Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции

Цивилева, Ольга Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции"

На правая рукописи

003165231

ЦИВИЛЕВА Ольга Михайловна

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛЕКТИНЫ ЬепНпив ейойев: ХАРАКТЕРИСТИКА, СВОЙСТВА И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ФУНКЦИИ

03.00.04 - Биохимия 03 00 07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

М АР 2008

Саратов - 2008

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук (ИБФРМ РАН), г Саратов

Научный консультант

доктор биологических наук Никитина Валентина Евгеньевна

Официальные оппоненты

доктор химических наук доктор биологических наук доктор медицинских наук

Щеголев Сергей Юрьевич Терешина Вера Михайловна Бородулин Владимир Борисович

Ведущая организация

ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН

Защита диссертации состоится « 21 » мая 2008 года в 10 00 на заседании диссертационного совета Д 002 146 01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу 410049, г Саратов, проспект Энтузиастов, 13

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК,

Автореферат разослан «_» февраля 2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002 146 01, доктор биологических наук

Никитина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы данной работы определяется прежде всего ее направленностью на разрешение проблемы явного несоответствия между весьма ограниченным к настоящему времени уровнем информации о важных биологически активных соединениях, пектинах ксилотрофных базидиомицетов, и заинтересованностью исследователей в углубленном изучении этих углеводсвязывающих белков самого разного биологического происхождения Грибы являются очень интересной в теоретическом и практическом плане группой живых организмов, в то же время внеклеточные грибные лектины практически не описаны

Вопрос о возможности искусственного выращивания грибов уже свыше двух тысячелетий занимает человечество Объектом научных исследований во всем мире являются более 100 тыс видов Промышленное производство высших грибов во многих странах мира выделилось в самостоятельную, интенсивно развивающуюся высокопроизводительную отрасль

Общеизвестно функциональное значение грибов в различных биогеоценозах, где они благодаря широкому набору ферментов принимают активное участие в процессах деструкции и минерализации органического вещества В настоящее время известно большое количество видов базидиальных грибов, которые представляют интерес в качестве продуцентов биологически активных веществ К числу перспективных микологических объектов для поверхностного и глубинного культивирования с целью получения дополнительного источника белка, биологически активных соединений безусловно относится ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes

Глубокие исследования физиологии высших грибов начались в последние три-четыре десятилетия Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность, определяющиеся наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды, требуют дальнейшего изучения При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т е вид и штамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и др, необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов [Дворнина, 1990]

Исследования роста базидиомицетов, в том числе L edodes, на жидких средах направлены на изучение питательных потребностей и физиологии вида в чистой культуре, разработку технологии погруженного культивирования мицелия с целью получения биомассы кормового и пищевого назначения, препаратов, обладающих онкостатическим действием [Соломко и Митропольская, 1994] Глубинное культивирование также предлагается как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства [Yang and Jong, 1989] Значительно меньшее число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развитая грибного организма в глубинной культуре В частности, лектиновая активность высших грибов изучена явно недостаточно, лишь отдельные работы касаются изучения лектинов в связи с физиологическими аспектами, проблемами морфогенеза грибов На стадиях, предшествующих плодоношению и характеризующихся у отдельных видов формированием специализированных вегетативных структур, таких как коричневая мицелиальная пленка шиитаке, исследование лектиновой активности приобретает особую актуальность, поскольку биохимические условия возникновения подобных

особенностей морфогенеза и способов дальнейшего развития (перехода либо к нормальному плодоношению, либо к образованию недифференцированных базидиом) давно интересовали исследователей, оставаясь неопределенными

Не обсуждалась роль лектинов при неблагоприятных условиях роста культур базидиомицетов, взаимодействие лектинов с важнейшими биологически активными соединениями (как антиоксидантной природы, так и вызывающими окислительный стресс, с соединениями фитогормональной природы, принимающими участие в цитодифференцировке у высших грибов) Не были выявлены регуляторы внеклеточной лектиновой активности, поэтому представляло интерес изучить не только эффекторы - компоненты синтетических сред культивирования, но и обнаружить какие-либо эндогенные низкомолекулярные регуляторы указанной активности, внешние условия их биосинтеза и проявления, что удалось реализовать в рамках настоящей работы

Следовательно, ко времени начала наших исследований в этой области налицо был недостаток сведений по вопросам выявления лектиновой активности грибных культур, получения очищенных препаратов внеклеточных грибных лектинов, изучения их свойств и предполагаемых функций Актуальным представляется наш посильный вклад в описание новой группы гликопротеинов ксилотрофных базидиомицетов, внеклеточных лектинов, физико-химические свойства которых важны для понимания их физиологической роли, морфогенетических функций в грибном организме как объекте микробиологических исследований Учитывая вышеизложенные обстоятельства, нами было предпринято настоящее исследование

Цель работы - характеристика внеклеточных лектинов культивируемого ксилотрофного базидиомицета Lentmus edodes и условий проявления их биологической активности

Задачи исследования

1 Провести скрининг штаммов Lentmus edodes на присутствие лектинов

2 Выделить внеклеточные лектины L edodes, изучить их химический состав, физико-химические свойства, углеводную специфичность

3 Изучить зависимость лектиновой активности культуры L edodes от условий выращивания Выявить оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности Разработать способ получения экзолектинов L edodes F-249 с целью повышения выхода препаратов

4 Исследовать влияние катионов металлов(П) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением расчетных методов квантовой химии и QSAR

5 Изучить влияние неблагоприятных внешних условий на лектиновую активность L edodes во взаимосвязи с ростовыми характеристиками культуры

6 Исследовать взаимосвязь активности внеклеточных лектинов L edodes и морфогенеза (формирования коричневой мицелиальной пленки) в глубинной культуре

7 Выявить взаимосвязь углеводного и жирнокислотного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры

8 Исследовать влияние некоторых элементоорганических соединений (Se-, серу-, азотсодержащих) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением теоретических представлений (пространственная и электронная структура молекул, QSAR свойства реактантов)

9 Исследовать биологические свойства лектинов их способность к взаимодействию с веществами фитогормональной природы, с разными типами эритроцитов, антигенные свойства

10 Изучить возможности использования глубинной культуры L edodes при модифицированном способе ее выращивания в качестве технологически перспективного посевного материала

Научная новизна работы

Впервые в культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета L edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам

Выделены чистые препараты лектинов из культуральной жидкости L edodes, изучены их физико-химические свойства, охарактеризована реакционная способность лектиновых препаратов

Впервые показано, что максимальное повышение внеклеточной лектиновой активности базидиомицета наблюдается при условиях, отличных от оптимальных для выращивания культуры

Впервые установлено участие лектинов в морфогенетических процессах и инициации плодообразования шиитаке Выявлена взаимосвязь активности лектинов с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с биосинтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам

Впервые обнаружен и выделен необычный для макробазидиомицетов гликолипид моносахаридной природы, способный модифицировать активность внеклеточных лектинов шиитаке

Впервые выявлено взаимодействие лектинов ксилотрофного базидиомицета с фитогормоном ИУК, сопровождающееся значительным увеличением лектиновой активности в системе "лектин-ИУК"

Научные положения работы расширяют и углубляют современные представления о разнообразии лектинов базидиомицетов и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их биосинтеза и активности, позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах Практическая значимость исследования

Работа вносит вклад в развитие направления лектинологии, связанного с изучением лектинов высших грибов, в рамках которого положено начало новой области исследования препаратов внеклеточных лектинов ксилотрофных базидиомицетов

Показана принципиальная осуществимость выделения и очистки внеклеточных лектинов из жидких синтетических сред культивирования ксилотрофных базидиомицетов Разработана методика эффективной дифференциации хроматографических свойств двух внеклеточных лектинов, способствующей их более эффективному разделению Выявлены низкомопекулярные вещества - эффекторы проявления внеклеточными пектинами их биологической активности, изучено взаимодействие лектинов с соединениями -антиоксидантами и индукторами окислительного стресса, с разными типами эритроцитов в реакции гемагглютинации, некоторые антигенные свойства Подобная характеристика внеклеточных лектинов способствует перспективному использованию выделенных белков при проведении научных и прикладных исследований в области биохимии, энзимологии и иммунологии

пленки Совокупность отличных от нормального плодоношения характеристик, в том числе по лектиновой активности, составу жирнокислотного и углеводного пула мицелия, могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе плодообразования Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза

Наше предположение и дальнейшее обоснование роли лектинов как потенциальных морфообразующих белков позволило внести определенный вклад в создание эффективного способа получения посевного мицелия шиитаке

По результатам работы получен патент РФ, а также положительное решение формальной экспертизы по заявке № 2005121083/13(023786) Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23 06 2006)

Внедрение результатов диссертационной работы подтверждено соответствующими актами, представленными в Приложении к диссертации

Основные положения, выносимые на защиту

1 В культуральной жидкости и на поверхности мицелия культур ряда штаммов Lentmus edodes присутствуют внеклеточные лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам

2 Культура L edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по своим физико-химическим свойствам, составу, углеводной специфичности, антигенным свойствам, агглютинации разных типов эритроцитов, реакционной способности в отношении низкомолекулярных биологически значимых соединений

3 Активность и динамика образования внеклеточных лектинов L edodes зависят от физико-химических условий культивирования Наиболее значимыми факторами, влияющими на лектиновую активность глубинной культуры L edodes, являются присутствие в среде культивирования аминокислотных источников азота, катионов металлов(Н), селена в органической форме

4 При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L edodes

5 Лектины L edodes принимают участие в морфогенетических процессах культуры Установлена взаимосвязь внеклеточной лектиновой активности шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам

6 Одним из эндогенных регуляторов активности лектинов L edodes является необычный для ксилотрофных базидиомицетов галактолипид S3, впервые выделенный из внеклеточных метаболитов L edodes

7 Экзогенными регуляторами внеклеточной лектиновой активности L edodes могут служить низкомолекулярные соединения - индукторы окислительного стресса, а также антиоксиданты, в частности, селенорганические соединения, при взаимодействии с которыми сильно влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий

8 Пектины L edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно увеличивается пектиновая активность в системе "лектин-ИУК" Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу

9 Эффективным способом разделения двух внеклеточных лектинов шиитаке на основе дифференциации хроматографических характеристик и усиления биосинтеза одного из лектинов является воздействие Cu(ll)

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой "Съедобные культивируемые грибы физиология и биохимия" (№ гос регистрации 01970008158, научный руководитель темы доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав лабораторией В Е Никитина), "Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов " (№ гос регистрации 01200606184, научный руководитель темы доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав лабораторией В Е Никитина)

Физико-химические задачи работы выполнены совместно с лабораторией структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав лабораторией - к х н ЕЕ Федоров), с лабораторией биохимии (зав лабораторией в период выполнения исследований - д б н В В Игнатов), а также на кафедре аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им H Г Чернышевского (СГУ), при непосредственном участии д х н, профессора А H Панкратова, на кафедре органической и биоорганической химии СГУ (зав кафедрой - д x н , профессор А П Кривенько)

Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 03-04-48129, 06-04-81042-Бел_а), Федерального агентства по науке и инновациям в рамках федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы (государственный контракт № 02 444 11 7331), программы Президиума РАН "Фундаментальные науки -медицине" в рамках совместного проекта ИБФРМ РАН и ИРЭ РАН, 2007 г

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на 37th IUPAC Congr Frontiers in Chemistry Molecular Basis of the Life Sciences, 27th GDCh General Meeting (Berlin, Germany, Aug 14-19, 1999), науч конфер "Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии" (Саратов, 1999), 5th World Congr of Theoretically Oriented Chemists - WATOC'99 (Imperial College, London, 1-6 Aug , 1999), 1-й регион конфер мол ученых (Саратов, 26-27 марта 2002), Первом съезде микологов России "Современная микология в России" (Москва, 18-20 апреля 2002), межд науч конфер "Физиология и биохимия культивируемых грибов" (6-8 июня 2002, Саратов), IV Всерос конфер мол ученых (Саратов, 23-25 июня, 2003), Int Symp "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants" (Saratov, 28-30 July, 2003), VIII Int Conf "The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology" (Saratov, September 9-13, 2003), 8-й Межд Пущинской школе-конфер мол ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 мая 2004), III Всерос школе-конфер "Химия и биохимия углеводов" (9-11 сентября 2004, Саратов), II Российской школе-конфер "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине" (Саратов, 13-16 октября 2004), Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 13-15 октября 2004), Всерос научно-практич конфер "Вавиловские чтения - 2004" (Саратов, 24-26 ноября

2004), II Всерос симп "Тест-методы химического анализа" (Саратов, 2004), 3-м Всерос Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005), 9-й Межд Пущинской школе-конфер мол ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 18-22 апреля 2005), Межд конфер "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 14-16 сентября 2005), Всерос конфер "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 15-17 июня 2005), V Всерос конфер мол ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 22-24 июня 2005), Int Conf "Biocatalysis-2005 Fundamentals&Applications" (St Petersburg, 1923 June, 2005), II Межд симп "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 25-30 сентября 2005), 10-й Пущинской школе-конфер мол ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 апреля 2006), 4-м Всерос Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006), Межд науч конфер "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М В Гусева)" (Москва, МГУ им MB Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006), III межрегион конфер мол ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 10-12 октября 2006), Межд науч конфер "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1-2 июня 2006), Втором Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006), 5-м Всерос Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007), 4-й Росс конфер "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 4-5 июня 2007), VI Всерос интерактивной конфер мол ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, июнь 2007), XV Congress of European Mycologists (St Petersburg, 1622 September 2007), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ

Личный вклад соискателя

Автору принадлежит идея, разработка путей экспериментального выполнения и теоретическое обоснование всех основополагающих задач, поставленных в диссертационной работе, ключевая роль на всех этапах исследования, интерпретации и теоретической обработки полученных результатов

Благодарности

Следует отметить вклад в выполнение данной работы д б н , зав лабораторией В Е Никитиной, явившейся вдохновителем самого факта проведения исследований с такими объектами, как Lentinus edodes и лектины этой культуры, а также организатором углубленных исследований важной морфогенетической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки и эффекта неблагоприятных условий внешней среды Интересное и полезное обсуждение результатов было обеспечено со стороны В Е Никитиной на всем протяжении периода выполнения работы

Правильная интерпретация полученных результатов в терминах физико-химических, спектроскопических, аналитической химии была бы крайне обеднена, а квантовохимическая интерпретация - невозможна, без сотрудничества с д х н, профессором кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ им Н Г Чернышевского А Н Панкратовым

Публикации

научных изданий, рекомендуемых ВАК ", 19 статей в сборниках научных трудов), 1 патент РФ, 1 положительное решение формальной экспертизы Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23 06 2006)

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы и приложения Приложение содержит документальное подтверждение внедрения материалов диссертации в учебный процесс и практику научных исследований

Работа изложена на 353 страницах машинописного текста Иллюстративный материал представлен 55 рисунками и 54 таблицами Список цитируемой литературы включает 519 источников (отечественных и зарубежных)

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы (глава 1), представленном 3 разделами, 12 подразделами, изложены современные представления о свойствах и функциях лектинов грибов (общее понятие о лектинах, предполагаемая роль, биологические свойства, применение грибных лектинов) Во второй части обзора охарактеризованы морфолого-культуральные и физиолого-биохимические особенности Lentinus edodes (дана краткая характеристика этого вида как гриба "белой" гнили, оценены питательные свойства и медицинское значение шиитаке) В третьей части обзора литературы рассмотрено значение экзогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности мицелиальных культур Значительное внимание уделено соединениям селена в процессах жизнедеятельности биотехнологически значимых грибных культур (селен описан как составляющая часть минерального питания грибов, представлена общая информация по химии селена в живой клетке, данные о влиянии искусственных добавок селенсодержащих веществ на развитие грибных культур) Далее подчеркнуты важнейшие функции, выполняемые соединениями меди в жизнедеятельности микроорганизмов, в основном в связи с биохимией микологических объектов В следующем подразделе описаны имеющиеся в литературе немногочисленные исследования фитогормона (З-индолил-З-уксусной кислоты во взаимосвязи с искусственной культурой базидиомицетов

На основании каждого из разделов представленного обзора сформулированы аспекты исследования для достижения цели настоящей работы и определен круг решаемых для этого задач

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования, условия культивирования

Данное исследование выполнено на материале коллекции штаммов высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им М В Ломоносова В работе использованы 4 штамма L edodes NY, F-249, 2Т, 0779 Культуры грибов поддерживали на сусло-агаре при 4°С

В процессе исследования лектиновой активности L edodes на разных стадиях морфогенеза промежуточную культуру для получения плодовых тел выращивали на

среде следующего состава ([Song et al, 1987], г/л) D-GIc -10, L-Asn - 1, KH2PO4 - 5, MgS04 7H20 -2 5, FeS04 7H20 - 0 03, тиамин - 5104, H20 до общего объема 1 л

При изучении влияния состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов L edodes использовали следующие источники углерода (300 мМ по углероду) D-GIc, Suc, L-Ara, L-Rha, D-Man, D-Mal, D-Fru, D-Gal, D-Lac, СНзС001МаЗН20 В качестве источника азота в среду вносили в различных концентрациях L-Asn, NaNOe, NH4CI Рассчитывали оптимальное соотношение С N В состав сред входили только указанные компоненты Кислотность исходной среды культивирования устанавливали добавлением HCl или NaOH (0,05 M) в стерильных условиях после раздельной стерилизации компонентов

Для исследования взаимосвязи молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании L edodes использовали синтетические среды на основе D-GIc (50 мМ) с источниками азота NH4CI или NaN03 (соотношение CN в среде составляло от 7,5 1 до 150 1), эссенциальные аминокислоты (20 мМ по азоту) В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали катионы Са2+ или Мп2+ в виде хлоридов

С целью изучения стимуляторов лектиновой активности на агаризованных средах при культивировании L edodes использовали синтетические среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду) D-GIc, Suc, L-Ara, L-Rha, D-Man, D-Mal, D-Fru, D-Gal, D-Lac, источником азота (концентрация 20 мМ по азоту) Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Phe, Trp, NH4CI, a также среду с PBS (pH 7,2) и композиции указанных компонентов Среды Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Asp, Glu, Asn, Phe, Trp содержали также 0,4500 г/л Glc Среда PBS содержала также, г/л Glc - 0,4500, NH4CI - 0,2140 Среда Glc-NH4CI содержала, г/л Glc-0,4500, NH4CI - 0,2140

Исследование влияния селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и пектиновую активность L edodes проводили на жидких и агаризованных средах При глубинном культивировании L edodes использовали среды с Glc и Asn, соотношение С N 15 1 (среда I), пивное сусло, 2° по Баллингу (среда II), среда на основе пшеничной муки (20 г/л) (среда III), среда на основе экстракта дубовых опилок (среда IV) В состав плотных сред того же состава (la, Illa, IVa) и 4°-го агаризованного пивного сусла (На) входил дополнительно агар (18 г/л) ДАФС-25 синтезирован, описан и любезно предоставлен Б И Древко [Древко и др , 2001] Концентрация в пересчете на селен в средах культивирования составляла 0,1 мг/л Изучая влияние Ме2+ на активность внеклеточных лектинов шиитаке, использовали синтетические жидкие среды с источником углерода (концентрация 300 мМ по углероду) D-GIc, L-Ara, Suc, источником азота служил Asn (10 мМ) В качестве компонентов - добавок к среде выращивания использовали соли металлов (концентрации 0-10 мМ) MgS047H20, CaCI22H20, MnCI24H20, FeSCU 7Н20, CuS045H20, ZnS047H20, CoCI26H20, N\S046H20, SnCI22H20

Синтетическая среда для изучения процессов хелатообразования в рамках проблемы влияния Fe(ll), Co(ll), Ni(ll) на активность внеклеточных лектинов L edodes состояла из Glc (50 мМ), Asn (10 мМ), включала добавки Fe(ll), Co(ll), Ni(ll) (4 мМ) и EG (2 мМ или 4 мМ)

Методы исследования

При посеве грибной культуры в качестве инокулята использовали 14-сут культуру L edodes F-249, выращенную на агаризованном пивном сусле при 26°С Способ дозирования посевной культуры состоял в засеве жидких сред дисками сусло-агара диаметром 5 мм с культурой гриба, взятыми из одной зоны растущего мицелия, обычно 3 диска на 50 мл среды или 1 диск на чашку Петри

Растворы органических Se-, S-, N-содержащих соединений, используемых в качестве добавок к среде выращивания, после стерилизации в тонком слое УФ облучением добавляли непосредственно перед посевом

Получение плодовых тел L edodes осуществляли как на органической плотной среде из смеси дубовых опилок и пшеничного зерна (4 1, v/v), так и на чашках Петри со средой сусло-агар, по модифицированной методике [Stamets, 1993] с применением холодового шока и суточных температурных колебаний Время от засева субстрата до начала плодоношения составляло от 38 до 70 сут в зависимости от штамма

Ростовой коэффициент (PK) вычисляли по формуле PK = dhg/t, где d -диаметр колонии, мм, h - высота колонии, мм, g - плотность колонии, балл, t - возраст колонии, сут Величину g оценивают по трехбалльной шкале [Бухало, 1988] Скорость роста при глубинном культивировании определяли по накоплению сухой биомассы в единицу времени в зависимости от продолжительности выращивания

.Пектиновую активность в жидких пробах определяли реакцией ГА с самопроизвольным оседанием эритроцитов, используя 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов в серии последовательных разведений лектина [Луцик и др , 1981] ТГА выражали как наибольшее разведение раствора, вызывающее агглютинацию эритроцитов

Углеводную специфичность определяли в серии последовательных разведений углевода (от 0,3 М) при использовании раствора испытуемого гемагглютинина с титром 4 в реакции ГА В работе использовали 21 препарат углеводов (Serva) Углеводную специфичность оценивали по минимальной концентрации углевода, ингибирующующей реакцию ГА лектина в данных условиях При отсутствии ингибирования в интервале концентраций углевода от 0 до 100 мМ считали, что специфичность исследуемого лектина к данному углеводу отсутствует

Изучение зависимости пектиновой активности от температуры культивирования мицелия проводили при 26°С как оптимальной температуре роста мицелия для данного вида, 16°С - температуре замедленного роста, 32°С и 37°С -верхних предельных значениях температурного интервала развития этой культуры на плотных и жидких средах соответственно

Относительную молекулярную массу белковых образцов определяли с помощью электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) по методу Лэммли В качестве стандарта использовали набор белков маркеров фирмы «Amresco» (США) Визуализация белковых полос осуществлялась методом окраски геля при помощи 0,2%-ного раствора Coomassie' Brilliant Blue G-250 или 0,1% (m/v) раствора АдМОз

Аминокислотный состав белков определяли на аминокислотном анализаторе AAA 339 (ЧССР) Подготовку образца проводили по общепринятому методу (при 105°С 24 ч в 6М HCl)

Состав углеводной фракции исследовали методом капиллярной газовой хроматографии на .неподвижной жидкой фазе SE-54 в режиме программирования температуры, с предварительным получением силильных производных Сахаров

Хроматографию проводили на приборе «Chrom 5» (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором, используя кварцевую капиллярную колонку длиной 25 м, при программировании температуры от 150 до 280°С со скоростью нагрева термостата колонок 8 град/мин Объем пробы 1 мкл Газ-носитель - гелий

Триметилсилиловые эфиры исследуемых проб и соединений-стандартов получали с использованием 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазана и триметилхлорсилана в качестве катализатора [Пецев и Коцев, 1987]

Липиды экстрагировали модифицированным методом С Song с соавторами (1989), включающим обработку сухого мицелия смесями метанол-вода-хлороформ в объемном соотношении (1 2 3), высушивание в токе азота или аргона и экстракцию сухого остатка гексаном Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии Метиловые эфиры ЖК разделяли на газожидкостном хроматографе "Биохром-1" на кварцевой капиллярной колонке (длина 25 м, внутренний диаметр 0 2 мм) с неподвижной фазой SE-54 Использовали режим программирования температуры термостата колонки от 130 до 270°С со скоростью нагрева 4°С/мин Температура испарителя 150°С, детектора 270°С Газ-носитель -гелий, скорость потока 1 6 мл/мин

Жирные кислоты идентифицировали по временам удерживания их метиловых эфиров В качестве стандартов метиловых эфиров ЖК использовали набор Bacterial Acid Methyl Esters CP Mix (Supelco) 11 0, 2-OH 10 0, 12 0, 13 0, 2-OH 12 0, 3-OH 12 0, 14 0, 1-15 0, a-15 0,15 0, 2-OH 14 0, 3-OH 14 0, 1-16 0, 16 19, 16 0, i-17 0, 17 O, 2-OH 16 O, 18 2912, 18 19, 18 0, 19 0, 20 0, а также в дополнение другие метиловые эфиры ЖК (Sigma) 7 0, 8 0, 9 0, 10 0, 18 1, 20 2, 21 0, 22 1, 22 0, 23 0, 24 1, 24 0

Поликлональные кроличьи антитела получали на хроматографически очищенный препарат внеклеточного пектина L1 Иммунизацию проводили 3 раза с интервалом 2 недели, последовательно вводя в подколенные лимфатические узлы кролика 50, 100 и 150 мкг лектина Антиген растворяли в физрастворе, забуференном фосфатами (pH 7 2) до концентрации 100 мкг/мл и смешивали с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1 1 Кровь отбирали через неделю после третьей иммунизации Фракцию иммуноглобулинов G получали из антисыворотки осаждением сульфатом аммония

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в полистироловых 96-луночных планшетах В качестве ферментативной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с анти-кроличьими козлиными антителами В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО ИЛИП, г Санкт-Петербург) Результаты твердофазного ИФА продемонстрировали наличие общих антигенных детерминант в составе двух внеклеточных лектинов

Съемку рентгенограмм проводили на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3 на Cu-Ka излучении в следующем режиме сила анодного тока 75-150 А, катодное напряжение 75-150 В Скорость сканирования 2 град/мин

Спектры ЯМР получали на спектрометре Varían FT 80А (США), частота 80 МГц, для 2 - 3% растворов образцов в 99 96 % D20 при ЗОЗК (внутренний стандарт -ацетон, дн 2 225 м д , дс 31 45 м д , и внешний стандарт - 85% водная Н3Р04, др 0 м д ) Для калибровки спектров использовали Na-соль 3-(триметилсилил)-пропионовой-2,2,3,3-d4 кислоты (внутренний стандарт, д„0)

Инфракрасные спектры регистрировали на приборе ИК-Фурье спектрометр ФСМ 1201 в тонком слое вазелинового масла и гексахлорбутадиена

QSAR-свойства вычисляли с помощью программы комплекса HyperChem по атомно-аддитивным схемам [Hasel et al, 1988, Still et al, 1990, Bodor et al, 1989, Gavezotti, 1983, Ghose and Crippen, 1986, 1987, Viswanadhan et al, 1989, Miller, 1990, Ghose et al, 1988]

При изучении влияния Fe(ll), Co(ll), Ni(ll) на активность внеклеточных лектинов L edodes квантовохимические ab initio расчеты проводили неограниченным методом Хартри - Фока (UHF) в базисе 3-21G(d,p) (UHF/3-21 G(d,p)) [Hehre et al, 1986, Кларк, 1990] с использованием программ из пакета HyperChem [HyperChem (TM), Hypercube, Inc, 1115 NW 4th Street, Gainesville, Florida 32601, U S А] Полную оптимизацию

геометрии проводили посредством алгоритма Полака - Рибера (Polak - Ribiere conjugate gradient algorithm) [Дэннис и Шнабель, 1988] Предварительную оптимизацию геометрии осуществляли методом РМЗ [Stewart, 1989а, 1989b] посредством программы из того же пакета При квантовохимических расчетах задавали условие, чтобы норма градиента не превышала 0 02 ккал/(мольЛ) Корреляционные поправки к хартри-фоковским энергиям рассчитывали для оптимизированной геометрии (Single Point) в рамках теории возмущений Меллера - Плессе второго порядка (МР2) [Hehre et al, 1986, Кларк, 1990] в том же базисе (подход MP2/3-21G(d,p)//UHF/3-21G(d,p))

При оценке полученных результатов пользовались методом расчета стандартного отклонения среднего арифметического, данные, представленные в настоящей работе, имеют соответствующие доверительные интервалы при уровне доверительной вероятности 0,95

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаружение, выделение, определение специфичности агглютининов Lentinus edodes

Обнаружение пектинов Lentmus edodes

О наличии пектинов L edodes информация крайне ограничена и представлена двумя работами [Jeune et al, 1990, Wang et al, 1999], касающимися выделения пектина из плодовых тел L edodes В литературе отсутствуют данные о внеклеточных пектинах шиитаке Поэтому, учитывая важность и разнообразие функций пектинов в живых организмах, а также разностороннее значение базидиомицета L edodes, мы предприняли исследования по обнаружению внеклеточных пектинов, находящихся в культуральной жидкости гриба, а также в пассивных смывах с поверхности мицелия в условиях твердофазного культивирования

В результате экспериментов по поискам гемагглютининов культуральной жидкости была обнаружена ГА активность в КЖ у всех взятых в эксперимент штаммов L edodes F-249, 2Т, 0779, NY, выращенных на минеральной среде при 26°С Анализ КЖ показал значительные вариации ГА активности в зависимости от штамма шиитаке Возникает вопрос, не объясняются ли эти штаммовые различия по продукции внеклеточных гемагглютининов разной способностью культур к накоплению биомассы7 Для корректности сравнения ГА активности у разных штаммов L edodes, культивируемых одно и то же время, проведены эксперименты по определению скорости роста используемых штаммов на минеральной среде, позволившие заключить, что различия в отношении ГА активности заметно превосходят различия в скорости роста культур штаммов

Полученные данные позволили говорить о большом количестве внеклеточных агглютининов, выделяющихся в среду выращивания Для доказательства принадлежности выявленных гемагглютининов к классу пектинов были получены результаты определения углеводной специфичности агглютининов КЖ методом ингибирования агглютинации эритроцитов углеводами Агглютинины всех штаммов высокоспецифичны к D-Gal (кроме NY), D-Lac, в меньшей степени -D-Mal Ингибирующая концентрация углевода минимальна в случае Lac и штамма F-249 При этом аминопроизводные Gal и Glc малоэффективны в отношении ингибирования реакции ГА пектинов КЖ всех штаммов, a GalNAc и GlcNAc ингибируют только ГАА пектинов штамма NY (4,17 и 16,7 мМ соответственно)

К L-Rha особенно специфичны лектины штамма F-249 реакцию ГА ингибирует концентрация этого углевода 11,1 мМ Исключительно в отношении пектинов штамма F-249 наблюдается явно выраженная углеводная специфичность к D-ManOH и D-Cel (8,33 и 33,3 мМ соответственно в сравнении с величинами, превышающими 100 мМ, для других штаммов) Мы осознаем, что преждевременно было бы говорить об углеводной специфичности грибных лектинов как о систематическом штаммоспецифичном признаке, однако из полученных нами данных довольно четко видны различия этого параметра у разных культур штаммов

Предположив, что гемагглютинины присутствуют и на поверхности грибных гиф при выращивании на плотных средах, и что ГА активность будет проявляться в пассивных смывах с мицелия, мы провели эксперименты по обнаружению внеклеточных гемагглютининов при твердофазном культивировании Была выявлена ГА активность в пассивных смывах с мицелия у всех взятых в эксперимент штаммов L edodes, выращенных на агаризованных средах разного состава Различия в отношении ГА активности заметно превосходят различия ростовых характеристик культур штаммов, и корреляций ГА активности со скоростью накопления биомассы не выявляется (как и при жидкофазном культивировании) Определение углеводных гаптенов для агглютининов вегетативного мицелия культур 4-х штаммов шиитаке показано присутствие во всех без исключения случаях лектинов с высокой специфичностью только к D-Lac Специфичность к D-Gal и D-GaIN, несомненно, ниже, но также обнаружена для всех штаммов Лектины с аналогичной высокой специфичностью к Lac были обнаружены нами и в КЖ

