Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Субмитохондриальное распределение лектиновой активности и ее изменения с возрастом растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борисова, Наталия Николаевна, Москва

/

и -.4 — ,/ *■) Л

* ! ; ?

российская академия наук институт физиологии растений

На правах рукописи

БОРИСОВА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

СУБМИТОХОНДРИАЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЯ С ВОЗРАСТОМ РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биол. наук Э.И.Выскребенцева

Москва-1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Новые аспекты изучения митохондрий....................................................12

Глава II. Лектины и гликоконъюгаты - основные участники

белок-углеводных взаимодействий.......................................................22

II. 1. Лектины - белки, избирательно взаимодействующие с

гликоконъюгатами..........................................................................................................................................23

II. 1.1. Лектины как объект биологических исследований.... 23

II. 1.2. Общие принципы строения лектинов. Гомология их

структуры.................................................................................................................................................25

II. 1.3. Распространение и локализация лектинов......................................29

II. 1.4. Взаимодействие лектинов с углеводами, углеводная

специфичность лектинов.............................................................31

П.2.Углеводсодержащие макромолекулы - гликоконъюгаты - вторая группа участников белок-углеводных взаимодействий............................................................................................................................................................................35

11.2.1. Гликопротеины..............................................................................................................................36

11.2.2. Гликолипиды и протеогликаны........................................................................41

11.2.3. Лектины как возможные гликоконъюгаты при образовании белок-углеводных взаимодействий....................................................44

Глава III. Роль лектинов и их гликоконъюгатов в процессах

жизнедеятельности..............................................................................46

III. 1. Лектины и углеводсодержащие макромолекулы во

взаимодействии клеток..........................................................................................................................47

III. 1.1. Лектины и гликоконъюгаты в процессах гистогенеза и морфогенеза клеток......................................................................................................................47

III. 1.2. Роль лектинов и гликоконъюгатов во взаимодействии хозяина и паразита..........................................................................................................................52

III. 1.3. Белок-углеводные взаимодействия в формировании

симбиотических отношений........................................................................................................54

III. 1.4. Роль лектинов в индукции цветения и в оплодотворении клеток....................................................................................................................................55

111.2. Возможное участие лектинов во взаимодействии субклеточных структур.................................................................56

111.3. Роль лектинов в организации крупных белковых комплексов и регуляции их работы..................................................................................59

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава IV. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

IV. 1. Объекты исследования........................................................................................................67

IV.2. Выделение митохондрий и субмитохондриальных

фракций............................................................................................................................................67

IV.3. Методы, использованные для оценки нативности и

степени чистоты полученных фракций....................................................................73

IV.4. Исследование гемагглютинирующей активности митохондрий и субмитохондриальных фракций..............................................74

IV. 5. Исследование возможности взаимодействия мембранных лектинов с экзогенными сахарами и компонентами "растворимых" фракций митохондрий....................................................77

IV. 6. Определение белка......................................................................................................................78

IV.7. Статистическая обработка результатов..................................................78

Глава V. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

V. 1. Субмитохондриальная локализация лектинов.......................79

V.l.l. Локализация гемагглютинирующей активности в митохондриях корнеплодов сахарной свеклы..............................................79

V.l.2. Локализация гемагглютинирующей активности в

митохондриях корней проростков кормовых бобов..........................80

V.I.3. Определение прочности связи лектинов с мембранами митохондрий......................................................................................................................................81

V.l.4. Гемагглютинирующая активность лектинов в составе мембран и во фракции экстрагированных мембранных

белков..............................................................................................................................................82

V.l.5. Характер экспонирования углеводсвязывающих

центров мембранных лектинов................................................................................................84

V.l.6. Сравнительный анализ уровня лектиновой активности отдельных субмитохондриальных фракций........................................87

V.2. Изменения гемагглютинирующей активности лектинов митохондрий с возрастом растений и под влиянием

низкой положительной температуры............................................................................87

