генов лектина зарегистрированы в международных банках данных EMBL/GenBank/DDBJ.
Исследования показали, что УСП лектинов, специфичных к одному и тому же моносахариду, достаточно сильно отличаются по последовательности и составу включенных в процесс связывания сахара аминокислот. Лектины разных бобовых растений могут связывать одинаковые сахара с помощью различных сочетании активных аминокислотных остатков, тем самым' еще более повышая поливариантность строения углеводсвязывающего домена для образования тонкой специфичности белка к олигосахариду.
Обнаружена взаимосвязь между образованием групп бобовых * • растений, подчас из разных родов и триб, вступающих в симбиоз с одним и тем же видом 'ризобий H схожестью строения углеводсвязывающих участков молекул лектина этих растений. В организации генов лектинов растений, входящих в одну группу инокуляции, выражено наличие ч консервативных, характерных только для данной группы растительных лектинов, аминокислот. При этом, лектины растений одной группы инокуляции имеют сходную специфичность к простым сахаридам, то есть специфичность к моносахаридам является необходимым, но не достаточным условием, чтобы лектины специфично связывались с поверхностными полисахаридами ризобий. Секвенирование фрагментов генов, кодирующих углеводсязывающие участки лектинов морфологически близких видов растений козлятника восточного и лекарственного, вступающих тем не менее в симбиоз с разными биоварами клубеньковых бактерий Rhizobium galegae (bv. oriental is и bv. officinalis, соответственно) показало, что их лектины значительно различаются, при высокой гомологии Nod факторов их ризобий, являющихся детерминантами специфичности бобово-ризобиальной системы Galega sp. - R. galegae. Этот факт указывает на то, что лектин может являться одним из критических факторов, обуславливающих существование двух групп инокуляции G. officinalis - R. galegae bv. officinalis и G. orientalis - R. galegae bv. orientalis, но не является рецептором Nod факторов ризобий.
Опираясь на полученные данные с помощью оригинальной методики сайт-направленного мутагенеза, позволяющей заменять протяженные участки молекул ДНК, созданы уникальные химерные конструкции, представляющие собой полноразмерный ген лектина гороха с замещенным углеводсвязывающим участком (УСП) участками генов Trifolium pratense (psl/tp¡), Onobrychis arenaria (psl/oal), Melilotas albus (psl/mal) и Astragalus glycyphyllos (psl/agl). Показано, что синтезируемые в клетках Е. coli гибридные лектины способны связывать сахариды и вызывать агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их пространственной укладки и полимеризации субъединиц.
Анализ углеводсвязывающих свойств гибридных белков показал, что специфичный к Man/Glc PSL с участком лектина Melilotus albus приобрел слабую аффинность к Gal/GalNAc, а при замещении на таковой Astragalus glycyphyllos - к Gal, заметно ослабив аффинность к Man. Таким образом, разработанная нами стратегия изменения углевосвязывающих свойств лектинов позволяет моделировать лектины с разнообразной специфичностью, которые могут найти применение в таких биотехнологических процессах как тонкая очистка углеводов и т.д.
К сожалению, исследования формирования специфичности групп перекрестной инокуляции бобовых растений умеренного климата к отдельным видам и штаммам ризобий связаны с определенными трудностями, вследствие недостаточной изученности данных микроорганизмов. Многие клубеньковые бактерии, почв средней полосы России, в настоящий момент даже не имеют видового статуса.
Анализ бактерий из клубеньков астрагала нутового и эспарцета песчаного, произрастающих на горе Чесноковская Уфимского района Республики Башкортостан показал, что секвенированный фрагмент генов 16S рРНК клубеньковых бактерий астрагала, полностью идентичен таковому Agrobacterium tumefaciens strain I AM 14 (Dl 3294), описанному Yanagi и Yamasato, а бактерии эспарцета по последовательности генов 16S рРНК имеют 99,9% гомологии с Phyllobacterium trifolii, описанным Valverde с соавторами.
Одной из причин неизученности ризобий является практическое отсутствие морфологических различий между штаммами клубеньковых бактерий, инфицирующих то или иное растение. Вследствие чего идентификация штамма, образовавшего клубенек на конкретном бобовом растении, с помощью нумерических методов сопряжена с определенными трудностями.
Для решения данной проблемы нами был рассмотрены методы молекулярной биологии, способные с довольно высокой чувствительностью на генетическом уровне выявлять различия близкородственных штаммов бактерий. Исследована эффективность применения таких современных методов идентификации микроорганизмов как RAPD и КМРФ для обнаружения и паспортизации штаммов азотфиксирующих клубеньковых бактерий Rhizobium galegae, вступающих в симбиоз с козлятником. Выявлена генетическая отдаленность штаммов ризобий, нодулирующих козлятник восточный, от штаммов, специфичных к козлятнику лекарственному.
Рассмотрены сильные и слабые стороны каждого метода и даны рекомендации по их использованию. Особое внимание уделено относительно новому методу КМРФ, позволяющему с высоким разрешением не только идентифицировать, но и паспортизировать штаммы ризобий. На основе данного метода разработан метод цифровой паспортизации микроорганизмов путем присвоения им индивидуальных штрих кодов, выведенных на основании уникального набора длин фрагментов их рестрицированной ДНК. На метод получен международный патент РСТ WO 03/066899 AI "Digital identification of genetic materials and methods for acquiring data for it".
При обработке ризобий \egummosarum Ьу. \iciae лектином гороха в ризосфере люцерны обнаружены неинфицированные клубеньки необычайно больших размеров, имевшие особенную гроздеподобную форму, не наблюдавшиеся в других вариантах.
При инокуляции люцерны неспецифичными для нее бактериями А. скег и обработке гибридным лектином РБЬ/АвЬ, на корнях сформировались в небольшом количестве клубеньки. Рассев содержимого клубеньков на питательную среду выявил наличие в них бактерий, которые по ЯАРЭ ДНК-анализу оказались идентичны бактериям из клубеньков А. сгсег. Таким образом, в данном варианте наблюдались нетипичные симбиотические отношения между люцерной и клубеньковыми бактериями астрагала с образованием инфицированных клубеньков.
Гибридные лектины, полученные нами путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны вызывать симбиотические реакции у бобовых растений. Более того, они расширяют (РБЬ/АСЬ) специфичность растений к ризобиям, возможно за счет расширения у гибридов специфичности к углеводам. Исследования роли лектинов в бобово-ризобиальном симбиозе, благодаря созданию и использованию в них гибридных лектинов из разных растений с разными углеводсвязывающими свойствами, могут значительно упроститься и стать гораздо информативнее. Кроме того, гены таких гибридных лектинов как РБЬ/АвЦ сочетающих в себе углеводсвязывающие качества нескольких лектинов, можно интродуцировать в бобовые растения с целью увеличения группы клубеньковых бактерий, из которых растения в данных почвенно-климатических условиях могут выбрать наилучшего партнера для симбиоза, что, в конечном счете, может привести к более высокому уровню азотфиксации, а, стало быть и к росту биологической урожайности сельскохозяйственных культур.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Баймиев, Алексей Ханифович, Уфа
1. Андронов Е.Е., Румянцева М.Л., Симаров Б.В. Генетическое разнообразие природной популяции Sinorhizobium me/iloti, выявленное при анализе криптических плазмид и IS Rm20\ 1-2-фингерпринтов // Генетика. 2001. - Т.37, № 3. - С. 610-616.
2. Белимов A.A., Кунакова A.M., Сафронова В.И., Степанок В.В., Юдкин Л.Ю., Алексеев Ю.В., Кожемяков А.П. Использование ассоциативных бактерий для инокуляции ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием // Микробиология. 2004. - Т.73. - С. 118-125.
3. Доросинский Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л.: Колос, 1970. 191С.
4. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Мол. биология. 1994. - Т. 28, № 2. - С. 245-273.
5. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М.: Наука, 1973. 288 С.
6. Новикова H.H. Современные представления о филогении и систематике клубеньковых бактерий // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 4.-С. 437-450.
7. Новикова H.H., Сафронова В.И., Павлова Е.А. О характере взаимодействия клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium galegae с бобовыми растениями // С.-х. биология. 1992. - № 5. - С. 105-110.
8. Парийская А.Н., Клевенская И.Л. Распространение в природе и возможные пути эволюции азотфиксирующего симбиоза // Успехи микробиол. 1979.-Т. 14.-С. 124-147.
9. Проворов H.A. Взаимосвязь между таксономией бобовых и специфичностью их взаимодействия с клубеньковыми бактериями // Ботан. журнал. 1992. - Т. 77, № 8. - С. 21-32.
10. Проворов H.A. Коэволюция бобовых растений и клубеньковых бактерий: таксономические и генетические аспекты // Журнал общей биологии. 1996. - Т. 57. № 2. - С. 52-77.
11. Проворов H.A. Специфичность взаимодействия клубеньковых бактерий и бобовых растений и эволюция симбиоза // С.-х. биология. -1985.-№3.-С. 34-47.
12. Проворов H.A., Борисов А.Ю., Тихонович H.A. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами // Журнал общей биологии. 2002. - Т. 63. № 6. - С. 451 -472.
13. Родынюк И.С., Клевенская И.Л. Клубеньковые образования травянистых растений Сибири. Новосибирск: Наука, 1977.- 174 С.