Таким образом, данные, полученные из экспериментов по обнаружению гемагглютининов шиитаке, позволяют утверждать, что агглютинины L edodes присутствуют в КЖ и в пассивных смывах с мицелия у всех взятых в эксперимен штаммов L edodes, выращенных в условиях жидкофазного и твердофазного культивирования Определение углеводных гаптенов позволяет отнести выявленные гемагглютинины к классу лектинов Различия в отношении пектиновой активности заметно превосходят различия ростовых характеристик культур штаммов

Выделение и очистка, определение углеводной специфичности лектинов

Для дальнейших исследований по выделению и очистке внеклеточных лектино шиитаке мы использовали штамм L edodes F-249 Выбор был основан на следующем высокая пектиновая активность в условиях эксперимента, быстрый рост вегетативного мицелия на агаризованных средах, именно для штамма F-249 нам удалось получит плодовые тела на чашках Петри в течение не более чем 60 суток

При выделении внеклеточных лектинов L edodes F-249 в качестве грубой белкового экстракта использовали КЖ В состав синтетической среды входили Glc (5* мМ) и Asn (10 мМ) Сконцентрированный фильтрат КЖ осаждали ацетоном, выпавший при 4°С осадок отделяли от супернатанта Осадок растворяли в воде, получа' неочищенный раствор пектина 1 (L1) Супернатант освобождали от ацетона высушивали при 30-32°С, остаток растворяли в воде, получая неочищенный раство| пектина 2 (L2) Полученные водные растворы лектинов пропускали через колонку i Sephadex G-25, элюент вода Выход белковых фракций регистрировали на прибор! Uvicord S-ll (LKB) при 280 нм

Далее очистку лектинов Z.1 и L2 проводили с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии При нанесении активных по ГА фракций, сошедших с колонки после гель-эксклюзионной хроматографии, на колонку с катионообменником Toyopearl СМ-650М большинство примесей связалось с носителем, тогда как очищенные лектины выходили со свободным объемом После гель-фильтрации на колонке с Toyopearl HW-55S (рис 1) удалось выделить и разделить две активные по

ГА фракции целевых белков Анионообменная хроматография указанных фракций, содержавших преимущественно L1 или L2, на колонке с Toyopearl DEAE-650M привела к удалению большинства примесей и полному разделению двух лектинов, выходивших с колонки при существенно различной ионной силе элюента (L1 при концентрации NaCI 0,3 моль/л, L2 элюировался PBS с концентрацией NaCI 0,14 моль/л) Окончательную очистку проводили на колонке с Sephadex G-75 Обессоленные водные растворы L1 и 2 концентрировали

О 1

20 36 68

Объем элюции мл

Рис 1 Профиль элюции лектинов ¿1 и L2 Lentinus edodes F-249 на колонке с Toyopearl HW-55S 1-LU2-L2

SDS-PAGE показал, что оба белка мономерны, характеризуются молекулярными ассами 43 и 37 кДа соответственно Дополнительное подтверждение указанных еличин получили при использовании калиброванной по молекулярной массе колонке с ephadex G-75 Установлено, что внеклеточные лектины L edodes F-249 являются ликопротеинами, однако содержание углеводов в L2 значительно выше, чем в L1

Определение углеводной специфичности показало, что оба лектина проявляют пецифичность к D-Gal и D-Lac И для L1, и для L2 минимальные ингибирующие онцентрации этих углеводов 2,08 мМ Gal и 8,33 мМ Lac Другие углеводы, к которым ектины проявляют более или менее высокое сродство для L1 это Rha (4,16 мМ), для 2 - Ara (4,16 мМ) и МапОН (8,33 мМ)

Интересна специфичность одного из лектинов (L2) и гемагглютиннов КЖ к апОН Известно, что метаболизм МапОН играет важную роль в развитии плодовых тел риба У L edodes содержание этого полиола может достигать 30-50 % от общих глеводов По нашим данным МапОН накапливается в белом мицелии L edodes перед ормальным плодоношением на коричневой мицелиальной пленке

Лектины обнаруживают высокую специфичность к гликопроизводным, в составе олекул которых есть прежде всего D-галактозид или, в меньшей степени, к роизводным 4-0-0-глюкопиранозы, предпочтительнее 4-O-a-D-Glc- по сравнению с 4-0--D-GIc- Никакие иные D-глюкозидные производные, как и сама Glc, не проявляют родства к исследуемым пектинам

Внеклеточный гликопротеин L edodes-лектин L1 Внеклеточный лектин L1 из L edodes F-249 - гликопротеин с моносубъединичной труктурой, молекулярной массой 43 кДа L1 имеет в своем составе (10,5 ± 1,0)% ?/т)углеводов, представленных Glc

По результатам определения аминокислотного состава Z.1 обращает на себя нимание достаточно высокий уровень полярных аминокислот (Asx, Glx, Lys, Arg) Так, одержание Lys и Arg составляет 10,4 и 16,5 мол % соответственно Много и кислот,

занимающих промежуточное положение между гидрофильными и гидрофобными, особенно Hys, Ser и Gly Для Í.1 индекс полярности равен 54,6% Такая высокая полярность характерна для большинства водорастворимых белков, для которых величина указанного индекса находится обычно в рамках интервала 47 ± 6 %

На хроматографически очищенный препарат внеклеточного лектина L1 получали поликлональные кроличьи антитела Результаты твердофазного ИФА продемонстрировали наличие общих антигенных детерминант в составе двух внеклеточных лектинов

Агглютинирующие свойства лектинов L edodes на разных стадиях очистки препаратов этих белков изучали в зависимости от типа эритроцитов (разных животных и 4 групп крови человека) и их предварительной обработки (нативных и трипсинизированных) Очищенные лектины демонстрировали высокую избирательность при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизированных эритроцитов кролика, не реагировали с эритроцитами других животных и человека Обработка эритроцитов трипсином значительно повышала чувствительность реакции

Внеклеточный протеогликан L edodes - лектин L2 Внеклеточный лектин 2 из L edodes F-249 - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 кДа L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0)% (т/т) углеводов, предсталенных Glc (73% общей массы углеводной части молекулы лектина) и Gal (27% общей массы углеводной части молекулы лектина)

В L2 высоко содержание полярных аминокислот, прежде всего Asx - около 42% от суммы аминокислот Элементный анализ (на содержание азота) показал, что Asx присутствует в виде Asn Менее 10% в L2 других полярных аминокислот Glx, Lys, Arg Для L2 индекс полярности равен 56,7%

Содержание углеводов в L2 значительно выше, чем в L1 Высокое содержание Asn в составе L2 согласуется с нашими данными о положительном эффекте Asn в отношении формирования коричневой мицелиальной пленки L edodes в глубинной культуре Кроме того, высокий уровень Asn в L2 наряду с составом углеводной части молекулы (Glc и Gal) позволяют отнести этот лектин к N-аспарагинсвязанным, имеющим N-гликозидную связь в молекуле протеогликана Белковая часть связывается с углеводной через Asn [Э А Коваленко, 1997]

Более детальная структурная характеристика L2 была получена с помощью спектроскопии ЯМР Спектр ЯМР 1Н образца L2 содержит две группы сигналов (табл 1) Химический сдвиг протона воды (Н20), содержащейся в растворителе (D2O), равен 4 632 млн"1 Поэтому с высокой степенью достоверности пики при 4 380, 4 884, 5 047 и 5 087 млн"1 могут быть отнесены к протонам гидроксильных групп

Кроме того, пики при 5 047 и 5 087 млн"1 могут относиться к алкиламинным (AlkNH2, AlkNHAlk') или алкиламидным протонам (AlkCONH2, AlkCONHAIk'), для резонанса которых характерны химические сдвиги 5 0-8 0 и 5 0-8 5 млн"1 соответственно [Панкратов и Остроумов, 1995]

Отметим, что сигналы метиленовых и метиновых протонов групп СНгОН и СНОН обычно проявляются в области 3 6 и 3 8 млн"1 соответственно Это согласуется с предположением о наличии в составе образца названных групп

В пользу отнесения пиков к ОН- или NH-протонам свидетельствует то, что все сигналы в той или иной степени уширены Причиной уширения сигналов протонов при гетероатомах обычно является их участие в обменных взаимодействиях, а в случае протонов при атоме азота - также наличием у ядра 14N электрического квадрупольного момента [Панкратов и Остроумов, 1995]

Таблица 1. Данные спектра ЯМР 'Н внеклеточного лектина£2 из L edodes F-249

Химический сдвиг (5,млн"1) Возможное отнесение

3 268, 3 317, 3 380, 3 420, 3 466,3 631 1 Алкильные протоны в фрагментах СН2ОН, СНОН, CH2NCOR, ch2nso2r, ch2n+, chn+, ch2n=c=s, ch2+n=c~, ch2so2f, CH2C1, CH2Br, CH2I 2 Алкильные протоны разнообразных фрагментов XCH2Y и XCHY, включая R2NCH2COOR, R2NCHCOOR (R = H, Alk, Ar) 3 Протоны при гетероатомах О, N, S в соединениях AlkOH, ArNH2, ArNHR, ArSH

4 380, 4 884, 5 047,5 087 1 Протоны при гетероатомах О, N в соединениях AlkOH, АгОН, ArNH2, ArNHR 2 Винильные протоны фрагментов С=СН2, ROC=CH (R = Н, Alk, Ar)

Спектр не содержит сигналов алкипьных и циклоалкильных протонов, не связанных с электроноакцепторными атомными группами, а также протонов ароматических, хиноидных, пиридиновых, пиррольных, фурановых, тиофеновых циклов, альдегидных протонов (RCHO), подвижных атомов водорода карбоновых кислот (RCOOH), сульфокислот (RSO3H), оксимов (R2C=NOH), алкилтиолов (AlkSH)

Учитывая характер образца, можно исключить возможность присутствия фрагментов CH2NCOR, CH2NS02R, CH2N=C=S, СН2+№С", CH2S02F, CH2CI, CH2Br, CH2I, структурных элементов XCH2Y и XCHY, кроме приведенных в табл 1 а-аминокислотных, а также С=СН2, ROC=CH, AlkNH2, AlkNHAIk', ArNH2, ArNHR, ArSH

Следовательно, спектр ЯМР 1H образца не противоречит возможности наличия в его составе углеводных и a-аминокислотных звеньев, то есть протеогликановой природе L2

Выделение и характеристика внеклеточного гликолипида L edodes

Используя экстракцию смесями метанол-вода-хлороформ, из L2 на промежуточной стадии его очистки мы получили препарат, содержащий Gal (выход 0,19%) и жирные кислоты (выход 0,17%) С8 0 и С9 0 (в соотношении 28% и 72% (т/т) от суммы двух ЖК соответственно) Путем простых вычислений из экспериментально найденного соотношения масс Gal и алкановых кислот получаем, что в выделенном препарате (обозначенном нами S3) на одну молекулу Gal приходится 1 молекула ЖК Это в пределах погрешности эксперимента подтверждается теоретическими подсчетами (приведены в тексте диссертации) Согласно результатам элементного анализа, 15% молекул галактолипида сульфатировано То есть главными компонентами S3 являются Gal (1-сульфат-Са1), ацилированная остатками октадекановой или нонадекановой кислот Указанные методы исследования дополнены ИК-спектроскопическими

В ИК-спектре галактолипида S3 наблюдались случаи, когда полосы можно относить к сульфатной группе Имелись типичные алифатические полосы, свидетельствовавшие о присутствии углеводородной цепи ацильного заместителя, а также признаки полиметиленовой цепи Отнесения частот для колебания с участием связей С-0 в карбоновых кислотах, сложных эфирах (1155 и 1111 см 1) могут говорить о сложноэфирном характере присоединения жирнокислотного заместителя Gal В

целом отнесения частот не противоречат возможности наличия в составе соединения S3 углеводных звеньев и ЖК остатков

Накопление входящих в состав S3 короткоцепочечных ЖК происходит в мицелии шиитаке на стадии формирования коричневой мицелиальной пленки и коррелирует с резким повышением внеклеточной лектиновой активности в смывах с мицелия именно на этой морфогенетической стадии Никакого повышения содержания в мицелии ЖК С8 0 или С9 0 не наблюдается при образовании недифференцированных плодовых тел на белом мицелии, когда и увеличения лектиновой активности не происходит Более подробному описанию изменений жирнокислотного состава мицелия во взаимосвязи с лектиновой активностью культуры в процессе морфогенеза посвящен один из разделов настоящей работы

Можно высказать предположение о возможной роли S3 как одного из регуляторов активности внеклеточных лектинов Кроме корреляции накопления компонентов S3 с увеличением лектиновой активности, о возможном вкладе гликолипида в регуляцию этой активности говорят результаты других наших наблюдений В смесях препаратов S3 + L1 и S3 + L2 при одинаковой массовой концентрации компонентов титр гемагглютинации возрастает в 8 и 16 раз соответственно (собственной ГА активности S3 не проявляет) Кроме того, в ходе процедуры очистки препарата L2 удельная активность его проходит через максимум на промежуточной стадии, на которой L2 связан с S3, а затем заметно снижается по мере дальнейшей очистки L2

Длительное время в литературе обсуждаются вопросы, связанные с неспецифичностью реакции клеток микроорганизмов в ответ на самые различные внешние воздействия В общем механизме приспособления к неблагоприятным условиям или стрессу значимую роль играют регуляторные соединения, экскретируемые во внеклеточную среду (факторы стресса) [Андреев и др , 1988] Среди компонентов фактора были выявлены урацил, фосфаты, жирные кислоты (¿9 0 и С10 0), олигосахариды (Примечание среди компонентов S3 72 масс% жирнокислотного пула приходится на С9 0) Подобное соединение синтезируется одним из первых на фоне затухания метаболических процессов, работающих в состоянии нормы [Феофилова, 1994]

Мы полагаем, что в дополнение к комплексу вторичных метаболитов, экскретируемых культурой L edodes, под воздействием изменившихся в отрицательную сторону условий внешней среды (питательный стресс, переход к цитодифференцировке вследствие истощения питательных ресурсов) присоединяются вещества - регуляторы лектиновой активности, одним из которых является S3

С учетом разнообразия биологического происхождения продуцентов гликолипидов с признаками как явного сходства, так и немаловажного в функциональном плане различия молекулярного строения обсуждаемых соединений, выявляемых современными исследованиями [Cheng et al, 2003, Голубев и др , 2004, Воробьева и др, 2006, Плужников и др, 2006, Кулаковская и др, 2007], не представляется особенно удивительным тот факт, что L edodes и, вероятно, другие макробазидиомицеты способны самостоятельно синтезировать подобные соединения, однако пока в отношении данной систематической группы такой информации в литературе мы не встречали

Зависимость лектиновой активности от условий культивирования

Имеется ряд признанных важными физико-химических и биологических факторов внешней среды, которые могут служить триггерами процессов сложного

пути развития мицелиальных грибов [Феофилова и др, 1988]. От таких параметров внешних условий, как температура культивирования, количество посевного материала, возраст культуры, состав питательной среды (природа веществ -источников углеродного и азотного питания, соотношение "C:N", кислотность), мы изучали зависимость активности пектинов L. edodes для успешного решения в дальнейшем проблемы получения этих биологически активных соединений методом глубинного культивирования.

Влияние количества посевного мицелия, температуры, возраста культуры на лектиновую активность L. edodes

Для изучения влияния количества посевного мицелия на активность внеклеточных пектинов гриба мы выбрали способ дозирования посевной культуры -дисками сусло-агара, покрытыми мицелием (d=5 мм). Зависимость лектиновой активности КЖ от дозы посевного мицелия изучали в процессе роста культуры на синтетической Glc-Asn среде. Оказалось, что зависимость лектиновой активности КЖ от количества посевного материала характеризуется непропорционально быстрым увеличением этой активности, имеющим предельное значение при определенном количестве инокулята.

Изучение зависимости лектиновой активности от температуры культивирования показало, что титры ГА имеют более высокие значения как при повышении температуры, так и при ее понижении по сравнению с оптимумом роста (26°С). Для корректности сравнения лектиновой активности у разных штаммов L. edodes, культивируемых одно и то же время, проведены эксперименты по определению скорости роста используемых штаммов при данных температурных условиях выращивания. Оказалось, что таких резких изменений, как это имеет место в плане лектиновой активности, скорость роста не претерпевает ни в зависимости от штамма, ни тем более от температуры выращивания. Штаммовые различия скоростей роста относительно невелики: не более чем в 1,1 раза при 37°С, в 1,2 раза при 26°С, в 1,3 раза при 16°С, а штаммовые различия по лектиновой активности достигают 5,1-103 раз (при 37°С). Изучали влияние выбранных температур на лектиновую активность КЖ в процессе роста культуры, а также зависимость скорости роста всех исследуемых и

сdm/dt) X (1/m) X 103

Ig Т

5 10 15 20 t. сут

10 15 20 г, сут

10 15 20

25 30

t. сух

Рис. 2. Зависимость лектиновой активности КЖ (а, б, в) и скорости роста (г) L. edodes от времени культивирования при различных температурах выращивания (26"С (а, г), 16°С (б), 37"С (в)). Штаммы: 1 - NY, 2 - F-249, 3 - 2Т, 4 - 0779

Видно, что штаммовые различия в отношении ГА активности КЖ, сравнительно небольшие при 1б°С, увеличиваются при 26°С с одновременным изменением вида соответствующей кривой При 37°С штаммовые различия продолжают углубляться, резко отличается от других штамм NY Сопоставление характера зависимостей на рис 2 (а, б, в) с рис 2 (г) позволяет сделать вывод, что изменения лектиновой активности в нашем эксперименте не определяются только скоростью роста Аналогичный вывод был сделан нами и ранее для случая температурного оптимума 26°С лектиновая активность - биохимическая характеристика, производная не только от способности грибной культуры к накоплению биомассы

Активность внеклеточных лектинов L. edodes в зависимости от источников углерода и азота

Исследования, связанные с образованием внеклеточных лектинов шиитаке в зависимости от условий глубинного культивирования, позволяют представить характеристику внешних условий биосинтеза лектинов культуры, выявить оптимальную в этом отношении химически детерминированную среду выращивания и усовершенствовать процедуру выделения и очистки экзолектинов С этой целью первоначально мы изучали жидкие среды разнообразного химического состава, а именно с различными источниками углерода и азота, низкомолекулярными компонентами-добавками, значениями pH среды, в динамике роста культуры

Анализ КЖ показал значительное увеличение титров ГА для всех сред с моносахаридами в качестве источника углерода по сравнению с лектиновой активностью сред на основе других углеводов или ацетата натрия В этой связи особенно выделяется Ara, титр ГА при использовании которой в КЖ возрос не менее чем в 8 раз по сравнению с другими изученными веществами Обнаружено, что наибольшей лектиновой активностью характеризуется среда выращивания "Ara - Asn" при соотношении С N (9,5-12) 1 на 15-18-е сут культивирования (титр ГА 8192), а также "Glc - Asn" при возрасте культуры 3-7 сут и CN 17 1 (титр ГА 4096) Отмечено значительное увеличение лектиновой активности при pH 8-9 и отсутствие положительного эффекта рИ-статирования растущей культуры

Эффект некоторых низкомолекулярных компонентов среды эксперимент и квантовохимическое рассмотрение

Катионы двухвалентных металлов

Известно стимулирующее влияние некоторых микроэлементов, в том числе катионов металлов, на синтез вторичных метаболитов различными грибами [Scott and Gaucher, 1984, Козловский и Соловьева, 1986, Hughes and Poole, 1989, Ловкова и др, 1995, Козловский и др , 2000] О механизмах их действия на процесс в целом или на его отдельные этапы известно крайне мало Исследование лектиновой активности L edodes во взаимосвязи с химическим составом среды культивирования мы продолжили с использованием введения в состав синтетических сред катионов металлов (II) в виде солей Девять металлов(П) выбрали по принципу биологической значимости их катионов для минерального питания грибов Соли выбранных металлов входят в микроколичествах в состав оптимизированных питательных сред ксилотрофных базидиомицетов [напр , Бухало, 1988, Дворнина, 1990, Дудка и др , 1992]

Изучая зависимость лектиновой активности глубинной культуры L edodes от концентрации солей металлов(И) в синтетической среде выращивания, мы установили, что одним из факторов, влияющих на эту активность, несомненно является присутствие в среде культивирования солей металлов в степени окисления +2

В случае меди имеет место зависимость "лектиновая активность - концентрация катиона", противоположная наблюдаемой для других металлов в настоящей работе: наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди,

В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей пектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона Ме2+, но и источник углеродного питания грибной культуры. Так, среды выращивания с Са2+ и Glc (рис. За), Suc (рис. 36), Ara (рис. Зв) различаются как величинами титров ГА (максимальные значения составляют 1024 для Glc и Ara, 256 для Suc), так и периодами проявления наибольшей лектиновой активности. Так, титр 1024 наблюдается при содержании Са2+ 1 мМ на 9-е сут и в период 16-28 сут культивирования в случае Glc, но только в интервале 21-28 сут в случае Ara. Максимальная лектиновая активность (титр 256) для среды с Suc наблюдается лишь ¡ на 3-й и 5-е сут, причем при той же 1 мМ концентрации Са2+.

1 Полученные данные для металлов, образующих обсуждаемые выше катионы,

позволяют составить последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта Мег+ на активность внеклеточных лектинов шиитаке: Mg > Са > Cu > Fe > Мп > Zn ~ Sn > Со > Ni.

а б в

Рис. 3. Зависимость летиновой активности (lgT) КЖ L. edodes F-249 с добавкой Са2+ i при использовании в качестве источника углерода: D-Glc (a), Suc (б), L-Ara (в) от времени культивирования. [Са2+], мМ: (61,68,75) - 0; (62,69,76) - 1; (63,70,77) - 2; (64,71,78)-4; (65,72,79) - 6; (66,73,80) - 8; (67,74,81) - 10

Катионы металлов триады железа

Интерес представляет объяснение влияния катионов металлов на лектиновую ' активность с позиций квантовой химии. Металлы, рассмотренные в настоящей i работе, очень различны по положению в Периодической системе элементов и по | свойствам. Поэтому для столь многофакторного свойства, как лектиновая активность, корректные сопоставления можно делать только в ряду близких по важнейшим характеристикам катионов металлов. Поэтому нами в этом плане рассмотрена триада железа, кобальта, никеля.

Вероятный механизм положительного влияния катионов металлов на лектиновую активность состоит в том, что они образуют смешаннолигандные комплексы с годроксильными группами лектинов и гликоконъюгатов, способствуя обратимому связыванию гликоконъюгатов лектинами. Из-за сходства электронной

конфигурации и электростатических предпосылок комплексообразования изучаемых катионов с кислородсодержащими лигандами есть основания полагать, что различия определяются термодинамикой реакций комплексообразования, прочностью связи металл - кислород Для проверки этого предположения мы провели квантовохимическое ab initio исследование термодинамики реакций гексааквокомплексов Fe(ll), Co(ll) и Ni{ll) с модельной системой - EG, типичным хелатообразующим реагентом и простым аналогом углеводов Оценивали тенденцию изменения значений полной энергии молекулярных систем в ряду металлов, а именно Е как аналог свободной энергии ( G) реакции без учета энтропии (корректность использования величины Е вместо G показана в тексте диссертации)

Ряд уменьшения склонности катионов к комплексообразованию с этиленгликолем Fe2+ > Со2+ » Ni2+, полученный из квантовохимических расчетов, согласуется с рядом уменьшения влияния этих катионов на лектиновую активность Fe2+ > Сог+ > Ni2+ При этом все величины Е положительны, что свидетельствует о несамопроизвольности, обратимости возможных процессов комплексообразования Катион металла не должен быть связан в прочный комплекс, и связывание лектина с гликоконъюгатом обратимо, что отражает важнейшую особенность взаимодействия пектинов с гликоконъюгатами

Наряду с описанным выше квантовохимическим ab initio исследованием термодинамики реакций гексааквокомплексов Fe(ll), Co(ll) и Ni(ll) с EG, мы провели экспериментальное исследование поведения моделируемой системы, определяли в динамике лектиновую активность КЖ L edodes в разных вариантах опыта

В качестве обобщения данной части работы следует сказать, что мы исследовали эффекты двухзарядных катионов металлов триады железа в составе жидкой синтетической среды культивирования, проявляющиеся в изменении активности внеклеточных пектинов L edodes, и попытались объяснить влияние катионов металлов на лектиновую активность с позиций квантовой химии Показано, что активность внеклеточных пектинов зависит от присутствия в среде культивирования двухзарядных катионов металлов триады железа Влияние Fe2+, Со2+, l\)i2+ на лектиновую активность изменяется симбатно с рассчитанными на уровнях теории UHF/3-2lG(d,p), MP2/3-21G(d,p)//UHF/3-21G(d,p) энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным лигандом EG Г ипотеза об обратимом связывании катионов металлов в непрочные смешаннолигандные комплексы с пектинами и гликоконъюгатами, разумно объясняющая различное влияние катионов металлов на лектиновую активность, получила квантовохимическое обоснование на примере трех металлов (Fe, Со, Ni)

Селен в органической Форме

Актуальность изучения влияния Se на физиолого-биохимические характеристики грибных культур и отсутствие соответствующей информации в отношении шиитаке (об этом можно судить при рассмотрении обзора литературы) дало нам основания к проведению описанных ниже исследований Мы использовали новое органическое соединение Se, обладающее преимуществами перед селенатами и селенитами натрия 1,5-Дифенил-3-селенпентандион-1,5 (препарат ДАФС-25) является одним из немногочисленных селеноорганических соединений, внедренных в практику [Древко и др , 2001]

Исследована зависимость пектиновой активности и ростовых характеристик L edodes от присутствия в жидких и агаризованных средах селенсодержащего компонента ДАФС-25 Наблюдается стимуляция процесса накопления биомассы при глубинном культивировании в присутствии селеновых добавок, относительно

быстрорастущий мицелий более подвержен позитивному влиянию препарата Выявлено положительное воздействие ДАФС-25 на ростовые показатели L edades на агаризованных средах, при этом максимальный эффект достигается в случае среды с наиболее низкой скоростью роста мицелия Под воздействием ДАФС-25 лектиновая активность как культуральной жидкости, так и мицелиальных смывов L edodes в наибольшей степени возрастает в случае синтетической среды, характеризующейся высокой активностью внеклеточных лектинов изучаемой культуры и сравнительно низкой лектиновой активностью смывов с мицелия в отсутствие ДАФС-25

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что селенсодержащий препарат ДАФС-25 в концентрации 104 г/л в пересчете на селен оказывает заметное действие на процессы жизнедеятельности L edodes, выраженное в изменении ростовых параметров и лектиновой активности культуры как на жидких, так и на агаризованных средах Селеновая добавка в наибольшей степени стимулирует рост и лектиновую активность шиитаке на синтетической агаризованной среде, арактеризующейся низкими значениями как ростовых показателей, так и лектиновой ктивности смывов с мицелия, в отсутствие ДАФС-25 Кроме того, под воздействием репарата возрастает лектиновая активность и на жидкой синтетической среде, арактеризующейся максимальными в нашем эксперименте титрами гемагглютинации равнительно низкая при отсутствии ДАФС-25 лектиновая активность или смывов с ицелия (как это имеет место в случае синтетической среды), или культуральной идкости (среда с дубовыми опилками) может, по-видимому, служить отчасти редпосылкой более выраженного стимулирующего эффекта ДАФС-25 в отношении ктивности внеклеточных лектинов культуры

Воздействие неблагоприятных факторов на лектиновую активность L. edodes

Одним из достаточно важных вопросов, который возникает при исследовании ффектов добавок различных компонентов к среде культивирования, является вопрос о ом, как повлияют условия "питательного стресса" (терминология в соответствии с аботой Е П Феофиловой (1994)) на изучаемую биологическую активность В ависимости от того, будет ли наблюдаться повышение активности внеклеточных ектинов при выращивании на неполноценных синтетических питательных средах, ожно было бы сделать предположение об участии лектинов в адаптации культуры к еблагоприятным факторам внешней среды

Идентифицированные внеклеточные соединения, участвующие в адаптации икроорганизмов к неблагоприятным условиям среды, по химической природе относятся разным типам Они представлены белками, углеводородами, органическими ислотами, нуклеотидами, аминокислотами, липопептидами, летучими соединениями Николаев, 2004) Однако большая часть таких соединений в настоящее время не дентифицирована Снижение уровня энергетического и конструктивного метаболизма и ыход из неповрежденных клеток компонентов внутриклеточного пула являются арактерными для защитных метаболических реакций (напр, [Андреев и др, 1988]) 1одуляции в лектиновой компоненте внеклеточных белков культуры L edodes, озможно, являются одним из механизмов, регулирующих метаболизм грибных клеток од влиянием внешних факторов Начальный подход к доказательству данного редположения осуществлен в настоящем разделе работы Нам не удалось найти ведений об изучении в подобном аспекте микологических культур

В качестве показателя "неблагоприятности" условий культивирования гриба мы спользовали ростовые характеристики (замедление роста мицелия на агаризованных редах) и изучали, будет ли наблюдаться повышение активности внеклеточных ектинов при выращивании на таких средах Представляло интерес исследовать ультуральную жидкость L edodes F-249 с тем же, как у агаризованных, составом

исходных жидких сред на присутствие внеклеточных лектинов Получены также данные по пектиновой активности культуральной жидкости L edodes F-249 при выращивании на жидкой среде с Glc В этом случае в качестве посевного материала служил мицелий, полученный на всех указанных выше агаризованных синтетических средах

В пользу высказанных выше предположений о стимулирующей роли неблагоприятных условий выращивания на пектиновую активность шиитаке свидетельствуют медленно растущие колонии на агаризованных средах разных составов, характеризующихся одновременно высокими титрами ГА, а также примеры обратной ситуации, то есть "быстрый рост - низкая лектиновая активность" Следовательно, результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что компоненты питательных сред, неблагоприятные для роста культуры, при определенных условиях стимулируют повышение лектиновой активности шиитаке Вполне вероятно, что постоянное присутствие внеклеточных лектинов Lentinus edodes, обнаруженное нами, - не препятствие для предварительного (требуется дальнейшее углубленное изучение) отнесения их к описанным протекторным белкам Здесь, опираясь на данные литературы по бактериальным внеклеточным факторам адаптации [Николаев, 2004], необходимо также учитывать, что факторы адаптации протекторного типа могут быть и, как правило, являются долгоживущими А сигнальные молекулы, молекулы-зонды, для которых изучена динамика их появления и исчезновения из культуральной жидкости, относительно короткоживущие, они быстро накапливаются в среде до активной концентрации и быстро элиминируются

Лектины шиитаке в процессах морфогенеза

Исследования, представленные в данном разделе, затрагивают такой малоизученный вопрос, как взаимосвязь процессов роста и развития грибного мицелия с синтезом соединений, способных регулировать включение той или иной морфогенетической программы К числу таких соединений безусловно относят и важнейшие компоненты химического состава мицелия - липиды и углеводы [Феофилова и др , 1994, 2000, Терешина и др , 2002] Предположение о том, что к числу таких соединений принадлежат грибные лектины, мы постараемся доказать далее Поэтому наряду с активностью лектинов шиитаке мы исследовали углеводный состав мицелия L edodes и жирнокислотный состав общих липидов на разных стадиях морфогенеза

Лектиновая активность L. edodes на разных стадиях формирования плодовых тел Особый интерес представляет обнаружение и изучение лектиновой активности культуры L edodes в процессе развития, проследив за изменениями этой активности на стадиях образования различных вегетативных структур, в том числе пигментированной мицелиальной пленки (МП) Исследования показали, что это образование представляет собой плотное сплетение толстостенных пигментированных гиф У L edodes МП обычно предшествуют образованию примордиев и далее плодовых тел [Гарибова и др , 1997]

