Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛЕКТИНЫ LETITINUS EDODES: ХАРАКТЕРИСТИКА, СВОЙСТВА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ФУНКЦИИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛЕКТИНЫ LETITINUS EDODES: ХАРАКТЕРИСТИКА, СВОЙСТВА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ФУНКЦИИ"



На правах рукописи

ЦИВИЛЕВА Ольга Михайловна

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛЕКТИНЫ Lentinus edades: ХАРАКТЕРИСТИКА, СВОЙСТВА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ФУНКЦИИ

03.00.04 - Биохимия 03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2008

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук (ИБФРМ РАН), г. Саратов

Научный консультант:

доктор биологических наук Никитина Валентина Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук доктор биологических наук доктор медицинских наук

Щеголев Сергей Юрьевич Терешина Вера Михайловна Бородулин Владимир Борисович

ведущая организация:

ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гауэе РАМН

Защита диссертации состоится « » мая 2008 года в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК,

Автореферат разослан «_ Февраля 2008 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002,146.01, доктор биологических наук

з ! рглгасхл.......

I имени К.А. ТимирлЭеза { ЦНБ имени Н. гЖглеэаова ВВЕДЕН И i Фонд научней едг^ратурм

Актуальность темы данной работы определяется_¿д^жде. всего ее

направленностью на разрешение проблемы явного несоответствия между весьма ограниченным к настоящему времени уровнем информации о важных биологически активных соединениях, лектинах ксилотрофных базидиомицетов, и заинтересованностью исследователей в углубленном изучении этих углеводсвязывающих белков самого разного биологического происхождения. Грибы являются очень интересной в теоретическом и практическом плане группой живых организмов, в то же время внеклеточные грибные лектины практически не описаны.

Вопрос о возможности искусственного выращивания грибов уже свыше двух тысячелетий занимает человечество. Объектом научных исследований во всем мире являются более 100 тыс. видов. Промышленное производство высших грибов ео многих странах мира выделилось в самостоятельную, интенсивно развивающуюся высокопроизводительную отрасль.

Общеизвестно функциональное значение грибов в различных биогеоценозах, где они благодаря широкому набору ферментов принимают активное участие в процессах деструкции и минерализации органического вещества. В настоящее время известно большое количество видов базидиапьных грибов, которые представляют интерес в качестве продуцентов биологически активных веществ. К числу перспективных микологических объектов для поверхностного и глубинного культивирования с целью получения допопнительного источника белка, биологически активных соединений безусловно относится ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes.

Глубокие исследования физиологии высших грибов начались в последние три-четыре десятилетия. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность, определяющиеся наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды, требуют дальнейшего изучения. При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид и штамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и др., необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов [Дворника, 1990].

Исследования роста базидиомицетов, в том числе L. edodes, на жидких средах направлены на изучение питательных потребностей и физиологии вида в чистой культуре, разработку технологии погруженного культивирования мицелия с целью получения биомассы кормового и пищевого назначения, препаратов, обладающих онкостатическим действием [Соломко и Митропольская, 1994]. Глубинное культивирование также предлагается как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства [Yang and Jong, 1989]. Значительно меньшее число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. В частности, пектиновая активность высших грибов изучена явно недостаточно, лишь отдельные работы касаются изучения лектинов в связи с физиологическими аспектами, проблемами морфогенеза грибов. На стадиях, предшествующих плодоношению и характеризующихся у отдельных видов формированием специализированных вегетативных структур, таких как коричневая мицелиальная пленка шиитаке, исследование лектиновой активности приобретает особую актуальность, поскольку биохимические условия возникновения подобных

особенностей морфогенеза и способов дальнейшего развития (перехода либо к нормальному плодоношению, либо к образованию недифференцированных базидиом) давно интересовали исследователей, оставаясь неопределенными.

Не обсуждалась роль лектинов при неблагоприятных условиях роста культур базидиомицетов. взаимодействие лектинов с важнейшими биологически активными соединениями (как антиоксидантной природы, так и вызывающими окислительный стресс; с соединениями фитогормональной природы, принимающими участие в цитодифференцировке у высших грибов). Не были выявлены регуляторы внеклеточной лектиновой активности, поэтому представляло интерес изучить не только эффекторы - компоненты синтетических сред культивирования, но и обнаружить какие-либо эндогенные низкомолекулярные регуляторы указанной активности, внешние условия их биосинтеза и проявления, что удалось реализовать в рамках настоящей работы.

Следовательно, ко времени начала наших исследований в этой области налицо был недостаток сведений по вопросам выявления лектиновой активности грибных культур, получения очищенных препаратов внеклеточных грибных лектинов, изучения их свойств и предполагаемых функций. Актуальным представляется наш посильный вклад в описание новой группы гликопротеинов ксилотрофных базидиомицетов, внеклеточных лектинов, физико-химические свойства которых важны для понимания их физиологической роли, морфогенетических функций в грибном организме как объекте микробиологических исследований. Учитывая вышеизложенные обстоятельства, нами было предпринято настоящее исследование.

Цель работы - характеристика внеклеточных лектинов культивируемого ксилотрофного базидиомицета Lentínus edodes и условий проявления их биологической активности.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг штаммов Lentínus edodes на присутствие лектинов.

2. Выделить внеклеточные лектины L. edodes, изучить их химический состав, физико-химические свойства, углеводную специфичность.

3. Изучить зависимость лектиновой активности культуры L edodes от условий выращивания. Выявить оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности. Разработать способ получения экзолектинов L, edodes F-249 с целью повышения выхода препаратов.

4. Исследовать влияние катионов металлов(Н) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением расчетных методов квантовой химии и QSAR.

5. Изучить влияние неблагоприятных внешних условий на лектиновую активность L. edodes во взаимосвязи с ростовыми характеристиками культуры.

6. Исследовать взаимосвязь активности внеклеточных лектинов L. edodes и морфогенеза (формирования коричневой мицелиальной пленки) в глубинной культуре.

7. Выявить взаимосвязь углеводного и жирнокислотного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры.

8. Исследовать влияние некоторых элементоорганических соединений (Se-, серу-, азотсодержащих) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением теоретических представлений (пространственная и электронная структура молекул, QSAR свойства реактантов).

9. Исследовать биологические свойства лектинов: их способность к взаимодействию с веществами фитогормональной природы, с разными типами эритроцитов; антигенные свойства.

10. Изучить возможности использования глубинной культуры L. edodes при модифицированном способе ее выращивания в качестве технологически перспективного посевного материала.

Научная новизна работы

Впервые в культурапьной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета L edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

Выделены чистые препараты лектинов из культурапьной жидкости L edodes, изучены их физико-химические свойства, охарактеризована реакционная способность пектиновых препаратов.

Впервые показано, что максимальное повышение внеклеточной пектиновой активности базидиомицета наблюдается при условиях, отличных от оптимальных для выращивания культуры.

Впервые установлено участие лектинов в морфогенетических процессах и инициации плодообразования шиитаке. Выявлена взаимосвязь активности лектинов с формированием коричневой мицелизльной пленки в глубинной культуре; с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании; с биосинтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам.

Впервые обнаружен и выделен необычный для ма к ро базидиомицетов гликолипид моносахарид кой природы, способный модифицировать активность внеклеточных лектинов шиитаке.

Впервые выявлено взаимодействие лектинов ксилотрофного базидиомицета с фитогормоном ИУК, сопровождающееся значительным увеличением лектиновой активности в системе "лектин-ИУК".

Научные положения работы расширяют и углубляют современные представления о разнообразии лектинов базидиомицетов и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их биосинтеза и активности; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах.

Практическая значимость исследования

Работа вносит вклад в развитие направления лектинологии, связанного с изучением лектинов высших грибов, в рамках которого положено начало новой области исследования препаратов внеклеточных лектинов ксилотрофных базидиомицетов.

Показана принципиальная осуществимость выделения и очистки внеклеточных лектинов из жидких синтетических сред культивирования ксилотрофных базидиомицетов. разработана методика эффективной дифференциации хроматографических свойств двух внеклеточных лектинов, способствующей их более эффективному разделению. Выявлены низкомолекулярные вещества - эффекторы проявления внеклеточными пектинами их биологической активности, изучено взаимодействие лектинов с соединениями -антиоксидантами и индукторами окислительного стресса, с разными типами эритроцитов в реакции гемагглютинации; некоторые антигенные свойства. Подобная характеристика внеклеточных лектинов способствует перспективному использованию выделенных белков при проведении научных и прикпадных исследований в области биохимии, энзимологии и иммунологии.

На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие характерной для данного вида коричневой мицелиальной

пленки. Совокупность отличных от нормального плодоношения характеристик, в том числе по лектиновой активности, составу жирнокислотного и углеводного пула мицелия, могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе ллодообразования. Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза.

Наше предположение и дальнейшее обоснование роли лектинов как потенциальных морфообразующих белков позволило внести определенный вклад в создание эффективного способа получения посевного мицелия шиитаке.

Материалы работы и препараты лектинов используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе химического факультета С ГУ, СВИРХБЗ, лаборатории микробиологии Института микробиологии НАН Беларуси.

По результатам работы получен патент РФ, а также положительное решение формальной экспертизы по заявке № 2005121083/13(023786). Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).

Внедрение результатов диссертационной работы подтверждено соответствующими актами, представленными в Приложении к диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В культуральной жидкости и на поверхности мицелия культур ряда штаммов Lentfnus edades присутствуют внеклеточные лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

2. Культура L edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по своим физико-химическим свойствам, составу, углеводной специфичности, антигенным свойствам, агглютинации разных типов эритроцитов, реакционной способности в отношении низкомолекулярных биологически значимых соединений.

3. Активность и динамика образования внеклеточных лектинов L, edodes зависят от физико-химических условий культивирования. Наиболее значимыми факторами, влияющими на лектиновую активность глубинной культуры L. edodes, являются присутствие в среде культивирования аминокислотных источников азота, катионов металлов^/), селена s органической форме,

4. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L. edodes.

5. Лектины 1.. edodes принимают участие в морфогенетических процессах культуры. Установлена взаимосвязь внеклеточной лектиновой активности шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия — липидам и углеводам.

6. Одним из эндогенных регуляторов активности лектинов L. edodes является необычный для ксилотрофных базидиомицетов галактолилид S3, впервые выделенный из внеклеточных метаболитов L. edodes.

7. Экзогенными регуляторами внеклеточной лектиновой активности L. edodes могут служить низкомолекулярные соединения - индукторы окислительного стресса, а также антиоксид анты, в частности, селенорганические соединения, при взаимодействии с которыми сильно влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий.

8, Лектины L. edoäes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно увеличивается лектиновая активность в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу.

9. Эффективным способом разделения двух внеклеточных лектинов шиитаке на основе дифференциации хром а то графических характеристик и усиления биосинтеза одного из лектинов является воздействие Cu(ll).

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина), "Роль угле вод связывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов " (Na гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина),

Физико-химические задачи работы выполнены совместно с лабораторией структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией — к.х.н. Е.Е Федоров), с лабораторией биохимии (зав. лабораторией в период выполнения исследований - д.б.н. 6.В. Игнатов), а также на кафедре аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), при непосредственном участии д.х.н., профессора А.Н. Панкратова; на кафедре органической и биоорганической химии СГУ (зав. кафедрой — д.х.н., профессор А.П. Кривенько).

Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (NsNa проектов 03-04-48129, 06-04-81042-Бел_а), Федерального агентства по науке и инновациям в рамках федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы (государственный контракт Na 02.444.11,7331), программы Президиума РАН "Фундаментальные науки -медицине* в рамках совместного проекта ИБФРМ РАН и ИРЭ РАН, 2007 г.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на: 37th lUPAC Congr. Frontiers in Chemistry: Molecular Basis of the Life Sciences, 27th GDCh General Meeting (Berlin, Germany, Aug. 14-19, 1999); науч. конфер. 'Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии* (Саратов, 1999); 5th World Congr, of Theoretically Oriented Chemists - WATOC'99 (Imperial College, London, 1-6 Aug., 1999); 1-й регион, конфер. мол, ученых (Саратов, 26-27 марта 2002); Первом съезде микологов России "Современная микология в России" (Москва, 18-20 апреля 2002); межд. науч. конфер. "Физиология и биохимия культивируемых грибов" (6-8 июня 2002, Саратов); IV Всерос. конфер. мол. ученых (Саратов, 23-25 июня, 2003); Int. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Techtiogertic Environmental Pollutants* {Saratov, 28-30 July, 2003); VIII Int. Conf, The Biology of Plant Cells in Vitro and Biotechnology" (Saratov, September 9-13, 2003); 8-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 мая 2004); III Всерос. школе-конфер. "Химия и биохимия углеводов" (9-11 сентября 2004, Саратов); II Российской школе-конфер. "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине* (Саратов, 13-16 октября 2004); Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва. 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практич. конфер. "Вавиловские чтения -2004" (Саратов, 24-26 ноября

2004); II В се рос. симп. "Тест-методы химического анализа* (Саратов, 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Путинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 18-22 апреля 2005); Межд. конфер. "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" {Саратов, 14-16 сентября 2005); Всерос. конфер. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты* (Саратов, 15-17 июня 2005); V Всерос. конфер. мол, ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 22-24 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysls-2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 1923 June, 2005); II Межд, симл. "Разделение и концентрирование а аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 25-30 сентября 2005); 10-й Пущинской школе-конфер. моп. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 апреля 2006); 4-м Всерос, Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); Межд. науч. конфер. "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)" (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 10-12 октября 2006); Межд. науч. конфер. "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1-2 июня 2006); Втором Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006); 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); 4-й Росс, конфер. "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 4-5 июня 2007); VI Всерос. интерактивной конфер, мол, ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 1622 September 2007), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.

Личный вклад соискателя

Автору принадлежит идея, разработка путей экспериментального выполнения и теоретическое обоснование всех основополагающих задач, поставленных в диссертационной работе, ключевая роль на всех этапах исследования, интерпретации и теоретической обработки полученных результатов.

Благодарности

Следует отметить вклад в выполнение данной работы д.б.н., зав. лабораторией В.Е. Никитиной, явившейся вдохновителем самого факта проведения исследований с такими объектами, как Lentínus edades и пектины этой культуры, а также организатором углубленных исследований важной морфогенетической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки и эффекта неблагоприятных условий внешней среды. Интересное и полезное обсуждение результатов было обеспечено со стороны В.Е. Никитиной на всем протяжении периода выполнения работы.

Правильная интерпретация полученных результатов в терминах физико-химических, спектроскопических, аналитической химии была бы крайне обеднена, а квантовохимическая интерпретация - невозможна, без сотрудничества с д.х.н., профессором кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ им. Н.Г, Чернышевского А.Н. Панкратовым,

Публикации

По теме диссертации опубликовано 78 научных работ, в том числе 38 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в рецензируемых иностранных изданиях и российских журналах, входящих в "Перечень периодических

научных изданий, рекомендуемых ВАК 19 статей в сборниках научных трудов), 1 патент РФ, 1 положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы и приложения. Приложение содержит документальное подтверждение внедрения материалов диссертации в учебный процесс и практику научных исследований.

Работа изложена на 353 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 55 рисунками и 54 таблицами. Список цитируемой литературы включает 519 источников (отечественных и зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы (глава 1), представленном 3 разделами, 12 подразделами, изложены современные представления о свойствах и функциях лектиное грибов (общее понятие о пектинах, предполагаемая роль, биологические свойства, применение грибных лектинов). Во второй части обзора охарактеризованы морфолого-культуральные и физиолого-биохимические особенности Lentínus edades (дана краткая характеристика этого вида как гриба "белой" гнили, оценены питательные свойства и медицинское значение шиитаке). В третьей части обзора литературы рассмотрено значение экзогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности мицелиальных культур. Значительное внимание уделено соединениям селена в процессах жизнедеятельности биотехнологически значимых грибных культур (селен описан как составляющая часть минерального питания грибов, представлена общая информация по химии селена в живой клетке, данные о влиянии искусственных добавок селенсодержащих веществ на развитие грибных культур). Далее подчеркнуты важнейшие функции, выполняемые соединениями меди в жизнедеятельности микроорганизмов, в основном в связи с биохимией микологических объектов. В следующем подразделе описаны имеющиеся в литературе немногочисленные исследования фитогормона ß-индолил-З-уксусной кислоты во взаимосвязи с искусственной культурой базидиомицетое.

На основании каждого из разделов представленного обзора сформулированы аспекты исследования для достижения цели настоящей работы и определен круг решаемых для этого задач.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования, условия культнвировання

Данное исследование выполнено на материале коллекции штаммов высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, В работе использованы 4 штамма L. edodes' NY. F-249, 2Т. 0779. Культуры грибов поддерживали на сусло-агаре при 4°С.