14. Симаров Б.В., Аронштам A.A., Новикова H.H. Генетические основы селекции клубеньковых бактерий. Л.: Агропромиздат, 1990. 192 С.
15. Спайнк Г., Кондороши А., Хукас П. Rhizobiaceae, молекулярная биология бактерий взаимодействующих с растениями: Пер. с англ. / Под ред. Тихоновича H.A., Проворова H.A. Санкт-Петербург, - 2002. - 567 С.
16. Тахтаджян А.Л. Система магнолиофитов. Л.: Наука, 1987. 439 С.
17. Тихонович H.A. Повышение эффективности симбиотической азотфиксации у бобовых // Микробиол. журнал. 1997. - Т. 59, № 4. - С. 14-22.
18. Феник С.И., Трофимяк Т.Б., Блюм Я.Б. Механизмы формирования устойчивости растений к тяжелым металлам // Усп. совр. биол. 1995. -Т.1 15. - С. 261-275.
19. Чернова Т.А., Аронштам A.A., Симаров Б.В. Изучение генетической природы невирулентных штаммов СХМ1-125 и СХМ1126 Rhizobium meliloti II Генетика. 1986. - Т. 22. №.8. - С. 2066-2073.
20. Яковлев Г.П. Бобовые земного шара. Л.: Наука, 1991. - 144 С.
21. Abe M., Kawamura R., Higashi S., Mori S., Shibata M., Uchiumi T. Transfer of the symbiotic plasmid from Rhizobium leguminosarum bv. trifolii to Agrobacterium tumefaciens II J. Gen. Appl. Microbiol. 1998. - V. 44, N 1.- P. 65-74.
22. Abe M., Sherwood J.E., Hollingsworth R.I., Dazzo F.B. Stimulation of clover root hair infection by lectin-binding oligosaccharides from the capsular and extracellular polysaccharides of Rhizobium trifolii II J. Bacteriol. 1984. -V. 160. - P. 517-520.
23. Adar R., Sharon N. Mutational studies of the amino acid residues in the combining site of Erythrina corallodendron lectin // Eur. J. Biochem. 1996. -V. 239. P. 668-674.
24. Adar R., Streicher H., Rozenblatt S., Sharon N. Synthesis of soybean agglutinin in bacterial and mammalian cells // Eur. J. Biochem. 1997. - V. 249, N 3. - P. 684-689.
25. Allen O.N., Allen E.K. The Leguminosae. A source book of characteristics, uses and nodulation // Madison: Univ. Wisconsin Press, 1981. 800 P.
26. Al-Mallah M.K., Davey M.R., Cocking E.C. Enzymatic treatment of clover root hairs removes a barrier to Rhizobium host specificity // Biotechnol.- 1987. V. 5, N 8. - P. 1319-1322.
27. Al-Mallah M.K., Davey M.R., Cocking E.C. Formation of nodular structures on rise seedlings by rhizobia // J. Exper. Bot. 1989. - V. 40. - P. 473-478.
28. Armitage J.P., Gallager A., Johnston A.W.B. Comparison of the chemotactic behaviour of Rhizobiwn leguminosarum with and without the nodulation plasmid // Molec. Microbiol. 1988. - V. 2, N 6. - P. 743-748.
29. Badenoch-Jones J., Flanders D.J., Rollfe B.G. Association of Rhizobium strains with roots of Trifolium repens II Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49, N6.-P. 1511-1520.
30. Banfalvi Z., Sakanyan V., Koncz C., Kiss A., Dusha I., Kondorosi A. Location of nodulation and nitrogen fixation genes on a high molecular weight plasmid of R. meliloti II Mol. Gen. Genet. 1981.-V. 184. - P. 334-339.
31. Barbour W.M., Hatterman D.R., Stacey G. Chemotaxis of Bradyrhizobium japonicum to soybean exudates // Appl. Environ. Microbiol. -1991. V. 57. - P. 2635-2639.
32. Bauer W.D. Infection of legumes by rhizobia // Annu. Rev. Plant Physiol. 1981. - V. 32. - P. 407-409.
33. Baumann C., Rudiger H., Strosberg A.D. A comparison of the two lectins from Vicia cracca II FEBS Lett. 1979. - V. 102. - P. 216-218.
34. Baumann C„ Strosberg A.D., Rudiger H. Purification and characterization of a mannose/glucose-specific lectin from Vicia cracca II Eur. J. Biochem. 1982. - V. 122. - P. 105-1 10.
35. Becking J.H. The Rhizobium symbiosis with the nonlegume Parasponia // In: Biol. Nitrogen Fixation (Stacey G., Burris R.H., Evans H.J., Ed.). 1992. -P. 497-559.
36. Bhuvaneswari T.V., Bauer W.D. Role of lectins in plant-microorganism interactions // Plant Physiol. 1978. - V. 62. - P. 71-74.
37. Bhuvaneswari T.V., Mills K.K., Crist D.K., Evans W.R., Bauer W.D. Effect of culture age on symbiotic infectivity of Bradyrhizobium japonicum II J. Bacterid. 1983,-V. 153.-P. 443-451.
38. Bhuvaneswari T.V., Pueppke S.G., Bauer W.D. Role of lectins in plant-microorganisms interactions. I. Binding of soybean lectin to rhizobia // Plant. Physiol. 1977. - V. 60. - P. 486-492.
39. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 7. - P. 1513-1523.
40. Bohlool B.B., Schmidt E.L. Lectins: a possible basis for specificity in the Rhizobium-legume symbiosis // Science. 1974. - V. 185. - P. 269-275.
41. Boogerd F.C., van Rossum D. Nodulation of groundnut by Bradyrhizobium: a simple infection process by crack entry // FEMS Microbiology Reviews. 1997. - P. 5-27.
42. Booij P., Demel R.A., De Pater B.S., Kijne J.W. Insertion of pea lectin into a phospholipid monolayer // Plant. Mol. Biol. 1996. - V. 31. - P. 169-173.
43. Bouckaert J., Hamelryck T., Wyns L., Loris R. Novel structures of plant lectins and their complexes with carbohydrates // Curr. Opin. Struct. Biol. -1999.-V. 9, N 5.-P. 572-577.
44. Brelles-Marino G., Costa G.A., Boiardi J.L. Enhancement of infection thread formation by Rhizobium etli incubated with bean seed lectin // Microbiol. Res. 1996. - V. 151. - P. 243-246.
45. Brewer C.F. Multivalent lectin-carbohydrate cross-linking interactions // Chemtracts: Biochem. Mol. Biol. 1996. - V. 6. - P. 165-179.
46. Brill L. M., Fujishige N. A., Hackworth C. A., Hirsch A. M. Expression of MsLECl transgenes in alfalfa plants causes symbiotic abnormalities // Mol. Plant Microbe Interact. 2004. - V. 17, N 1. - P. 16-26.
47. Brom S., Martinez E., Davila G., Palacios R. Narrow- and broad-host-range symbiotic plasmids of Rhizobium spp. strains that nodulate Phaseolus vulgaris.// Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. - P. 1280-1283.
48. Brom S., Santos A.G., Stepkowsky T., Flores M., Davila G., Romero D., Palacios R. Different plasmids of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli are required for optimal symbiotic performance // J. Bacteriol. 1992. - V. 174, N16. - P. 5186-5189.
49. Broughton W.J., Jabbouri S., Perret H. Keys to symbiotic harmony// J. Bacteriol. 2000. P. 5641 -5652.
50. Broughton W.J., Samrey U., Stanlay J. Ecological genetics of Rhizobium meliloti: symbiotic plasmid transfer in the Medicago sativa rhisosphere // FEMS Microb. Lett. 1987. - V. 40, N 2. - P. 251-255.
51. Bunker T.W. // Ph.D thesis, University of California. // Plant Physiol. -1995. -V. 76. P. 879-884.
52. Burd G.I., Dixon D.G., Glick B.R. Plant growth promoting bacteria that decrease heavy metal toxicity in plants // Can. J. Microbiol. 2000. - V. 46. -P. 245-247.
53. Caetano-Anolles G., Joshi P., Gresshoff P. Nodulation in the absence of Rhizobium // In: Plant Biotech. Development (Gresshoff P., Ed.). London. -1992. P. 61-70.
54. Caetano-Anolles G., Wrobel-Boerner E., Bauer W.D. Growth and movement of spot inoculated Rhizobium meliloti on the root surface of alfalfa // Plant Physiol. 1992.-V. 98. - P. 1181-1189.
55. Callaham D.A., Torrey J.G. The structural basis for the infection of root hairs in Trifolium repens by Rhizobium II Can. J. Bot. 1981. - V. 59. - P. 1647-1664.
56. Carlson R.W. Heterogeneity of Rhizobium lipopolisaccharides // J. Bacterid. 1984. - V. 158. - P. 1012-1017.
57. Carlson R.W., Kalembasa S., Tunoroski D., Packori P., Noel K.D. Characterisation of the lipopolysaccharide from a Rhizobium phaseoli mutant that is defective in infection thread development // J. Bacteriol. 1987. - V. 169.-P. 4923-4928.
58. Casida L.E. Ensifer adhaerens gen. nov., sp. nov.: A bacterial predator of bacteria in soil. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1982. -.V. 32, - P. 339-345.