Учитывая время появления МП и титры ГА мицелиальных смывов для этой вегетативной структуры, мы сделали вывод о том, что чем выше ТГА в смывах с мицелия, тем быстрее формируется МП, с более высокой при этом лектиновой активностью В экспериментах по получению плодовых тел на чашках Петри мы наблюдали, что в дальнейшем процессе морфогенеза и плодовые тела образуются лишь в случае МП с максимальной лектиновой активностью

При проведении экспериментов по определению лектиновой активности на различных стадиях морфогенеза (непигментированный мицелий, пигментированный мицелий, коричневая мицепиальная пленка, мицелиальная корка, примордии, незрелое плодовое тело, зрелое плодовое тело) нами было показано, что пектиновая активность различна на всех стадиях развития гриба ГА активность смывов с мицелия, примордиев, ножки плодового тела существенно ниже, чем в случае МП Важно отметить тот факт, что появление пигментированного мицелия, предшествующего образованию МП, не приводит к увеличению ГА активности Лишь формирование плотной коричневой МП дает резкое повышение титра ГА Можно предположить определенное значение лектинов на каждом этапе морфогенетического развития гриба, особенно на стадии образования МП Согласно имеющейся информации [Botton and Guillot, 1987, Richard, 1995], образование специализированных вегетативных структур в процессе роста грибов требует мицелиальной агрегации, и внеклеточные пектины могут участвовать в обеспечении сцепления между гифами [Kaneko et al, 1993]

Определение углеводных гаптенов для агглютининов различных вегетативных структур шиитаке позволило представить последовательность по возрастанию ингибирующей концентрации углевода D-Lac>D-Gal>D-GalN>D-GlcN>L-Rha, которая нарушается в единственном случае (плодовое тело, штамм F-249), когда Gal и Lac в приведенном ряду меняются местами

Формирование пигментированной мицелиальной пленки в глубинной культуре шиитаке в зависимости от активности внеклеточных лектинов

Итак, участие лектинов в формировании пигментированной мицелиальной пленки L edodes подтверждается рядом экспериментов, описанных выше Эти эксперименты были проведены в условиях твердофазного культивирования Возникает вопрос о существовании взаимосвязи лектиновой активности L edodes и морфогенетических процессов в условиях жидких питательных сред Каковы условия формирования МП в глубинной культуре, зависит ли образование этой морфогенетической структуры от активности внеклеточных лектинов7 Для выяснения этих вопросов впервые предприняты попытки получения МП на жидких синтетических средах, характеризующихся высокой лектиновой активностью

Суммируя результаты оптимизации состава среды выращивания в отношении лектиновой активности, описанные выше, можно заключить, что активность внеклеточных лектинов L edodes F-249 высока для сред с аминокислотным азотом (ТГА достигает значения 4096 при соотношении С N, равном 17 1) Однако появление МП наблюдалось только после 55-60 суток культивирования

Мы попытались получить МП L edodes F-249 с использованием ряда добавок к синтетической среде, в частности, солей Са, Mn(ll) CaCI22H20, MnCI24H20 Обнаружен положительный эффект катионов Са2+ (2-10 ммоль/л) или Мп2+ (0,5 - 2 мМ) В отсутствие аминокислотного источника азота не обнаружено влияния этих катионов на появление МП Среди изученных нами эссенциальных аминокислот выражен эффект Asn на процесс образования МП в жидкой среде культивирования То есть имеет место явный эффект одновременного присутствия двухзарядных катионов Са или Мп и Asn на процесс формирования МП в глубинной культуре

Естественно предположить, что Asn участвует в определенных биохимических процессах, медиированных ионами Са2+ и Мп2+ Но ограничено ли отличие Asn как компонента жидкой питательной среды только участием в химическом связывании в растворе7 Если это так, то по электронному строению молекулы Asn должен выделяться даже среди структурно близких аминокислот Известно, что углеводы

взаимодействуют с лектинами в том числе посредством образования множественных водородных связей, при этом амидный водород и карбонильный кислород Asn в структуре сайтов связывания часто включены в это белок-углеводное взаимодействие ["The Lectins ", 1986, Elgavish and Shaanan, 1997] К рассмотрению данной проблемы нами привлечены методы квантовой химии

Возникает предположение, что реакционным фрагментом аспарагина служит амидная группировка, однако вследствие сопряжения в амидной группе нуклеофильные свойства азота существенно понижены Наиболее вероятным центром связывания катиона металла является атом кислорода Это вытекает также из принципа жестких и мягких кислот и оснований [Pearson, 1990] предпочтительно взаимодействие жесткой кислоты Льюиса - катиона Са или Мп(П) с жестким реакционным центром - кислородным атомом Если реакционным фрагментом является СООН-группа, то связывание металла по кислородному атому не имеет альтернативы

Gin - ближайший структурный аналог Asn и единственная из исследованных нами аминокислот, помимо Asn, имеющая в своем составе группу СОЫНг Хотя молекула Gin отличается от Asn только одним метиленовым звеном, тем не менее Gin, в отличие от Asn, как компонент питательной среды не оказывает заметного влияния на формирование МП шиитаке Важно объяснить разное химическое поведение этих двух структурно аналогичных соединений Основываясь на вышесказанном, можно предположить, что различия в реакционной способности обусловлены различными зарядами на вероятных реакционных центрах

Ограниченным методом Хартри-Фока (RHF) [Кларк, 1990] нами произведены ab initio расчеты электронной структуры цвиттер-ионов Asn и Gin Заряды на атомах в изученных молекулярных системах служат квантовохимическим индексом, описывающим реакционную способность веществ в реакциях, управляемых электростатическими силами Жестко-жесткое взаимодействие аминокислота -катион Са2+ или Мп2+ как раз относится к такого рода процессам Получили, что зарядовые характеристики возможных реакционных центров обеих аминокислот очень близки между собой По-видимому, дифференциальный характер взаимодействия изученных аминокислот с катионами металлов не связан с различиями в электронном строении цвиттер-ионов

Для выявления других возможных факторов, влияющих на химическое поведение двух аминокислот при взаимодействии с катионами металлов, нами с помощью программного пакета HyperChem рассчитаны QSAR-свойства цвиттер-ионов Asn и Gin Результаты расчетов позволили сделать вывод, что, возможно, различие в реакционной способности двух цвиттер-ионов в некоторой степени связано с их дифференциальной гидрофобностью Asn как менее гидрофобный реактант имеет более прочную гидратную оболочку и поэтому связывает катион металла менее прочно, то есть обратимо Одной из причин высокой селективности к Asn по сравнению с Gin может являться пространственный фактор На основе таких критериев, как ван-дер-ваальсова поверхность и особенно объем молекулы, можно направленно искать подходящие по топологии фрагменты в структуре белка, основываясь на возможных будущих данных рентгеноструктурного анализа

Необычно высокое содержание Asn, обнаруженное нами при изучении аминокислотного состава пектина L2 (см выше), по меньшей мере не противоречит предположению о важности этой аминокислоты для пектинового биосинтеза На наш взгляд, несомненна активизация процессов формирования МП в глубинной культуре шиитаке с повышенной пектиновой активностью, и Asn способствует этой активизации

Следовательно, в данном разделе показана зависимость внеклеточной лектиновой активности L edodes F-249 от одновременного присутствия в синтетической жидкой среде культивирования Asn и двухзарядных катионов Са или Мп При этом наблюдается формирование МП в глубинной культуре в течение нескольких суток Результаты произведенных методом RHF/6-31G* ab initio расчетов электронной структуры цвиттер-ионов Asn и Gin не позволяют связывать дифференциальный характер взаимодействия изученных аминокислот с катионами металлов с различиями в электронном строении цвиттер-ионов Рассчитаные QSAR-свойства этих цвиттер-ионов свидетельствуют в пользу того, что различие в реакционной способности Asn и Gin в некоторой степени связано с их разной гидрофобностью Кроме того, полученные в настоящей работе данные не позволяют и ограничивать роль аспарагина на изучаемой стадии морфогенеза L edodes только участием в химическом связывании в жидкой среде выращивания По нашему мнению, аспарагин включен, возможно опосредованно, в биосинтетические процессы, одним из результатов которых является формирование МП культуры

Взаимосвязь углеводной специфичности пектинов и углеводного состава мицелия L edodes на разных стадиях морфогенеза Высказываются предположения об участии углеводов в индукции процесса плодообразования у грибов Смена стадий цитодифференцировки происходит под воздействием стрессовых факторов, что сопровождается изменением химического состава, структуры и функции клеток Для базидиальных грибов таким регулирующим фактором часто является температура, например, холодовой стресс индуцирует образование базидиом у L edodes [Терешина и др, 2002] Одна из важнейших ответных реакций клетки гриба на стресс - изменение углеводного состава, это может регулировать активность ферментов и влиять на развитие гриба

Известно в то же время, что морфогенетическая стадия коричневой мицелиальной пленки, предшествующая нормальному плодоношению шиитаке, обладает по результатам наших экспериментов высокой лектиновой активностью Процесс формирования неполноценных плодовых тел на непигментированном мицелии, минуя стадию образования МП, практически не изучен, в частности, ничего не известно о пектиновых комплексах и изменениях углеводного состава неполноценных базидиом Использованный в настоящем исследовании подход позволяет судить об особенностях углеводного состава и лектиновой активности, проявляющихся в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел, о корреляциях состава углеводного компонента мицелия и углеводной специфичности пектинов Кроме того, он дает возможность выявить характерные признаки, сопутствующие образованию плодовых тел, вне зависимости от их морфологии, условий формирования и стадии жизненного цикла культуры

В данной части наших исследований мы поставили задачу выявления взаимосвязи углеводного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры Для этого состав углеводной фракции L edodes изучали на разных этапах развития культуры белый мицелий, слабопигментированный мицелий, МП, плодовое тело Обнаружили изменения углеводного состава L edodes на разных стадиях морфогенеза

Углеводный состав МП отличается от такового не только плодовых тел и белого мицелия, но и слабопигментированного мицелия - стадии, предшествующей формированию собственно мицелиальной пленки Для сравнения изучен также состав углеводной фракции на разных стадиях развития мицелия двух других

штаммов культуры - 2Т и NY Выбор указанных штаммов в качестве объектов исследования обусловлен существованием разделенных во времени явлений плодоношения и формирования коричневой пленки, при этом на белом мицелии появляются немногочисленные деформированные, «неполноценные» плодовые тела, а затем, после формирования пленки, происходит обычное, с точки зрения геометрических характеристик плодовых тел и урожайности, плодоношение

Изучено относительное содержание углеводов, к которым специфичны лектины L edodes Содержание Lac у штамма F-249 максимально в МП и не обнаруживается в базидиомах Соотношение относительных величин содержания Lac в МП и слабопигментированном мицелии составило 44 1 соответственно В случае двух других штаммов культуры - 2Т и NY оказалось, что на стадии белого мицелия штамма 2Т, приводящей к формированию неполноценных плодовых тел, повышено содержание Gal, не обнаруживаемой настоящим методом на других стадиях Состав деформированных базидиом, образующихся первоначально на белом мицелии штамма NY, характеризуется относительно высоким содержанием Lac, также не найденной в наших экспериментах в непигментированном мицелии Для обоих углеводов соотношение примерно 40 1 в сравнении с другими стадиями каждого штамма

Определено содержание углевода, к которому специфичны лектины только плодовых тел всех изученных штаммов - D-Mal Минимальные ингибирующие концентрации ее достаточно невысоки и составляют 8,33 - 16,7 мМ В случае штамма F-249 этот дисахарид присутствует в белом мицелии, в значительных количествах накапливается в пигментированном мицелии, расходуется на стадии МП и вновь появляется в базидиомах в соотношении на указанных стадиях 14:5 5-1, соответственно В случаях формирования плодовых тел без коричневой пленки (штаммы 2Т и NY) Mal не обнаруживается ни в составе неполноценных плодовых тел, ни на стадиях, предшествующих плодоношению

Количество Rha, к которой углеводная специфичность лектинов относительно низка, при плодоношении без МП возрастает одновременно с Lac и Gal, углеводная специфичность к которым проявляется в гораздо большей степени При формировании базидиом L edodes F-249 Rha обнаруживается лишь на стадиях, когда содержание Lac наименьшее или она отсутствует Таким образом, в коричневой пленке накапливается только углевод, характеризующийся наибольшим «сродством» к пектинам культуры

При рассмотрении особенностей углеводного состава мицелия шиитаке в случае плодоношения на МП обращают на себя внимание выраженные количественные изменения D-ManOH и D-Ino в зависимости от стадии морфогенеза Содержание МапОН в белом мицелии, пигментированном мицелии, МП и плодовом теле соотносится как 714 55 1 56 соответственно Содержание же Ino наиболее низко в белом мицелии и резко возрастает в пигментированном в соотношении примерно 1 39 То есть МапОН накапливается, a Ino, наоборот, присутствует в минимальных количествах в белом мицелии перед плодоношением Интересно, что те же изменения в химическом составе мицелия происходят под влиянием низкотемпературного стресса [Феофилова и др , 1994]

Таким образом, углеводная специфичность лектинов L edodes при твердофазном культивировании в наибольшей степени проявляется к углеводам, обнаруживаемым на стадии коричневой пленки Наблюдаются различия углеводного состава (количества Mal, Rha, МапОН и Ino) при нормальном плодоношении культуры и при образовании деформированных базидиом на непигментированном мицелии Такие данные, как увеличение пектиновой активности и содержания углеводов, к которым специфичны лектины культуры, на фоне роста количества МапОН и

снижения уровня Ino перед плодоношением, представляются нам еще одним свидетельством в пользу предположения об участии пектинов в индукции процесса плодообразования

Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности L. edodes в процессе морфогенеза

Во введении к предыдущему разделу уже упоминалось о крайне малой изученности процесса формирования неполноценных плодовых тел на непигментированном мицелии, минуя стадию образования МП В частности, ничего не известно о пектиновых комплексах и липидах неполноценных базидиом При выборе объектов исследования в обсуждаемой части работы мы использовали штамм L edodes, характеризующийся «классическим» развитием плодовых тел на пигментированной мицелиальной пленке, а также штаммы, образующие деформированные плодовые тела на стадии белого мицелия, а затем, после формирования МП, приступающие к обычному для данного вида плодоношению Подобный подход позволяет судить об особенностях жирнокислотного состава и лектиновой активности, проявляющихся в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел

Широким набором сведений о функциональной и метаболической взаимосвязи пектинов и липидов мы пока не располагаем Однако хорошо известно, что гидрофобные участки молекул пектинов и гидрофобные взаимодействия чрезвычайно важны для функционирования этих белков То есть усиление гидрофобности посредством образования более или менее устойчивых ассоциатов лектинов с такими соединениями, как ЖК, образующиеся после гидролиза нейтральных липидов, может влиять на биосинтез и/или активность лектинов Задача настоящей части работы - выявление изменений ЖК состава общих липидов и активности лектинов, происходящих по мере развития шиитаке

Обнаружены изменения ЖК состава общих липидов мицелия L edodes на разных стадиях морфогенеза На примере штамма F-249 показано, что по мере развития вегетативного мицелия происходит постепенное снижение ненасыщенности (за счет С18 1 и С22 1 кислот, а также увеличение относительного содержания короткоцелочечных ЖК На стадии образования плодовых тел отмечается заметное увеличение уровня ненасыщенных ЖК (в основном за счет С221 и С241) и исчезновение ЖК с короткими цепями Резкие изменения относительного содержания короткоцепочечных ЖК могут быть связаны с температурой культивирования шиитаке (развитие белого мицелия происходило при 26°С, пигментация и образование МП при 4°С, развитие плодовых тел при 18°С) Ранее отмечалось, что у базидиальных грибов, выращенных при низких температурах, наблюдается укорачивание ацильных цепей ЖК липидов [Феофилова и др , 2000]

Достаточно высокая для базидиальных грибов концентрация пальмитиновой кислоты отличает L edodes от других ксилотрофов [Феофилова и др , 1998] Появление пигментации мицелия и затем МП у L edodes F-249 коррелирует с заметным (в 1,7 раза) увеличением уровня С16 0 У штамма NY высокая концентрация пальмитиновой кислоты (около 40% от суммы ЖК) отмечается на стадии белого мицелия, у 2Т - на стадии образования плодовых тел

Значительное содержание линолевой кислоты (С18 2) отмечается как общая закономерность при изучении ЖК состава общих липидов грибов разных трофических групп В нашем эксперименте у штамма F-249 каких-либо колебаний относительного содержания линолевой кислоты при переходе от белого мицелия к стадии МП, а затем к базидиомам, отмечено не было Другая картина наблюдалась у L edodes NY содержание С18 2 перед плодоношением в 3 раза превышало

соответствующую величину для плодовых тел При этом у штамма 2Т относительное содержание этой ЖК оставалось практически неизменным Таким образом, изменения уровня линолевой кислоты в процессе морфогенеза изученных культур L edodes нельзя однозначно связать с типом плодоношения и с наличием стадии МП

Появление ненасыщенных длинноцепочечных ЖК в базидиомах Pleurotus ostreatus и Agaricus bisporus связывают с «Холодовым шоком», который является необходимым триггером образования плодовых тел [Феофилова и др , 2000] В то же время отмечена корреляция между появлением МП на поверхности зрелого мицелия L edodes и началом плодообразования [Александрова и др , 1998] С этих позиций объяснимо возрастание относительного содержания длинноцепочечных моноеновых ЖК в плодовом теле по сравнению с белым мицелием в случае плодоношения L edodes F-249 на МП Однако эта закономерность не прослеживалась при формировании неполноценных плодовых тел у штаммов 2Т и NY Плодообразование у этих штаммов сопровождалось резким увеличением концентрации ЖК с нечетным количеством атомов углерода, в том числе С17 0 у NY и С15 0 у 2Т Данный факт требует, на наш взгляд, дальнейшего изучения

На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие МП Лектиновая активность на стадии неполноценных плодовых тел остается относительно высокой, по величине ТГА соответствует примордиям при нормальном плодоношении и существенно превышает рассматриваемые показатели для зрелого плодового тела В отличие от плодовых тел, развивающихся на МП, образование деформированных базидиом на белом мицелии не сопровождается увеличением степени ненасыщенности ЖК Вместе с тем, их формирование коррелирует с увеличением процентного содержания ЖК с нечетным количеством атомов углерода, а также, вероятно, уменьшением активности реакций элонгации, что выразилось в снижении относительного содержания (штамм NY) или полной редукции (штамм 2Т) длинноцепочечных ЖК По-видимому, совокупность указанных характеристик могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе плодообразования Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза

В целом по результатам, описанным в разделе, посвященном участию пектинов шиитаке в морфогенетических процессах, можно прийти к таким заключениям Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных пектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам Вероятно, пектины Lentmus edodes участвуют в процессе инициации плодообразования

Лектины шиитаке при взаимодействии с экзогенными соединениями

Взаимодействие пектинов с органическими селенсодержащими веществами

Влияние селенсодержащих соединений на активность внеклеточных пектинов L edodes

Литературные данные свидетельствуют о непосредственном активном участии микроэлемента селена в биохимических и физиологических процессах Однако отмечается отсутствие достаточно обоснованных сведений о биохимических механизмах действия селена, особенно селенорганических соединений [Whanger, 2002] Отсутствует какая-либо информация о взаимодействиях селенорганических веществ, рассматриваемых в нашей работе или им структурно подобных, - не только с пектинами, но и с белками вообще В связи с вышесказанным нами была поставлена задача изучения активности внеклеточных пектинов L edodes при различных условиях взаимодействия препаратов пектинов с некоторыми соединениями Se Получение данных по влиянию селеноорганического вещества ДАФС-25, представителя ряда 1,5-и(4-П-фенил)-3-селенпентандионов-1,5, на пектиновую активность культуры (см раздел выше) позволило нам перейти к следующему шагу работы, уже с препаратами внеклеточных лектинов культуры

В ходе экспериментальных и теоретических исследований, описанных в настоящем разделе, помимо препарата ДАФС-25, рассмотрены и другие органические соединения селена (табл 2)

Таблица 2 Селенсодержащие соединения, рассмотренные в настоящей работе

Номер Название R

I 1,5-Дифенил-3-селенпентандион-1,5 Н

II 1,5-Ди(4-метоксифенил)-3-селенпентандион-1,5 ОСН,

III 1,5-Ди(4-этоксифенил)-3-селенпентандион-1,5 OC2Hs

IV 1,5-Ди(4-н-октилоксифенил)-3-селенпентандион-1,5 *-осхн,7

На основании экспериментов с ДАФС-25 предполагались интересные результаты пределения изучаемой биологической активности в реакционных смесях с ыделенными из КЖ и очищенными лектинами При этом можно ожидать, что структура еленсодержащего компонента реакционных смесей, как и его концентрация, окажут начительное влияние на лектиновую активность препарата белка, и что активность ¡родуктов взаимодействия лектина с селенорганическим соединением будет различной зависимости и от стадии очистки белка после его первоначального выделения из интетической среды выращивания гриба Все вышесказанное привело нас к выбору оединений - производных изученного нами ранее 1,5-дифенил-3-селенпентандиона-1,5 табл 2) и препаратов двух лектинов (L1 и L2) на трех основных стадиях очистки каждого »елка, описанных в соответствующем разделе В результате "белковых объектов" получили шесть, условно обозначив их для целей настоящей работы следующим )бразом в последовательности увеличения степени чистоты препарата белка 1, 3, 5 оответствовали L1, а 2, 4, 6 - лектину L2

В качестве растворителя для соединений ряда 1,5-ди(4-Р-фенил)-3-,еленпентандионов-1,5 выбрали смешанный растворитель ДМСО Н20 (4 1, v/v) Растворы селенорганических соединений I, III, IV в ДМСО использовали в таких максимальных концентрациях (С1), при которых собственная ГА активность ни ДМСО, и I, III, IV не проявлялась, это также дополнительно контролировалось реакцией емагглютинации I, III, IV в выбранных концентрациях С1, С2, СЗ Минимальная из

трех величина СЗ равна концентрации соединения I (ДАФС-25) в наших более ранних исследованиях пектиновой активности КЖ, а С2 занимала промежуточное положение.

Изменение характеристик взаимодействия пектинов с селенорганическими

соединениями в зависимости от стадии очистки препарата лектина

Стадия очистки препарата лектина оказывает наибольшее (если сравнивать с такими характеристиками, как концентрация I, III, IV) влияние на дифференциальный характер взаимодействия внеклеточных пектинов с селеноорганическими соединениями.

Так, в случае вещества I при одной и той же концентрации С1 селенсодержащего соединения титр гемагглютинации меняется от 64 до 1024, возрастая по мере степени чистоты препарата лектина L2, и почти так же резко снижается (от 1024 до 128 при СЗ) по мере очистки L1 Препарат ДАФС-25, таким образом, в гораздо большей степени повышает лектиновую активность очищенного L2, чем L1, однако для этого требуются относительно высокие концентрации селенового соединения (50 мг/л Se).

Заметно выражено "сродство" препарата 1 (неочищенного L1) к соединению III, причем и при самой высокой, и при самой низкой концентрации указанного соединения титр гемагглютинации очень высок (512 и 2048 соответственно). Однако по мере очистки лектина 1 титр ГА в присутствии тех же концентраций этокси-производного (вещество III) становится равным 64. Наоборот, очищенный препарат лектина 2 значительно повышает свою ГА активность при взаимодействии с III (до величины ТГА, равной 512 - заметим, до того же значения, что и неочищенный L1). И снова для этого требуются высокие концентрации (С1) селенового производного III. Самая низкая концентрация и ДАФС-25 (как только что говорилось), и вещества III нисколько не эффективны в отношении стимулирования пектиновой активности очищенного L2: титры ГА 16 и 8 соответственно по сравнению с величиной 32 в отсутствие селенорганических соединений. Не оказывает ингибирующего действия только вещество IV: титр ГА минимум 32, достигает 512 для обоих пектинов после первой стадии очистки. В то же время для IV менее всего из селенорганических соединений выражена зависимость его влияния на лектиновую активность от стадии очистки препарата. Это вещество достаточно индифферентно в отношении наличия примесей в препаратах пектинов 1-6, зато наблюдается оптимальная в обсуждаемом аспекте концентрация IV, когда титр ГА равен 512 независимо от степени чистоты пектинов (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость лектиновой активности от стадии очистки препаратов лектинов при концентрации селенорганических соединений С2 = 6.33 моль/л (5 мг/л Se). 1,3,5-11; 2, 4, 6 -L2 на трех стадиях очистки

Подобная неспецифичность взаимодействия н-октилокси-производного (вещество IV) с пектинами при наличии явно выраженной концентрационной зависимости реактанта привели нас к мысли о каком-то едином химизме этих процессов, возможно, гидрофобных взаимодействиях с октильным радикалом.

Изменение характеристик взаимодействия пектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от концентрации селенсодержащих соединений

Зависимость пектиновой активности обоих исследуемых белков на всех трех стадиях их очистки от концентрации селенорганического соединений проходит через максимум лишь в единственном случае соединения IV (рис. 5). Признать возможность мицеллообразования в реакционной среде в данном случае вряд ли правомерно, поскольку после достижения критической концентрации мицеллообразования, ККМ, i эффективность взаимодействия, отражаемая параметром ТГА в нашем эксперименте, должна оставаться на постоянном уровне при увеличении концентрации IV. Мы этого не наблюдаем, но тем не менее считаем очень вероятным, что вещество IV, содержащее н-октильный заместитель, более способно к мицеллообразованию по сравнению с I или III. Необходимы специальные исследования с определением ККМ. Наиболее очевиден тот факт, что явная гидрофобность соединения IV по сравнению с остальными изученными селеновыми веществами вносит существенный вклад во I взаимодействие с пектинами L. edodes. Соединение IV положительно влияет на активность пектинов и L1, и L2, этот аспект мы обсуждаем также в следующем разделе.

Рис. 5. Зависимость лектиновой активности препаратов лектинов

I(13,5-11; 2,4, 6-L2

на трех стадиях очистки) от концентрации в-ва IV: !С 1=6.33 1(Г4 моль/л

(50 мг/л Se) С2 = 6.33 I (Г4 моль/л (5 мг/л Se) С3=6.33 10"(> моль/л (0.5 мг/л Se)

Квантовохимические и QSAR свойства селенсодержащих соединений ряда 1,5-ди(4-Й-фенил)-3-селенпентандионов-1,5

Электронное и пространственное строение изучаемых селенорганических соединений, их QSAR свойства могут служить предпосылкой наблюдаемого нами j химического поведения этих соединений в процессах их взаимодействия с пектинами L. edodes. По данным расчетов на уровне теории B3LYP/6-31G(d,p), позволивших судить о некоторых пространственных параметрах и зарядах на атомах молекул селенсодержащих соединений, электронные и топологические характеристики молекул I-III очень близки между собой. Следовательно, различие во влиянии веществ на ГА способность определяется не остовом молекул (включающим атом Se ' и фрагмент СН2СОАг), а заместителем в положении 4 ароматического кольца (Н, ОСН3, OC2H5 и н-OC8Hi7 в случае соединений I, II, III и IV соответственно). При этом положительный заряд на атоме селена свидетельствует о том, что в процессах, в

которых селен проявляет себя как антиоксидант, он является злектрофильным центром и может взаимодействовать с электроноизбыточными частицами, например молекулами кислорода 02, пероксида водорода Н202, супероксидным анион-радикалом Ог', тиолами RSH и др [Blessing et al, 2004, Jacob et al, 1999] Примечательная особенность селена состоит в его способности окислять тиолы в восстанавливающих условиях [Turan et al, 1997, Ganther, 1999, Jacob et al, 2003, Blessing et al, 2004]

На окислении тиолов следует остановиться особо К числу общих свойств лектинов относится в том числе стабилизация углеводсвязывающих участков дисульфидными мостиками То есть дополнительное образование -S-S- в молекулах исследуемых лектинов вполне может способствовать усилению способности последних к взаимодействию с углеводными структурами эритроцитов, иными словами - увеличению титров ГА

Для выявления других возможных факторов, влияющих на химическое поведение селенорганических соединений при взаимодействии с пектинами, нами рассчитаны QSAR-свойства [Hasel et al, 1988, Still et al, 1990, Bodor et al, 1989, Gavezotti, 1983, Ghose and Crippen, 1986, 1987, Viswanadhan et al, 1989, Miller, 1990, Ghose et al, 1988] молекул l-IV

Возможно, различие в реакционной способности селенсодержащих молекул в некоторой степени связано с их дифференциальной гидрофобностью

Из общих свойств лектинов разного происхождения следует, что углеводы взаимодействуют с пектинами посредством водородных связей, координирования металлов, ван-дер-ваальсовых, гидрофобных взаимодействий [Elagavish and Shaanan, 1997] Несмотря на преобладающе гидрофильный характер углеводов, гидрофобные взаимодействия играют важную роль в их распознавании лектинами Особенно примечательно взаимодействие между ароматическими фрагментами аминокислот и галактозой в углеводсвязывающих участках галактозоспецифических лектинов, что приписывается взаимодействию между частично заряженными алифатическими протонами на поверхности кольца гексозы и частичным отрицательным зарядом я-электронов ароматической системы [Elagavish and Shaanan, 1997] Отметим, что L1 и L2 галактозоспецифичны

Участки гидрофобного связывания вообще очень характерны для лектинов К ним относят и липидсвязывающие участки, хорошо изученные в случае бактериальных лектинов (адгезинов и токсинов) [Лахтин, 1989] На примере некоторых бактериальных и вирусных лектинов показано, что липидсвязывающие участки характеризуются выраженными гидрофобными свойствами Кроме того, можно предположить и особую роль ароматического кольца в структуре исследованных нами селенорганических соединений, наличие этого кольца могло бы оказать дополнительный положительный эффект в отношении углеводсвязывающих свойств лектинов L edodes Так, на примере лектинов бобовых показано, что гидрофобные пептиды в составе гидрофобной полости на поверхности пектиновых молекул участвуют во взаимодействии с фенильными и метильными производными сахаридов, поскольку такие пептиды располагаются в непосредственной близости от углеводсвязывающих участков [Лахтин, 1994, Луцик и ДР, 1981]

Если согласно [Лахтин, 1994, Луцик и др, 1981] принять ключевую роль ароматических фрагментов молекул I-IV в связывании с лектинами, то ясно, что остальная часть молекулы по-разному, из очевидных пространственных соображений, влияет на "арил-лектиновое" взаимодействие с результирующим разным титром гемагглютинации реакционной смеси Вероятно, значительное увеличение длины углеводородной цепи в н-октилпроизводном (IV) может отчасти экранировать участвующий во взаимодействии с гликоконъюгатами эритроцитов

арильный участок молекулы IV Этому способствует гидрофобное взаимодействие, стремящееся уменьшить поверхность контакта между гидрофобной частью молекулы (ароматическим фрагментом и углеводородной цепью) и водой При этом алкильная цепь может стерически экранировать ароматическое кольцо, препятствуя тем самым взаимодействию с лектином

Сравнительный анализ реакционной способности ¿.-цистеина и L-метионина некоторые теоретические предпосылки замещения атома серы на селен

Cys и Met - единственные аминокислоты в белках, которые претерпевают обратимое окисление/восстановление в биологических условиях Окисление серусодержащих боковых цепей Cys и Met кислородными агентами может приводить к окислительным состояниям серы, не способным восстанавливаться в биологических условиях То есть нужны такие механизмы окисления, которые защищают против переокисления эти кислотные остатки и предотвращают необратимую потерю активности белка В работе [Jones et al, 2004] показано, что редокс-потенциал стационарного состояния цистеин/цистиновой пары позволяет обепечить мягкое окисление белков без прямого участия более сильных окислителей

С биохимической точки зрения Se замещает S в определенных цистеиновых фрагментах селенопротеинов Он отличается от серы редокс-потенциалами и стабильностью в разных степенях окисления, что приводит к множественным каталитическим процессам с его участием [Jacob eta!, 1999, Blessing etal, 2004]