В процессе исследования лектиноеой активности L edodes на разных стадиях морфогенеза промежуточную культуру для получения плодовых тел выращивали на

среде следующего состава ([Song etat., 1987], г/л): D-Glc -10; L-Asn -1; КН2РО4 - 5; Мд304 7Нг0 - 2.5; FeSCUTHjO - 0.03; тиамин - 510'"; НгО до общего объема 1 л

При изучении влияния состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов L edodes использовали следующие источники углерода (300 мМ по углероду): D-Glc, Suc, L-Ara, L-Rha, D-Mart, D-Mal, D-Fru, D-Gal, D-Lac, CH3COONa3H20. В качестве источника азота в среду вносили в различных концентрациях L-Asn, NaNOs, NHjCI. Рассчитывали оптимальное соотношение C:N. В состав сред входили только указанные компоненты. Кислотность исходной среды культивирования устанавливали добавлением HCl или NaOH (0,05 M) в стерильных условиях после раздельной стерилизации компонентов.

Для исследования взаимосвязи молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании L edodes использовали синтетические среды на основе D-Glc (50 мМ) с источниками азота: NHXI или NaN03 (соотношение C:N в среде составляло от 7,5:1 до 150:1); эссенциальные аминокислоты (20 мМ по азоту). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали катионы Саг+ или Мпг* в виде хлоридов.

С целью изучения стимуляторов пектиновой активности на агаризованных средах при культивировании L. edodes использовали синтетические среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду): D-Glc, Suc, L-Ara, L-Rha, D-Man, D-Mal, D-Fru, D-Gal, D-Lac; источником азота (концентрация 20 мМ по азоту): Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Phe, Trp, NH4CI, a также среду с PBS (pH 7.2) и композиции указанных компонентов. Среды Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Phe, Trp содержали также 0,4500 г/л Glc. Среда PBS содержала также, г/л: Glc - 0,4500, NH4CI - 0,2140. Среда Glc-NHíCl содержала, г/л: Glc - 0,4500, NH4CI - 0.2140.

Исследование влияния селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и пектиновую активность L edodes проводили на жидких и агаризованных средах. При глубинном культивировании L. edodes использовали среды: с Glc и Asn, соотношение C:N 15:1 (среда I); пивное сусло, 2° по Баллингу (среда II); среда на основе пшеничной муки (20 г/л) (среда III); среда на основе экстракта дубовых опилок (среда IV). В состав плотных сред того же состава (la, Illa, IVa) и 4°-го ara ри зова иного пивного сусла (IIa) входил дополнительно агар (18 г/л). ДАФС-25 синтезирован, описан и любезно предоставлен Б.И. Древко [Древко и др., 2001]. Концентрация в пересчете на селен в средах культивирования составляла 0,1 мг/л.

Изучая влияние Мег* на активность внеклеточных лектинов шиитаке, использовали синтетические жидкие среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду): D-Glc, L-Ara, Suc; источником азота служил Asn (10 мМ). В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали соли металлов (концентрации 0-10 мМ): MgSOi*7HaO, СаСЬ'2НгО, МпСЬЧНгО, FeS04'7Hî0, CuSCVSHîO, ZnS04'7H20, CoCI2 6H20, NÍSO4 6H2O, SnC12'2H20.

Синтетическая среда для изучения процессов хелатообразования в рамках проблемы влияния Fe(II), Co(ll), N¡(11) на активность внеклеточных лектинов L. edodes состояла из Glc (50 мМ), Asn (10 мМ), включала добавки Fe(ll), Co(ll), N¡(ll) (4 мМ) и EG (2 мМ или 4 мМ).

Методы исследования При посеве грибной культуры в качестве инокулята использовали 14-сут культуру L edodes F-249, выращенную на агаризованном пивном сусле при 2б°С. Способ дозирования посевной культуры состоял в засеве жидких сред дисками сусло-агара диаметром 5 мм с культурой гриба, взятыми из одной зоны растущего мицелия, обычно 3 диска на 50 мл среды или 1 диск на чашку Петри.

Растворы органических Se-, S-, N-содержащих соединений, используемых 8 качестве добавок к среде выращивания, лосле стерилизации в тонком слое УФ облучением добавляли непосредственно перед посевом.

Получение плодовых тел L. edodes осуществляли как на органической плотной среде из смеси дубовых опилок и пшеничного зерна (4:1, v/v), так и на чашхах Петри со средой сусло-агар, по модифицированной методике [Stamets, 1993] с применением холодового шока и суточных температурных колебаний. Время от засева субстрата до начала плодоношения составляло от 38 до 70 сут в зависимости от штамма.

Ростовой коэффициент (PK) вычисляли по формуле: PK = dhg/t, где d -диаметр колонии, мм; h - высота колонии, мм; g - плотность колонии, балл; t - возраст колонии, сут. Величину g оценивают по трехбалльной шкале [Бухало, 1988]. Скорость роста при глубинном культивировании определяли по накоплению сухой биомассы в единицу времени в зависимости от продолжительности выращивания.

Лектиновую активность в жидких пробах определяли реакцией ГА с самопроизвольным оседанием эритроцитов, используя 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов в серии последовательных разведений лектина (Пуцик и др., 1981]. ТГА выражали как наибольшее разведение раствора, вызывающее агглютинацию эритроцитов.

Углеводную специфичность определяли в серии последовательных разведений углевода (от 0,3 М) при использовании раствора испытуемого гемагглютинина с титром 4 в реакции ГА. В работе использовали 21 препарат углеводов (Serva). Углеводную специфичность оценивали по минимальной концентрации углевода, ингибирующующей реакцию ГА лектина в данных условиях. При отсутствии ингибирования в интервале концентраций углевода от 0 до 100 мМ считали, что специфичность исследуемого лектина к данному углеводу отсутствует.

Изучение зависимости лекти но вой активности от температуры культивирования мицелия проводили: при 26°С как оптимальной температуре роста мицелия для данного вида, 16°С • температуре замедленного роста. 32°С и 37°С -верхних предельных значениях температурного интервала развития этой культуры на плотных и жидких средах соответственно.

Относительную молекулярную массу белковых образцов определяли с помощью электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) по методу Лэммли. В качестве стандарта использовали набор белков маркеров фирмы «Amresco» (США) Визуализация белковых полос осуществлялась методом окраски геля при помощи 0.2%-ного раствора Coomassre' Brilliant Blue G-250 или 0,1% (rtvV) раствора AgN03.

Аминокислотный состав белков определяли на аминокислотном анализаторе AAA 339 (ЧССР). Подготовку образца проводили по общепринятому методу (при 105°С 24 ч в 6М HCl).

Состав углеводной фракции исследовали методом капиллярной газовой хроматографии на неподвижной жидкой фазе SE-54 в режиме программирования температуры, с предварительным получением силильных производных Сахаров.

Хроматографию проводили на приборе «Chrom 5» (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором, используя кварцевую капиллярную колонку длиной 25 м. при программировании температуры от 150 до 280°С со скоростью нагрева термостата колонок 8 град/мин. Объем пробы 1 мкл. Газ-носитель - гелий.

Тримети л сил иловые эфиры исследуемых проб и соединений-стандартов получали с использованием 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазана и триметилхлорсилана в качестве катализатора [Пецев и Коцев, 1987].

Липиды экстрагировали модифицированным методом С. Song с соавторами (1939), включающим обработку сухого мицелия смесями метанол-вода-хлороформ в объемном соотношении (1:2:3), высушивание в токе азота или аргона и экстракцию сухого остатка гексаном. Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии. Метиловые эфиры ЖК разделяли на газожидкостном хроматографе "Биохром-1" на кварцевой капиллярной колонке (длина 25 м, внутренний диаметр 0.2 мм) с неподвижной фазой SE-54. Использовали режим программирования температуры термостата колонки от 130 до 270°С со скоростью нагрева 4°С/мин. Температура испарителя 150°С, детектора 270°С. Газ-носитель -гелий, скорость потока 1.6 мл/мин.

Жирные кислоты идентифицировали по временам удерживания их метиловых эфиров. В качестве стандартов метиловых эфиров ЖК использовали набор Bacterial Acid Methyl Esters CP Mix (Supelco): 11:0, 2-OH 10:0, 12:0, 13:0, 2-OH 12:0, 3-OH 12:0, 14:0, M 5:0, a-15:0, 15:0, 2-OH 14:0, 3-OH 14:0, ¡-16:0, 16:1a, 16:0, ¡-17:0, 17:0, 2-OH 16:0, 18:29'1г, 18:1s, 18:0, 19:0, 20:0, а также в дополнение другие метиловые эфиры ЖК (Sigma): 7:0, 8:0, 9:0, 10:0,18:1, 20:2, 21:0, 22:1, 22:0, 23:0, 24:1, 24:0.

Политональные кроличьи антитела получали на хроматографически очищенный препарат внеклеточного пектина L1. Иммунизацию проводили 3 раза с интервалом 2 недели, последовательно вводя в подколенные лимфатические узлы кролика 50. 100 и 150 мкг пектина. Антиген растворяли в физрастворе, забуференном фосфатами (pH 7.2) до концентрации 100 мкг/мл и смешивали с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Кровь отбирали через неделю после третьей иммунизации. Фракцию иммуноглобулинов G получали из антисыворотки осаждением сульфатом аммония.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в полистироловых 96-луночных планшетах. В качестве ферментативной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с анти-кроличьими козлиными антителами. В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО ИЛИП, г, Санкт-Петербург), Результаты твердофазного ИФА продемонстрировали наличие общих антигенных детерминант в составе двух внеклеточных лектинов.

Съемку рентгенограмм проводили на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3 на Cu-Kj излучении в следующем режиме: сила анодного тока 75-150 А, катодное напряжение 75-150 В. Скорость сканирования 2 град/мин.

Спектры ЯМР получапи на спектрометре Varian FT 80А (США), частота 80 МГц. для 2 - 3% растворов образцов в 99.96 % DíO при ЗОЗК (внутренний стандарт -ацетон, д„ 2.225 м.д., дс 31.45 м.д., и внешний стандарт - 85% водная НзР04> <ЭР 0 м.д.). Для калибровки спектров использовали Na-соль 3-(триметилсилил)-пропионовой-2,2,3,3-d4 кислоты (внутренний стандарт, 5„0).

Инфракрасные спектры регистрировали на приборе ИК-Фурье спектрометр ФСМ 1201 в тонком слое вазелинового масла и гексахлорбутадиена.

QSAR-свойства вычисляли с помощью программы комплекса HyperChem по атомно-аддитивным схемам [Hasel et at,, 1988; Still ef al., 1990; Bodor et al., 1989; Gavezotti, 1983; Ghose and Crippen, 1986, 1987; Viswanadhan et al., 1989; Miller, 1990; Ghose etal., 1988].

При изучении влияния Fe(ll), Co(ll), Ni(il) на активность внеклеточных лектинов L edodes квантовохимические ab initio расчеты проводили неограниченным методом Хартри - Фока (UHF) в базисе 3-21G(d,p) (UHF/3-21G(d,p)) [Hehre ef al., 1986; Кларк, 1990] с использованием программ из пакета HyperChem [HyperChem (TM), Hypercube, Inc., 1115 NW 4thStreet, Gainesville, Florida 32601, U. S. А.]. Полную оптимизацию

геометрии проводили посредством алгоритма Полака - Рибера (Potak • Rtbiere conjugate gradient algorithm) (Дэнкис и Шнабель, 1988]. Предварительную оптимизацию геометрии осуществляли методом РМЗ [Stewart, 1989а; 1989b] посредством программы из того же пакета. При квантовохимических расчетах задавали условие, чтобы норма градиента не превышала 0.02 ккал/(моль А). Корреляционные поправки к хартри-фокоеским энергиям рассчитывали для оптимизированной геометрии (Single Point) в рамках теории возмущений Меллера - Плессе второго порядка (МР2) [Hehre et ai., 1986; Кларк, 1990] в том же базисе (подход WlP2y3-21G(d,py/UHF/3-21G(d,p».

При оценке полученных результатов пользовались методом расчета стандартного отклонения среднего арифметического; данные, представленные в настоящей работе, имеют соответствующие доверительные интервалы при уровне доверительной вероятности 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаружен не» выделение, определение специфичности агглютининов Lentinus edodes

Обнаружение лектинов Lentinus edodes

О наличии лектинов L. edodes информация крайне ограничена и представлена двумя работами [Jeune et ai., 1990; Wang et ali, 1999], касающимися выделения лектина из плодовых тел L. edodes. В литературе отсутствуют данные о внеклеточных лектинах шиитаке. Поэтому, учитывая важность и разнообразие функций лектинов в живых организмах, а также разностороннее значение базидиомицета L edodes, мы предприняли исследования по обнаружению внеклеточных лектинов, находящихся в культуральной жидкости гриба, а также в пассивных смывах с поверхности мицелия в условиях твердофазного культивирования.

В результате экспериментов по поискам гемагглютининов культуральной жидкости была обнаружена ГА активность в ЮК у всех взятых в эксперимент штаммов L edodes F-249, 2Т, 0779, NY, выращенных на минеральной среде при 26°С. Анализ КЖ показал значительные вариации ГА активности в зависимости от штамма шиитаке. Возникает вопрос, не объясняются ли эти штаммовые различия по продукции внеклеточных гемагглютининов разной способностью культур к накоплению биомассы? Для корректности сравнения ГА активности у разных штаммов L. edodes, культивируемых одно и то же время, проведены эксперименты по определению скорости роста используемых штаммов на минеральной среде, позволившие заключить, что различия е отношении ГА активности заметно превосходят различия в скорости роста культур штаммов.

Полученные данные позволили говорить о большом количестве внеклеточных агглютининов, выделяющихся в среду выращивания. Для доказательства принадлежности выявленных гемагглютининов к классу лектинов были получены результаты определения углеводной специфичности агглютининов КЖ методом ингибирования агглютинации эритроцитов углеводами. Агглютинины всех штаммов высокоспецифичны к D-Gal (кроме NY), D-Lac, в меньшей степени -D-Mal. Ингибирующая концентрация углевода минимальна в случае Lac и штамма F-249. При этом ам и но про из водные Gal и G le малоэффективны в отношении ингибирования реакции ГА лектиноа КЖ всех штаммов, a GalNAc и GlcNAc ингибируют только ГАА лектинов штамма NY (4,17 и 16,7 мМ соответственно).

К L-Rha особенно специфичны лектины штамма F-249: реакцию ГА ингибирует концентрация этого углевода 11,1 мМ. Исключительно в отношении пектинов штамма F-249 наблюдается явно выраженная углеводная специфичность к D-ManOH и D-Cel (8,33 и 33,3 мМ соответственно в сравнении с величинами, превышающими 100 мМ, для других штаммов). Мы осознаем, что преждевременно было бы говорить об углеводной специфичности грибных лектинов как о систематическом штаммоспецифичном признаке, однако из полученных нами данных довольно четко видны различия этого параметра у разных культур штаммов.

Предположив, что гемаггпютинины присутствуют и на поверхности грибных гиф при выращивании на плотных средах, и что ГА активность будет проявляться в пассивных смывах с мицелия, мы провели эксперименты по обнаружению внеклеточных гемагглютининое при твердофазном культивировании. Была выявлена ГА активность в пассивных смывах с мицелия у всех взятых в эксперимент штаммов L. edodes, выращенных на агаризовзнных средах разного состава. Различия в отношении ГА активности заметно превосходят различия ростовых характеристик культур штаммов, и корреляций ГА активности со скоростью накопления биомассы не выявляется (как и при жидкофазном культивировании). Определение углеводных гаптенов для агглютининов вегетативного мицелия культур 4-х штаммов шиитаке показано присутствие во всех без исключения случаях лектинов с высокой специфичностью только к D-Lac. Специфичность к D-Gal и D-GaIN, несомненно, ниже, но также обнаружена для всех штаммов. Лектины с аналогичной высокой специфичностью к Lac были обнаружены нами и в КЖ.

Таким образом, данные, полученные из экспериментов по обнаружению гемагглютининов шиитаке, позволяют утверждать, что агглютинины L. edodes присутствуют в КЖ и в пассивных смывах с мицелия у всех взятых в эксперимент штаммов L edodes, выращенных в условиях жидкофазного и твердофазного культивирования. Определение углеводных гаптенов позволяет отнести выявленные гемаггпютинины к классу лектинов. Различия в отношении лектиновой активности заметно превосходят различия ростовых характеристик культур штаммов.

Выделение и очистка, определение углеводной специфичности лектинов

Для дальнейших исследований по выделению и очистке внеклеточных лектинов шиитаке мы использовали штамм L edodes F-249. Выбор был основан на следующем: высокая лектиновая активность в условиях эксперимента; быстрый рост вегетативного мицелия на агаризованных средах; именно для штамма F-249 нам удалось получить плодовые тела на чашках Петри в течение не более чем 60 суток.