59. Chen W.X., Li G.S., Wang E.T., Yuan H.L., Li J.L. Rhizobium huakuii sop. nov. isolated from the root nodules of Astragalus sinicus II Internat. J. Systen. Bacteriol. 1991. - V. 41, N 2. - P. 275-280.
60. Chen W.X., Wang E.T, Kuykendall L.D. Genus Mesorhizobium // In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., (Garrity G.M., Ed.) -New York, Springer-Verlag. 2003. - V. 2.
61. Chen W.X., Yan G.H., Li J.L. Numerical taxonomic study of fast-growing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned to Sinorhizobium gen. nov. // Intern. J. Systen. Bacteriol. 1988. - V. 38, N 4. - P. 392-397.
62. Chervenak M.C., Toone E.J. Calorimetric analysis of the binding of lectins with overlapping carbohydrate-binding ligand specificities // Biochemistry. 1995.-V. 34, N 16.-P. 5685-95.
63. Chrispeels M.J., Raikhel N.V. Lectins, lectin genes and their role in plant defence//Plant Cell. 1991.-V. 3. P. 1-9.
64. Clewell D.B., Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular DNA form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. - V. 62, N 4. - P. 1159-1166.
65. Cobbett C.S. Phytochelatin biosynthesis and function in heavy metal detoxification // Curr. Opini. Plant Biology. 2000a. - V. 3. - P. 211-216.
66. Cobbett C.S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification // Plant Physiol. 2000b. - V. 123. - P. 825-832.
67. Cocking E.C., Davey M.R. Nitrogen from the air for non-legume crops // Chem. Industry. 1991. - P. 831-835.
68. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria Genetic transformation of E. coli by R-factor DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1972. - V. 69. - P. 2110-21 14.
69. Cote F., Hahn M.G. Oligosaccharins: Structures and signal transduction // Plant Mol. Biol. 1994.-V. 26. - P. 1379-1411.
70. Cullimore J.V., Ranjeva R., Bono J.J. Perception of lipo-chitooligosaccaridic Nod factors in legumes // Elsevier Science Ltd. 2001. -P. 1360-1385.
71. Dazzo F. B., Brill W. J. Receptor site on clover and alfalfa roots for Rhizobiumll Appl. Environ. Microbiol. 1977.-V. 33.-P. 132-136.
72. Dazzo F.B., Brill W.J. Regulation by fixed nitrogen of host-symbiont recognition in the rhizobium-clover symbiosis // Plant Physiol. 1978. - V. 62. -P. 18-21.
73. Dazzo F.B., Hubbel D.H. Cross-reactive antigens and lectin as determinants of symbiotic specificity in the Rhizobium-clovev association // Appl. Microbiol. 1975. - V. 30. - P. 1017-1021.
74. Dazzo F.B., Napoli C.A., Hubbell D.H. Adsorption of bacteria to roots as related to host specificity in the Rhizobium-clover symbiosis // Appl. Envir. Microbiol. 1976.-V. 32, N l.-P. 166-171.
75. Dazzo F.B., Truchet G.L, Sherwood J.E. Alteration of the trifolin A-binding capsule of Rhizobium trifolii -0403 by enzymes released from clover roots // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V. 44. - P. 478-490.
76. Dazzo F.B., Truchet G.L. Interactions of lectins and their saccharide receptors in the Rhizobium-legume symbiosis // J. Membr. Biol. 1983. - V. 73. -P. 4-11.
77. De Moranville C.J., Kaminski A.R., Barnett N.M., Bottino P.J., Blevins D.G. Substancies from cultured soybean cells which stimulate or inhibit acetylene reduction by free-living Rhizobium japonicum II Physiol. Plant. -1981.-V. 42, N 1.-P. 53-58.
78. Deasey M. C., Matthysse A. G. Interactions of wild type and a cellulose-minus mutant of Agrobacterium tumefaciens with tobacco mesophyll and tobacco tissue culture cells // Phytopathology. 1984. - V. 74. - P. 991-994.
79. Denarie I., Cullimore J. Lipo-oligosaccharide nodulation factors: a new class of signalling molecules mediating recognition and morphogenesis // Cell. 1993. -V. 74. - P. 951-954.
80. Denarie I., Debelle F., Prome J.C. Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: signaling molecules mediating recognition and morphogenesis // Annu. Rev. Biochem. 1996. - 65. - P. 503-535.
81. Di Virgilio S.N.A. High performance lectin affinity chromatography for fractionation and sequence determination of oligosaccharides // University of Georgia. 1998.
82. Diaz C.L., Logman T.J.J., Stam H.C., Kijne J.W. Sugar-binding activity of pea lectin expressed in white clover hairy roots // Plannt Physiol. 1995. -V. 109.-P. 1167-1177.
83. Diaz C.L., Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., Lugtenberg B.J.J., Kijne J.W. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium-\Qgume symbiosis //Nature. 1989. - V. 338. - P. 579-581.
84. Diaz C.L., Spaink H.P., Kijne J.W. Heterologous rhizobal lipochitin oligosaccharides and chitin oligomers induce cortical cell divisions in red clover root, transformed with the pea lectin gene // Mol. Plant Microbe Interact. 2000,-V. 13.-P. 268-276.
85. Diaz C.L., Van Spronsen P.C., Bakhuizen R., Logman G.J.J., Lugtenberg B.J.J., Kijne J.W. Correlation between infection by Rhizobium leguminosarum and lectin on the surface of Pisum sativum L. roots // Planta. 1986. - V. 168. -P. 350-358.
86. Dixon R.A., Paiva N.L. Stress-induced phenylpropanoid metabolism // Plant Cell. 1995.- V. 7.-P. 1085-1097.
87. Djordjevic M.A., Zurkowski W., Shine J., Rolfe B.G. Sym plasmid transfer to various symbiotic mutants of Rhizobium trifolii, R. leguminosarum and R. meliloti II J. Bacteriol. 1983.-V. 156, N3.-P. 1035-1045.
88. Dobert R.C., Breil B.T., Triplett E. DNA sequence of the common nodulation genes of Bradyrhizobium elkanii and their phylogenetic relationship to those of other nodulating bacteria // Mol. Plant-Microbe Interact. 1994. -V. 7,N5.-P. 564-572.
89. Dooley J.J., Harrisson S.P., Mytton L.R., Dye M., Cresswell A., Scot L., Beeching J.R. Phylogenetic grouping and identification of Rhizobium isolates based on random amplified polymorphic DNA profiles // Can. J. Microbiol. -1993. V. 39. - P. 665-673.
90. Dreyfus B., Dommergueas Y.R. Nitrogen-fixing nodules induced by Rhizobium on the stem of the tropical legume Sesbania rostrata II FEMS Microbiol. Letts. 1981. -V. 10. - P. 313-317.
91. Dreyfus B., Garcia J.L., Gillis M. Characterization of Azorhizobium caulinodans gen. nov., sp. nov., a stem-nodulating nitrogen-fixing bacteriaisolated from Sesbania rostrata II Internat. J. Systen. Bacteriol. 1988. - V. 38, N1.-P. 89-98.
92. Duxbury T., Bicknell B. Metal tolerant bacterial populations from natural and metal-polluted soil // Soil. Biol. Biochem. 1983. - V. 15. - P. 243-250.
93. Dye M., Scot L., Mytton L.R., Harrison S.P., Dooley J.J., Cresswell A. A study of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii populations from soil extracts using randomly amplified polymorphic DNA profiles // Can. J. Microbiol. 1995. - V. 41. - P. 336-344.
94. Dylan T. Rhizobium meliloti genes required for nodule development are related to chromosomal virulence genes in Agrobacterium tumefaciens II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 4403-4407.
95. Eardly B.D., Materon L.A., Smith N.H., Johnson D.A., Rumbaugh M.G., Selander R.K. Genetic structure of natural populations of the nitrogen-fixing bacterium Rhizobium meliloti II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56, N 1. -P. 187-194.
96. Ebeling S., Kundig C., Hennecke H. Discovery of a rhizobial RNA that is essential for symbiotic root nodule development // J. Bacteriol. 1990. - V. 173, N. 20.-P. 6373-6382.
97. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid in bacteria// Plasmid. 1978. - V. 1. - P. 584-588.
98. Elgavish S., Shaanan B. Chemical characteristics of dimer interfaces in the legume lectin family // Protein Science. 2001. - V. 10. - P. 753-761.
99. Etzler M.E. Plant lectins: Molecular biology, synthesis, and function // In Glycoconjugates: Composition, structure and function. 1992. - P. 521 -539.
100. Etzler M.E. Production of a lectin in tissue cultures of Dolichos biflorus II Annu. Rev. Plant Physiol. 1985. - V. 36. - P. 209-234.
101. Etzler M.E. The Lectins: Properties, functions and applications in biology and medicine // New York, Academic Press. 1986.- P. 371-435.
102. Etzler M.E., Marilynn E. From structure to activity: new insights into the functions of legume lectins // in Glycoscience and Glycotechnology. 1998. -V. 10,N53-P. 247-255.
103. Etzler M.E., Murphy J.B. Do legume vegetative tissue lectins play roles in plant-microbial interactions? // In: Biology of Plant-Microbe Interactions (Stacey G., Mullin B, Gresshiff P.M., Eds). St. Paul, ISMPMI. - 1996. - P. 105-110.