V.2.1. Изменения активности лектинов митохондрий в ходе роста корнеплода сахарной свеклы........................................................................88

V.2.2. Пектиновая активность митохондрий корней

проростков кормовых бобов разного возраста............................................97

V.2.2.1. Рост осевых органов проростков кормовых бобов. 97

V.2.2.2. Изменения процентного содержания белка в субмитохондриальных фракциях с увеличением возраста

проростков....................................................................................................................................................................100

V.2.2.3. Лектиновая активность митохондрий корней разновозрастных проростков кормовых бобов......................................................107

V.2.3. Лектиновая активность субмитохондриальных фракций в условиях действия на растения низкой положительной температуры................................................................................................................................110

V.3. Поиск возможных экзогенных и эндогенных ингибиторов гемагглютинирующей активности субмитохондри-

альных фракций...............................................................................................................116

V.3.I. Углеводная специфичность мембранных лектинов

митохондрий............................................................................................................................................................116

V.3.2. Поиск возможных эндогенных лигандов митохонд-

риальных лектинов........................................................................................................................................122

V.3.2.I. Влияние совместной инкубации мембран и «растворимых» фракций митохондрий корнеплода сахарной свеклы на гемагглютинирующую активность мембранных лектинов............................................................................................................................................122

V.3.2.2. Гемагглютинирующая активность мембран митохондрий клеток корней проростков кормовых бобов при их совместной инкубации с «растворимыми» фракциями

цитозоля и митохондрий этих же клеток................................ 124

ОБСУЖДЕНИЕ

Глава VI. Возможные функции лектинов в митохондриях........ 127

ВЫВОДЫ......................................................................................... 142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................... 144

ВВЕДЕНИЕ

Уже более 100 лет прошло с момента первого открытия внутриклеточных органелл, которые получили название митохондрии. Благодаря многочисленным исследованиям в настоящее время стало известно, что митохондрии являются высокоспециализированными органеллами клетки с весьма оригинальным белковым и липидным составом, имеющие свой геном (Douse, 1985). В них локализованы специфические метаболические процессы, необходимые для клетки. В частности, процессы генерирования энергии, восстановительного аминирования органических кислот, обмен жирных кислот, кетонов и метаболизм пуриновых нуклеотидов (Мецлер, 1980; Le Floc'h, Lafleuriel, 1983; Ленинджер, 1985; Douce, 1985). В митохондриях клеток разных организмов, в том числе и растений, локализована часть орнитинового цикла Кребса, позволяющего избавлять клетки от таких отходов метаболизма, как НС03~ и NH3 (Кретович, 1971; Ленинджер, 1985). Особое внимание стали уделять митохондриям в последние несколько лет в связи с обнаружением в их межмембранном пространстве фактора, который вызывает апоптоз (запрограммированную гибель) клеток (Скулачев, 1996).

Митохондрии являются полуавтономными органеллами. Поэтому их жизнедеятельность невозможна без взаимодействия с другими компартмен-тами клетки, в ходе которого происходит обмен метаболитами, а также, по последним данным (Thorsness, Fox, 1990), нуклеиновыми кислотами и поставка энергии в виде АТФ. Это взаимодействие может осуществляться через цитозоль (например, путем изменения концентрации АДФ или с участием вторичных мессенджеров), а также путем непосредственных контактов с другими мембранами клетки. Не исключено, что последние могут формироваться с участием специфических белков, получивших название лектины, и лигандов-гликоконъюгатов. Однако, эта гипотеза не

имеет в настоящее время прямых подтверждений и требует проведения ряда исследований.