При выделении внеклеточных лектинов L. edodes F-249 в качестве грубого белкового экстракта использовали КЖ. В состав синтетической среды входили Glc (50 мМ) и Asn (1D мМ). Сконцентрированный фильтрат КЖ осаждали ацетоном, выпавший при 4°С осадок отделяли от супернатанта. Осадок растворяли в воде, получая неочищенный раствор пектина 1 (L1). Супернатант освобождали от ацетона, высушивали при 30-32°С, остаток растворяли в воде, получая неочищенный раствор лектина 2 (£.2). Полученные водные растворы лектинов пропускали через колонку с Sephadex G-25, элюент вода. Выход белковых фракций регистрировали на приборе Uvicord S-ll (LKB) при 280 нм.

Далее очистку лектинов L1 и L2 проводили с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. При нанесении активных по ГА фракций, сошедших с колонки после гель-эксклюзионной хроматографии, на колонку с катионообменником Toyopearl СМ-650М большинство примесей связалось с носителем, тогда как очищенные лектины выходили со свободным объемом. После гель-фильтрации на колонке С Toyopearl HW-5 5S (рис.1) удалось выделить и разделить две активные по

ГА фракции целевых белков. Анионообменная хроматография указанных фракций, содержавших преимущественно i.1 или L2, на колонке с Toyopearl DEAE-650M привела к удалению большинства примесей и полному разделению двух пектинов, выходивших с колонки при существенно различной ионной силе элюента (L1 при концентрации NaCI 0,3 моль/л; L2 элюировзлся PBS с концентрацией NaCI 0,14 моль/л). Окончательную очистку проводили на колонке с Sephadex G-75. Обессоленные водные растворы L1 и L2 концентрировали.

20 Зв 68

Объем элюции, мл

Рис. 1. Профиль ЭЛЮЦИ и лектинов£1 и L2 Lentinus edodes F-249 на колонке с Toyopearl HW-55S. 1-ti; 2-12

SDS-PAGE показал, что оба белка мономерны, характеризуются молекулярными массами 43 и 37 кДа соответственно. Дополнительное подтверждение указанных величин получили при использовании калиброванной по молекулярной массе колонке с Sephadex G-75. Установлено, что внеклеточные лектины L edodes F-249 являются гл икс протеи нам и, однако содержание углеводов в L2 значительно выше, чем в L1.

Определение углеводной специфичности показало, что оба пектина проявляют специфичность к D-Gal и D-Lac. И для i.1, и для L2 минимальные ингибирующие концентрации этих углеводов 2,03 мМ Gal и 8,33 мМ Lac. Другие углеводы, к которым лектины проявляют более или менее высокое сродство; для ¿1 это Rha (4,16 мМ); для £2 - Ara (4,16 мМ) и МапОН (8,33 мМ).

Интересна специфичность одного из пектинов (L2) и гемаггпютиннов КЖ к МапОН. Известно, что метабопизм МапОН играет важную ропь в развитии плодовых тел гриба. У L. edodes содержание этого полиола может достигать 30-50 % от общих углеводов. По нашим данным МапОН накапливается в белом мицелии L. edodes перед нормальным плодоношением на коричневой мицелиалькой пленке.

Лектины обнаруживают высокую специфичность к гликопроизводным, в составе молекул которых есть прежде всего D-галактозид ипи, в меньшей степени, к производным 4-0-D-глюкопираноэы, предпочтительнее 4-O-a-D-Glc- го сравнению с 4-0-p-D-Glc-, Никакие иные D-глюкозидные производные, как и сама Glc, не проявляют сродства к исследуемым пектинам.

Внеклеточный гликопротеин L. edodes — пектин L1

Внеклеточный лектин L1 из L. edodes F-249 — гликопротеин с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 43 »Да. M имеет в своем составе (10,5 ± 1,0)% (т/т)углеводов, представленных Glc.

По результатам определения аминокислотного состава L1 обращает на себя внимание достаточно высокий уровень полярных аминокислот (Asx, Glx, Lys, Arg), Так, содержание Lys и Arg составляет 10,4 и 16,5 мол.% соответственно. Много и кислот.

занимающих промеж/точное положение между гидрофильными и гидрофобными, особенно Hys, Ser и Gly. Для L1 индекс полярности равен 54,6%. Такая высокая полярность характерна для большинства водорастворимых белков, для которых величина указанного индекса находится обычно в рамках интервала 47 ± б %,

На хроматографически очищенный препарат внеклеточного лектина Í.1 получали поликлональные кроличьи антитела. Результаты твердофазного ИФА продемонстрировали наличие общих антигенных детерминант в составе двух внеклеточных лектинов.

Агглютинирующие свойства лектинов L. edades на разных стадиях очистки препаратов этих белков изучали в зависимости от типа эритроцитов (разных животных и 4 групп крови человека) и их предварительной обработки (нативных и трипсинизиро ванных). Очищенные лектины демонстрировали высокую избирательность при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизиро ванных эритроцитов кролика, не реагировали с эритроцитами других животных и человека. Обработка эритроцитов трипсином значительно повышала чувствительность реакции.

Внеклеточный протеогликан L. edodea - лектин 12 Внеклеточный лектин 2 из L. edades F-249 - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 кДа. L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0)% (m/m) углеводов, предсталенных Glc (73% общей массы углеводной части молекулы лектина) и Gal (27% общей массы углеводной части молекулы лектина).

В L2 высоко содержание полярных аминокислот, прежде всего Asx - около 42% от суммы аминокислот. Элементный анализ (на содержание азота) показал, что Asx присутствует в виде Asn. Менее 10% в L2 других полярных аминокислот; Glx, Lys, Arg. Для L2 индекс полярности равен 56,7%.

Содержание углеводов в L2 значительно выше, чем в Í.1. Высокое содержание Asn в составе L2 согласуется с нашими данными о положительном эффекте Asn в отношении формирования коричневой мицелиальной пленки L. edodes в глубинной культуре. Кроме того, высокий уровень Asn в Í.2 наряду с составом углеводной части молекулы (Glc и Gal) позволяют отнести этот лектин к N-аспарагинсвязанным, имеющим N-гликозидную связь в молекуле протеогликан а. Белковая часть связывается с углеводной через Asn [Э.А. Коваленко, 1997].

Более детальная структурная характеристика L2 была получена с помощью спектроскопии ЯМР. Спектр ЯМР 'Н образца L2 содержит две группы сигналов (табл. 1). Химический сдвиг протона воды (НгО), содержащейся в растворителе (ОгО), равен 4.632 млн'1. Поэтому с высокой степенью достоверности пики при 4.380, 4.884, 5.047 и 5.087 млн"' могут быть отнесены к протонам гидроксильных групп.

Кроме того, пики при 5.047 и 5.087 млн"1 могут относиться к алкиламинным (AlkNHj, AlkNHAlk') или алкиламидным протонам (AlkCONH2, AlkCONHAIk"), для резонанса которых характерны химические сдвиги 5.0-8.0 и 5.0-8.5 млн"' соответственно (Панкратов и Остроумов, 1995).

Отметим, что сигналы метиленовых и мети новых протонов групп СНгОН и СНОН обычно проявляются в области 3.6 и 3,8 млн"' соответственно. Это согласуется с предположением о наличии в составе образца названных групп,

В пользу отнесения пиков к ОН- или NH-протонам свидетельствует то, что все сигналы в той или иной степени уширены. Причиной уширения сигналов протонов при гетероатомах обычно является их участие в обменных взаимодействиях, а в случае протонов при атоме азота - также наличием у ядра 14N электрического квадрулольного момента [Панкратов и Остроумов, 1995].

Таблица 1. Данные спектра ЯМР 'Н внеклеточного лектнна L2 из L. cdodes F-249

ХимическиЛ сдвиг (й,млн"') Возможное отнесение

3.268; 3.317; 3.380; 3.420; 3.466; 3.631 ]. Алкпльные протоны в фрагментах ОЬОН, СНОН, СН2ЫССЖ, СН^ОЖ, СН2М\ СНЫ4, СН2К=С=5, СН2+М«С~, СН,502Р, сн2а, сн2вг, аы 2. Алкильные протоны разнообразных фрагментов ХСН2У и ХСНУ, включая К2КСН2СО<Ж, К^СНСОСЖ (Я = Н, АН;, Аг) 3. Протоны при гетероатомах О, N. Э в соединениях А1ЮН, АгЫН2, АгИНИ, АгБН

4.380; 4.884; 5.047; 5.087 1. Протоны при гетероатомах О, N в соединениях А1кОН, АЮН, АгЫН2, АгШт 2. Винильные протоны фрагментов С=СН>, ЕЮС=СН (Я = Н, А1к, Аг)

Спектр не содержит сигналов алкильных и циклоалкильных протонов, не связанных с электрокоакцепторными атомными группами, а также протонов ароматических, хиноидных, пиридиновых, пиррол ьных, фура новых, тиофеновых циклов, альдегидных протонов (RCHO), подвижных атомов водорода карбоновых кислот (RCOOH), сульфокислот (RS03H), оксимов (ВгС=МОН), алкилтиолов (AlkSH).

Учитывая характер образца, можно исключить возможность присутствия фрагментов CH2NCOR, CHsNSOíR, CH2N=C=S, CWN-C", CH2S02F, СНгС1, СНгВг, CH2I, структурных элементов ХСН2У и XCHY, кроме приведенных в табл. 1 «аминокислотных, а также С=СНг, ROC=CH, AlkNH2, AlkNHAIk', ArNHj, ArNHR, ArSH.

Следовательно, спектр ЯМР 1H образца не противоречит возможности наличия в его составе углеводных и a-аминокислотных звеньев, то есть протеогликановой природе LZ.

Выделение и характеристика внеклеточного гликолипида L. ectodes Используя экстракцию смесями метанол-вода-хлороформ, из L2 на промежуточной стадии его очистки мы получили препарат, содержащий Gal (выход 0,19%) и жирные кислоты (выход 0,17%) С8:0 и С9:0 (в соотношении 28% и 72% (т/т) от суммы двух ЖК соответственно). Путем простых вычислений из экспериментально найденного соотношения масс Gal и апкановых кислот получаем, что в выделенном препарате (обозначенном нами S3) на одну молекулу Gal приходится 1 молекула ЖК. Это в пределах погрешности эксперимента подтверждается теоретическими подсчетами (приведены в тексте диссертации). Согласно результатам элементного анализа, 15% молекул галактолипида сульфатировано. То есть главными компонентами S3 являются Gal {1-сульфат-Gal), ацилированная остатками октадекановой или нонадекановой кислот. Указанные методы исследования дополнены ИК-спектроскопическими,

В ИК-спектре галактолипида S3 наблюдались случаи, когда полосы можно относить к сульфатной группе. Имелись типичные алифатические полосы, свидетельствовавшие о присутствии углеводородной цепи ацильного заместителя, а также признаки полиметиленовой цепи. Отнесения частот для колебания с участием связей С-О в карбоновых кислотах, сложных эфирах (1155 и 1111 см"1) могут говорить о сложноэфирном характере присоединения жир но кислотно го заместителя Gal. В

целом отнесения частот не противоречат возможности наличия в составе соединения S3 углеводных звеньев и ЖК остатков.

Накопление входящих в состав S3 короткоцепочечных ЖК происходит в мицелии шиитаке на стадии формирования коричневой мицелиальной пленки и коррелирует с резким повышением внеклеточной пектиновой активности в смывах с мицелия именно на этой морфогенетической стадии. Никакого повышения содержания в мицелии ЖК С8;0 или С9:0 не наблюдается при образовании недифференцированных плодовых тел на белом мицелии, когда и увеличения пектиновой активности не происходит. Более подробному описанию изменений жир но кислотного состава мицелия во взаимосвязи с пектиновой активностью культуры в процессе морфогенеза посвящен один из разделов настоящей работы.

Можно высказать предположение о возможной роли S3 как одного из регуляторов активности внеклеточных пектинов. Кроме корреляции накопления компонентов S3 с увеличением лектиновой активности, о возможном вкладе гл и кол ил ид а в регуляцию этой активности говорят результаты других наших наблюдений. В смесях препаратов S3 + L1 и S3 + L2 при одинаковой массовой концентрации компонентов титр гемагглютинации возрастает в 8 и 16 раз соответственно (собственной ГА активности S3 не проявляет). Кроме того, в ходе процедуры очистки препарата L2 удельная активность его проходит через максимум на промежуточной стадии, на которой L2 связан с S3, а затем заметно снижается по мере дальнейшей очистки L2.

Длительное время в литературе обсуждаются вопросы, связанные с неспецифичностью реакции клеток микроорганизмов в ответ на самые различные внешние воздействия. В общем механизме приспособления к неблагоприятным условиям или стрессу значимую роль играют регуляторные соединения, экскретируемые во внеклеточную среду (факторы стресса) [Андреев и др., 1988]. Среди компонентов фактора были выявлены урацил, фосфаты, жирные кислоты (С9:0 и С10:0), олигосахариды, (Примечание: среди компонентов S3 72 масс% жирно кислотно го пула приходится на С9:0). Подобное соединение синтезируется одним из первых на фоне затухания метаболических процессов, работающих в состоянии нормы [Феофилова. 1994].

Мы полагаем, что в дополнение к комплексу вторичных метаболитов, экс к ре тируемых культурой L. edodes, под воздействием изменившихся в отрицательную сторону условий внешней среды (питательный стресс, переход к цитодифференцировке вследствие истощения питательных ресурсов) присоединяются вещества - регуляторы лектиновой активности, одним из которых является S3,

С учетом разнообразия биологического происхождения продуцентов гликолипидов с признаками как явного сходства, так и немаповажного в функциональном плане различия молекулярного строения обсуждаемых соединений, выявляемых современными исследованиями [Cheng ef а/., 2003; Голубев и др., 2004; Воробьева и др., 2006; Плужников и др., 2006; Кулаковская и др., 2007], не представляется особенно удивительным тот факт, что L, edodes и, вероятно, другие макробазидиомицеты способны самостоятельно синтезировать подобные соединения, однако пока в отношении данной систематической группы такой информации в литературе мы не встречали.

Зависимость лектиновой активности от условии культивирован и я

Имеется ряд признанных важными физико-химических и биологических факторов внешней среды, которые могут служить триггерами процессов сложного

пути развития мицелиальных грибов [Феофилова и др, 1988]. От таких параметров внешних условий, как температура культивирования, количество посевного материала, возраст культуры, состав питательной среды (природа веществ -источников углеродного и азотного питания, соотношение *С:№, кислотность), мы изучали зависимость активности пектинов L. edades для успешного решения в дальнейшем проблемы получения этих биологически активных соединений методом глубинного культивирования.

Влияние количества посевного мицелия, температуры, возраста культуры на пектиновую активность L. edodes

Для изучения влияния количества посевного мицелия на активность внекпеточных пектинов гриба мы выбрали способ дозирования посевной культуры -дисками сусло-агара, покрытыми мицелием (d=5 мм). Зависимость лектиновой активности КЖ от дозы посевного мицелия изучали в процессе роста культуры на синтетической Glc-Asn среде. Оказалось, что зависимость лектиновой активности КЖ от количества посевного материала характеризуется непропорционально быстрым увеличением этой активности, имеющим предельное значение при определенном количестве икокулята.

Изучение зависимости лектиновой активности от температуры культивирования показало, что титры ГА имеют более высокие значения как при повышении температуры, так и при ее понижении по сравнению с оптимумом роста (26°С). Для корректности сравнения лектиновой активности у разных штаммов L edodes, культивируемых одно и то же время, проведены эксперименты по определению скорости роста используемых штаммов при данных температурных условиях выращивания. Оказалось, что таких резких изменений, как это имеет место в плане лектиновой активности, скорость роста не претерпевает ни в зависимости от штамма, ни тем более от температуры выращивания. Штаммовые различия скоростей роста относительно невелики: не более чем в 1,1 раза при 37°С, в 1,2 раза при 26°С, в 1,3 раза при 16°С, а штаммовые различия по лектиновой активности достигают 5,1*103 раз (при 37°С). Изучали влияние выбранных температур на лектиновую активность КЖ в процессе роста культуры, а также

Рис. 2. Зависимость лектиновой активности КЖ (а, б, в) н скорости роста (г) L. edodes от времени культивирования при различных температурах выращивания <26Х (а, г), 16"С (б), ЗГС (в)). Штаммы: l - NY, 2 - F-249, 3 - 2Т, 4 - 0779

Видно, что штаммовые различия в отношении ГА активности КЖ, сравнительно небольшие при 16°С, увеличиваются при 26°С с одновременным изменением вида соответствующей кривой. При 37°С штаммовые различия продолжают углубляться, резко отличается от других штамм NY, Сопоставление характера зависимостей на рис. 2 (а, б, в) с рис. 2 (г) позволяет сделать вывод, что изменения лектиновой активности в нашем эксперименте не определяются только скоростью роста. Аналогичный вывод был сделан нами и ранее для случая температурного оптимума 26°С: лектиновая активность — биохимическая характеристика, производная не только от способности грибной культуры к накоплению биомассы.