Анализ литературы позволяет прийти к выводу, что наиболее вероятный химизм взаимодействия соединений Se с белками (в том числе пектинами) состоит в образовании связей разной прочности с серусодержащими аминокислотами лектинов, вплоть до, возможно, полного замещения серы на селен Оба пектина L1 и L2 имеют в своем составе заметные количества серусодержащих аминокислот, цистеина и метионина Представляет интерес рассмотреть эту проблему химизма более подробно, проведя сравнительный анализ реакционной способности L-Cys и /.-Met и обсудив некоторые теоретические предпосылки замещения атома серы на селен Задача сравнительного исследования Met и Cys интересна и в следующем аспекте

В живых организмах селен обнаружен в составе нескольких индивидуальных соединений, но одной из основных форм существования органического селена в растительных и грибных тканях является селенометионин (SeMet) [Whanger, 2002] Так, SeMet - преобладающее селенсодержащее соединение обогащенных селеном дрожжей при стандартизированных условиях выращивания дрожжевых культур около 85% селена содержится в них в виде SeMet [lp et al, 2000] Культура пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae способна ассимилировать до 3 мг/г биомассы Se [Demirci, 1999], при этом более 90% общего Se находится в форме SeMet, а селеноцистеина (SeCys) лишь 0 5% [Schrauzer, 1998, Schrauzer, 2000] Та же картина наблюдается у высших съедобных грибов - культивируемых базидиомицетов, в том числе наиболее интересующего нас объекта исследований L edodes Судя по результатам работ [Yoshida et al, 2005, Ogra et al, 2004], в культуре шиитаке, выращенной на обогащенном селенитом натрия субстрате, основное соединение - SeMet, связанный с белком

Таким образом, налицо явное "предпочтение" грибными культурами разных систематических групп именно органической формы селена в виде SeMet Задача, поставленная в данном разделе работы - сравнительное квантовохимическое исследование электронного строения молекул и реакционной способности двух

серусодержащих эссенциальных аминокислот - L-Cys и L-Met на начальном этапе взаимодействия с электрофильными реагентами для выяснения предпосылок замещения атома серы на селен именно в молекуле L-Met Результативным оказался следующий подход

i) использовали выявленные нами электрофильные свойства атома селена в селенорганических соединениях I-IV как исходное положение, позволяющее предположить возможность "облегченной" димеризации аминокислот в составе белковой молекулы пектина L edodes Это привело к постановке задачи по теоретическому рассмотрению влияния селенсодержащих соединений на формирование дополнительных дисульфидных связей в молекуле пектина Тиольная группа аминокислоты служит реакционным центром биохимически важных процессов - окислительной димеризации с формированием дисульфидных мостиков [Jacob et al, 1999, 2004, Giles et al, 2003b, Jones et al, 2004], замещения атома серы на селен [Moroder, 2005] и др Указанные процессы важны для проявления биологической активности определенных классов белков, в том числе пектинов Как отмечалось в разделе 3 5 1-4, к числу общих свойств углеводсвязывающих белков относится стабилизация сайтов связывания углеводов дисульфидными мостиками,

Ii) под влиянием селенсодержащих соединений происходит процесс не только димеризации серусодержащих аминокислот с формированием дополнительных дисульфидных мостиков в белковой молекуле, но и образования селенсодержащих аналогов, SeCys и SeMet, известны и смешанные аналоги Однако подобные модификации аминокислот, судя по данным литературы, выражены в различной степени у Cys и Met Для выявления некоторых возможных причин этого мы поставили задачу теоретического рассмотрения полной замены серы на селен с образованием селензамещенных аминокислот В целом результаты настоящей части работы (электронное строение, поляризуемость, дипольные моменты, липофильность) косвенно подтверждают большую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах усвоения последнего по сравнению с Cys

Положительное влияние изученных селенорганических соединений на активность внеклеточных пектинов необходимо рассматривать в совокупности с таким аспектом, как функционирование системы антиоксидантной защиты (АОЗ) грибов Об антиоксидантных свойствах селеновых соединений в связи с их влиянием на активность пектинов упоминалось выше (раздел 3 5 14) Влияние цистеиновых фрагментов белковой молекулы на биологическую активность и, в частности, на белок-углеводные взаимодействия, предполагающее возможность обратимого окисления-восстановления цистеина в биологических условиях, требует благоприятствующих условий химического окружения и состояния тиольной группы Вероятно, первоначальный акт взаимодействия в системе "соединение селена - а-аминокислота", включающий взаимную ориентацию молекул реактантов и образование межмолекулярных водородных связей, служит предпосылкой того, что тиольная группа оказывается способной принимать участие в последующих стадиях (включающих более глубокие химические превращения) биологически значимых реакций

Увеличение внутриклеточного уровня активных форм кислорода сопряжено с гипероксидантным состоянием клетки, предшествующим процессу клеточной цитодифференцировки [напр , Гесслер и др , 2006] Неизбежно возникающие в клетке под действием внутренних и внешних факторов активные формы кислорода с одной стороны являются сигнальными молекулами, запускающими механизмы дифференцировки, а с другой стороны они создают необходимость присутствия в клетке системы АОЗ Защита биологических молекул осуществляется не только ферментами, но и низкомолекулярными соединениями различной химической

природы, вступающими в реакцию с активными формами кислорода Существенную роль в защите клетки от окислительного стресса играют тиоловые соединения Накапливаются данные о том, что многие тиолсодержащие белки, локализованные на клеточной поверхности и в экстраклеточной жидкости, могут подвергаться редокс-превращениям, откликаясь на изменение редокс-статуса клеточного окружения [Октябрьский и Смирнова,2007]

Поддержание SH-групп в восстановленном состоянии и образование дисульфидных мостиков в молекуле белка - противоположно направленные реакции при взаимодействии препаратов внеклеточных пектинов с изученными селеноорганическими соединениями Здесь играет роль соотношение процессов с одной стороны - стабилизации структуры пектиновых молекул (S=S мостиками), активность которых при этом возрастает (в практическом плане это важно, как нами показано в разделе 3 4, на репродуктивных стадиях развития грибной культуры, особенно в коричневой мицелиальной пленке) С другой стороны - увеличение числа восстановленных тиоловых групп под влиянием антиоксидантных свойств соединений селена способно поддержать АОЗ, важную при окислительном стрессе, сопровождающем смену фаз развития мицелия [напр , Белозерская и Гесслер, 2006]

Ввиду такой неоднородности влияния селенсодержащих веществ неудивительно, что степень проявления эффекта изученных селенорганических соединений на активность лектинов L edodes различна и зависит не только от природы селенового производного, но и от его концентрации, от содержания примесей в препаратах лектинов (т е от стадии их очистки) Тонкий баланс между окислительными и восстановительными молекулами, поддержание экстраклеточного тиол-дисульфидного статуса является важным инструментом регуляции биологической активности, передачи клеточных сигналов, дифференциации [цит по Октябрьский и Смирнова, 2007]

Взаимодействие лектинов с катионами меди (II)

Хотя медь и является необходимым элементом питания (см обзор литературы в диссертации), она вызывает окислительный стресс в результате образования свободных радикалов в реакциях Габера-Вайса и Фентона [Halliwell and Gutteridge, 1984, Деви и Прасад, 2005] В условиях индуцированного металлом окислительного стресса время жизни образовавшихся активных форм кислорода и их токсическое действие контролируются системой актиоксидантной защиты клетки, т е соответствующими метаболитами [Mazhoudi eta1, 1997, Noctor and Foyer, 1998]

В заключение предыдущего раздела мы уже говорили об известном явлении взаимозависимости окислительного стресса, цитодифференцировки и перехода к репродуктивной стадии развития грибного мицелия, необходимости при этом усиления АОЗ и предполагаемой нами вовлеченности в эти процессы лектинов в связи с их взаимодействием с селенорганическими соединениями Последние проявляют себя как антиоксиданты и, по всей видимости, при участии лектинов L edodes могли бы усиливать АОЗ Интересно выявить результаты взаимодействия лектинов с эффектором противоположного свойства, то есть способствующим углублению окислительного стресса и активизации тех вторичных метаболитов гриба (мы полагаем, и лектинов см раздел 3 4 диссертации), которые принимают участие в развитии последствий этого стресса, в конечном итоге в формировании признаков генеративной стадии развития мицелия Еще раз в ином аспекте подойти к рассмотрению описанной проблемы помогает, на наш взгляд, изучение взаимодействия меди (II) с пектинами шиитаке

В ряду катионов, представленных выше как последовательность в порядке уменьшения положительного эффекта катионов металлов(П) на активность внеклеточных лектинов шиитаке (Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>Ni) нас прежде всего заинтересовала медь(Н) Было обнаружено, что лишь в случае меди имеет место зависимость "лектиновая активность-концентрация катиона", противоположная наблюдаемой для других металлов в настоящей работе наибольшая активность внеклеточных лектинов проявлялась на среде с максимальным содержанием меди Можно сформулировать несколько предположений о причинах и последствиях подобного эффекта меди(П)

- добавки ионов меди приводят к усилению биосинтеза внеклеточных лектинов L edodes, при этом в неодинаковой степени для L1 и L2 Возможно также, что в присутствии Си2+ имеет место накопление внеклеточных неактивных по гемагглютинации лектинов (например, связанных с металлом в комплекс или неактивных из-за токсического действия металла на грибную культуру) В этом случае удельная лектиновая активность (титр ГА/белок) не должна возрастать, она сохраняется или даже снижается из-за увеличения массы белка,

- значительно повышается активность экстрацеллюлярных лектинов, а прирост белковой массы "отстает" - происходит в гораздо меньшей степени Тогда удельная лектиновая активность заметно возрастает Сопровождаться такой эффект мог бы активным взаимодействием Cu(ll) с внеклеточными лектинами в культуральной жидкости L edodes Если бы к тому же катионы меди проявляли "предпочтение" в отношении одного из лектинов, продукция и/или увеличение активности которого стимулируется ионами меди, - это могло бы способствовать дифференциации белков КЖ и иметь положительные последствия для процесса предварительного разделения компонентов КЖ с целью дальнейшей очистки лектинов Ниже приводим экспериментальное подтверждение своих предположений

Более подробное исследование в динамике внеклеточной лектиновой активности шиитаке при выращивании на синтетических средах с разными концентрациями Си2+ (в интервале концентраций катиона от 2 10 4 до 1 10" моль/л) проводили, определяя удельную лектиновую активность, достигаемую в КЖ при используемых концентрациях компонентов среды Наилучший результат получался при концентрации ионов меди (II) в синтетической среде культивирования L edodes - 1 мМ, D-глюкозы - 300 мМ по углероду, L-аспарагина - 20 мМ по азоту При возрасте глубинной культуры 14 сут достигалось более чем 8-кратное увеличение удельной лектиновой активности при указанной концентрации Си2+ по сравнению с более низкими концентрациями меди из приведенного выше интервала значений Оптимальная концентрация ионов Cu(ll) в среде культивирования L edodes составляет 1 103 моль/л, при этом удельчая лектиновая активность на 14-е сут культивирования более чем в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте

Далее мы подтвердили, что ион меди образует с лектинами комплексы, отличающиеся по хроматографическим свойствам К питательной среде (состоящей из Glc (510"2 М) и Asn (1 10" М), характеризующейся по нашим данным высокой активностью внеклеточных лектинов L edodes, был добавлен C11SO4 5НгО до концентрации 10~2 - 10"4 М Далее спустя 14 сут выращивания грибной культуры получали фильтрат КЖ и проводили осаждение ацетоном Более полно произошло осаждение (осадка получилось больше), была обнаружена третья фаза примесных соединений меди, нерастворимая в смесях вода - ацетон Гель-хроматограммы реакционных смесей были получены для разных концентраций Сиг+, возрастающих от 2104 М до 1 10~2 М Степень осаждения искомого белка оказалась значительно увеличенной (судя по поглощению при 280 нм, в 7,5 раз по сравнению с контролем в случае 1 102 М Си2+)

Продукты разделения (на Sephadex G-25) фильтрата КЖ L edodes (выращенного в присутствии сульфата меди указанных выше концентраций), осажденного ацетоном и растворенного в воде, анализировали методом электронной абсорбционной спектроскопии

Меняется интенсивность и положение полосы 270 нм - ароматическое кольцо, находящееся в сопряжении (В-полоса) При переходе к концентрации Cu(ll) от 0 к 1102 М происходит возрастание интенсивности этой полосы Вероятно, это обусловлено увеличением количества лектина при концентрации Cu(ll) до 2 10 3 М Смещение перегиба на кривой поглощения из области 270 нм в область 230 нм, имеющее место при дальнейшем повышении концентрации меди, слишком велико для неспецифических сольватохромных эффектов Скорее всего, 230 нм - это уже не В-, а К-полоса ароматического кольца, то есть некие гетероатомы (N, О, S), неподеленные электронные пары которых находились в сопряжении с тт-системами ароматических колец, координируются с медью и тем самым выключаются из цепи сопряжения Происходит химическое взаимодействие, вероятно, комплексообразование с медью Поэтому предположительно при увеличении концентрации меди до 5 103 М возрастает количество комплекса меди с пектином Наконец, концентрация меди(И) 1 102 М оказывается достаточно высокой для связывания значительного количества лектина, что приводит к скачкообразному увеличению содержания указанного комплекса Полученные данные подтверждают приведенную выше информацию о том, что оптимальна в отношении удельной пектиновой активности именно миллимолярная концентрация Си2+, стимулирующая, очевидно, биосинтез лектина без потери его гемагглютинирующих свойств Избыточная медь(Н) (выше 5103 М) препятствует проявлению лектином этих свойств Проведенные эксперименты наводят на мысль, что взаимодействие иона меди (II) с пектинами действительно привело к дифференциации их хроматографических характеристик Одновременно с параметрами разделения белков при использовании катионов меди в качестве добавки к синтетической питательной среде, изменяется и продукция грибной культурой одного из пектинов (Í.2), но из-за связывания пектинов медью(П) с увеличением ее концентрации удельная пектиновая активность (титр/белок) проходит через максимум

Образование хелатов металла с внеклеточными соединениями, часто неидентифицированными, исследователи связывают с адаптацией микроорганизмов к высоким концентрациям металла Причем предполагается, что клетки выделяют хелатирующие агенты именно при длительном культивировании в присутствии металла, когда последний добавлен в период лаг-фазы [Налимова и др , 2005] Насколько дифференцировано взаимодействие Í.1 и L2 с Си2+, насколько превалирует усиление биосинтеза одного из пектинов (L2, судя по гель-хроматографическим характеристикам)"7 Как меняется их массовое соотношение с изменением концентрации соли меди в питательной среде7 В пределах возможностей метода ответить на эти вопросы помогло нам осуществление рентгенофазового анализа экзолектинов L edodes Был проанализирован ряд образцов, порядок перечисления отвечает последовательности стадий выделения и очистки Образцы 1, 2, 3, 4, 5, 6 получены осаждением ацетоном из фильтрата КЖ В образце 1 не было меди(И), в образцы 2, 3, 4, 5, 6 в питательную среду добавлялось 5 10~4, 1 10~3, 210"3, 510 3, 1 10~2 моль/л Си2+ Образец L1+L2 - промежуточная стадия разделения белков L1 и L2, когда оба они присутствуют в смеси

Рентгенограммы образцов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, L1+L2 содержат две группы пиков Интенсивность пиков первой группы уменьшается от образца 1 к образцу 6, а интенсивность пиков второй возрастает Первая группа пиков соответствует пектину Í.1, а вторая - L2 Полученные данные иллюстрирует табл 3

Таблица 3 Соотношения (CtJC\) концентраций лектиновLI wL2

Образец 1 2 3 4

Отношение 1 00 1 65 2 27 5 18

Образец 5 6 11+12

Отношение 18 4 14 8 1 33

Корректность развитого подхода подтверждается результатами независимого гель-хроматографического исследования со спектрофотометрическим детектированием

Для образцов L1, L2 пиков, аналогичных остальным образцам, не получено, из чего следует, что лектины L1 и L2 взаимодействуют друг с другом Отсутствуют также пики, соответствующие свободным углеводам (использованным в качестве стандартных веществ) Таким образом, Glc входит в состав кристаллических форм гликопротеинов

Следовательно, в данном разделе показано, что

- Ион меди (II) избирательно взаимодействует с одним из двух внеклеточных лектинов L edodes В результате двух возможных процессов - усиления биосинтеза пектинов в присутствии меди (II) и/или участия меди (II) в дифференциации белков КЖ на стадии получения ацетонового осадка белковой природы - в отделенной осаждением части КЖ значительно увеличивается количество только одного (L2) из лектинов

- Оптимальная концентрация ионов меди (II) в синтетической среде культивирования L edodes составляет 1 103 моль/л, при этом удельная пектиновая активность в 2 раза выше, чем в контрольном эксперименте, а количество не растворимого в ацетоне примесного осадка соединений меди достаточно мало Более низкие концентрации меди малодейственны, а более высокие характеризуются значительным количеством указанного осадка

- Предложена и реализована, на примере экзолектинов L edodes, методология расчета отношения концентраций веществ в образце по данным рентгенофазового анализа с точностью до постоянной величины

- На основании предложенного подхода можно судить о взаимодействии двух экзолектинов L edodes между собой, а также о полноте разделения этих белков на разных стадиях их очистки

Взаимодействие экзолектинов шиитаке с фитогормоном ИУК

Некоторые доказательства участия фитогормона ИУК в процессах морфогенетической дифференциации грибов рода Lentinus, полученные в ходе простых экспериментов, существуют достаточно давно, хотя и описаны в единичных работах [Rypacek and Sladky, 1972, 1973] Результаты этих исследований подтвердили предположение, высказанное в еще более ранней публикации, посвященной изучению дрожжей [Kamisaka et al, 1967], о том, что гормонально контролируемый механизм регуляции роста имеет много общих особенностей у грибов и высших растений

Известно, что не только растения и бактерии, но и некоторые микромицеты (Pisohthus tinclorius и Paxillus involutus) способны образовывать связанные формы ИУК [Цавкелова и др , 2006] ИУК связывается с сахарами, аминокислотами и белками, образуя запасные (неактивные) формы, из которых фитогормон при необходимости высвобождается и восстанавливает свою физиологическую

активность [Дерфлинг, 1985] Имеющейся к настоящему времени информации об ИУК в культуре базидиомицетов посвящен раздел обзора литературы 1 3 3

На примере Lentinus tigrmus исследователями Rypacek и Sladky еще в 19721973 гг доказано предположение о том, что в дифференциации грибной культуры важное место принадлежит фитогормонам, и что процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том числе ауксина ИУК О взаимодействии ИУК с пектинами базидиомицетов сведения в литературе отсутствуют Для нас представляло интерес выяснить возможность взаимодействия in vitro внеклеточных пектинов и фитогормона, объединить которые можно по признаку участия в морфогенетических процессах грибной культуры

Для изучения взаимодействия "лектин-ИУК" использовали образцы пектинов и растворы ИУК в концентрациях 0,001, 0,01 и 0,1 г/л Препараты двух внеклеточных пектинов (L1 и L2) L edodes исследовали на трех основных стадиях очистки каждого белка В результате "белковых объектов" - компонентов реакционных смесей получили шесть, условно обозначив их для целей настоящей работы следующим образом в последовательности увеличения степени чистоты препарата белка 1, 3, 5 соответствовали L1, а 2, 4, 6 - пектину L2 Растворы исходных белковых компонентов (пектины 1-6) предполагаемых реакционных смесей готовили так, чтобы они характеризовались по возможности практически одинаковой пектиновой активностью В качестве растворителя для ИУК выбрали этанол ■ Н20 (1 1, v/v) При любой использованной (и даже более высокой) концентрации спиртового раствора ИУК собственная ГАА отсутствовала

Полученные данные демонстрируют увеличение пектиновой активности в 864 раза в системе "лектин-ИУК" по сравнению с исходными белковыми растворами Не просматривается явной зависимости результатов взаимодействия ни от концентрации ИУК, ни от степени чистоты препарата пектина Ясно только, что по мере очистки пектинов титр ГА не снижается (или возрастает) Что касается концентрации ИУК, то оптимальной (по параметру ГАА продуктов взаимодействия ее с пектинами) следует считать 0,01 г/л для образцов пектинов 1 - 4 и 6 титр ГА в 2-4 раза выше при этой концентрации Образец 5 (напомним, это очищенный £.1) образует продукт взаимодействия с ИУК, характеризующийся титром ГА 1024 независимо от концентрации фитогормона

Эти результаты наводят на мысль о коцентрационно-насыщаемом взаимодействии в системе "лектин-ИУК", приводящем к образованию химически однородных для двух пектинов продуктов взаимодействия Для дополнительной характеристики указанных систем мы использовали спектрофотометрический метод анализа Продукты взаимодействия препаратов пектинов и ИУК анализировали методом электронной абсорбционной спектроскопии

Различия спектров практически не проявляются при разной степени очистки пектина 1 Кривые для пектина 2 в зависимости от стадии его очистки отличались только по интенсивности поглощения и геометрически могли бы быть получены одна из другой параллельным смещением вдоль оси ординат Оказалось, что комплекс (L1 + ИУК) характеризуется тем же набором максимумов поглощения (200, 220 и 280 нм), однако при ином соотношении интенсивностей

Меняется интенсивность полосы 280 нм Она снижается почти в 2 раза при переходе от начальной к конечной стадии очистки пектина 2 При одинаковом, в пределах погрешности измерений, исходном титре ГА это может означать стимулирующее влияние примесных к L2 соединений на процесс взаимодействия пектина с фитогормоном Вероятно, подобный эффект правомерно назвать положительным каталитическим, поскольку качественные характеристики спектра поглощения сохраняются, и лишь снижается количество продуктов взаимодействия

"ИУК-/.2" при удалении примесных соединений Максимум 220 нм - это, скорее всего, К-полоса ароматического кольца, то есть гетероатомы (N, О, S), азот ИУК, неподеленные электронные пары которых находились в сопряжении с тт-системами ароматических колец, координируются с пектинами и тем самым выключаются из цепи сопряжения Происходит химическое взаимодействие, вероятно, комплексообразование с пектинами

Итак, внеклеточные лектины L edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8 - 64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "лектин-ИУК" Продукты взаимодействия с ИУК для двух пектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу

ВЫВОДЫ

1 В культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета Lentinus edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам

2 Культура L edodes F-249 синтезирует два внеклеточных пектина, различающихся по составу и физико-химическим свойствам Внеклеточный лектин Z.1 из L edodes - гликопротеин с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 43 кДа L1 имеет в своем составе (10,5 + 1,0) % (т/т) углеводов, представленных глюкозой Внеклеточный лектин L2 - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 «Да L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0) % (т/т) углеводов, представленных глюкозой (73% (т/т) углеводной части молекулы пектина) и галактозой (27% (т/т) углеводной части молекулы пектина) В L2 высоко содержание Asn 42% (т/т) от суммы аминокислот Этот факт наряду с составом углеводной части молекулы (Glc+Gal) позволяет отнести L2 к N-аспарагинсвязанным белкам

3 Два пектина L1 и L2 различаются по углеводной специфичности Оба белка специфичны к D-галактозе и D-лактозе при одинаковой для L1 и L2 минимальной ингибирующей концентрации этих углеводов (2,08 мМ Gal, 8,33 мМ Lac) Другие углеводы, к которым лектины проявляют более или менее высокое сродство для L1 это Rha (4,16 мМ), для L2-Ara (4,16 мМ) и МапОН (8,33 мМ)

4 Два пектина L1 и L2 различаются по антигенным свойствам, имея при этом общие антигенные детерминанты Очищенные внеклеточные лектины L edodes высоко избирательны при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизированных эритроцитов кролика, не реагируя с эритроцитами других животных и человека

5 Установлено, что активность и динамика образования пектинов L edodes зависят от условий культивирования, а именно температуры, количества посевного мицелия, возраста культуры, а также от состава среды глубинного культивирования соотношения количеств углерода и азота, природы компонентов - источников углерода и азота, кислотности среды Оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной пектиновой активности шиитаке включает в качестве источника углерода L-Ara или D-GIc, источника азота - L-Asn

6 Одним из значимых факторов, влияющих на пектиновую активность глубинной культуры L edodes, является присутствие в среде культивирования катионов металлов(И) В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей пектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона М2+, но и источник углеродного питания грибной культуры Полученные данные для металлов, образующих эти катионы, позволяют составить следующий ряд в порядке уменьшения положительного эффекта на активность

внеклеточных лектинов шиитаке Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>Ni Влияние двухзарядных катионов металлов триады железа на активность внеклеточных лектинов L edodes изменяется симбатно с энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным бидентатным лигандом этиленгликолем

7 При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L edodes

8 Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных лектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам, что может свидетельствовать об участии лектинов L edodes в морфогенетических процессах и инициации плодообразования

9 Изменения активности внеклеточных лектинов L edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с соединениями - представителями ряда 1,5-ди(4-Н-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 в зависимости от структуры селенсодержащего компонента реакционных смесей, его концентрации, от стадии очистки белков, позволяют выявить влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий в химических процессах с участием лектинов При этом результаты квантовохимических расчетов и QSAR свойства косвенно подтверждают большую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах по сравнению с Cys

10 Выявлено взаимодействие лектинов L edodes с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8 - 64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "лектин-ИУК" Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу Возможность взаимодействия в указанной системе in vivo может основываться на участии обоих компонентов (и лектинов, по данным нашей работы, и ИУК, по литературным данным) в процессах морфогенетической дифференцировки мицелия высших грибов

11 Впервые из внеклеточных метаболитов Lentinus edodes выделен галактолипид S3, являющийся одним из эндогенных регуляторов активности внеклеточных лектинов L edodes Галактолипид представляет собой D-галактопиранозу (15% (т/т) S3 содержат сульфэт-Gal), ацилированную остатками октадекановой или нонадекановой кислот в соотношении 28% и 72% (т/т) от суммы двух ЖК соответственно

12 Предложена методика эффективного разделения двух внеклеточных лектинов L edodes, основанная на дифференциации их хроматографических свойств в присутствии Cu(ll)

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1 Pankratov А N , Tsivileva О М , Nikitina V Е Laccase of Lentinus edodes catalyzed oxidation of amines and phenolic compounds a quantum chemical consideration II J Biochem Mol Biol 2000 Vol 33, № 1 P 37-42

2 Цивилева О M , Никитина В Е, Гарибова Л В , Завьялова Л А , Игнатов В В Гемагглютинирующая активность Lentinus edodes (Berk) Sing [Lentinula edodes (Berk) Pegler] II Микробиология 2000 T 69, № 1 С 38-44

3 Tsivileva О M , Nikitina V E , Garibova L V , Ignatov V V Lectin activity of Lentinus edodes // International Microbiology 2001 Vol 4, № 1 P 41-45

4 Никитина В Е , Озерова Р А , Цивилева О М Особенности роста мицелия Lentinus edodes на различных средах // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета Саратов Научная книга, 2003 Выл 2 С 176-179

5 Панкратов А Н, Цивилева О М , Никитина В Е, Учаева И М Квантовохимическое рассмотрение возможной роли источника азота в связи с активностью внеклеточных лектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes II Органические реагенты в организованных средах Межвузовский сборник научных статей Вып 7 Саратов Научная книга, 2003 С 220-225

6 Цивилева О М , Панкратов А Н , Никитина В Е , Гарибова Л В Взаимосвязь молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes (Berk) Sing [Lentinula edodes (Berk) Pegler] II Микробиология 2004 T 73, № 4 С 486-490

7 Никитина В E , Цивилева О М , Гарибова Л В Стимуляторы лектиновой активности Lentinus edodes на синтетических агаризованных средах // Биотехнология

2004 №3 С 49-54

8 Цивилева ОМ, Панкратов АН, Древко БИ, Никитина BE Влияние 1,5-дифенил-З-селенпентандиона-1,5 на лектиновую активность глубинной культуры Lentinus edodes II Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов Сборник науч трудов / Под ред проф АП Кривенько Саратов Научная книга, 2004 С 301-303

9 Лощинина Е А , Цивилева О М , Никитина В Е , Панкратов А Н , Древко Б И Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на морфолого-культуральные характеристики съедобного гриба шиитаке // «Вавиловские чтения - 2004» Материалы Всероссийской научно-практической конф , поев 117-й годовщине со дня рожд акад Н И Вавилова Саратов, 24-26 ноября 2004 Секция физиологии и защиты растений -Саратов Изд-во СГАУ, 2004 - С 36-39

10 Цивилева ОМ, Никитина BE, Гарибова Л В Влияние состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes II Прикл биохимия и микробиология 2005 Т 41, №2 С 200-203

11 Tsivileva О М , Pankratov А N , Nikitina V Е , Garibova L V Effect of media components on the mycelial film formation in submerged culture of Lentinus edodes (Shiitake) II Food Technol Biotechnol 2005 Vol 43, № 3 P 227-234

12 Силина Ю E , Кучменко ТА , Коренман Я И , Цивилева О М , Никитина В Е Применение полного факторного эксперимента для разработки газового сенсора на основе экстрактов мицелиального гриба Pleurotus ostreatus Н Жури аналит химии

2005 Т 60, № 7 С 759-764

13 Цивилева О М , Никитина В Е , Панкратов А Н , Древко Б И , Лощинина Е А , Гарибова Л В Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и лектиновую активность Lentinus edodes II Биотехнология 2005 № 2 С 56-62

14 Цивилева О М , Никитина В Е , Макаров О Е , Гарибова Л В Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия Lentinus edodes (Berk) Sing [Lentinula edodes (Berk) Pegler] на разных стадиях морфогенеза II Микробиология 2005 Т 74, № 5 С 714-716

15 Никитина BE, Цивилева ОМ, Степанова Л В, Лощинина ЕА Поиск группоспецифичных лектинов грибного происхождения // Успехи медицинской микологии Том V / Под общей научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева М Национальная академия микологии, 2005 С 201-205

16 Pankratov А N , Tsivileva О М , Nikitina VEA Brief Guide to Mycology Web Resources // Online Information Review 2006 Vol 30, № 1 P 43-52

17 Цивилева О M, Никитина В Е, Гарибова Л В Использование двухвалентного марганца при получении посевного мицелия Lentinus edodes // Микология и фитопатология 2006 Т 40, вып 2 С 142-145

18 Цивилева ОМ, Панкратов АН, Лощинина ЕА, Никитина BE Экспериментальное и теоретическое исследование влияния катионов металлов триады железа на активность внеклеточных пектинов Lentinus edodes II Вестник Московского университета Серия 2 Химия 2006 Т 47, № 2 С 91-96

19 Степанова Л В , Цивилева О М , Никитина В Е , Лощинина Е А , Гарибова Л В , Тюрюкина Е В Гемагглютинирующая активность некоторых базидиальных ксилотрофов на стадии дикариотического мицелия II Микология и фитопатология 2006 Т 40, вып 4 С 307-313

20 Лощинина Е А , Никитина В Е , Цивилева О М , Степанова Л В , Пономарева Е Г, Шелудько А В Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentinus edodes при совместном культивировании с бактериями рода Azospirillum II Вестник СГАУ 2006, № 6, вып 2 С 24-26

21 Никитина В Е , Цивилева О М , Лощинина Е А Взаимоотношения ксилотрофных базидиомицетов и почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum II Успехи медицинской микологии Том VII / Под общей научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева М Национальная академия микологии,

2006 С 293-294

22 Цивилева О М , Макаров О Е , Никитина В Е , Гарибова Л В Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности Lentinus edodes в процессе морфогенеза // Микология и фитопатология 2007 Т 41 № 5 С 450455

23 Цивилева О М , Панкратов А Н , Никитина В Е , Бычков Н А , Лощинина Е А Влияние некоторых неорганических соединений на активность внеклеточных лектинов гриба Lentinus edodes II Известия Саратовского университета Новая серия 2007 Т 7 Серия Химия Биология Экология Вып 1 С 21-27

24 Nikitina V Е , Tsivileva О М , Pankratov А N , Bychkov N A Lentinula edodes Biotechnology - From Lentinan to Lectins // Food Technology and Biotechnology 2007 Vol 45, № 3 P 230-237

