Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние внешних факторов бактериальной, индольной и селенорганической природы на рост и развитие ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние внешних факторов бактериальной, индольной и селенорганической природы на рост и развитие ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes"

На правах рукописи

Тм

ЛОЩИНИНА Екатерина Александровна

ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ, ИНДОЛЬНОЙ И СЕЛЕНОРГАНИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КСИЛОТРОФНОГО БАЗИДИОМИЦЕТА ¡.ЕЫТШЭ ЕОООЕБ

03.02.03 - микробиология 03.01.04-биохимия

1 О НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4859203

Саратов - 2011

4859203

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН), г. Саратов

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Никитина Валентина Евгеньевна

доктор биологических наук Цивилева Ольга Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тараненко Татьяна Михайловна

доктор биологических наук Терешина Вера Михайловна

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Пензенская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится « 50 » НОЙфЯ _ 2011 года в « /У » часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при ИБФРМ РАН по адресу: 410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ

и на сайте ИБФРМ РАН:

http://ibppm.ru/dissertacrannyy-sovef/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан » 2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.146.01, -

доктор биологических наук, профессор /ж^'— В.Е. Никитина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одним из приоритетных направлений современной микробиологии и биохимии является расшифровка путей индуцирования биохимических процессов онтогенетического развития грибов. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность во многом определяются факторами внешней среды, которые требуют детального изучения.

Среди культивируемых базидиомицетов Lentinus edades (шиитаке) безусловно относится к числу наиболее перспективных объектов. Этот гриб занимает второе место в мире по объему промышленного производства и обладает ценными питательными и целебными свойствами {Wasser and Weis, 1999; Zaidman et ai, 2005; Hearst et ai, 2009; De Roman, 2010; Shen et al., 2011]. Большое значение имеет вопрос о возможной оптимизации искусственного выращивания этой культуры. Внедрение биологических способов стимуляции роста мицелия и защиты его от посторонней микрофлоры позволило бы улучшить технологию выращивания, сократив время культивирования шиитаке и одновременно подавив рост контаминантов гриба. Повысить устойчивость гриба к негативном воздействиям окружающей среды можно, вероятно, за счет выращивания его совместно со стимулирующими рост микроорганизмами.

Бактерии рода Azospirillum, представители группы ризосферных бактерий, являются ассоциативными азотфиксаторами, стимулирующими рост и развитие растений посредством фиксации атмосферного азота и гормональной регуляции [Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan and de-Bashan, 2010; Fibach-Paldi et al., 2011]. Отмечается бактерицидная и фунгицидная активность азослирилл [Red'kina, 1990; Милькова и др., 2003] и их лектинов [Никитина, 2001] в отношении некоторых бактерий и микроскопических грибов. Сведения о совместном культивировании базидиомицетов с бактериями рода Azospirillum в искусственных условиях в литературе отсутствуют. Можно было надеяться, что в двойной культуре шиитаке с азоспириллами проявятся ростостимулирующие свойства этих бактерий, будет иметь место усиленная продукция соединений различной природы, способствующих росту мицелия. К числу таких ростостимулирующих веществ относятся фитогормоны.

Роль растительных гормонов в морфообразовании высших грибов-ксилотрофов практически не исследована, хотя в литературе встречаются предположения о том, что фитогормонам принадлежит важное место в дифференциации грибной культуры, и что процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том числе основного фитогормона класса ауксинов - индолилуксусной кислоты (ИУК). Согласно литературным данным, фитогормоны, в том числе ИУК, в определенных, значительно различающихся для разных видов концентрациях могут оказывать положительное влияние на прорастание спор, рост вегетативного мицелия и образование плодовых тел базидиомицетов [McMeekin, 2000; Isikhuemhen and Vaugnas-Ward, 2005; Mukhopadhyay et al., 2005]. Крайне немногочисленны сведения об обнаружении ИУК и исследовании путей ее биосинтеза у ксилотрофных базидиомицетов. Сообщения об изучении синтеза индолилуксусной кислоты ксилотрофом Lentinus edodes в доступной нам литературе отсутствуют.

Большое значение для нормальной жизнедеятельности организмов имеет обеспечение необходимыми микроэлементами. Селен - эссенциальный микроэлемент для большинства живых организмов, влияющий на функциональное состояние клетки и метаболические процессы [Барабой и Шестакова, 2004; Reilly, 2006]. Экспериментальные исследования показали, что различные селеновые соединения в разных концентрациях селективно влияют на развитие, скорость роста грибов и продукцию биоактивных компонентов, либо подавляя, либо стимулируя эти процессы.

Значительное количество работ посвящено исследованию действия неорганических форм селена на биохимический состав грибов [Ogra et ai, 2004; Zhao et ai, 2004b; Muñoz et al., 2006; Fatandysz, 2008]. В то же время влияние на грибные культуры органических соединений селена и метаболические пути утилизации этих веществ остаются практически не изученными.

В последние годы в связи с наблюдающимся в ряде регионов дефицитом Se в рационе людей и животных все больше развивается производство различных сепен-обогащенных продуктов как с помощью добавления селена в готовые пищевые продукты, так и путем выращивания различных сельскохозяйственных культур на обогащенных селеном средах [Combs, 2001; Whanger, 2002]. Многие виды макромицетов обладают способностью к аккумуляции селена в очень высоких концентрациях [Голубкина и др., 2000; Borovicka and Randa, 2007; Falandysz, 2008]. Поэтому исследование метаболизма селена у базидиомицетов не только имеет большое фундаментальное значение, но и может получить практическое применение для биологического синтеза низкотоксичных органических селеновых соединений (селенопротеинов и селеновых аминокислот) [Ogra ef al., 2004; Du ef al., 2007]. Перспективным направлением является также получение наночастиц элементного селена с помощью грибного мицелия [Sastry et al., 2003; Narayanan and Sakthivel, 2010, Popescu ef al 2010; Musarrat et al., 2011].

Все это обусловливает необходимость изучения индольных и селенорганических соединений, а также совместного культивирования с бактериями в связи с процессами цитодифференцировки и морфообразования грибов, выявления роли этих факторов в жизнедеятельности грибных культур. Представляло интерес сравнить действие этих разных по природе факторов между собой. Такого рода исследования могли бы быть полезны для целенаправленного отбора эффективных индукторов, повышающих стресс-устойчивость съедобных культивируемых грибов, как это имеет место у растений [Dat et al., 1998].

Важность изучения и разнообразие эффектов биотических и абиотических факторов в онтогенезе базидиомицетов, а также разностороннее значение гриба шиитаке, ко времени начала наших исследований явно не согласовывались с недостатком сведений о роли индольных соединений и путей их трансформации, селенсодержащих органических соединений в жизнедеятельности высших грибов. Не изучалась двойная культура базидиомицета Lentinus edodes с бактериями вообще, и в частности с известными продуцентами фитогормона индольной природы - почвенными ассоциативными бактериями рода Azospirillum. На основании вышеизложенного нами было предпринято настоящее исследование.

Цель данной работы - исследование совместного культивирования ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing, с бактериями Azospirillum brasilense и выявление роли индольных и селенсодержащих соединений, характеристик их биосинтеза и путей трансформации у грибной культуры.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать условия совместного культивирования L. edodes F-249 и A brasilense

Sp7.

2. Изучить влияние азоспирилл на рост, морфологические и биохимические особенности L. edodes F-249.

3. Исследовать воздействие экзогенной ИУК и предшественников ее биосинтеза на рост и развитие L. edodes F-249.

4. Выявить способность L. edodes F-249 к синтезу ИУК под влиянием различных индольных соединений.

5. Установить пути биосинтеза ИУК изучаемой культурой L. edodes F-249 при выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенных синтетических аналогов соединений -предшественников ИУК.

6. Изучить влияние органического селенсодержащего соединения (ДАФС-25) на рост L edodes F-249 на жидких и твердых средах разного состава.

7. Определить возможные пути метаболизма селенорганического ксенобиотика ДАФС-25 у шиитаке.

Научная новизна работы

Впервые была экспериментально подтверждена возможность, подобраны условия и показана эффективность совместного глубинного культивирования базидиомицета Lentinus edodes с бактериями Azospirillum brasilense и получения посевного мицелия на основе

промежуточной совместной культуры. Выявлены положительные эффекты совместного культивирования шиитаке и азоспирилл. Обнаружено снижение биотического влияния посторонней микрофлоры на мицелий шиитаке в условиях двойной культуры с А. ЬгаэНепзе Бр7, усиленное накопление маннита как биохимического предшественника подготовки к плодоношению, отсутствие увеличения лектиновой активности как один из показателей благоприятных условий роста шиитаке в присутствии азоспирилл.

Впервые обнаружена и количественно охарактеризована способность ксилотрофного базидиального гриба ес/ос/сэ к биосинтезу фитогормона ИУК и промежуточных соединений этого синтеза, а также влияние шести индольных соединений при экзогенном введении в среду на рост, морфогенез, уровень собственной продукции и конкурентные отношения триптофан-зависимого и независимого путей биосинтеза ИУК макробазидиомицетом.

Впервые выявлена индукция генеративной стадии развития шиитаке индольным производным. Установлено, что среди изученных соединений - предшественников ИУК только индолилацетамид в концентрации порядка КГ* г/л в культуральной жидкости 1. еЬоЬев оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на формирование морфологической структуры - коричневой мицелиальной пленки шиитаке.

Впервые выявлено накопление элементного селена в результате трансформации селенорганического соединения высшим грибом ЬепИпиз еёойез, обнаружена стимуляция роста и развития мицелия под действием этого соединения.

Практическая значимость исследования

Научные положения работы выявляют первоочередные задачи начальных этапов изучения смешанных культур высших грибов с симбиотическими ускоряющими рост растений бактериями, функциональной роли последних в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах, расширяют и углубляют современные представления о разнообразии функций природных соединений группы индола, о физиолого-биохимических механизмах регуляции их продукции базидиомицетами; позволяют с новых позиций подойти к изучению селенорганических веществ.

В работе выявлены реальные пути оптимизации процесса получения плодовых тел ценного высшего гриба. Обнаруженное положительное влияние таких факторов, как совместное выращивание с азоспириллами и присутствие селенорганического препарата ДАФС-25, на рост и развитие грибной культуры может быть использовано для совершенствования условий культивирования шиитаке.

Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе ИБФРМ РАН, Института химии СГУ, лаборатории экспериментальной микологии Института микробиологии НАН Беларуси.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бактерии АгозрИНит ЬгавНепБе в условиях совместной культуры с базидиомицетом 1епИпив ес1ос1е5 стимулируют рост, усиливают конкурентоспособность посевного мицелия в отношении контаминирующей микрофлоры и вызывают изменения в углеводном, жирнокислотном и белковом составе мицелия.

2. Культура ¡_. ееЫея Р-249 синтезирует соединения индольной природы при росте в условиях погруженного культивирования. Состав группы экстраклеточных индольных соединений шиитаке зависит от условий глубинного культивирования и включает в разных соотношениях следующие компоненты: /.-триптофан, р-индолил-3-уксусную кислоту, р-индолил-3-ацетапьдегид, р-Индолил-З-ацетамид, индолил-3-пировиноградную кислоту, триптамин, 5-гидрокси-р-индолил-З-уксусную кислоту.

3. Путь биосинтеза ИУК изучаемой грибной культурой является триптофан-зависимым, однако происходит переключение на триптофан-независимый путь при выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенного индола, а также при индуцировании биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты ее микродобавками.

4. Селенорганическое соединение ДАФС-25 является экзогенным регулятором роста и развития ес/о^ея. В качестве одного из путей метаболизма ДАФС-25 впервые выявлено выделение элементного селена в глубинной культуре высшего гриба.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствий с плановой тематикой «Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия» (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина); «Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина); «Изучение гликопротеинов и биогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200904389, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина).

Работа частично поддержана фантами РФФИ-БРФФИ (РФФИ и Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований; руководитель с российской стороны - д.б.н., проф. В.Е. Никитина): «Гликополимеры и углеводсвязывающие белки ксилотрофных базидиомицетов: функции и биологическая активность» № 06-04-81042-Бел_а (2006-2007 гг.); «Липофильные соединения мицелиальных грибов: образование, характеристика» № 08-08-90004-Бел_а (2008-2009 гг.); «Соединения фитогормональной природы в культуре базидиомицетов: биосинтез и физиологический эффект экзогенного воздействия» № 10-04-90021-Бел_а (2010-2011 гг.).

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на: Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 13-15 октября 2004); Всерос. научно-практ. конфер. «Вавиловские чтения - 2004» (Саратов, 24-26 ноября 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005); Всерос. конфер. «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 15-17 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysis-2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); 4-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29-31 марта 2006); 10-й Пущинской школе-конфер. мол. ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 17-21 апреля 2006); Межд. науч. конфер. «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)» (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 1619 мая 2006); Межд. науч. конфер. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 1-2 июня 2006); Межд. науч. конф. «Микробные технологии», поев. 140-летию со дня рожд. Д.К. Заболотного (Одесса, Украина, 11-15 сентября 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 10—12 октября 2006); 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); VI Всерос. интерактивной конфер. мол. ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 16-22 September 2007), Межд. научно-практ. конф., поев. 120-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, 27-30 ноября 2007); Междунар. науч. конф. «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 15-18 мая 2008); Втором Съезде микологов России (Москва, 16-18 апреля 2008); IV межрегиональной конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 14-16 октября 2008); Межд. научно-практ. конф. «Вавиловские чтения - 2008» (Саратов, 26-27 ноября 2008); II Всерос. с межд. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 25-29 мая

2009); «VII Межд. Симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 19-23 октября 2009); Межд. науч.-практ. конф. «Вавиловские чтения -2009» (Саратов, 25-26 ноября 2009); 14-й Пущинской межд. шкопе-конф. мол. ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010); VII Межд. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 31 мая-4 июня

2010); V Всерос. конф. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сентября-1 октября 2010); VIII Межд. конф. «Биоантиоксидант» (Москва, 4-6 октября 2010); Всерос. симпозиуме с межд. участием, поев.

85-летию со дня рожд. В.А. Кумакова «Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у культивируемых растений» (Саратов, 13-15 октября 2010); Межд. конфер. «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология», поев. 100-летию со дня рожд. академика Т.Б. Дарканбаева (Алматы, Казахстан, 28-29 октября 2010); Межд. науч,-практ. конф. «Вавиловские чтения-2010» (Саратов, 25-26 ноября 2010); Всерос. симпозиуме с межд. участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.

Личный вклад соискателя состоит в постановке и разработке путей выполнения всех основополагающих задач, решаемых в рамках диссертационной работы, ключевая роль на всех этапах исследования и интерпретации полученных результатов, участие в подготовке публикаций.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых изданиях и 14 статей в сборниках научных трудов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы.

Работа изложена на 169 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 38 рисунками и 8 таблицами. Список цитируемой литературы включает 248 источников, в том числе 170 зарубежных, 116 опубликованы в XXI веке.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы (глава 1) представлен 4 разделами, 9 подразделами. В первой части обзора кратко охарактеризованы морфолого-культурапьные и физиолого-биохимические особенности ЛепМпдо ебоВо второй части изложены современные представления о бактериально-грибных симбиозах, описаны имеющиеся в литературе немногочисленные исследования совместного культивирования базидиомицетов с бактериями в искусственных условиях, освещены предпосылки для использования при получении двойных культур с базидиальными грибами почвенных азотфиксаторов рода АговрШит. В третьей части обзора литературы рассмотрено значение фитогормонов индольной природы в жизнедеятельности базидиомицетов. Приведена характеристика фитогормона класса ауксинов - р-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), рассмотрены особенности биосинтеза ИУК микроорганизмами. Далее изложены сведения об изучении синтеза ИУК базидиальными грибами и влияния экзогенной ИУК на рост и развитие грибных культур. В четвертой части обзора приведена характеристика микроэлемента селена, охарактеризованы важнейшие функции, выполняемые селеном и его соединениями в живых организмах, подчеркнуто значение Эе в питании человека. Рассмотрена способность шляпочных грибов к аккумуляции селена и влияние этого микроэлемента на их ростовые характеристики. Приведены данные о химическом составе и практическом применении органического селенсодержащего препарата ДАФС-25. На основании каждого из разделов представленного обзора сформулированы аспекты исследования для достижения цели настоящей работы и определен круг решаемых для этого задач.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования, условия культивирования

В работе использовали культуру Lentinus edodes F-249 из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета и штамм Azospiríllum brasilense Sp7, полученный из Института микробиологии РАН (г. Москва).

Для выращивания культур использовали среды следующего состава: сусло пивное (1,2 или 2° по Баллингу); среда на основе отвара пшеничной муки; среда на основе экстракта дубовых опилок; среда с дрожжевым экстрактом состава (г/л): глюкоза - 10; дрожжевой экстракт-1; КН2Р04-2; К2НРО„-3; MgS04-7Ha0-2,5; FeS04-7H20 - 0,03; CaCI2-7H20 -0,02; гпюкозо-аспарагиновые среды состава (г/л): D-гпкжоза - 9; L-аспарагин - 1,5 или D-глюкоза -10, L-аспарагин-1; КН2РО„-2; К2НР04-3; MgS04-7H20 - 2,5; FeS04-7H20 - 0,03; CaCI2-7H20

- 0,02; модифицированная малатная среда [Day and Dobereiner, 1976] состава (г/л): К2НР04 -3.0; КН2РО„ - 2,0; NaCI - 0,1; MgS04-7H20 - 0,2; CaCI2 - 0,02; FeS04-7H20 - 0,02; MnS04-5H20

- 0,1; N?2Mo04-2 H20 - 0,002; NaOH - 2,24; яблочная кислота - 3,76 (pH 6,8-7,0). Плотные среды получали, добавляя в питательные растворы 1,8-2% (m/v) агара, при этом концентрацию пивного сусла увеличивали до 4° по Баллингу. Для получения плодовых тел шиитаке использовали субстрат на основе зерна пшеницы и дубовых опилок в пропорции 1:4 (v/V).

Индольные соединения ("Sigma") и селенсодержащий препарат ДАФС-25 вносили в среду виде растворов в 50%-ном этаноле, Na2Se03 и Na2Se04 ("Sigma") - в виде водного раствора.

Температура выращивания монокультуры L. edodes составила 26°С, совместной культуры L. edodes и A. brasilense - 28°С.

Методы исследования

При посеве грибной культуры в качестве инокулята использовали 14-суточную культуру L. edodes F-249, выращенную на агаризованном пивном сусле (4° по Баллингу) при 26°С. Среды инокулировали блоками мицелия (диаметр 5 мм) из расчета 10 блоков на 100 мл жидкой среды или 1 блок на 1 чашку Петри. При исследовании диапазона концентраций ДАФС-25 жидкие среды инокулировали мицелием, взятым с чашки Петри в виде сектора (1/8 чашки). Плодовые тела L edodes получали на плотном субстрате, состоящем из смеси дубовых опилок и пшеничного зерна [Przybylowicz and Donoghue, 1991].

При исследовании совместного роста L. edodes F-249 и A. brasilense Sp7 на чашках Петри с сусло-агаром шиитаке подсевали к растущей 24-часовой культуре A. brasilense или помещали диск с мицелием на расстоянии 2-2,5 см от центра чашки Петри, и через 5 сут с противоположной стороны подсевали штрихом азоспириллу. Смешанную культуру на жидких средах получали, подсевая A. brasilense к L. edodes либо в виде смыва с агаризованной среды, либо в виде 24-часовой культуры на малатной среде (2-10 7 клеток /мл).

Для оценки роста культур базидиомицетов на агаризованных средах определяли скорость линейного роста колонии и ростовой коэффициент [Бухало, 1988]. При глубинном культивировании шиитаке рост характеризовали по накоплению сухой биомассы мицелия [Методы ..., 1982].

Экстракты из мицелия для определения белкового состава получали по модифицированному методу Banerjee с соавт. [Banerjee ef. al., 1982] с использованием буфера Tris-HCI (рН 7,5). Для определения углеводного состава высушенный и измельченный мицелий экстрагировали трижды в течение 30 мин. кипящей дистиллированной водой или этанолом соответственно. Для определения селенсодержащих аминокислот экстракцию мицелия проводили дистиллированной водой в течение 3 ч при 37°С [Ogra ef al., 2004].

Индольные соединения определяли в культуральной жидкости (КЖ) методом распределительной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборном комплексе "Millichrom" ("Laboratorni Pristroje", Чехия). Колонка (150x4.6 мм) "Luna 5р С18(2)" ("Phenomenex", США), с предколонкой (типа Security Guard) той же

марки, носитель с химически связанными гидрофобными остатками С18 (5 мкм), элюент -смесь метанол - вода (36 : 64 либо 50 : 50, v/v).

Рентгенофлуоресцентный анализ осуществляли с помощью энергодисперсионного рентгеновского спектрометра EDX-720 Energy Dispersive X-Ray Spectrophotometer.

Хромато-масс-спектрометрическое исследование (в варианте ГХ-МС) проводили на газовом хромато-масс-спектрометре Trace GC - Trace DSQ ("ThermoFinnigan", США).

Рентгенофазовый анализ осуществляли на рентгеновском дифрактометре ДРОН-З.О с CuKa-излучением (длина волны 1.54173 А).

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в неденатурирующих условиях на приборе для вертикального гель-электрофореза VE-4M («Хеликон», Россия) Визуализация белковых спектров осуществлялась методом окраски при помощи нитрата серебра [Блохин, 1988].

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) КЖ и экстрактов из мицелия для определения аминокислотного состава проводили на пластинках силикагеля в системе растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1, v/v). Для визуализации результатов разделения применяли раствор нингидрина (0,3 г нингидрина в смеси 100 мл н-бутанола и 3 мл ледяной уксусной кислоты).

.Пектиновую активность КЖ и экстрактов из мицелия определяли реакцией гемагглютинации с самопроизвольным оседанием эритроцитов в серии последовательных разведений пектина [Луцик и др., 1981]. Использовали 2%-ную суспензию трипсинизированных эритроцитов кролика.

Состав углеводной фракции мицелия исследовали методом капиллярной газовой хроматографии на неподвижной жидкой фазе SE-54 с предварительным получением синильных производных Сахаров, на приборе "Chrom 5" (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором, используя кварцевую капиллярную колонку длиной 25 м. Триметилсилиловые эфиры исследуемых проб и соединений-стандартов получали с использованием 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазана и триметилхлорсилана в качестве катализатора [Пецев и Коцев, 1987].

Липиды для анализа жирнокислотного состава мицелия экстрагировали модифицированным методом Song с соавт. [Song et al., 1989]. Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) [Хроматография ..., 1986] на газожидкостном хроматографе «Биохром-1» на кварцевой капиллярной колонке (длина 25 м, внутренний диаметр 0,2 мм) с неподвижной фазой SE-54.

Просвечивающую электронную микроскопию проводили на электронном микроскопе "Libra 120" ("Carl Zeiss") при 120 kV и увеличении *4000 на никелевых сеточках с подложкой (1%-ный раствор формвара в дихлорэтане), световую микроскопию - на микроскопе "Leica DM6000B" ("Leica Microsystems") при увеличении *20 и *40.

Опыты по измерению грибной биомассы проводили в 5-10 повторностях, все остальные - в 3 повторностях. При оценке полученных результатов пользовались методом расчета стандартного отклонения среднего арифметического [Рокицкий, 1973]. Представленные в работе данные имеют соответствующие доверительные интервалы при уровне доверительной вероятности 0,95. Для количественной обработки данных использовали также программу Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние азоспирилл на рост и развитие L. edodes F-249

Бактерии рода Azospirillum являются перспективным объектом для совместного культивирования с шиитаке благодаря своей способности стимулировать рост симбиотических организмов и в то же время подавлять жизнедеятельность фитопатогенной микрофлоры. Достаточно хорошо изучена способность азоспирилл к стимуляции роста высших растений, исследуется и культивирование азоспирилл совместно с другими микроорганизмами - водорослями, бактериями и микроскопическими грибами. Известно, что в природных условиях бактерии рода Azospirillum ассоциируются также с микоризами и спорокарпами микоризных грибов. Приступая к исследованию совместного культивирования

Рис. 1. Рост мицелия L. edodes (30 сут) на опилочно-зерновом субстрате при инокуляции: а - монокультурой L. edodes F-249;

б - совместной культурой L. edodes F-249 и A. brasilense Sp7

L. edodes и A. brasilense, мы поставили задачу прежде всего экспериментально подтвердить возможность, подобрать условия выращивания двойной культуры и выявить положительные эффекты совместного культивирования шиитаке и азоспирилл.

Поведение совместных культур изучали на жидких и агаризованных средах, на твердом

опилочно-зерновом субстрате. Морфология колоний А. brasilense при культивировании с шиитаке не изменялась. Было установлено, что одной из наиболее благоприятных сред для нормального роста обеих культур является жидкая среда на основе пивного сусла. На данной среде были получены все морфологические стадии шиитаке. При совместном росте с азоспириллой в жидкой глубинной культуре на данной среде сухая биомасса мицелия увеличивалась на 60%. При использовании совместной культуры в качестве инокулята заметно ускорялся рост мицелия и на опилочно-зерновом субстрате (рис. 1); наибольшее положительное влияние азоспирилл на развитие гриба наблюдалось при возрасте посевной совместной культуры 14 сут. Использование зернового мицелия, полученного на основе промежуточной совместной культуры L. edodes F-249 и A. brasilense Sp7, для выращивания плодовых тел приводило к увеличению урожайности шиитаке. Последовательная инокуляция того же субстрата шиитаке и азоспириллой указанных положительных последствий не имела.

Наблюдалось явное преимущество двойной культуры в плане подавления посторонней микрофлоры (рис. 2). Оставленные в нестерильных условиях открытые колбы с двойной культурой оказались практически не подвержены контаминации, тогда как в отрытых колбах с монокультурой гриба заражение происходило во всех случаях. Фунгистатические свойства двойной культуры в отношении посторонней микрофлоры продолжали заметно отличаться от монокультуры шиитаке при пересеве на опилочно-зерновой субстрат. Этот субстрат используется для получения плодовых тел съедобных ксилотрофных грибов. Мицелий при этом находится в нестерильных условиях, и субстратные блоки сильно подвержены заражению конкурентной микрофлорой, в первую очередь плесневыми грибами, такими, как представители рода Trichoderma. Поэтому защита мицелия шиитаке от контаминации на данном этапе культивирования приобретает особое значение, и решением этой проблемы может послужить использование в качестве посевного материала двойной культуры L. edodes с азоспириллой.

Возможно, снижение биотического влияния контаминирующих микроорганизмов на мицелий шиитаке происходит как благодаря большей физиологической активности мицелия, так и за счет фунгистатического действия азоспирилл в отношении контаминантов.

Одним из важнейших свойств азоспирилл является биосинтез фитогормонов, позволяющий рассматривать их как стимуляторы роста растений. Мы предположили, что благоприятное влияние A. brasilense на шиитаке связано с выделением в среду культивирования веществ фитогормональной природы. Исследовали влияние на грибную монокультуру ИУК - растительного гормона, наиболее изученного как в отношении влияния на базидиомицеты, так и в плане биосинтеза азоспириллой. При выращивании L. edodes на синтетической глюкозо-аспарагиновой среде с добавлением 2-10"5 - 2-10"6 г/л ИУК сухая

Рис. 2. Совместная культура L. edodes F-249 и A. brasilense Sp7 на жидкой среде (пивное сусло) и монокультура L. edodes F-249 того же возраста (30 сут), зараженная посторонней микрофлорой

биомасса мицелия увеличилась на 17-29%, а на пивном сусле ИУК в концентрации 2-Ю"5— 2Ю'7 г/л вызвала увеличение сухой биомассы на 56-64% (рис. 3). В то же время более высокие концентрации - от 5-10"4 г/л и выше на синтетической среде, 2Ю~3 г/л и выше на пивном сусле - ингибировали рост культуры.

2,5

□ 10 мг/л

0 5 мг/л

В 2 мг/л

S 0,5 мг/л

И 0,2 мг/л

И 0,02 мг/л

И 0,002 мг/л

И 0,0002 мг/л

И контроль синтетическая сусло

среда

Рис. 3. Накопление сухой биомассы монокультуры L. edades F-249 на средах с ИУК

Однако при ВЭЖХ-анализе культуральных жидкостей как монокультур шиитаке и азоспириллы, так и двойной культуры ИУК не была обнаружена, несмотря на присутствие достаточно высоких концентраций ее основного предшественника - триптофана, что не позволяет связать положительное влияние азоспирилл на рост гриба шиитаке при их совместном глубинном культивировании с биосинтезом свободной ИУК бактериями.

Характеристика биохимических показателей грибного мицелия при совместном культивировании L. edodes F-249 с A. brasilense Sp7

Среди биохимических особенностей

мицелия,

способность базидиомицета к важное место занимают его белковый, углеводный и жирнокислотный

определяющих плодоношению, аминокислотный, состав.

Результаты ТСХ-исследования показали различия в составе пула аминокислот КЖ и экстрактов из мицелия монокультуры шиитаке и выращенной совместно с азоспириллой.

Нативный электрофорез в полиакриламидном геле выявил различия в белковом составе мицелиальных экстрактов L. edodes в монокультуре и при совместном росте с A. brasilense (рис. 4). У двойной культуры наблюдалось появление белков с молекулярной массой около 70 кДа и двух высокомолекулярных белков около 200 и 300 кДа, отсутствующих в мицелии монокультуры.

Определение гемагглютинирующей активности культуральной жидкости не выявило отличий этого показателя у двойной культуры и монокультуры гриба. Условия культивирования в присутствии азоспирилл не являются для L. edodes стрессовыми, на что указывают возрастание биомассы гриба и отсутствие изменения лектиновой активности.

Изменения в углеводном и жирнокислотном составе мицелия в двойной культуре по сравнению с

669

232

М 1 2

Рис. 4. Нативный электрофорез экстрактов из мицелия L. edodes F-249 (21 сут). М - маркеры, 1 - экстракт мицелия монокультуры шиитаке, 2 - экстракт мицелия шиитаке, выращенного в двойной культуре с A. brasilense

монокультурой гриба оказались качественно сходными с соответствующими биохимическими изменениями, происходящими в мицелии перед плодоношением. В мицелии, выращенном в присутствии А. ЬгазИепБе, повышалось содержание полиола маннита (на стадии белого мицелия и примордия - в 3 раза, на стадии коричневой мицелиальной пленки (КМП) - более чем в 30 раз) и снижалась степень насыщенности жирных кислот. Это явление может служить одним из аспектов объяснения обнаруженного нами положительного влияния А. ЬгазНепве Бр7 на рост edodes Р-249.

Влияние экзогенной ИУК и ее предшественников на рост и развитие шиитаке

По данным наших исследований, ИУК оказалась в стороне от стимулирующей рост мицелия деятельности А. ЬгазНепве Эр7. Тем не менее, явная способность химического аналога этого ауксина положительно влиять на накопление биомассы, проявляя при этом дозозависимый характер, требовала дальнейшего изучения.

У грибов достаточно хорошо изучена роль ауксинов в жизнедеятельности только определенных групп микокультур: фитопатогенных и микоризных. Фитогормональные соединения служат у этих организмов для взаимодействия с растением-хозяином. Способностью к продукции ауксинов могут обладать и грибы, не связанные тесно в процессе своей жизнедеятельности с растениями. Достаточно давно выдвигаются предположения о том, что фитогормоны, в том числе представители группы ауксинов, принимают участие в процессах роста и дифференцировки не только у растений, но и у грибов, однако этот вопрос до сих пор остается практически не исследованным. Поэтому следующим этапом наших исследований явилось изучение способности 1-епНпиз ес1ос1е8 Р-249 экзогенно продуцировать индолилуксусную кислоту, определение соединений, служащих в качестве предшественников для синтеза ИУК и возможных путей этого синтеза, а также влияния этих соединений при экзогенном введении в среду на рост, развитие и уровень продукции гетероауксина культурой.

Изучили влияние экзогенной ИУК на накопление сухой биомассы мицелия в динамике роста на синтетической среде (рис. 5). Высокие концентрации ИУК (10 - 10"4) г/л вызывали уменьшение биомассы по сравнению с контролем; максимальным (почти в 2 раза) это снижение оказалось на 7-10 сут, а после 14 сут негативное влияние ИУК становилось менее выраженным. Более низкие концентрации ИУК в целом не оказывали выраженного негативного влияния на ескэс/ез, но на 10 сут на средах с 10"8 - 10~5 г/л ИУК биомасса снижалась. Прирост биомассы по сравнению с контролем оказался максимальным на средах с 10"5 и 10"7 г/л индолилуксусной кислоты после 14 сут культивирования.

2 ■ 3

- - 4 -- 5

6

— 7

Рис. 5. Накопление биомассы мицелия Lentinus edodes F-249 на синтетической среде с ИУК. 1 - контроль, 2 — 10"8 г/л ИУК, 3 - 107 г/л ИУК, 4 - Ю^6 г/л ИУК, 5 - 10"5 г/л ИУК, 6 - 10"4 г/л ИУК, 7 - 10'3 г/л ИУК, 8 - 10'2 г/л ИУК, 9 - 10'1 г/л ИУК

Помимо самой индолилуксусной кислоты, было изучено влияние ряда ее предшественников на рост погруженной культуры L. edodes на синтетической глюкозо-аспарагиновой среде. Триптофан добавляли к исходной среде в количестве 10 и 100 мг/л.

Аминокислота не оказала на культуру шиитаке заметно выраженного воздействия. 10 мг/л не влияли достоверно на накопление биомассы, 100 мг/л слабо стимулировали рост. Влияние индолил-3-ацетамида (ИААм), триптамина (ТАм), индолилпировиноградной кислоты (ИПВК) и индола изучили в динамике роста. На средах с ИААм, ТАм и ИПВК рост мицелия был несколько более интенсивным, чем в контрольном варианте опыта. В наибольшей степени стимулировали накопление мицелия 100 мг/л триптамина и 0,1 мг/л ИААм, а 10-100 мг/л индола заметно угнетали рост.

На средах с ИУК и ее предшественниками в большинстве случаев не наблюдалось изменений в морфологии погруженного мицелия L. edades. Исключение составила среда с 0,1 мг/л ИААм, на которой отмечено сокращение времени появления коричневой мицелиальной пленки - специализированной морфоструктуры шиитаке, образующейся на стадии, предшествующей плодоношению. Пленка появилась на этой среде уже на 17-е сут, тогда как в контрольном варианте, при других концентрациях ИААм и на средах с остальными индольными соединениями ее образования не наблюдалось. 0,1 мг/л ИААм оказали наибольший стимулирующий эффект на накопление мицелиальной биомассы, и максимальным (24%) прирост был именно на 17-е сут. Вероятно, с этим усилением роста связано и ускорение образования КМП.

Биосинтез ИУК и ее предшественников культурой L. edodes F-249 Основным предшественником ИУК является аминокислота триптофан. Биосинтез ИУК из триптофана (триптофан-зависимый синтез), у микроорганизмов может проходить по одному из четырех путей: через ИПВК и индолил-3-уксусный альдегид (ИААльд) (наиболее распространенный путь); через ТАм и ИААльд; через ИААм либо через индолилацетальдоксим и индолил-3-уксусный нитрил. Наряду с триптофан-зависимым биосинтезом ИУК как у растений, так и у микроорганизмов выделяют также Тгр-независимый, при котором индолилуксусная кислота образуется из индола или антраниловой кислоты не через триптофан. Механизм Trp-независимого биосинтеза ауксинов микроорганизмами изучен крайне мало, а его вклад в биосинтез ИУК считается незначительным.

Состав культуральной жидкости L. edodes F-249, выращенной на глюкозо-асларагиновой среде с добавками различных концентраций предшественников ИУК, изучили методом ВЭЖХ с целью определить наличие и количественное содержание в ней индольных соединений, вовлекающихся в процесс биосинтеза ИУК микроорганизмами. В культуральной жидкости L. edodes F-249 были обнаружены следующие индольные соединения: ИУК, триптофан, триптамин, ИААм, ИПВК, ИААльд, 5-гидрокси-индолил-З-уксусная кислота.

Способность L. edodes к экзогенной продукции ИУК нами обнаружена впервые. На среде, изначально не содержавшей триптофана, ИУК накапливалась в КЖ в максимальной концентрации 7,43 мг/л (рис. 6).

s

i 3

1 ф

3" г

л/ ^ л/ ^

¿f ^ ^ ^ ^

^ ^ ^ ^ Л 0<?

Г ^VV

,j>

N л гР

# # ^ * л

Рис. 6. Синтез внеклеточной ИУК глубинной культурой Lentinus edodes F-249 разного возраста на средах с индольными соединениями

Добавление триптофана к среде выращивания вызывало увеличение содержания ИУК до 9,33 мг/л (на среде со 100 мг/л триптофана). Стимулирующее действие на синтез ИУК оказали 1-10 мг/л ТАм. Среды с добавлением индола характеризовались достаточно высокими значениями ИУК (до 9 мг/л) на 14-21-е сут культивирования, причем количества образовавшейся ИУК не зависели от исходной концентрации индола, изменявшейся на 4 порядка. На средах с ИПВК индолил-3-уксусная кислота обнаружилась лишь в очень малых количествах (максимум 1,8 мг/л на 14 сут на среде с 100 мг/л ИПВК), однако было обнаружено в высоких концентрациях (до 27,9 мг/л) промежуточное соединение синтеза ИУК из ИПВК или триптамина - ИААпьд, не найденное на других средах (рис. 7).

Рис. 7. Синтез внеклеточного ИААпьд глубинной культурой Lentinus edodes F-249 разного возраста на средах с индольными соединениями

На всех изученных средах в КЖ присутствовал триптофан (рис. 8). Внесение 10 и 100 мг/л триптофана в среду привело к значительному повышению содержания этого вещества в КЖ. Максимальное количество триптофана - 327 мг/л - отмечено на 14-е сут на среде, куда изначально было внесено 100 мг/л этой аминокислоты.

с- 35

= 30 гг

d 25 I Ш 3 сут

I ; MjüljLjmí JJ i VZ.

£ 10 шшшгашшшмии iiíhiuiib si4Cyr

=г c lliliilBlKiniliili 8 21 cyr

x t, ИТИЯ вин га-тем влыма -г™ на™ 'о-"*1

О

ьг

0

Рис. 8. Синтез внеклеточного триптофана глубинной культурой Lentinus edodes F-249 разного возраста на средах с индольными соединениями

Индол не был обнаружен ни в одной из проб, в том числе и в тех случаях, когда его добавляли в среду перед началом культивирования гриба.

В контроле, на средах с ТАм и ИААм при всех возрастах мицелия в КЖ присутствовала окисленная форма ИУК - 5-гидрокси-ИУК, концентрации ее при этом колебались в пределах от 0,78 до 2,63 мг/л. Исключение составила среда с 0,1 мг/л ИААм, где на 14-21 сут уровень 5-гидрокси-ИУК резко увеличился на порядок (рис. 9). Как было сказано выше, этот вариант опыта отличался от остальных ранним появлением коричневой мицелиальной пленки. На 14 сут наблюдалась заметная пигментация мицелия, а к 17 сут пленка полностью образовалась. Можно предположить, что 5-гидрокси-ИУК кислота вовлекается в процесс формирования КМП.

^^VV у у у ^ ^VV^ / / / /

^ Л* V>

Рис. 9. Синтез внеклеточной 5-гидрокси-ИУК глубинной культурой Lentinus edodes F-249 разного возраста на средах с индольными соединениями

отношении ИУК

Определение возможных путей синтеза ИУК культурой L. edodes F-249

Выявленная нами биосинтетическая способность гриба предшественника триптофана позволила исследуемой культуры Тгр-зависимого синтеза ИУК. В КЖ L edodes F-249 выявлены промежуточные соединения трех путей Тгр-зависимого биосинтеза ИУК - через ТАм, ИААм и ИПВК (рис. 10). Интересно, что ИААльд, являющийся интермедиатом синтеза ИУК как из ИПВК, так и из ТАм, выявлен только на средах с добавкой ИПВК, где ИААльд накапливался в больших количествах, однако уровень ИУК в то же время был очень низким. Это позволяет предположить, что путь синтеза ИУК через ИПВК не реализуется до конца.

Однако наряду с Тгр-зависимым биосинтезом ИУК у L. edodes, имеются предпосылки для и Trp-независимого пути синтеза. Принято считать, что у бактерий

синтез ИУК - это путь детоксификации триптофана, поэтому для бактериальных продуцентов именно триптофан - наиболее эффективный и «целесообразный» прекурсор ИУК. Для изучаемого нами высшего гриба триптофан токсичным не является, по крайней мере вплоть до относительно высоких концентраций, которые грибная культура создает при глубинном культивировании (до 330 мкг/мл).

ТАМ

ИААм

ИПВК

Рис. 10. Содержание предшественников ИУК в КЖ глубинной культуры Lentinus edodes F-249 (контроль)

Одним из труднопреодолимых моментов на пути доказательства Тгр-независимости биосинтеза ИУК является то, что индол может служить как предшественником ИУК при Тгр-независимом биосинтезе, так и предшественником триптофана. Тгр, синтезированный из индола, затем также может служить предшественником для ИУК. Случаи, когда ИУК синтезируется культурой в отсутствие триптофана, не отмечены, что указывает на Тгр-зависимый путь биосинтеза ИУК изучаемой грибной культурой. Тем не менее, можно предположить, что происходит переключение на Trp-независимый путь, или, что вероятнее, подключение этого альтернативного пути, реализуемого в присутствии экзогенного индола в интервале концентраций 10"1 - 10"4 г/л. Необходимо оговориться в отношении добавок индола, что и в этом случае фоновый уровень триптофана есть, но, во-первых, в сравнении с контрольным опытом на 14-е сут он изменяется незначительно, а ИУК синтезируется в 1,51,9 раз больше, несмотря на явное снижение биомассы гриба под воздействием индола. Во-вторых, концентрация триптофана в среде индифферентна к возрастанию уровня экзогенного индола от 0,1 до 100 мг/л (в 1000 раз), а потому индол предположительно не является в данном случае сколько-нибудь значимым прекурсором триптофана с дальнейшим превращением последнего в ИУК. Повышенный уровень индола в культуральной среде усиливал продукцию ИУК, а не триптофана. Это позволяет говорить о подключении Тгр-независимого пути.

Признаки этого пути имеются и при индуцировании биосинтеза ИУК ее экзогенными микродобавками (10"5- 10"8 г/л). Например, при исходной концентрации 1№7 г/л ИУК на 10-е сут выращивания уровень фитогормона составил около 4-10"4 г/л, т.е. возрос в 4000 раз). Появление антраниловой кислоты (до 1,5 мг/л) как признака Тгр-независимого пути отмечено нами только в этих экспериментальных условиях (рис. 11). В то же время сам триптофан в КЖ на средах с 10"1 - 10~8 г/л ИУК обнаружен не был.

Концентрация ИУК в исходной среде, мг/л

Рис. 11. Синтез внеклеточной антраниловой кислоты глубинной культурой Lentinus edodes F-249 разного возраста на средах с добавлением ИУК

Зависимость ростовых процессов L. edodes F-249 от присутствия ДАФС-25 в среде культивирования

Изучение эффектов селена в органической форме позволило выявить еще один значимый фактор в отношении роста и развития L. edodes. Достаточно широко изучено влияние солей селена на рост ряда грибных культур и аккумуляцию этого микроэлемента в мицелии. В то же время, практически не исследованным остается влияние на грибы селенорганических соединений. В качестве источника селена целесообразно использовать органическое соединение, низкая токсичность физиологических концентраций в сочетании с высокой эффективностью которого доказана ранее в отношении живых организмов. В нашей работе мы рассмотрели влияние на L. edodes F-249 1,5-дифенил-3-селенпентадиона-1,5 (диацетофенонилселенид, препарат ДАФС-25). Данный препарат является одним из немногочисленных селенорганических соединений, внедренных в практику, и используется в

сельском хозяйстве в качестве кормовой добавки.

Изучена зависимость ростовых характеристик L. edodes от присутствия в жидких и агаризованных средах ДАФС-25. Исследование ДАФС в диапазоне концентраций от 0,1 мкМ до 1 мМ показало, что 0,1-1 мМ препарата угнетают рост гриба на сусло-агаре и агаризованной синтетической глюкозо-аспарагиновой среде, тогда как более низкие концентрации (0,1-1 мкМ) стимулируют мицелиальный рост (рис. 12).

£ 30 а>

§ 25

£ 20

■8- 15

О

° 10

'I 5 ш

° 0 и о а

0,0

3 5 7 10 12 14 17 21 3 7 10 14 17 21 25 28 —

Возраст, сут Возраст, сут

а б

Рис. 12. Значения ростовых показателей L edodes F-249 на синтетических средах с ДАФС-25: а - твердофазное культивирование, б - глубинное культивирование. 1 - гонтроль, 2 - 10"7 М ДАФС-25, 3 - 10* М ДАФС-25, 4 -10"5 М ДАФС-25, 5 -104 М ДАФС-25, 6 -10"3 М ДАФС-25

Стимулирующее действие селенорганического соединения проявилось в первую очередь в заметном увеличении плотности грибных колоний. Аналогичная картина наблюдалась и при жидкофазном культивировании: 0,1-1 мМ ДАФС-25 подавляли рост гриба, 0,1-1 мкМ оказывали положительное воздействие.

В присутствии 0,1-1 мМ ДАФС при культивировании L. edodes на жидкой среде наблюдалось красное или красновато-оранжевое окрашивание мицелия (рис. 13), интенсивность которого зависела от концентрации препарата и сохранялась в течение длительного периода культивирования (до 90 сут). Согласно литературным данным, такое окрашивание характерно для бактерий, водорослей и грибов, растущих на селенсодержащих средах, и указывает на накопление культурой элементного селена. В то же время на плотных средах с высокими концентрациями ДАФС-25 красного окрашивания мицелия не наблюдалось.

Возможные пути метаболизма ДАФС-25 культурой L. edodes F-249

Определение химических форм селена в организмах, относящихся к различным таксономическим группам, является актуальной областью исследований. В ряде стран с целью устранения дефицита селена практикуется получение сельскохозяйственных растений и промышленных микроорганизмов с повышенным содержанием этого микроэлемента. Съедобные грибы являются очень благоприятным объектом для этого в связи с их способностью аккумулировать селен. В последние годы появилось достаточно большое число исследований, посвященных изучению химического состава грибов, выращенных на средах с неорганическими соединениями селена - селенатами и селенитами. Установлено,

Рис. 13. Красное окрашивание мицелия L. edodes F-249 на средах с ДАФС-25. Слева направо: контроль, 0,001, 0,1 и 1 мМ ДАФС-25 (14 сут)

что селен содержится в грибах преимущественно в форме высоко биодоступных и малотоксичных органических соединений - селенсодержащих аминокислот, как свободных, так и входящих в состав белков. В то же время метаболические пути органических форм селена в грибах остаются практически не исследованными. В ходе нашей работы мы впервые изучили метаболизм селенорганического соединения ДАФС-25 у базидиомицетов на примере L. edodes.

Методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием на полярной колонке исследовали состав КЖ глубинного выращивания шиитаке и их гексановых экстрактов. В образцах с добавлением органического селена был обнаружен ацетофенон, происхождение которого может быть связано только с деструкцией ДАФС-25.

Другим продуктом разложения селенорганического препарата может быть элементный селен. Как было указано выше, для мицелия, росшего на средах с 0,1-1 мМ ДАФС-25, оказалось характерно красное окрашивания мицелия, что является признаком накопления Se0. Первоначальное детектирование элементного селена в культуральной жидкости и клетках гриба проводили с помощью качественной специфической реакции с метиленовым голубым, позволяющей определять неорганические соединения селена. Дальнейшее исследование соединений, синтезируемых грибом при его культивировании в присутствии ДАФС-25, а также взятых для сравнения селенита и селената натрия, осуществляли методом рентгеновской флуоресценции. Результаты анализа показали наличие селена во всех образцах, при этом его количество различалось для разных селенсодержащих соединений и зависело от концентрации селена в исходной среде. Максимальное содержание селена в мицелии выявлено на среде с ДАФС-25, тогда как мицелий, выращенный с 10"3 М селената натрия, не приобрел красного окрашивания и содержал селен лишь в следовых количествах.

Для подтверждения того, что селен содержится в мицелии именно в элементном состоянии (нулевой степени окисления) провели рентгенофазовый анализ гиф L. edodes F-249, выращенных с соединениями селена. При выращивании гриба в присутствии 1 мМ препарата в мицелии выявлена фаза, изоструктурная ДАФС-25. В этом же образце был выявлен элементный селен.

Согласно литературным данным, основным селенсодержащим компонентом выращенного на среде с солями селена L. edodes является аминокислота селенометионин [Ogra et al., 2004]. Мы исследовали культуральные жидкости и экстракты из мицелия L. edodes, выращенного при добавлении 0,1 мкМ, 0,1 мМ и 1 мМ ДАФС-25 к среде, методом ТСХ с использованием в качестве стандартов коммерческих препаратов селенометионина, селеноцистеина и селенометилцистина. Ни одной из этих аминокислот не удалось обнаружить указанным методом ни в мицелиальных экстрактах, ни в КЖ. Это позволяет заключить, что основным продуктом деструкции ДАФС-25 культурой L. edodes F-249 является элементный селен. Поскольку накопление элементного селена в мицелии коррелирует с повышением уровня ДАФС-25 а среде, можно предположить, что разложение ДАФС-25 с образованием Se° служит у L. edodes для снижения токсического действия высоких концентраций соединения, что характерно для многих микроорганизмов.

Электронная микроскопия образцов окрашенного мицелия показала наличие наноразмерных частиц элементного селена, диаметр которых колебался в пределах 140-320 нм (рис. 14).

У синтезированных химическим путем наночастиц селена обнаружены противоопухолевые и антиоксидантные свойства. Это делает их очень перспективным объектом для изучения, и в последние годы все большее внимание уделяется исследованиям, посвященным биотехнологическому получению таких частиц при помощи микроорганизмов. Биосинтез селеновых

Рис. 14. Гифы /_. edodes Я-249 (увеличение х4000): а - при культивировании на среде с 0,3 мМ ДАФС-25, б - контроль

наночастиц при помощи культуры съедобного высшего гриба приобретает особую актуальность в связи с простотой, доступностью и экологической безопасностью этого метода.

Во всех известных нам работах для получения наночастиц селена при помощи микроорганизмов используют неорганические соединения Se. Мы сравнили появление окрашивания при культивировании шиитаке на средах с 0,3 мМ ДАФС-25, селенита и селената натрия. Красное окрашивание наблюдалось на средах с добавлением ДАФС-25 и селенита натрия, однако сроки его появления сильно различалась. На среде, содержащей 0,3 мМ ДАФС-25, мицелий становился красноватым уже через 3 ч, а через 1 сут был полностью окрашен. В то же время на среде с Na2Se03 культура начинала приобретать красноватое окрашивание лишь после 7 сут роста, а интенсивного оранжево-красного цвета мицелий стал к 10 сут выращивания. 0,3 мМ Na2SeC>4 не вызывали изменения цвета мицелия. Таким образом, применение ДАФС-25 для получения наночастиц селена обладает существенным преимуществом по сравнению с использованием селенита натрия, поскольку позволяет значительно сократить время образования наночастиц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивируемый гриб-ксилотроф, сочетающий высокую практическую значимость и явно недостаточно изученные физиолого-биохимические особенности, базидиомицет Lentinus edodes (шиитаке), представляет особый интерес в качестве объекта исследований в ряду микокультур. Почвенным азотфиксирующим бактериям рода Azospirillum уделяется пристальное внимание как микроорганизмам, потенциально способным активно влиять на рост и развитие сельскохозяйственных культур. Свойство, позволяющее рассматривать бактерии рода Azospirillum как стимуляторы роста растений, связано в том числе со способностью этих микроорганизмов образовывать вещества фитогормональной природы.

Борьба с посторонней микрофлорой у шиитаке протекает значительно успешнее в двойной культуре с азоспириллами по сравнению с монокультурой гриба, как это показано впервые в настоящей работе. При этом не наблюдается повышения уровня индолилуксусной кислоты в смешанной культуре и, казалось бы, следует предположить, что фитогормон не участвует в мобилизации защитных сил высшего гриба против патогенов. Однако в сосуществовании феноменов подавления контаминирующей микрофлоры и отсутствия заметных изменений уровня ИУК в системе шиитаке-азоспирилла нет противоречия. Для растений, например, ситуация складывается следующим образом [Яруллина, 2006]. При грибном патогенезе фитопатогены индуцируют повышение содержания ИУК, что, в свою очередь, приводит к снижению интенсивности окисления фенолов и подавлению защитного ответа растения. Возможным механизмом, объясняющим это явление, служит способность фитогормона ингибировать активность некоторых защитных окислительных ферментов. Это ингибирование сыграло бы отрицательную для L. edodes роль в борьбе с посторонней микрофлорой, и не наблюдается в смешанной культуре L. edodes - Azospirillum, где биомасса мицелия в то же время накапливается значительно быстрее. Вышесказанное послужило предпосылкой использования двойной культуры съедобных грибов с этими бактериями в качестве посевного материала с высокими защитными свойствами благодаря увеличенной скорости освоения мицелием плотного питательного субстрата (в нашей лаборатории получен патент РФ [Никитина, 2005]).

Изучение процессов фитогормональной регуляции у высших грибов - фундаментальная проблема микологии, разработка которой находится на самой начальной стадии, в то же время имеет важный биотехнологический аспект. Свойства соединений фитогормональной природы, характеризующиеся высокой степенью изученности у высших растений и интенсивно исследуемые у почвенных ассоциативных микроорганизмов, лишь в несистематическом порядке и на явно недостаточном уровне описаны у макробазидиальных грибов. Ростостимулирующие и защитные функции синтезируемых грибами веществ фитогормональной природы находятся на начальных этапах исследования.

Изменения баланса фитогормонов относят к числу общих (неспецифических) реакций, включенных в процесс формирования устойчивости растительных организмов к

неблагоприятным абиотическим факторам [Тарчевский, 2001; Шакирова, 2001; Чиркова, 2002J. При этом фитогормоны, являясь важными компонентами регуляторной системы, могут играть ключевую роль не только в ростовых и морфогенетических процессах, но и в адаптивных реакциях, связанных с воздействием неблагоприятных факторов [Таланова, 2009 и ссылки там же]. Фитогормоны, наряду с генетической системой, играют ключевую роль в защитно-приспособительных реакциях растений на действие неблагоприятных факторов абиотической природы.

Литературные данные по этой проблеме касаются прежде всего стрессовых гормонов, абсцизовой кислоты (АБК) и этилена, способных действовать как регуляторы, определяя ответ растительных клеток на неблагоприятные воздействия. Недостаточно внимания уделяется участию фитогормонов группы ауксинов, предшественников и производных ИУК, в жизнедеятельности высших культивируемых грибов, в том числе в период действия неблагоприятных факторов.

Казалось бы, усиление биосинтеза ИУК, сопровождаемое снижением интенсивности окисления фенолов, должно отрицательно сказываться и на формировании защитной морфологической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки, пигментированной как раз продуктами окислительной полимеризации фенольных соединений. Каков тогда биологический смысл продукции ИУК после завершения стадии активного роста мицелия L. edodes? На основании обнаруженных в нашей лаборатории физико-химических свойств и реакционной способности внеклеточных пектинов шиитаке, выявленных аспектах их физиолого-биохимической роли, участия в морфогенетическом развитии становится очевидной способность лектина L2 легко связывать органические соединения с образованием достаточно устойчивых комплексов, и в то же время это связывание обратимо. Одним из таких органических соединений является ИУК, взаимодействующая с очищенными препаратами лектинов с результирующим повышением активности лектинов почти на 2 порядка [Цивилева, 2008]. Формирование коричневой мицелиальной пленки сопровождается увеличением лектиновой активности, этому способствует ИУК, которая к тому же в связанной с внеклеточными лектинами L. edodes форме в гораздо меньшей степени способна к ингибированию ферментов, ответственными за окисление фенольных субстратов.

Основные известные пути биосинтеза ИУК связаны с триптофаном. Путь, независимый от триптофана, встречается у растений, а среди бактерий обнаружен у азоспирилл и цианобактерий. К настоящему времени превалирует мнение, что вклад трипофан-независимого пути в биосинтез ИУК незначителен, сам механизм этого пути биосинтеза ауксинов не изучен. И все-таки мнения исследователей разделились. Так, хотя предшествующие работы доказывают существование индолацетамидного пути у Azospiríllum brasilense [Prinsen et al., 1993], приводят биохимические и генетические обоснования использования азоспириллами также пути через ИПВК [Bar and Окоп, 1995; Costacurta et al., 1994], и в то же время делают предположения о том, что 90% ИУК у Azospiríllum биосинтезируется по триптофан-независимому пути [Prinsen et al., 1993]. Пути биосинтеза ИУК у макробазидиомицетов вообще рассматривались в лучшем случае только на уровне положительного/отрицательного влияния добавок триптофана к среде выращивания. Поэтому выявленная и количественно охарактеризованная в настоящей работе продукция целого спектра индольных соединений культурой гриба шиитаке, - как предшественников ИУК, так и продуктов их окисления - представляется важным шагом в плане изучения гормональной регуляции у представителей царства грибов.

Известно, что ИУК является участником разнообразных взаимодействий экологического характера: межвидовых, внутривидовых и обусловленных хозяйственной деятельностью человека. Однако при этом не изучена биологическая активность ИУК в низких концентрациях, окончательно не определен молекулярный механизм фитогормонального действия ИУК, нет объяснения двухфазности воздействия гетероауксина. Известно, что физиологическая активность ауксинов в растениях проявляется при очень низких концентрациях - растяжение растительных клеток происходит под воздействием 0,1 нмоль/л ИУК. Для исследования действия индолил-3-уксусной кислоты на грибную культуру мы взяли ИУК в широком интервале концентраций (10"' - 10~8 г/л). М, (ИУК) = 174, поэтому самые низкие изученные концентрации были примерно на порядок ниже наномолярных и

соответствовали вышеуказанным литературным данным по физиологически активным концентрационным величинам. В результате в обнаруженных нами разнонаправленных эффектах экзогенной ИУК получило дополнительную иллюстрацию вышеописанное действие малых доз фитогормона. Действительно, так же, как и в работе [Рогачева, 2008], своего рода точкой смены «знака» биологического действия ИУК стала концентрация 5,7-10" моль/л (1,0-10"* г/л). Кроме того, при использовании ИУК в концентрации порядка 10'9 моль/л (1,75-Ю7 г/л), способствующей, по данным вышеуказанной работы, более эффективному взаимодействию ауксина с мембраной или рецептором, мы наблюдали абсолютные максимумы в соответствующей серии экспериментов (продукция ИУК и антранилата).

Имеющиеся в литературе единичные сведения о пути биотрансформации грибами неорганических солей, в которых селен входит в состав аниона, с выделением элементного Se, привели нас к изучению эффекта селенорганического вещества ДАФС-25 в культуре шиитаке. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что селенсодержащий препарат ДАФС-25 оказывает заметное действие на процессы жизнедеятельности L, edodes, выраженное в изменении ростовых параметров культуры как на жидких, так и на агаризованных средах. Селеновая добавка в наибольшей степени стимулирует рост шиитаке на синтетической агаризованной среде, характеризующейся низкими значениями ростовых показателей в отсутствие ДАФС-25. "При начальных концентрациях диацетофенонилселенида в питательной жидкой среде не ниже 10" - 10 моль/л наблюдается появление красной пигментации мицелия, интенсивность и период возникновения которой зависят от концентрации ДАФС-25. Впервые мы сделали вывод о способности глубинной культуры L edodes к деструкции ксенобиотика селенорганической природы с образованием элементного селена красной модификации. В ходе дальнейших исследований предстоит количественная физико-химическая характеристика мультикомпонентной системы, создаваемой в процессе метаболизма соединения ДАФС-25 культурой гриба.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что совместное культивирование базидиомицета ¿.елй'лоз edodes бактериями АговртНит ЬгааНепзе приводит к стимуляции мицелиального роста, снижению биотического влияния на шиитаке посторонней микрофлоры, усиленному накоплению в мицелии маннита как биохимического предшественника плодоношения.

2. Впервые обнаружена и количественно охарактеризована способность и edodes к биосинтезу фитогормона ИУК и промежуточных соединений этого синтеза, а также влияние шести индольных соединений при экзогенном введении в среду на рост, развитие и уровень их продукции культурой. Получены экспериментальные доказательства сосуществования двух альтернативных путей биосинтеза ИУК у I.. edodes: триптофан-зависимого (в основном через триптамин) и триптофан-независимого, реализуемого в присутствии экзогенного индола в интервале концентраций 1-10"3 - 1-Ю"4 г/л, а также при индуцировании биосинтеза ИУК ее экзогенными микродобавками.

3. Установлено положительное влияние экзогенной ИУК в интервале концентраций 1-10" - 1-Ю"4 г/л на накопление биомассы I. edodes при минимальной ингибирующей рост концентрации фитогормона около 5-Ю"4 г/л. Обнаружено, что среди изученных соединений -предшественников ИУК только индолил-3-ацетамид в концентрации порядка 10^ г/л в культуральной жидкости и edodes оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на формирование морфологической структуры шиитаке - коричневой мицелиальной пленки.

4. Впервые изучено влияние селенорганического ксенобиотика ДАФС-25 на рост и развитие шиитаке при различных условиях культивирования. На средах с начальными концентрациями ДАФС-25 1-Ю"4 - 1-Ю"3 моль/л наблюдали выделение свободного селена и ацетофенона, а в интервале концентраций 1-10"т - 1-10"® моль/л - стимуляцию роста мицелия, зависящую от среды выращивания.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях

1. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и пектиновую активность Lentínus edodes II Биотехнология. - 2005. - № 2. - С. 56-62.

2. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г., Шелудько A.B. Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentínus edodes при совместном культивировании с бактериями рода Azospiríllum И Вестник СГАУ. 2006. - № 6, вып. 2. - С. 24-26.

3. Степанова Л.В., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В., Тюрюкина Е.В. Гемагглютинирующая активность некоторых базидиальных ксилотрофов на стадии дикариотического мицелия II Микол. и фитопатол. - 2006. - Т. 40, вып. 4. - С. 307-313.

4. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Никитина В.Е. Фитогормон ß-индолил-З-уксусная кислота в искусственной культуре базидиомицетов // Вестник КазНУ. Серия биологическая. -2010. - № 3 (45). - С. 218-220.

5. Цивилева О.М., Учаева И.М., Андреев К.В., Лощинина Е.А., Панкратов А.Н., Дербенева В.В., Никитина В.Е. Биосинтез компонентов микробного фактора автолиза клеток в присутствии триптофана при глубинном культивировании базидиомиицета Lentínus edodes II Иммунопатология, аллергол., инфектол. - 2010. - Вып. 1. - С. 270-271.

6. Панкратов А.Н., Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Макаров O.E., Юрасов H.A., Никитина В.Е. Выявление участия индола в ростовых и метаболических процессах мицелиального гриба // Известия Саратовского университета. Новая серия. - 2011. - Т. 11. - Серия: Химия. Биология. Экология. Вып. 2.

Статьи в сборниках научных трудов

1. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на морфолого-культуральные характеристики съедобного гриба шиитаке II «Вавиловские чтения - 2004»: Материалы Всероссийской научно-практической конф., поев. 117-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 24-26 ноября 2004. Секция физиологии и защиты растений. - Саратов: Изд-во СГАУ, 2004. - С. 36-39.

2. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Лощинина Е.А. Поиск группослецифичных лектинов грибного происхождения II Успехи медицинской микологии. Том V / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. - М.: Национальная академия микологии, 2005. - С. 201-205.

3. Никитина В.Е-, Цивилева О.М., Ветчинкина Е.П., Лощинина Е.А., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л. Анализ белковых спектров и лектинов базидиомицета Lentínus edodes II Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Материалы Межд. науч. конф., 1-2 июня 2006 г. Минск-Раков. -Мн.: ОДО «НоваПринт», 2006. - С. 32-34.

4. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А. Взаимоотношения ксилотрофных базидиомицетов и почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospiríllum // Успехи медицинской микологии. Том VII / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. -М.: Национальная академия микологии, 2006. - С. 293-294.

5. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А. Биохимические особенности развития мицелия Lentunus edodes в совместной культуре с диазотрофными бактериями Azospiríllum brasilense И Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. -М.: Национальная академия микологии, 2007. - С. 9-12.

6. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Никитина В.Е.., Панкратов А.Н. Жирные кислоты мицелия на разных стадиях морфогенетического развития Lentínus edodes II Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. - Саратов: Изд-во «Научная книга», 2007. - С. 116-118.

7. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E. Экспериментальные предпосылки отнесения пути биосинтеза фитогормона ИУК базидиомицетом Lentinus edodes к триптофанзависимому типу // «Вавиловские чтения - 2007»: Материалы межд. научно-практ. конф., поев. 120-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 27-30 ноября 2007. Т. 1. - Саратов: Изд-во СГАУ, 2007. - С. 37-38.

8. Лощинина Е.А., Цивилева О.М, Никитина В.Е. Физиолого-биохимические процессы в двойной культуре ксилотрофа Lentinus edodes с почвенными бактериями Azospiríllum brasllense I! Проблемы биозкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): материалы Междунар. науч. конф., Саранск, 15-18 мая 2008 г. / редкол.: A.C. Лукаткин (отв. ред.) [и др.]. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2008. - С. 398-399.

9. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E. Выявление соединений-предшественников при триптофанзависимом биосинтезе индолилуксусной кислоты грибом Lentinus edodes (шииитаке) II «Вавиловские чтения - 2008»: Материалы межд. научно-практ. конф. Саратов, 26-27 ноября 2008. Ч. 1. - Саратов: ИЦ «Наука», 2008. - С. 30-32.

10. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E. Влияние соединений индольной природы на биосинтез индолил-3-уксусной кислоты ксилотрофным базидиомицетом Lentinus edodes II Вавиловские чтения - 2009: Материалы Межд. науч-практ. конф. Саратов, 25-26 ноября 2009. Ч. 1. - Саратов: ООО Издательство «КУБиК», 2009. -С. 47-49.

11. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Щерба В.В., Пучкова ТА, Никитина

B.Е. Биосинтез биологически активных производных индола ксилотрофным базидиомицетом // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Материалы VII Межд. конф. (Минск, 31 мая - 4 июня 2010 г.). - Минск: «Беларуская навука», 2010.-С. 174-176.

12. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Юрасов H.A., Панкратов А.Н., Штыков

C.Н., Никитина В.Е. Индуцированная окислительным стрессом продукция производных 5-гидрокси-индолил-3- и фенольных соединений в культуре высшего гриба II Материалы VIII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 4-6 октября 2010. - М.: РУДН, 2010.-С. 503-505.

13. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров O.E., Никитина В.Е. Эффект низких концентраций синтетического аналога ауксина в развитии мицелия ценного высшего культивируемого гриба // Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у культивируемых растений: Материалы докладов Всероссийского симпозиума с международным участием. - Саратов: Издательство «Саратовский источник» (ФГУН «Российская книжная палата» г. Москва), 2010. - С. 98-100.

14. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Ветчинкинз Е.П., Никитина В.Е. Влияние селенсодержащего соединения ДАФС-25 на рост ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes и накопление элементарного селена грибной культурой II Вавиловские чтения - 2010: Материалы Межд- науч.-практ. конф. в 3 томах - Саратов: Изд-во «КУБиК», 2010. - Т. 1. - С. 225.

Материалы конференций

1. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А. Лектиновая активность и ростовые характеристики Lentinus edodes в присутствии селенсодержащего препарата ДАФС-25 II Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России: Москва, 13-15 октября 2004 г. / Под ред. Р.Г. Василова - М.: МАКС Пресс, 2004. - С. 73-74.

2. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Лощинина Е.А.. Влияние некоторых низкомолекулярных соединений на лектиновую активность и морфогенез базидиомицета Lentinus edodes И Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Материалы Всероссийской конференции. Саратов, 15-17 июня 2005 г. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 38.

3. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г. Совместное культивирование гриба Lentinus edodes и бактерий рода Azospiríllum П Биология -

наука XXI века: 10-я Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 апреля 2006 года). Сборник тезисов. - Пущино: Изд-во Пущинского научного центра РАИ, 2006. - С. 199.

4. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е. Рост базидиомицета Lentinus edodes в присутствии индолилуксусной кислоты различного происхождения // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы III межрегиональной конфер. мол. ученых. Саратов, 10-12 октября 2006 г. - Саратов: Научная книга, 2006. - С. 52.

5. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А. Влияние бактерий рода Azospiríllum на рост и развитие съедобных грибов Lentinus edodes Н Микробные технологии: Материалы Межд. науч. конф., поев. 140-летию со дня рожд. Д.К. Заболотного, 11-15 сент 2006 г. Одесса, Украина. - Одесса: Астропринт, 2006. - С 87.

6. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров O.E., Лощинина Е.А., Степанова Л.В. Изменение углеводного и жирнокислотного состава мицелия Lentinus edodes при совместном культивировании с ризосферными бактериями И Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева): Материалы международной научной конференции, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006 г. - М.: МАКС Пресс, 2006. - С. 42.

7. Серяпин В.О., Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Учаева И.М., Макаров O.E., Панкратов А.Н., Никитина В.Е. Ингибирование продукции внеклеточного триптофана в присутствии метилфосфоновой кислоты в культуре базидиомицета Lentinus edodes // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 14-я Пущинская межд. школа-конф. мол. ученых (Пущино, 19-23 апреля 2010 года). Сборник тезисов. Том 2. - Пущино, 2010. - С. 259.

8. Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Бурашникова М.М., Панкратов А.Н., Казаринов И.А., Древко Б.И., Никитина В.Е. Трансформация органической формы селена в культуре базидиомицета Lentinula edodes II Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее: Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011 г.: Материалы / Отв.ред. Нетрусов А.И., Колотилова H.H. - М.: МАКС Пресс, 2011. - С. 127.

Список сокращений, использованных в автореферате:

5-гидрокси-ИУК - 5-гидрокси-индолил-З-уксусная кислота, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ГЖХ - газожидкостная хроматография, ГХ-МС - газожидкостная хроматография с масс-селективным детектированием, ДАФС-25 - 1,5-дифенил-З-селенпентандион-1,5, ИААльд - индояил-3-ацетальдегид, ИААм - индолил-3-ацетамид, ИПВК - индолил-3-пировиноградная кислота, ИУК - (З-индолил-З-уксусная кислота, КЖ -культуральная жидкость, КМП - коричневая мицелиальная пленка, ТАм - триптамин, ТСХ -тонкослойная хроматография, ЭеМе1 - селенометионин, Тгр - триптофан.

Благодарности:

Диссертант выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией на период выполнения работы -к.х.н. Е.Е Федоров), лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (зав. лабораторией - д.б.н. В.В. Игнатов), лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН (зав. лабораторией - д.б.н. В.Е. Никитина), Института химии Саратовского государственного Университета им. Н,Г. Чернышевского.

Подписано к печати 21.10.2011 г. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Техно-Декор» 410012, г. Саратов, ул. Московская 160

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лощинина, Екатерина Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАЗВДИОМИЦЕТА^елГшмя ейойеБ

1.2. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ

1.2.1. Симбиотические отношения грибов и бактерий '

1.2.2. Влияние бактериальных культур на базидиомицеты при 21 совместном культивировании

1.3. ЗНАЧЕНИЕ ФИТОГОРМОНОВ ИНДОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ 24 В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

1.3.1. Характеристика ИУК и ее микробный синтез

1.3.2. Синтез ауксинов базидиальными грибами

1.3.3. Влияние экзогенной ИУК на базидиомицеты

1.4. РОЛЬ СЕЛЕНА В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

1.4.1. Химические свойства и значение селена в питании

1.4.2. Шляпочные грибы как накопители селена

1.4.3. Влияние экзогенного селена на развитие грибных культур

1.4.4. Характеристика селенсодержащего препарата ДАФС

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.3.1. Получение чистой мицелиальной культуры 57 и плодовых тел ЬепНпиБ ейойеБ

2.3.2. Получение двойной культуры Ь. ейойеБ и А. ЬгаБИепБе

2.3.3. Определение ростовых характеристик грибной культуры

2.3.4. Получение экстрактов из мицелия Ь. ес1ос1е

2.3.5. Идентификация и количественное определение индольных 60 соединений

2.3.6. Рентгенофлуоресцентное исследование

2.3.7. Хромато-масс-спектрометрическое исследование

2.3.8. Рентгенофазовый анализ

2.3.9. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.3.10. Тонкослойная хроматография

2.3.11. Определение гемагглютинирующей активности

2.3.12. Определение углеводного состава мицелия

2.3.13. Анализ жирнокислотного состава мицелия

2.2.14. Микроскопия образцов

2.2.15. Статистическая обработка результатов 68 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ/,. ес1ос1ез ¥-249 69 В ПРИСУТСТВИИ БАКТЕРИЙ А. ЬгаШепБе Бр

3.1.1. Влияние азоспирилл на рост и развитие Ь. ес1ос1е8 ¥

3.1.2. Значение двойной культуры в предотвращении заражения

Ь. edod.es Б-249 контаминирующими микроорганизмами

3.1.3. Характеристика биохимических показателей грибного мицелия 79 при совместном культивировании Ь. ейойеБ Бс А. ЬгаъИепБе Бр

3.2. ФИТОГОРМОН ИНДОЛИЛ-З-УКСУСНАЯ КИСЛОТА 88 В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ Ь. ЕЭСЮЕБ ¥

3.2.1. Влияние экзогенной ИУК и ее предшественников на рост и 88 развитие шиитаке

3.2.2. Биосинтез ИУК и ее предшественников культурой е^ог/ез1 Б

3.2.3. Индол, ИУК и защитно-приспособительные реакции

3.2.4. Определение возможных путей синтеза ИУК 115 культурой Ь. ¥

3.3. ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНОРГАНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДАФС-25 120 НА РОСТ И РАЗВИТИЕ/,, edodes ¥

3.3.1. Зависимость ростовых процессов/,, edodes ¥-249 от присутствия

ДАФС-25 в среде культивирования 3.3.2. Возможные пути метаболизма ДАФС-25 культурой

L. edodes F

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние внешних факторов бактериальной, индольной и селенорганической природы на рост и развитие ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes"

Актуальность проблемы

Одним из приоритетных направлений современной микробиологии и биохимии является расшифровка путей индуцирования биохимических процессов онтогенетического развития грибов. Происходящие при росте и развитии грибного организма сложные физиологические и биохимические процессы, их интенсивность во многом определяются факторами внешней среды, которые требуют детального изучения.

Среди культивируемых базидиомицетов Lentinus edodes (шиитаке) безусловно относится к числу наиболее перспективных объектов. Этот гриб занимает второе место в мире по объему промышленного производства и обладает ценными питательными и целебными свойствами [Wasser and Weis, 1999; Zaidman et al, 2005; Hearst et al, 2009; De Roman, 2010; Shen et al, 2011]. Большое значение имеет вопрос о возможной оптимизации искусственного выращивания этой культуры. Внедрение биологических способов стимуляции роста мицелия и защиты его от посторонней микрофлоры позволило бы улучшить технологию выращивания, сократив время культивирования шиитаке и одновременно подавив рост контаминантов гриба. Повысить устойчивость гриба к негативным воздействиям окружающей среды можно, вероятно, за счет выращивания его совместно со стимулирующими рост микроорганизмами.

Бактерии рода Azospirillum, представители группы ризосферных бактерий, являются ассоциативными азотфиксаторами, стимулирующими рост и развитие растений посредством фиксации атмосферного азота и гормональной регуляции [Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan and de-Bashan, 2010; Fibach-Paldi et al, 2011]. Отмечается бактерицидная и фунгицидная активность азоспирилл [Red'kina, 1990; Милькова и др., 2003] и их лектинов [Никитина, 2001] в отношении некоторых бактерий и микроскопических грибов. Сведения о совместном культивировании базидиомицетов с бактериями рода Azospirillum в искусственных условиях в литературе отсутствуют. Можно было надеяться, что в двойной культуре шиитаке с азоспириллами проявятся ростостимулирующие свойства этих бактерий, будет иметь место усиленная продукция соединений различной природы, способствующих росту мицелия. К числу таких ростостимулирующих веществ относятся фитогормоны.

Роль растительных гормонов в морфообразовании высших грибов-ксилотрофов практически не исследована, хотя в литературе встречаются предположения о том, что фитогормонам принадлежит важное место в дифференциации грибной культуры, и что процесс морфогенеза тесно связан с динамикой уровня эндогенных регуляторов роста, в том числе основного фитогормона класса ауксинов — индолилуксусной кислоты (ИУК). Согласно литературным данным, фитогормоны, в том числе ИУК, в определенных, значительно различающихся для разных видов концентрациях могут оказывать положительное влияние на прорастание спор, рост вегетативного мицелия и образование плодовых тел базидиомицетов [McMeekin, 2000; Isikhuemhen and Vaugnas-Ward, 2005; Mukhopadhyay et ah, 2005]. Крайне немногочисленны сведения об обнаружении ИУК и исследовании путей ее биосинтеза у ксилотрофных базидиомицетов. Сообщения об изучении синтеза индолилуксусной кислоты ксилотрофом Lentinus edodes в доступной нам литературе отсутствуют.

Большое значение для нормальной жизнедеятельности организмов имеет обеспечение необходимыми микроэлементами. Селен — эссенциальный микроэлемент для большинства живых организмов, влияющий на функциональное состояние клетки и метаболические процессы [Барабой и Шестакова, 2004; Reilly, 2006]. Экспериментальные исследования показали, что различные селеновые соединения в разных концентрациях селективно влияют на развитие, скорость роста грибов и продукцию биоактивных компонентов, либо подавляя, либо стимулируя эти процессы.

Значительное количество работ посвящено исследованию действия неорганических форм селена на биохимический состав грибов [Ogra et al., 2004; Zhao et al., 2004b; Muñoz et al., 2006; Falandysz, 2008]. В то же время влияние на грибные культуры органических соединений селена и метаболические пути утилизации этих веществ остаются практически не изученными.

В последние годы в связи с наблюдающимся в ряде регионов дефицитом Se в рационе людей и животных все больше развивается производство различных селен-обогащенных продуктов как с помощью добавления селена в готовые пищевые продукты, так и путем выращивания различных сельскохозяйственных культур на обогащенных селеном средах [Combs, 2001; Whanger, 2002]. Многие виды макромицетов обладают способностью к аккумуляции селена в очень высоких концентрациях [Голубкина и др., 2000; Borovicka and Randa, 2007; Falandysz, 2008]. Поэтому исследование метаболизма селена у базидиомицетов не только имеет большое фундаментальное значение, но и может получить практическое применение для биологического синтеза низкотоксичных органических селеновых соединений (селенопротеинов и селеновых аминокислот) [Ogra et al., 2004; Du et al., 2007]. Перспективным направлением является также получение наночастиц элементного селена с помощью грибного мицелия [Sastry et al., 2003; Narayanan and Sakthivel, 2010; Popescu et al., 2010; Musarrat et al, 2011].

Все это обусловливает необходимость изучения индольных и селенорганических соединений, а также совместного культивирования с бактериями в связи с процессами цитодифференцировки и морфообразования грибов, выявления роли этих факторов в жизнедеятельности грибных культур. Представляло интерес сравнить действие этих разных по природе факторов между собой. Такого рода исследования могли бы быть полезны для целенаправленного отбора эффективных индукторов, повышающих стресс-устойчивость съедобных культивируемых грибов, как это имеет место у растений [Dat et al, 1998].

Важность изучения и разнообразие эффектов биотических и абиотических факторов в онтогенезе базидиомицетов, а также разностороннее значение гриба шиитаке, ко времени начала наших исследований явно не согласовывались с недостатком сведений о роли индольных соединений и путей их трансформации, селенсодержащих органических соединений в жизнедеятельности высших грибов. Не изучалась двойная культура базидиомицета Lentinus edodes с бактериями вообще, и в частности с известными продуцентами фитогормона индольной природы - почвенными ассоциативными бактериями рода Azospirillum. На основании вышеизложенного нами было предпринято настоящее исследование.

Цель данной работы - исследование совместного культивирования ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing, с бактериями Azospirillum brasilense и выявление роли индольных и селенсодержащих соединений, характеристик их биосинтеза и путей трансформации у грибной культуры.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать условия совместного культивирования/,, edodes F-249 и А. brasilense Sp7.

2. Изучить влияние азоспирилл на рост, морфологические и биохимические особенности L. edodes F-249.

3. Исследовать воздействие экзогенной ИУК и предшественников ее биосинтеза на рост и развитие L. edodes F-249.

4. Выявить способность L. edodes F-249 к синтезу ИУК под влиянием различных индольных соединений.

5. Установить пути биосинтеза ИУК изучаемой культурой L. edodes F-249 при выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенных синтетических аналогов соединений - предшественников ИУК.

6. Изучить влияние органического селенсодержащего соединения (ДАФС-25) на рост Ь. ес1ос1е5 Б-249 на жидких и твердых средах разного состава.

7. Определить возможные пути метаболизма селенорганического ксенобиотика ДАФС-25 у шиитаке.

Научная новизна работы

Впервые была экспериментально подтверждена возможность, подобраны условия и показана эффективность совместного глубинного культивирования базидиомицета ЬепПпиБ ес1ос1е$ с бактериями АгоярЬгШит ЪгаяИепзе и получения посевного мицелия на основе промежуточной совместной культуры. Выявлены положительные эффекты совместного культивирования шиитаке и азоспирилл. Обнаружено снижение биотического влияния посторонней микрофлоры на мицелий шиитаке в условиях двойной культуры с А. ЬгаБйепяе 8р7, усиленное накопление маннита как биохимического предшественника подготовки к плодоношению, отсутствие увеличения лектиновой активности как один из показателей благоприятных условий роста шиитаке в присутствии азоспирилл.

Впервые обнаружена и количественно охарактеризована способность ксилотрофного базидиального гриба Ь. edod.es к биосинтезу фитогормона ИУК и промежуточных соединений этого синтеза, а также влияние шести индольных соединений при экзогенном введении в среду на рост, морфогенез, уровень собственной продукции и конкурентные отношения триптофан-зависимого и независимого путей биосинтеза ИУК макробазидиомицетом.

Впервые выявлена индукция генеративной стадии развития шиитаке индольным производным. Установлено, что среди изученных соединений — предшественников ИУК только индолилацетамид в концентрации порядка 10~4 г/л в культуральной жидкости Ь. edodes оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на формирование морфологической структуры — коричневой мицелиальной пленки шиитаке.

Впервые выявлено накопление элементного селена в результате трансформации селенорганического соединения высшим грибом Lentinus edodes, обнаружена стимуляция роста и развития мицелия под действием этого соединения.

Практическая значимость исследования

Научные положения работы выявляют первоочередные задачи начальных этапов изучения смешанных культур высших грибов с симбиотическими ускоряющими рост растений бактериями, функциональной роли последних в жизнедеятельности грибных культур, в адаптационных и морфогенетических процессах, расширяют и углубляют современные представления о разнообразии функций природных соединений группы индола, о физиолого-биохимических механизмах регуляции их продукции базидиомицетами; позволяют с новых позиций подойти к изучению селенорганических веществ.

В работе выявлены реальные пути оптимизации процесса получения плодовых тел ценного высшего гриба. Обнаруженное положительное влияние таких факторов, как совместное выращивание с азоспириллами и присутствие селенорганического препарата ДАФС-25, на рост и развитие грибной культуры может быть использовано для совершенствования условий культивирования шиитаке.

Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе ИБФРМ РАН, Института химии СГУ, лаборатории экспериментальной микологии Института микробиологии HAH Беларуси.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бактерии Azospirillum brasilense в условиях совместной культуры с базидиомицетом Lentinus edodes стимулируют рост, усиливают конкурентоспособность посевного мицелия в отношении контаминирующей микрофлоры и вызывают изменения в углеводном, жирнокислотном и белковом составе мицелия.

2. Культура L. edodes F-249 синтезирует соединения индольной природы при росте в условиях погруженного культивирования. Состав группы экстраклеточных индольных соединений шиитаке зависит от условий глубинного культивирования и включает в разных соотношениях следующие компоненты: L-триптофан, р-индолил-3-уксусную кислоту, Р-индолил-3-ацетальдегид, [З-индолил-З-ацетамид, индолил-3-пировиноградную кислоту, триптамин, 5-гидрокси-(3-индолил-3-уксусную кислоту.

3. Путь биосинтеза ИУК изучаемой грибной культурой является триптофан-зависимым, однако происходит переключение на триптофан-независимый путь при выращивании ксилотрофа в присутствии экзогенного индола, а также при индуцировании биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты ее микродобавками.

4. Селенорганическое соединение ДАФС-25 является экзогенным регулятором роста и развития L. edodes. В качестве одного из путей метаболизма ДАФС-25 впервые выявлено выделение элементного селена в глубинной культуре высшего гриба.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в соответствии с плановой тематикой «Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия» (№ гос. регистрации 01970008158, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина); «Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200606184, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина); «Изучение гликопротеинов и биогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200904389, научный руководитель темы: д.б.н., проф. В.Е. Никитина).

Работа частично поддержана грантами РФФИ-БРФФИ (РФФИ и Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований; руководитель с российской стороны - д.б.н., проф. В.Е. Никитина): «Гликополимеры и углеводсвязывающие белки ксилотрофных базидиомицетов: функции и биологическая активность» № 06-04-81042-Бела (2006-2007 гг.); «Липофильные соединения мицелиальных грибов: образование, характеристика» № 08-08-90004-Бела (2008-2009 гг.); «Соединения фитогормональной природы в культуре базидиомицетов: биосинтез и физиологический эффект экзогенного воздействия» № 10-04-90021-Бела (2010-2011 гг.).

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на: Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 13—15 октября 2004); Всерос. научно-практ. конфер. «Вавиловские чтения — 2004» (Саратов, 24—26 ноября 2004); 3-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2005); 9-й Межд. Пущинской школе-конфер. мол. ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 18—22 апреля 2005); Всерос. конфер. «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 15-17 июня 2005); Int. Conf. "Biocatalysis-2005: Fundamentals&Applications" (St. Petersburg, 19-23 June, 2005); 4-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, 29—31 марта 2006); 10-й Пущинской школе-конфер. мол. ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 17—21 апреля 2006); Межд. науч. конфер. «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева)» (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006); Межд. науч. конфер. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 1-2 июня 2006); Межд. науч. конф. «Микробные технологии», поев. 140-летию со дня рожд. Д.К. Заболотного (Одесса, Украина, 11—15 сентября 2006); III межрегион, конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 10-12 октября 2006); 5-м Всерос. Конгрессе по Медицинской микологии (Москва, март 2007); VI Всерос. интерактивной конфер. мол. ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, июнь 2007); XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 1622 September 2007), Межд. научно-практ. конф., поев. 120-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова «Вавиловские чтения — 2007» (Саратов, 27-30 ноября 2007); Междунар. науч. конф. «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 15-18 мая 2008); Втором Съезде микологов России (Москва, 16-18 апреля 2008); IV межрегиональной конфер. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 14-16 октября 2008); Межд. научно-практ. конф. «Вавиловские чтения - 2008» (Саратов, 26—27 ноября 2008); II Всерос. с межд. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 25-29 мая 2009); «VII Межд. Симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 19-23 октября 2009); Межд. науч.-практ. конф. «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, 25—26 ноября 2009); 14-й Пущинской межд. школе-конф. мол. ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010); VII Межд. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 31 мая-4 июня 2010); V Всерос. конф. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сентября-1 октября 2010); VIII Межд. конф. «Биоантиоксидант» (Москва, 4-6 октября 2010); Всерос. симпозиуме с межд. участием, поев. 85-летию со дня рожд. В.А. Кумакова «Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у культивируемых растений»

Саратов, 13-15 октября 2010); Межд. конфер. «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология», поев. 100-летию со дня рожд. академика Т.Б. Дарканбаева (Алматы, Казахстан, 28-29 октября 2010); Межд. науч.-практ. конф. «Вавиловские чтения - 2010» (Саратов, 25-26 ноября 2010); Всерос. симпозиуме с межд. участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27—29 января 2011), а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ.

Личный вклад соискателя состоит в постановке и разработке путей выполнения всех основополагающих задач, решаемых в рамках диссертационной работы, ключевая роль на всех этапах исследования и интерпретации полученных результатов, участие в подготовке публикаций.

Физико-химические задачи работы выполнены совместно с лабораторией структурных методов исследования ИБФРМ РАН (зав. лабораторией — к.х.н. Е.Е Федоров. Прим.: даны актуальные на период выполнения работы сведения), с лабораторией биохимии ИБФРМ РАН (зав. лабораторией - д.б.н. В.В. Игнатов), Институтом химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых изданиях и 14 статей в сборниках научных трудов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 основных глав и ряда подглав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка использованных источников литературы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лощинина, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что совместное культивирование базидиомицета Lentinus edodes бактериями Azospirillum brasilense приводит к стимуляции мицелиального роста, снижению биотического влияния на шиитаке посторонней микрофлоры, усиленному накоплению в мицелии маннита как биохимического предшественника плодоношения.

2. Впервые обнаружена и количественно охарактеризована способность L. edodes к биосинтезу фитогормона ИУК и промежуточных соединений этого синтеза, а также влияние шести индольных соединений при экзогенном введении в среду на рост, развитие и уровень их продукции культурой. Получены экспериментальные доказательства сосуществования двух альтернативных путей биосинтеза ИУК у L. edodes: триптофан-зависимого (в основном через триптамин) и триптофан-независимого, реализуемого в присутствии экзогенного индола в интервале концентраций МО"3 — 1 -10"4 г/л, а также при индуцировании биосинтеза ИУК ее экзогенными микродобавками.

3. Установлено положительное влияние экзогенной ИУК в интервале концентрации МО"7 - МО"4 г/л на накопление биомассы L. edodes при минимальной ингибирующей рост концентрации фитогормона около 5-Ю"4 г/л. Обнаружено, что среди изученных соединений - предшественников ИУК только индолил-3-ацетамид в концентрации порядка 10"4 г/л в культуральной жидкости L. edodes оказывает ярко выраженное стимулирующее влияние на формирование морфологической структуры шиитаке — коричневой мицелиальной пленки.

4. Впервые изучено влияние селенорганического ксенобиотика ДАФС-25 на рост и развитие шиитаке при различных условиях культивирования. На средах с начальными концентрациями ДАФС-25 1-10"4 - МО"3 моль/л наблюдали выделение свободного селена и ацетофенона, а в интервале

7 6 концентраций 1-10" — 1-10" моль/л - стимуляцию роста мицелия, зависящую среды выращивания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивируемый гриб-ксилотроф, сочетающий высокую практическую значимость и явно недостаточно изученные физиолого-биохимические особенности, базидиомицет ЬепйпиБ ес1ос1ея (шиитаке), представляет особый интерес в качестве объекта исследований в ряду микокультур. Почвенным азотфиксирующим бактериям рода АгоБртИит уделяется пристальное внимание как микроорганизмам, потенциально способным активно влиять на рост и развитие сельскохозяйственных культур. Свойство, позволяющее рассматривать бактерии рода АгоБртИит как стимуляторы роста растений, связано в том числе со способностью этих микроорганизмов образовывать вещества фитогормональной природы.

Борьба с посторонней микрофлорой у шиитаке протекает значительно успешнее в двойной культуре с азоспириллами по сравнению с монокультурой гриба, как это показано впервые в настоящей работе. При этом не наблюдается повышения уровня индолилуксусной кислоты в смешанной культуре и, казалось бы, следует предположить, что фитогормон не участвует в мобилизации защитных сил высшего гриба против патогенов. Однако в сосуществовании феноменов подавления контаминирующей микрофлоры и отсутствия заметных изменений уровня ИУК в системе шиитаке-азоспирилла нет противоречия. Для растений, например, ситуация складывается следующим образом [Яруллина, 2006]. При грибном патогенезе фитопатогены индуцируют повышение содержания ИУК, что, в свою очередь, приводит к снижению интенсивности окисления фенолов и подавлению защитного ответа растения. Возможным механизмом, объясняющим это явление, служит способность фитогормона ингибировать активность некоторых защитных окислительных ферментов. Это ингибирование сыграло бы отрицательную для Ь. edod.es роль в борьбе с посторонней микрофлорой, и не наблюдается в смешанной культуре Ь. edodes — АгоБр'и-Шит, где биомасса мицелия в то же время накапливается значительно быстрее. Вышесказанное послужило предпосылкой использования двойной культуры съедобных грибов с этими бактериями в качестве посевного материала с высокими защитными свойствами благодаря увеличенной скорости освоения мицелием плотного питательного субстрата (в нашей лаборатории получен патент РФ [Никитина, 2005]).

Изучение процессов фитогормональной регуляции у высших грибов — фундаментальная проблема микологии, разработка которой находится на самой начальной стадии, в то же время имеет важный биотехнологический аспект. Свойства соединений фитогормональной природы, характеризующиеся высокой степенью изученности у высших растений и интенсивно исследуемые у почвенных ассоциативных микроорганизмов, лишь в несистематическом порядке и на явно недостаточном уровне описаны у макробазидиальных грибов. Ростостимулирующие и защитные функции синтезируемых грибами веществ фитогормональной природы находятся на начальных этапах, исследования.

Изменения баланса фитогормонов относят к числу общих (неспецифических) реакций, включенных в процесс формирования устойчивости растительных организмов к неблагоприятным абиотическим факторам [Тарчевский, 2001; Шакирова, 2001; Чиркова, 2002]. При этом фитогормоны, являясь важными компонентами регуляторной системы, могут играть ключевую роль не только в ростовых и морфогенетических процессах, но и в адаптивных реакциях, связанных с воздействием неблагоприятных факторов [Таланова, 2009 и ссылки там же]. Фитогормоны, наряду с генетической системой, играют ключевую роль в защитно-приспособительных реакциях растений на действие неблагоприятных факторов абиотической природы.

Литературные данные по этой проблеме касаются прежде всего стрессовых гормонов, абсцизовой кислоты (АБК) и этилена, способных действовать как регуляторы, определяя ответ растительных клеток на неблагоприятные воздействия. Недостаточно внимания уделяется участию фитогормонов группы ауксинов, предшественников и производных ИУК, в жизнедеятельности высших культивируемых грибов, в том числе в период действия неблагоприятных факторов.

Казалось бы, усиление биосинтеза ИУК, сопровождаемое снижением интенсивности окисления фенолов, должно отрицательно сказываться и на формировании защитной морфологической структуры шиитаке — коричневой мицелиальной пленки, пигментированной как раз продуктами окислительной полимеризации фенольных соединений. Каков тогда биологический смысл продукции ИУК после завершения стадии активного роста мицелия L. edodesl На основании обнаруженных в нашей лаборатории физико-химических свойств и реакционной способности внеклеточных лектинов шиитаке, выявленных аспектах их физиолого-биохимической роли, участия в морфогенетическом развитии становится очевидной способность лектина L2 легко связывать органические соединения с образованием достаточно устойчивых комплексов, и в то же время это связывание обратимо. Одним из таких органических соединений является ИУК, взаимодействующая с очищенными препаратами лектинов с результирующим повышением активности лектинов почти на 2 порядка [Цивилева, 2008]. Формирование коричневой мицелиальной пленки сопровождается увеличением лектиновой активности, этому способствует ИУК, которая к тому же в связанной с внеклеточными лектинами L. edodes форме в гораздо меньшей степени способна к ингибированию ферментов, ответственными за окисление фенольных субстратов.

Основные известные пути биосинтеза ИУК связаны с триптофаном. Путь, независимый от триптофана, встречается у растений, а среди бактерий обнаружен у азоспирилл и цианобактерий. К настоящему времени превалирует мнение, что вклад трипофан-независимого пути в биосинтез ИУК незначителен, сам механизм этого пути биосинтеза ауксинов не изучен. И все-таки мнения исследователей разделились. Так, хотя предшествующие работы доказывают существование индолацетамидного пути у Azospirillum brasilense [Prinsen et al., 1993], приводят биохимические и генетические обоснования использования азоспириллами также пути через ИПВК [Ваг and Окоп, 1995; Costacurta et al., 1994], и в то же время делают предположения о том, что 90% ИУК у Azospirillum биосинтезируется по триптофан-независимому пути [Prinsen et al., 1993]. Пути биосинтеза ИУК у макробазидиомицетов вообще рассматривались в лучшем случае только на уровне положительного/отрицательного влияния добавок триптофана к среде выращивания. Поэтому выявленная и количественно охарактеризованная в настоящей работе продукция целого спектра индольных соединений культурой гриба шиитаке, - как предшественников ИУК, так и продуктов их окисления — представляется важным шагом в плане изучения гормональной регуляции у представителей царства грибов.

Известно, что ИУК является участником разнообразных взаимодействий экологического характера: межвидовых, внутривидовых и обусловленных хозяйственной деятельностью человека. Однако при этом не изучена биологическая активность ИУК в низких концентрациях, окончательно не определен молекулярный механизм фитогормонального действия ИУК, нет объяснения двухфазности воздействия гетероауксина. Известно, что физиологическая активность ауксинов в растениях проявляется при очень низких концентрациях — растяжение растительных клеток происходит под воздействием 0,1 нмоль/л ИУК. Для исследования действия индолил-3-уксусной кислоты на грибную культуру мы взяли ИУК в широком интервале концентраций (10"1 - 10"8 г/л). Мг (ИУК) = 174, поэтому самые низкие изученные концентрации были примерно на порядок ниже наномолярных и соответствовали вышеуказанным литературным данным по физиологически активным концентрационным величинам. В результате в обнаруженных нами разнонаправленных эффектах экзогенной ИУК получило дополнительную иллюстрацию вышеописанное действие малых доз фитогормона.

Действительно, так же, как и в работе [Рогачева, 2008], своего рода точкой смены «знака» биологического действия ИУК стала концентрация 5,7-Ю"7 моль/л (1,0-Ю*4 г/л). Кроме того, при использовании ИУК в концентрации

Q Н порядка 10" моль/л (1,75-10" г/л), способствующей, по данным вышеуказанной работы, более эффективному взаимодействию ауксина с мембраной или рецептором, мы наблюдали абсолютные максимумы в соответствующей серии экспериментов (продукция ИУК и антранилата).

Имеющиеся в литературе единичные сведения о пути биотрансформации грибами неорганических солей, в которых селен входит в состав аниона, с выделением элементного Se, привели нас к изучению эффекта селенорганического вещества ДАФС-25 в культуре шиитаке. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что селенсодержащий препарат ДАФС-25 оказывает заметное действие на процессы жизнедеятельности L. edodes, выраженное в изменении ростовых параметров культуры как на жидких, так и на агаризованных средах. Селеновая добавка в наибольшей степени стимулирует рост шиитаке на синтетической агаризованной среде, характеризующейся низкими значениями ростовых показателей в отсутствие ДАФС-25. При начальных концентрациях диацетофенонилселенида в питательной жидкой среде не ниже 10"5 - 10"4 моль/л наблюдается появление красной пигментации мицелия, интенсивность и период возникновения которой зависят от концентрации ДАФС-25. Мы впервые сделали вывод о способности глубинной культуры L. edodes к деструкции ксенобиотика селенорганической природы с образованием элементного селена красной модификации. В ходе дальнейших исследований предстоит количественная физико-химическая характеристика мультикомпонентной системы, создаваемой в процессе метаболизма соединения ДАФС-25 культурой гриба.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лощинина, Екатерина Александровна, Саратов

1. Авцын А.П., Жаворонков A.A., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементозы человека. - М.: Медицина, 1991. — 496 с.

2. Алексеева С.А., Ермаков В.В. Селен в макромицетах Восточной Мещеры // Материалы 3-й Российской биогеохимической школы «Геохимическая экология и биогеохимическое изучение таксонов биосферы». — Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2000. С. 235-236.

3. Барабой В.А., Шестакова E.H. Селен: биологическая роль и антиоксидантная активность // Укр. 6ioxiM. журн. — 2004. — Т. 76, № 1. — С. 2331.

4. Бахарев В.Д., Бухарова М.А., Шостак В.И. О влиянии селена на световую чувствительность глаза // Физиологический журнал СССР. 1975. -Т. 61, № 1. - С. 150-152.

5. Беккер З.И. Физиология и биохимия грибов. — М.: Изд-во МГУ, 1988. — 227 с.

6. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших базидиальных грибов объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. — 1992. - Т. 26, вып. 4. - С. 321-324.

7. Беловежец Л.А., Волчатова И.В., Медведева С.А. Дереворазрушающие грибы как продуценты регуляторов роста растений // Микология и фитопатология. 2007. - Т. 41, вып. 5. - С. 436-441.

8. Белозерская Т.А., Гесслер H.H. Активные формы кислорода и стратегия антиоксидантной защиты у грибов (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 2007. - Т. 43, № 5. - С. 565-575.

9. Бисько H.A., Билай В.Т. Влияние бактерий рода Bacillus на жизнедеятельность вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr) Kumm. в частично замкнутой искусственной экосистеме // Микология и фитопатология. -1995. Т. 29, № 5-6. - С. 1-7.

10. Блинохватов А.Ф. О селене, которого нам не хватает // Химия и жизнь.- 1995. Т. 23, № 3. - С. 40-45.

11. Блохин Д.Ю. Локализация белковых зон в полиакриламидном геле методом серебряного окрашивания // Лабораторное дело. 1988. — № 8. — С. 3033.

12. Бухало A.C. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. — Киев: Наукова думка, 1988. — 144 с.

13. Ветчинкина Е.П. Анализ белкового состава, лектинов и фенолоксидаз в процессе морфообразования ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing. Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов: ООО «Интехника», 2008. 25 с.

14. Вощенко A.B., Иванов В.Н., Бондарев Г.И. Содержание селена в продуктах питания, рационах и сыворотке крови жителей эндемичного по болезни Кешана района // Вопросы питания. — 1989. № 1. — С. 65-66.

15. Гамбург К.З., Кулаева О.Н., Муромцев Г.С., Прусакова Л.Д., Чкаников Д.И. Регуляторы роста растений / Под ред. Г.С. Муромцева. — М.: Колос, 1979.- 246 с.

16. Гмошинский И.В., Мазо В.К. Селен в питании: краткий обзор // Med. Alt. 1999. - № 4. - С. 18-22.

17. Гмошинский И.В., Мазо В.К. Минеральные вещества в питании человека. Селен: всасывание и биодоступность // Вопросы питания. — 2006. — Т. 75, № 5. С. 15-21.

18. Гмошинский И.В., Мазо В.К., Тутельян В.А., Хотимченко С.А. Микроэлемент селен: роль в процессах жизнедеятельности // Экология моря. —2000. Вып. 54. - С. 5-19.

19. Голубкина H.A. Содержание Se в пшеничной и ржаной муке России, стран СНГ и Балтии // Вопросы питания. 1997. - № 3. - С. 17-20.

20. Голубкина H.A., Пигарова И.Ю., Жукова Е.Э. Специфика накопления селена грибами центрального региона России // Экология моря. 2000. - Вып. 54. - С. 75-82.

21. Голубкина H.A., Соколов Я.А., Хотимченко С.А., Тутельян В.А., Золотов П.А., Олежко-Ожевский Ю.П., Жминченко В.М., Аманова И.Ю., Мепеньзина O.JI. Селен-обогащенные дрожжи Saccharomyces cerevisiae // Биотехнология. -1996. № 5. — С. 52-56.

22. Голубкина H.A., Хотимченко С.А., Тутельян В.А. К вопросу обогащения пищевых продуктов селеном // Микроэлементы в медицине. — 2003.-Т. 4, вып. 4.-С. 1-5.

23. Денисова Г.В., Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. Влияние неорганического соединения селена на рост и плодоношение грибов // Сб. трудов науч. конф. спец. сельского хоз-ва. — Пенза, 1997. — С. 84-85.

24. Денисова Г.В., Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. Способ стимулирования роста посевного мицелия шампиньона. Пат. № 2136141 РФ. 1998.

25. Дорожкина А.Ф. Содержание селена в кормах Иссык-кульской котловины // Микроэлементы в животноводстве и растениеводстве. — Фрунзе: ИЛИМ, 1978. Вып. 17. - С. 70-75.

26. Древко Б.И., Древко Р.И., Антипов В.А., Чернуха Б.А., Яковлев А.Н. Средство для лечения и профилактики инфекционных заболеваний иотравлений животных и птиц, повышающее их продуктивность и сохранность // Пат. № 2171110 РФ. Бюлл. изобрет. 2001. № 21.

27. Ермаков В.В. Субрегионы и биогеохимические провинции СССР с различным содержанием селена // Тр. биогеохимической лаборатории. 1978. — Т. 15.-С. 54-57.

28. Ермаков В.В., Бронников И.С. Содержание селена в пастбищной растительности и кормах Улетовского района Читинской области // Записки Забайкальского отдела Всес. Географического общества. Чита, 1962. - Вып. 18.-С. 86-94.

29. Ермаков В.В., Ковальский В.В. Биологическое значение селена. М.: Наука, 1974.-300 с.

30. Живецкий A.B., Сучков Б.П. Содержание селена в крови здоровых лиц и больных со злокачественными новообразованиями по материалам в Черновицкой области // Микроэлементы в медицине: респ. межвед. сб. Киев, 1973.-Вып. 4.-С. 69-73.

31. Иванов А.И., Блинохватов А.Ф., Денисова Г.В., Ильин Д.Ю. Влияние соединений селена на рост и развитие грибов. II. Макромицеты // Микология и фитопатология. 2000. — Т. 34, вып. 5. — С. 46-50.

32. Иванов А.И., Блинохватов А.Ф. О роли базидиальных макромицетов в трансформации ультрамикроэлементов в экосистемах. I. Биоадсорбция селена // Микология и фитопатология. — 2003. Т. 37, вып. 1. - С. 70-75.

33. Кагина H.A., Хрянин В.Н., Иванов А.И. Влияние фотопериода и фитогормонов на рост и развитие Pleurotus cornucopiae (Paulet) Rolland // Микология и фитопатология. — 1993. — Т. 27, вып. 2. — С. 27-31.

34. Карелина JI.B. Содержание селена в некоторых растениях. // Микроэлементы регуляторы жизнедеятельности и продуктивности растений. -Рига, 1971.-209 с.

35. Кельнер Р., Мерме Ж.-М., Otto М., Видмер Г.М. Аналитическая химия. Проблемы и подходы: В 2 т. Т. 1. М.: Мир, ACT, 2004. - 608 с.

36. Кобзарь Е.Ф., Сердюк О.П. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе ауксинов // Биохимия. 1993. - Т. 58, вып. 1. — С. 5061.

37. Кудрин А.Н. Научные основы применения неорганических и органических соединений селена в медицинской практике // Витамины. — 1975. -Вып. 8.-С. 128-134.

38. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов // Биохимия. — 2004. — Т. 69, вып. 3. — С. 293-310.1

39. Кудрявцев A.A. Химия и технология селена и теллура / Под ред. И.В. Тананаева. — М.: Государственное издательство «Высшая школа», 1961 — 287 с.

40. Лабутова Н.М. Взаимоотношения эндомикоризных грибов с микроорганизмами ризосферы // Микология и фитопатология. — 2009. — Т. 43, вып. 1.-С. 3-19.

41. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Пленина Л.В., Пучкова Т.А., Осадчая О.В. Состав и биологическая активность глубинного мицелия ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. — Т. 39, № 1. - С. 69-73.

42. Луцик М.Д., Панасюк E.H., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Вища школа, 1981. — 156 с.

43. Методы экспериментальной микологии / Под ред. В.И. Билай. — Киев:

44. Наукова думка, 1982. 550 с.

45. Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Отв. ред. В.В. Игнатов. М.: Наука, 2005. -262 с.

46. Назаренко И.И., Ермаков А.Н. Аналитическая химия селена и теллура. -М.: Наука, 1971.-251 с.

47. Никитина В.Е. Лектины азоспирилл: свойства, биологическая активность и перспективы их практического использования: Дис. . д-ра биол. наук. — Саратов, 2001. — 310 с.

48. Никитина В.Е. Пат. № 2249614 РФ. Способ получения посевного мицелия съедобных грибов. Бюлл. изобрет. 2005. № 10.

49. Никитина В.Е., Озерова P.A., Цивилева О.М. Особенности роста мицелия Lentinus edodes на различных средах // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. — Саратов: Научная книга, 2003. -Вып. 2.-С. 176-179.

50. Обухова Т.И. Значение определения селена в диагностике болезни Кешана // Микроэлементы в биологии и их применение в сельском хозяйстве и медицине: тез. науч. конф. — Самарканд: СамГУ, 1990. С. 479-480.

51. Пецев Н., Коцев Н. Справочник по газовой хроматографии / Пер. с болг. Мулл ера В.М. Под ред. В.Г. Березкина, К.И. Сакодынского. — М.: Мир, 1987. 260 с.

52. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. - 248 с.

53. Пронина H.A., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Лапин А.Б., Алексеева С.Г., Баум Р.Ф., Мишина И.М., Цоглин Л.Н. Влияние селенит-ионов на рост и накопление селена у Spirulina platensis II Физиология растений. — 2002. Т. 49, №2.-С. 264-271.

54. Решетникова И.А. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. — М., 1997. 197 с.

55. Рогачева С.М. Роль водной компоненты и полисахаридов клеточной поверхности в процессах коммуникации живых систем: анализ молекулярных моделей. Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Воронеж: ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет». — 2008. 40 с.

56. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. — Минск: Высш. школа, 1973.-320 с.

57. Савельева Д.Н., Камзолкина О.В. Совместное культивирование некоторых видов рода Pleurotus с эпифитными дрожжами // Микология и фитопатология. 2009. - Т. 43, вып. 1. - С. 45-51.

58. Соломко Э.Ф., Митропольская Н.Ю. Получение посевного материала Lentinus edodes (Berk.) Sing, глубинным методом II Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28, вып. 3. - С. 34-39.

59. Сучков Б. П. Содержание подвижных форм селена и фтора в почвах черновицкой области и некоторых минеральных удобрений // Селен в биологии: мат-лы науч.конф. — Баку: Элм, 1981. — С. 13-14.

60. Таланова В.В. Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. — Петрозаводск, 2009. — 44 с.

61. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: Изд-во «Фэн», 2001.-448 с.

62. Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А., Голубкина H.A., Кушлинский Н.Е., Соколов Я.А. Селен в организме человека. -М.: изд. РАМН, 2002. 224 с.

63. Феофилова Е.П., Горнова И.Б., Меморская A.C., Гарибова JI.B. Липидный состав плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing Lentinula edodes (Berk.) Pegler. // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 5. - С. 655-659.

64. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C., Хохлова Н.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе липидов // Микробиология. — 2000. Т. 69, № 5. - С. 612-619.

65. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Меморская A.C., Марышова Н.С. Прорастание базидиоспор Agaricus bisporus // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40, № 2. - С. 220-226.

66. Хроматография: Практ. приложение метода: В 2-х ч. Ч. 2. / Пер. с англ. A.B. Родионова. Ред. пер. В.Г. Березкин. Под ред. Э. Хефтмана. — М.: Мир, 1986. 422 с.

67. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. — М.: Мир, 1965. — 508 с.

68. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Е.А., Нетрусов А.И. Микроорганизмы стимуляторы роста растений и их практическое применение (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42, № 2. - С. 133143.

69. Цивилева О.М. Внеклеточные лектины Lentinus edodes: характеристика, свойства и предполагаемые функции: Дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 2008. - 353 с.

70. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. — СПб.: СПбГУ, 2002. 244 с.

71. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. — Уфа: Гилем, 2001. — 160 с.

72. Яруллина Л.Г. Механизмы индуцирования устойчивости пшеницы к грибным патогенам: Автореф. дис. . докт. биол. наук. — Уфа, 2006. 48 с.

73. Banerjee P.C., Ghosh A.K., Sengupta S. Hemagglutinating activity in extracts of mycelia from submerged mushroom cultures // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - Vol. 44, No 4. - P. 1009-1011.

74. Bar Т., Okon Y. Induction of indole-3-acetic acid synthesis and possible toxicity of tryptophan in Azospirillum brasilense Sp 7 // Symbiosis. 1992. - Vol. 13, No 1-3.-P. 191-198.

75. Barker S.J., Tagu D. The Roles of Auxins and Cytokinins in Mycorrhizal Symbioses // Journal of Plant Growth Regulation. 2000. - Vol. 19, No 2. - P. 144154.

76. Barkes L., Fleming R.W. Production of Dimethylselenide Gas from Inorhanic Selenium by Eleven Soil Fungi // Bulletin of Environmental Contamination & Toxicology. 1974. - Vol. 12, No 3. - P. 308-311.

77. Bashan Y., de-Bashan L.E. How the Plant Growth-Promoting Bacterium Azospirillum Promotes Plant Growth A Critical Assessment // Advances in Agronomy. - 2010. - Vol. 108. - P. 77-136.

78. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-phmi relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. - Vol. 43, No 2. -P. 103-121.

79. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003) I I Can. J. Microbiol. 2004. - Vol. 50, No 8. - P. 521-577.

80. Bashan Y., Puente M.E., de-Bashan L.E., Hernandez J.-P. Environmental uses of plant growth-promoting bacteria // Plant-Microbe Interactions. 2008. - P. 70-93.

81. Bis'ko N.A., Bilay V.T. Effects of Bacillus macerans Fr. on growth of Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. // Science and cultivation of edible fungi / Ed. T.J. Elliott. A.A. Balkema: Rotterdam, Brookfield. -1995. - Vol. 2. - P. 843-846.

82. Borovicka J., Randa Z. Distribution of iron, cobalt, zinc and selenium in macrofungi // Mycol. Progress. 2007. - Vol. 6, No 4. - P. 249-259.

83. Brady J.M., Tobin J.M., Gadd G.M. Volatilization of selenite in aqueous medium by a Penicillium species // Mycological Research. 1996. - Vol. 100, Issue 8.-P. 955-961.

84. Cannon, P.F. International Commission on the Taxonomy of Fungi (ICTF): name changes in fungi of microbiological, industrial and medical importance. Part 1 // Microbiol. Sci. 1986. - Vol. 3, No 6. - P. 168-171.

85. Carlile M.J., Watkinson S.C., Gooday G.W. The Fungi. Second edition. -London, San Diego: Academic Press, 2001. 588 p.

86. Chang T.T., Li C.Y. Weathering of Limestone, Marble, and Calcium Phosphate by Ectomycorrhizal Fungi and Associated Microorganisms // Taiwan Forestry Research Institute. 1998. - Vol. 13, No 2. - P. 85-90.

87. Chasteen T.G., Bentley R. Biomethylation of Selenium and Tellurium: Microorganisms and Plants // Chemical Reviews. 2003. - Vol. 103, No 1. - P. 1-25.

88. Ciapellano S., Testolin G., Allegrini M., Porrini M. Availability of selenium in dough and bisquits in comparison to wheat meal // Ann. Nutr. Metab. 1990. — Vol. 34, No 6. - P. 343-349.

89. Combs Jr G.F. Selenium in global food systems // British Journal of Nutrition. 2001. - Vol. 85, No 5. - P. 517-547.

90. Costacurta A., Keijers V., Vanderleyden J. Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene // Mol. Gen. Genet. 1994. - Vol. 243, No 4. - P. 463-472.

91. Dackman C., Olsson S., Jansson H.-B., Lundgren B., Nordbring-Hertz B. Quantification of Predatory and Endoparasitic Nematophagous Fungi in Soil // Microb. Ecol. 1987. - Vol. 13, No 1. - P. 89-93.

92. Dahm H., Rozycki H., Strzelczyk E., Li C.Y. Production of B-group vitamins by Azospirillum spp. grown in media of different pH at different temperatures // Zentralbl. Mikrobiol. 1993. - Vol. 148, No 3. - P. 195-203.

93. Dat J.F., Lopez-Delgado H., Foyer C.H., Scott I.M. Parallel Changes in H202 and Catalase during Thermotolerance Induced by Salicylic Acid or Heat Acclimation in Mustard Seedlings // Plant Physiology. 1998. - Vol. 116, No 4. - P. 1351-1357.

94. Day J.M., Dobereiner J. Physiological aspects of N-fixation by a Spirillum from Digitaria roots // Soil Biology and Biochemistry. 1976. - Vol. 8, Issue 1. - P. 45-50.

95. De Roman M. The Contribution of Wild Fungi to Diet, Income and Health: A World Review. // Progress in Mycology / Eds. M. Rai, G. Kovics. India: Scientific Publishers and Dordrecht, The Netherlands: Springer Science+Business

96. Dernovics M., Stefánka Zs., Fodor P. Improving selenium extraction by sequential enzymatic processes for Se-speciation of selenium-enriched Agaricus bisporus // Anal. Bioanal. Chem. 2002. - Vol. 372, No 3. - P. 473-480.

97. Dewick P.M. The biosynthesis of shikimate metabolites // Natural Product Reports. 1998. - Vol. 15, No 1. - P. 17-58.

98. Dumont E., Vanhaecke F., Cornelis R. Selenium speciation from food source to metabolites: a critical review // Anal. Bioanal. Chem. 2006. - Vol. 385,1. No 7. P. 1304-1323.

99. Duponnois R., Lesueur D. Sporocarps of Pisolithus albus as an ecological niche for fluorescent pseudomonads involved in Acacia mangium Wild Pisolithus albus ectomycorrhizal symbiosis // Can. J. Microbiol. - 2004. - Vol. 50, No 9. — P. 691-696.

100. Eckardt N.A. New Insights into Auxin Biosynthesis // The Plant Cell. -2001.-Vol. 13, No l.-P. 1-3.

101. Epstein E. Studies of the Biosyntesis of Indigotin by the Basidiomycete Schizophyllum commune. Ph.D. dissertation. — State University of New York at Buffalo. 1966. - University Microfilm order number 66-12,109.

102. Epstein E., Miles P.G. Identification of Indole-3-Acetic Acid in the Basidiomycete Schizophyllum commune // Plant Physiol. 1967. - Vol. 42, No 7. -P. 911-914.

103. Ermakov V.V., Alekseeva S.A. Mushrooms as source of selenium consumption // Proceedings of 3rd Int. Symposium on Trace Elements in Human: New Perspectives. Athens, Greece, 2001. - P. 384-392.

104. Falandysz J. Selenium in Edible Mushrooms // Journal of Environmental Science and Health, Part C: Environmental Carcinogenesis and Ecotoxicology Reviews. 2008. - Vol. 26, Issue 3. - P. 256-299.

105. Feigl F., West P.W. Test for Selenium Based on a Catalytic Effect // Anal. Chem. 1947. - Vol. 19, No 5. - P 351-353.

106. Fernández-Martínez A., Charlet L. Selenium environmental cycling and bioavailability: a structural chemist point of view // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. — 2009. Vol. 8, No 1. - P. 81-110.

107. Frankenberger W.T., Poth M. Biosynthesis of Indole-3-Acetic Acid by the Pine Ectomycorrhizal Fungus Pisolithus tinctorius // Applied and Environmental Microbiology. 1987. - Vol. 53, No 12. - P. 2908-2913.

108. Frey-Klett P., Garbaye J., Tarkka M. The mycorrhiza helper bacteria revisited // New Phytologist. 2007. - Vol. 176, Issue 1. - P. 22-36.

109. Gao X., Zhang J., Zhang L. Hollow Sphere Selenium Nanoparticles: Their In-Vitro Anti Hydroxyl Radical Effect // Adv. Mater. 2002. - Vol. 14, No 4. - P. 290-293.

110. Garbaye J. Helper bacteria: a new dimension to the mycorrhizal symbiosis // New Phytologist. 1994. - Vol. 128, No 2. - P. 197-210.

111. Garbisu C., Ishii T., Leighton T., Buchanan B.B. Bacterial reduction of selenite to elemental selenium // Chemical Geology. 1996. - Vol. 132, Issues 1-4. -P. 199-204.

112. Gay G., Debaud C. Genetic Study on Indole-3-Acetic Acid Production by Ectomycorrhizal Hebeloma Species: Inter- and Intraspecific Variability in Homo- and Dikaryotic Mycelia // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - Vol. 26, No 2. - P. 141146.

113. Gladyshev V.N., Hatfield D.L. Selenocysteine-Containing Proteins in Mammals // J. Biomed. Sci. 1999. - Vol. 6, No 3. - P. 151-160.

114. Gopinathan S., Raman N. Indole 3-Acetic Acid Production by Ectomycorrhizal Fungi // Indian Journal of Experimental Biology. 1992 - Vol. 30, No 2.-P. 142-143.

115. Gromer S., Eubel J.K., Lee B.L., Jacob J. Human Selenoproteins at a Glance: Review // Cell. Mol. Life Sci. 2005 - Vol. 62, No 21. - P. 2414-2437.

116. Gruen H.E. Auxins and Fungi // Ann. Rev. Plant. Physiol. 1959. - Vol. 10. - P. 405-440.

117. Guha A.K., Banerjee A.B. Effect of Indole-3-Acetic Acid and Kinetin on Submerged Growth of Agaricus campestris // Acta Microbiologica Polonica Ser. B. -1974. Vol. 6, No 23. P. 133-134.

118. Han Y.H., Yeng W.T., Chen L.C., Chang S. Physiology and ecology of Lentinus edodes (Berk.) Sing // Mushroom Sci. 1981. - Vol. 11, No 2. - P. 623-658.

119. Halsall D.M. Inoculation of wheat straw to enhance lignocellulose breakdown and associated nitrogenase activity // Soil Biology and Biochemistry. -1993. Vol. 25, Issue 4. - P. 419-429.

120. Hasan H.A.H. Gibberellin and auxin production by plant root-fungi and their biosynthesis under salinity-calcium interaction // Rostlinna Vyroba. 2002. -Vol. 48, No 3. - P. 101-106.

121. Hunter W.J., Kuykendall L.D. Reduction of Selenite to Elemental Red

122. Selenium by Rhizobium sp. Strain B1 // Curr. Microbiol. 2007. - Vol. 55, No 4. - P. 344-349.

123. Hunter W.J., Manter D.K. Reduction of Selenite to Elemental Red

124. Selenium by Pseudomonas sp. Strain CA5 // Curr. Microbiol. 2009. - Vol. 58, No 5. - P. 493-498.

125. Inoue Y., Matsuda T., Sugiyama K., Izawa S., Kimura A. Genetic Analysis of Glutathione Peroxidase in Oxidative Stress Response of Saccharomyces cerevisiae // The Journal of Biological Chemistry. 1999. - Vol. 274, No 38. - P. 27002-27009.

126. Isikhuemhen O.S., Vaugnas-Ward K. Spore Germination and Breeding Pattern in Grifóla frondosa (Dicks.: Fr.) S.F. Gray // International Journal of Medicinal Mushrooms. 2005. - Vol. 7, Issue 3. - P. 414.

127. Jacob C., Giles G.I., Giles N.M., Sies H. Sulfur and Selenium: The Role of Oxidation State in Protein Structure and Function // Angew. Chem. Int. Ed. -2003. Vol. 42, No 39. - P. 4742-4758.

128. Jaffee B.A., Ferris H., Scow K.M. Nematode-Trapping Fungi in Organic and Conventional Cropping Systems // Ecology and Population Biology. 1998. -Vol. 88, No 4. - P. 344-350.

129. Kampert M., Strzelczyk E. Synthesis of Auxins by Fungi Isolated from the Roots of Pine Seedlings (Pinus silvestris L.) and from Soil // Acta Microbiologica Polonica Series B: Microbiología Applicata. 1975. - Vol. 7, No 4. - P. 223-230.

130. Kende H., Zeevaart J.A.D. The Five "Classical" Plant Hormones // The Plant Cell. 1997. - Vol. 9, No 7. - P. 1197-1210.

131. Kessi J., Ramuz M., Wehrli E., Spycher M., Bachofen R. Reduction of Selenite and Detoxification of Elemental Selenium by the Phototrophic Bacterium Rhodospirillum rubrurn // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - Vol. 65, No 11.-P. 4734-4740.

132. Knaggs A.R. The biosynthesis of shikimate metabolites // Natural Product Reports. 1999. - Vol. 16, Issue 4. - P. 525-560.

133. Konishi M., Hagimoto H. Occurrence, Formation and Destruction of Indole Acetic Acid in the Fruit Body of Agaricus bisporus (Lange) Sing. // Plant and Physiology. 1961. - Vol. 2, No 4. - P. 425-434.

134. Lebuhn M., Heulin T., Hartmann A. Production of auxin and other indolic and phenolic compounds by Paenobacillus polymyxa strains isolated from different proximity to plant roots // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. - Vol. 22, Issue 4. - P. 325-334.

135. Levy A., Chang B.J., Abbott L.K., Kuo J., Harnett G., Inglis T.J.J. Invasion of Spores of the Arbuscular Mycorrhizal Fungus Gigaspora decipiens by Burkholderia spp. // Applied and Environmental Microbiology. 2003. - Vol. 69, No 10.-P. 6250-6256.

136. Li C.Y. Nitrogen-fixing (acetylene-reducing) bacteria associated with ectomycorrhizae of Douglas-fir // Plant and Soil. 1987. -Vol. 98, No 3. - P. 425428.

137. Li C.Y., Castellano M.A. Azospirillum Isolated from within Sporócarps of the Mycorrhizal Fungi Hebeloma crustuliniforme, Laccaria laccata and Rhizopogon vinicolor // Trans. Br. Mycol. Soc. 1987. - Vol. 88, No 4. - P. 563-565.

138. Li C.Y., Strzelczyk E. Belowground Microbial Processes Underpin Forest Productivity // Phyton. 2000. - Vol. 40, No 4. - P. 129-134.

139. Margis R., Dunand C., Teixeira F.K., Margis-Pinheiro M. Glutathione peroxidase family an evolutionary overview // FEBS Journal. — 2008. - Vol. 275, Issue 15.-P. 3959-3970.

140. McMeekin D. Indole-3-Acetic Acid, Glucose, and Inoculum Influence the Formation and Distribution of Basidiocarps of Pholiota malicola in Culture //

141. Mycologia. 2000. - Vol. 92, Issue 4. - P. 772-776.

142. Metal Nanoparticles in Microbiology / Eds.: M. Rai, N. Duran. Berlin, Heidelberg: Springer, 2011. - 303 p.

143. Minaev V.S., Timoshenkova S.P., Kalugina V.V. Structural and Phase Transformations in Condensed Selenium // Journal of Optoelectronics and Advanced Materials. 2005. - Vol. 7, No 4. - P. 1717-1741.

144. Moulton J.E. Extraction of Auxin from Maize, from Smut Tumors of Maize and from Ustilago zeae // Bot. Gaz. 1942. - Vol. 103, No 4. - P. 725-739.

145. Mrazkova L., Dobra M., Kriz J., Stanek M. Microorganisms in fermented nutrient substrate for Pleurotus ostreatus a review of results // 3rd Int.Symp. Physiology, Ecology and Cultivation of Edible Fungi. - Prague, 1979. - P. 143-148.

146. Mukhopadhyay R., Chatterjee S., Chatterjee B.P., Guha A.K. Enhancement of Biomass Production of Edible Mushroom Pleurotus sajor-caju Grown in Whey by Plant Growth Hormones // Process biochemistry. — 2005. — Vol. 40, No 3-4. P. 1241-1244.

147. Narayanan K.B., Sakthivel N. Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes // Advances in Colloid and Interface Science. 2010. - Vol. 156, Issue 1-2.-P. 1-13.

148. Niemi K., Vuorinen T., Ernstsen A., Haggman H. Ectomycorrhizal Fungi and Exogenous Auxins Influence Root and Mycorrhiza Formation of Scots Pine

149. Hypocotyl Cuttings in vitro II Tree Physiology. 2002. - Vol. 22, No 17. - P. 12311239.

150. Normanly J. Approaching Cellular and Molecular Resolution of Auxin Biosynthesis and Metabolism // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010. - Vol. 2, Issue l.-P. 1-17.

151. Normanly J., Slovin J.P., Cohen J.D. Rethinking Auxin Biosynthesis and Metabolism // Plant Physiol. 1995. - Vol. 107, No 2. - P. 323-329.

152. Ogra Y., Ishiwata K., Encinar J.R., Lobinski R., Suzuki K.T. Speciation of selenium in selenium-enriched shiitake mushroom, Lentinula edodes // Anal. Bioanal. Chem. 2004. - Vol. 379, No 5-6. - P. 861-866.

153. Pedrero Z., Madrid Y. Novel approaches for selenium speciation in foodstuffs and biological specimens: A review // Analytica Chimica Acta. 2009. -Vol. 634, Issue 2. - P. 135-152.

154. Philip D. Biosynthesis of Au, Ag and Au-Ag nanoparticles using edible mushroom extract // Spectrochim. Acta A. Mol. Biomol. Spectrosc. 2009. - Vol. 73, No 2.-P. 374-381.

155. Piepponen S., Liukkonen-Lilja H., Kuusi T. The Selenium Content of Edible Mushrooms in Finland // Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1983. - Vol. 177, No 4.-P. 113-120.

156. Plant Hormones. Biosynthesis, Signal Transduction, Action! Revised third edition / Ed. P.J. Davies. Dordrecht, Heidelberg, London, New York: Springer Science+Business Media B.V., 2010. - 802 p.

157. Podila G.K. Signaling in mycorrhizal symbioses elegant mutants lead the way // New Phytologist. - 2002. - Vol. 154, Issue 3. - P. 541-545.

158. Poole E.J., Bending G.D., Whipps J.M., Read D.J. Bacteria associated with Pinus sylvestris-Lactarius rufus ectomycorrhizas and their effects on mycorrhiza formation in vitro // New Phytologist. 2001. - Vol. 151, Issue 3. - P. 743-751.

159. Popescu M., Velea A., Lorinczi A. Biogenic Production of Nanoparticles // Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 2010. - Vol. 5, No 4. - P. 1035-1040.

160. Prinsen E, Costacurta A, Michiels K., Vanderleyden J., Van Onckelen H. Azospirillum brasilense indole 3-acetic acid biosynthesis: evidence for a non-tryptophan dependent pathway // Molecular Plant-Microbe Interactions. 1993. -Vol. 6, No 5.-P. 609-615.

161. Prokisch J., Zommara M.A. Process for Producing Elemental Selenium Nanospheres // Patent Application Publication. 2010. - Pub. No US 2010/0189634 Al.

162. Przybylowicz P., Donoghue J. Shiitake growers handbook: the art and science of mushroom cultivation. Dubuque: Kendall/Hunt Publ. Co., 1991. - 217 p.

163. Radwanski E.R., Last R.L. Tryptophan Biosynthesis and Metabolism: Biochemical and Molecular Genetics // The Plant Cell. 1995. - Vol. 7, No 7. - P. 921-934.

164. Ramadan H.E., Razak A.A., Yousseff Y.A., Sedky N.M. Selenium Metabolism in a Strain of Fusarium // Biological Trace Element Research. 1988. -Vol. 18, No 1.-P. 161-170.

165. Rao R.P., Hunter A., Kashpur O., Normanly J. Aberrant Synthesis of Indole-3-Acetic Acid in Saccharomyces cerevisiae Triggers Morphogenic Transition, a Virulence Trait of Pathogenic Fungi // Genetics. 2010. - Vol. 185, No. 1. - P. 211-220.

166. Rayman M.P., Infante H.G., Sargent M. Food-chain selenium and human health: spotlight on speciation: Review Article // British Journal of Nutrition. 2008. - Vol. 100, No 2. - P. 238-253.

167. Red'kina T.V. Fungistatic Activity of Bacteria of the Genus Azospirillum // Agrokemia es Talajtan (Agrochemistry and Soil Science). 1990. - Vol. 39, No 3-4.-P. 465-468.

168. Reeves M.A., Hoffmann P.R. The human selenoproteome: recent insights into functions and regulation // Cell. Mol. Life Sci. 2009. - Vol. 66, No 15. - P. 2457-2478.

169. Reilly C. Selenium in Food and Health. New York: Springer Science+Business Media, LLC, 2006. - 206 p.

170. Rotruck J.T., Pope A.L., Ganther H., Hoekstra H.G. Prevention of oxidative damage to rat erythrocytes by dietary selenium // J. of Nutrition. 1972.

171. Vol. 102, No 5.-P. 689-696.

172. Rypachek V., Sladky Z. Relation between the Level of Endogenous Growth Regulators and the Differentiation of the Fungus Lentinus tigrinus Studied in a Synthetic Medium // Biologia Plantarum. 1973. - Vol. 15, No 1. - P. 20-26.

173. Rypachek V., Sladky Z. The Character of Endogenous Growth Regulators in the Course of Development in the Fungus Lentinus tigrinus // Mycopatologia et Mycologia applicata. 1972. - Vol. 46, No 1. - P. 65-72.

174. Sastry M., Ahmad A., Khan M.I., Kumar R. Biosynthesis of metal nanoparticles using fungi and actinomycete // Current Science. 2003. - Vol. 85, No 2. - P. 162-170.

175. Schrauzer G.N. Nutritional Selenium Supplements: Product Types, Quality, and Safety // Journal of the American College of Nutrition. 2001. - Vol. 20, No l.-P. 1-4.

176. Schrauzer G.N. Selenomethionine: A Review of Its Nutritional Significance, Metabolism and Toxicity // The Journal of Nutrition. 2000. - Vol. 130, No 7.-P. 1653-1656.

177. Schwarz R., Foltz C.M. Selenium as an integral part of Factor 3 against dietary necrotic liver degeneration // J. Amer. Chem. Soc. 1957. — Vol. 79, No 12. -P. 3293.

178. Singh S. Interaction of mycorrhizae with soil microflora and microfauna -Part II. Interaction with free-living nitrogen fixers and soil micro-fauna // Mycorrhiza

179. News. 1998. - Vol. 10, No 2. - P. 2-13.

180. Sladky Z., Tichy V. Stimulation of the Formation of Fruiting Bodies of the Fungus Lentinus tigrinus (Bull.) Fr. by Growth Regulators // Biologia Plantarum.- 1974. Vol. 16, No 6. - P. 436-443.

181. Slankis V. Hormonal relationship in mycorrhizal development. // Ectomycorrhizae: Their Ecology and Physiology. / Eds. G.C. Marks, T.T. Kozlowski.- New York, London: Academic Press, 1973. P. 231-298.

182. Song C.H., Cho K.Y., Nair N.G., Vine J. Growth stimulation and lipid synthesis in Lentinus edodes // Mycologia. 1989. - Vol. 81, No 4. - P. 514-522.

183. Sosa-Morales M.E., Guevara-Lara F., Martinez-Juarez V.M., Paredes-Lopez O. Production of Indole-3-Acetic Acid by Mutant Strains of Ustilago maydis (maize smut/huitlacoche) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - Vol. 48, No 6. -P. 726-729.

184. Spaepen, S. Vanderleyden J., Remans R. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling // FEMS Microbiol. Rev. — 2007. Vol. 31, Issue 4.-P. 425-448.

185. Spano S.D., Jurgensen M.F., Larsen.M.J., Harvey A.E. Nitrogen-fixing bacteria in Douglas-fir residue decayed by Fomitopsis pinícola // Plant and Soil. — 1982. Vol. 68, No 1. - P. 117-123.

186. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms. Berkeley: Ten Speed Press, 1993. - 552 p.

187. Stanek M., Bis'ko N.A. Regulation of microbiological processes in substrate for the cultivation Pleurotus ostreatus //■ Zahradnictvi. 1982. - Vol. 3. — P. 221-233.

188. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiology Reviews. 2000. - Vol. 24, Issue 4. - P. 487-506.

189. Stepanova L.V., Schelud'ko A.V., Katsy E.I., Ponomareva E.G., Nikitina V.E. The role of lectin-carbohydrate biospecific interactions between medicinal

190. Basidiomycetes mushroom Grifola frondosa (Dicks.: Fr.) S.F. Gray and Azospirillum brasilense during their co-cultivation // International Journal of Medicinal Mushrooms. 2008. - Vol. 10, No 1. - P. 65-72.

191. Stijve T. Selenium Content of Mushrooms // Z. Lebensm. Unters.-Forsch.- 1977. Vol. 164, No 3. - P. 201-203.

192. Strzelczyk E., Sitek J.M., Kowalski S. Synthesis of Auxins from Tryptophan and Tryptophan-precursors by Fungi Isolated from Mycorrhizae of Pine (Pinus silvestris L.) // Acta Microbiologica Polonica. 1977. - Vol. 26, No 3. - P. 255-264.

193. Tapiero H., Townsend D.M., Tew K.D. The antioxidant role of selenium and seleno-compounds // Biomedicine & Pharmacotherapy. 2003. - Vol. 57, Issues 3-4.-P. 134-144.

194. Tham L.X., Matsuhashi S., Kume T. Growth and fruitbody formation of Ganoderma lucidum on media supplemented with vanadium, selenium and germanium // Mycoscience. 1999. - Vol. 40, No 1. - P. 87-92.

195. Tilak K.V.B.R., Li C.Y., Ho I. Occurrence of nitrogen-fixing Azospirillum in vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi // Plant and Soil. 1989. - Vol. 116, No 2.- P. 286-288.

196. Turker M., Demirel K., Uzun Y., Battal P. Determination of phytohormones level in some dried and fresh macrofungi taxa // Phyton. 2005. — Vol. 45, No 2. - P. 145-157.

197. Turfo J., Gutkowska B., Herold F. Effect of selenium enrichment on antioxidant activities and chemical composition of Lentinula edodes (Berk.) Pegl. mycelial extracts // Food and Chemical Toxicology. 2010. - Vol. 48, Issue 4. - P. 1085-1091.

198. Turlo J., Gutkowska B., Malinowska E. Relationship between the selenium, selenomethionine, and selenocysteine content of submerged cultivated mycelium of Lentinula edodes (Berk.) // Acta Chromatographica. 2007. - No 18. -P. 36-48.

199. Turner R.J., Weiner J.H., Taylor D.E. Selenium metabolism in Escherichia coli // BioMetals. 1998. - Vol. 11, No 3. - P. 223-227.

200. Unyayar S., Unal E., Unyayar A. Relationship between Production of 3-Indoleacetic Acid and Peroxidase-Laccase Activities Depending on the Culture Periods in Funalia trogii (Trametes trogii) // Folia Microbiol. 2001. - Vol. 46, No 2.-P. 123-126.

201. Vinklarkova K., Sladky Z. Exogenous Regulators in the Mycelium of Pleurotus ostreatus after Exogenous Application // Folia Microbiol. 1978. - Vol. 23, No l.-P. 55-59.

202. Wang Y. Differential Effects of Sodium Selenite and Nano-Se on Growth Performance, Tissue Se Distribution, and Glutathione Peroxidase Activity of Avian Broiler // Biol. Trace Elem. Res. 2009. - Vol. 128, No 2. - P. 184-190.

203. Wasser S.P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. - Vol. 89. -P. 1323-1332.

204. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal Properties of Substances Occuring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms. 1999. - Vol. 1. - P. 31-62.

205. Watkinson J.H. A Selenium-accumulating Plant of the Humid Regions: Amanita muscaria // Nature. 1964. - Vol. 202, Issue 4938. - P. 1239-1240.

206. Wenjun H., Tingzhi F. Biotransformation of selenium in hyphostroma of

207. Flammulina velutipes NJ9601 // Edible fungi of China. 1997. - Vol. 16, Part 3. - P. 30-33.

208. Whanger P.D. Selenocompounds in Plants and Animals and their Biological Significance: Review // Journal of the American College of Nutrition. -2002. Vol. 21, No 3. - P. 223-232.

209. Wolf F.T. The Production of Indoleacetic Acid by Ustilago zeae and its Possible Significance in Tumor Formation // Proc. Natl. Acad. Sci. 1952. - Vol. 38, No 2.-P. 106-111.

210. Woodward A.W., Bartel B. Auxin: Regulation, action and interaction // Annals of Botany. 2005. - Vol. 95. - P. 707-735.

211. Wright A.D., Moehlenkamp C.A., Perrot G.H., Neuffer M.G., Cone K.C. The Maize Auxotrophic Mutant orange pericarp is Defective in Duplicate Genes for Tryptophan Synthase p // The Plant Cell. 1992. - Vol. 4, Issue 6. - P. 711-719.

212. Wright A.D., Sampson M.B., Neuffer M.G., Michalczuk L., Slovin J.P., Cohen J.D. Indole-3-acetic acid biosynthesis: De novo synthesis in the maize mutant orange pericarp, a tryptophan auxotroph // Science. 1991. - Vol. 254, No 5034. -P. 998-1000.

213. Yadav V., Sharma N., Prakash R., Raina K.K., Bharadwaj L.M., Prakash N.T. Generation of Selenium-Containing Nano-Structures by Soil Bacterium Pseudomonas aeruginosa // Biotechnology. 2008 - Vol. 7, No 2. - P. 299-304.

214. Yurekli F., Geckil H., Topcuoglu F. The Synthesis of Indole-3-Acetic Acid by the Industrially Important White-Rot fungus Lentinus sajor-caju under Different Culture Conditions // Mycol. Res. 2003. - Vol. 107, Issue 3. - P. 305-309.

215. Yurekli F., Yesilada O., Yurekli M., Topcuoglu S.F. Plant Growth Hormone Production from Olive Oil Mill Alcohol Factory Wastewaters by White Rot Fungi // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 1999. - Vol. 15, No 4. -P. 503-505.

216. Zaidman B.-Z., Yassin M., Mahajna J., Wasser S.P. Medicinal mushroom modulators of molecular targets as cancer therapeutics // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - Vol. 67, No 4. - P. 453-468.

217. Zakharova E.A., Shcherbakov A.A., Brudnik V.V., Skripko N.G., Bulkhin N.Sh., Ignatov V.V. Biosynthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense. Insights from quantum chemistry // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 259, Issue 3. - P. 572-576.

218. Zhang J.S., Gao X.Y., Zhang L.D., Bao Y.P. Biological effects of a nano red elemental selenium // Biofactors. 2001. - Vol. 15, No 1. - P. 27-38.

219. Zhang J., Wang X., Xu T. Elemental Selenium at Nano Size (Nano-Se) ass ta Potential Chemopreventive Agent with Reduced Risk of Selenium Toxicity: Comparison with Se-Methylselenocysteine in Mice // Toxicol. Sci. 2008. - Vol. 101, No 1.-P. 22-31.

220. Zhao L., Zhao G., Zhao Z. Chen P., Tong J., Hu X. Selenium Distribution in a Se-Enriched Mushroom Species of the Genus Ganoderma // J. Agric. Food Chem. 2004. - Vol. 52, No 12. - P. 3954-3959.