Активность внеклеточных пектинов L. edades в зависимости от источников углерода и азота

Исследования, связанные с образованием внеклеточных пектинов шиитаке в зависимости от условий глубинного культивирования, позволяют представить характеристику внешних условий биосинтеза пектинов культуры, выявить оптимальную в этом отношении химически детерминированную среду выращивания и усовершенствовать процедуру выделения и очистки экзолектинов. С этой целью первоначально мы изучали жидкие среды разнообразного химического состава, а именно с различными источниками углерода и азота, низкомолекулярными компонента ми-добавками, значениями pH среды, в динамике роста культуры.

Анализ КЖ показал значительное увеличение титров ГА для всех сред с моносахаридами в качестве источника углерода по сравнению с лектиновой активностью сред на основе других углеводов или ацетата натрия. В этой связи особенно выделяется Ara, титр ГА при использовании которой в КЖ возрос не менее чем в 8 раз по сравнению с другими изученными веществами. Обнаружено, что наибольшей лектиновой активностью характеризуется среда выращивания 'Ara - Asn" при соотношении C:N (9,5-12):1 на 15-18-е сут культивирования (титр ГА 8192), а также "Glc - Asn" при возрасте культуры 3-7 сут и C:N 17:1 (титр ГА 4096). Отмечено значительное увеличение лектиновой активности при pH 8-9 и отсутствие положительного эффекта рН-статирования растущей культуры.

Эффект некоторых низкомолекулярных компонентов среды: эксперимент и квантовохимическое рассмотрение

Катионы двухвалентных металлов

Известно стимулирующее влияние некоторых микроэлементов, в том числе катионов металлов, на синтез вторичных метаболитов различными грибами [Scott and Gaucher, 1984; Козловский и Соловьева, 1986; Hughes and Poole, 1989; Ловкова и др, 1995; Козловский и др., 2000). О механизмах их действия на процесс в целом или на его отдельные этапы известно крайне мало. Исследование лектиновой активности L. edodes во взаимосвязи с химическим составом среды культивирования мы продолжили с использованием введения в состав синтетических сред катионов металлов (II) в виде солей. Девять металлов(М) выбрали по принципу биологической значимости их катионов для минерального питания грибов. Сопи выбранных металлов входят в микроколичествах в состав оптимизированных питательных сред ксилотрофных базидиомицетов [напр., Бухало, 1988; Дворника, 1990; Дудка и др., 1992].

Изучая зависимость лектиновой активности глубинной культуры L edodes от концентрации солей металлое(И) в синтетической среде выращивания, мы установили, что одним из факторов, влияющих на эту активность, несомненно является присутствие в среде культивирования солей металлов в степени окисления +2,

В случае меди имеет место зависимость "пектиновая активность - концентрация катиона*, противоположная наблюдаемой для других металлов в настоящей работе: наибольшая активность внеклеточных пектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди.

В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей лектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона Мег+, но и источник углеродного питания грибной культуры. Так, среды выращивания с Саг+ и Glc (рис. За), Suc (рис. 36), Ara (рис. Зв) различаются как величинами титров ГА (максимальные значения составляют 1024 для Glc и Ara, 256 для Suc), так и периодами проявления наибольшей лектиновой активности. Так, титр 1024 наблюдается при содержании Саг* 1 мМ на 9-е сут и в период 16-28 сут культивирования в случае Glc, но только в интервале 21-28 сут в случае Ara. Максимальная лектиновая активность (титр 256) для среды с Suc наблюдается лишь на 3-й и 5-е сут, причем при той же 1 мМ концентрации Саг\

Полученные данные для металлов, образующих обсуждаемые выше катионы, позволяют составить последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта Me2' на активность внеклеточных пектинов шиитаке: Mg > Са > Cu > Fe > Mn > Zn ~ Sn > Со > N¡.

-t-Z

-•-s -•-77

-t-Ш

tqp

я 6в

Рис. 3. Зависимость лети но вой активности (IgT) КЖА. edodes F-249 с добавкой Са3+ при использовании в качестве источника углерода: D-Glc (a), Suc (б), L-Ara (в) от времени культивирования. [Са2+], мМ: (61,68,75)-0; (62f69,76>- 1; (63,70,77)-2;

(64,71,78) - 4; (65,72,79) - 6; (66,73,80) - 8; (67,74,81) - 10

Катионы металлов триады железа

Интерес представляет объяснение влияния катионов металлов на лектиновую активность с позиций квантовой химии. Металлы, рассмотренные в настоящей работе, очень различны по положению в Периодической системе элементов и по свойствам. Поэтому для столь многофакторного свойства, как лектиновая активность, корректные сопоставления можно делать только в ряду близких по важнейшим характеристикам катионов металлов. Поэтому нами в этом плане рассмотрена триада железа, кобальта, никеля.

Вероятный механизм положительного влияния катионов металлов на лектиновую активность состоит в том, что они образуют смешаннолигандные комплексы с гидроксильными группами пектинов и гликоконъюгатов, способствуя обратимому связыванию гликоконъюгатов пектинами. Из-за сходства электронной

№ Зт.

•kVH

tir

конфигурации и электростатических предпосылок комплексообразования изучаемых катионов с кислородсодержащими лигандами есть основания полагать, что различия определяются термодинамикой реакций комплексообразования, прочностью связи металл - кислород. Для проверки этого предположения мы провели квантовохи мическое ab initio исследование термодинамики реакций гексааквокомплексов Fe(ll), Со(М) и N¡(11) с модельной системой — EG, типичным хелатообразующим реагентом и простым аналогом углеводов. Оценивали тенденцию изменения значений полной энергии молекулярных систем в ряду металлов, а именно Е как аналог свободной энергии ( G) реакции без учета энтропии (корректность использования величины Е вместо G показана в тексте диссертации).

Ряд уменьшения склонности катионов к комплексообразованию с этиленгликолем Fe1* > Сог+ » Niiv, полученный из квантовохимических расчетов, согласуется с рядом уменьшения влияния этих катионов на лектиновую активность: Fe£* > Со2* > Ni2\ При этом все величины Е положительны, что свидетельствует о несамопроизвольности, обратимости возможных процессов комплексообразования. Катион металла не должен быть связан в прочный комплекс, и связывание пектина с гликоконъюгатом обратимо, что отражает важнейшую особенность взаимодействия пектинов с гликоконъюгатами.

Наряду с описанным выше квантовохимическим ab initio исследованием термодинамики реакций гексааквокомплексов Fe(ll), Co(ll) и N¡(11) с EG, мы провели экспериментальное исследование поведения моделируемой системы, определяли в динамике лектиновую активность КЖ1. edodes в разных вариантах опыта.

В качестве обобщения данной части работы следует сказать, что мы исследовали эффекты двухзарядных катионов металлов триады железа в составе жидкой синтетической среды культивирования, проявляющиеся в изменении активности внеклеточных пектинов L edodes, и попытались объяснить влияние катионов металлов на лектиновую активность с позиций квантовой химии. Показано, что активность внеклеточных пектинов зависит от присутствия в среде культивирования двухзарядных катионов металлов триады железа. Влияние Fe2*, Сог+, Ni на лектиновую активность изменяется симбатно с рассчитанными на уровнях теории UHF/3-21G(d,p), MP2/3-21G(d,p)//UHF/3-21G(d,p) энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным лигандом EG. Гипотеза об обратимом связывании катионов металлов в непрочные смешанной игандные комплексы с пектинами и гликоконъюгатами, разумно объясняющая различное влияние катионов металлов на лектиновую активность, получила к вантов охи мическое обоснование на примере трех металлов (Fe, Со, Ni).

Селен в органической Форме

Актуальность изучения влияния Se на физиолого-биохимические характеристики грибных культур и отсутствие соответствующей информации в отношении шиитаке (об этом можно судить при рассмотрении обзора литературы) дало нам основания к проведению описанных ниже исследований. Мы использовали новое органическое соединение Se, обладающее преимуществами перед селенатами и селенитами натрия. 1,5-Дифенил-3<еленпентандион-1,5 (препарат ДАФС-25) является одним из немногочисленных селеноорганических соединений, внедренных в практику [Древко и др., 2001).

Исследована зависимость пектиновой активности и ростовых характеристик L. edodes от присутствия в жидких и агаризовакных средах селенсодержащего компонента ДАФС-25. Наблюдается стимуляция процесса накопления биомассы при глубинном культивировании в присутствии селеновых добавок; относительно

быстрорастущий мицелий более подвержен позитивному влиянию препарата. Выявлено положительное воздействие ДАФС-25 на ростовые показатели L. edodes на агаризованных средах, при этом максимальный эффект достигается в случае среды с наиболее низкой скоростью роста мицелия. Под воздействием ДАФС-25 лектиноеая активность как кулыуральной жидкости, так и мицелиальных смывов L. edodes в наибольшей степени возрастает в случае синтетической среды, характеризующейся высокой активностью внеклеточных пектинов изучаемой культуры и сравнительно низкой лектиновой активностью смывов с мицелия в отсутствие ДАФС-25.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что селенсодержащий препарат ДАФС-25 в концентрации 10"* г/л в пересчете на селен оказывает заметное действие на процессы жизнедеятельности L edodes, выраженное в изменении ростовых параметров и пектиновой активности культуры как на жидких, так и на агаризованных средах. Селеновая добавка в наибольшей степени стимупирует рост и пектиновую активность ши итаке на синтетической агаризованной среде, характеризующейся низкими значениями как ростовых показатепей, так и лектиновой активности смывов с мицепия, в отсутствие ДАФС-25. Кроме того, под воздействием препарата возрастает пектиновая активность и на жидкой синтетической среде, характеризующейся максимальными в нашем эксперименте титрами гемагглютинации. Сравнительно низкая при отсутствии ДАФС-25 пектиновая активность или смывов с мицелия (как это имеет место в случае синтетической среды), или культуральной жидкости (среда с дубовыми опилками) может, по-видимому, служить отчасти предпосылкой более выраженного стимулирующего эффекта ДАФС-25 в отношении активности внеклеточных пектинов культуры.

Воздействие неблагоприятных факторов на лектиновую активность L. edodes

Одним из достаточно важных вопросов, который возникает при исследовании эффектов добавок различных компонентов к среде купьтивирования, является вопрос о том, как повлияют условия "питательного стресса* (терминология в соответствии с работой Е.П. Феофи повой (1994)) на изучаемую биологическую активность. В зависимости от того, будет ли набпюдаться повышение активности внекпеточных пектинов при выращивании на неполноценных синтетических питатепьных средах, можно было бы сделать предположение об участии пектинов в адаптации культуры к неблагоприятным факторам внешней среды.

Идентифицированные внеклеточные соединения, участвующие в адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды, по химической природе относятся к разным типам. Они представлены белками, углеводородами, органическими кислотами, нукпеотидами, аминокислотами, липопептидами, летучими соединениями [Николаев, 2004]. Однако большая часть таких соединений в настоящее время не идентифицирована. Снижение уровня энергетического и конструктивного метаболизма и выход из неповрежденных кпеток компонентов внутриклеточного пула являются характерными для защитных метаболических реакций (напр., [Андреев и др., 1983]). Модуляции в лектиновой компоненте внеклеточных белков культуры L. edodes, возможно, являются одним из механизмов, регулирующих метаболизм грибных клеток под влиянием внешних факторов. Начальный подход к доказательству данного предположения осуществлен в настоящем разделе работы. Нам не удалось найти сведений об изучении в подобном аспекте микологических культур.

В качестве показателя "небпагоприятности" усповий купьтивирования гриба мы использовали ростовые характеристики (замедление роста мицепия на агаризованных средах) и изучали, будет пи наблюдаться повышение активности внеклеточных пектинов при выращивании на таких средах. Представляло интерес исследовать культуральную жидкость L edodes F-249 с тем же, как у агаризованных, составом

исходных жидких сред на присутствие внеклеточных лектинов. Получены также данные по лектиновой активности культуральной жидкости L. edodes F-249 при выращивании на жидкой среде с Glc. В этом случае в качестве посевного материала служил мицелий, полученный на всех указанных выше агаризованных синтетических средах.

В пользу высказанных выше предположений о стимулирующей роли неблагоприятных условий выращивания на пектиновую активность шиитаке свидетельствуют медленно растущие колонии на агариэованных средах разных составов, характеризующихся одновременно высокими титрами ГА, а также примеры обратной ситуации, то есть "быстрый рост - низкая лектиновая активность".

Следовательно, результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что компоненты питательных сред, неблагоприятные для роста культуры, при определенных условиях стимулируют повышение лектиновой активности шиитаке. Вполне вероятно, что постоянное присутствие внеклеточных лектинов Lentinus edodes, обнаруженное нами, - не препятствие для предварительного (требуется дальнейшее углубленное изучение) отнесения их к описанным протекторным белкам. Здесь, опираясь на данные литературы по бактериальным внеклеточным факторам адаптации [Николаев, 2004), необходимо также учитывать, что факторы адаптации протекторного типа могут быть и, как правило, являются долгожмвущими, А сигнальные молекулы, молекулы-зонды, для которых изучена динамика их появления и исчезновения из культуральной жидкости, относительно короткоживущие. они быстро накапливаются в среде до активной концентрации и быстро элиминируются.

Лектины шиитаке в процессах морфогенеза

Исследования, представленные в данном разделе, затрагивают такой малоизученный вопрос, как взаимосвязь процессов роста и развития грибного мицелия с синтезом соединений, способных регулировать включение той или иной морфогенетической программы. К числу таких соединений безусловно относят и важнейшие компоненты химического состава мицелия — липиды и углеводы [Феофилова и др., 1994, 2000; Терешина и др., 2002]. Предположение о том, что к числу таких соединений принадлежат грибные лектины, мы постараемся доказать далее. Поэтому наряду с активностью лектинов шиитаке мы исследовали углеводный состав мицелия L. edodes и жирнокислотный состав общих липидов на разных стадиях морфогенеза.

Лектиновая активность L. edodes на разных стадиях формирования плодовых тел

Особый интерес представляет обнаружение и изучение лектиновой активности культуры L. edodes в процессе развития, проследив за изменениями этой активности на стадиях образования различных вегетативных структур, в том числе пигментированной мицепиальной пленки (МП). Исследования показали, что это образование представляет собой плотное сплетение толстостенных пигментированных гиф. У L. edodes МП обычно предшествуют образованию примордиев и далее плодовых тел [Гарибова и др., 1997].

Учитывая время появления МП и титры ГА мицелиальных смывов для этой вегетативной структуры, мы сделали вывод о том, что чем выше ТГА в смывах с мицелия, тем быстрее формируется МП, с более высокой лри этом пектиновой активностью. В экспериментах по получению плодовых тел на чашках Петри мы наблюдали, что в дальнейшем процессе морфогенеза и плодовые тела образуются лишь в случае МП с максимальной лектиновой активностью.

При проведении экспериментов по определению пектиновой активности на различных стадиях морфогенеза (непигментированный мицелий; пигментированный мицелий; коричневая мицелиапьная пленка; мицелиапьная корка; примордии; незрелое плодовое тело; зрелое плодовое тело) нами было показано, что лектиновая активность различна на всех стадиях развития гриба. ГА активность смывов с мицелия, лримордиев, ножки плодового тела существенно ниже, чем е случае МП. Важно отметить тот факт, что появление пигментированного мицелия, предшествующего образованию МП, не приводит к увеличению ГА активности. Лишь формирование плотной коричневой МЛ дает резкое повышение титра ГА. Можно предположить определенное значение лектинов на каждом этапе морфогенетического развития гриба, особенно на стадии образования МП. Согласно имеющейся информации [Botlon and Guillot, 1987; Richard. 1995], образование специализированных вегетативных структур в процессе роста грибов требует мицелиальной агрегации, и внеклеточные пектины могут участвовать в обеспечении сцепления между гифами [КапеКо et al, 1993].

Определение углеводных гаптенов для агглютининов различных вегетативных структур шиитаке позволило представить последоватепьность по возрастанию ингибирующей концентрации угпеаода: D-Lac>D-Gal>D-GalN>D-GlcN>L-Rha, которая нарушается в единственном случае (плодовое тело, штамм F-249), когда Gal и Lac в приведенном ряду меняются местами.

Формирование пигментированной мицелиальной пленки в глубинной культуре шиитаке в зависимости от активности внеклеточных лектинов

Итак, участие лектинов в формировании пигментированной мицелиальной пленки L edodes подтверждается рядом экспериментов, описанных выше. Эти эксперименты были проведены в условиях твердофазного культивирования. Возникает вопрос о существовании взаимосвязи лектинов ой активности L edodes и морфогенетических процессов в условиях жидких питательных сред. Каковы условия формирования МП в глубинной культуре, зависит ли образование этой морфогенетической структуры от активности внеклеточных лектинов? Для выяснения этих вопросов впервые предприняты попытки получения МП на жидких синтетических средах, характеризующихся высокой лектиновой активностью.

Суммируя результаты оптимизации состава среды выращивания в отношении лектиновой активности, описанные выше, можно заключить, что активность внеклеточных лектинов L edodes F-249 высока для сред с аминокислотным азотом (ТГА достигает значения 4096 при соотношении C:N, равном 17:1). Однако появление МП наблюдалось только поспе 55-60 суток культивирования.