25 Никитина В E , Цивилева О M , Лощинина Е А , Макаров О Е , Бабицкая В Г , Щерба В В , Пучкова Т А Биохимические особенности развития мицелия Lentunus edodes в совместной культуре с диазотрофными бактериями Azospirillum brasilense И Успехи медицинской микологии Том IX / Под общей научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева М Национальная академия микологии, 2007 С 9-12

26 Пучкова Т А , Филимонова Т В , Бабицкая В Г , Никитина В Е , Цивилева О М , Щерба В В , Иконникова Н В Меланиновые пигменты грибов Lentinus edodes и Ganoderma lucidum II Успехи медицинской микологии Том IX / Под общей научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева М Национальная академия микологии,

2007 С 17-20

27 Бабицкая В Г , Щерба В В , Пучкова Т А , Никитина В Е , Цивилева О М , Иконникова Н В , Смирнов Д А , Осадчая О В Гликопротеины Lentinus edodes факторы, влияющие на их образование II Успехи медицинской микологии Том IX / Под общей научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева М Национальная академия микологии, 2007 С 142-144

28 Смирнов Д А , Щерба В В , Никитина В Е , Рожкова 3 А , Бабицкая В Г , Цивилева О М , Пучкова Т А , Осадчая О В Сравнительное изучение экзо- и эндополисахаридов, образуемых Lentinus edodes при различных способах культивирования II Успехи медицинской микологии Том IX / Под общей научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева М Национальная академия микологии, 2007 С 181-183

29 Никитина В Е , Цивилева О М , Бабицкая В Г , Щерба В В , Пучкова Т А Современные биотехнологические аспекты глубинного культивирования Lentunus

edodes И Успехи медицинской микологии Том IX / Под общей научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева М Национальная академия микологии, 2007 С 247251

30 Цивилева О М, Никитина В Е Соединения селена в процессах жизнедеятельности биотехнологически значимых грибных культур II Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты Сборник научных трудов Выпуск 16 -М РАЕН, 2007 С 47-58

31 Лощинина Е А , Цивилева О М , Никитина В Е , Панкратов А Н Жирные кислоты мицелия на разных стадиях морфогенетического развития Lentmus edodes II Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии Сборник научных трудов Саратов Научная книга, 2007 С 116-118

32 Бычков Н А , Цивилева О М , Никитина В Е , Панкратов А Н Способ выделения индивидуальных экзолектинов из жидких сред культивирования базидиомицета Lentmus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии Сборник научных трудов Саратов Научная книга, 2007 С 74-76

33 Бычков Н А , Панкратов А Н , Цивилева О М , Липатов И А , Никитина В Е , Древко Б И Взаимодействие соединений ряда 1,5-ди(4-В-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 с лектинами базидиомицета Lentmus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии Сборник научных трудов Саратов Научная книга, 2007 С 331-333

34 Бычков Н А, Панкратов А Н , Цивилева О М DFT-исследование взаимодействия ¿.-цистеина с кислотами селена II Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии Сборник научных трудов Саратов Научная книга, 2007 С 337-339

35 Бычков Н А , Панкратов А Н , Цивилева О М , Былинкина Н Н , Никитина В Е Рентгенофазовый анализ экзолектинов базидиомицета Lentmus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии Сборник научных трудов Саратов Научная книга, 2007 С 71-74

36 Бычков Н А , Панкратов А Н , Цивилева О М Сравнительный анализ реакционной способности L-цистеина и L-метионина предпосылки замещения атома серы на селен в биохимических процессах // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии Сборник научных трудов Саратов Научная книга, 2007 С 328-330

37 Лощинина Е А, Цивилева О М , Никитина В Е , Макаров О Е Экспериментальные предпосылки отнесения пути биосинтеза фитогормона ИУК базидиомицетом Lentmus edodes к триптофанзависимому типу // «Вавиловские чтения - 2007» Материалы межд научно-практ конф, поев 120-й годовщине со дня рожд акад Н И Вавилова Саратов, 27-30 ноября 2007 Т 1 - Саратов Научная книга, 2007 С 37-38

38 Ветчинкина Е П , Никитина В Е , Цивилева ОМ, Гарибова Л В Активность внутриклеточных пектинов Lentmus edodes на разных стадиях развития гриба // Прикл биохимия и микробиология 2008 Т 44, № 1 С 76-83

39 Никитина В Е , Цивилева О М Способ выращивания съедобных грибов Lentmus edodes II Патент РФ № 2239983 Бюл изобр № 32 от 20 11 2004

40 Цивилева О М , Никитина В Е , Кучменко ТА , Силина Ю Е , Панкратов А Н Биомодификатор для определения фенола и его производных / Положительное решение формальной экспертизы № 2005121083/13(023786) Приоритет от 13 12 2006

Список сокращений, использованных в автореферате

аланин - Ala, арабиноза - Ara, аргинин - Arg, аспарагин - Asn, аспарагиновая кислота - Asp, валин - Val, галактоза - Gal, гемагглютинация - ГА, гемагглютинирующая активность - ГАА, гистидин - Hys, глицин - Gly, глутамин -Gin, глутаминовая кислота - Glu, глюкоза - Glc, двухзарядный катион металла -Меа\ диметилсульфоксид - ДМСО, жирные кислоты -ЖК, изолейцин - Не, иммуноферментный анализ - ИФА, инозит - Ino, культуральная жидкость - КЖ, лактоза - Lac, лейцин - Leu, мальтоза - Mal, маннит- МапОН, манноза - Man, метионин - Met, пигментированная мицелиальная пленка - МП, рамноза - Rha, ростовой коэффициент - PK, сахароза - Suc, титр гемагглютинации - ТГА, триптофан - Тгр, фенилаланин - Phe, фосфатно-солевой буфер - PBS, фруктоза -Fru, целлобиоза — Cel, цистеин - Cys, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия - SDS-PAGE, этиленгликоль - EG, Quantitative Structure - Activity Relationships (количественные соотношения структура - активность) -QSAR

Подписано к печати 6 02 08 Гарнитура Anal 9 Формат 60x84 1/16 Объем 2 уел печ л Тираж 100 экз

Отпечатано в ИБФРМ РАН 410049 Саратов, проспект Энтузиастов, 13

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Цивилева, Ольга Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ ЛЕКТИНОВ ГРИБОВ

1.1.1. Общее понятие о лектинах.

1.1.2. Предполагаемая роль лектинов грибов

1.1.3. Биологические свойства грибных лектинов.

1.1.4. Применение грибных лектинов

1.2. МОРФОЛОГО-КУЛЪТУРАЛЬНЫЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ LENTINGS EDODES (BERK.) SING

LENTINULA EDODES (BERK.) PEGLER]

1.2.1. Краткая характеристика Lehtinus edodes.

1.2.2. Lentinus edodes - гриб "белой" гнили

1.2.3. Питательные свойства и медицинское значение Lentinus edodes.

1.3. ЗНАЧЕНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

1.3.1. Соединения селена в процессах жизнедеятельности биотехнологически значимых грибных культур.

1.3.1.1. Селен - составляющая часть минерального питания грибов

1.3.1.2. Химия селена в живой клетке.

1.3.1.3. Влияние искусственных добавок селенсодержащих веществ на развитие грибных культур.

1.3.2. Соединения меди в биохимии микроорганизмов.

1.3.3. Фитогормон ß-индолил-З-уксусная кислота в искусственной культуре базидиомицетов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Получение чистой мицелиальной культуры и плодовых тел Ь. edod.es.

2.2.2. Пробоотбор грибных изолятов с плотных и жидких сред.

2.2.3. Определение ростовых характеристик грибной культуры.

2.2.4,Определение гемагглютинирующей активности.

2.2.5. Установление зависимости активности лектинов от условий культивирования.

2.2.6. Определение углеводной специфичности агглютининов.

2.2.7. Определение молекулярной массы белков.

2.2.8. Анализ аминокислотного состава.

2.2.9. Хроматографический анализ углеводов

2.2.10. Дериватизация углеводных фракций.

2.2.11. Анализ жирнокислотного состава.

2.2.12. Получение антител к лектинам.

2.2.13. Иммуноферментный анализ.

2.2.14. Определение индольных и фенольных соединений.

2.2.15. Рентгенофазовый анализ.

2.2.16. Спектральный анализ ЯМР 'Н.

2.2.17. РЖ спектральный анализ.

2.2.18. Расчетные методы квантовой химии и ОБАБ.

2.2.19. Статистическая обработка экспериментальных данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ОБНАРУЖЕНИЕ, ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА, ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ГЕМАГГЛЮТИНИНОВ ЬЕМТШиБ ЕВ О ВЕБ

3.1.1. Обнаружение внеклеточных лектинов!/. edodes.

3.1.2. Выделение и очистка, определение углеводной специфичности лектинов.

3.2. ЗАВИСИМОСТЬ ЛЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ ОТ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

3.2.1. Влияние температуры, дозы посевного мицелия, возраста культуры на лектиновую активность/,, edodes

3.2.2. Активность внеклеточных лектинов/,. edodes в зависимости от источников углерода и азота.

3.2.3. Эффект некоторых низкомолекулярных компонентов среды: эксперимент и квантовохимическое рассмотрение

3.2.3.1. Катионы двухвалентных металлов

3.2.3.2. Катионы металлов триады железа.

3.2.3.3. Селен в органической форме

3.2.4. Воздействие неблагоприятных факторов на лектиновую активность/,, edodes.

3.3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕКТИНОВ LENTINUS EDODES

3.3.1. Внеклеточный гликопротеин L. edodes — лектин/,

3.3.2. Внеклеточный протеогликан L. edodes - лектин L

3.4. ЛЕКТИНЫ ШИИТАКЕ В ПРОЦЕССАХ МОРФОГЕНЕЗА

3.4.1. Лектиновая активность/,, edodes на разных стадиях . формирования плодовых тел.

3.4.2. Формирование пигментированной мицелиальной пленки в глубинной культуре шиитаке в зависимости от активности внеклеточных лектинов

3.4.3. Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия L. edodes на разных стадиях морфогенеза.

3.4.4. Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности L. edodes в процессе морфогенеза.

3.5. ЛЕКТИНЫ ШИИТАКЕ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ЭКЗОГЕННЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

3.5.1. Взаимодействие лектинов с органическими селенсодержащими веществами.

3.5.1.1. Влияние селенсодержащих соединений на активность внеклеточных пектинов Ь. ейойеБ

3.5.1.2. Изменение характеристик взаимодействия лектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от стадии очистки препарата лектина.

3.5.1.3. Изменение характеристик взаимодействия лектинов с селенорганическими соединениями в зависимости от концентрации селенсодержащих соединений

3.5.1.4. Квантовохимические и ОБАИ свойства селенсодержащих соединений ряда

1,5-ди(4-К-фенил)-3-селенпентандионов-1,

3.5.1.5. Сравнительный анализ реакционной способности Х-цистеина и Х-метионина: некоторые теоретические предпосылки замещения атома серы на селен.

3.5.2. Взаимодействие лектинов с катионами меди (II).

3.5.3. Взаимодействие экзолектинов шиитаке с фитогормоном ИУК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции"

Актуальность темы данной работы определяется прежде всего ее направленностью на разрешение проблемы явного несоответствия между весьма ограниченным к настоящему времени уровнем информации о важных биологически активных соединениях, лектинах ксилотрофных базидиомицетов, и заинтересованностью исследователей в углубленном изучении этих углеводсвязывающих белков самого разного биологического происхождения. Грибы являются очень интересной в теоретическом и практическом плане группой живых организмов, в то же время внеклеточные грибные лектины практически не описаны.

Вопрос о возможности искусственного выращивания грибов уже свыше двух тысячелетий занимает человечество. Объектом научных исследований во всем мире являются более 100 тыс. видов. Промышленное производство высших грибов во многих странах мира выделилось в самостоятельную, интенсивно развивающуюся высокопроизводительную отрасль.

Общеизвестно функциональное значение грибов в различных биогеоценозах, где они благодаря широкому набору ферментов принимают активное участие в процессах деструкции и минерализации органического вещества. В настоящее время известно большое количество видов базидиальных грибов, которые представляют интерес в качестве продуцентов биологически активных веществ. К числу перспективных микологических объектов для поверхностного и глубинного культивирования с целью получения дополнительного источника белка, биологически активных соединений относится ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes.

Глубокие исследования физиологии высших грибов начались в последние три-четыре десятилетия. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность, определяющиеся наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды, требуют дальнейшего изучения. При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид и штамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и др., необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов [Дворнина, 1990].

Исследования роста базидиомицетов, в том числе L. edodes, на жидких средах направлены на изучение питательных потребностей и физиологии вида в чистой культуре, разработку технологии погруженного культивирования мицелия с целью получения биомассы кормового и пищевого назначения, препаратов, обладающих онкостатическим действием [Соломко и Митропольская, 1994]. Глубинное культивирование также предлагается как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства [Yang and Jong, 1989]. Значительно меньшее число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. В частности, лектиновая активность высших грибов изучена явно недостаточно, лишь отдельные работы касаются изучения лектинов в связи с физиологическими аспектами, проблемами морфогенеза грибов. На стадиях, предшествующих плодоношению и характеризующихся у отдельных видов формированием специализированных вегетативных структур, таких как коричневая мицелиальная пленка шиитаке, исследование лектиновой активности приобретает особую актуальность, поскольку биохимические условия возникновения подобных особенностей морфогенеза и способов дальнейшего развития (перехода либо к нормальному плодоношению, либо к образованию недифференцированных базидиом) давно интересовали исследователей, оставаясь неопределенными.

Не обсуждалась роль лектинов при неблагоприятных условиях роста культур базидиомицетов, взаимодействие лектинов с важнейшими биологически активными соединениями (как антиоксидантной природы, так и вызывающими окислительный стресс; с соединениями фитогормональной природы, принимающими участие в цитодифференцировке у высших грибов). Не были выявлены регуляторы внеклеточной лектиновой активности, поэтому представляло интерес изучить не только эффекторы — компоненты синтетических сред культивирования, но и обнаружить какие-либо эндогенные низкомолекулярные регуляторы указанной активности, внешние условия их биосинтеза и проявления, что удалось реализовать в рамках настоящей работы.

Следовательно, ко времени начала наших исследований в этой области налицо был недостаток сведений по вопросам выявления лектиновой активности грибных культур, получения очищенных препаратов внеклеточных грибных лектинов, изучения их свойств и предполагаемых функций. Актуальным представляется наш посильный вклад в описание новой группы гликопротеинов ксилотрофных базидиомицетов, внеклеточных лектинов, физико-химические свойства которых важны для понимания их физиологической роли, морфогенетических функций в грибном организме как объекте микробиологических исследований. Учитывая вышеизложенные обстоятельства, нами было предпринято настоящее исследование.

Цель работы - характеристика внеклеточных лектинов культивируемого ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes и условий проявления их биологической активности.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг штаммов Lentinus edodes на присутствие лектинов.

2. Выделить внеклеточные лектины L. edodes, изучить их химический состав, физико-химические свойства, углеводную специфичность.

3. Изучить зависимость лектиновой активности культуры L. edodes от условий выращивания. Выявить оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности. Разработать способ получения экзолектинов L. edodes F-249 с целью повышения выхода препаратов.

4. Исследовать влияние катионов металлов(И) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением расчетных методов квантовой химии и QSAR.

5. Изучить влияние неблагоприятных внешних условий на лектиновую активность L. edodes во взаимосвязи с ростовыми характеристиками культуры.

6. Исследовать взаимосвязь активности внеклеточных лектинов L. edodes и морфогенеза (формирования коричневой мицелиальной пленки) в глубинной культуре.

7. Выявить взаимосвязь углеводного и жирнокислотного состава мицелия шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития с лектиновой активностью и углеводной специфичностью лектинов культуры.

8. Исследовать влияние некоторых элементоорганических соединений (селен-, серу-, азотсодержащих) на активность внеклеточных лектинов шиитаке с привлечением теоретических представлений (пространственная и электронная структура молекул, QSAR свойства реактантов).

9. Исследовать биологические свойства лектинов: их способность к взаимодействию с веществами фитогормональной природы, с разными типами эритроцитов; антигенные свойства.

10. Изучить возможности использования глубинной культуры L. edodes при модифицированном способе ее выращивания в качестве технологически перспективного посевного материала.

Научная новизна работы

Впервые в культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета L. edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

Выделены чистые препараты лектинов из культуральной жидкости L. edodes, изучены их физико-химические свойства, охарактеризована реакционная способность лектиновых препаратов.

Впервые установлено участие лектинов в морфогенетических процессах и инициации плодообразования шиитаке. Выявлена взаимосвязь активности лектинов с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре; с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании; с биосинтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам.

Впервые на промежуточной стадии очистки одного из лектинов обнаружен и выделен необычный для макробазидиомицетов гликолипид моносахаридной природы, способный модифицировать активность внеклеточных лектинов шиитаке.

Научные положения работы расширяют и углубляют современные представления о разнообразии лектинов базидиомицетов и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их биосинтеза и активности; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах.

Практическая значимость исследования

Показана принципиальная осуществимость выделения и очистки внеклеточных лектинов из жидких синтетических сред культивирования ксилотрофных базидиомицетов. Разработана методика эффективной дифференциации хроматографических свойств двух внеклеточных лектинов, способствующей их более эффективному разделению. Выявлены низкомолекулярные вещества - эффекторы проявления внеклеточными лектинами их биологической активности, изучено взаимодействие лектинов с соединениями - антиоксидантами и индукторами окислительного стресса, с разными типами эритроцитов в реакции гемагглютинации; некоторые антигенные свойства. Подобная характеристика внеклеточных лектинов способствует перспективному использованию выделенных белков при проведении научных и прикладных исследований в области биохимии, энзимологии и иммунологии.

На основании результатов проведенного исследования выявлен ряд особенностей, проявляющихся при формировании неполноценных плодовых тел шиитаке в отсутствие характерной для данного вида коричневой мицелиальной пленки. Совокупность отличных от нормального плодоношения характеристик, в том числе по лектиновой активности, составу жирнокислотного и углеводного пула мицелия, могла бы служить дополнительным параметром биохимической оценки мицелия в процессе плодообразования. Полученные данные, свидетельствующие о существенных изменениях в направленности реакций синтеза, десатурации и элонгации жирных кислот у неполноценных плодовых тел, могут быть полезны и при обсуждении роли липидов в процессе морфогенеза.

Материалы работы и препараты лектинов используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе химического факультета СГУ, СВИРХБЗ, лаборатории микробиологии Института микробиологии HAH Беларуси. По результатам работы получен патент РФ, а также положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006). Внедрение результатов диссертационной работы подтверждено соответствующими актами, представленными в Приложении к диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В культуральной жидкости и на поверхности мицелия культур ряда штаммов Lentinus edodes присутствуют внеклеточные лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

2. Культура L. edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по своим физико-химическим свойствам, составу, углеводной специфичности, антигенным свойствам, агглютинации разных типов эритроцитов, реакционной способности в отношении низкомолекулярных биологически значимых соединений.

3. Активность и динамика образования внеклеточных лектинов L. edodes зависят от физико-химических условий культивирования. Наиболее значимыми факторами, влияющими на лектиновую активность глубинной культуры L. edodes, являются присутствие в среде культивирования аминокислотных источников азота, катионов металлов(Н), селена в органической форме.

4. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L. edodes.

5. Лектины L. edodes принимают участие в морфогенетических процессах культуры. Установлена взаимосвязь внеклеточной лектиновой активности шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия — липидам и углеводам.

6. Одним из эндогенных регуляторов активности лектинов L. edodes является необычный для ксилотрофных базидиомицетов галактолипид S3, впервые выделенный из внеклеточных метаболитов L. edodes.

7. Экзогенными регуляторами внеклеточной лектиновой активности L. edodes могут служить низкомолекулярные соединения - индукторы окислительного стресса, а также антиоксиданты, в частности, селенорганические соединения, при взаимодействии с которыми сильно влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий.

8. Лектины L. edodes взаимодействуют с фитогормоном ИУК, при этом значительно увеличивается лектиновая активность в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу.

9. Эффективным способом разделения двух внеклеточных лектинов шиитаке на основе дифференциации хроматографических характеристик и усиления биосинтеза одного из лектинов является воздействие Си(Н).

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина), "Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов " (№ гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией В.Е. Никитина).

Физико-химические задачи работы выполнены совместно с лабораторией структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией — к.х.н. Е.Е Федоров), с лабораторией биохимии (зав. лабораторией в период выполнения исследований — д.б.н. В.В. Игнатов), а также на кафедре аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), при непосредственном участии д.х.н., профессора А.Н. Панкратова; на кафедре органической и биоорганической химии СГУ (зав. кафедрой - д.х.н., профессор А.П. Кривенько).

Частично данная работа получила финансовую поддержку:

- грант РФФИ "Лектины ксилотрофных базидиомицетов разных систематических групп" № 03-04-48129 (2003-2005 гг.)

- грант РФФИ-БРФФИ (РФФИ и Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований) "Гликополимеры и углеводсвязывающие белки ксилотрофных базидиомицетов: функции и биологическая активность" № 06-04-81042-Бела (2006-2007 гг.)

- грант Федерального агентства по науке и инновациям в рамках федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 20022006 годы (государственный контракт № 02.444.11.7331)

- программа Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", совместный проект ИБФРМ РАН и ИРЭ РАН, 2007 г.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на: 37th IUP AC Congr. Frontiers in Chemistry: Molecular Basis of the Life Sciences, 27th GDCh General Meeting (Berlin, Germany, Aug. 14-19, 1999); науч. конфер. "Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии" (Саратов, 1999); 5th World Congr. of Theoretically Oriented Chemists - WATOC'99 (Imperial College, London, 1-6 Aug., 1999); 1-й регион, конфер. мол. ученых (Саратов, 26-27 марта 2002); Первом съезде микологов России "Современная микология в России" (Москва, 18-20 апреля 2002); межд. науч. конфер. "Физиология и биохимия культивируемых грибов" (6-8 июня 2002, Саратов); IV Всерос. конфер. мол. ученых (Саратов, 23-25 июня, 2003); Int. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants" (Saratov, 28-30 July, 2003); VIII Int. Conf. "The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology" (Saratov, September 9-13, 2003); 8-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 17-21 мая 2004); III Всерос. школе-конфер. "Химия и биохимия углеводов" (9-11 сентября 2004, Саратов); II Российской школе-конфер. "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине" (Саратов, 13-16 октября 2004); Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практич. конфер. "Вавиловские чтения - 2004" (Саратов, 24-26 ноября 2004); II Всерос. симп. "Тест-методы химического анализа" (Саратов, 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 18-22 апреля 2005); Межд. конфер. "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 14-16 сентября 2005); Всерос. конфер. "Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты" (Саратов, 15-17 июня 2005); V Всерос. конфер. мол. ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии"

Саратов, 22-24 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysis-2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); II Межд. симп. "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 25-30 сентября 2005); 10-й Пущинской школе-конфер. мол. ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 17-21 апреля 2006); 4-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); Межд. науч. конфер. "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)" (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 10-12 октября 2006); Межд. науч. конфер. "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1-2 июня 2006); Втором Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006); 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); 4-й Росс, конфер. "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 4-5 июня 2007); VI Всерос. интерактивной конфер. мол. ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 16-22 September 2007), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.

Личный вклад соискателя

Благодарности

Следует отметить вклад в выполнение данной работы д.б.н., зав. лабораторией В.Е. Никитиной, явившейся вдохновителем самого факта проведения исследований с такими объектами, как Lentinus edodes и лектины этой культуры, а также организатором углубленных исследований важной морфогенетической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки и эффекта неблагоприятных условий внешней среды. Интересное и полезное обсуждение результатов было обеспечено со стороны В.Е. Никитиной на всем протяжении периода выполнения работы.

Правильная интерпретация полученных результатов в терминах физико-химических, спектроскопических, аналитической химии была бы крайне обеднена, а квантовохимическая интерпретация — невозможна, без сотрудничества с д.х.н., профессором кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ им. Н.Г. Чернышевского А.Н. Панкратовым.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 78 научных работ, в том числе 38 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 19 статей в рецензируемых иностранных изданиях и российских журналах, входящих в "Перечень периодических научных изданий, рекомендуемых ВАК .", 19 статей в сборниках научных трудов), 1 патент РФ, 1 положительное решение формальной экспертизы. Подана заявка на предполагаемое изобретение (приоритет от 23.06.2006).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы и приложения. Приложение содержит документальное подтверждение внедрения материалов диссертации в учебный процесс и практику научных исследований.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Цивилева, Ольга Михайловна

ВЫВОДЫ

1. В культуралыюй жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета Lentinus edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.

2. Культура L. edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по составу и физико-химическим свойствам. Внеклеточный лектин L\ из L. edodes — гликопротеин с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 43 кДа. L1 имеет в своем составе (10,5 ± 1,0) % (т/т) углеводов, представленных глюкозой. Внеклеточный лектин L2 — протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 к Да. L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0) % (т/т) углеводов, представленных глюкозой (73% (т/т) углеводной части молекулы лектина) и галактозой (27% (т/т) углеводной части молекулы лектина). В L2 высоко содержание Asn: 42% (т/т) от суммы аминокислот. Этот факт наряду с составом углеводной части молекулы (Glc+Gal) позволяет отнести L2 к N-аспарагинсвязанным белкам.

3. Два лектина L1 и L2 различаются по углеводной специфичности. Оба белка специфичны к D-галактозе и D-лактозе при одинаковой для L1 и L2 минимальной ингибирующей концентрации этих углеводов (2,08 мМ Gal; 8,33 мМ Lac). Другие углеводы, к которым лектины проявляют более или менее высокое сродство: для L1 это Rha (4,16 мМ); для L2 - Ara (4,16 мМ) и МапОН (8,33 мМ).

4. Два лектина L1 и L2 различаются по антигенным свойствам, имея при этом общие антигенные детерминанты. Очищенные внеклеточные лектины L. edodes высоко избирательны при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизированных эритроцитов кролика, не реагируя с эритроцитами других животных и человека.

5. Установлено, что активность и динамика образования лектинов L. edodes зависят от условий культивирования, а именно: температуры, количества посевного мицелия, возраста культуры, а также от состава среды глубинного культивирования: соотношения количеств углерода и азота, природы компонентов - источников углерода и азота, кислотности среды. Оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности шиитаке включает в качестве источника углерода L-арабинозу или D-глюкозу, источника азота - L-аспарагин.

6. Одним из значимых факторов, влияющих на лектиновую активность глубинной культуры L. edodes, является присутствие в среде культивирования катионов металлов(П). В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей лектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона М2+, но и источник углеродного питания грибной культуры. Полученные данные для металлов, образующих эти катионы, позволяют составить следующий ряд в порядке уменьшения положительного эффекта на активность внеклеточных лектинов шиитаке: Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>Ni. Влияние двухзарядных катионов металлов триады железа на активность внеклеточных лектинов L. edodes изменяется симбатно с энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным бидентатным лигандом этиленгликолем.

7. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L. edodes.

8. Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных лектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия — липидам и углеводам, что может свидетельствовать об участии лектинов L. edodes в морфогенетических процессах и инициации плодообразования.

9. Изменения активности внеклеточных лектинов L. edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с соединениями — представителями ряда 1,5-ди(4-11-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 в зависимости от структуры селенсодержащего компонента реакционных смесей, его концентрации, от стадии очистки белков, позволяют выявить влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий в химических процессах с участием лектинов. При этом результаты квантовохимических расчетов и QSAR свойства косвенно подтверждают большую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах по сравнению с Cys.

10. Выявлено взаимодействие лектинов L. edodes с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8 - 64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу. Возможность взаимодействия в указанной системе in vivo может основываться на участии обоих компонентов (и лектинов, по данным нашей работы, и ИУК, по литературным данным) в процессах морфогенетической дифференцировки мицелия высших грибов.

11. Впервые из внеклеточных метаболитов Lentinus edodes выделен галактолипид 53, являющийся одним из эндогенных регуляторов активности внеклеточных лектинов L. edodes. Галактолипид представляет собой D-галактопиранозу (15% (т/т) 53 содержат сульфат-Gal), ацилированную остатками октадекановой или нонадекановой кислот в соотношении 28% (т/т) и 72% (т/т) от суммы двух ЖК соответственно.

12. Предложена методика эффективного разделения двух внеклеточных лектинов L. edodes, основанная на дифференциации их хроматографических свойств в присутствии Cu(II).

304

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что Ьепйпт ейойеБ (шиитаке) занимает ведущие позиции по объему промышленного производства, известен своими ценными пищевыми качествами и перспективностью использования для получения медицинских препаратов, существуют значительные пробелы в изучении биохимических характеристик роста и развития Ь. ес1о(1еБ в глубинной культуре.

Глубинное (жидкофазное погруженное) культивирование считается эффективным методом получения посевного материала высших базидиомицетов для микологических исследований и широкомасштабного получения плодовых тел. Получение погруженной культуры в наиболее активном физиологическом состоянии требует изучения влияния добавок различной химической природы к известным жидким средам. Наши исследования при указанном способе выращивания Ь. ес1ос1е5 были направлены на изучение углеводсвязывающих белков — лектинов. Эти соединения, имеющие широкий спектр биологической активности, участвуют во внутриклеточных и межклеточных взаимодействиях, выступают в роли иммуномодуляторов и триггеров, широко используются в разных областях биологии, медицины. В то же время лектины высших ксилотрофных грибов малоизучены, а внеклеточные грибные лектины практически не описаны. Подавляющее большинство исследований лектинов высших грибов сосредоточено на определении их в экстрактах плодовых тел с целью использования этого признака в экологии и систематике. Поэтому важно изучение лектинов в связи с физиологическими аспектами, проблемами роста и развития грибов.

Вклад настоящей работы в биохимическую область знания состоит в описании новой группы гликопротеинов ксилотрофных базидиомицетов, внеклеточных лектинов, физико-химические свойства которых важны для понимания их физиологической роли, морфогенетических функций в грибном организме как объекте микробиологических исследований. Место настоящей работы в микробиологической области знания, способствующей созданию теоретических основ современных биотехнологий, следует рассматривать прежде всего в известных аспектах использования метода глубинного культивирования: выращивание посевного мицелия для получения плодовых тел; получение на основе культивирования мицелия съедобных грибов биологически активных и ценных химических веществ. К числу последних принадлежат и внеклеточные лектины L. edodes, как следует из результатов настоящей работы, при этом основным методом их накопления для дальнейшего выделения и очистки служит погруженное культивирование.

В ходе выполнения настоящей работы достаточно полно решены задачи, поставленные в связи с изучением активности внеклеточных лектинов Lentinus edodes в зависимости от условий глубинного культивирования, с оптимизацией состава жидкой среды выращивания для получения максимальной лектиновой активности и дальнейшего выделения внеклеточных лектинов. Известный подход введения добавок разнообразной химической природы в синтетические среды позволил не только провести указанную оптимизацию, но и выявить значительное увеличение лектиновой активности в условиях, неблагоприятных для роста мицелия - явление, свидетельствующее в пользу адаптогенной роли лектинов.

Несомненный интерес представляет исследование влияния ультрамикроэлементов, в том числе селена, на рост и развитие съедобных грибов, поскольку одним из наименее изученных аспектов биохимии и физиологии высших грибов справедливо считается их отношение к различным микроэлементам. Согласно взглядам многих исследователей, селен не только действует на процессы, происходящие в организме, но и сам активно включается в метаболизм. В последние годы отмечается отсутствие достаточно обоснованных сведений о физиологических и биохимических механизмах действия селена. Участие соединений селена в процессах роста, развития грибных культур как на вегетативной, так и на генеративной стадиях, важная роль в биохимических процессах живой клетки требуют дальнейшего внимания исследователей к этому ультрамикроэлементу во взаимосвязи с жизнедеятельностью грибных организмов наряду с другими биологическими системами.