104. Feinberg A.P., Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity // Anal. Biochem. -1983.-V. 132.-P. 6-13.
105. Finan T.M., Hirsch A.M., Leigh J.A., Johansen E., Kuldau G.A., Deegan S., Walker G.C., Signer E.R. Symbiotic mutants of Rhizobium meliloti that uncouple plant from bacterial differentiation // Cell 1985. - V. 40. - P. 869877.
106. Finan T.M. Evolving insights: Symbiosis islands and horizontal gene transfer. // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 2855-2856.
107. Foriers A., de Neve R., Kanarek L., Strosberg A.D. Common ancestor for concanavalin A and lentil lectin? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. -P. 1136-1139.
108. Franssen H.J., Vijn I., Yang W.C., Bisseling T. Developmental aspects of the Rhizobium-legume symbiosis // Plant. Mol. Biol. 1992. - V. 19. - P. 89107.
109. Fraysse N., Couderc F., Poinsot V. Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legamQ symbiosis // Eur. J. Biochem. 2003. -V. 270. - P. 1365-1380.
110. Freiberg C., Fellay R., Bairoch A., Brouchton W.J., Rosen-thai A., Perret X. Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes. // Nature. -1997.-V. 387. P.394-401.
111. Gadd G.M. Heavy metal accumulation by bacteria and other microorganisms // Experientia. 1990. - V. 46. - P. 834-840.
112. Gao J., Terefework Z., Chen W., Lindstrom K. Genetic diversity of rhizobia isolated from Astragalus adsurgens growing in different geographical regions of China // J. Biotechnol. 2001. - V. 91. - P. 155-168.
113. Gao J.L., Sun J.G., Wang E.T., Chen W.X. Numerical taxonomy and DNA relatedness of tropical rhizobia isolated from Hainan province, China // Intern. J. System. Bacteriol. 1994. - V. 44, N 1. - P. 151-158.
114. Garoff, H., Ansorge, W. Improvements of DNA sequencing gels // Anal. Biochem. 1981. - V. 115. - P.450-457.
115. Gatehouse J.A., Bown D., Evans I.M., Gatehouse L.N., Jobes D., Preston P., Croy R.R.D. Sequence of the seed lectin from pea (Pisum sativum L.) // Nucl. Acids Res. 1987. - V. 15, N 18. - P. 7642.
116. Gaunt M.W., Turner S.L., Rigottier-Gois L., Lloyd-Macgilp S.A., Young J.P.W. Phylogenies of atpD and recA support the small subunit rRNA-based classification of rhizobia. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - 51. - P. 2037-2048.
117. Gegg C.V., Roberts D.D., Segel I.H., Etzler M.E. Characterization of the adenine binding sites of two Dolichos biflorus lectins // Biochemistry. 1992. -V. 31,N30.-P. 6938-42.
118. Geremia R.A., Mergaert P., Geelen D., Van Montagu M., Holsters M. The NodC protein of Azorhizobium caulinodans is an N-acetylglucosaminyltransferase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. -P. 2669-2673.
119. Geurts R., Franssen H. Signal transduction in Rhizobium-'mducQd nodule formation // Plant Physiol. 1996. - V. 112. - P. 447 - 453.
120. Goethals K., Van Den Eede G., Van Montagu M., Holsters M. Identification and characterization of a functional nodD gene in Azorhizobium caulinodans ORS571 // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 2658-2666.
121. Goossens A., Geremia R., Bauw G., van Montagu M., Angenon G. Isolation and characterisation of arcelin-5 proteins and cDNAs // Eur. J. Biochem. 1994. - V. 225. - P. 787-795.
122. Gottfert M., Rothlisberger S., Kundig C., Beck C., Marty R., Hennecke H. Potential symbiosis-specific genes uncovered by sequencing a 410-kilobase DNA region of the Bradyrhizobium japonicum chromosome // J. Bacteriol. -2001.-V. 183.-P. 1405-1412.
123. Go vers F., Moerman M., Downie J. A. Rhizobium nod-genes are involved in inducing on early nodulation gene // Nature. 1986. - V. 323. - P. 564-566.
124. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. - V. 85, N 2. - P. 609-613.
125. Gualtieri G., Bisseling T. The evolution of nodulation // Plant Mol. Biol.- 2000. V. 42.-P. 181-194.
126. Guo W., Zhang X.X., Zhang Z.M., Li F.D. Characterization of Astragalus sinicus rhizobia by restriction fragment length polymorphism analysis of chromosomal and nodulation gene regions // Curr. Microbiol. -1999.-V. 39. P. 358-364.
127. Hagen M.J. Hamrick J.L. A hierarchical analysis of population genetic structure in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii II Mol. Ecol. 1996. - V. 5. -P. 177-186.
128. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // J. Exp. Botany. 2002. - V. 53. - P. 1-11.
129. Halverson L.J., Stacey G. Effect of lectin on nodulation by wild-type Bradyrhizobium japonicum and a nodulation-defective mutant // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 51. - P. 753-760.
130. Halverson L.J., Stacey G. Signal exchange in plant-microbe interactions // Microbiol. Rev. 1986. - V. 50, № 2. - P. 193-225.
131. Hamblin J., Kent S.P. Possible role of phytohemagglutinin in Phaseolus vulgaris L. // Nature New Biol. 1973. - V. 245. - P. 28-29.
132. Hamelryck T. W., Poortmans F., Goossens A., Angenon G., Van Montagu M., Wyns L., Loris R. Crystal Structure of Arcelin-5, a Lectin-like Defense Protein from Phaseolus vulgaris II J. Biol. Chem. 1996; - V. 271, N 51.-P. 32796-32802.
133. Hamelryck T.W., Loris R., Bouckaert J., Wyns L. From structure to activity: new insights into the functions of legume lectins // Trends Glycosci. Glycotech. 1998. - V. 10, N 53 - P. 247-255.
134. Hara-Nishimura I., Inoue K., Nishimura M. A unique vauolar processing enzyme responsible for conversion several proprotein precursors into the mature forms // FEBS Letters. 1991. - V. 294. - P. 89-93.
135. Hartwig U.A., Joseph C.M., Phillips D.A. Flavonoids released naturally from alfalfa seeds enhance growth rate of Rhizobium meliloti II Plant Physiol. -1991. -V. 95, N. 3. P. 797-803.
136. Haukka K., Lindstrom K. Pulsed-field gel electrophoresis for genotypic comparison of Rhizobium bacteria that nodulate leguminous trees // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - V. 119. - P. 215-220.
137. Haukka K., Lindstrom K., Young J.P.W. Three phylogenetic groups of nodA and nifH genes in Sinorhizobium and Mesorhizobium isolates from leguminous trees growing in Africa and Latin America // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 419-426.
138. He X.G. Signal molecules of plant-induced of gene expression of bacteria // Acta Bot. Sin. 1990. - V. 32, N 11. - P. 896-900.
139. Heidstra R., Geurts R., Franssen H., Spaink H.P., van Kämmen A., Bisseling T. Root hair deformation activity of nodulation factors and their fate in Vicia sativa H Plant Physiol. 1994. - V. 105. - P. 787-797.
140. Hess D., Schatzle H., Dressler K. In vitro associations of tomato plants and Rhizobium: induction of nitrogenase activity // Experientia. 1981. - T. 37, N 9. - C. 961-962.
141. Higgins D.G., Sharp P.M. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer // CAB/OS. 1989. - V. 5, N 2, - P. 151-153
142. Higgins T. J. V., Chandler P. M., Zurawski G., Button S.C., Spencer D. The biosynthesis and primary structure of pea seed lectin // J. Biol. Chem. -1983. V. 258. - P. 9544-9549.
143. Hirsch A.M., Brill L.M., Lim P.O., Scambray J., Van Rhijn P. Steps toward defining the role of lectins in nodule development in legumes // Symbiosis. 1995. - V. 19. - P. 155-173.
144. Hirsch A.M., Drake D., Jacobs T.W., Long S.R. Nodules are induced on alfalfa roots by Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium trifolii containing small segments of the Rhizobium meliloti nodulation region // J. Bacteriol. -1985.-V. 161,N 1.-P. 223-30.
145. Hirsch A.M., Wilson K.J., Jones J.D., Bang M., Walker V.V., Ausubel F. M. Rhizobium meliloti nodulation genes allow Agrobacterium tumefaciens and Escherichia coli to form pseudonodules on alfalfa // J. Bacteriol. 1984.- V. 158, N. 3.-P. 1133-1143.
146. Hirsch A.M. Role of lectins (and rhizobial exopolysaccharides) in legume nodulation // Plant Biol. 1999. V. 2. - P. 320-326.
147. Ho S.K., Kijne J.W. Lectins in Rhizobium-legume symbiosis // Lectin Revievs (Kilpatrick D.S., van Driessche E., Bog-Hansen T.C., Eds.). St. Louis, Sigma Chem. Comp. 1991.-V. l.-P. 171-181.
148. Hoedemaker F., van Eijsden R., Diaz C. Mutational analysis of legume lectins // 16thInterlec Conference (Toulouse). 1995. - V. 7.
149. Honeycutt R.J., McClelland M., Sobral B.W.S. Physical map of the genome of Rhizobium meliloti 1021 // J. Bacteriol. 1993. - V. 175, N 21. - P. 6945-6952.
150. Honma M.A., Ausubel F.M. Rhizobium meliloti has three functional copies of nodD symbiotic regulatory gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1987. V. 84, N23. - P. 8558-8562.