Мы попытались получить МП L. edodes F-249 с использованием ряда добавок х синтетической среде, в частности, солей Са, Мп(Н); СаС1а'2НгО, МпС1г'4НгО, Обнаружен положительный эффект катионов Саг+ (2 - 10 ммоль/л) или Мпг* (0,5 - 2 мМ). В отсутствие аминокислотного источника азота не обнаружено влияния этих катионов на появление МП. Среди изученных нами эссенциальных аминокислот выражен эффект Asn на процесс образования МП в жидкой среде культивирования. То есть имеет место явный эффект одновременного присутствия деухзарядных катионов Са или Мп и Asn на процесс формирования МП в глубинной культуре.

Естественно предположить, что Asn участвует в определенных биохимических процессах, медиированных ионами Саг* и Мпг\ Но ограничено ли отличие Asn как компонента жидкой питательной среды только участием в химическом связывании в растворе? Если это так, то по электронному строению молекулы Asn должен выделяться даже среди структурно близких аминокислот. Известно, что углеводы

взаимодействуют с пектинами в том числе посредством образования множественных водородных связей, при этом амидный водород и карбонильный кислород Asn в структуре сайтов связывания часто включены в это белок-углеводное взаимодействие ["The Lectins...", 1986; Elgavish and Shaanan, 1997]. К рассмотрению данной проблемы нами привлечены методы квантовой химии.

Возникает предположение, что реакционным фрагментом аспарагина служит амидная группировка, однако вследствие сопряжения в амид ной группе нуклеофильные свойства азота существенно понижены. Наиболее вероятным центром связывания катиона металла является атом кислорода. Это вытекает также из принципа жестких и мягких кислот и оснований [Pearson, 1990]: предпочтительно взаимодействие жесткой кислоты Льюиса - катиона Са или Мп(И) с жестким реакционным центром • кислородным атомом. Если реакционным фрагментом является СООН-группа, то связывание металла по кислородному атому не имеет альтернативы.

Gin - ближайший структурный аналог Asn и единственная из исследованных нами аминокислот, помимо Asn, имеющая в своем составе группу CONHj. Хотя молекула Gin отличается от Asn только одним метиленовым звеном, тем не менее Gin, в отличие от Asn, как компонент питательной среды не оказывает заметного влияния на формирование МП шиитаке. Важно объяснить разное химическое поведение этих двух структурно аналогичных соединений. Основываясь на вышесказанном, можно предположить, что различия в реакционной способности обусловлены различными зарядами на вероятных реакционных центрах.

Ограниченным методом Хартри-Фока (RHF) [Кларк, 1990] нами произведены ab initio расчеты электронной структуры цвиттер-ионов Asn и Gin. Заряды на атомах в изученных молекулярных системах служат квантовохимическим индексом, описывающим реакционную способность веществ в реакциях, управляемых электростатическими силами. Жестко-жесткое взаимодействие аминокислота -катион Са1+ или Мп1+ как раз относится к такого рода процессам. Получили, что зарядовые характеристики возможных реакционных центров обеих аминокислот очень близки между собой. По-видимому, дифференциальный характер взаимодействия изученных аминокислот с катионами металлов не связан с различиями в электронном строении цвиттер-ионов.

Для выявления других возможных факторов, влияющих на химическое поведение двух аминокислот при взаимодействии с катионами металлов, нами с помощью программного пакета HyperChem рассчитаны QSAR-свойства цвиттер-ионов Asn и Gin. Результаты расчетов позволили сделать вывод, что, возможно, различие в реакционной способности двух цвиттер-ионов в некоторой степени связано с их дифференциальной гидрофобностью. Asn как менее гидрофобный реактант имеет более прочную гидратную оболочку и поэтому связывает катион металла менее прочно, то есть обратимо. Одной из причин высокой селективности к Asn по сравнению с Gin может являться пространственный фактор. На основе таких критериев, как ван-дер-ваальсова поверхность и особенно объем молекулы, можно направленно искать подходящие по топологии фрагменты в структуре белка, основываясь на возможных будущих данных рентгеноструктурного анализа.

Необычно высокое содержание Asn, обнаруженное нами при изучении аминокислотного состава пектина L2 (см. выше), по меньшей мере не противоречит предположению о важности этой аминокислоты для пектинового биосинтеза. На наш взгляд, несомненна активизация процессов формирования МП в глубинной культуре шиитаке с повышенной лектиновой активностью, и Asn способствует этой активизации.

Следовательно, в данном разделе показана зависимость внеклеточной лектиновой активности L edodes F-249 от одновременного присутствия в синтетической жидкой среде культивирования Asn и двухза рядных катионов Са или Мп. При этом наблюдается формирование МП в глубинной культуре в течение нескольких суток. Результаты произведенных методом RHF/6-31G* ab initio расчетов электронной структуры цвиттер-ионов Asn и Gin не позволяют связывать дифференциальный характер взаимодействия изученных аминокислот с катионами металлов с различиями в электронном строении цвиттер-ионов. Рассчитаные QSAR-свойства этих цвиттер-ионов свидетельствуют в пользу того, что различие в реакционной способности Asn и Gin в некоторой степени связано с их разной гидрофобностью. Кроме того, полученные в настоящей работе данные не позволяют и ограничивать роль аспарагина на изучаемой стадии морфогенеза L. edodes только участием в химическом связывании в жидкой среде выращивания. По нашему мнению, аспарагин включен, возможно опосредованно, в биосинтетические процессы, одним из результатов которых является формирование МП культуры.

Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия L. edodes на разных стадиях морфогенеза Высказываются предположения об участии углеводов в индукции процесса плодообразования у грибов. Смена стадий цитодифференцировки происходит под воздействием стрессовых факторов, что сопровождается изменением химического состава, структуры и функции клеток. Для базидиальных грибов таким регулирующим фактором часто является температура, например, холодовой стресс индуцирует образование базидиом у L edodes П"ерешина и др., 2002]. Одна из важнейших ответных реакций клетки гриба на стресс - изменение углеводного состава; это может регулировать активность ферментов и влиять на развитие гриба.

Известно в то же время, что морфогенетическая стадия коричневой мицелиальной пленки, предшествующая нормальному плодоношению шиитаке, обладает по результатам наших экспериментов высокой лектиновой активностью. Процесс формирования неполноценных плодовых тел на не пигментированном мицелии, минуя стадию образования МП, практически не изучен, в частности, ничего не известно о пектиновых комплексах и изменениях углеводного состава неполноценных базидиом. Использованный в настоящем исследовании подход позволяет судить об особенностях углеводного состава и лектиновой активности, проявляющихся в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел, о корреляциях состава углеводного компонента мицелия и углеводной специфичности лектинов. Кроме того, он дает возможность выявить характерные признаки, сопутствующие образованию пподовых тел, вне зависимости от их морфологии, условий формирования и стадии жизненного цикла культуры.

В данной части наших исследований мы поставили задачу выявления взаимосвязи углеводного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры. Для этого состав углеводной фракции L edodes изучали на разных этапах развития культуры: белый мицелий, слабопигментированный мицелий, МП, плодовое тело. Обнаружили изменения углеводного состава L edodes на разных стадиях морфогенеза.

Углеводный состав МП отличается от такового не только плодовых тел и белого мицелия, но и слабоп и гментиро ванного мицелия - стадии, предшествующей формированию собственно мицелиальной пленки. Для сравнения изучен также состав углеводной фракции на разных стадиях развития мицелия двух других

штаммов культуры - 2Т и NY. Выбор указанных штаммов в качестве объектов исследования обусловлен существованием разделенных во времени явлений плодоношения и формирования коричневой пленки, при этом на белом мицелии появляются немногочисленные деформированные, «неполноценные» плодовые тела, а затем, после формирования пленки, происходит обычное, с точки зрения геометрических характеристик плодовых тел и урожайности, плодоношение.

Изучено относительное содержание углеводов, к которым специфичны лектины L. edades. Содержание Lac у штамма F-249 максимально в МП и не обнаруживается в базидиомах. Соотношение относительных величин содержания Lac в МП и слабопигментированном мицелии составило 44: 1 соответственно. В случае двух других штаммов культуры — 2Т и NY оказалось, что на стадии белого мицелия штамма 2Т, приводящей к формированию неполноценных плодовых тел, повышено содержание Gal, не обнаруживаемой настоящим методом на других стадиях. Состав деформированных базидиом, образующихся первоначально на белом мицелии штамма NY, характеризуется относительно высоким содержанием Lac, также не найденной в наших экспериментах в непигментированном мицелии. Для обоих углеводов соотношение примерно 40:1 в сравнении с другими стадиями каждого штамма.

Определено содержание углевода, к которому специфичны лектины только плодовых тел всех изученных штаммов - D-Mal. Минимальные ингибирующие концентрации ее достаточно невысоки и составляют 8,33 - 16,7 мМ. В случае штамма F-249 этот дисахарид присутствует в белом мицелии, в значительных количествах накапливается в пигментированном мицелии, расходуется на стадии МП и вновь появляется в базидиомах в соотношении на указанных стадиях 1.4:5.5:1, соответственно. В случаях формирования плодовых тел без коричневой пленки (штаммы 2Т и NY) Mal не обнаруживается ни в составе неполноценных плодовых тел, ни на стадиях, предшествующих плодоношению.

Количество Rha, к которой углеводная специфичность пектинов относительно низка, при плодоношении без МП возрастает одновременно с Lac и Gal, углеводная специфичность к которым проявляется в гораздо большей степени. При формировании базидиом L edodes F-249 Rha обнаруживается лишь на стадиях, когда содержание Lac наименьшее или она отсутствует. Таким образом, в коричневой пленке накапливается только углевод, характеризующийся наибольшим «сродством» к пектинам культуры.

При рассмотрении особенностей углеводного состава мицелия шиитаке в случае плодоношения на МП обращают на себя внимание выраженные количественные изменения D-ManOH и D-Ino в зависимости от стадии морфогенеза. Содержание МапОМ в белом мицелии, пигментированном мицелии. МП и плодовом теле соотносится как 714 : 55 : 1 : 56 соответственно. Содержание же Ino наиболее низко в белом мицелии и резко возрастает в пигментированном в соотношении примерно 1 : 39. То есть МапОН накапливается, a Ino, наоборот, присутствует в минимальных количествах в белом мицелии перед плодоношением. Интересно, что те же изменения в химическом составе мицелия происходят под влиянием низкотемпературного стресса [Феофилова и др.. 1994].

Таким образом, углеводная специфичность лектинов L. edodes при твердофазном купьтивировании в наибольшей степени проявляется к углеводам, обнаруживаемым на стадии коричневой пленки. Наблюдаются различия углеводного состава (количества Mal, Rha, МапОН и Ino) при нормальном плодоношении культуры и при образовании деформированных базидиом на непигментированном мицелии. Такие данные, как увеличение лектиновой активности и содержания углеводов, к которым специфичны лектины культуры, на фоне роста количества МапОН и

снижения уровня Ino перед плодоношением, представляются нам еще одним свидетельством в пользу предположения об участии лектинов в индукции процесса плодообразования.

Изменение жир но кислотно го состава общих липидов и лектиновой активности L. edodes в процессе морфогенеза

Во введении к предыдущему разделу уже упоминалось о крайне малой изученности процесса формирования неполноценных пподовых тел на не пигментирован ном мицелии, минуя стадию образования МП. В частности, ничего не известно о пектиновых комплексах и пипидах неполноценных базидиом. При выборе объектов исследования в обсуждаемой части работы мы использовали штамм L edodes, характеризующийся «классическим» развитием плодовых тел на пигментированной мицелиальной пленке, а также штаммы, образующие деформированные плодовые тела на стадии белого мицелия, а затем, после формирования МП, приступающие к обычному для данного вида плодоношению. Подобный подход позволяет судить об особенностях жирнокислотного состава и лектиновой активности, проявляющихся в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел.

Широким набором сведений о функциональной и метаболической взаимосвязи лектинов и липидов мы пока не располагаем. Однако хорошо известно, что гидрофобные участки молекул лектинов и гидрофобные взаимодействия чрезвычайно важны для функционирования этих белков. То есть усиление гидрофобности посредством образования более или менее устойчивых ассоциатов лектинов с такими соединениями, как ЖК, образующиеся после гидролиза нейтральных липидов, может влиять на биосинтез и/ипи активность лектинов. Задача настоящей части работы • выявление изменений ЖК состава общих липидов и активности лектинов, происходящих по мере развития шиитаке.

Обнаружены изменения ЖК состава общих липидов мицелия 1. edodes на разных стадиях морфогенеза. На примере штамма F-249 показано, что по мере развития вегетативного мицелия происходит постепенное снижение не насыщенности (за счет С18:1 и С22:1 кислот, а также увеличение относительного содержания короткоцепочечных ЖК. На стадии образования плодовых тел отмечается заметное увеличение уровня ненасыщенных ЖК (в основном за счет С22:1 и С24:1) и исчезновение ЖК с короткими цепями. Резкие изменения относительного содержания короткоцепочечных ЖК могут быть связаны с температурой культивирования шиитаке (развитие белого мицелия происходило при 26°С, пигментация и образование МП при 4°С, развитие пподовых тел при 18°С). Ранее отмечалось, что у базидиальных грибов, выращенных при низких температурах, наблюдается укорачивание ацильных цепей ЖК липидов [Феофилова и др., 2000).

Достаточно высокая для базидиальных грибов концентрация пальмитиновой кислоты отличает L edodes от других ксилотрофов [Феофилова и др., 1998J. Появление пигментации мицелия и затем МП у L. edodes F-249 коррелирует с заметным (в 1.7 раза) увеличением уровня С16:0. У штамма NY высокая концентрация пальмитиновой кислоты (около 40% от суммы ЖК) отмечается на стадии белого мицелия, у 2Т - на стадии образования плодовых тел.

Значительное содержание линолевой кислоты (С18:2) отмечается как общая закономерность при изучении ЖК состава общих липидов грибов разных трофических групп. В нашем эксперименте у штамма F-249 каких-либо колебаний относительного содержания линолевой кислоты при переходе от белого мицелия к стадии МП. а затем к базидиомам, отмечено не было. Другая картина наблюдалась у í.. edodes NY: содержание С18:2 перед плодоношением в 3 раза превышало

соответствующую величину для плодовых ■ тел. При этом у штамма 2Т относительное содержание этой ЖК оставалось практически неизменным. Таким образом, изменения уровня л и нолевой кислоты в процессе морфогенеза изученных культур ебобез нельзя однозначно связать с типом плодоношения и с наличием стадии МП.

Появление ненасыщенных длинноцепочечных ЖК в базидиомах Р1еигоШз о$&еаШз и Адапсиэ Ызрогиз связывают с «Холодовым шоком», который является необходимым триггером образования плодовых тел [Феофилова и др., 2000]. В то же время отмечена корреляция между появлением МП на поверхности зрелого мицелия ебобез и началом плодообразования [Александрова и др., 1908]. С этих позиций объяснимо возрастание относительного содержания длинноцепочечных моноеновых ЖК в плодовом теле по сравнению с белым мицелием в случае плодоношения е<3ск}ез Р-249 на МП. Однако эта закономерность не прослеживалась при формировании неполноценных плодовых тел у штаммов 2Т и ЫУ. Плодообразование у этих штаммов сопровождалось резким увеличением концентрации ЖК с нечетным количеством атомов углерода, в том числе С17:0 у ЫУ и С15:0 у 2Т. Данный факт требует, на наш взгляд, дальнейшего изучения.

На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие МП, Лектиновая активность на стадии неполноценных плодовых тел остается относительно высокой, по величине ТГА соответствует примордиям при нормальном плодоношении и существенно превышает рассматриваемые показатели для зрелого плодового тела. В отличие от плодовых тел, развивающихся на МП, образование деформированных базидиом на белом мицелии не сопровождается увеличением степени ненасыщенности ЖК. Вместе с тем, их формирование коррелирует с увеличением процентного содержания ЖК с нечетным количеством атомов углерода; а также, вероятно, уменьшением активности реакций элонгации, что выразилось в снижении относительного содержания (штамм ЫУ) или полной редукции (штамм 2Т) длинноцепочечных ЖК. По-видимому, совокупность указанных характеристик могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе плодообразования. Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза.

В целом по результатам, описанным в разделе, посвященном участии? пектинов шиитаке в морфогенетических процессах, можно прийти к таким заключениям. Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных лектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам. Вероятно, пектины 1.епМпиз ебоёвв участвуют в процессе инициации плодообразования.