Поставка митохондриями энергии, а также метаболитов осуществляется адекватно потребностям клетки. Многие ферменты митохондрий организованы в мультиферментные комплексы или, по более современным представлениям, метаболоны (Srere, 1972; Фридрих, 1986, Поглазов, 1996). Конвейерная упаковка ферментов в метаболонах способствует ускорению протекания метаболического процесса. Активность последнего, таким образом, может регулироваться путем сборки или разборки таких временных образований. Помимо этого, регуляция процессов дыхания и энергетического сопряжения может происходить и на других уровнях, в частности, путем изменения проницаемости мембран, а также, по-видимому, благодаря заякориванию ферментов цитозоля и матрикса на митохондриальных мембранах. Последнее обеспечивает временную компартментацию необходимых процессов и более тесное сопряжение между энергодающими и энергопотребляющими процессами. Существенная роль в образовании таких временных комплексов может принадлежать лектинам и углеводсодержащим макромолекулам, так как их взаимодействие не является ковалентным, и в связи с этим комплекс лектин-лиганд может легко распадаться в зависимости от pH среды или концентрации Ca (Kojima et al., 1982; Алексидзе и др., 1984; Sharon, Lis, 1990; Hatakeyama et al., 1995; Puri, Springer, 1996).

Белки, которые получили название лектины, и углеводсодержащие макромолекулы - их гликоконъюгаты (гликопротеины, протеогликаны, гликолипиды) являются основными участниками белок-углеводных взаимодействий. Лектины - это группа белков неиммунного происхождения, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их

ковалентной структуры (Луцик и др., 1989). При этом к лектинам относятся и ферменты углеводного обмена, у которых каталитический и лектиновый участки связывания углеводов различны (Лахтин, 1987). Согласно данному определению, к лектинам не относятся белки иммуноглобулиновой природы (антитела), способные к связыванию углеводов. Вместе с тем известно, что некоторые иммуноглобулины содержат лектиновый домен, отличный от углеводсвязывающего центра. Примером такого иммуноглобулина может служить IgE человека (Sutton, Gould, 1993). В связи с этим следует отметить, что Franz с сотр. еще в 1979 году предложили лектины объединить с углеводсвязывающими иммуноглобулинами и ферментами-гликозидазами и назвать их «аффинитины». Однако, это предложение до сих пор не является общепризнанным.

Первичная структура многих лектинов, как оказалось, имеет высокую степень гомологии. Они обнаружены практически во всех тканях всех таксономических групп растений, а также животных и микроорганизмов (Sharon, Lis, 1972; Liener, 1976; Goldstein, Hayes, 1978; Марков, Хавкин, 1983; Королев, 1984; Etzler, 1985; Chrispeels, Raikhel, 1991; Лахтин, 1992; Козлов и др., 1995; Hatakeyama et al., 1995; Peumans, Van Damme, 1995; Карпунина и др., 1996; Полевщиков, 1996; Hughes, 1996). Более того, присутствие лектиновых белков установлено практически во всех компартментах клетки, в том числе и в митохондриях (Bowles et al., 1976, 1979; Yoshida, 1978; Monsigny et al., 1979; Jeffree, Yeoman, 1981; Алексидзе и др., 1983, 1984; Алексидзе, Выскребенцева, 1986; Лепехин и др., 1987; Алексидзе, Санадзе, 1990; Фалькович и др., 1994). Все это, а также наличие в клетках растений долгоживущих мРНК лектиновых белков (Peumans et al., 1980) свидетельствует об эволюционной древности лектинов, а следовательно о древности существования белок-углеводных взаимодействий. Сохранение системы лектин-рецептор в ходе эволюции дает основание

считать необходимым ее участие в процессах жизнедеятельности целого организма, отдельной клетки, органеллы.

В качестве основных углеводсодержащих макромолекул, с которыми взаимодействуют лектины, обычно рассматривают гликопротеины. Однако очевидно, что гликоконъюгатами, способными взаимодействовать с лектинами, могут выступать также и гликолипиды, и протеогликаны. Помимо этого, лектины могут проявлять сродство к макромолекулярным соединениям чисто углеводной природы, например гликогену, а также к моносахаридам (Ленинджер, 1985; Хьюз, 1985; Лахтин, 1992).