151. Hooykaas P.J.J., Klapwijk P.M., Nuti M.P., Schilperoort R.A., Rosen A. Transfer of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid to avirulent agrobacteria and to Rhizobium explanta // J. Gen. Microbiol. 1977. - V. 98. - P. 477-485.
152. Hooykaas P.J.J., Snijdewint F.G.M., Shilperoort. Identification of the Sym plasmid of Rhizobium leguminosarum strain 1001 and its transfer to and exspression in other rhizobia and Agrobacterium tumefaciens II Plasmid. -1982.-V. 8.-P. 73-82.
153. Hooykaas P.J.J., van Brüssel A.A.N., Dulk-Ras H.D., Von Slogteren G.M.S., Schilperoort. Sym-plasmid of Rhizobium trifolii expressed in defferent rhizobial species and Agrobacterium tumefaciens II Nature. 1981. - V. 291. -P. 351-353.
154. Hornik C.L., Karush F. From structure to activity: new insights into the functions of legume lectins// Immunochemistry. 1972. - V. 9. - P. 325-340.
155. Horvath B., Heidstra M., Lados M., Moerman M., Spaink H.P., Prome J.S., van Kämmen A., Bisseling T. Lipo-oligosaccharides of Rhizobium induce infection related early nodulin gene expression in pea root hairs // Plant J. -1993.-V. 4.-P. 727-733.
156. Hubac C., Ferran J., Tremolieres A., Kondorosi A. Luteoline uptake by Rhizobium meliloti: evidence for several steps including an active extrusion process // Microbiology. 1994. - V. 140, N 10. - P. 2769-2774.
157. Hungria M., Joseph C.M., Phillips D.A. Anthocyanidins and flavonols, major nod-genes inducers from seeds of a black-seeded common bean (Phaseolus vulgaris L.) // Plant Physiol. 1991. - V. 97, N. 2. - P. 751-758.
158. Jacobs M., Ruberry H.P. Naturally occuring auxin transport vegetators // Science. 1988,-V. 241.-P. 346-349.
159. Jarvis B.D.W., Gillis M., De Ley J. Intra- and intergeneric similarities between the ribosomal ribonucleic acid cistrons of Rhizobium and Bradyrhizobium species and some related bacteria // Intern. J. System. Bacterid. 1986. - V. 36, N 2. - P. 129-138.
160. Jarvis B.D.W., Pankhurst C.E., Patel J.J. Rhizobium loti, a new species of legume root nodule bacteria // Intern. J. System. Bacteriol. 1982. - V. 32, N 3.- P. 378-380.
161. Jayaraman V., Das H.R. Interaction of peanut root lectin (PRAII) with rhizobial lipopolysaccharides // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1381, N. 1. -P. 7-11.
162. John M., Rohrig H., Schmidt J., Wieneke U., Schell J. Rhizobium NodB protein involved in nodulation signal synthesis is a chitooligosaccharide deacetylase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. - V. 90. - P. 625-629.
163. Jordan D. C Genus I. Rhizobium, Genus II. Bradyrhizobium. II In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Krieg N.R., Holt J.G., Eds.). Baltimore, Williams and Wilkins. 1984. - V.l. - P. 1235-244.
164. Jordan D.S. Family III. Rhizobiaceae II In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Krieg N.R., Holt J.G., Eds.). Baltimore, The Williams and Wilkins Co. - 1984. - V. 1. - P. 234-242.
165. Jordan D.S. Transfer of Rhizobium japonicum, Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen. nov., a genus of slow growing root nodule bacteria of leguminous plants // Intern. J. System. Bacteriol. 1982. - V. 32, N 1. - P. 136139.
166. Jorrdan E.T., Goldstein I.J. The sequence of second member of the Lima Bean lectin gene family and the expression and characterization of recombinant lectin in Escherichia coli H J. Biol. Chem. 1993. - V. 269, N 10. - P. 76747681.
167. Joshi P.A., Caetano-Anolles G., Graham E.T., Gresshoff P.M. Ontogeny and ultrastructure of spontaneous nodules in alfalfa (Medicago sativa) II Protoplasma. 1991,-V. 162, N. l.-P. 1-11.
168. Journet J.P., Pichon N., Dedieu A., de Billy F., Truchet G., Barker D.G. Rhizobium meliloti Nod factors elicit cell-specific transcription of the Enodl2 gene in transgenic alfalfa // Plant J. 1994. - V. 6. - P. 241-249.
169. Judd A.K., Scheider M., Sadowsky M., de Bruijn F.J. Use of repetitive sequences and the polymerase chain reaction to classify genetically related Bradyrhizobium japonicum seroclaster 123 strains // Appl. Environ. Microbiol. 1993.-V. 59.-P. 1702-1708.
170. Jumas-Bilak E., Michaux-Charachon S., Bourg G., Ramuz M., Allardet-Servent A. Unconventional genomic organization in the alpha subgroup of the Proteobacteria II J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 2749-2755.
171. Kaijalainen S., Lindstrom K. Restriction fragment length polymorphism analysis of Rhizobium galegae strains // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 5561-5566.
172. Kalsi G., Babu C.R., Das R.H. Localisation of peanut (Arachis hypogaea) root lectin (PRAII) on root surface and its biological significance // Glyciconjugate J. 1995. - V. 12. - P. 45-50.
173. Kamagata Y., Fulthorpe R.R., Tamura K., Takami H., Forney L.J., Tiedje J.M. Pristine environments harbor a new group of oligotrophic 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degrading bacteria // Appl. Environ. Microbiol. -1997. V. 63. - P. 2266-2272.
174. Kardailsky I.V., Sherrier D.J., Brewin N.J. Identification of a new pea gene, PsNlecl, encoding a lectin-like glycoprotein isolated from the symbiosomes of root nodules // Plant Physiol. 1996. - V. 111, N. 1. - P. 49-60.
175. Kato G., Maruyama Y., Nakamura M. Involvement of lectins in Rhizobium--pea recognition // Plant Cell Physiol. 1981. - V. 22. - P. 759-771.
176. Kersters K., De Ley J. Genus Agrobacterium. II In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Krieg N.R., Holt J.G., Eds.). Baltimore, Williams and Wilkins. 1984.-V.l.-P. 244-254.
177. Kijne J.W., Bauchrowitz M.A., Diaz C.L. Root lectin and Rhizobia II Plant Physiol. 1997. - V. 115. - P. 869-973.
178. Kijne J.W., Diaz C.L., Pater S. Lectins in the symbiosis between Rhizobia and leguminous plants // Advances in Lectin Research (Franz H.,van Driessche E., Kasai K.J., Eds.). Berlin, Ullstein Mosby. 1992. - P. 15-50.
179. Kinkle B.K., Schmidt E.L. Transfer of pea symbiotic plasmid pJB5JI in non-sterile soil // Appl. Environt. Microbiol. 1991. - V. 57, N11. - P. 32643269.
180. Konami Y., Yamamoto K., Osawa T., Irimura T. The primary structure of the Cytisus scoparius seed lectin and a carbohydrate-binding peptide // J. Biochem. 1992. - V. 112. - P. 366-375.
181. Konami Y.,Yamamoto K., Toyoshima S. The primary structure of the Laburnum alpinum seed lectin // FEBS Letters. 1991. - V. 286. - P. 33-38.
182. Kondorosi E., Banfalvi Z., Kondorosi A. Physical and genetic analysis of a symbiotic region of Rhizobium meliloti: identification of nodulation genes // Mol. Gen. Genet. 1984. - V. 193. - P. 445-452.
183. Kundig C., Beck C., Hennecke H., Gottfert M. A single rRNA gene region in Bradyrhizobium japonicum. II J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 5151-5154.
184. Küster E., Grun I. Cadmium and soil microorganisms // Angew. Botanik. 1984. -V. 58. -P. 31-38.
185. Kuykendall L.D. Genus Azorhizobium. II In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., (Garrity G.M., Ed.) New York, SpringerVerlag. - 2003b. - V. 2.
186. Kuykendall L.D. Genus Bradyrhizobium. II In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., (Garrity G.M., Ed.) New York, SpringerVerlag. - 2003a. - V. 2.
187. Kuykendall L.D., Dazzo F.B. Genus Allorhizobium. II In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., (Garrity G.M., Ed.) New York, Springer-Verlag. - 2003. - V. 2.
188. Kuykendall L.D., Hashem F.M., Wang E.T. Genus Sinorhizobium. II In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., (Garrity G.M., Ed.) -New York, Springer-Verlag. 2003a. - V. 2.
189. Kuykendall L.D., Saxena B., Devine T.E., Udell S.E. Genetic diversity in Bradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. nov. II Canad. J. Microbiol. 1992. - V. 38, N6. - P. 501-505.
190. Malek W. The role of motility in the efficiency of nodulation by Rhizobium meliloti II Arch. Microbiol. 1992. - V. 158. - P. 26-28.
191. Marchuk D., Drumm M., Saulino A., Collins F.S. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products // Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 1154.
192. Martinez E., Palacios R., Sanchez F. Nitrogen-fixing nodules induced by Agrobacterium tumefaciens harboring Rhizobium phaseoli plasmids. // J. Bacteriol. 1987. -V. 169. - P. 2828-2834.
193. Martinez E., Romero D., Palacios R. The Rhizobium genome. // Crit. Rev. Plant Sei. 1990. - V. 9. - P. 59-93.
194. Martinez-Romero E. Recent developments in Rhizobium taxonomy // Plant Soil. 1994. - V. 161, N. l.-P. 11-20.
195. Martinez-Romero E., Romero D., Palacios R. The Rhizobium genome // Crit. Rev. Plant. Sei. 1990. - V. 9. - P. 59-63.
196. Martinez-Romero E., Segovia L., Mercante F.M., Franco A.A.,Graham H., Pardo M.A. Rhizobium tropici, a novel species nodulating Phaseolus vulgaris L. beans and Leucaena sp. trees // Intern. J. System. Bacteriol. 1991. -V. 41, N. 3,- P. 417-426.
197. Matthysse A.G. Role of bacterial cellulose fibrils in Agrobacterium tumefaciens infections // J. Bacteriol. 1983. - V. 154. - P. 906-915.
198. Matthysse A.G., Holmes K.V., Gurlitz R.H.G. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumefaciens during attachment to carrot cells // J. Bacteriol. 1981.-V. 145.-P. 583-595.
199. McDermott T.R., Graham P.H. Bradyrhizobium japonicum inoculant mobility, nodule occupancy and acetylene reduction in the soybean root system // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V. 55. - P. 2493-2498.
200. Meinkoth J., Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports // Anal. Biochem. 1984. - V.132. - P.267- 284.
201. Mellor H.Y., Glenn A.R., Arwas R., Dilworth M.J. Symbiotic and competitive properties of motility mutants of Rhizobium trifolii TA1 // Arch. Microbiol. 1987. - V. 148. - P. 34-39.
202. Milner J.L., Araujo R.S., Handelsman J. Molecular and symbiotic characterization of exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium tropici strain CIAT899 // Mol. Microbiol. 1992. - V. 6. - P. 3137-3147.
203. Minamisawa K., Mitsui H. Genetic ecology of soybean bradyrhizobia // In: Soil Biochemistry (Bollag J.-M., Stotzky G., Marcel Dekker. Eds.). New York. -2000. - V. 10.-P. 152-180.
204. Mody B., Modi V. Peanut agglutinin induced alterations in capsular and extracellular polysaccharide synthesis and ex-planta nitrogenase activity of cowpea rhizobia // J. Biosci. 1987. - V. 12. - P. 289-296.
205. Mohnen D., Hahn M.G. Cell wall carbohydrates as signals in plants // Seminars in Cell Biol.- 1993. V. 4.- P. 93-102.
206. Moreira-Silva L.I.M., Sanz L., Cavada B.S., Calvete J.J. Characterization and structure of a lectin from Risum arvense seeds // Europ. J. Cell Biol. -1997. V. 74. Supplement 46. - P. 7.
207. Moulin L., Munive A., Dreyfus B., Boivin-Masson C. Nodulation of legumes by members of the ß-sub-class of Proteobacteria // Nature. 2001. -V. 411.-P. 948-950.
208. Nishiguchi M., Yoshida K., Sumizono T., Tazaki K. Studies by sitedirected mutagenesis of the carbohydrate-binding properties of a bark lectin from Robiniapseudoacacia II FEBS Lett. 1997. - V. 403. - P. 294-298.
209. Norel F., Desnoues N., Elmerich C. Characterization of DNA sequence homologous to Klebsiella pneumoniae nifll, D, K and E in the tropical Rhizobium ORS571 // Mol. Gen. Genet. 1985. - V. 199, N2. - P. 352-356.
210. Novikova N., Safronova V. Transconjugants of Agrobacterium radiobacter harbouring sym genes of Rhizobium galegae can form an effective symbiosis with Medicago sativa II FEMS Microbiol. Lett. 1992. - V. 93. - P. 261-268.
211. Novikova N.I., Pavlova E.A., Vorobjev N.I., Limeshchenko E.V. Numerical taxonomy of Rhizobium strains from legumes of the temperate zone // Intern. J. System. Bacteriol. 1994. - V. 44, N 4. - P. 734-742.
212. Olson E.R., Sadowsky M.J., Verma D.P.S. Identification of genes involved in the Rhizobium-\Qgume symbiosis by Mudi (Kan, Lac)-generated transcription fusions // Biotechnology 1985. - V. 3. - P. 143-149.
213. Osborn T.C., Blake T., Gepts P., Bliss F.A. Bean arcelin. Genetic variation, inheritance and linkage relationships of a novel seedprotein of Phaseolus vulgaris II Theor. Appl. Genet. 1986. - V. 71. - P. 847-855.
214. Palacios R., Brom S., Davila G. Gene amplification in Rhizobium U In: New Horizons Nitrogen Fixation (Palacios R., Newton W., Mora J., Ed.). -Dordrecht, Kluwer Academic Publishers. 1993. - P. 581-585.
215. Pankhurst C.E., McDonald P.E., Reves J.M. Enhanced nitrogen fixation and competitiveness for nodulation of Lotus pedunculatus by a plasmid-cured derivative of Rhizobium loti II J. Gen. Microbiol. 1986. - V. 132, N8. - P. 2321-2328.
216. Parker M. A., Lafay B., Burdon J. J., van Berkum P. Conflicting phylogeographic patterns in rRNA and nifD indicate regionally restricted gene transfer in Bradyrhizobium II Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 2557-2565.
217. Parniske M., Ahborn B., Werner D. Isoflavonoid-inducible resistance to the phytoalexin glyceolin in soybean rhizobia // J. Bacteriol. 1991. - V. 173, N 11. - P. 3432-3439.
218. Peferoen M., Huybrechts R., De Loof A. Vacuum-blotting: a new simple and efficient transfer of proteins from sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose // FEBS Lett. 1982. - 145, N 2. - P. 369-372.
219. Peumans W.J., Barre A., Hao Q., Rouge P., van Damme, Els J.M. Higher plants developed structurally different motifs to recognize foreign glycans // Trends Glycoscience Glycotechnology. 2000. - V. 12, N 64. - P. 83-101.
220. Peumans W.J., van Damme E.J.M. Lectins as plant defense proteins // Plant Physiol. 1995.- V. 109. - P. 347-352.
221. Prakash R.K., Atherly A.G. Plasmids of Rhizobium II Internat. Rev. Cytol.- 1986. V. 104.-P. 1-24.
222. Prasad M.N.V. Cadmium toxicity and tolerance in vascular plants 11 Env. Exp. Botany. 1995. - V. 35. - P. 525-545.
223. Pretorius-Guth I.M., Puhler A., Simon R. Conjugal transfer of megaplasmid 2 between Rhizobium meliloti strains in alfalfa nodules // Appl. Environt. Microbiol. 1990. - V. 56, N8. - P. 2354-2359.
224. Prevost D., Bordeleau L.M., Antoun H. Symbiotic effectiveness of indigenous arctic rhizobia on a temperate forage legume: sainfoin 0Onobrychis viciifolia) II Plant Soil. 1987. - V. 104. - P. 63-67.
225. Pueppke S.G. Adsorption of slow- and fast-growing rhizobia to soybean and cowpea roots II Plant Physiol. 1984. - V.75. - P. 924-928.
226. Quinto C., de la Vega H., Flores M. Reiteration of nitrogen-fixation gene sequence in Rhizobium phaseoli II Nature. 1982. - V. 5885. - P. 724-726.
227. Rahbe Y., Sauvion N., Febvay G., Peumans W.J., Gatehouse A.M.R. Toxicity of lectins and processing of ingested proteins in the pea aphid Acyrthosiphonpisum II Entomol. Exp. Appl. 1995. -V. 76. P. 143-155.
228. Rao V.S.R., Lam K., Qasba P.K. Architecture of the sugar binding sites in carbohydrate binding proteins a computer modeling study // Int. J. Biol. Macromol. - 1998. - V. 23. - P. 295-307.
229. Rauser W.E. Phytochelatins and related peptides // Plant Physiol. 1995.-V. 109.-P. 1141-1149.
230. Rinaudo G., Orenga S., Fernandez M.P., Meungnier H., Bardin R. DNA homologies among members of the stem- and root- nodulating bacteria isolated from the tropical legume Sesbania rostrata II Intern. J. System. Bacteriol. -1991. -V. 41,N 1. -P. 114-120.
231. Rini J.M. Lectin structure // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. - V. 24.-P. 551-557.
232. Rodrigues-Quinones F., Judd A.K., Sadowsky M.J. Hyperreiterated DNA regions are conserved among Bradyrhizobium japonicum seroclaster 123 strains // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58, N6. - P. 1878-1885.
233. Rogel M.A., Hernandez-Lucas I., Kuykendall L.D., Balkwill D.L, Martinez-Romero E. Nitrogen-fixing nodules with Ensifer adhaerens harboring Rhizobium tropici symbiotic plasmids // Appl. Environ. Microbiol. 2001. -V.67.-P. 3264-3268.
234. Rolfe B., Gresshoff P.M. Genetic analysis of legume nodule initiation // Annu. Rev. Plant Physiol. 1988. - V. 39. - P. 297-319.
235. Romero D., Brom S., Martinez-Salazar J. Amplification and deletion of a nod-nif region in the symbiotic plasmid of Rhizobium phaseoli II J. Bacterid. -1991. V. 173, N8. - P. 2435-2441.
236. Roopashree S., Singh S.A., LalithaR. Gowda L.R., Appu Rao A.G. Dual-function protein in plant defence: seed lectin from Dolichos biflorus (horse gram) exhibits lipoxygenase activity // Biochem. J. 2006. - V. 395. - P. 629-639.
237. Rosenberg C., Boistard P., Denarie J., Casse-Delbart F. Genes controlling early and late functions is simbyosis are located on a megaplasmid in R. meliloti II Mol. Gen. Genet. 1981. - V. 184. - P. 326-333.
238. Rosenberg C., Casse-Delbart F., Dusha I., David M., Boucher C. Megaplasmids in the plant-associated bacteria R. meliloti and Pseudomonas solanacearum II J. Bacteriol. 1982. - V. 150. - P. 402-406.
239. Rouge P., Cambillau C., Bourne Y. The three-dimensional structure of legume lectins // In: Lectin Revievs (Kilpatrick D.S., van Driessche E., BogHansen T.C., Eds.). St. Louis, Sigma Chem. Comp. 1991. - V. 1. - P. 143-159.
240. Rouge P., Pere D., Bourne Y. In vitro cleavage of the Lathyrus nissolia isolectin//Plant Sci. 1989.-V. 62. - P. 181-189.
241. Rouge P., Pere D., Bourne Y. Single- and two-chain legume lectins: a revisited question // In: Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry (Kozourek J., Freed D., Eds.). St. Louis, Sigma Chem. Comp. 1990. - P. 105112.
242. Rudiger H. Purification and properties of blood group specific lectins from Vicia cracca II Eur. J. Biochem. 1977. - V. 72. - P. 317-322.
243. Rudiger H. Structure and function of plant lectins // In: Glycosciences (Gabius H.-J., Gabius S., Eds.). Weinheim, Capman&Hall. 1997. - P. 415438.
244. Rudiger H., Gabius H.-J. Plant lectins: Occurence, biochemistry, functions and applications // Glycoconj. J. 2001. - V. 18. - P. 589-613.
245. Rumjaneck N.G., Dobert R.C., van Bercum P., Triplett E. Common soybean inoculant strains in Brasil are members of Bradyrhisobium elkanii II Appl. Environt. Microbiol. 1993. - V. 59, N 12. - P. 4371-4373.
246. Rye P.D., Bovin N.V. Carbohidrate affmity-PAGE for the study of carbohydrate-binding proteins // BioTechniques. 1998. - V. 25. - P. 146-151.
247. Saito A., Mitsui H., Hattori R., Minamisawa K., Hattori T. Slow-growing and oligotrophic soil bacteria phylogenetically close to Bradyrhizobium japonicum IIFEMS Microbiol. Ecol. 1998. - V. 25. - P. 277-286.
248. Salema M.P., Parker C.A., Kidby D.K. Chatel D.L. Death of rhizobia on inoculated seed // Soil Biol. Biochem. 1982. - V. 14. - P. 13-14.
249. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual // Second Edn. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. - 1682 P.
250. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain termination inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 5463-5467.
251. Sanginga N., Abaidoo R., Dashiell K., Carsky R.J., Okogun A. Persistence and effectiveness of rhizobia nodulating promiscuous soybeans in moist savanna zones of Nigeria // Appl. Soil Ecol. 1996. - V. 3, - N. 3. - P. 215-224.
252. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants // Env. Exp. Botany. 1999. - V. 41. - P. 105-130.
253. Sawada H. Agrobacterium // In: Plant Pathogenic Bacteria: A Reference Guide. Wallingford. UK, CABI Publishing, a Division of CAB International. - 2003a.
254. Sawada H. Rhizobium // In: Plant Pathogenic Bacteria: A Reference Guide. Wallingford. UK, CABI Publishing, a Division of CAB International. -2003b.
255. Sawada H., Kuykendall L.D., Young J. M. Changing concepts in the systematics of bacterial nitrogen-fixing legume symbionts // J. Gen. Appl. Microbiol. 2003. - V. 49. - P. 155-179.
256. Scheres B., van Engelen F., van der Knaap E., van de Wiel C., van Kämmen A., Bisseling T. Sequential induction of nodulin gene expression in the developing pea nodule // Plant Cell. 1990. - V. 8. - P. 687-700.
257. Schlaman H.R.M., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Regulation of nodulation gene expression by NodD in rhizobia // J. Bacteriol. 1992. - V. 174.-P. 5177-5182.
258. Schlaman H.R.M., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Subcellular localization of the nodD gene product in Rhizobium leguminosarum H J. Bacteriol. 1989.-V. 171.-P. 4648-4653.
259. Schmidt P.E., Broughton W.J., Werner D. Nod factor of Bradyrhizobium japonicum and Rhizobium sp. NGR234 induce flavonoid accumulation in soybean root exudate // Mol. Plant-Microbe Interact. 1994. - V. 7. - P. 384390.
260. Scholia M., Elkan G.H. Rhizobium fredii sp. nov., a fast-growing species that effectively nodulates soybeans // Intern. J. System. Bacteriol. 1984. - V. 34, N4.-P. 484-486.
261. Scott M.P., Jung R., Muntz K., Nielsen N.C. A protease responsible for post-translational cleavage of a conserved Asn-Gly linkage in glycinin, the major seed storage protein of soybean // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. -V. 89. - P. 685-662.
262. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // In: Gel electrophoresis of nucleic acids. A practical approach. IRL Press; Oxford, -1982.-P. 3976.
263. Segovia L., Pinero D., Palacios R., Martinez-Romero E. Genetic structure of a soil population of non-symbiotic Rhizobium leguminosarum II Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V. 57. - P. 426-433.
264. Segovia L., Youn P., Martinez-Romero E. Reclassification of American Rhizobium leguminosarum bv. paseoli type I strains as Rhizobium etli sp. nov. // Intern. J. System. Bacteriol. 1993. - V. 43, N. 2. - P. 374-377.
265. Selenska-Trajkova S., Radeva G., Gigova L., Markov K. Localisation of the nif genes on large plasmids in Rhizobium galegae II Letts. Appl. Bacteriol. 1990. - V. 11, N1.-P. 73-76.
266. Sharma V., Surolia A. Analyses of carbohydrate recognition by legume lectins: size of the combining site loops and their primary specificity // J. Mol. Biol. 1997. - V. 267. - P. 433-445.
267. Sharon N. Lectin-carbohydrate complexes of plants and animals: an atomic view // Trends Biochem. Sei. 1993. - V. 18. - P. 221-226.
268. Sharon N., Lis H. Legume lectins a large family of homologous proteins // FASEB J. - 1990. - V. 4. - P. 3198-3208.
269. Singleton P.W., Tavares J.W. Inoculation response of legumes in relation to the number and effectiveness of indigenous Rhizobium populations // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 51. - P. 1013-1018.
270. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg J.J. Involvement of both cellulose fibrills and a Ca -dependent adhesin in the attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 42944301.
271. Song B., Palleroni N.J., Haggblom M.M. Isolation and characterization of diverse halobenzoate-degrading denitrifying bacteria from soils and sediments // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 3446-3453.
272. Soto M.J., Zorzano A., Mercado-Blanco J., Lepek V., Olivares J., Toro N. Nucleotide sequence and characterization of Rhizobium meliloti nodulation competitiveness genes nfe //. J. Mol. Biol. 1993. - V. 229, - N 2. -P. 570-576.
273. Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. The Rhizobiaceae. // Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. The Netherlands. 1998. - 566 P.
274. Spaink H.P., Weinmann J., Djordjevic M.A., Wijffelman C.A., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Genetic analysis and cellular localization of the
275. Rhizobium host specificity-determining NodE protein // EMBO J. 1989. - V. 8. - P. 2811-2818.
276. Sprent J.I., Raven J.A. Evolution of nitrogen-fixing symbiosis // In: Biol. Nitrogen Fixation (Stacey G., Burris R.H., Evans H.J., Eds.). New York; London, Chapman&Hall. - 1992. - P. 461-496.
277. Stacey G. Bradyrhizobium japonicum nodulation genetics // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 127, N 1-2. - P. 1-9.
278. Staehelin C., Schultze M., Kondorosi E., Mellor R.B., Boller T., Kondorosi A. Structural modifications in Rhizobium meliloti Nod factors influence their stability against hydrolysis by root chitinases // Plant J. 1994. -V. 5.-P. 319-330.
279. Stanley J., Brown G.G., Verma D.P.S. Slow-growing Rhizobium japonicum comprises two highly devergent symbiotic types // J. Bacteriol. -1985,-V. 163, N1,-P. 148-154.
280. Stubbs M. E., Carver J.P., Dunn R. J. Production of lectin in Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1986. -V. 261, N 14. - P. 6141-6144.
281. Sujatha M.S., Balaji Petety V. Identification of common structural features of binding sites in galactose-specific proteins // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2004. - V. 55. - P. 44-65.
282. Sullivan J.T., Patrick H.N., Lowther W.L., Scott D.B., Ronson C.W. Nodulating strains of Rhizobium loti arise through chromosomal symbiotic gene transfer in the environment // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - V. 92. - P. 8985-8989.
283. Sullivan J.T., Ronson C.W. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis island that integrates into a phe-tRNA gene // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998.-V. 95.-P. 5145-5149.
284. Suominen L., Roos C., Lortet G., Paulin L., Lindstrom K. Identification and structure of the Rhizobium galegae common nodulation genes: Evidence for horizontal gene transfer // Mol. Biol. Evol. 2001. - V. 18. - P. 907-916.