Лектины шиитаке при взаимодействии с экзогенными соединениями

Взаимодействие лектинов с органическими селен содержа щи ми веществами

Влияние селенсодержащих соединений на активность внеклеточных лектинов L. edodes

Литературные данные свидетельствуют о непосредственном активном участии микроэлемента селена в биохимических и физиологических процессах. Однако отмечается отсутствие достаточно обоснованных сведений о биохимических механизмах действия селена, особенно селенорганических соединений [Whanger, 2002]. Отсутствует какая-либо информация о взаимодействиях селенорганических веществ, рассматриваемых в нашей работе или им структурно подобных, - не только с пектинами, но и с белками вообще. В связи с вышесказанным нами была поставлена задача изучения активности внеклеточных лектинов L edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с некоторыми соединениями Se. Получение данных по влиянию селеноорганического вещества ДАФС-25, представителя ряда 1,5-ди(4-Н-фенил)-3-селенпентандионов-1.5, на пектиновую активность культуры (см, раздел выше) позволило нам перейти к следующему шагу работы, уже с препаратами внеклеточных лектинов культуры.

В ходе экспериментальных и теоретических исследований, описанных в настоящем разделе, помимо препарата ДАФС-25, рассмотрены и другие органические соединения селена (табл. 2).

Таблица 2. Селенсодержашие соединения, рассмотренные в настоящей работе

Номер Название R

I ],5-Дифенил-3-селенпентанднон-1,5 Н

11 1,5-Д и (4 - м его кси фен и л) -3-сел et i п ен тан ди о н -1,5 оси,

III 1,5-Д и (4-это kci i фе н и л )-3-се л е ¡ ш е нтан д и о н - ] ,5 OCMU

IV 1,5-Ди(4-«-октнлокснфенил)-3-селенпентандион-1,5 h-OCkF!|7

На основании экспериментов с ДАФС-25 предполагались интересные результаты определения изучаемой биологической активности в реакционных смесях с выделенными из КЖ и очищенными пектинами. При этом можно ожидать, что структура селенсодержащего компонента реакционных смесей, как и его концентрация, окажут значительное влияние на лектиновую активность препарата белка, и что активность продуктов взаимодействия лектина с селенорганическим соединением будет различной в зависимости и от стадии очистки белка после его первоначального выделения из синтетической среды выращивания гриба. Все вышесказанное привело нас к выбору соединений - производных изученного нами ранее 1,5-дифенил-3-селенпентандиона-1,5 (табл. 2) и препаратов двух лектинов (L1 и L2) на трех основных стадиях очистки каждого белка, описанных в соответствующем разделе. В результате "белковых объектов' получили шесть, условно обозначив их для целей настоящей работы следующим образом: в последовательности увеличения степени чистоты препарата бепка 1, 3, 5 соответствовали ¿1, а 2,4, 6 - пектину ¿2.

В качестве растворителя для соединений ряда 1,5-ди(4-Н-фенил)-3-селенлентандионов-1,5 выбрали смешанный растворитель ДМСО : НгО (4:1, v/v). Растворы селенорганических соединений I, III, IV в ДМСО использовали в таких максимальных концентрациях (С1), при которых собственная ГА активность ни ДМСО, ни I, III, IV не проявлялась; это также дополнительно контролировалось реакцией гемагглютинации I, III, IV в выбранных концентрациях С1, С2, СЗ. Минимальная из

трех величина СЗ равна концентрации соединения I (ДАФС-25) в наших более ранних исследованиях лектиновой активности КЖ, а С2 занимала промежуточное положение.

Изменение характеристик взаимодействия пектинов с сел енор г? и и чески ми соединениями в зависимости от стадии очистки препарата пектина Стадия очистки препарата пектина оказывает наибольшее (если сравнивать с такими характеристиками, как концентрация I, III, IV) влияние на дифференциальный характер взаимодействия внеклеточных пектинов с селеноорганичесхими соединениями.

Так, е случае вещества I при одной и той же концентрации С1 селенсодержащего соединения титр гемагглютинации меняется от 64 до 1024, возрастая по мере степени чистоты препарата лектина L2, и почти так же резко снижается (от 1024 до 128 при СЗ) по мере очистки i.1. Препарат ДАФС-25, таким образом, в гораздо большей степени повышает лектиновую активность очищенного L2, чем i_1, однако для этого требуются относительно высокие концентрации селенового соединения (50 мг/л Se).

Заметно выражено "сродство* препарата 1 (неочищенного i.1) к соединению III, причем и при самой высокой, и при самой низкой концентрации указанного соединения титр гемагглютинации очень высок (512 и 2048 соответственно). Однако по мере очистки лектина 1 титр ГА в присутствии тех же концентраций этокси-про изводи о го (вещество III) становится равным 64. Наоборот, очищенный препарат лектина 2 значительно повышает свою ГА активность при взаимодействии с III (до величины ТГА, равной 512 - заметим, до того же значения, что и неочищенный L1). И снова для этого требуются высокие концентрации (С1) селенового производного III. Самая низкая концентрация и ДАФС-25 (как только что говорилось), и вещества 111 нисколько не эффективны в отношении стимулирования лектиновой активности очищенного L2: титры ГА 16 и 8 соответственно по сравнению с величиной 32 в отсутствие селенорганических соединений. Не оказывает ингибирующего действия только вещество IV: титр ГА минимум 32, достигает 512 для обоих лектинов после первой стадии очистки. В то же время для IV менее всего из селенорганических соединений выражена зависимость его влияния на лектиновую активность от стадии очистки препарата. Это вещество достаточно индифферентно в отношении наличия примесей в препаратах лектинов 1—6, зато наблюдается оптимальная в обсуждаемом аспекте концентрация IV, когда титр ГА равен 512 независимо от степени чистоты лектинов (рис. 4),

Рис. 4. Зависимость лектиновой активности от стадии очистки препаратов лектинов при концентрации селенорганических соединений С2 = 6.33 1СГ5 моль/л (5 мг/л Se). 1,3,5-М; 2, 4, 6 — L2 на трех стадиях очистки

Подобная неспецифичность взаимодействия н-октилокси-производного (вещество IV) с лектинами при наличии явно выраженной концентрационной зависимости реактанта привели нас к мысли о каком-то едином химизме этих процессов, возможно, гидрофобных взаимодействиях с октильным радикалом.

Изменение характеристик взаимодействия пектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от концентрации селене од ержащих соединений

Зависимость лектиновой активности обоих исследуемых белков на всех трех стадиях их очистки от концентрации селенорганического соединений проходит через максимум лишь в единственном случае соединения IV (рис. 5). Признать возможность ■ мицеллообразования в реакционной среде в данном случае вряд ли правомерно, поскольку после достижения критической концентрации мицеллообразования, ККМ, эффективность взаимодействия, отражаемая параметром ТГА в нашем эксперименте, ! должна оставаться на постоянном уровне при увеличении концентрации IV, Мы этого не наблюдаем, но тем не менее считаем очень вероятным, что вещество IV, содержащее н-октильный заместитель, более способно к мицеллообразованию по сравнению с I или til. Необходимы специальные исследования с определением ККМ. Наиболее очевиден тот факт, что явная гидрофобность соединения IV по сравнению с остальными изученными селеновыми веществами вносит существенный вклад во взаимодействие с лектинами L edodes. Соединение IV положительно влияет на активность пектинов и Í.1, и Í.2, этот аспект мы обсуждаем также в следующем разделе.

Рис, 5. Зависимость лектиновоЛ активности препаратов лектпнов (1,3,5-¿1; 2,4,б—¿2 на трех стадиях очистки) от концентрат»] в-ва IV; Cl=6.33 I0"4 моль/л (50 мг/л Se) С2 = 6.33 I О*5 моль/л (5 мг/л Se) СЗ=б.ЗЗ 10** моль/л (0.5 мг/л Se)

Квантовохимические и QSAR свойства сепенсодержащих соединений ряда 1.5-ди(4-Й-<Ьенил1-3-селенггентандионое-1.5

Электронное и пространственное строение изучаемых селенорганических соединений, их QSAR свойства могут служить предпосылкой наблюдаемого нами химического поведения этих соединений в процессах их взаимодействия с лектинами L. edodes. По данным расчетов на уровне теории B3LYP/6-31G(d,p), позволивших судить о некоторых пространственных параметрах и зарядах на атомах молекул селенсодержащих соединений, электронные и топологические характеристики молекул I-III очень близки между собой. Следовательно, различие во влиянии веществ на ГА способность определяется не остовом молекул (включающим атом Se и фрагмент СНгСОАг), а заместителем в положении 4 ароматического кольца (Н, ОСНэ, ОСгНз и н-ОСаН)7 в случае соединений I. II, Ш и IV соответственно). При этом положительный заряд на атоме селена свидетельствует о том, что в процессах, в

g 600 - 1500 X л> £ 400 ' ас Л 2 зоо - 0 1 200 ■ 100 в foil Н ios1 1«!

С1 C2 СЭ

которых селен проявляет себя как антиоксидант, он является электрофильным центром и может взаимодействовать с электроноизбыточными частицами, например молекулами кислорода Ог, перо кем да водорода Н^Ог, супероксидным анион-радикалом Ог'", тиолами RSH и др. [Blessing ei а/., 2004, Jacob ei al,, 1999]. Примечательная особенность селена состоит в его способности окислять тиолы в восстанавливающих условиях [Turan et at., 1997; Ganther, 1999; Jacob et at., 2003; Blessing et al., 2004].

Ha окислении тиолов следует остановиться особо. К числу общих свойств лектинов относится в том числе стабилизация углеводсвязывающих участков дисульфидными мостиками. То есть дополнительное образование -S-S- в молекулах исследуемых лектинов вполне может способствовать усилению способности последних к взаимодействию с углеводными структурами эритроцитов, иными словами - увеличению титров ГА.

Для выявления других возможных факторов, влияющих на химическое поведение селенорганических соединений при взаимодействии с пектинами, нами рассчитаны QSAR-свойства [Hasel et al., 1988; Still et at., 1990; Bodor ef at., 1989; Gavezotti, 1983; Ghose and Grippen, 1986,1987; Viswanadhan et al., 1989; Miller, 1990; Ghos eetal., 1988] молекул 1-tV.

Возможно, различие в реакционной способности селенсодержащих молекул в некоторой степени связано с их дифференциальной гидрофобностью.

Из общих свойств лектинов разного происхождения следует, что углеводы взаимодействуют с пектинами посредством водородных связей, координирования металлов, ван-дер-ваальсовых, гидрофобных взаимодействий [Elagavish and Shaanan, 1997]. Несмотря на преобладающе гидрофильный характер углеводов, гидрофобные взаимодействия играют важную роль в их распознавании пектинами. Особенно примечательно взаимодействие между ароматическими фрагментами аминокислот и галактозой в углеводсвязывающих участках гапактозоспецифических лектинов, что приписывается взаимодействию между частично заряженными алифатическими протонами на поверхности кольца гексозы и частичным отрицательным зарядом тт-злектронов ароматической системы [Elagavish and Shaanan, 1997], Отметим, что L1 и ¿2 галактозоспецифичны.

Участки гидрофобного связывания вообще очень характерны для лектинов. К ним относят и липидсвязывающие участки, хорошо изученные в случае бактериальных лектинов (адгезинов и токсинов) [Лахтин, 1989]. На примере некоторых бактериальных и вирусных лектинов показано, что липидсвязывающие участки характеризуются выраженными гидрофобными свойствами. Кроме того, можно предположить и особую роль ароматического кольца в структуре исследованных нами селенорганических соединений; наличие этого кольца могло бы оказать дополнительный положительный эффект в отношении углеводсвязывающих свойств лектинов L. edodes. Так, на примере лектинов бобовых показано, что гидрофобные пептиды в составе гидрофобной полости на поверхности лектиновых молекул участвуют во взаимодействии с фенильными и метильными производными сахаридов, поскольку такие пептиды располагаются в непосредственной близости от углеводсвязывающих участков [Лахтин, 1994; Луцик и др.. 1981].

Если согласно [Лахтин, 1994; Луцик и др,. 1981] принять ключевую роль ароматических фрагментов молекул 1-IV в связывании с пектинами, то ясно, что остальная часть молекулы по-разному, из очевидных пространственных соображений, влияет на "арил-пектиновое" взаимодействие с результирующим разным титром гемагглютинации реакционной смеси. Вероятно, значительное увеличение длины углеводородной цепи в н-окти л производном (IV) может отчасти экранировать участвующий во взаимодействии с гл и кокон ъю га та ми эритроцитов

арильный участок молекулы IV. Этому способствует гидрофобное взаимодействие, стремящееся уменьшить поверхность контакта между гидрофобной частью молекулы (ароматическим фрагментом и углеводородной цепью) и водой. При этом алкильная цепь может стерически экранировать ароматическое кольцо, препятствуя тем самым взаимодействию с лектином.

Сравнительный анализ реакционной способности

¿-циствина и ¿-мегионина: некоторые теоретически»

предпосылки замещения атома серы на селен

Oys и Met - единственные аминокислоты в белках, которые претерпевают обратимое окисление/восстановпение в биологических условиях. Окисление се русоде ржа щи х боковых цепей Oys и Met кислородными агентами может приводить к окислительным состояниям серы, не способным восстанавливаться в биологических условиях. То есть нужны такие механизмы окисления, которые защищают против переокисления эти кислотные остатки и предотвращают необратимую потерю активности белка. В работе [Jones et af., 2004J показано, что редокс-потенциал стационарного состояния цистеин/цистиновой пары позволяет обепечить мягкое окисление белков без прямого участия более сильных окислителей.

С биохимической точки зрения Se замещает S в определенных цистеиновых фрагментах селенопротеинов. Он отличается от серы редокс-потенциалами и стабильностью в разных степенях окисления, что приводит к множественным каталитическим процессам с его участием [Jacob etat., 1999; Blessing etat., 2004].

Анализ литературы позволяет прийти к выводу, что наиболее вероятный химизм взаимодействия соединений Se с белками (в том числе пектинами) состоит в образовании связей разной прочности с серусодержащими аминокислотами пектинов, вплоть до, возможно, полного замещения серы на селен. Оба лектина Ы и L2 имеют в своем составе заметные количества серусодержащих аминокислот, цистеина и метионина. Представляет интерес рассмотреть эту проблему химизма более подробно, проведя сравнительный анализ реакционной способности L-Cys и ¿.-Met и обсудив некоторые теоретические предпосылки замещения атома серы на селен. Задача сравнительного исследования Met и Cys интересна и в следующем аспекте.

В живых организмах селен обнаружен в составе нескольких индивидуальных соединений, но одной из основных форм существования органического селена в растительных и грибных тканях является селенометионин (SeMet) [Whanger, 2002J. Так, SeMet - преобладающее селенсодержащее соединение обогащенных селеном дрожжей: при стандартизированных условиях выращивания дрожжевых культур около 85% селена содержится в них в виде SeMet [lp et а/., 2000]. Культура пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae способна ассимилировать до 3 мг/г биомассы So [Demtrci, 1999J, при этом более 90% общего Se находится в форме SeMet, а селеноцистеина (SeCys) лишь 0.5% [Schrauzer, 1998; Schrauzer, 2000]. Та же картина наблюдается у высших съедобных грибов • культивируемых базидиомицетов, в том числе наиболее интересующего нас объекта исследований L. edodes. Судя по резупьтатам работ [Yoshida et а}., 2005; Ogra et ai, 2004], в культуре шиитаке. выращенной на обогащенном селенитом натрия субстрате, основное соединение - SeMet, связанный с белком.

Таким образом, налицо явное "предпочтение" грибными культурами разных систематических групп именно органической формы селена в виде SeMet. Задача, поставленная в данном разделе работы • сравнительное квантовохимическое исследование электронного строения молекул и реакционной способности двух

серу содержащих эссенциальных аминокислот - L-Cys и L-Met на начальном этапе взаимодействия с электрофильными реагентами для выяснения предпосылок замещения атома серы на селен именно в молекуле ¿-Met. Результативным оказался следующий подход:

¡) использовали выявленные нами электрофильные свойства атома селена в селенорганических соединениях 1-IV как исходное положение, позволяющее предположить возможность "облегченной" димеризации аминокислот в составе белковой молекулы лектина L. edodes, Это привело к постановке задачи по теоретическому рассмотрению влияния селенсодержащих соединений на формирование дополнительных дисульфидных связей в молекуле лектина. Тиольная группа аминокислоты служит реакционным центром биохимически важных процессов - окислительной димеризации с формированием дисульфидных мостиков [Jacob ei al., 1999,2004; Giles et a!., 2003b; Jones ef ah, 2004), замещения атома серы на селен [Moroder, 2005] и др. Указанные процессы важны для проявления биологической активности определенных классов белков, в том числе лектинов. Как отмечалось в разделе 3.5.1-4, к числу общих свойств углеводсвязывающих белков относится стабилизация сайтов связывания углеводов дисульфидными мостиками;

н) под влиянием селенсодержащих соединений происходит процесс не только димеризации серусодержащих аминокислот с формированием дополнительных дисульфидных мостиков в белковой молекуле, но и образования селенсодержащих аналогов, SeCys и SeMet, известны и смешанные аналоги. Однако подобные модификации аминокислот, судя по данным литературы, выражены в различной степени у Cys и Met. Для выявления некоторых возможных причин этого мы поставили задачу теоретического рассмотрения полной замены серы на селен с образованием селензамещенных аминокислот. В целом результаты настоящей части работы (электронное строение, поляризуемость, дипольные моменты, липофильность) косвенно подтверждают большую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах усвоения последнего по сравнению с Cys.