Наше предположение и дальнейшее обоснование роли лектинов как потенциальных морфообразующих белков позволило внести определенный вклад в развитие вопроса об одной из стадий морфогенеза шиитаке, характерной для данного вида - коричневой мицелиальной пленке (МП). Отличительные биохимические особенности МП до сих пор были неизучены, хотя обнаружена интересная корреляция между появлением МП шиитаке и началом плодоношения, причем плодовые тела шиитаке также содержат коричневый пигмент. Проведенные нами исследования приводят к выводу, что лектиновая активность является важной биохимической характеристикой мицелия шиитаке на стадии МП. Во-первых, чем выше лектиновая активность мицелия, тем быстрее формируется МП; во-вторых, отмечается значительное увеличение лектиновой активности на этапе МП по сравнению с другими стадиями развития гриба. Лектины принимают участие в образовании МП и плодоношении. Мы в связи с этим предположили и доказали, что получение МП в глубинной культуре и использование этого мицелия в качестве посевного материала приводит к положительным результатам при последующем формировании плодовых тел. Данная часть работы завершена получением патента РФ.

Часть работы посвящена изучению взаимосвязи химического состава мицелия и лектиновой активности, углеводной специфичности агглютининов шиитаке в процессе плодообразования. Впервые для выявления возможных изменений химического состава мицелия перед плодообразованием исследовали биохимические особенности (углеводный и жирнокислотный состав мицелия во взаимосвязи с лектиновой активностью), проявляющиеся при формировании неполноценных плодовых тел у выбранных штаммов шиитаке. Внеклеточные лектины L. edodes можно отнести к группе морфообразующих. Это подтверждается следующим:

- изменением лектиновой активности на разных вегетативных и репродуктивных стадиях развития грибной культуры как на плотных, так и на жидких средах, активизацией процессов формирования пигментированной мицелиальной пленки в глубинной культуре шиитаке с повышенной лектиновой активностью;

- особенностями углеводного состава и лектиновой активности, проявляющимися в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел, корреляциями состава углеводного компонента мицелия и углеводной специфичности лектинов. Увеличение лектиновой активности и содержания углеводов, к которым специфичны лектины культуры, на фоне роста количества маннита и снижения уровня инозита перед плодоношением, свидетельствуют в пользу предположения об участии лектинов в индукции процесса плодообразования;

- особенностями жирнокислотного состава и лектиновой активности, проявляющимися в условиях формирования обычных и неполноценных плодовых тел.

Сотрудничество с профессором кафедры аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета А.Н. Панкратовым позволила в нескольких публикациях, пользуясь современными расчетными методами квантовой химии и QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships), представить теоретическое толкование полученных результатов. В частности,

- предложить одно из объяснений влияния катионов металлов(П) на лектиновую активность L. edodes с позиций квантовой химии на основе исследования динамики изменения активности внеклеточных лектинов в присутствии двухзарядных катионов металлов триады железа в составе жидкой синтетической среды культивирования;

- обосновать дифференциальный характер взаимодействия аминокислот -химических гомологов, аспарагина и глутамина, с двухзарядными катионами кальция или марганца как одну из причин избирательного положительного эффекта аспарагина в отношении формирования коричневой мицелиальной пленки L. edodes в глубинной культуре;

- рассмотреть возможные причины повышения активности препаратов лектинов шиитаке в присутствии селенсодержащих органических соединений, а именно 1,5-дифенил-3-селенпентандиона-1,5 и его алкилоксизамещенных с общим названием 1,5-ди(4-К-фенил)-3-селенпентандион-1,5, где R - метокси, этокси, м-октилокси группы; провести сравнительное квантовохимическое исследование электронного строения молекул и реакционной способности двух серусодержащих эссенциальных аминокислот - L-цистеина и L-метионина на начальном этапе взаимодействия с электрофильными реагентами для выяснения предпосылок замещения атома серы на селен именно в молекуле L-метионина.

На основании обнаруженных нами физико-химических свойств и реакционной способности внеклеточных лектинов шиитаке представляется возможным сделать предположения о некоторых аспектах их физиолого-биохимической роли. Прежде всего привлекает внимание способность L2 легко связывать органические соединения с образованием достаточно устойчивых комплексов, и в то же время это связывание обратимо. Как нам кажется, это до некоторой степени напоминает сигнальные образраспознающие рецепторы (pattern recognition receptors) (ОРР) [Лебедев и Понякина, 2006]. Каковы общие черты поведения ОРР и изучаемых нами гликопротеинов? Они могут узнавать определенные молекулярные структуры. В результате взаимодействия с чужеродными лигандами ОРР активируются, и далее активируют биохимический ответ организма (возможно, и грибного). Подобные рецепторы открыты в период с 1989 по 1999 годы не только на клетках животных, но и растений. С 2000 г. в работу по ОРР включились широкие массы исследователей. К сожалению, в России исследования по ОРР практически не начаты [Лебедев и Понякина, 2006].

Каждый ОРР имеет свои четко обозначенные агонисты, с которыми он связывается. До 2003 г. считалось, что такими агонистами могут быть только молекулярные структуры, отсутствующие в рассматриваемом организме (обладателе ОРР). Однако с 2003 г. нарастает количество публикаций, указывающих, что лигандами для ОРР могут являться даже синтетические соединения. Целый ряд веществ, появляющихся при стрессе организма, таких как антигены температурного шока и продукты разрушения клеток, также являются агонистами ОРР [Boasen et al., 2005; Takeda and Akira, 2005; Ohashi et al., 2000]. В настоящее время можно считать, что агонистами ОРР являются самые разнообразные вещества, нехарактерные для нормально функционирующих клеток и систем организма [Лебедев и Понякина, 2006].

С позиции экологической адаптации к стрессовым воздействиям можно следующим образом представить себе возникновение явления постоянного присутствия лектинов у необычного ксилотрофа (по удачному определению Л.В. Гарибовой, 1998) шиитаке. Процесс адаптации к неблагоприятным условиям среды путем повышения уровня экскреции лектинов сопровождается накоплением в мицелии короткоцепочечных жирных кислот - факторов автолизиса мицелия, наряду с веществами - факторами анабиоза (просто пока не выявленными у шиитаке, как мы уверены). Но если у типичных ксилотрофов синтез специализированных вторичных метаболитов связан только с экстремальной ситуацией и происходит (как основное условие) при торможении и прекращении ростовых процессов, то у шиитаке в процессе приспособительной эволюции возник новый феномен - способность образовывать лектины в течение интенсивно протекающих процессов формирования коричневой мицелиальной пленки. Эта морфологическая структура, оказывая протекторное действие на мицелий при подготовке к плодоношению, характеризуется повышенным содержанием лектинов и обеспечивает шиитаке возможность существования устойчивого сцепления между гифами с участием белок-углеводных взаимодействий. Шиитаке приспособились жить в условиях постоянной готовности к формированию коричневой мицелиальной пленки. Есть основания предполагать, что у шиитаке белки-лектины (возникающие de novo, характерные для стрессовых ситуаций белки) стали конститутивными, превратились в продукт нормального метаболизма этих организмов. Есть еще факты, которые подтверждают высказанное нами предположение о том, что с точки зрения биохимической эволюции лектиновую активность гриба следует рассматривать не как качественно новый феномен, а скорее как появление возможности постоянно использовать в экстремальных условиях существования все те адаптационные механизмы, которые функционируют и у обычных ксилотрофов. Однако у последних они функционируют временно и только в стрессовых состояниях, и не обеспечивают организму возможности нормально метаболизировать, а лишь существовать в течение очень краткого периода.

Экспериментальные данные, полученные в результате исследований, позволят расширить знания о роли лектинов в процессах биологического узнавания, их участии в межклеточных взаимодействиях, в жизнедеятельности ксилотрофных базидиальных грибов, в частности, добиться в выяснении связей "лектиновая активность - морфогенетическое развитие" несколько больших достижений, чем существующие к настоящему времени очень ограниченные представления. Роль лектинов высших грибов в плодообразовании остается невыясненной в настоящее время. Высказываются лишь догадки в отношении физиологической роли коричневой мицелиальной пленки шиитаке, морфологической структуры, характерной для Lentinus edodes и предшествующей плодоношению. Стабилизирующая, адаптогенная роль лектинов живых организмов, обсуждаемая в научной литературе, до сих пор практически не рассматривалась для микологических культур. Весьма интересен дальнейший поиск соединений — эффекторов внеклеточной лектиновой активности грибной культуры. Углубленные исследования в этих и сопутствующих им направлениях, как нам кажется, способны в перспективе значительно расширить представления о малоизученной пока группе внеклеточных белков с лектиновыми свойствами у ксилотрофных базидиомицетов. I

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Цивилева, Ольга Михайловна, Саратов

1. Андреев B.C., Попов В.Г., Дронова H.B. Электробиохимический механизм регуляции физиологической деятельности микроорганизмов на популяционном уровне // Биотехнология. 1988. Т. 4, № 1. С. 32-36.

2. Ахмедова З.Р. Биодеградация растительных отходов грибом Pleurotus ostreatus II Биотехнология. 1992. Т. 26, вып. 3. С. 109-115.

3. Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия. М.: Высшая школа, 1998.743 с.

4. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А., Смирнов Д.А. Факторы, влияющие на образование полисахаридов Ganoderma licidum II Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т. 41, № 2. С. 194-199.

5. Бейдер Р. Атомы в молекулах: Квантовая теория / Пер. с англ. Е.С. Апостоловой, М.Ф. Боброва, К.Ю. Супоницкого, К.А. Лысенко, И.И. Воронцова; Под ред. М.Ю. Антипина, В.Г. Цирельсона. М.: Мир, 2001. 532 с.

6. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших базидиальных грибов -объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. 1992. Т. 26, вып. 4. С. 321-324.

7. Белозерская Т. А., Гесслер H.H. Окислительный стресс и цитодифференцировка у Neurospora crassa II Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. С. 497-501.

8. Беккер З.И. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988.227 с.

9. Бисько H.A., Дудка И.А. Биология и культивирование съедобных грибов рода вешенка. Киев: Наукова думка, 1987. 148 с.

10. Бисько H.A., Фомина В.И., Володина Е.П., Билай В.Т. Изменениехимического состава субстрата при культивировании Pleurotus ostreatus // Микол. и фитопатол. 1986. Т. 20, вып. 5. С. 392-395.

11. Битюцкий Н.П. Микроэлементы и растение. СПб: Изд-во СПб ун-та, 1999. 230 с.

12. Блинохватов А.Ф. О селене, которого нам не хватает // Химия и жизнь. 1995. Т. 23, №3. С. 40-45.

13. Блинохватов А.Ф., Иванов А.И., Вихрева В.А., Денисова Г.В., Ильин Д.Ю., Хрянин В.Н. Значение селена для объектов биосферы // Эколого-экономическое развитие России (анализ и перспективы): Альманах, поев. 10-летию РАЕН. М., 2000. С. 145-152.

14. Блохин Д.Ю. Локализация белковых зон в полиакриламидном геле методом серебряного окрашивания // Лабораторное дело. 1988. № 8. С. 30-33.

15. Булах Е.М., Говорова O.K. Редкие и новые для России виды базидиальных грибов из Приморского края // Микол. и фитопатол. 2000. Т. 34, № 2. С. 21-25.

16. Бухало A.C. Влияние различных источников углерода и азота в синтетических средах на рост базидиомицетов // Микол. и фитопатол. 1972. Т. 6, вып. 3. С. 241-244.

17. Бухало A.C. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев: Наукова думка, 1988. 144 с.

18. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубиннойкультуре / Бисько H.A., Бухало A.C., Вассер С.П. и др. / Под общ. ред. Дудка И.А. Киев: Наукова думка, 1983. 312 с.

19. Гааль Э., Медъеши Г., Верецки А. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. 449 с.

20. Гарибова JI.B. Физиология питания культурного шампиньона (Agaricus bisporus Lange). 1. Углеродное питание // Науч. докл. высшей школы. Биол. науки. 1963. № 4. С. 137-140.

21. Гарибова JI.B. Барсукова Т.Н., Иванов А.И., Иманкулов М.О. Виды вешенок, перспективные для промышленного культивирования // Биол. науки. 1992. Вып. 3. С. 109-115.

22. Гарибова JI.B., Завьялова J1.A., Александрова Е.А., Никитина В.Е. Некоторые особенности биологии шиитаке Lentinus edodes (Berk.) Sing Lentinula edodes (Berk.) Pegler. // Материалы IV Междунар. конф. "Наука и практика грибоводства". М., 1997. С. 61-64.

23. Гарибова Л.В., Сидорова И.И. Грибы. Энциклопедия природы России. М.: ABF, 1997. 352 с.

24. Голдовский A.M. Анабиоз. Л.: Наука, 1981. 136 с.

25. Головлева Л.А., Леонтьевский A.A. Лигнинолитическая активность дереворазрушающих грибов // Микробиология. 1998. Т. 67, № 5. С. 581-587.

26. Голубев В.И., Кулаковская Т.В., Голубева E.B. Pseudozyma fusiformata ВКМ Y-2821 продуцент антифунгального гликолипида // Микробиология. 2001. Т. 70, № 5.С. 642-646.

27. Голубев В.И., Кулаковская Т.В., Кулаковская Е.В., Голубев Н.В. Фунгицидная активность внеклеточного гликолипида Sympodiomycopsis paphiopedili Sugiyama et al. // Микробиология. 2004. Т. 73, № 6. С. 841-845.

28. Дворнина A.A. Базидиальные съедобные грибы в искусственнойкультуре. Кишинев: Штиинца, 1990. 111 с.

29. Деви С.Р., Прасад M.H.B. Антиокислительная активность растений Brassica juncea, подвергнутых действию высоких концентраций меди // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 2. С. 233-237.

30. Денисова Г.В. Влияние неорганических соединений селена на рост и развитие базидиальных макромицетов: Дис. канд. биол. наук. М., 1999. 130 с.

31. Денисова Г.В., Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. Влияние неорганического соединения селена на рост и плодоношение грибов // Сб. тр. науч. конф. спец. сельского хоз-ва. Пенза, 1997. С. 84-85.

32. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985. 304с.

33. Детерман Г. Гель-хроматография / Пер. с нем. П.Д. Решетова. М.: Мир, 1970. 252 с.

34. Днепровский A.C., Темникова Т.И. Теоретические основы органической химии. Строение, реакционная способность и механизмы реакций органических соединений. JL: Химия, 1991. 560 с.

35. Древко Б.И., Древко Р.И., Антипов В.А., Яковлев А.Н. Средство для лечения и профилактики инфекционных заболеваний и отравлений // Пат. РФ №2171110. Бюлл. изобрет. 2001. № 21.

36. Дудка И.А., Бисько H.A., Билай В.Т. Культивирование съедобных грибов. Киев, 1992. 160с.

37. Дьюар М. Теория молекулярных орбиталей в органической химии / Пер. с англ. A.A. Дяткиной; Под ред. М.Е. Дяткиной. М.: Мир, 1972. 592 с.

38. Дьяков Ю.Т. Грибы, их значение в жизни природы и человека // Соросовский образовательный журн. 1997. № 3. С. 38-45.

39. Дэннис Дж., Шнабель Р. Численные методы безусловной оптимизации ирешения нелинейных уравнений / Пер. с англ. О.П. Бурдакова; Под ред. Ю.Г. Евтушенко. М.: Мир, 1988. 440 с.

40. Ермаков В.В., Ковальский В.В. Биологическое значение селена. М.: Наука, 1974. 298 с.

41. Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. О роли базидиальных макромицетов в трансформации ультрамикроэлементов в экосистемах. 1. Биоабсорбция селена // Микол. и фитопатол. 2003. Т. 37, вып. 1. С. 70-75.

42. Иванов А.И., Блинохватов А.Ф., Денисова Г.В., Ильин Д.Ю. Влияние соединений селена на рост и развитие грибов. И. Макромицеты // Микол. и фитопатол. 2000. Т. 34, вып. 5. С. 46-50.

43. Ильин Д.Ю. Влияние селена на рост и развитие микромицетов -продуцентов биологически активных веществ: Дис. канд. биол. наук. М., 2001. 126 с.

44. Карелина Л.В. Содержание селена в некоторых растения // Микроэлементы-регуляторы жизнедеятельности и продуктивности растений. Рига, 1971. 209 с.

45. Кефели В.И. Фитогормоны и природные ингибиторы в процессах роста растений. М.: Наука, 1975. С. 89-110.

46. Киричук В.Ф. Физиология крови. Саратов: Изд-во Сарат. гос. мед. ун-та, 2002. 69 с.

47. Кларк Т. Компьютерная химия: Практ. руководство по расчетам структуры и энергии молекулы / Пер. с англ. A.A. Коркина; Под ред. B.C. Мастрюкова, Ю.Н. Панченко. М.: Мир, 1990. 383 с.

48. Кобзарь Е.Ф., Сердюк О.П. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе ауксинов // Биохимия. 1993. Т. 58, вып. 1. С. 50-61.

49. Коваленко Э.А. Аминокислотный и моносахаридный состав внеклеточных сиалоспецифичных лектинов бактрий рода Bacillus // Микробиологический журнал. 1997а. Т. 59, № 5. С. 3-6.

50. Коваленко Э.А. Углеводная специфичность внеклеточных лектинов бактерий рода Bacillus II Микробиологический журнал. 1997b. Т. 59, № 5. С. 713.

51. Ковальский В.В., Раецкая Ю.И., Грачева Т.И. Микроэлементы в растениях и кормах. М., 1971. 64 с.

52. Козловский А.Г., Желифонова В.П., Винокурова Н.Г., Озерская С.М. Влияние микроэлементов на биосинтез вторичных метаболитов грибом Pénicillium citrinum Thom ВКМ F-1079 // Микробиология. 2000. T. 69, № 5. С. 642-646.

53. Козловский А.Г., Соловьева Т.Ф. Влияние условий культивирования на биосинтез алкалоидов Pénicillium kapuscinskii // Микробиология. 1986. Т. 55, вып. 1.С. 34-40.

54. Кон В. Электронная структура вещества волновые функции и функционалы плотности // Успехи физич. наук. 2002. Т. 172, № 3. С. 336-348.

55. Конова И.В., Карпова Н.В., Ткачевская Е.П., Алексеев С.М. Фенолсодержащие гликолипиды в составе липидных фракций гетероталличных штаммов зигомицета Blakeslea trispora II Микробиология. 1991. T. 60, вып. 1. С. 85-91.

56. Коренман И.М. Органические реагенты в неорганическом анализе: Справочник. М.: Химия, 1980. 448 с.

57. Королев Н.П. Функции лектинов в клетках // Итоги науки и техники. Сер. Общие проблемы физ.-хим. биологии. Т. 1. М.: ВИНИТИ, 1984. С. 351.

58. Кочкина Г.А., Иванушкина Н.Е., Озерская С.М. Антимикробные свойства базидиального гриба Lentinula edodes (Berk.) Pegler II Материалы III Междунар. конгр. "Наука и практика грибоводства". Россия, Кашира, 1996. С. 87-89.

59. Краснопольская JI.M. Базидиомицеты перспективные источникилекарственных соединений // М.: НИИНА РАМН, 1997. С. 71-74.

60. Краснопольская Л.М., Белицкий И.В. Физиолого-биохимические основы использования культивируемых лекарственных базидиомицетов // Там же. С. 24-25.

61. Кудрин А.Н. Научные основы применения неорганических и органических соединений селена в медицинской практике // Витамины. 1975. Вып. 8. С. 128-134.

62. Кулаева О.Н. Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. С. 62-83.

63. Кучменко Т. А. Применение метода пьезокварцевого микровзвешивания в аналитической химии. Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. технол. акад., 2001. 280 с.

64. Кучменко Т.А., Аристов И.В., Десятов Д.Б. Применение методов планирования многофакторных экспериментов в аналитической химии. Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. технол. акад., 1999. 101 с.

65. Лахтин В.М. Биотехнология лектинов // Биотехнология. 1989. Т. 5, № 6. С. 676-691.

66. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Молекулярная биология. 1994. Т. 28, вып. 2. С. 245-273.

67. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Новая иммунология — иммунология образраспознающих рецепторов // Изв. РАН. Серия биологическая. 2006. № 5.1. С. 517-529.

68. Лидин P.A., Андреева Л.Л., Молочко В.А. Справочник по неорганической химии. Константы неорганических веществ. М.: Химия, 1987. 320 с.

69. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Пленина Л.В., Пучкова Т.А., Осадчая О.В. Состав и биологическая активность глубинного мицелия ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes II Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39, № 1. С. 69-73.

70. Ловкова М.Я., Бузук Г.Н., Пономарева С.М. Молекулярные уровни регуляции метаболизма изохинолинов, индолов и тропанов. Роль кобальта и цинка в их образовании // Прикл. биохимия и микробиология. 1995. Т. 31, № 1. С. 80-86.

71. Луцик А.Д., Детюк Е.С., Луцик М.Д. Лектины в гистохимии. Львов: Вища школа, 1989. 156 с.

72. Луцик М.Д., Панасюк E.H., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Вища школа, 1981. 156 с.

73. Малахов H.H., Богданов A.A. Общение членов МАГ-участников «Дней российского грибоводства», проходивших с 19 по 22 июня 2001 года в Санкт-Петербурге // Школа грибоводства. 2001. № 4. С. 2.

74. Маркина Ж.В., Айздайчер H.A. Содержание фотосинтетических пигментов, рост и размер клеток микроводоросли Phaeodactylum tricornutum при загрязнении среды медью // Физиология растений. 2006. Т. 53, № 3. С. 343347.

75. Марков Е.Ю., Хавкин Э.Е. Лектины растений: предполагаемые функции // Физиол. растений. 1983. Т. 30, вып. 5. С. 852-867.

76. Маслова P.A. Влияние различных источников азота на рост дереворазрушающих грибов в культуре // Микол. и фитопатол. 1969. Т. 3, № 5. С. 452-457.

77. Методы белкового и аминокислотного анализа растений / Под ред. В.Г. Конарева. Л., 1973.

78. Методы экспериментальной микологии / Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1982. 550 с.

79. Мехтиева H.A., Рабкрин H.A. Значение явления серно-селенового антагонизма в развитии почвенных гифомицетов и накопление ими селена // Селен в биологии. Баку: Элм, 1981. С. 252-255.

80. Мюллер Э., Лёффлер В. Микология / Пер. с нем. М.: Мир, 1995. 343с.

81. Налимов В.В., Чернова H.A. Статистические методы планирования экстремальных экспериментов. М.: Наука, 1965. 340 с.

82. Налимова A.A., Попова В.В., Цоглин Л.Н., Пронина H.A. Влияние меди и цинка на рост Spirulina platensis и аккумуляция клетками тяжелых металлов // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 2. С. 259-265.

83. Негруцкий С.Ф. Физиология и биохимия низших растений. Киев: Вища школа, 1990. 200с.

84. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов / Под ред. Зигель X., Зигель А. М.: Мир, 1993. 366 с.

85. Низковская О.П. Противоопухолевые свойства высших базидиомицетов // Микол. и фитопатол. 1983. Т. 17, вып. 1. С. 243-247.

86. Никитина В.Е. Лектины азоспирилл: свойства, биологическая активность и перспективы их практического использования: Дис. . докт. биол. наук. Саратов, 2001. 317 с.

87. Никитина В.Е., Богомолова Н.В. Использование бактериальных лектинов для решения некоторых проблем гематологии: Науч.-информ. пособие. Саратов: Изд-во Сарат. гос. мед. ун-та, 2000. 28 с.

88. Никитина В.Е., Итальянская Ю.В., Аленькина С.А. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза лектина Azospirillum lipoferum 59b // Микробиол. журн. 1997. Т. 59, № 2. С. 12-19.

89. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Гарибова Л.В. Стимуляторы лектиновой активности Lentinus edodes на синтетических агаризованных средах // Биотехнология. 2004. № 3. С. 49-54.

90. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40, № 4. с. 387-397.

91. Николайчук Л.Ф., Шубина Е.Е., Розенцвет O.A., Козлов В.Г. Влияниеионов меди, свинца и кадмия на рост мицелия и состав липидов Pleurotus ostreatus II Микология и фитопатология. 2005. Т. 39, вып. 2. С. 56-61.

92. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия. 2007. Т. 72, вып. 2. С. 158-174.

93. Панкратов А.Н. Квантовохимическое описание региоселективности нитрования замещенных бензолов // Изв. вузов. Химия и хим. технол. 2004. Т. 47, вып. 9. С. 124-129.

94. Панкратов А.Н. Количественные соотношения «структура — свойство» в ряду катионов диазония полупродуктов синтеза аналитических форм и красителей // Журн. аналит. химии. 2005. Т. 60, № 2. С. 149-156.

95. Панкратов А.Н. Кислоты и основания в химии. Саратов: Изд-во Саратовск. ун-та, 2006. 196 с.

96. Панкратов А.Н., Остроумов И.Г. Установление строения молекул физическими методами. Саратов: Изд-во Саратовск. ун-та, 1995. 132 с.

97. Панкратов А.Н., Шалабай A.B. Квантовохимическая оценка протолитических свойств тиофенолов // Журн. структурн. химии. 2004. Т. 45, № 5. С. 800-806.

98. Панкратов А.Н., Щавлев А.Е. Протолитические, окислительно-восстановительные и полярные свойства реагентов ряда дифениламина: квантовохимическая оценка // Журн. аналит. химии. 2001. Т. 56, № 2. С. 143150.

99. Пат. РФ № 2239983. Способ выращивания съедобных грибов Lentinus edodes / В.Е. Никитина, О.М. Цивилева. Приоритет 21.03.2003.

100. Пецев Н., Коцев Н. Справочник по газовой хроматографии / Пер. с болг. В.М. Муллера; Под ред. В.Г. Березкина, К.И. Сакодынского. М.: Мир, 1987. 260 с.

101. Плужников К.А., Бочаров Д.Н., Кононова Н.В., Суханов C.B., Балашова

102. Т.А., Арсеньев A.C., Гришин E.B. Идентификация и структурный анализ гликофосфолипидного компонента из яда муравья Paraponera clavata // Биоорганическая химия. Т. 32, № 5. С. 530-537.

103. Поддубный A.B., Христофорова Н.К. Оценка качества среды по содержанию тяжелых металлов в опенке осеннем Armillaria mellea // Микология и фитопатология. 1999. Т. 33, вып. 4. С. 271-274.

104. Пономарева Е.Г., Аленькина С.А., Никитина В.Е. Воздействие неблагоприятных факторов на лектиновую активность Azospirillum brasilense и Azospirillum lipoferum II Биотехнология. 2000. № 5. С. 19-24.

105. Псурцева Н.В., Белова Н.В., Алехина И.А. Биотехнологические возможности использования коллекционных культур базидиомицетов // Биотехнология. 1994. № 7. С. 35-39.

106. Решетникова И.А. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. М., 1997. 197 с.

107. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйшая школа, 1973. 320 с.

108. Руководство по гематологии / Под ред. А.И. Воробьева, Ю.И. Лорие. М.: Медицина, 1979. 584 с.

109. Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы //Успехи микробиол. 1985. Т. 20. С. 227-252.

110. Серегин И.В., Кожевникова А.Д. Физиологическая роль никеля и его токсическое действие на высшие растения // Физиология растений. 2006. Т. 53, № 2. С. 285-308.

111. Соломко Э.Ф., Митропольская Н.Ю. Получение посевного материала Lentinus edodes (Berk.) Sing, глубинным методом II Микол. и фитопатол. 1994. Т. 28, вып. 3. С. 34-39.

112. Сурова Т.В., Еняшин А.Н. Таутомерия и кислотные свойства Nнезамещённых бензогидроксамовых кислот: полуэмпирическаяквантовохимическая оценка // Журн. структурн. химии. 2003. Т. 44, № 2. С. 334337.

113. Тамбиев А.Х. Реакционная способность экзометаболитов. М.: Изд-во МГУ, 1984. С. 34-40.

114. Торшин С.П., Удельнова Т.М., Ягодин Б.А. Биогеохимия и агрохимия селена и методы устранения селенодефицита в пищевых продуктах и кормах // Агрохимия. 1996а. № 8-9. С. 127-144.

115. Торшин С.П., Ягодин Б.А., Удельнова Т.М., Голубкина H.A., Дудецкий A.A. Влияние микроэлементов Se, Zn, Mo при разной обеспеченности почвы микроэлементами и серой на содержание селена в растениях яровой пшеницы и рапса // Агрохимия. 1996b. № 5. С. 54-64.

116. Тишенков А.Д. Культивирование шиитаке // Школа грибоводства. 2000. №1. С. 6-11.

117. Упитис В.В. Макро- и микроэлементы в оптимизации минерального питания микроводорослей. Рига: Зинатне, 1983. 240 с.

118. Федоров В. В. Теория оптимального эксперимента. М.: Наука, 1971. 312с.

119. Феофилова Е.П. Биохимическая адаптация грибов к температурному стрессу: Обзор//Микробиология. 1994. Т. 63, № 5. С. 757-776.

120. Феофилова Е.П. Использование высших базидиальных грибов для создания лекарственных препаратов // Матер. III Междунар. конгр. "Наука и практика грибоводства". Россия, Кашира, 1996. С. 17-20.

121. Феофилова Е.П. Прогресс в области экспериментальной микологии как основа для создания современных биотехнологий // Микробиология. 1997. Т. 66, № з. с. 302-309.

122. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов: Обзор // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. Т. 34, № 6. С. 597-608.

123. Феофилова Е.П. Царство грибов: гетерогенность физиолого-биохимических свойств и близость к растениям, животным и прокариотам: Обзор // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. Т. 37, № 2. С. 141-155.

124. Феофилова Е.П., Горнова И.Б., Меморская A.C., Гарибова JI.B. Липидный состав плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing Lentinula edodes (Berk.) Pegler. // Микробиология. 1998. Т. 67, № 5. С. 655-659.

125. Феофилова Е.П., Дараган-Сущова М.В., Волохова М.В., Величко Б.А., Широкова Е.А., Синицин А.П. Изменения в химическом составе клеток в цикле развития Aspergillus japonicus // Микробиология. 1988. Т. 57, вып. 5. С. 778-784.

126. Феофилова Е.П., Михайлова М.В., Грязнова М.В., Горнова И.Б. Участие липидов в фотоспорогенезе Aspergillus japonicus // Докл. Акад. наук СССР. 1989. Т. 307, № 1. С. 234-236.

127. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Меморская A.C., Марышова Н.С. Прорастание базидиоспор Agaricus bisporus // Прикл. биохим. и микробиол. 2004. Т. 40, № 2. С. 220-226.

128. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Горнова И.Б. Изменения в углеводном составе клеток грибов в связи с адаптацией к температурному стрессу // Микробиология. 1994. Т. 63, № 5. С. 792-798.

129. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C., Хохлова Н.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе липидов // Микробиология. 2000. Т. 69, №5. С. 612-619.

130. Фомина В.И., Бисько H.A., Билай В.Т. Особенности роста мицелиев штаммов Lentinus edodes (Berk.) Sing на растительных субстратах // Микол. и фитопатол. 1998 Т. 32, вып. 4. С. 18-23.

131. Фомина В.И., Митропольская Н.Ю., Бисько H.A., Шевцова Л.В. Отбор высокопродуктивных штаммов Lentinus edodes // Микол. и фитопатол. 2003. Т. 37, вып. 2. С. 60-65.

132. Хроматография: Практ. приложение метода: В 2-х ч. Ч. 2 / Пер. с англ.

133. A.B. Родионова; Ред. пер. В.Г. Березкин / Под ред. Э. Хефтмана. М.: Мир, 1986. 422 с.

134. Хьюи Дж. Неорганическая химия. Строение вещества и реакционная способность / Пер. с англ. Л.Ю. Аликберовой, Н.И. Козловой, Н.С. Рукк, Е.В. Савинкиной, A.A. Цветкова; Под общ. ред. Б.Д. Степина, P.A. Лидина. М.: Химия, 1987. 696 с.

135. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Е.А., Нетрусов А.И. Микроорганизмы стимуляторы роста растений и их практическое применение (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42, №2. С. 133-143.S

136. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Влияние состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т. 41, № 2. С. 200-203.

137. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Игнатов

138. B.В. Гемагглютинирующая активность Lentinus edodes (Berk.) Sing Lentinula edodes (Berk.) Pegler. // Микробиология. 2000. Т. 69, № 1. С. 38-44.

139. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и лектиновую активность Lentinus edodes II Биотехнология. 2005. № 2. С. 56-62.

140. Чарыков A.K. Математическая обработка результатов химического анализа. Л.: Химия, 1984. 270 с.

141. Шнырева A.B. Иммуномодулирующие свойства полисахаридов высших базидиальных грибов // Успехи мед. микол. Т. 3. М.: Национальная академия микологии, 2004. С. 189-192.

142. Adachi Y., Okazaki М., Ohno N., Yadomae Т. Enhancement of cytokineproduction by macrophages stimulated with (1—>3)-beta-D-glucan, grifolan (GRN), isolated from Grifola frondosa II Biol. Pharm. Bull. 1994. V. 17. P. 1554-1560.

143. Ahmad N., Bansal R., Ahmad A., Rastogi A.K., Kidway J.R. purification of hemagglutinins from Agaricus bisporus by affinity chromatography // Indian J. Biochem. Biophys. 1984. V. 21. P. 237-240.

144. Akira N., Takao H., Takashi S. Uptake of copper ion by green microalgae // Agric. Biol. Chem. 1979. V. 43. P. 1455-1460.

145. Albergoni V., Piccini E., Coppelotti O. Response to heavy metals in organisms // Compar. Biochem. Physiol. 1980. V. 67. P. 121-127.

146. Alscher R.G. Biosynthesis and antioxidant function of glutathione in plants // Physiol. Plant. 1988. V. 77. P. 457-464.

147. Ander P.L., Eriksson K.E. Lignin degradation and utilization by microorganisms // Progress in industrial microbiology / Ed. M.J. Bull. Amsterdam: Elsevier, 1978. V. 14. P. 1-58.

148. Asada Y., Watanabe A., Ohtsu Y., Kuwahara M. Purification and characterization of an aryl-alcohol oxidase from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium II Biosci. Biotech. Biochem. 1995. V. 59, № 7. P. 1339-1341.

149. Babilskaya V.G. Biologically active substances of mycelia and fruiting bodies of mushrooms Lentinus Fr. and Pleurotus (Fr.) P. Karst. // Intern. J. Med. Mushrooms. 2001. V. 3, №4. C. 42-43.

150. Bader R.F.W A Quantum Theory of Molecular Structure and Its Applications // Chemical Reviews. 1991. V. 91, № 5. P. 893-928.

151. Banerjee P.C., Ghosh A.K., Sengupta S. Hemagglutinating activity in extracts of mycelia from submerged mushroom cultures // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 44. P. 1009-1011.

152. Barceloux D.G. Selenium II J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1999. V. 37, № 2. P. 145-172.

153. Becke A.D. Density-Functional Thermochemistry. III. The Role of Exact Exchange //J. Chem. Phys. 1993. V. 98, № 7. P. 5648-5652.

154. Becke A.D. Density-Functional Exchange-Energy Approximation with Correct

155. Asymptotic Behavior 11 Physical Review A. 1988. V. 38, № 6. P. 3098-3100.

156. Besse D., Siedler F., Dierks T., Kessler H., Moroder L. The redox potential of selenocysteine in unconstrained cyclic peptides // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997. V. 36. P. 883-805.

157. Bettger W.J. Zinc and selenium, site-specific versus general antioxidation // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1993. V. 71, № 9. P. 721-724.

158. Beveridge T.J., Murray R.C.E. Sites of metal deposition in the cell wall of Bacillus subtilis //J. Bacteriol. 1980. V. 141. P. 876-877.

159. Birkett J.A., Rowlands R.T. Chlorate resistance and nitrate assimilation in industrial strains of Pénicillium chrysogenium // J. Gen. Microbiol. 1981. V. 123. P. 281-285.

160. Blessing H., Kraus S., Heindl P., Bal W., Hartwig A. Interaction of selenium compounds with zinc finger proteins involved in DNA repair // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 3190-3199.

161. Boasen J., Chisholrn D., Lebet L., et al. House dust extracts elicit Toll-like receptor-dependent dendritic cell responces // J. Allergy Clin. Immunol. 2005. V. 116. P. 185-195.

162. Bodor N., Gabanyi Z., Wong Chu-Kuok. A new method for the estimation of partition coefficient //J. Amer. Chem. Soc. 1989. V. Ill, № 11. P. 3783-3786.

163. Botton B., Guillot J. Purification d'une lectine a partir du basidiomycete Rigidoporus lignosus, parasite de l'hevea. implication possible de la molecule dans la différenciation des palmettcs du champignon. IVeme Reunion du Reseau Mycologie, Lyon, 1987.

164. Bourbonnais R., Paice M.G. Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodégradation // FEBS Lett. 1990. V. 267. P. 99102.

165. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72, № 1-2. P. 248-254.

166. Breton A., Bernalier A., Dusser M., Fonty G., Gaillard-Martinie B., Guillot J. Anacromyccs mucronatus nov. gen., nov. sp. A new strictly anaerobic rumen funguswith polycentric thallus // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 70. P. 177-182.

167. Bubela B., Powel T. Effects of copper on the composition of bacterial cell wall peptides // Zentr. Bl. Bakteriol. Abt. - 2.1973. V. 128. P. 457-466.

168. Buswell J.A., Odier E. Lignin biodégradation // CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1987. V. 6. P. 1-60.

169. Cammue B.P., Peeters B., Peumans W.J. Isolation and partial characterization of an N-acetylgalactosamine-specific lectin from winter-aconite (Eranthis hyemalis) root tubers // Biochem. J. 1985. V. 227. P. 949-955.

170. Cannon, P.F. International Commission on the Taxonomy of Fungi (ICTF): name changes in fungi of microbiological, industrial and medical importance. 1 // Microbiol. Sci. 1986. V. 3, № 6. P. 168-171.

171. Cavet J.S., Borrelly G.P.M., Robinson N.J. Zn, Cu and Co in cyanobacteria: selective control of metal availability // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 27. P. 165181.

172. Chang S.T. Mushrooms and food // Bioscience. 1980. V. 30. P. 399-401. Chang S.T., Miles P.O. A new look at cultivated mushrooms // Bioscience. 1984. V. 34, № 6. P. 358-362.

173. Chattaraj P.K., Schleyer P.v.R. An ab initio study resulting in a greater understanding of the HSAB principle // J. Amer. Chem. Soc. 1994. V. 116, № 3. P. 1067-1071.

174. Cheng Y., McNally D.J., Labbe C., Voyer N., Belzile F., Belanger R.R. Insertional mutagenesis of a fungal biocontrol agent led to discovery of a rarecellobiose lipid with antifungal activity // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69, № 5. P. 2595-2602.

175. Cheung W.M., Hui W.S., Chu P.W., Chiu S.W., Ip N.Y. Ganoderma extract activates MAP kinases and induces the neuronal differentiation of rat pheochromocytoma PC12 cells // FEBS Lett. 2000. V. 486. P. 291-296.

176. Chibata I., Okumura K., Takeyama S., Kotera K. Lentinacin: a new hypocholesterolemic substance in Lentinus edodes // Experimentia. 1969. V. 25, № 12. P. 1237-1238.

177. Chichara G., Hamuro J., Maeda Y., Arai Y. Fractionation and purification of the polysaccharides with marked antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes (Berk.) Sing, (an edible mushroom) // Cancer Res. 1970, № 30. P. 2776-2781.

178. Cochran K.W. Medical effects // The biology and cultivation of edible mushrooms / Eds. S.T. Chang, W.A. Hayes. New York etc.: Acad. Press, 1978. P. 169.

179. Colceag J., Mogos S., Hulea S. Studies on occurrence and characterization of phytolectins in some species of mushrooms // Rev. Roum. Biochim. 1984. V. 21. P. 263-266.

180. Coulet M., Bétail G., Guillot J. Etude des conditions d'action de deux hemagglutinines vegetales (Pisum sativum et Lactarius deliciosus) // Colloque sue les Applications en Immunologie. Technocon Symposia, Paris, 1969. P. 143-159.

181. Coulet M., Marche A.M. Presence d'une hemagglutinine spécifique chez l'Hydnacee Irpex sinuosus Fr. // C.R. Acad. Sci. 1962. V. 254. P. 3904-3905.

182. Coulet M., Mustier J. Presence d'une hemagglutinine non polyvalente chaz la Pleurotaceae Panus conchatus Fr. // C.R. Acad. Sci. 1964. V. 158. P. 2347-2350.

183. Coulet M., Mustier J., Guillot J. Les hemagglutinines des champignons // Revue de mycologie. 1970. V. 35. P. 71-89.

184. Crisan E.V., Sands A. Nutritional value // The biology and cultivation of edible mushrooms / Eds. S.T. Chang, W.A. Hayes. New York etc.: Acad. Press, 1978. P. 137-165.

185. Daniel G., Vole J., Kubatova E. Pyranose oxidase, a major source of H2O2during wood degradation by Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, and Oudemansiella mucida // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 2524-2532.

186. De Virgilio C., Piper P., Boiler T., Wiemken A. Acquisition of thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae without heat shock protein hspl04 and in the absence of protein synthesis // FEBS Lett. 1991. V. 288, №1,2. P. 86-90.

187. De Vos C.H.R., Schat H., Voojis R., Ernst W.H.O. Copper-induced damage to the permeability barrier in roots of Silene cucubalus 11 J. Plant. Physiol. 1989. V. 135. P. 164-169.

188. De Vos C.H.R., Vonk M.J., Schat H. Glutathione depletion due to copper induced phytochelatin synthesis causes oxidative stress in Silene cucubalus // Plant. Physiol. 1992. V. 98. P. 853-858.

189. Debray H., Dus D., Hueso P., Radzikowski C., Montreuil J. Lectin-resistant variants of mouse Lewis lung carcinoma cells. II. Altered glycosylation of membrane glycoproteins // Clin. Exp. Metastasis. 1990. V. 8. P. 287-298.

190. Debray H., Montreuil J .Aleuria aurantia agglutinin. A new isolation procedure and further study of its specificity towards various glycopeptides and oligosaccharides // Carbohydr. Res. 1989. V. 185. P. 15-26.

191. Demirci A. Enhanced organically bound selenium yeast production by fed-batch fermentation // J. Agric. Food Chem. 1999. V. 47. P. 2496-2500.

192. Derouin F., Beauvais B., Lariviere M., Guillot J. Etude de la fixation de lectines marquees a la fluoresceine sur les trophozoites et les kystes de trois souches de Toxoplasma gondii // C. R. Soc. Biol. 1981. V. 175. P. 761-768.

193. Didier E., Didier P., Guillot J., Croisille Y., Fargeix N. The glycoconjugatesinvolved in cell and cell matrix interactions during urogenital morphogenesis in the chick embryo // Biol. Cell. 1984. V. 51. P. 9a.

194. Didier E., Didier P., Guillot J., Croisille Y.,Thiery J.P. Expression and distribution of carbohydrate sequences in chick germ cells: a comparative study with lectins and the NC-l/HNK-1 monoclonal antibody // Int. J. Dev. Biol. 1990. V. 34. P. 421-431.

195. Ditchfield R., Hehre W.J., Pople J.A. A Self-Consistent Molecular-Orbital Methods. IX. An Extended Gaussian-Type Basis for Molecular-Orbital Studies of Organic Molecules //J. Chem. Phys. 1971. Vol. 54, № 2. P. 724-728.

196. Dubovoy C., Calderon S., Herrera T. Investigation de fitohemagglutinas en algunas criptogamas // Ann. Inst. Biol. Univ. Mex. 1966. V. 37. P. 9-41.

197. Dus D., Debray H., Strzadala L., Rak J., Kusnierczyk H., Montreuil J., Radzikowski C. Lectin-resistant variants of mouse lung carcinoma cells. I. Selection and in vivo properties // Clin. Exp. Metastasis. 1990. V. 8. P. 277-285.

198. Dus D., Matuszyk J., Kusnierczyk H., Strzadala L., Radzikowski C. Tumorigenicity and metastatic ability of MmB16 mouse melanoma cell line and its two Aleuria aurantia agglutinin resistant variants // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1992. V. 40. P. 263-269.

199. Elgavish S., Shaanan B. Lectin-Carbohydrate Interactions: Different Folds, Common Recognition Principles // Trends Biochem. Sci. 1997. V. 22. P. 462-467.

200. Endo T., Ohbayashi H., Kanazawa K., Kochibe N., Kobata A. Carbohydrate binding specificity of immobilized Psathyrella velutina lectin // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 707-713.

201. Epstein E. Studies of the biosynthesis of indigotin by the basidiomycete Schizophyllum commune. Ph.D. dissertation. State University of New York at Buffalo, 1966.

202. Epstein E., Miles P.G. Identification of indole-3-acetic acid in the basidiomycete Schizophyllum commune // Plant Physiol. 1967. V. 42. P. 911-914.

203. Eriksson K.E., Vallander L. Biomechanical pulping // Lignin biodégradation: microbiology, chemistry and potential application / Eds. T.K. Kirk et al. Boca Raton, Florida: CRS Press, 1980. V. II. P. 213-224.

204. Ewart R.B.L., Kornfeld S., Kepris D.M. Effet of lectins on hormone release from isolated rat islets of Langerhans // Diabetes. 1975. V. 24. P. 705-714.

205. Fargeix N. The glycoconjugates involved in cell and cell matrix interactions during urogenital morphogenesis in the chick embryo // Biol. Cell. 1984. V. 51. P. 9a.

206. Fargeix N., Didier E., Guillot J., Damez M. Utilisation de diverses lectines fluorescents dans l'etude des cellules germinales en migration chez l'embryon d'Oiseau // C.R. Acad. Sci. 1980. V. 290. P. 995-1002.

207. Feizi T. 'Glyco-epitope' assignments for the selectins: advances enabled by the neoglycolipid (NGL) technology in conjunction with synthetic carbohydrate chemistry // Adv. Exp. Med. Biol. 2001. V. 491. P. 65-78

208. Fernandes J.C., Henriques F.S. Biochemical, physiological and structural efects of excess copper in plants // Bot. Rev. 1991. V. 57. P. 246-273.

209. Ford W.W. The distribution of haemolysis agglutinins and poisons in fungi, especially the Amanitas, the Entolomas, the Lactarius and the Inocybes // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1910. V. 2. P. 285-318.

210. Forrester I.T., Grabski A.C., Burgess R.R., Leatham G.F. Manganese, Mn-dependent peroxidases, and the biodegradationof lignin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 157. P. 992-999.

211. Furue H., Kitoh I. Phase III study on Lentinan // Jpn. J. Cancer Chemother. 1981. V. 8. P. 944-960.

212. Gaillard-Martinie B., Breton A., Dusser M., Guillot J. Contribution to the morphological, cytological, and ultrastructural characterization of Piromyces mae, a strictly anaerobic rumen fungus // Curr. Microbiol. 1992. V. 24. P. 159-164.

213. Galagher J.T. Carbihydrate-binding properties of lectins: a possible approach to lectin nomenclature and classification // Biosci. Rep. 1984. V. 4. P. 621-632.

214. Galli-Vallerio B., Bornand M. Hamagglutinine und Hämolysine in getrockneten Pilzen // Z. Immunitatsforsch. Exp. Ther. 1916. V. 25. P. 154-162.

215. Ganther H.E. Selenium metabolism, selenoproteins and mechanisms of cancer prevention: complexities with thioredoxin reductase // Carcinogenesis. 1999. V. 20, №9. P. 1657-1666.

216. Gao Y., Zhou S. The immunomodulating effects of Ganoderma lucidum // Intern. J. Med. Mushrooms. 2002. V. 4. P. 1-17.

217. Gavezotti A. The Calculation of Molecular Volumes and the Use of Volume Analysis in the Investigation of Structured Media and of Solid-State Organic Reactivity //J. Amer. Chem. Soc. 1983. V. 105, № 16. P. 5220-5225.

218. Ghose A.K., Pritchett A., Crippen G.M. Atomic physicochemical parameters for three dimensional structure directed quantitative structure activity relationships. III. Modelling hydrophobic interactions // J. Comput. Chem. 1988. V. 99, № 1. P. 8090.

219. Giardina P., Aurilia V., Cannio R., Marzullo L., Amoresano A., Siciliano R., Pucci P., Sannia G. The gene, protein and glycan structures of laccase from Pleurotus ostreatus I I Eur. J. Biochem. 1996. V. 235. P. 508-515.

220. Giles N.M., Giles G.I., Jacob C. Multiple roles of cysteine in biocatalysis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003a. V. 300, № 1. P. 1-4.

221. Giles N.M., Watts A.B., Giles G.I., Fry F.H., Littlechild J.A., Jacob C. Metal and redox modulation of cysteine protein function // Chem. Biol. 2003b. V. 10, № 8. P. 677-693.

222. Glenn J.K., Akileswaran L., Gold M.H. Mn(II) oxidation is the principal function of the extracellular Mn peroxidase from Phanerochaete chrysosporium // Arch. Biochem. and Biophys. 1986. V. 251. P. 688-696.

223. Glenn J.K., Gold M.H. Purification and characterization of an extracellular Mn(II)-dependent peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium 11 Arch. Biochem. Biophys. 1985. V. 242. P. 329-341.

224. Glenn J.K., Morgan M.A., Mayfield M.B., Kuwahara M., Gold M.H. An extracellular ^(Vrequiring enzyme preparation involved in lignin biodégradation by the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium // Biochem. and Biophys.

225. Res. Commun. 1983. V. 114. P. 1077-1083.

226. Glendening E.D., Reed A.E., Carpenter J.E., Weinhold F.A. NBO Version 3.1,1995.

227. Gold M.H., Kuwahara M., Chiu A.A., Glenn J.K. Purification and characterization of an extracellular diarylpropane oxygenase from the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium // Arch. Biochem. and Biophys. 1984. V. 234. P. 353-362.

228. Golovleva L.A., Leontievsky A.A., Matseva O.V., Myasoedova N.M. Ligninolytic enzymes of the fungus Panus tigrinus 8/18: biosynthesis, purification and properties // J. Biotechnol. 1993. V. 30. P. 71-77.

229. Green R.V., Gold M.J. Fatty acid-coenzyme A oxidase activity and H2C>2 production in Phanerochaete chrysosporium mycelia // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1984. V. 118. P. 437-443.

230. Greene W. C., Fleisher T.A., Waldmann T.A. Suppression of human T and B lymphocyte activation by Agaricus bisporus lectin // J. Immunol. 1981. V. 126. P. 580-586.

231. Grossman A., Wendel A. Non-reactivity of the selenoenzymc glutathione peroxidase with enzymatically hydroperoxidized phospholipids // Eur. J. Biochem. 1983. P. 549-552.

232. Gruen H.E. Auxins and fungi // Ann. Rev. Plant. Physiol. 1959. V. 10. P. 405440.

233. Gryndler M., Hrselova H., Chavatalova I., Jansa J. The effect of selected plant hormones on in vitro proliferation of hyphae of Glomus fistulosum // Biologia Plantarum. 1998. V. 41, № 2. P. 255-263.

234. Gueugnot J. Recherches sur la lectines dans l'etude taxonomique des Trypanosomatidae des genres Critridia, Blastocritridia, Leishmania, Trypanosoma. These de Doctorat en Pharmacie, Clemont-Ferrand, 1980.

235. Gueugnot J., Guillot J., Damez M., Coulet M. Identification and taxonomy of human and animal leishmanias by lectin-mediated agglutination // Acta Tropica. 1984. V. 41. P. 135-143.

236. Gueugnot J., Petavy A.F., Guillot J., Damez M., Coulet M. Etude comparative de la fixation de lectines sur les membranes de quatre especes de Critidia // Protistologica. 1980. V. 16. P. 33-38.

237. Guha A.K., Banerjee A.B. Effect of indole-3-acetic acid and kinetin on submerged growth of Agaricus campestris // Acta Microbiologica Polonica. Ser. B. 1974. V. 6 (23), № 3. P. 133-134.

238. Guillot J. Contribution a l'etude de quelques hemagglutinines de Mycetes. These de Doctorat en Pharmacie. 1970. Clemont-Ferrand.

239. Guillot J., Breton A., Damez M., Dusser M., Gailard-Martinie B., Miller L. Use of lectins for a comparative study of cell wall composition of different anaerobic rumen fungal strains // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 67. P. 151-156.

240. Guillot J., Genaud L., Gueugnot J., Damez M. Purification and properties of two hemagglutinins of the mushroom Laccaria amethystina // Biochemistry. 1983. V. 22. P. 5365-5369.

241. Guillot J., Giollant M., Damez M., Dusser M. Isolation and characterization of a lectin of the mushroom Lactarius deliciosus // J. Biochem. 1991. V. 109. P. 840845.

242. Guillot J., Giollant M., Damez M., Dusser M. Intervention des lectines fongiques dans les evenements precoces de reconnaissance arbre/champignon au cours de la formation des ectomycorhizes // Acta Bot. Gallica. 1994. V. 141. P. 443447.

243. Guillot J., Griffaut B., De Jaegher G., Dusser M. Isolement, caracterisation partielle et localisation d'une lectine de topinambour (Helianthus tuberosus L.) // C. R. Acad. Sci. 1991a. V. 312. P. 573-578.

244. Guillot J., Scandariato M., Coulet M. Essai d'application du pouvoir agglutinant des lectines a l'etude du genre Candida // Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur). 1974. V. 125. P. 489-500.

245. Gunde-Cimerman N., Cimerman A. Pleurotus fruiting bodies contain theinhibitor of 3-hydroxy-3-mehtylglutaryl-coenzyme A reductase lovastin // Exp. My col. 1995. V. 19. P. 1-6.

246. Gustavsson S., Ohlson C., Karlson J.O. Glycoproteins of axonal transport: affinity chromatography of fucose-specific lectins // J/ Neurochem. 1982. V. 38. P. 852-855.

247. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals, and disease // Biochem. J. 1984. V. 219. P. 1-14.

248. Hammel K.E., Moen M.A. Depolimerization of a synthetic lignin in vitro by lignin peroxidase// Enzyme Microbiol. Technol. 1991. V. 13. P. 15-18.

249. Harvey L., McNeil B. Production of lentinan by submerged cultivation of Lentinus edodes (Berk.) Sing // Intern. J. Med. Mushrooms. 2001. V. 3, № 5. P. 6163.

250. Hasel W., Hendrickson T.F., Still W.C. A rapid approximation to the solvent-accessible surface areas of atoms // Tetrahedron Computer Methodology. 1988. V. 1, №2. P. 103-116.

251. Hashimoto M, Saito Y., Seki H., Kamiya T. Hyphocholesterolemic alkaloids of Lentinus edodes. IV. Synthesis of three stereoisomers of eritadenine // Chem. Pharmacol. Bull. 1972. V. 20. P. 1374-1379.

252. Hauzer K., Ticha M., Kocourek J. Studies on lectins. XLIV. The pH dependence of lectin interactions with sugars as determined by affinity electrophoresis //Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 583. P. 103-109.

253. Hehre W.J., Radom L., Schleyer P.v.R., Pople J.A. Ab Initio Molecular Orbital Theory. Wiley: New York, 1986. 548 p.

254. Hellin H. Der giftige Eiweissekorper Abrin und dessen Wirkung auf das Blut. Inaug. Diss. Dorpat, 1891.

255. Hernandez E., Ortiz R., Lopez F., Masso F., Montano L.F., Marinage A., Zenteno E. Purification and characterization of a galactose-specific lectin from Psilocybe barreae//Phytochemistry. 1983. V. 32. P. 1209-1211.

256. Ho J.C.K., Sze S.C.W., Shen W.Z., Liu W.K. Mitogenic activity of edible mushroom lectins // Biochim. Biophys. Acta (BBA) General Subjects. 2004. V. 1671, № 1-3. P. 9-17.

257. Hobbs C. Medicinal mushrooms: Modern clinical uses overview // Intern. J. Med. Mushrooms. 2001. V. 3. P. 86.

258. Hohl H.R., Balsiger S. A model system for the study of fungus host surface interactions: adhesion of Phytophtora megasperma to protoplasts and mesophyll cells soybean // Nato Asi. 1986. V. 4. P. 259-272.

259. Houda Bouazizi, Jouili H., Ferjani E. Copper-induced oxidative stress in maize shoots (Zea mays L.): H202 accumulation and peroxidases modulation // Acta Biologica Hungarica. 2007. V. 58, № 2. P. 209-218.

260. Hsieh K.Y., Hsu C.I., Lin J.Y., Tsai C.C., Lin R.H. Oral administration of an edible-mushroom-derived protein inhibits the development of food-allergic reactions in mice // Clin. Exp. Allergy. 2003. V. 33, № li. p. 1595-1602.

261. Hu H., Ahn N.S., Yang X., Lee Y.S., Kang K.S. Ganoderma lucidum extract induces cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cell // Intern. J. Cancer. 2002. V. 102. P. 250-253.

262. Jacob C., Giles G.I., Giles N.M., Sies H. Sulfur and selenium: the role of oxidation state in protein structure and function // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003. V. 42, № 39. P. 4742-4758.

263. Jacob C., Holme A.L., Fry F.H. The sulfinic acid switch in proteins // Org. Biomol. Chem. 2004. V. 2, № 14. p. 1953-1956.

264. Jacob C., Maret W., Vallee B.L. Selenium redox biochemistry of zinc-sulfur coordination sites in proteins and enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96, №5. P. 1910-1914.

265. Jefferies T.M., Choi S., Kirk T.K. Nutritional regulation of lignin degradation by Phanerochaete chrysosporium // Appl. Environ. Microbiol. 1981. V. 42. P. 290296.

266. Jeune K.H., Moon I.J., Kim M.K., Chung S.R. Studies on lectins from Korean higher fungi; IV. A mitogenic lectin from the mushroom Lentinus edodes I I Planta Med. 1990. V. 56. P. 592.

267. Jin M., Jung H.J., Choi J.J., Jeon H., Oh J.H., Kim B., Shin S.S., Lee J.K., Yoon K., Kim S. Activation of selective transcription factors and cytokines by water-soluble extract from Lentinus lepideus 11 Exp. Biol. Med. 2003. V. 228. P. 749-758.

268. Johansson T., Nyman P.O. A manganese (Il)-dependent peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor//Acta Chem. Scand. 1987. V. 41. P. 762-765.

269. Jones D.P., Go Y.M., Anderson C.L., Ziegler T.R., Kinkade J.M. Jr., Kirlin W.G. Cysteine/cystine couple is a newly recognized node in the circuitry for biologic redox signaling and control // FASEB J. 2004. V. 18, № 11. p. 1246-1248.

270. Jong S.C., Birmingham J.M. The medicinal value of the mushroom Grifola // World J. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 6. P. 227-235.

271. Jong S.C., Birmingham J.M. Medicinal benefits of the mushroom Ganoderma // Adv. Appl. Microbiol. 1993b. V. 37. P. 101-127.

272. Jong S.C., Donovick R. Antitumor and antiviral substances from fungi // Adv.

273. Appl. Microbiol. 1989. V. 34. P. 183-262.

274. Jun Y., Yi L., Yong Т., Jianben L., Xiong C., Qin Z., Jiaxin D., Songsheng Q., Ziniu Y. The action of Cu2+ on Bacillus thuringiensis growth investigated by microcalorimetry II Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39, № 6. С. 656660.

275. Kalberer P.P. Experiments on the cultivation of shiitake (Lentinus edodes) on sawdust // Mushroom Sci. 1987. V. 12. P. 231-244.

276. Kamisaka S., Yanagishima N., Masuda Y. Effect of auxin and gibberellin on sporulation in yeast // Physiol. Plant. 1967. V. 20. P. 90-97.

277. Kamiya Т., Saito Y., Hashimoto M., Seki H. Hypocholesterolemic alkaloids of Lentinus edodes (Berk.) Sing. I. Structure and synthesis of eritadenine // Tetrahedron. 1972. V. 28, № 4. P. 899-906.

278. Kaneda T, Tokuda S. Effects of various mushroom preparations on cholesterol levels in rats // J. Nutrition. 1966. V. 90. P. 371-376.

279. Kaneko Т., Oguri S., Kato S., Nagata Y. Developmental appcarance of lectin during fruit body formation in Pleurotus cornucopiae // J. Gen. Appl. Microbiol. 1993. V. 39. P. 83-90.

280. Kawagishi H., Mori H., Uno A., Kimura A., Chiba S. A sialic acid-binding lectin from the mushroom Hericium erinaceum I IFEBS Lett. 1994. V. 340. P. 56-58.

281. Kawagishi H., Nomura A., Mizuno Т., Kimura A., Chiba S. Isolation and characterization of a lectin from Grifola frondosa fruiting bodies // Biochim. et Biophys. Acta. 1990. V. 1034. P. 247-252.

282. Kilpatrick D.C. Handbook of animal lectins: properties and biomedical applications. London; New York et al.: Wiley, 2000. 480 p.

283. Kimura Y., Taniguchi M., Baba K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: mechanism of action and isolation of an active substance // Anticancer Res. 2002. V. 22. P. 3309-3318.

284. Kirk Т.К. Effects of microorganisms on lignin // Ann. Rev. Phytopathol. 1971. V. 9. P. 195-210.

285. Kirk Т.К. Degradation and conversion of lignocelluloses // The filamentous fungi / Eds. J.E. Smith et al. London: Advard Arnold Publ. Ltd., 1983. V. 4. P. 266

286. Kirk T.K., Connors W.J., Zeikus J.G. Requirement for a growth substrate during lignin decomposition by two wood rotting fungi // Appl. Environ. Microbiol. 1976. V. 32. P. 192.

287. Knoepfel L., Steinkuhler C., Carri M.T., Rotilio G. Role of zinc-coordination and of the glutathione redox couple in the redox susceptibility of human transcription factor Spl // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 201, № 2. P. 871-877.

288. Kobata A., Endo T. Immobilized lectin columns: useful tools for the fractionation and structural analysis of oligosaccharides // J. Chromatogr. 1992. V. 597. P. 111-122.

289. Kocourek J., Horejsi V. Defining a lectin // Nature. 1981. V. 290, № 5803. P.188.

290. Kocourek J., Horejsi V. A note on the recent discussion on definition of the term "Lectin"// Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry. Vol. 3 / Eds. T.C. B0g-Hansen, G.A. Spengler. Berlin; New York: Walter de Gruytcr, 1983. P.3-6.

291. Kodama N., Komuta K., Sakai N., Nanba H. Effects of D-fraction, a polysaccharide from Grifola frondosa on tumor growth involve activation of NK cells // Biol. Pharm. Bull. 2002a. V. 25. P. 1647-1650.

292. Kodama N., Harada N., Nanba H. A polysaccharide, extract from Grifola frondosa, induces Th-1 dominant responses in carcinoma-bearing BALB/c mice // Jpn. J. Pharmacol. 2002b. V. 90. P. 357-360.

293. Konska G. Lectins in higher fungi. Thesis, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Cracow (in Polish), 1985.

294. Konska G. A survey of domestic species of Basidiomycetes fungi for the presence of lectins in their carpophores // Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 1988a. V. 57. P. 247-260.

295. Konska G. The lectin occurrence in selected Basidiomycetes species growing in south districts of Poland // Acta Mycol. 1988b. V. 24. P. 101-112.

296. Konska G., Guillot J., Dusser M., Damez M., Botton B. Isolation and characterization of an N-acetyllactosamine-binding lectin from the mushroom Laetiporus sulfureus // J. Biochem. 1994. V. 116, № 3. P. 519-523.

297. Kretz O. Isolement et etude des propriétés physico-chimiques, biologiques et toxicologiques de la bolesatine, toxine proteique glycoproteique extraite de Boletus satanas Lenz. These de Doctorat en Pharmacie, Strasbourg, 1992.