285. Suzuki K., Hattori Y., Uraji M., Ohta N., Iwata K., Murata K., Kato A., Yoshida K. Complete nucleotide sequence of a plant tumor-inducing Ti plasmid // Gene. 2000. - V. 242. - P. 331-336.
286. Tan Z.Y, Kan F.L, Peng G.X, Wang E.T., Reinhold-Hurek B., Chen W.X. Rhizobium yanglingense sp. nov., isolated from arid and semiarid regions in China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 909-914.
287. Terefework Z., Giselle N., Suomalainen S., Paulin L., Lindstrom K. Phylogeny of Rhizobium galegae with respect to other rhizobia and agrobacteria // Intern. J. System. Bacteriol. 1998. - V. 48. - P. 349-356.
288. Terefework Z., Kaijalainen S., Lingstrom K. AFLP fingerprinting as a tool to study the genetic diversity of Rhizobium galegae isolated from Galega orientalis and Galega officinalis II J. Biotechnol. 2001. - V. 91. - P. 169-180.
289. Tlusty B., van Berkum P., Graham P.H. Characteristics of the rhizobia associated with Dalea spp. in the Ordway, Kellogg-Weaver Dunes, and Hayden prairies // Can. J. Microbiol. 2005. - V. 51. - P. 15-23.
290. Truchet G., Roche P., Lerouge J., Vasse J., Camut S., de Billy F., Prome J.-C., Denarie J. Sulphated lipo-oligosacharide signals of R. meliloti elicit root nodule organogenesis in alfalfa //Nature. 1991. - V. 351. - P. 670-673.
291. Truchet G., Rosenberg C., Vasse J., Julliot J.S., Camut S., Denarie J. Transfer of Rhizobium meliloti pSym genes into Agrobacterium tumefaciens: host-specific nodulation by atypical infection // J Bacteriol. 1984. - V. 157, N l.-p. 134-42.
292. Turgeon B.G., Bauer W.D. Ultrastructure of infection thread development during the infection of soybean by Rhizobium japonicum II Planta. 1985. - V. 163, N1. - P. 328-349.
293. Turner S.L., Young J.P.W. The glutamine synthetases of rhizobia: Phylogenetics and evolutionary implications // Biol. Evol. 2000. - V. 17. - P. 309-319.
294. Ueda T., Suga Y., Yahiro N., Matsuguchi T. Phylogeny of sym plasmids of rhizobia by PCR-based sequencing of a nodC segment // J. Bacteriol. 1995. -V. 177, N2.-P. 468-472.
295. Vesper S.J., Bauer W.D. Role of pili (fimbriae) in attachment of Bradyrhizobium japonicum to soybean roots // Appl. Environ. Microbiol. -1986. -V. 52. P. 134-141.
296. Vodkin L.O., Rhodes P.R. and Goldberg R.B. Ca lectin gene insertion has the structural features of a transposable element // Cell 1983. - V. 34. -P. 1023-1031.
297. Wedlock D.N., Jarvis B.D.W. DNA homologies between Rhizobum fredii, rhizobia that nodulate Galegae sp., and other Rhizobium and Bradyrhizobium species // Intern. J. System. Bacteriol. 1986. - V. 36, N 4. - P. 550-558.
298. Willems A., Collins M.D. Phylogenetic analysis of rhizobia and agrobacteria based on 16S rRNA gene sequences // Int. J. Syst. Bacteriol. -1993.-V. 43.-P. 305-313.
299. Willems A., Coopman R., Gillis M. Phylogenese and DNA-DNA hybridization analyses of Bradyrhizobium species // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2001a.-V. 51.-P. 111-117.
300. Willems A., Doignon-Bourcier F., Goris J., Coopman R., de Lajudie P., De Vos P., Gillis M. DNA-DNA hybridization study of Bradyrhizobium strains. //Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001b.-V. 51.-P. 1315-1322.
301. Williams A., Westhead D.R. Sequence relationships in the legume lectin fold and other jelly rolls // Protein Engineering. 2002. - V. 15, N 10. - P. 771774.
302. Wong P.P. Interactions between rhizobia and lectins of lentil, pea, broad bean, and jackbean// Plant Physiol. 1980. -V. 65. - P. 1049-1052.
303. Wood S.M., Newcomb W. Nodule morphogenesis: the early infection of alfalfa (Medicago sativa) root hairs by Rhizobium meliloti II Can. J. Bot. -1989. -V. 67. P. 3108-3122.
304. Wycoff K.L., Van Rhijn P., Hirsch A.M. The ribosomal protein PO of soybean (Glycine max L. Merr.) has antigenic cross-reactivity to soybean seed lectin // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 34. - P. 295-306.
305. Yamamoto K., Konami Y., Kusui K. Purification and characterization of a carbohydrate-binding peptide from Bauhinia purpurea lectin // FEBS Letters. 1991. -V. 281. - P. 258-262.
306. Yamamoto K., Konami Y., Osawa T. Alteration of the carbohydrate-binding specificity of the Bauhinia purpurea lectin trough the preparation of a chimeric lectin // J. Biochem. 1992a. - V. 111. - P. 87-90.
307. Yamamoto K., Konami Y., Osawa T. Carbohydrate-binding peptides from several anti-H(O) lectins // J. Biochem. 1992b. - V. 111. - P. 436-439.
308. Yanagi M., Yamasato K. Phylogenetic analysis of the family Rhizobiaceae and related bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequencer. // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 107. - P. 115-120.
309. Nod factors with a,(3-unsaturated iV-acyl substitutions // Mol. Microbiol. -1999.-V. 34.-P. 227-237.
310. Yao Z.Y, Kan R.L, Wang E.T., Wei G.H., Chen W.X. Characterization of rhizobia that nodulate legume species of the genus Lespedeza and description of Bradyrhizobium yuanmingense sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2002.-V. 52.-P. 2219-2230.
311. Yelton M.M., Mulligan J.T., Long S.R. Expression of Rhizobium meliloti nod genes in Rhizobium and Agrobacterium backgrounds // J. Bacteriol. -1987.- V. 169, N 7. P. 3094-8.
312. Yokota A., Sakane T., Ophel K., Sawada H. Further studies on the cellular fatty acid composition of Rhizobium and Agrobacterium species // IFO Res. Commun. 1993. - V. 16. - P. 86-94.
313. Young J.M., Kerr A., Sawada H. Genus Agrobacterium // In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., (Garrity G.M., Ed.) New York, Springer-Verlag. - 2003. - V. 2.
314. Young J.P.W. Molecular phylogeny and evolution of rhizobia // In: The Nitrogen Fixation and its Research in China (Hond G.F., Ed.). Berlin, Springer-Verlag. - 1992. - P. 365-381.
315. Young J.P.W. Molecular phylogeny of rhizobia and their relatives // In: New Gorizons Nitrogen Fixation (Palacios R., Newton W., Mora J., Ed.). -Dordrecht, Kluwer Academic Publishers. 1993. - P. 587-592.
316. Young J.P.W. Phylogenetic classification of nitrogen-fixing organisms // In: Biol. Nitrogen Fixation (Stacey G., Burris R.H., Evans H.J., Ed.). New York; London, Chapman&Hall. - 1992. - P. 43-86.
317. Young J.P.W., Haukka K.E. Diversity and phylogeny of rhizobia // New Phytol. 1996. - V. 133. - P. 87-94.
318. Young J.P.W., Johnston A.W.B. The evolution of specificity in the legumQ-Rhizobium symbiosis // Trends Ecol. Evolut. 1989. - V. 4, N 11. - P. 341-349.
319. Young N.M., Oomen R.P. Analysis of sequence variation among legume lectins: a ring of hypervariable residues forms the perimeter of the carbohydrate-binding site // J. Mol. Biol. 1992. - V. 228. - P. 924-934.
320. Zahran H.H. Rhizobia from wild legumes: diversity, taxonomy, ecology, nitrogen fixation and biotechnology // J. Biotechnol. 2001. - V. 91. - P. 143153.
321. Zhang X.X., Turner S.L., Guo X.W., Yang H.J. The common nodulation genes of Astragalus sinicus rhizobia are conserved despite chromosomal diversity // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. N7. - P. 2988-2995.
322. Zou X., Li R., Chen H. Characteristics of plasmids in Rhizobium huakuii II Curr. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 215-220.
323. Zurkovski W. Molecular mechanism for loss of nodulation properties of Rhizobium trifolii II J. Bacteriol. 1982. - V. 150, N3. - P. 999-1007.
-
Баймиев, Алексей Ханифович
-
доктора биологических наук
-
Уфа, 2007
-
ВАК 03.00.12
- Гибридные лектины с измененными углеводсвязывающими свойствами и их влияние на бобово-ризобиальный симбиоз
- Структура углеводсвязывающих пептидов лектина бобовых растений в связи с их различной хозяйской специфичностью при образовании симбиоза с клубеньковыми растениями
- Агглютинины Rhizobium Leguminosarum 252 и их роль во взаимодействии с растениями
- Субмитохондриальное распределение лектиновой активности и ее изменения с возрастом растений
- ПОЛИСАХАРИДЫ RHIZOBIUM LEGUMIHOSARUM И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПЕКТИНАМИ РАСТЕНИЙ-ХОЗЯЕВ