В настоящее время общепризнано, что лектины являются адгезивными молекулами и, наряду с углеводсодержащими соединениями, играют ведущую роль в межклеточных взаимодействиях, которые имеют место в ходе таких процессов, как морфогенез, гистогенез, оплодотворение клеток, при трансплантациях, формировании симбиотических и паразитических отношений (Sharon, Lis, 1972; Марков, Хавкин, 1983; Королев, 1984; Etzler, 1985; Титов и др., 1992). Возможно, с участием лектинов и их лигандов осуществляются взаимодействия между внутриклеточными структурами. Установлено, что лектины могут регулировать работу ионных каналов и пор, участвовать в организации мультиферментных комплексов (Yamagami, Terayama, 1979; Hankins et al., 1980; Campillo et al., 1981 b; Эткин и др., 1982; Houston, Dooley, 1982; Марков, Хавкин, 1983; Лахтин, 1986; Weiner, Rudy, 1988; Macanlay et al., 1995). Значительные изменения активности лектинов обнаружены во время ответной реакции организма на стрессовые воздействия (Любимова и др., 1988; Комарова и др., 1993 - 1995; Шакирова и др., 1993; Тимофеева и др., 1996). Однако, несмотря на разнообразие процессов, в которых участвуют лектины, их функция все еще остается невыясненной. Это, в частности, касается и митохондрий, на поверхности или в мембранной фракции которых обнаружена лектиновая активность

(Bowles et al., 1976; Jeffree, Yeoman, 1981; Алексидзе, Выскребенцева, 1986; Лепехин и др., 1987).

Первое свидетельство о наличии лектинов во внешней мембране митохондрий Ricinus communis (касторовых бобов) появилось более 20 лет назад (Bowles et al., 1976). В 1990 г. было обнаружено, что гликопротеид, выделенный из растворимой фракции корнеплода сахарной свеклы, специфически взаимодействующий с лектином внешней мембраны митохондрий, влиял на функциональную активность органелл (Выскребенцева и др., 1990). В частности, наблюдалось избирательное торможение функционирования первого комплекса электронтранспортной цепи. Помимо этого имело место разобщение окисления и фосфорилирова-ния вследствие использования энергии, генерируемой дыхательной цепью не на синтез АТФ, а на транспорт ионов. Это указывало на то, что белок-углеводные взаимодействия могут контролировать функциональную активность митохондрий, а лектины могут быть регуляторами биохимических процессов, протекающих внутри этих органелл. Однако, механизм действия цитоплазматического гликопротеида на изменения во внутренней мембране митохондрий оставался неясным. Казалось вероятным, что между двумя мембранами могут возникать области контактов. При этом не было исключено, что их возникновение может происходить на основе белок-углеводных взаимодействий, в которых наряду с лектинами и/или гликоконъюгатами внешней мембраны могут участвовать лектины и/или углеводсодержащие макромолекулы внутренней мембраны. Единственная работа, указывающая на присутствие лектинов во внутренней мембране митохондрий, была сделана в 1976 году (Bowles et al., 1976). Лектиновая активность растворимых белков митохондрий при этом не изучалась и, к сожалению, эти исследования не были продолжены. Таким образом, до начала нашей работы субмитохондриальная локализация лектинов, а также

ориентация углеводсвязывающих центров мембранных лектинов не были известны. В связи с этим цель нашей работы заключалась в установлении субмитохондриальной локализации лектиновой активности, характера экспонирования углеводсвязывающих центров мембранных лектинов и изучении уровня их активности в митохондриях растений двух видов.

Несмотря на то, что впервые лектины в составе митохондрий были обнаружены уже более 20 лет назад, до сих пор нет никаких доказательств или хотя бы предположений относительно роли и механизма действия лектинов в организации и функционировании этих органелл. Результаты опытов, проведенные на других объектах показали, что лектины не всегда проявляют свою активность. Они могут отсутствовать вообще или обладать низкой гемагглютинирующей способностью в разные периоды онтогенеза растений. Функциональное состояние митохондрий растений разного во