Положительное влияние изученных селенорганических соединений на активность внеклеточных лектинов необходимо рассматривать в совокупности с таким аспектом, как функционирование системы антиоксидантной защиты (АОЗ) грибов. Об антиоксидантных свойствах селеновых соединений в связи с их влиянием на активность лектинов упоминалось выше (раздел 3.5.1.4). Влияние цистеиновых фрагментов белковой молекулы на биологическую активность и, в частности, на белок-углеводные взаимодействия, предполагающее возможность обратимого окисления-восстановления цистеина в биологических условиях, требует благоприятствующих условий химического окружения и состояния тиольной группы. Вероятно, первоначальный акт взаимодействия в системе "соединение селена - «аминокислота", включающий взаимную ориентацию молекул ре актантов и образование межмолекулярных водородных связей, служит предпосылкой того, что тиольная группа оказывается способной принимать участие в последующих стадиях (включающих более глубокие химические превращения) биологически значимых реакций.

Увеличение внутриклеточного уровня активных форм кислорода сопряжено с гмпероксидзнтным состоянием клетки, предшествующим процессу клеточной цитодифференцировки [напр., Гесслер и др., 2006]. Неизбежно возникающие в клетке под действием внутренних и внешних факторов активные формы кислорода с одной стороны являются сигнальными молекулами, запускающими механизмы дифференцировки, а с другой стороны они создают необходимость присутствия в клетке системы АОЗ. Защита биологических молекул осуществляется не только ферментами, но и низкомолекулярными соединениями различной химической

природы, вступающими в реакцию с активными формами кислорода. Существенную роль в защите клетки от окислительного стресса играют тиоловые соединения. Накапливаются данные о том, что многие тиолсодержащие белки, локализованные на клеточной поверхности и в экстраклеточной жидкости, могут подвергаться редокс-п ре в ращениям, откликаясь на изменение редокс-статуса клеточного окружения [Октябрьский и Смирнова, 2007].

Поддержание SH-групп в восстановленном состоянии и образование дисульфидных мостиков в молекуле белка - противоположно направленные реакции при взаимодействии препаратов внеклеточных пектинов с изученными селеноорганическими соединениями. Здесь играет роль соотношение процессов: с одной стороны - стабилизации структуры лектиновых молекул (S=S мостиками), активность которых при этом возрастает (в практическом плане это важно, как нами показано в разделе 3.4, на репродуктивных стадиях развития грибной культуры, особенно в коричневой мицелиальной пленке). С другой стороны - увеличение числа восстановленных* тиоловых групп под влиянием антиоксидантных свойств соединений селена способно поддержать АОЗ, важную при окислительном стрессе, сопровождающем смену фаз развития мицелия [напр., Белозерская и Гесслер, 2006].

Ввиду такой неоднородности влияния селенсодержащих веществ неудивительно, что степень проявления эффекта изученных селенорганических соединений на активность лектинов L edodes различна и зависит не только от природы селенового производного, но и от его концентрации, от содержания примесей в препаратах лектинов (т.е. от стадии их очистки). Тонкий баланс между окислительными и восстановительными молекулами, поддержание экстр а клеточного тиоп-дисульфидного статуса является важным инструментом регуляции биологической активности, передачи клеточных сигналов, дифференциации [цшп. по Октябрьский и Смирнова, 2007].

Взаимодействие лектинов с катионами меди (И)

Хотя медь и является необходимым элементом питания (см. обзор питературы в диссертации), она вызывает окислитепьный стресс в результате образования свободных радикалов в реакциях Габера-Вайса и Фентона [HalliweII and Gutteridge, 1984; Деви и Прасад, 2005]. В условиях индуцированного металлом окислительного стресса время жизни образовавшихся активных форм кислорода и их токсическое действие контролируются системой актиоксидантной защиты клетки, т.е. соответствующими метаболитами [Mazhoudi et ai., 1997; Noctor and Foyer, 1998].

В заключение предыдущего раздепа мы уже говорили об известном явлении взаимозависимости окислительного стресса, цитодифференцировки и перехода к репродуктивной стадии развития грибного мицелия, необходимости при этом усиления АОЗ и предполагаемой нами вовлеченности в эти процессы лектинов в связи с их взаимодействием с селенорганическими соединениями. Последние проявляют себя как антиоксиданты и, по всей видимости, при участии лектинов L. edodes могли бы усиливать АОЗ. Интересно выявить результаты взаимодействия лектинов с эффектором противоположного свойства, то есть способствующим углублению окислительного стресса и активизации тех вторичных метаболитов гриба (мы полагаем, и лектинов; см. раздел 3.4 диссертации), которые принимают участие в развитии последствий этого стресса, в конечном итоге в формировании признаков генеративной стадии развития мицелия. Еще раз в ином аспекте подойти к рассмотрению описанной проблемы помогает, на наш взгляд, изучение взаимодействия меди (II) с пектинами шиитаке.

В ряду катионов, представленных выше как последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта катионов металлов(И) на активность внеклеточных пектинов шиитаке (Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>Ni) нас прежде всего заинтересовала медь(И), Было обнаружено, что лишь в случае меди имеет место зависимость "лектиновая активность-концентрация катиона*, противоположная наблюдаемой для других металлов в настоящей работе: наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди. Можно сформулировать несколько предположений о причинах и последствиях подобного эффекта меди(Н):

- добавки ионов меди приводят к усилению биосинтеза внеклеточных лектинов L edades, при этом в неодинаковой степени для L1 и Í.2. Возможно также, что в присутствии Си'* имеет место накопление внеклеточных неактивных по гемагглютинации лектинов (например, связанных с металлом в комплекс или неактивных из-за токсического действия металла на грибную культуру). В этом случае удельная лектиновая активность (титр ГА/белок) не должна возрастать, она сохраняется или даже снижается из-за увеличения массы белка;

- значительно повышается активность экстрацеллюлярных лектинов, а прирост белковой массы "отстает* • происходит в гораздо меньшей степени. Тогда удельная лектиновая активность заметно возрастает. Сопровождаться такой эффект мог бы активным взаимодействием Cu(ll) с внеклеточными лектинами в культуральной жидкости L edades. Если бы к тому же катионы меди проявляли "предпочтение" в отношении одного из лектинов, продукция и/или увеличение активности которого стимулируется ионами меди, • это могло бы способствовать дифференциации белков КЖ и иметь положительные последствия для процесса предварительного разделения компонентов КЖ с целью дальнейшей очистки лектинов. Ниже приводим экспериментальное подтверждение своих предположений.

Более подробное исследование в динамике внеклеточной пектиновой активности шиитаке при выращивании на синтетических средах с разными концентрациями Сц£* (в интервале концентраций катиона от 2Ю"4 до 1*10' моль/л) проводили, определяя удельную пектиновую активность, достигаемую в КЖ при используемых концентрациях компонентов среды. Наилучший результат получался при концентрации ионов меди (II) в синтетической среде культивирования L. edodes - 1 мМ, D-глюкозы - 300 мМ по углероду. L-аспарагина - 20 мМ по азоту. При возрасте глубинной культуры 14 сут достигалось более чем 8-кратное увеличение удельной лектиновой активности при указанной концентрации Сиг+ по сравнению с более низкими концентрациями меди из приведенного выше интервала значений. Оптимальная концентрация ионов Cu (И) в среде культивирования £,. edodes составляет Г10"3 моль/л, при этом удельная лектиновая активность на 14-е сут культивирования более чем в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте.

Далее мы подтвердили, что ион меди образует с лектинами комплексы, отличающиеся по хроматографическим свойствам. К питательной среде (состоящей из Glc (5*10"г М) и Asn (140 М), характеризующейся по нашим данным высокой активностью внеклеточных лектинов L edodes, был добавлен CuSCVSHaO до концентрации 10~2 - 10~4 М. Далее спустя 14 сут выращивания грибной культуры получали фильтрат КЖ и проводили осаждение ацетоном. Более полно произошло осаедение (осадка получилось больше), была обнаружена третья фаза примесных соединений меди, нерастворимая в смесях вода • ацетон. Гель-хроматограммы реакционных смесей были получены для разных концентраций Сиг\ возрастающих от 2Ю"4 М до 1'10"а М, Степень осаждения искомого белка оказалась значительно увеличенной (судя по поглощению при 280 нм, в 7,5 раз по сравнению с контролем в случае ПО2 МСиг+).

Продукты разделения (на Sephadex G-25) фильтрата КЖ L. edodes (выращенного в присутствии сульфата меди указанных выше концентраций), осажденного ацетоном и растворенного в воде, анализировали методом электронной абсорбционнойслектросколии.

Меняется интенсивность и положение полосы 270 нм - ароматическое кольцо, находящееся в сопряжении (В-полоса). При переходе к концентрации Cu(ll) от 0 к 140 М происходит возрастание интенсивности этой полосы. Вероятно, это обусловлено увеличением количества пектина при концентрации Cu(ll) до 2*10"э М. Смещение перегиба на кривой поглощения из области 270 нм в область 230 нм, имеющее место при дальнейшем повышении концентрации меди, слишком велико для неспецифических сольватохромных эффектов. Скорее всего, 230 нм - это уже не В-, а К-полоса ароматического кольца, то есть некие гетероатомы (N, О, S), неподеленные электронные пары которых находились в сопряжении с тт-системами ароматических колец, координируются с медью и тем самым выключаются из цепи сопряжения. Происходит химическое взаимодействие, вероятно, комплексообразование с медью. Поэтому предположительно при увеличении концентрации меди до 5 Ю"3 М возрастает количество комплекса меди с пектином. Наконец, концентрация меди(М) 1Ю'г М оказывается достаточно высокой для связывания значительного количества лектина, что приводит к скачкообразному увеличению содержания указанного комплекса. Полученные данные подтверждают приведенную выше информацию о том, что оптимальна в отношении удельной лектиновой активности именно миллимолярная концентрация Сиг+, стимулирующая, очевидно, биосинтез лектина без потери его гемагглютинирующих свойств. Избыточная медь(И) (выше 510'3 М) препятствует проявлению лектином этих свойств.

Проведенные эксперименты наводят на мысль, что взаимодействие иона меди (II) с лектинами действительно привело к дифференциации их хроматографических характеристик. Одновременно с параметрами разделения белков при использовании катионов меди в качестве добавки к синтетической питательной среде, изменяется и продукция грибной культурой одного из лектиков (¿2), но из-за связывания лектиное медью(Н) с увеличением ее концентрации удельная лектиновая активность (титр/белок) проходит через максимум.

Образование хелатов металла с внеклеточными соединениями, часто неидентифицированными, исследователи связывают с адаптацией микроорганизмов к высоким концентрациям металла. Причем предполагается, что клетки выделяют хелатирующие агенты именно при длительном культивировании в присутствии металла, когда последний добавлен в период лаг-фазы [Налимова и др., 2005]. Насколько дифференцировано взаимодействие L1 и L2 с Сиг\ насколько превалирует усиление биосинтеза одного из пектинов (Í.2, судя по гель-хроматографическим характеристикам)? Как меняется их массовое соотношение с изменением концентрации соли меди в питательной среде? В пределах возможностей метода ответить на эти вопросы помогло нам осуществление рентгенофазового анализа экзолектинов L. edodes. Был проанализирован ряд образцов; порядок перечисления отвечает последовательности стадий выделения и очистки. Образцы 1,2, 3,4, 5. 6 получены осаждением ацетоном из фильтрата КЖ. В образце 1 не было медиф), в образцы 2, 3, 4, 5, б в питательную среду добавлялось 5" 10"*, 11 О*3, 210"3, 510 , 1Ю~* моль/л Сцг\ Образец L1+L2 - промежуточная стадия разделения белков 11 и L2, когда оба они присутствуют в смеси.

Рентгенограммы образцов 1,2,3, 4, 5, 6, 7, £.1+L2 содержат две группы пиков. Интенсивность пиков первой группы уменьшается от образца 1 к образцу 6, а интенсивность пиков второй возрастает. Первая группа пиков соответствует пектину Í.1, а вторая - L2. Полученные данные иллюстрирует табл. 3.

Таблица З.Соотношення (Ст/С|) концентраций лектинов ¿1 и L2

Образец [ 1 2 3 4

Отношение 1.00 1.65 2.27 5.18

Образец 5 б ¿1+L2

Отношение 18.4 14.8 1.33

Корректность развитого подхода подтверждается результатами независимого гель-хроматографического исследования со спектрофотометрическим детектированием.

Для образцов L1, L2 ликов, аналогичных остальным образцам, не получено, из чего следует, что лектины L1 и L2 взаимодействуют друг с другом. Отсутствуют также пики, соответствующие свободным углеводам (использованным в качестве стандартных веществ). Таким образом, Glc входит в состав кристаллических форм гликопротеинов.

Следовательно, в данном разделе показано, что:

- Ион меди (II) избирательно взаимодействует с одним из двух внеклеточных лектинов L edodes. В результате двух возможных процессов - усиления биосинтеза лектинов в присутствии меди (II) и/или участия меди (II) в дифференциации белков КЖ на стадии получения ацетонового осадка белковой природы - в отделенной осаждением части КЖ значительно увеличивается количество только одного (L2) из лектинов,

- Оптимальная концентрация ионов меди (II) в синтетической среде культивирования L. edodes составляет 1'10'э моль/л, при этом удельная лектиновая активность в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте, а количество не растворимого в ацетоне примесного осадка соединений меди достаточно мало. Более низкие концентрации меди малодейственны, а более высокие характеризуются значительным количеством указанного осадка.

- Предложена и реализована, на примере экзолектинов L. edodes, методология расчета отношения концентраций веществ в образце по данным рентгенофазового анализа с точностью до постоянной величины.

- На основании предложенного подхода можно судить о взаимодействии двух экзолектинов L. edodes между собой, а также о полноте разделения этих белков на разных стадиях их очистки.

Взаимодействие экзолектинов шиитаке с фитогормоном ИУК

Некоторые доказательства участия фитогормона ИУК в процессах морфогенетической дифференциации грибов рода Leníínus, полученные в ходе простых экспериментов, существуют достаточно давно, хотя и описаны в единичных работах [Rypacek and Sladky, 1972, 1973]. Результаты этих исследований подтвердили предположение, высказанное в еще более ранней публикации, посвященной изучению дрожжей [Kamisaka el al, 1967], о том, что гормонально контролируемый механизм регуляции роста имеет много общих особенностей у грибов и высших растений.

Известно, что не только растения и бактерии, но и некоторые микром и цеты (Pisolithus tinclorius и Paxillus invotutus) способны образовывать связанные формы ИУК [Цавкелова и др., 2006]. ИУК связывается с сахарами, аминокислотами и белками, образуя запасные (неактивные) формы, из которых фитогормон при необходимости высвобождается и восстанавливает свою физиопогическую

активность [Дерфлинг, 1985]. Имеющейся к настоящему времени информации об ИУК в культуре базидиомицетов посвящен раздел обзора литературы 1.3.3.

На примере Lentinus tigrinus исследователями Rypacek и Sladky еще в 19721973 гг, доказано предположение о том, что в дифференциации грибной культуры важное место принадлежит фитогормонам, и что процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том числе ауксина ИУК. О взаимодействии ИУК с лектинами базидиомицетов сведения в литературе отсутствуют. Для нас представляло интерес выяснить возможность взаимодействия in vitro внеклеточных пектинов и фитогормона, объединить которые можно по признаку участия в морфогенетических процессах грибной культуры.

Для изучения взаимодействия "пектин-И У 1С использовали образцы пектинов и растворы ИУК в концентрациях 0,001; 0,01 и 0,1 г/л. Препараты двух внеклеточных лектинов (L1 и L2) L. edades исследовали на трех основных стадиях очистки каждого белка. В резупьтате "белковых объектов" - компонентов реакционных смесей получили шесть, условно обозначив их для целей настоящей работы следующим образом; в последовательности увеличения степени чистоты препарата белка 1, 3, б соответствовали ¿Л, а 2. 4, 6 — пектину L2. Растворы исходных белковых компонентов (лектины 1-6) предполагаемых реакционных смесей готовили так, чтобы они характеризовались по возможности практически одинаковой лектиновой активностью. В качестве растворителя для ИУК выбрали этанол : НгО (1:1, v/v). При любой использованной (и даже более высокой) концентрации спиртового раствора ИУК собственная ГАА отсутствовала.

Полученные данные демонстрируют увеличение лектиновой активности в 864 раза в системе "лектин-ИУК" по сравнению с исходными белковыми растворами. Не просматривается явной зависимости результатов взаимодействия ни от концентрации ИУК, ни от степени чистоты препарата лектина. Ясно только, что по мере очистки лектинов титр ГА не снижается (или возрастает). Что касается концентрации ИУК, то оптимальной (по параметру ГАА продуктов взаимодействия ее с лектинами) следует считать 0,01 г/л: для образцов лектинов 1 - 4 и 6 титр ГА в 2-4 раза выше при этой концентрации. Образец 5 (напомним, это очищенный L1) образует продукт взаимодействия с ИУК, характеризующийся титром ГА 1024 независимо от концентрации фитогормона.

Эти результаты наводят на мысль о коцентрационно-насыщаемом взаимодействии в системе "лектин-ИУК", приводящем к образованию химически однородных для двух лектинов продуктов взаимодействия. Для дополнительной характеристики указанных систем мы использовали спектрофотометрический метод анализа. Продукты взаимодействия препаратов лектинов и ИУК анализировали методом электронной абсорбционной спектроскопии.

Различия спектров практически не проявпяются при разной степени очистки лектина 1. Кривые для лектина 2 в зависимости от стадии его очистки отличались только по интенсивности поглощения и геометрически могли бы быть получены одна из другой параплелъным смещением вдоль оси ординат. Оказалось, что комплекс (L1 + ИУК) характеризуется тем же набором максимумов поглощения (200, 220 и 280 нм). однако при ином соотношении ин теней в ноете й.

Меняется интенсивность полосы 280 нм. Она снижается почти в 2 раза при переходе от начальной к конечной стадии очистки лектина 2. При одинаковом, в пределах погрешности измерений, исходном титре ГА это может означать стимулирующее влияние примесных к L2 соединений на процесс взаимодействия лектина с фитогормоном. Вероятно, подобный эффект правомерно назвать положительным каталитическим, поскольку качественные характеристики спектра поглощения сохраняются, и лишь снижается количество продуктов взаимодействия

*ИУК-1.2° при удалении примесных соединений. Максимум 220 нм - это, скорее всего, К-полоса ароматического кольца, то есть гетероатомы (N, О, S). азот ИУК, нелодепенные электронные пары которых находились в сопряжении с тт-системами ароматических колец, координируются с лектинами и тем самым выключаются из цепи сопряжения. Происходит химическое взаимодействие, вероятно, комплексообразевание с лектинами.

Итак, внеклеточные лектины L edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8 - 64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "лектин-ИУК*. Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу.

ВЫВОДЫ

1. В культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета Leniinus edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

2. Культура L edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по составу и физико-химическим свойствам. Внеклеточный лектин L\ из L. edodes — гликопротеин с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 43 «Да. L1 имеет в своем составе (10,5 ± 1,0) % (т/т) углеводов, представленных глюкозой. Внеклеточный лектин L2 - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 кДа. L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0) % (т/т) углеводов, представленных глюкозой (73% (т/т) углеводной части молекулы лектина) и галактозой (27% (т/т) углеводной части молекулы лектина). В L2 высоко содержание Asn: 42% (т/т) от суммы аминокислот. Этот факт наряду с составом углеводной части молекулы (Glc+Gal) позволяет отнести L2 к N-аспарагинсвязанным белкам.

3. Два лектина L1 и L2 различаются по углеводной специфичности. Оба белка специфичны к D-галактозе и D-лактозе при одинаковой для L1 и L2 минимальной ингибирующей концентрации этих углеводов (2,08 мМ Gal; 8,33 мМ Lac). Другие углеводы, к которым лектины проявляют более или менее высокое сродство: для L1 это Rha (4,16 мМ); для L2 - Ara (4,16 мМ) и МапОН (8,33 мМ).

4. Два лектина ¿1 и L2 различаются по антигенным свойствам, имея при этом общие антигенные детерминанты. Очищенные внеклеточные лектины L edodes высоко избирательны при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизированных эритроцитов кролика, не реагируя с эритроцитами других животных и человека.

5. Установлено, что активность и динамика образования лектинов L. edodes зависят от условий культивирования, а именно: температуры, количества посевного мицелия, возраста культуры, а также от состава среды глубинного культивирования: соотношения количеств углерода и азота, природы компонентов - источников углерода и азота, кислотности среды. Оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной пектиновой активности шиитаке включает в качестве источника углерода L-Ara или D-Glc, источника азота - L-Asn.

6. Одним из значимых факторов, влияющих на лектиновую активность глубинной культуры L edodes, является присутствие в среде культивирования катионов металлов(Н). В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей лектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона Мг', но и источник углеродного питания грибной культуры. Полученные данные для металлов, образующих эти катионы, позволяют составить следующий ряд в порядке уменьшения положительного эффекта на активность

внеклеточных пектинов шиитаке: Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>N¡. Влияние двухзарядных катионов металлов триады железа на активность внеклеточных пектинов L edades изменяется симбатно с энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным бидентатным л и га н дом зтиленгликолем.

7. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью пектинов L edodes.

8. Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных пектинов шишаке с формированием коричневой мицелиальной пленки е глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия — липидам и углеводам, что может свидетельствовать об участии лектинов L edodes в морфогенегических процессах и инициации плодообразования.

9. Изменения активности внеклеточных лектинов L. edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с соединениями - представителями ряда 1,5-ди(4-Я-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 в зависимости от структуры селенсодержащего компонента реакционных смесей, его концентрации, от стадии очистки белков, позволяют выявить влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий в химических процессах с участием лектинов. При этом результаты квантовохимических расчетов и QSAR свойства косвенно подтверждают ббльшую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах по сравнению с Cys.

10. Выявлено взаимодействие лектинов L edodes с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8 - 64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "пектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух пектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу. Возможность взаимодействия в указанной системе in vivo может основываться на участии обоих компонентов (и лектинов, по данным нашей работы, и ИУК, по литературным данным) в процессах морфогенетической дифференцировки мицелия высших грибов.

11. Впервые из внеклеточных метаболитов Lentínus edodes выделен галактолипид S3, являющийся одним из эндогенных регуляторов активности внеклеточных лектинов I. edodes. Галактолипид представляет собой D-галактопиранозу (15% {т/т) S3 содержат сульфэт-Gal), ацилированную остатками октадехановой или нонадекановой кислот в соотношении 28% и 72% (т/т) от суммы двух ЖК соответственно,

12. Предложена методика эффективного разделения двух внеклеточных лектинов L edodes, основанная на дифференциации их хром а то графических свойств в присутствии Cu(ll).

Основные работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Pankratov A.N., Tsrvileva О.М., Nikitina V.E, Lacease of Lentínus edodes catalyzed oxidation of amines and phenolic compounds: a quantum chemical consideration//J. Biochem, Mol. Biol, 2000, VoJ. 33, Na 1, P, 37-42.

2. Цивилеаа O.M., Никитина B E., Гарибова П.В., Завьялова Л.А., Игнатов B.B. Гемагглютинирующая активность Lentínus edodes (Berk.) Sing [Lentinuia edodes (Berk.) Pegler] {} Микробиология. 2000. T, 69, Na 1. C. 38-44.

3. Tsivileva O.M., Niki tina V.E., Garibova L.V., Ignatov V.V. Lectin activity of Lentínus edodes // International Microbiology. 2001. Vol, 4, № 1. P. 41-45.

4. Никитина D.E., Озерова P.A., Цивилева О.M. Особенности роста мицелия Lentinus edodes на различных средах // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. Саратов: Научная книга, 2003. Вып. 2. С. 176-179.

5. Панкратов АН., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Учаева И.М. Квантовохимическое рассмотрение возможной роли источника азота в связи с активностью внеклеточных пектинов при глубинном культивировании Lent/nus edodes II Органические реагенты в организованных средах: Межвузовский сборник научных статей. Вып. 7. Саратов: Научная книга, 2003, С. 220-225.

6. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Взаимосвязь молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных пектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinuia edodes (Berk.) Pegler] II Микробиология, 2004. T. 73, Na 4. С. 486-490.

7. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Гарибова Л.В. Стимуляторы пектиновой активности Lentinus edocfes на синтетических агаризованных средах II Биотехнология.

2004. Na 3, С. 49-54.

8. Цивилева О.М., Панкратов А Н., Древко Б.И., Никитина В.Е. Влияние 1,5-дифенил-З-селенпентандиона-1,5 на пектиновую активность глубинной культуры Lentinus edodes ff Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов: Сборник науч. трудов / Под ред. проф. А.П. Кривенько. Саратов: Научная книга, 2004. С. 301-303.

9. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на морфолого-культуральные характеристики съедобного гриба шиитаке ft «Вавиловские чтения - 2004»: Материалы Всероссийской научно-практической конф., поев, 117-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 24-26 ноября 2004. Секция физиологии и защиты растений. -Саратов: Изд-во СГАУ, 2004. - С. 36-39.

10. Цивилева О.М., Никитина В.Ё., Гарибова Л.В. Влияние состава среды культивирования на активность внеклеточных пектинов Lentinus edodes ff Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41, Na 2. С. 200-203.

11. Tsivileva О.М., Pankratov A.N., Nikitina V.E., Garibova L,V. Effect of media components on the mycelial film formation in submerged culture of Lentinus edodes (Shiitake) // Food Technol. Biotechnol. 2005. Vol. 43, Ne 3. P. 227-234.

12. Силина Ю.Е., Кучменхо T.A., Коренман Я.И., Цивилева О.М., Никитина В.Е. Применение полного факторного эксперимента для разработки газового сенсора на основе экстрактов мицелиального гриба Pleurotus ostreatus ff Журн. аналит. химии.

2005. Т. 60. N9 7. С. 759-764.

13. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и лектиновую активность Lentinus edodes ff Биотехнология. 2005. № 2. С, 56-62.

14. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E., Гарибова Л.В. Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing (Lentinuia edodes (Berk.) Pegler} на разных стадиях морфогенеза ff Микробиология. 2005. T. 74, Ne 5. С. 714-716.

15. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Лощинина Е.А. Поиск группоспецифичных лектинов грибного происхождения II Успехи медицинской микологии. Том V / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2005. С. 201-205.

16. Pankratov A.N., Tsivileva О.М., Nikitina V.E. A Brief Guide to Mycology Web Resources// Online Information Review. 2006. Vol. 30, Na 1, P. 43-52.

17. Цивилева О.M., Никитина B.E., Гарибова Л.В. Использование двухвалентного марганца при получении посевного мицелия Lentinus edodes ft Микология и фитопатология. 2006. Т. 40, вып. 2. С. 142-145.

18. Цивилева О.М,, Панкратов А.Н., Лощинина Е.А., Никитина В.Е. Экспериментальное и теоретическое исследование влияния катионов металлов триады железа на активность внеклеточных пектинов Lentinus edodes Н Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2006. Т. 47, Ms 2. С. 91-96.

19. Степанова Л.В., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В., Тюрюкина Е.В. Гемагглютипирующая активность некоторых базидиальных ксилотрофов на стадии дикариотического мицелия // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40, вып. 4. С. 307-313.

20. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г., Шелудько А,В. Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentinus edodes при совместном культивировании с бактериями рода Azospirillum II Вестник СГАУ. 2006, Na 6, вып. 2. С. 24-26,

21. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А. Взаимоотношения ксилотрофных базидиомицетов и почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum // Успехи медицинской микологии. Том VII / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии,

2006. С. 293-294.

22. Цивилева О.М., Макаров О.Е., Никитина В.Е,, Гарибова Л.В. Изменение жирнокислотного состава общих липидов и пектиновой активности Lentinus edodes в процессе морфогенеза II Микология и фитопатология. 2007. Т. 41. № 5. С. 450455.

23. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Никитина В.Е., Бычков Н.А., Лощинина Е.А. Влияние некоторых неорганических соединений на активность внеклеточных пектинов гриба Lentinus edodes И Известия Саратовского университета. Новая серия. 2007. Т. 7. Серия: Химия. Биология. Экология. Вып. 1. С. 21-27.

24. Nikitina V.E., Tsivileva О.М., Pankratov A.N., Bychkov N.A. Lentinula edodes Biotechnology - From Lentinan to Lectins // Food Technology arid Biotechnology. 2007, Vol. 45, Na 3. P. 230-237.

25. Никитина B.E., Цивилева O.M., Лощинина E.A., Макаров О.Е., Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А. Биохимические особенности развития мицелия Lentunus edodes в совместной культуре с диазотрофными бактериями Azospirillum brasilense it Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 9-12.

26. Пучкова Т.А., Филимонова Т.В., Бабицкая В.Г., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Щерба В.В., Иконникова Н.В. Меланиновые пигменты грибов Lentinus edodes и Ganoderma lucidum II Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии,

2007. С. 17-20.

27. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Иконникова Н.В., Смирнов Д.А., Осадчая О.В. Гликопротеины Lentinus edodes: факторы, влияющие на их образование // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 142-144.

28. Смирнов Д.А., Щерба В.В.. Никитина В.Е., Рожкова З.А., Бабицкая В.Г., Цивилева О.М., Пучкова Т.А., Осадчая О.В. Сравнительное изучение экзо- и эндополисахаридов, образуемых Lentinus edodes при различных способах культивирования Н Успехи медицинской микологии. Том IX I Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 181-183.

29. Никитина В.Е., Цивилева О.М,, Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А. Современные биотехнологические аспекты глубинного культивирования Lentunus

edodes II Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 247251.

30. Цивилева О.М., Никитина В.Е. Соединения селена в процессах жизнедеятельности биотехно логически значимых грибных культур II Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Сборник научных трудов. Выпуск 16. - М.: РАЕН, 2007. С. 47-58.

31. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е.., Панкратов А.Н. Жирные кислоты мицелия на разных стадиях морфогенетического развития Lentinus edodes И Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. С. 116-118.

32. Бычков H.A., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н. Способ выделения индивидуальных экзолектинов из жидких сред культивирования базидиомицета Lentinus edodes И Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. С. 74-76.

33. Бычков H.A., Панкратов А.Н., Цивилева О.М., Липатов И.А., Никитина В.Е., Древко Б.И. Взаимодействие соединений ряда 1,5-ди(4-Р-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 с лектинами базидиомицета Lentinus edodes И Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. С. 331-333.

34. Бычков H.A., Панкратов А.Н., Цивилева О.М. DFT-исследование взаимодействия Л-цистеина с кислотами селена II Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. С. 337-339.

35. Бычков H.A., Панкратов А.Н., Цивилева О.М., Былинкина H.H., Никитина В.Е. Рентгенофазовый анализ экзолектинов базидиомицета Lentinus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. С. 71 -74,

36. Бычков H.A., Панкратов А.Н., Цивилева О.М. Сравнительный анализ реакционной способности L-цистеина и L-метионина: предпосылки замещения атома серы на селен в биохимических процессах II Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. С. 328-330.

37. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E. Экспериментальные предпосылки отнесения пути биосинтеза фитогормона ИУК базидиомицетом Lentinus edodes к триптофан зависимому типу II «Вавиловские чтения - 2007»: Материалы межд. научно-практ. конф., поев. 120-Й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 27-30 ноября 2007. Т. 1. - Саратов: Научная книга, 2007. С. 37-38.

38. Ветчинкина Е.П., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Гарибова Л.В. Активность внутриклеточных лектинов Lentinus edodes на разных стадиях развития гриба II Прикп. биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, № 1. С. 76-83.

39. Никитина В.Е., Цивилева О.М. Способ выращивания съедобных грибов Lentinus edodes II Патент РФ Na 2239983. Бюл. изобр. Na 32 от 20.11.2004.

40. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Кучменко Т.А., Силина Ю.Е., Панкратов А.Н. Биомодификатор для определения фенола и его производных / Положительное решение формальной экспертизы Na 2005121083/13(023786). Приоритет от 13.12.2006.

Слисок сокращений, использованных в автореферате:

аланин — Ata; арабиноза — Ara; аргинин — Arg; аспарагин — Asn; аспарагиновая кислота - Asp; валин - Val; галактоза - Gal; гемагглютинация - ГА; гемагглютинирующая активность - ГАА; гистидин - Hys; глицин - Gly; глутамин -Gin; глутаминовая кислота - Glu; глюкоза - Glc; двухзарядный катион металла -Me2t; диметилсульфоксид — ДМСО; жирные кислоты - ЖК; изолейцин - Не; и м му но ферментный анализ — ИФА; инозит — Ino; культуральная жидкость — КЖ; лактоза-Lac; пейцин - Leu; мальтоза - Mal; маннит- МапОН; манноза- Man; метионин - Met; пигментированная мицелиальная пленка - МП; рамноза - Rha; ростовой коэффициент - PK; сахароза - Suc; титр гемагглютинации - ТГА; триптофан - Тгр; фенилаланин - Phe; фосфатно-солевой буфер - PBS; фруктоза -F ru; целлобиоза - Cel; цистеин — Cys; электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия - SDS-PAGE; этиленгликоль - EG; Quantitative Structure • Activity Relationships (количественные соотношения структура - активность) — OSAR

Подписано к печати 6.02.08. Гарнитура Arial 9. Формат 60x84 1/16, Объем 2 усл. печ. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано а ИБФРМ РАН 410049 Саратов, проспект Энтузиастов, 13