298. Kretz O., Creppy E.E., Boulanger Y., Dirheimer G. Purification and some properties of bolesatine, a protein inhibiting in vitro protein synthesis, from the mushroom Boletus setanas Lenz (Boletaceae) // Arch. Toxicol. Suppl. 1989. V. 13. P. 422-427.

299. Kretz O., Creppy E.E., Dirheimer G. Disposition of the toxic protein, bolesatine, in rats: its resistance to proteolytic enzymes // Xenobiotica. 1991a. V. 21. P. 65-73.

300. Kretz O., Creppy E.E., Dirheimer G. Characterization of bolesatine, a toxic protein from the mushroom Boletus satanas Lenz and its effects on kidney cells // Toxicology. 1991b. V. 66. P. 213-224.

301. Krishnan R., Binkley J.S., Seeger R., Pople J.A. Self-Consistent Molecular Orbital Methods. XX. A Basis Set for Correlated Wave Functions // J. Chem. Phys. 1980. V. 72, № 1. P. 650-654.

302. Krupe M. Blutgruppen spezifische Pflanzliche Eiweisskorper. F. Enke, Stuttgart, 1956.

303. Kubo K., Aoki H., Nanba H. Anti-diabetic activity in the fruit body of Grifola frondosa (Maitake)//Biol. Pharmaceut. Bull. 1994. V. 17. P. 1106-1110.

304. Kulkarni R.K. Mannitol metabolism in Lentinus edodes, the Shiitake Mushroom // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. № 1. P. 250-253.

305. Kumar A. Biosensors based on piezoelectric crystal detectors: theory and application // JOM. 2000. V. 52. Exclusively on the web. http://www.tms.org/pubs/journals/JOM/0010/Kumar/Kumar-0010.html.

306. Kurashima Y., Tsuda M., Sugimura T. Marked formation of thiazolidine-4-carboxylic acid, an effective nitrite trapping agent in vivo, on boiling of dried shiitakemushroom {Lentinus edodes) // J. Agric. Food Chem. 1990. V. 38. P. 1945-1949.

307. Makela O. Studies in hemagglutinins of Leguminosae seeds. Academic Dissertation, Helsinki. 1957.

308. Makela J., Makela P., Krupe M. Zur Spezifität der anti-B-Phytahemagglutinine // Z. Immunitatstorsch. Exp. Ther. 1959. 117. 220-229.

309. Maltseva O.V., Golovleva L.A., Leontievsky A.A., Nerud F., Misurcova Z., Musilek V. Dynamics of enzymes generating hydrogen peroxide in solid-state fermentation of Panus tigrinus on wheat straw // Folia Microbiol. 1989. V. 34. P. 261-266.

310. Man Y.H., Yeng W.T, Chen L.C., Chang S. Physiology and ecology of Lentinus edodes (Berk.) Sing // Mushroom Sei. 1981. V. 11. P. 623-658.

311. Marzullo L., Cannio R., Giardina P., Santini M.T., Sannia G. Veratryl alcohol oxidase from Pleurotus ostreatus participates in lignin biodégradation and prevents polymerization of laccase-oxidized substrates //J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 38233827.

312. Mazhoudi S., Chaoui A., Ghorbal M.H., Ferjani E.E. Response of antioxidant enzymes to excess copper in tomato (Ly copersicon esculentum Mill.) I I Plant Sci. 1997. V. 127. P. 129-137.

313. McLean A.D., Chandler G.S. Contracted Gaussian Basis Sets for Molecular Calculations. I. Second Row Atoms, Z = 11-18 // J. Chem. Phys. 1980. V. 72, № 10. P. 5639-5648.

314. Merrill W., Cowling E.B. Role of nitrogen in wood deterioration: amounts and distribution of nitrogen in tree stems // Can. J. Biol. 1966. V. 44. P. 1555-1580.

315. Miertus S., Scrocco E., Tomasi J. Electrostatic Interaction of a Solute with a Continuum. A Direct Utilization of Ab Initio Molecular Potentials for the Prevision of Solvent Effects // Chem. Phys. 1981. V. 55, № 1. P. 117-129.

316. Mikiashvili N., Elisashvili V., Wasser S.P., Nevo E. Comparative study of lectin activity of higher basidiomycetes // Int. J. Med. Mushrooms. 2006. V. 8. P. 3138.

317. Mizuno T. Bioactive biomolecules of mushrooms: food functions and medicinal effect of mushroom fungi // Food Rev. Intern. 1995a. V. 11. P. 7-21.

318. Mizuno T. Shiitake, Lentinus edodes\ functional properties for medicinal and food purposes. // Food Rev. Intern. 1995b. V. 11, № 1. P. 111-128.

319. Mizuno T. Yamabushitake, Hericium erinaceum: bioactive substances and medicinal utilization // Food. Rev. Intern. 1995c. V. 11. P. 173-178.

320. Mizuno T. The extraction and development of antitumor-active polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan // Int. J. Med. Mushroom. 1999. V. 1. P. 9-29.

321. Molina F.I., Shen P., Jong S.C., Orikono K. Molecular evidence supports the separation of Lentinula edodes from Lentinus and related genera // Can. J. Bot. 1992. V. 70, № 12. P. 2446-2452.

322. Mori K., Kugimiya N. Analysis on the incompatible factors in natural population of Lentinus edodes II Jap. J. Genet. 1972. V. 47. P. 359.

323. Mori K., Toyomasu T., Nanba H., Kuroda H. Antitumor action of fruit bodies of mushrooms orally administrated to mice // Mushroom Sci. 1989. V. 12, part 1. P. 653-660.

324. Moroder L. Isosteric replacement of sulfur with other chalcogens in peptides and proteins // J. Pept. Sci. 2005. V. 11, № 4. P. 187-214.

325. Morton N., Hammond J.B.W., Dickerson A.G. The Agaricus bisporus mannitol pathway during sporophore growth // Trans. Br. Mycol. Soc. 1985. V. 85. P. 671-675.

326. Moulton J.E. Extraction of auxin from maize, from smut tumors of maize and from Ustilago zeae // Bot. Gaz. 1942. V. 103. P. 725-739.

327. Mullcr S., Scnn H., Gsell B., Vetter W., Baron C., Bock A. The formation of diselenide bridges in proteins by incorporation of selenocysteine residues:biosynthesis and characterization of (Se)2-thioredoxin // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 3404-3412.

328. Mustier J., Coulet M. Localisation de Phemagglutinine de l'oeuf de Phallus impudicus L. ex Fr. // C. R. Soc. Biol. 1965. V. 159. P. 1566-1570.

329. Noctor G., Foyer C.H. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control // Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 249-279.

330. Nowell P.C. Phytohemagglutinin: as initiator of mitosis in cultures of normal lymphocytes // Cancer Res. 1960. V. 20. P. 462-466.

331. Ogra Y., Ishiwata K., Ruiz Encinar J., Lobinski R., Suzuki K.T. Speciation of selenium in selenium-enriched shiitake mushroom, Lentinula edodes // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 379, № 5-6. P. 861-866.

332. Oguri S., Yoshida M., Nagata Y. Isolation, crystallization, and characterization of a 16.5-kDa protein from fruit bodies of a lectin-deficient strain of Pleurotus comucopiae // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V. 58. P. 502-506.

333. Ohashi K., Burkart V., Flohe S. Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the Toll-like receptor-4 complex // J. Immunol. 2000. V. 164. P. 558-561.

334. Ohlson C., Karlsson J.O. Glycoproteins of axonal transport. Polypeptides interacting with the lectin from Aleuria aurantia 11 Brain Res. 1983. V. 264. P. 99104.

335. Okazaki M., Adachi Y., Ohno N., Yadomae T. Structure-activity relationship of (1—>3)-beta-D-glucans in the induction of cytokine production from macrophages, in vitro //Biol. Pharm. Bull. 1995. V. 18. P. 1320-1327.

336. Okeke B.C., Paterson A., Smith J.E., Watson-Craik I.A. The relationship between phenoloxidase activity, soluble protein and ergosterol with growth of Lentinus species in oak sawdust logs // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 41. P. 28-31.

337. Olsnes S., Pihl A. // The specificity and action of animal, bacterial and plant toxins (Receptors and Recognition, Ser. B.V.I.) / Ed. P. Cuatrecasas. London: Chapmand and Hill, 1977. P. 131-141.

338. Onsager L. Electric Moments of Molecules in Liquids // J. Amer. Chem. Soc. 1936. V. 58, № 8. P. 1486-1493.

339. Ooi V.E., Liu F. Immunomodulation and anticancer activity of polysachcaride-protein complexes // Curr. Med. Chem. 2000. V. 7. P. 715-729.

340. Otien L., Blanchette R.A. Xylobolus frustulatus decay of oak: patterns of selective delignification and subsequent cellulose removal // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 47. P. 670-676.

341. Paaventhan P., Joseph J.S., Seow S.V., Vaday S., Robinson H., Chua K.Y., Kolatkar P.R. A 1.7 A structure of Fve, a member of the new fungal immunomodulatory protein family // J. Mol. Biol. 2003. V. 332, № 2. P. 461-470.

342. Pajtasz E., Dus D., Debray H. Mitogenic stimulation of lymphoid cells by Aleuria aurantia agglutinin // Arch. Exp. Ther. 1988. V. 36. P. 133-139.

343. Pankratov A.N. Electrophilic aromatic substitution regioselectivity for benzene derivatives in terms of cationic localization energies from semiempirical quantum chemical computations // J. Mol. Struct. Theochem. 2000. V. 507, № 1-3. P. 239-244.

344. Pankratov A.N. Quantitative structure property relationships in the pyridine series // Heteroatom Chemistry. 2002. V. 13, № 3. P. 229-241.

345. Pankratov A.N. Azo-coupling reactions used in analytical chemistry: The role of reactants, intermediates, and aqueous medium // Helvetica Chim. Acta. 2004. V. 87, № 6. P. 1561-1573.

346. Pankratov A.N., Bilenko O.A., Mushtakova S.P. Oxidation of 4-amino-4methoxydiphenylamine in aqueous and organo-aqueous media // Afinidad. 2000a. V. 57, № 487. P. 201-208.

347. Pankratov A.N., Drevko B.I. An approach to quantum chemical consideration of the "hydride" transfer reactions // J. Serb. Chem. Soc. 2004. V. 69, № 2. P. 431439.

348. Pankratov A.N., Shalabay A.V. Benzenethiols: pKa values measured in solutions against quantum chemically computed gaseous-phase proton affinities // Phosphorus, Sulfur, Silicon and the Related Elements. 2003. V. 178, № 10. P. 10071019.

349. Pankratov A.N., Shchavlev A.E. Semiempirical quantum chemical PM3 computations and evaluations of redox potentials, basicities and dipole moments of the diphenylamine series as analytical reagents // Can. J. Chem. 1999. V. 77, № 12. P. 2053-2058.

350. Pankratov A.N., Tsivileva O.M. Mixed stationary phase polymethylsiloxanc-acrylic acid in gas chromatographic determinations // Rev. Roumaine Chim. 2003. V. 48, № 6. P. 491-498.

351. Pankratov A.N., Tsivileva O.M., Nikitina V.E. Laccase of Lentinus edodes catalyzed oxidation of amines and phenolic compounds: a semiempirical quantum chemical consideration // J. Biochem. and Mol. Biol. 2000b. V. 33, № 1. P. 37-42.

352. Pankratov A.N., Uchaeva I.M. A semiempirical quantum chemical testing of thermodynamic and molecular properties of arsenic compounds // J. Mol. Struct. Theochem. 2000. V. 498, № 1-3. P. 247-254.

353. Pankratov A.N., Uchaeva I.M. Thermodynamic properties and molecular dipole moments of antimony compounds from quantum chemical evaluations // Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements. 2002a. V. 177, № 5. P. 791-802.

354. Pardoe G.I., Uhlenbruck G., Anstee D.J., Reifenberg V. On the specificity ofbroad spectrum agglutinins. III. Heterophile agglutinins associated with anti-B-like specificity 11 Z. Immunitatsforsch. Allergie Klin. 1969. V. 139. P. 468-485.

355. Paszczynski A., Huynh V.-B., Crawford R.L. Enzymatic activities of an extracellular, manganese-dependent peroxidase from Phanerochaete chrysosporium // FEMS Microbiol. Lett. 1985. V. 29. P. 37-41.

356. Paszczynski A., Huynh V.-B., Crawford R.L. Comparison of ligninase-1 and peroxidase M-2 from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium // Arch. Biochem. and Biophys. 1986. V. 244. P. 750-765.

357. Payne M.J., Campbell S., Patchett R.A., Kroll R.G. The use of immobilized lectins in the separation of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria and Salmonella ssp. from pure cultures and foods // J. Appl. Bacteriol. 1992. V. 73. P. 4152.

358. Pearson R.G. Hard and soft acids and bases // J. Amer. Chem. Soc. 1963. V. 85, № 22. P. 3533-3539.

359. Pearson R.G. Theoretical models of chemical bonding / Ed. Z. Maksic. Berlin: Springer-Verlag, 1990. Part 2. P. 45.

360. Petavy A.F., Gueugnot J., Guillot J., Damez M., Coulet M. Fixation des lectines sur Leishmania tropics et Critridie luccilae // Protistologica. 1978. V. 14. P. 103-108.

361. Petavy A.F., Guillot J., Coulet M. Interet des lectines dans l'identification des Candida. Application a Candida ablicans; diagnostic positif et exclusion des especes affines. Bull. Soc. Mycol. Med. 1975. V. 19. P. 225-228.

362. Poulos T.L., Edwards S.T., Wariishi H., Gold M.H. Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2A // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 4429-4440.

363. Przybylowicz P., Donoghue J. Shiitake growers handbook: the art and science of mushroom cultivation. Dubuque: Kendall/Hunt Publ. Co., 1991. 217 p.

364. Ranque J., Nicoli R.M., Chefson J., Battaglini P.F. Sur quelques hemagglutinines aspecificues d'origine vegetale. Leur comportement en presence d'un polysaccharide le "dexlran" // Bull. Soc. Pharm. Marseille. 1962. V. 11. P. 1-3.

365. Raszeja S. Uber spezifische Phytagglutinine aus Laccaria laccata varietas proxima II Z. Arztl. Forblid. 1958. V. 14. P. 801-803.

366. Rcitherman R.W., Rosen S.D. , Frazier W.A., Barondes S.H. Cell surface specific high affinity receptor for discoidin: developmental regulation in Diclyostelium discoideum // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1975. V. 72, № 9. P. 35413545.

367. Reshetnikov S.V., Wasser S.P., Tan K.K. Higher Basidiomycota as a source of antitumor and immunostimulating polysaccharides // Int. J. Med. Mushrooms. 2001. V. 3. P. 361-394.

368. Richard T. Contribution a l'etude de la lectine du champignon basidiomycete Rigoporus lignosus. Purification, propriétés physicochimiques et localisation de la lectine et de ses sites d'affinité II These de Doctorat en Sciences. Nancy, 1995.

369. Rokujo T., Kikuchi H., Tensho A., Tsukitani Y., Takenawa T., Yoshida K., Kamiya T. Lentysine: a new hypolipidemic agent from a mushroom. Lentinus edodes. // Life Sei. 1970. V. 9, № 7. P. 379-385.

370. Rosenfield R.E., Haber G.V. detection and measurement of homologous human hemagglutinins // Automation in Analytical Chemistry, Technicon Symposia. New York, 1965. P. 515.

371. Rosenzweig W.D., Ackroyd D. Binding characteristics of lectins involved in the trapping of nematodes by fungi // Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 46. P. 10931096.

372. Royse D.J., Schisler L.C. Mushrooms, their consumption, production and culture development // Interdise. Sei. Rev. 1980. V. 5, № 4. P. 324-332.

373. Rudiger H., Gabius H.-J. Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications // Glycoconjugate J. 2001. V. 18. P. 589-613.

374. Rypacek V., Sladky Z. The character of endogenous growth regulators in the course of development in the fungus Lentinus tigrinus // Mycopathologia et Mycologia applicata. 1972. V. 46. P. 65-72.

375. Rypacek V., Sladky Z. Relation between the level of endogenous growth regulators and the differentiation of the fungus Lentinus tigrinus studied in a synthetic medium// Biologia Plantarum (Praha). 1973. V. 15, № 1. P. 20-26.

376. Sage H.J., Vazquez J.J. Studies on a hemagglutinin from the mushroom Agaricus campestris // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 120-125.

377. Sasaki T., Takasuka N. Further study of the structure of lentinan, an anti-tumor polysaccharide from Lentinus edodes an edible mushroom. // Carbohydr. Res. 1976. V. 47, № 1. P. 99-104.

378. Sauerbrey G.G. Messung von Plattenschwingungen sehr kleiner Amplitude durch Lichtstrom-modulation // Z. Phys. 1964. Bd. 178. S. 457-471.

379. Savoie J.-M., Cesbron V., Delpech P. Induction of polyphenol-oxidases in the mycelium of Leniinula edodes // Science and cultivation of edible fungi. Vol. 2. / Ed. T.J. Elliott. Rotterdam: Balkema, 1995. P. 787-793.

380. Schlegel H.B., McDouall J.J. // Computational Advances in Organic Chemistry / Edited by C. Ogretir, I.G. Csizmadia. The Netherlands: Kluwer Academic, 1991. P. 167-185.

381. Schrauzer G.N. Selenomethionine and selenium yeast: appropriate forms of selenium for use in infant formulas and nutritional supplements // J. Med. Foods. 1998. V. 1. P. 201-206.

382. Schrauzer G.N. Selenomethionine: A review of its nutritional significance, metabolism and toxicity // J. Nutr. 2000. V. 130, № 7. P. 1653-1656.

383. Schwarz P.A., Foltz C.M. Selenium as an integral part of Factor 3 against dietary necrotic liver degeneration // J. Amer. Chem. Sci. 1957. V. 79. P. 3292.

384. Scott P.E., Gaucher G.M. A manganese requirement for patulin biosynthesis by cultures of Penicillium urticae // Biotechnol Lett. 1984. V. 6, № 4. P. 231-236.

385. Scroeder H.A., Frost O.V., Balassa J.J. Essential trace elements in man: selenium // J. Chron. Dis. 1970. V. 23. P. 227-243.

386. Seeger R., Wiedmann R. Zum Vorkommen von Hamolysen und Agglutininen in höheren Pilzen (Basidiomyceten) // Arch. Toxicol. 1972. V. 29. P. 189-217.

387. Shrift A. Metabolism of selenium by plants and microorganisms // Selenium compounds in nature and medicine. New York: Cornell University, 1961. 816 p.

388. Silicani V., Nicoli R.M., Ranque J., Battaglini P.F. Sur deux nouvelles agglutinines anti-H d'origine vegetale // Bull. Soc. Pharm. Marseille. 1962. V. 11. P. 1-3.

389. Simpson D.L., Thorne D.R., Loh H.H. Lectins: endogeneous carbohydrate-binding proteins from vertebrate tissues: functional role in recognition processes? // Life Sei. 1978. V. 22, №. 9. P. 727-748.

390. Sjostrom V.A. Wood chemistry. Fundamentals and applications / 2nd ed. N.Y.; London: Acad. Press, 1993.

391. Sladky Z., Tichy V. Stimulation of the formation of fruiting bodies of the fungus Lentinus tigrinus (Bull.) Fr. by growth regulators // Biologia Planlarum (Praha). 1974. V. 16, № 6. P. 436-443.

392. Sliva D. Ganoderma lucidum (reishi) in cancer treatment // Integr. Cancer Ther. 2003. V. 2. P. 358-364.

393. Sliva D., Labarrere C., Slivova V., Sedlak M., Lloyd F.P. Jr., Ho N.W. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and prostate cancer cells // Biochcm. and Biophys. Res. Commun. 2002. V. 298. P. 603-612.

394. Song C.H., Cho K.Y., Nair N.G. A synthetic medium for the production of submerged cultures oiLentinus edodes // Mycologia. 1987. V. 79. P. 866-876.

395. Song C.H., Cho K.Y., Nair N.G., Vine J. Growth stimulation and lipid synthesis in Lentinus edodes II Mycologia. 1989. V. 81, № 4. P. 514-522.

396. Sosa-Morales M.E., Guevara-Lara F., Martinez-Juarez V.M., Paredes-Lopez O. Production of indole-3-acetic acid by mutant strains of Ustilago maydis (maize smut/huitlacoche) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 726-729.

397. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms. Berkeley: Ten Speed Press, 1993. 552 p.

398. Stanley P. Selection of lectin-resistant mutants of animal cells // Methods Enzymol. 1983. V. 96. P. 157-183.

399. Stewart J.J.P. Optimization of Parameters for Semiempirical Methods. I. Method // J. Comput. Chem. 1989a. V. 10, № 2. P. 209-220.

400. Stewart J.J.P. Optimization of Parameters for Semiempirical Methods. II. Applications // J. Comput. Chem. 1989b. V. 10, № 2. P. 221-264.

401. Stewart J.J.P. Optimization of Parameters for Semiempirical Methods. III. Extension of PM3 to Be, Mg, Zn, Ga, Ge, As, Se, Cd, In, Sn, Sb, Te, Hg, Pb, and Bi // J. Comput. Chem. 1989c. V. 12, № 3. P. 320-341.

402. Still W.C., Tempczyk A., Hawley R.C., Hendrickson Th. Semianalytical treatment of solvation for molecular mechanics and dynamics // J. Amer. Chem. Soc. 1990. V. 112, № 16. P. 6127-6129.

403. Stillmark H. Uber Ricin, ein gifliges Ferment aus den Samen von Ricinus communis L. und Einigen anderen Euphorbiaceae. Inaug. Dissertation. Dorpat, 1888.

404. Stohs S., Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions // Free Radic. Biol. Med. 1995. V. 18. P. 321-336.

405. Sueyoshi S., Tsuji T., Osawa T. Purification and characterization of four isolectins of mushroom (Agaricus bisporus) // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1985. V. 366. P. 213-221.

406. Sun H., Zhao C.G., Tong X., Qi Y.P. A lectin with mycelia differentiation and antiphytovirus activities from the edible mushroom Agrocybe aegerita // J. Biochem. Mol. Biol. 2003. V. 36, № 2. P. 214-222.

407. Sundarmoorthy M., Kishi K., Gold M., Poulos T.L. The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.06 A resolution // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 32759-32767.

408. Suzuki S., Oshita S. Influence of shiitake (.Lentinus edodes) on human serum cholesterol // Mushroom Sci. 1974. V. 9. P. 463-467.

409. Taguchi T., Furue H., Kimura T., Kondo T., Hattori T., Itoh T., Osawa N. Endpoint results of phase III study of lentinan // Jpn. J. Cancer Chemother. 1985. V. 12. P. 366-380.

410. Takamura K., Hoshino H., Sugahara T., Amano H. Determination of vitamin D2 in shiitake mushroom {Lentinus edodes) by high-performance liquid chromatography //J. Chromatogr. 1991. V. 545, № 1. P. 201-204.

411. Takashima K. The hyphocholesterolemic action of eritadenin in the rat //Arteriosclerosis. 1976. V. 17. P. 491-502.

412. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity // Intern. Immunol. 2005. V. 17. № 1. P. 1-16.

413. Taketo M.M. Cyclooxygenase-2 inhibitors in tumorigenesis. Part I // J. Natl. Cancer Inst. 1998a. V. 90. P. 1529-1536.

414. Taketo M.M. Cyclooxygenase-2 inhibitors in tumorigenesis. Part II // J. Natl. Cancer Inst. 1998b. V. 90. P. 1609-1620.

415. Takeuchi A., Okano T., Sayamoto M., Sawamura S., Kobayashi T. Distribution and existence forms of vitamin D2 and ergosterol in Shiitake (Lentinus edodes) // Vitamins (J. Vitamin Soc. Jap.) 1984. V. 58, № 12. P. 589-595.

416. Tanabe N., Sagawa I., Ohtsubo K., Iijima Y., Yanagi S.O. Comparison of phenoloxidase activities during the cultivation of several basidiomycetes // Agric. Biol. Chem. 1989. V. 53, № 11. P. 3061-3063.

417. The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine / Eds I.E. Liener, N. Sharon, I.J. Goldstein. Orlando: Acad. Press, 1986. 601 p.

418. Thruston C.F. The structure and function of fungal laccases // Microbiology. 1994. V. 140. P. 19-26.

419. Tien M., Kirk T.K. Lignin-degrading enzyme from the hymenomycete Phanerochaete chrysosporium Burds // Science. 1983. V. 221. P. 661-663.

420. Tien M., Kirk T.K. Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium: purification, characterization, and catalytic properties of a unique H202-requiring oxygenase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 2280-2284.

421. Togami M. Basidiomycetes. 1. Antitumor polysaccharide from bagasse medium on which mycelia of Lentinus edodes had been grown // Chem. Pharm. Bull. 1982. V. 30. P. 1134-1140

422. Tomsett A.B., Thurman D.A. Molecular biology of metal tolerances of plants // Plant Cell Environ. 1988. V. 11. P. 383-394.

423. Trigiano R.N., Fergus C.L. Extracellular enzymes of some fungi associated with mushroom culture // Mycologia. 1979. V. 71. P. 908-917.

424. Tritatana S., Tantikanjan T. Effects of some environmental factors on the morphology and yield of Lentinus edodes (Berk.) Sing I I Mushroom Sci. 1987. V. 12. P. 233-242.

425. Tsivileva O.M., Nikitina V.E., Garibova L.V., Ignatov V.V. Lectin activity of Lentinus edodes I I Intern. Microbiol. 2001. V. 4, № 1. P. 41-45.

426. Tsivileva O.M., Pankratov A.N., Nikitina V.E., Garibova L.V. Effect of media components on the mycelial film formation in submerged culture of Lentinus edodes (Shiitake) // Food Technol. and Biotechnol. 2005. V. 43, № 3. P. 227-234.

427. Tsuda M. Purification and characterization of a lectin from the mushroom Flammulina velutipes // J. Biochem. 1979. V. 86. P. 1463-1468.

428. Turan B., Fliss H., Desilets M. Oxidants increase the intracellular free Zn2+ concentration in rabbit ventricular myocytes // Am. J. Physiol. 1997. V. 272. C. 20952106.

429. Tworzydlo M. Recherche de lectines dans le mycelium cultive in vitro de certaines especes de champignons supérieurs. These en vue de la preparation du Diplôme d'Etudes Supérieures en Pharmacie. Cracow {in Polish), 1986.

430. Ugorski M., Pahlsson P., Dus D., Nilsson B. Glycosphingolipids in lectin-resistant variants of mouse Lewis lung carcinoma cells // Int. J. Cancer. 1989. V. 43. P. 93-101.

431. Vetter I. The biological effect of Lentinus edodes (Berk.) Sing // Микол. и фитопатол. 1993. Т. 27, вып. 6. С. 345-365.

432. Vinklarkova К., Sladky Z. Exogenous regulators in the mycelium of Pleurotus ostreatus after exogenous application // Folia Microbiol. 1978. V.23. P. 55-59.

433. Wang H.X., Ng T.B., Ooi V.E.C. Studies on purification of a lectin from fruiting bodies of the edible shiitake mushroom Lentinus edodes I I Intern. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V. 31, № 5. P. 595-599.

434. Wariishi H., Akileswaran L., Gold M.H. Manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium: spectral characterization of the oxidized states and the catalytic cycle // Biochemistry. 1988. Vol. 27. P. 5365-5370.

435. Wasser S.P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysacharides // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 60. P. 258-274.

436. Wasser S.P., Nevo E., Sokolov D., Reshetnikov S.V., Timor-Tismenetsky M. Dietary supplements from medicinal mushrooms: diversity of types and variety of regulations // Int. J. Med. Mushrooms. 2000. V. 2. P. 1-19.

437. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal mushrooms. Lentinus edodes (Berk.) Sing (Shiitake mushroom). Haifa, Israel: Peledful Publ., 1997.

438. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives: Review // Intern. J. Med. Mushrooms. 1999a. V. 1. P. 31-62.

439. Wasser S.P., Weis A.L. Therapeutic effects of substances occurring in higher

440. Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective // Crit. Rev. Immunol. 1999b. V. 19, № 1. P. 65-96.

441. Welsh D.T. Ecological significance of compatible solute accumulation by micro-organisms: from single cells to global climate // FEMS Microbiol. Rev. 2000. V. 24, №3. P. 263-290.

442. Whanger P.D. Selenocompounds in plants and animals and their biological significance // J. Am. Coll. Nutr. 2002. V. 21, № 3. P. 223-232.

443. Wolf F.T. The production of indoleacetic acid by Ustilago zeae and its possible significance in tumor formation // Proc. Natl. Acad. Sci. 1952. V. 38. P. 106-111.

444. Wohler 1. Auxin-indole derivatives in soils determined by a colorimetric method and by high performance liquid chromatography // Microbiol. Res. 1997. V. 152. P. 399-405.

445. Yagi F., Tadera K. Purification and characterization of lectin from Auricidaria polytricha //Agric. Biol. Chem. 1988. V. 52. P. 2077-2079.

446. Yamashita K., Kochibe N., Ohkura T., Ueda I., Kobata A. Fractionation of L-fucose-containing oligosaccharides on immobilized Aleuria aurantia lectin I I J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 4688-4693.

447. Yang Q.Y., Jong S.C. A quick and efficient method of making mushroom spawn // Mushroom Sci. 1989. V. 12. Part 1. P. 631-643.

448. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeev S.D. Laccase: properties, catalytic mechanism, and applicability // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 49. P. 257-280.

449. Yazawa S., Furukawa K., Kochibe M. Isolation of fucosyl glycoproteins from human erythrocytes membranes by affinity chromatography using Aleuria aurantia lectin // J. Biochem. 1984. V. 96. P. 1737-1742.

450. Yazawa S., Kochibe M., Asao T. A simple procedure for isolation of tumor-associated antigens by affinity chromatography using fucose-specific Aleuriaaurantia lectin // Immunol Invest. 1990. V. 19. P. 319-327.

451. Yoshida M., Kato S., Oguri S., Nagata Y. Purification and properties of lectins from a mushroom Pleurotus cornucopiae // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V. 58, № 3. P. 498-501.

452. Yu L., Fernig D.G., Smith J.A., Milton J.D., Rhodes J.M. Reversible inhibition of proliferation of epithelial cell lines by Agaricus bisporus (edible mushroom) lectin // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 4627-4632.

453. Yurekli F, Geckil H, Topcuoglu F. The synthesis of indole-3-acetic acid by the industrially important white-rot fungus Lentinus sajor-caju under different culture conditions // Mycol. Res. 2003. V. 107, Pt. 3. P. 305-309.

454. Yurekli F., Yesilada O., Yurekli M., Topcuoglu S.F. Plant growth hormone production from olive oil mill and alcohol factory wastewaters by white rot fungi // World J. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 15. P. 503-505.

455. Zhang J., Tang Q., Zimmerman-Kordmann M., Reutter W., Fan H. Activation of B lymphocytes by GLIS, a bioactive proteoglycan from Ganoderma lucidum // Life Sci. 2002a. V. 71, № 6. P. 623-638.

456. Zhang Y., Mills G.L., Nair M.G. Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant compounds from the mycelia of the edible mushroom Grifola frondosa // J. Agric. Food Chem. 2002b. V. 50. P. 7581-7585.

457. Zhuang C., Murata T., Usui T., Kawagishi H., Kobayashi K. Purification and chracterization of a lectin from the toxic mushroom Amanita pantherina // Biochim. et Biophys. Acta (BBA). 1996. V. 1291. P. 40-44.

458. Zhuang C., Wasser S.P. Medicinal value of culinary-medicinal Maitake mushroom Grifola frondosa (Dicks.: Fr.) S.F. Gray (Aphyllophoromycetideae): Review // Intern. J. Med. Mushrooms. 2004. V. 6. P. 287-314.

Информация о работе

Цивилева, Ольга Михайловна
доктора биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы