Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические особенности некоторых штаммов культивируемого гриба Lentinus edodes. (Berk. Sing.)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические особенности некоторых штаммов культивируемого гриба Lentinus edodes. (Berk. Sing.)"

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ ШТАММОВ КУЛЬТИВИРУЕМОГО ГРИБА LENTINUS EDODES. (Berk. Sing.)

03.00.12 - физиология и биохимия растений.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж 2003

Работа выполнена в Воронежском государственном аграрном университете им. К. Д. Глинки

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Евдокимова Ольга Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович

кандидат биологических наук Соколенко Галина Григорьевна

Ведущая организация:

научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции (г. Вороонеж)

Защита диссертации состоится " 19 " декабря 2003 г. в 13 00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 Воронежского государственного университета по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, В ГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан: "18й ноября 2003 г. Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук, доцент ¿Л^с^-Ж Брехова Л.И.

aoo-g-A

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Современное фибоводство имеет отчетливую тенденцию к предпочтению культивирования экзотических грибов, обладающих природными биологически активными комплексами и лечебными свойствами. Одним из наиболее перспективных для этой цели объектов являются высшие базидиальные грибы рода Lentinus Fr., сочетающие в себе высокую питательную ценность, биологическую активность (иммуномоделирующую, онкостатическую, антихолестериновую, антивирусную и др), а также отсутствие токсичности.

Однако гриб Lentinus edodes является медленнорастущим, вследствие этого происходит освоение субстрата конкурентной микрофлорой, высыхание и снижение продуктивности. Поэтому необходимо изучение его физиологических особенностей для разработки технологии ускоренного развития и повышения продуктивности. Так же недостаточно изучены его биохимические особенности и питательная ценность. Неизвестно действие биологически активных веществ на онтогенез гриба и его продуктивность.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении физиолого-биохимических параметров роста и продуктивности 4 штаммов Lentinus edodes: М 370, N 99, L.Poot, L. 4080.; их биохимических особенностей и пищевой ценности..

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить физиологические характеристики 4 штаммов Lentinus edodes М 370, N-99, L. Poot, L. 4080; охарактеризовать их скорость роста на различных средах и продуктивность.

2. Изучить биохимический состав мицелия и плодовых тел и определить пищевую и биологическую ценность.

3. Установить наиболее перспективный штамм и изучить влияние биорегуляторов на скорость роста мицелия и продуктивность гриба ЬепИпив е<1ос1е8.

4. Изучить влияние синтетических биорегуляторов на биохимический состав мицелия и плодовых тел Ьепйпив еёоёев.

5. Определить влияние биорегуляторов на динамику целлюлозолитической активности гриба.

6.Сравнить влияние биорегуляторов на скорость роста быстрорастущего гриба ИеигоШв овй-еайк и медленнорастущего Ьепйпив еёоёев.

7. Разработать рекомендации по ускоренному выращиванию гриба ЬеМтив есЫев.

Научная новизна.

Изучены ростовые характеристики и целлюлозолитическая активность 4 штаммов Ьепйпив ес1ос1е5 на разных средах, в результате выявлены быстрорастущие технологичные штаммы. Полученные данные биохимического состава мицелия и плодовых тел четырех штаммов Ьепйпив есМев свидетельствуют о высокой пищевой и биологической ценности гриба, высоком содержании белка и полисахаридов, сбалансированном аминокислотном составе. Впервые показано, что в процессе органогенеза ЬгаЯишя еёоёев наблюдается уменьшение содержания витамина С и увеличение количества витамина А в плодовых телах. Высокая пищевая ценность и биологическая активность плодовых тел ЬепИпив е<1ос1е8 позволяет найти широкое применение в пищевой промышленности и фарамацефтике. Изучено влияние биологически активных веществ на рост и продуктивность гриба Ьепйпив есЬёев, и показано их стимулирующее действие как на вегетативный рост мицелия, так и на плодоношение гриба. Впервые выявлен синергический эффект, вызванный совместным действием биорегуляторов и индукторов на рост и продуктивность гриба Ьепйпиз есЬЗеБ. ■ • • ,

Практическая значимость.

На основании проведенных исследований отобраны перспективные для промышленного культивирования штаммы гриба Lentinus edodes: М 370, N 99, L 4080.

Проведены успешные технологические испытания перспективного штамма М 370 в опытном цехе ВГАУ и показано, что интенсивное культивирование гриба Lentinus edodes с использованием биорегуляторов позволило сократить цикл его развития в 1,5-2,0 раза и почти в 2 раза повысить продуктивность. В то же время биорегуляторы не оказывали существенного влияния на биохимический состав грибов.

Высокая биологическая и пищевая ценность плодовых тел гриба Lentinus edodes свидетельствует о целесообразности его внедрения в промышленное производство. Апробация работы.

Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на научной сессии ВГАУ (2001, 2002, 2003 г.) студенческой научной конференции (Воронеж 1999г), научной конференции посвященной памяти А. А. Землянухина (г. Воронеж 2000г). Были представлены на Всесоюзном симпозиуме, посвященном современным проблемам в микробиологии и биотехнологии (г. Пущино 2000г), LI студенческой научной конференции (г. Воронеж 2000 г.), научной конференции, посвященной памяти А. А. Землянухина (г. Воронеж 2001 г), LH студенческой научной конференции (г. Воронеж 2001г.), I съезде микологов России (г. Москва 2002 г.), на научной конференции, посвященной памяти A.A. Землянухина (г. Воронеж 2002 г.). Публикации.

Основные результаты исследований опубликованы в 12 печатных работах. По материалам диссертации получено 2 авторских свидетельства. Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных глав, выводов, списка литературы, который

включает 170 наименований. Работа иллюстрирована 19 рисунками, содержит 16 таблиц приложение.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали 4 штамма гриба Ь. е<1оёе5: М 370, N99, Ь.4080, Ь.Роо^ относящихся к порядку Agaricales, классу Ваз1с1ютусе1е5. В качестве сравнения использовали штамм РкшчНш о^еаПю НК-35.

Мицелий в жидкой среде культивировали в колбах объемом 100 и 250 мл, содержащих 50 и 100 мл сусло - среды. Культуру выращивали при температуре 26 и 15 °С. Количество биомассы определяли взвешиванием после высушивания через каждые 2 суток.

В качестве зерновой среды использовали овес, ячмень, пшеницу. Культивировали при температуре 25-26 °С в стеклянных бутылках объемом 0,5 л. Для определения скорости зарастания, измеряли длину колонии с 4-х сторон каждые 2 суток. Для получения плодовых тел использовали субстрат из дубовых опилок (90 %) с добавлением пшеничных отрубей (10%) и СаС03 (0,2%).

Определение активности целлюлазы проводили глюкозооксидантным методом. Общее содержание липидов определяли методом кислотного гидролиза. Белок определяли по методу Бредфорда. Минеральные вещества определяли. следующими методами: фосфор - спектрофотометрическим, кальций - титрометрическим, натрий - ионометрическим, калий пламенно -фотометрическим.

Витамин А определяли колориметрическим методом, тиамин и рибофлавин - флоуромегричсеким, аскорбиновую кислоту тирометрическим. Аминокислоты определяли на аминокислотном анализаторе Т 339. Фракционный состав белков - экстагированием различных фракций в соответствующем растворителе и определяли с реактивом Фолина.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 10-12 биологических повторностях. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с использованием критерия Стьюдента.

3.Результаты исследований.

1. Физиолого-биохимические характеристики штаммов Lentinus edodes.

Показано, что штаммы М 370, L. 4080 и N 99 имеют более высокую скорость роста: на агаризованной и жидкой среде: 0,38, 0,31, 0,29 см/сут соответственно на агаризованной среде, и 0,36г/л в сут; 0,42 г/л в сут; 0,38 г/л сут. на жидкой среде. Скорость роста штамма L. Poot составила 0,1 см/сут, скорость нарастания биомассы в жидкой среде 0,24 г/л сут. Следовательно, по скорости роста изучаемые нами штаммы можно разделить на быстрорастущие: М370, N99 и L4080 и медленнорастущие: L. Poot. Рис 1.

А Б

Рис.1 Динамика роста штаммов Lentinus edodes на агаризованной (А) и жидкой сусло среде (Б).

1-М 370 2-L 4080,3-N 99,4-L.Poot

Мицелий штаммов М370 и N 99 более высокий, плотный, тогда как мицелий штаммов L. 4080, L. Poot. имеет гладкую, шелковистую поверхность.

Ростовые коэффициенты с учетом морфологических особенностей оказались равны: М 370 - 3,4; N 99 - 2,6; L 4080 - 1,9; L. Poot - 0,3. Таким образом, наивысший коэффициент имеет штамм М 370, самый низкий - L. Poot.

1.2. Целлюлозолитическая активность штаммов Lentinus edodes.

Изучение целлюлозолитической активности штаммов L. edodes показало, что у всех 4-х штаммов пик активности наступает на 26-32 сутки и достигает максимальной отметки 9,9 Е/мг белка у штамма М 370. Активность фермента штамма L. edodes достигает уровня б Е/мг белка. У всех четырех штаммов до 15 суток идет усиленная секреция белка, т.е. на этом этапе активность растет за счет увеличения количества фермента целлюлазы. Затем секреция белка стабилизируется на одном уровне, следовательно возрастание общей активности происходит за счет усиления деятельности самих ферментов, т.е. растет удельная активность целлюлазы (Рис. 2).

Рис.2. Удельная целлюлазная активность штаммов Lentinus edodes 1- L.4080,2- N 99,3- L.Poot, 4- М 370

13. Развитие и плодоношение штаммов Lentinus edodes.

В результате исследований выявлено, что на первом этапе развития -обрастания субстрата и дифференциации тканей наибольшую скорость роста имеют штаммы L. 4080, М 370 и N 99. Образование плодовых тел у штаммов М 370 и N 99, происходило в большей степени в первую волну, а у штаммов L. 4080 и L. Poot в первую и вторую волну равномерно. Плодовые тела штаммов М 370 и N 99 крупные, одиночные, ножка толстая, шляпка диаметром до 12 см. Штамм L. Poot имеет плодовые тела одиночные, среднего размера. Штамм L. 4080 - разветвленные спорофоры, на одном сростке от 4 до 7 штук среднего размера. Наибольшую продуктивность в наших условиях имели штаммы М370, N99 и L4080. Урожайность составила от 200 до 250 г грибов на 1 кг. субстрата за две волны. Из литературы известно, что различные штаммы L. edodes в промышленных условиях имеют урожайность 200-300 г. на 1 кг субстрата, т.е. выбранные нами штаммы имеют средние показатели урожайности. (Табл. 1)

Таблица 1.

Продуктивность штаммов L. edodes.

Урожайность штаммов Ь. еёоёев Среда дубовые опилки (90%), отруби пшеничные (10 %)

Штамм М370 N99 4080 Poot

Урожайность 1 волны г/кг субстрата 146 163 103 82

Урожайность 2 волны г/кг субстрата 66 82 100 80

Суммарная урожайность (г/ кг) 212 245 203 162

1.4. Сравнительный анализ биохимического состава мицелия и плодовых тел штаммов Ьепйшк ес1ос1ез.

Для определения пищевой и биологической ценности некоторых штаммов L. edodes М 370, N 99, L. 4080, L. Poot был проведен сравнительный анализ общего количества белка, углеводов, аминокислотного состава как в мицелии, так и плодовых телах.

Из результатов, приведенных на рис. 3,4 видно, что мицелий грибов L. edodes штаммов М 370, N 99 и L. 4080 богат белками, составляющими 15% белков от сухого вещества. Исключение составляет штамм L. Poot, который содержит 2,15% белка. В плодовых телах количество белка увеличивается до 20,3% (штамм L. 4080). Штаммы М 370 и N 99 тоже имеют высокое содержание белка 18,1-18,4%. Особенно резкое увеличение содержания белка в плодовых телах относительно мицелия отмечено в штамме L. Poot -14,4%.

25 -

2W

* 20----fx-

i ,5. п» 1 JL |*LjL__

о--M-j-Ё , И , Я , 'as., mJ&-„

12 3 4 5 6 7 8 штаммы L.edodes

Рис. 3 Содержание белка в мицелии и плодовых телах в 4-х

штаммах L. edodes.

1- Мицелий М 370, 2- Плодовое тело М 370, З-Мицелий N99, 4-Плодовое тело N99, 5- Мицелий L. 4080,6- Плодовое тело L. 4080, 7-Мицелий L. Poot, 8-Плодовое тело L. Poot.

На рис. 4 представлены результаты определения содержания

полисахаридов в мицелии и плодовых телах штаммов L. edodes.

10

tiffiFF.

1 2 3 4 5 6 7 штаммы L.edodcs

14,4

Наибольшее количество полисахаридов в мицелии содержит штамм N 99 -50% от сухого вещества. Другие штаммы содержат от 20% до 35%. В плодовых телах полисахаридов значительно больше - от 65 до 84%. 84% полисахаридов содержат плодовые тела штамма N 99. У штамма L. Poot, имеющего обычно более низкие показатели, количество полисахаридов составляет 80%.

А

--ЛЛ -

DH 020

Т-тпг-

4 5

штаммы L. edodes

штаммы L. edodes

Рис. 4 Содержание полисахаридов (А) и свободных Сахаров (Б) в

штаммах L. edodes.

1- Мицелий М 370, 2- Плодовое тело М 370, З-Мицелий N99, 4-Плодовое тело N99, 5- Мицелий L. 4080, 6- Плодовое тело L. 4080, 7-Мицелий L. Poot, 8-Плодовое тело L. Poot.

11

Из результатов, приведенных на рис. 4 видно, что во всех исследуемых штаммах в плодовых телах значительно уменьшилось содержание свободных Сахаров по сравнению с мицелием: от 28,5-39,3 % до 12,0-17,0 %. Наиболее богат свободными сахарами мицелий штамма М 370(39,3%). Повышенное содержание свободных Сахаров в мицелии и снижение их в плодовых телах можно объяснить тем, что свободные сахара являются мономерами для синтеза полисахаридов в плодовых телах.

Биохимический состав, изучаемых нами штаммов согласуется с результатами работ, проведенных Вассером на других штаммах Ь. еёоск«. >

По его данным полисахариды сосредоточены в плодовых телах, а свободные сахара - в мицелии, и процесс органогенеза сопровождается биосинтезом полисахаридов.

Содержание липидов в плодовых телах очень небольшое - 0,081,27%, в мицелии в следовых количествах. Содержание микроэлементов и витаминов незначительно варьирует как между разными штаммами, так и между мицелием и плодовыми телами.

Во всех исследуемых культурах содержание некоторых аминокислот как в мицелии, так и в плодовых телах превосходят норму БАО. По сумме незаменимых аминокислот отличаются высоким содержанием плодовые тела штаммов М 370, N 99, Ь. 4080.

Таблица 2.

Сумма незаменимых аминокислот белков мицелия и плодовых тел Ьепипдо есЫев.

Штамм М 370 N99 Ь.4080 Ь.Роо1

Норма ¥АО М П М П М П М П

40,0 39,2 58,6 35,7 56,2 45,8 57,9 31,2 48,7

М- мицелий, П- плодовое тело.

Как видно, из табл. 2 сумма незаменимых аминокислот в белках плодовых тел во всех 4-х штаммах значительно превосходит сумму незаменимых аминокислот белков мицелия.

Таблица 3.

Коэффициенты биологической ценности и перевариваемое™ белков мицелия и плодовых тел гриба Ь. ескикв

Штамм М 370 N99 L. 4080 L. Poot

П БЦ П БЦ П БЦ П БЦ

Мицелий 1,08 0,90 1,11 0,95 1,00 0,86 0,98 0,98

Плодовые тела 3,40 1,30 4,52 1,40 4,00 1,04 3,32 0,99

Перевариваемость (П) =аргинин+лизин/пролин.

Биологическая ценность (БЦ)=Е незаменимых аминокислот/Е заменимых аминокислот

Как видно из таблицы 3 коэффициент биологической ценности белков мицелия мало отличается у всех 4 штаммов. Что касается белков плодовых тел, то коэффициент биологической ценности выше, чем у мицелия и можно выделить штаммы М 370 и N 99, которые имеют наивысшие коэффициенты 1,3 и 1,4 соответственно.

Известно, что для пищевой ценности белка важным показателем является перевариваемость, которая зависит от соотношения легко- и трудно-гидролизуемых аминокислот, входящих в состав белка. Показатель перевариваемости белков различных штаммов Ь. еёоскв мицелия и плодовых тел представлен в таблице 3. Для примера белок риса имеет показатель близкий к 4,0. соевая мука - 2,1, злаковые культуры — 1,0 и меньше. Как видно из табл. 3 показатель перевариваемости плодовых тел значительно в 3-4 раза выше такого показателя мицелия.

Таким образом, грибной белок имеет довольно высокий показатель перевариваемости и может служить источником пищевого белка.

Отмечено, что в мицелии всех четырех штаммов повышено содержание витамина С по сравнению с плодовыми телами (в 2-3) раза. В то же время содержание витамина А больше в плодовых телах, чем в мицелии (в 4-10 раз). Эта закономерность наблюдается во всех изученных штаммах.

Таблица 4.

Содержание витамина А и С в мицелии и плодовых телах Ь. есЫез.

Штамм М 370 N99 L4080 L. Foot

Витамины мкг/г м П М П М П М П

А 34,40 132,14 22,12 128,18 58,10 114,05 13,80 120,90

С 39,40 14,77 62,25 18,25 68,90 15,28 65,15 24,32

М- мицелий, П- плодовые тела.

1.5. Изменение роста мицелия и развития плодовых тел гриба Ьепйппв е<1о<1е8 при использовании биологически активных веществ.

Проблема состоит в том, что гриб Ь. еёоёев является медленнорастущим, вследствие этого происходит освоение субстрата конкурентной микрофлорой, высыхание субстрата и снижение продуктивности. Поэтому, дальнейшей нашей задачей было исследовать влияние биологически активных веществ на рост, развитие и продуктивность гриба Ь. есЬёев с целью ускорения роста и повышения продуктивности.

При исследовании влияния индукторов и биорегуляторов на гриб Ь. еёоёев была выявлена концентрационная зависимость скорости роста мицелия на агаризованной, жидкой и зерновой средах.

контроль ю10 ю-9 10" 10'7 10* 10'5 10"* 10"3

мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл

концентрация индукторов в среде

Игуммике Яванилин Рис.5 Влияние индукторов на рост мицелия Ьепйпия е<1о<1е8 на

агаризованной среде.

юлряъ ю10 10® Ю-* Ю-7 Ю-6 КГ5 10"4 Ю'3 мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл

ко15. . шММГм»гуляи^х»вереде. мг/мл _г/мл_

В ЭЛИ ШИи*фН1ХИПф1Г

Рис.6 Влияние биорегуляторов на рост мицелия на агаризованной

среде.

Показано, что внесение в среду для культивирования биорегуляторов: эпина(10"7 мг/мл), иммуноцитофита (10"4 мг/мл) и индукторов: ванилина (Ю-* мг/мл) и гуммикса (10"5 мг/мл) дает увеличение скорости роста мицелия: с эпином в 1,5; с иммуноцитофитом в 2; с гуммиксом и ванилином в 1,4 раза. Наибольшая скорость роста на агаризованной среде достигает 0,65 смУсут. в присутствии иммуноцитофита. (Рис. 5,6).

На агаризованной среде был отмечен синергический эффект при совместном влиянии эпина и индукторов: ванилина и гуммикса.

На агаризованной и зерновых средах наилучший эффект был достигнут при совместном влиянии биорегуляторов и индукторов. Стимуляция составила 200%.(Рис.7). Эпин, гуммикс и ванилин в концентрациях 10'5 мг/мл, 10"4 мг/мл, 10"7 мг/мл соответственно вызывают ингибирование роста мицелия.

варианты

Рис.7. Влияние индукторов ванилина и гуммикса и биорегулятора эпина на рост мицелия

На жидких средах отмечено, что стимулирование эпином увеличивает выход биомассы до 0,83 г/л в сутки (против 0,42 г/л в сутки в контрольном варианте); с иммуноцитофитом до 0,93 г/л в сутки, что составляет 220% относительно контроля. (Рис. 8).

концентрация биорегуляторов в среде | аэ>и ■ ЛЛуКЦЛОфП"

Рис.8 Влияние биорегуляторов на накопление биомассы мицелия ЬепНпия еёоёея при 26° С.

Из литературных данных известно, что эпин является не только ростостимулирующим, но и антистрессовым фактором. В производственных условиях выращивания грибов стрессовым фактором часто бывает пониженная температура. При этом рост мицелия замедляется, но при внесении эпина (концентрация 10'7 мг/мл) заметно возрастает и достигает контрольного образца при оптимальной температуре, при этом стимулирование составляет 250%.

1.6. Влияние ростостимулирующих препаратов на активность фермента целлюлазы гриба ЬепИпиз е<1о<1ев.

Результаты, полученные в экспериментах по стимулированию роста мицелия Ь. ейоёея с помощью биорегуляторов и индукторов, позволили нам предположить, что данные биологически активные вещества влияют на активность ферментов лигнолитического комплекса. Одним из таких ферментов является целлюлаза.

А Б

Рис. 9. Изменение удельной активности целлюлазы I» е<1о<1е8 (А) и Р.озЬ'еяйк (Б) под действием биорегуляторов.

1-контроль, 2- эпин, 3-иммуноцитофит.

Из анализа полученных данных видно, что эпин и иммуноцитофит оказали положительный эффект на активизацию работы фермента целлюлазы. Пик максимальной активности целлюлазы уже на 24 день достигает значения 9,3 Е/мг белка с эпином и 10,5 Е/мг белка - с иммуноцитофитом. (Рис. 9.)

Тогда как наибольшая активность в контрольном варианте была зарегистрирована на 27 день и составила 8,2 Е/мг белка, а на 24 день - всего 6,8 Е/мг белка.

Одинаковая закономерность просматривается при действии биологически активных веществ как на медленнорастущий гриб Ь. еёосЬв, так и на быстрорастущий Р. ов^езШв. При этом больший эффект наблюдается при действии биорегуляторов на медленнорастущий гриб.

1.7. Влияние биостимуляторов на продуктивность гриба ЬепНшк

Применение биорегуляторов эпина и иммуноцитофита и индуктора ванилина дало увеличение продуктивности гриба Ь. е<1о(1е8 на 80-100% по сравнению с контролем и также повлияло на более быстрое созревание плодовых тел, отсутствию мелких и недоразвитых.

Таблица 5

Влияние биорегуляторов на рост и урожайность гриба Ьепйпив еёоёсБ.

Урожайность гриба Ь. есЬсЫ г/кг субстрата На дубовых опилках.

контроль эпин Иммуноцитофит Эпин+ ванилин Иммуноцитофит + ванилин Ванилин

Урожайность 1 волны 146 226 268 269 302 210

Урожайность 2 волны 69 125 64 145 120 48

Суммарная урожайность 212 351 332 414 422 258

Таким образом, биорегуляторы влияют не только на вегетативный рост мицелия, но и на органогенез, приводя к существенному увеличению урожайности.

1.8. Влияние биорегуляторов на биохимический состав гриба ЬетШпиз е<1о<1е$.

Из полученных результатов следует, что изменения биохимического состава образцов, выращенных с биорегуляторами незначительные как по общему содержанию полисахаридов, белков, липидов, так и по аминокислотному составу белков (за исключением метионина) мицелия и плодовых тел. Во фракционном составе белков мицелия Ь. е<1ос1е5 немного изменилось соотношение протоплазменных и резервных белков.

Таким образом применение биорегуляторов существенно не повлияло на аминокислотный состав, содержание белков, полисахаридов, микроэлементов и витаминов. Поэтому биорегуляторы эпин, иммуноцигофит, индукторы ванилин и гуммикс могут быть включены в технологию культивирование гриба Ь. ес1ос1е8, для стимулирования роста и повышения продуктивности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Высшие грибы, и особенно ксилотрофные базидиомицеты, стали в последнее десятилетие предметом исследования многих специалистов. Особенности биохимической активности этих грибов позволяют использовать их для получения биологически активных веществ (БАВ). Одним из самых популярных культивируемых грибов в мире является ксилотрофный базидиомицет Ь. е<1ос1е5, или шиитаке. В настоящее время приобладает интенсивная технология выращивания этого гриба, не зависящая от климатических условий, что способствует распространению культуры в самых различных регионах земного шара. Интерес к шиитаке обусловлен не только из-за отличных вкусовых качеств гриба, но,, в первую

очередь, в связи с наличием у него ряда БАВ, положительно влияющих на организм человека и представляющих определенную фармакологическую ценность.

Ь. еёоёев является медленно растущим грибом, поэтому интенсивная технология выращивания этого гриба требует стерилизации субстрата для уничтожения конкурентной микрофлоры. Это приводит к существенному удорожанию конечного продукта - грибов. Кроме того длительность обрастания субстрата различными штаммами гриба колеблется от 40 до 120 •

дней. Поэтому для оптимизации интенсивной технологии выращивания грибов очень важно знать физиологические параметры роста грибов.

В результате сравнительных исследований динамики роста 4 штаммов Ь. еёойев как на агаризованной, так и на жидкой среде были отобраны 3 штамма: М-370, Ь-7080, N-99, обладающих максимальными скоростями роста. Штамм Ь-Роо( резко отставал как на твердой, так и на жидкой средах. В то же время количество белка секректируемого в культуральную жидкость у всех 4 штаммов колебалось в пределах 10%.

Наибольшая целлюлазная активность обнаружена у штамма Ь-4080, наименьшая - у Ь-Роо! Способность к плодоношению у этих штаммов тоже была различной: наибольшая у N-99 - 245 г/кг субстрата, наименьшая — 162 г/кг субстрата у Ь-РскЛ.

л

Изучение биохимического состава мицелия и плодовых тел 4 штаммов Ь. еёойев показало, что плодовые тела у всех штаммов по сравнению с мицелием содержат повышенное количество белка (до 20,3%) ,

и полисахаридов (до 84%), в мицелии отмечено повышенное содержание свободных Сахаров.

Что касается витаминов, то отмечено, что при плодообразовании снижается содержание аскорбиновой кислоты (витамина С), но значительно увеличивается содержание витамина А.

Содержание некоторых аминокислот как в мицелии, так и в плодовых телах превосходит норму РАО. Во всех штаммах отмечено высокое

содержание незаменимых аминокислот, в процентном отношении их содержание выше в плодовых телах по сравнению с мицелием. Коэффициент биологической ценности выше у плодовых тел штаммов М-370 и N-99, а показатель перевариваемое™ выше в 3-4 раза у плодовых тел всех штаммов по сравнению с мицелием. Наиболее высокие значения этого показателя выявлены у штаммов N-99 и L-4080.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что наиболее ценными с биологической точки зрения являются плодовые тела. В них накапливается больше белка, в состав которого входит больше незаменимых аминокислот. Плодовые тела также характеризуются более высоким содержанием полисахаридов, которые обуславливают основной лечебный эффект грибов шиитаке. Следовательно, плодовые тела представляют больший интерес для пищевых и фармакологических целей.

Для технологии промышленного культивирования отобраны 3 штамма: М-370, L-4080 и N-99, имеющие наиболее высокие показатели по скорости роста.

На одном из этих штаммов М-370 были проведены исследования по влиянию БАВ на онтогенез гриба. Были выбраны регуляторы роста эпибрасснолид и им муноцитоф ит и индукторы синтеза ферментов лигнолитического комплекса - ванилин и гуммикс. Введение этих БАВ в среду роста гриба как агаризованную, так и жидкую приводило к ускорению вегетативного роста более, чем в 2 раза. Определены оптимальные концентрации этих БАВ, дающие наибольший эффект. Самое сильное стимулирование роста было получено при сочетании регуляторов роста и индукторов синтеза ферментов. Причем, так же как и ранее на P. ostreatus, на L. edodes наблюдался эффект пролонгированного эффекта. Мицелий, выращенный на первых стадиях с применением БАВ, сохранял высокую скорость роста и давал более высокий урожай плодовых тел. Сочетание БАВ эпина с ванилином и иммуноцитофита с ванилином позволило получить урожай плодовых тел в 2,5-3 раза превышающий контроль. Поскольку БАВ усиливают активность ферментов лигнолитического

комплекса, то мы считаем, что повышение урожайности плодовых тел происходит за счет более активной работы ферментных систем грибной клетки.

Изучение влияния БАВ на биохимический состав грибной клетки не выявило значительных изменений в содержании белков, липидов, полисахаридов и Сахаров. Не найдено также различий в составе аминокислот мицелия и плодовых тел, выращенных в присутствии БАВ и без них.

На основании полученных данных мы считаем целесообразным использование БАВ эпина, иммуноцитофита, ванилина и гуммикса в технологии культивирования медленнорастущего гриба Ь. еёосЫ для повышения скорости его роста и продуктивности.

ВЫВОДЫ.

1. Изучены физиолого-биохимические особенности четырех культивируемых штаммов Ьепйпия ес!ос1е&

Показано, что наибольший ростовой коэффициент имел штамм М 370 (3,4), наименьший - Ь.Роо! (0,3).

Данные биохимических исследований показали, что содержание белка в плодовых телах превышает его количество в мицелии. Наиболее высокая концентрация до 20,5% обнаружена у штамма Ь 4080.

Показано, что плодовые тела отличаются от мицелия повышенным содержанием полисахаридов, наиболее высокое количество этих веществ обнаружено у штамма N 99.

2. Установлено, что мицелий и плодовые тела содержат все незаменимые аминокислоты. Их содержание в плодовых телах выше, чем в мицелии и превышает максимальную норму установленную для съедобных грибов, что обеспечивает их высокую биологическую и питательную ценность.

3. Впервые показано, что в процессе органогенеза Ьепйпив еёоёев наблюдается уменьшение содержания витамина С и увеличение количества витамина А в плодовых телах.

4. Выявлено, что характер секреции белка мицелием в культуральную жидкость и уровень активности целлюлозолитического фермента у медленнорастущего штамма ниже, чем у быстрорастущих, при этом показано, что удельная активность фермента штамма Ь. Роо1 составляет 6 Е/мг. белка, у штаммов М 370, N99, Ь 4080 величина этого показателя колеблется от 8 до 10 Е/мг. белка

5. Впервые показано, что биорегуляторы (иммуноцитофит и эпин) и индукторы (гуммикс и ванилин) оказывают стимулирующее действие на рост мицелия и продуктивность гриба Ьепйпиз еёоскв. При этом наблюдалась стимуляция роста мицелия эпином в 2 раза, иммуноцитофитом в 2,5 раза, гуммиксом и ванилином в 1,4 раза.

6. Впервые выявлен синергический эффект, вызванный совместным действием биорегуляторов и индукторов на рост и продуктивность гриба Ьепй'пиз еёоскв. В частности скорость роста культуры увеличилась до 0,6 см. в сутки, что составило 180% по сравнению с контрольным вариантом.

7. Впервые показано, что комплекс биорегуляторов, включая эпин (10" 7 мг./мл.), иммуноцитофит (10"6 мг./мл.), гуммикс и ванилин (10'5 мг./мл.) увеличивает активность целлюлазы до 10,5 Е/мг. белка, что выше на 40%, чем в контроле.

8. Впервые удалось добиться повышения продуктивности Ь. еёоёез в 2 раза, не за счет модификации состава среды, а вследствие стимулирования ферментов лигнолитического комплекса, в частности целлюлазы.

9. Показано, что введение биорегуляторов в питательную среду не приводит к изменению основных характеристик биохимического состава мицелия и плодовых тел Ь. еёоёев. Не изменились общее количество белков, полисахаридов, витаминов, микроэлементов и аминокислотный состав белков.

10. Биорегуляторы эпин и иммуноцитофит и индукторы ванилин и гуммикс могут быть включены в технологию культивирования гриба Ь. есЫев для стимуляции его роста и повышения продуктивности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Usacheva R.V. The growth regulators influence on the growth and development of Pleurotus ostreatus Fr. Kumm. / R.V. Usacheva, O.A. Evdokimova, V. E. Aksenovskya // Russian academy of sciences, June, 25-30. -Pushchino, 2000.-P.108.

2. Способ стимуляции мицелия Pleurotus ostreatus Fr. Kumm. / P.B. Усачева, O.A. Евдокимова, C.B. Польских, B.E. Аксеновская, Jl.A. Кашапова, B.B. Манешин. // Авторское свидетельство. Патент № 2000102740. Заявл. 03.02.2000.

3. Способ получения посевного материала базидиомицетов. / Р.В. Усачева, O.A. Евдокимова, В.Е. Аксеновская, C.B. Польских. // Авторское свидетельство. Патент №2000 125 942/ 13 Заявл. 12.10.2000.

4. Влияние эпибрассинолида на рост и развитие мицелия Pleurotus ostreatus. / P.B. Усачева, O.A. Евдокимова, C.B. Польских, В.Е. Аксеновская. // Микология и фитопатология. -2002.- Т.36, № 4.- С. 44-46.

5. Усачева Р.В. Влияние биорегулятора иммуноцитофита на рост мицелия древоразрушающих грибов Lentinus edodes и Pleurotus ostreatus и активность фермента целлюлазы. / Р.В. Усачева, O.A. Евдокимова, В.Е. Аксеновская. // Микология и фитопатология. -2002.- Т.34, №6. - С. 158.

6. Усачева Р.В. Влияние биорегуляторов на активность целлюлазы древоразрушающих грибов Pleurotus ostreatus и Lentinus edodes. / P.B. Усачева, O.A. Евдокимова, C.B. Польских. // 1 съезд микологов России. Тез.докл. Современная микология в России. - Москва, 2002,- С. 279.

7. Усачева Р.В. Влияние эпибрассиноида на рост и развитие мицелия гриба Pleurotus ostreatus. Сб. тц. / Р.В. Усачева, O.A. Евдокимова, C.B. Польских //

Актуальные направления стабилизации и развития АПК в XXI веке. -Воронеж, 2001.- С. 114-117.

8. Усачева Р.В. Влияние экстрактов дереворазрушающих грибов Pleurotos ostreatus и Lentinus edodes на имунный статус животных. / Р.В. Усачева, О. А. Евдокимова // Межрегиональный сборник научных работ, посвещенный памяти А.А. Землянухина. ВГУ. -2002.- № 4.- С. 101-104.

9. Усачева Р.В. Биохимический состав грибов Pleurotos ostreatus и Lentinus edodes. / Р.В.Усачева, О.А. Евдокимова, В.Е. Аксеновская. // Сб. тез. ВГУ. Организация и регулирование физиолого-биохимических процессов. -2001.-№ 3.- С. 17

10. Усачева Р.В. Физиолого-биохимическая характеристика четырех штаммов Lentinus edodes. / Р.В. Усачева, О.А. Евдокимова. // Материалы первого всероссийского конгресса по медицинской микологии. -Москва, 2003.- С.317-318.

11. Усачева Р.В. Влияние биорегуляторов на биохимический состав мицелия грибов Pleurotos ostreatus и Lentinus edodes. / Р.В. Усачева, О.А. Евдокимова,С.В. Польских. // Материалы первого всероссийского конгресса по медицинской микологии. -Москва, 2003.- Т.1.- С. 318-319.

12. Усачева Р.В. Влияние экстрактов дереворазрушающих грибов Pleurotos ostreatus и Lentinus edodes на имунный статус животных. / Р.В. Усачева, О.А. Евдокимова, А.Е. Аксеновская. // Первый съезд микологов в России. Тез. Докладов. -Москва, 2002.- С. 258.

Тип. ВГАУ, зак. 450 - 2003 г., т. 100 экз., объем 1,0 п. л

1 9742 ¡

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Усачева, Римма Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. Обзор литературы.v.v.

1.1. Биология дереворазрушающих грибов белой гнили.

1.1.1. Природные субстраты белых гнилей.

1.1.2. Минеральное питание дереворазрушающих грибов.

1.1.3. Разрастание в древесине.

1.1.4. Изменение биохимического состава древесины.

1.1.5. Дыхание древоразрушающих грибов.

1.2. Lentinus edodes (Berk.) Sing: биология, лечебные свойства.

1.2.1. Таксономия.

1.2.2. Морфология.

1.2.3. Естественное местообитание.

1.2.4. Особенности жизненного цикла.

1.2.5. Морфолого-культуральные признаки и физиология.

1.3. Культивирование шиитаке.

1.3.1. Интенсивная технология культивирования шиитаке на опилках.

1.3.2. Субстраты для интенсивного культивирования шиитаке.

1.3.3. Инкубация.

1.3.4. Плодоношение.

1.3.5. Интенсификация технологии культивирования шиитаке методом подбора субстрата.

1.3.6. Оптимизация способа получения плодовых тел Lentinus edodes.

1.3.7. Получение посевного материала.

1.3.8. Интенсификация технологии с применением светового режима и иси использования фитогормонов.

1.4. Функционирование гидролитических экзоферметов дереворазрушающих грибов.

1.5. Особенности жирно-кислотного состава липидов гриба Lentinus edodes.

1.6. Особенности полисахаридного состава грибов.

1.6.1. Биологическая активность хитина.

1.6.2. Полисахарид лентинан - биологически активный компонент гриба Lentinus edodes.

1.7. Биорегуляторы и их действие на грибы.

1.7.1. Брассиностероиды и их действие на растение.

1.7.2. Влияние брассиностероидов на рост и развитие грибов.

1.7.3. Влияние иммуноцитофита на защитные свойства растения.

ГЛАВА II Экспериментальная часть.

2.1. Культуры грибов и условия выращивания.

2.2. Ростовые стимуляторы.

2.3. Подготовка ферментного препарата.

2.4. Определение активности фермента целлюлазы.

2.5. Определение белка по методу Бредфорда.

2.6. Методы определения микроэлементов.

2.6.1. Спектрофотометрический метод определения общего содержания фосфора.

2.6.2. Определение содержания кальция.

2.6.3.Ионометрический метод определения натрия.

2.6.4. Метод определения содержания калия.

2.6.5. Метод определения витамина А.

2.6.6. Метод определения витамина С.

2.7. Хроматографический метод определения аминокислот.

2.8. Определение фракционного состава белков.

2.9. Статистическая обработка.

2.10. Полученные результаты и обсуждение.

2.10.1. Изучение физиолого-биохимических характеристик четырех штаммов Lentinus edodes.

2.10.1.1. Рост Lentinus edodes на агаризованной среде.

2.10.1.2. Рост и сравнительный анализ штаммов Lentinus edodes: М370, N99, L 4080, L. poot при культивировании в жидкой среде.

2.10.1.3. Целлюлозолитическая активность штаммов Lentinus edodes: М370, N99, L. 4080, L. poot.

2.10.1.4. Развитие и плодоношение штаммов Lentinus edodes.

2.10.1.5. Сравнение биохимического состава мицелия и плодовых тел Lentinus edodes.

2.10.1.6. Изучение аминокислотного и фракционного состава мицелия и плодовых тел Lentinus edodes.

2.10.1.7. Фракционный состав белков.

2.10.2. Влияние биологически активных веществ на рост мицелия и развитие плодовых тел гриба Lentinus edodes.

2.10.2.1. Действие биорегуляторов на рост мицелия Lentinus edodes на агаризованной среде.

2.10.2.2. Влияние индуктора ванилина и гуммикса на рост мицелия Lentinus edodes.

2.10.2.3. Совместное влияние индукторов ванилина, гуммикса и биорегуляторов эпина и иммуноцитофита на рост мицелия Lentinus edodes на агаризованной среде.

2.10.2.4. Влияние индуктора гуммикса и биорегуляторов эпина и иммуноцитофита на рост мицелия Lentinus edodes.

2.10.2.5. Влияние биорегуляторов на рост мицелия в жидкой среде.

2.10.2.6. Действие биорегуляторов на рост мицелия при пониженной температуре.

2.10.2.7. Действие биорегуляторов на рост гриба Lentinus edodes при культивировании на зерновом субстрате. Изучение скорости роста мицелия на разных видах зерна.

2.10.2.8. Пролонгированное действие биорегуляторов на рост мицелия Lentinus edodes на пшенице.

2.10.2.9. Влияние ростостимулирующих препаратов на активность фермента целлюлазы. Влияние эпина на активность целлюлазы.

2.10.2.10. Влияние иммуноцитофита на активность целлюлазы.

2.10.2.11. Модельный опыт.V.

2.10.2.12. Влияние биорегуляторов на развитие и продуктивность гриба Len-tinus edodes.

2.10.2.13. Сравнительный анализ влияния биорегуляторов на рост и раз витие медленнорастущего гриба Lentinus edodes и быстрорастущего Pleurotus ostreatus.

2.10.2.14. Сравнительный анализ изменения целлюлазной активности под влиянием биорегуляторов у грибов Lentinus edodes и Pleurotus ostreatus.

2.10.2.15.Влияние бирегуляторов на биохимический состав гриба Lentinus edodes.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиолого-биохимические особенности некоторых штаммов культивируемого гриба Lentinus edodes. (Berk. Sing.)"

Актуальность проблемы.

Современное грибоводство имеет отчетливую тенденцию к предпочтению культивирования экзотических грибов, обладающих природными биологически-активными комплексами и лечебными свойствами. Создание лечебно-профилактических препаратов, сочетающих в себе безвредность пищевого продукта с высокой биологической активностью, является актуальной задачей биотехнологии. Одним из наиболее предпочтительных для этой цели объектов с нашей точки зрения являются высшие базидиальные грибы рода Lentinus Fr., сочетающие в себе высокую питательную ценность, биологическую активность (иммуномоделирующую, онкостатическую, антихолестериновую, антивирусную и др), а так же отсутствие токсичности.

Однако гриб L. edodes является медленнорастущим, в следствии этого происходит освоение субстрата конкурентной микрофлорой, высыхание и снижение продуктивности. Поэтому необходимо изучение его физиологических особенностей для разработки технологии ускоренного развития и повышения продуктивности. Так же недостаточно изучены его биохимические особенности и питательная ценность. Научная новизна.

Изучены ростовые характеристики и целлюлозолитическая активность 4 штаммов Lentinus edodes на разных средах, в результате выявлены быстрорастущие технологичные штаммы. Изучение биохимического состава мицелия и плодовых тел четырех штаммов Lentinus edodes показало, высокую пищевую и биологическую ценность гриба, высокое содержание белка и полисахаридов, сбалансированный аминокислотный состав, особенно в плодовых телах Изучено влияние биорегуляторов на рост и продуктивность гриба L. edodes и показано их стимулирующее действие на вегетативный рост мицелия и образование плодовых тел.

Практическая значимость.

На основании проведенных исследований отобраны перспективные штаммы гриба L. edodes.

Интенсивное культивирование гриба L edodes на основе применения биорегуляторов позволило сократить цикл развития в 1,5-2,0 раза и в 2-3 раза повысить продуктивность. Проведены технологические испытания в опытном цехе ВГАУ. Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Охарактеризованы наиболее перспективные по физиолого-биохимическим показателям штаммы L. edodes

2. Плодовые тела отличаются от мицелия повышенным содержанием полисахаридов, белков, имеют сбалансированный аминокислотный состав, что обеспечивает высокую биологическую и пищевую ценность.

3. Биорегуляторы: эпин, иммуноцитофит и индукторы: ванилин и гуммикс стимулируют процесс роста мицелия (в 1,5-2 раза), активизируют целлюлазолитические ферменты (в 1,4 раза) и способствуют повышению продуктивности гриба в раза.

4. Введение биорегуляторов в питательную среду не влияет на основные биохимические показатели гриба.

5. Биорегуляторы: эпин, иммуноцитофит и индукторы: ванилин и гуммикс могут быть включены в технологию культивирования гриба L. edodes для стимулирования его роста и повышения продуктивности.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на научной сесси ВГАУ (2001, 2002, 2003 г.), L студенческой научной конференции (Воронеж 1999г), научной конференции посвященной памяти А. А. Землянухина (г. Воронеж 2000г). Результаты работы были представлены на всесоюзном симпозиуме посвященному современным проблемам в микробиологии и биотехнологии (г. Пущино 2000г), LI студенческой научной конференции (г. Воронеж 2000 г.), научной конференции посвященной памяти А. А. Землянухина (г. Воронеж 2001 г), LII студенческой научной конференции (г. Воронеж 2001г.), I съезде микологов России посвященным проблемам современной микологии в России (г. Москва 2002 г.), на научной конференции посвященной памяти А.А. Землянухина (г. Воронеж 2002 г.), ж. Микология и фитопатология № 4, 2002 г., №6 2002 г. Публикации.

Основные результаты исследований опубликованы в 13 печатных работах, в том числе в 2 авторских свидетельствах. Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 126 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных глав, выводов, списка литературы, который включает 170 наименований. Работа иллюстрирована 19 рисунками, содержит 16 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Усачева, Римма Васильевна

выводы.

1. Изучены физиолого-биохимические особенности четырех культивируемых штаммов Lentinus edodes. Показано, что наибольший ростовой коэффициент имел штамм М 370 (3,4), наименьший — L.Poot (0,3).

Данные биохимических исследований показали, что содержание белка в плодовых телах превышает его количество в мицелии. Наиболее высокое количество до 20,5% обнаружено у штамма L 4080.

Показано, что плодовые тела отличаются от мицелия повышенным содержанием полисахаридов, наиболее высокое количество этих веществ обнаружено у штамма N 99.

2. Установлено, что мицелий и плодовые тела содержат все незаменимые аминокислоты. Их содержание в плодовых телах выше, чем в мицелии и превышает норму FAO, что обеспечивает высокую биологическую и питательную ценность.

3. Впервые показано, что в процессе органогенеза Lentinus edodes идет уменьшение содержания витамина С и увеличение количества витамина А в плодовых телах.

4. Выявлено, что характер секреции белка мицелием в культурапьную жидкость и уровень активности целлюлозолитического фермента у медленнорастущего штамма ниже, чем у быстрорастущих, при этом показано, что удельная активность фермента штамма L. Poot составляет 6 Е/мг. белка, у штаммов М 370, N99, L 4080 величина этого показателя колеблется от 8 до 10 Е/мг. белка

5. Впервые показано, что биорегуляторы (иммуноцитофит и эпин) и индукторы (гуммикс и ванилин) оказывают стимулирующее действие на рост мицелия и продуктивность гриба Lentinus edodes. При этом наблюдалась стимуляция роста мицелия эпином в 2 раза, иммуноцитофитом в 2,5 раза, гуммиксом и ванилином в 1,4 раза.

6. Впервые выявлен синергический эффект, вызванный совместным действием биорегуляторов и индукторов на рост и продуктивность гриба

Ill

Lentinus edodes. В частности скорость роста культуры увеличилась до 0,6 см. в сутки, что составило 180% по сравнению с контрольным вариантом.

7. Впервые показано, что комплекс биорегуляторов, включая эпин (10" 7 мг./мл.), иммуноцитофит (10"6 мг./мл.), гуммикс и ванилин (10"5 мг./мл.) увеличивает активность целлюлазы до 10,5 Е/мг. белка, что выше на 40%, чем в контроле.

8. Впервые удалось добиться повышения продуктивности L. edodes в 2 раза, не за счет модификации состава среды, а вследствие стимулирования ферментов лигнолитического крмплекса, в частности целлюлазы.

9. Показано, что введение биорегуляторов в питательную среду не приводит к изменению основных характеристик биохимического состава мицелия и плодовых тел L. edodes. Не изменились общее количество белков, полисахаридов, витаминов, микроэлементов и аминокислотный состав белков.

10. Биорегуляторы эпин и иммуноцитиофит и индукторы ванилин и гуммикс могут быть включены в технологию культивирования гриба L. edodes для стимуляции его роста и повышения продуктивности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Высшие грибы, и особенно ксилотрофные базидиомицеты, стали в последнее десятилетие предметом исследования многих специалистов. Особенности биохимической активности этих грибов позволяют использовать их для получения биологически активных веществ (БАВ). Одним из самых популярных культивируемых грибов в мире является ксилотрофный базидиомицет L. edodes, или шиитаке. В настоящее время приобладает интенсивная технология выращивания этого гриба, не зависящая от климатических условий, что способствует распространению культуры в самых различных регионах земного шара. Интерес к шиитаке обусловлен не только из-за отличных вкусовых качеств гриба, но в первую очередь в связи с наличием у него ряда БАВ, положительно влияющих на организм человека и представляющих определенную фармакологическую ценность.

L. edodes является медленно растущим грибом, поэтому интенсивная технология выращивания этого гриба требует стерилизации субстрата для уничтожения конкурентной микрофлоры. Это приводит к существенному удорожанию конечного продукта — грибов. Кроме того длительность обрастания субстрата различными штаммами гриба колеблется от 40 до 120 дней. Поэтому для оптимизации интенсивной технологии выращивания грибов очень важно знать физиологические параметры роста грибов.

Целью настоящей работы явилось изучение физиологических параметров роста и продуктивности 4 штаммов L. edodes для определения наиболее технологичного штамма. Кроме того необходимо было изучить целлюлозолитическую активность, биохимический состав этих штаммов, пищевую ценность мицелия и плодовых тел. Одной из задач данной работы было изучить влияние БАВ на онтогенез гриба с целью ускорения роста и повышения продуктивности. Для этого были использованы различные стимуляторы и регуляторы роста, применяемые на растениях.

В результате сравнительных исследований динамики роста 4 штаммов L. edodes как на агаризованной, так и на жидкой среде были отобраны 3 штамма: М-370, L-7080, N-99, обладающих максимальными скоростями роста. Штамм L-Poot резко отставал как на твердой, так и на жидкой среде. В то же время количество секрктируемого в культуральную жидкость белка у всех 4 штаммов колебалось в пределах 10%.

Наибольшая целлюлазная активность обнаружена у штамма L-4080, наименьшая - у L-Poot. Способность к плодоношению у этих штаммов тоже была различной: наибольшая у N-99 - 245 г/кг субстрата, наименьшая - 162 г/кг субстрата у L-Poot.

Изучение биохимического состава мицелия и плодовых тел 4 штаммов L. edodes показало, что плодовые тела у всех штаммов по сравнению с мицелием содержат повышенное количество белка (до 20 %) и полисахаридов (до 84 %), в мицелии отмечено повышенное содержание свободных Сахаров.

Что касается витаминов, то отмечено, что при плодообразовании снижается содержание аскорутиновой кислоты (витамина С), но значительно увеличивается содержание витамина А.

Содержание некоторых аминокислот как в мицелии, так и в плодовых телах превосходит норму FAO. Во всех штаммах отмечено высокое содержание незаменимых аминокислот, в процентном отношении их содержание выше в плодовых телах по сравнению с мицелием. Коэффициент биологической ценности выше у плодовых тел штаммов М-370 и N-99, а показатель перевариваемости выше в 3-4 раза у плодовых тел всех штаммов по сравнению с мицелием, наиболее высокие показатели у штаама N-99 и L-4080.

Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что наиболее ценными с биологической точки зрения являются плодовые тела. В них накапливается больше белка, в состав которого входит больше незаменимых аминокислот. Плодовые тела также содержат больше полисахаридов, которые обуславливают основной лечебный эффект грибов шиитаке. Следовательно, плодовые тела представляют больший интерес для пищевых и фармакологических целей.

Для технологии культивирования отобраны 3 штамма: М-370, L-4080 и N-99, имеющие наиболее высокие показатели по скорости роста.

На одном из этих штаммов М-370 были проведены исследования по влиянию БАВ на онтогенез гриба. Были выбраны регуляторы роста эпибрасснолид и иммуноцитофит и индукторы синтеза ферментов лигнолитического комплекса - ванилин и гуммикс. Введение этих БАВ в среду роста гриба как агаризованную, так и жидкую приводило к ускорению вегетативного роста более, ■ чем в 2 раза. Определены оптимальные концентрации этих БАВ, дающие наибольший эффект. Самое сильное стимулирование роста было получено при сочетании регуляторов роста и индукторов синтеза ферментов. Причем, так же как и ранее на P. ostreatus, на L. edodes наблюдался эффект пролонгированного эффекта. Мицелий, выращенный на первых стадиях с применением БАВ сохранял высокую скорость роста и давал более высокий урожай плодовых тел. Сочетание БАВ эпина с ванилином и иммуноцитофита с ванилином позволило получить урожай плодовых тел в 2,5-3 раза превышающий контроль. Поскольку БАВ усиливают активность ферментов лигнолитического комплекса, то мы считаем, что повышение урожайности плодовых тел происходит за счет более активной работы ферментных систем грибной клетки.

Изучение влияния БАВ на биохимический состав грибной клетки не выявило значительных изменений в содержании белков, липидов, полисахаридов и Сахаров. Не выявлено также различий в составе аминокислот мицелия и плодовых тел, выращенных в присутствии БАВ и без них.

На основании полученных данных мы считаем целесообразным использование БАВ эпина, иммуноцитофита, ванилина и гуммикса в технологии культивирования медленнорастущего гриба L. edodes для повышения скорости роста и продуктивности.

110

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Усачева, Римма Васильевна, Воронеж

1. Получение плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes / Е.А. Александрова, JI.A. Завьялова, В.М. Терешина, J1.B. Гарибова, Е.П. Феофилова. (Berk.) sing. // Микология и фитопатология. -1994,- Т. 28, № 3. -С. 34-39.

2. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях./ А.Р. Воробьев, И.П. Ашмарин // Гос. Изд-во мед.лит. -Санкт-Петербург, 1962.- С. 365.

3. Белова Н.В. Базидиомицеты источники биологически активных веществ / Н.В. Белова. // Растительные ресурсы. -1991.- №.2. - С.8-17.

4. Бисько Н.А.,. Биология и культивирование съедобных грибов рода Вешенка. / Н.А. Бисько, И.А. Дудка. // Наукова думка. -Киев, 1987.- С. 148.

5. Бисько Н.А., Физиологические и медикобиологические аспекты исследований гриба Lentinus edodes (Berk.) Sing. / Н.А. Бисько, Н.Ю. Митропольская. // 1съезд микологов.: " Современная микология в России". — Москва, 2002. С.277-278.

6. Бокебаева Г.А. Защитное действие брассиностероидов на листья ячменя при солевом стрессе. / Г.А. Бокебаева. // Тр. XX науч. Конф. Молодых ученых « Проблемы современной биологии». -Москва, 1986. С. 52-53.

7. Бурханова Э.А. и др. Действие брассиностероидов на синтез белка листьев пшеницы при нормальной температуре и тепловом шоке / Э.А. Бурханова. // П Совещ. по брассиностероидам. Минск, 1991.- С. 25-26.

8. Бухайло А.С. Внешние съедобные базидиомицеты в чистой культуре. /. А.С. Бухайло. // -Киев: Наук, думка, 1988.- С. 144.

9. Стероидные гликозиды — перспективные средства защита растений / А.П. Волынцев, С.Э. Кароза, В.П. Шуканов.// 111 Междунар. конф.: "Регуляторы роста и развития растений". Москва, 1995. -С. 189-191.

10. Волынец А.П. К механизму действия брассиностероидов на растения / А.П. Волынец, В.А. Хрипач. // Симпоз. "Брассистероидыбиорациональные, экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений Минск, 1993. - С. 5-7.

11. Биология Lentinus edodes. / JI.B. Гарибова, JI.А. Завьялова, Е.А. Алексанрова, В.Е. Никитина // Микология и фитопаталогия. -1999.- Т.ЗЗ., №2.-С. 107-110.

12. Гарибова JI.B. Морфология и физиология чистых культур: вегетативная стадия базидиомы Lentinus edodes (Berk) Sing. / JI.B. Гарибова, JI.A. Завьялова. //1 съезд микологов :" Современная микология в России". -Москва, 2002.- С. 279-280.

13. Выделение и свойства лакказы из базидиального гриба Coriolus birsitus ( fr. Quell. / A.JI. Гиндис, E.O. Жажина, Ю.А. Баринов и др. // Биохимия. -1998.- Т. 53, № 5. С. 735-739.

14. Горовой Л.Ф. Влияние света на морфогенез шляпочных грибов. -Киев, 1989.- С. 44.

15. Генетическая детерминация реакции растений пшеницы на воздействие брассиностероидвми / В.П. Деева, Ж.Э. Мазец, Л.В. Хотылева // 111 Междунар. конф.: " Регуляторы роста и развития растений." Москва, 1995.- С. 61-63.

16. Денисова Н.П. Природа и биологическая роль протеиназ базидиальных грибов. Н.П. Денисова // Физиология и биохимия растений. -1984.-Т. 18, №2.-С. 116-121.

17. Денисова Н.П. Протеиназы высших базидиомицетов. / Н.П. Денисова // Микология и фитопатология. -1990.- Т. 24. № 6, С. 478-484.

18. Дубинская A.M. Химфарм. / A.M. Дубинская, А.Е. Добротворский // Ш. -1991.- Т. 25, № 8. С. 623-630.

19. Дудка И.А. Грибы. Справочник миколога и грибника. /Дудка И.А., С.П. Вассер // -Киев: Наукова думка, -1987.- С. 536.

20. Кайминь И.Ф. Производство и применение хитина и хитозина. / И.Ф. Кайминь, Г. Озолиня. // -Москва. Изд-во ВНИРО, -1995.- С. 55-56.

21. Брассиностероиды изменяют метаболизм белков и жиров люпина / O.JI. Канделинская, С.А. Бушуева, Е.Р. Уральская и др. // 11 Совещ. По брассиностероидам. Минск, 1991 .-С. 33-35.

22. Капич А.Н. Антиоксидантные свойства дереворазрушающих базидиомицетов. / А.Н. Капич, JI.H. Шишкина // Микология и фитопатология. -1992.- Т. 26, № 6. С. 486-491.

23. Содержание липидов в мицелии дереворазрушающих базидиомицетов и их жирнокислотный состав. / А.Н. Капич, Е.С. Романовец, С.П. Войт. // Микология и фитопатология. -1990.- Т. 24, №.1. С. 51-56.

24. Караваева А.В. Микология и фитопатология. / А.В. Караваева, М.А. Кашнина // -1994,- Т.28, №6. С.76-85.

25. Природные и синтетические регуляторы онтогенеза растений. /В.И. Кефели, П.В. Влассов, Л.Д. Прусакова и др. // -Москва. ВИНИТИ, сер. Физиологич растений. -1990. Т.7. - С. 157.

26. Кислин Е.Н. Влияние брассиностероидов на эндогенный уровень цитокининов в листьях ячменя / Е.Н. Кислин, Семичева Т.В. // 11 Совещ. По брассиностероидам. Минск, 1991. - С. 26-27.

27. Клесов А.А. Гидролиз микрокристаллической целлюлазы под действием полиферментных целлюлазных комплексов различного происходления. А.А. Клесов, И.В. Чурилова. // Биохимия. 1982.- Т.47, № 3. -С. 409-418.

28. Ковганко Н.В. Брассиностероиды в растительном мире. / Н.В. Ковганко // Химия природных соединений. 1991.- № 2. - С. 159-166.

29. Влияние условий освещения на развития мицелия и плодовых тел вешенки / Н.С. Клюшкина, Н.П. Чевардова, Е.А. Харитонова, Е.В. Бабаева. // Микроорганизмы в искусственных системах. -Новосибирск. Наука, 1985.- С. 151-154.

30. Ковганко Н.В. Брассиностероиды в растительном мире / Н.В. Ковганко. // Химия природных соединений.- 1991. № 2.-С. 159-166.

31. Кюринер М. Определение содержания клетчатки в растительных остатках. / М. Кюринер, Ганек И. // Методы биохимических анализов. -Москва, 1974.-С. 15-17.

32. Новый тип углевод-углеводного взаимодействия. / Е.В. Михальчик, С.Д. Шиян, Н.В. Бовин. // Доклад АН. -1997.- Т.354, №2. С.261-264.

33. Михайлова Н.В. Липиды высших грибов и их жирно-кислотный состав при различных экологических условиях. / Н.В. Михайлова. // Автореферат. Диссс. Канд. Биолог. Наук. -Днепропетровск, 1990. С. 16.

34. Аминокислотный и фракционный состав белков грибного происхождения. / О.П. Низковская, Олешко, В.Г. Бабицкая. // Микология и фитопатология. -1991.- Т.25, С. 233-239.

35. Низовская О.П. Противоопухолевые свойства высших базидиомицетов./ О.П. Низовская. // Микология и фитопатология. 1983.- Т. 17, № 3, - С. 243-247.

36. Никитина В.Е. Изучение лектиновой активности Lentinus edodes. / В.Е. Никитина, О.М. Цивилева. //1 съезд микологов в России: " Современная микология в Россия". Москва, 2002.- С, 284.

37. Никитина Е.В. Лакказная и пероксидазная активность некоторых штаммов Lentinus edodes / Е.В. Никитина, О.М. Цивилева // I съезд микологов в России". -Москва, 2002.- С. 284.

38. Олешко. Фракционный состав белков грибного происхождения / Олешко, Бабицкая. // Микология и фитопоталогия. -1991.- Т 19 С. 317-321.

39. Плешков Б.П. Методы биохимического анализа растений. / Б.П. Плешков // -Москва, 1985.- С.256.

40. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. / Б.П. Плешков. // Москва, Агропромиздат.- 1985.- С.255.

41. Прусакова Л.Д. Роль брассиностероидов в росте, устойчивости и продуктивности растений. / Л.Д. Прусакова, С.И. Чижова. // Агрохимия. -1996. -№ 11.-С. 137-150.

42. Влияние брассиностероидов на рост и продуктивность зерновых злаковых культур. / Л.Д. Прусакова, С.И. Чижова, И.А. Хрипач и др. // Экологические аспекты регуляции роста и продуктивности растений. -Ярославль, 1991.- С. 266-232.

43. Прусакова Л.Д. Биологическая активность эпи- и гомобрасинолидов и их влияние на продуктивность пшеницы и ячменя. / Л.Д. Прусакова, С.И. Чижова. // 11 Совещ. По брассиностероидам. — Минск, 1991.- С.37-39.

44. Прусакова Л.Д. Нового типа регуляторы роста и развития растений. / Л.Д. Прусакова, С.И. Чижова. // Рабочее совещ. " Регуляторы роста и развития растений." Москва, 1991. - С. 49-53.

45. Савельева Е.А. Применение брассиностероидов на посадках картофеля. /Е.А. Савельева, И.И. Карась. // IV конф. «Брассиностероиды -биорациональные, экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений». Минск, 1995. -С. 21-22.

46. Соломко Э.Ф. Перспективы. использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности / Э.Ф. Соломко, И.А. Дудка. // Обзорная информация ВНИИ СЭНТИ. -Москва, 1989.- С.48.

47. Тишенков А.Д. Культивирование шиитаке. / А.Д. Тишенков. // Школа грибоводства, -2000.- №1. -С. 6-10.

48. Производство и применение хитина и хитозина. / C.JI. Тютерев, М.С. Якубчик, С.А. Тарлаковский . // -Москва: Изд-во ВНИРО, 1995. С. 5557.

49. Усов А. И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул в растениях. / А.И. Усов. // Усп. химии. -1993.- Т.62, №11. - С. 1119-1144.

50. Федоров Н.И. Целлюлозолитическая активность Armillariella melea (Fr.) Karts. / Н.И. Федоров, С.В. Бадяй // Прикладная биохимия и микробиология. 1983. -Т.9, №3.-С. 408-412.

51. Полиаминосахариды мицелиальных грибов: новые биотехнологии и перспективы практического использования. / Е.П. Феофилова, Д.В. Немцев, В.М. Терешина, В.П. Козлов. // Прикладная биохимия и микробиология, -1996, Т. 32, №5. -с. 483-492.

52. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов. / Е.П. Феофилов // Прикладная биохимия и микробиология. -1998.- Т.34, № 6. С. 597-608.

53. Липидный состав плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes ( Berk.) Sing. / Е.П. Феофилова, И.Б. Горнова, А.С. Меморская, Л. В. Гарибова. // Микробиология. 1998.- Т. 67, № 5.- С. 655-659.

54. Изменение в липидном составе клеток грибов в хематоксонометрии. / Е.П. Феофилова, М.В. Михайлова, Г.Г. Шумекая, В.М. Терешина, Л.В. Гарибова. // Микология и фитопатология. -1991.- Т. 25, № 4.- С. 348-359.

55. Фомина В.И. О возможности культивирования гриба L. edodes. / В.И. Фомина, А.В. Лысенкова. // Растительные ресурсы. -1989.- № 4. С. 588593.

56. Брассиностероиды. / В.А. Хрипач, В.Н. Жабинский, Ф.А. Лахвич. // -Минск: Наука и техника. -1993. С. 287.

57. Перспектива практического применения брассиностероидов — нового класса фитогормонов. / В.А. Хрипач, В.Н. Жабинский, Ф.А. Лихвач. // С.-х. биология. 1995. - № 1.- С. 3-9.

58. Chem Pharm. / J. Adchi, N. Ohno, M. Ohsava. // Bull.-1990.- V. 38, № 2.- p. 477-482.

59. Ander P. The importance of phenol oxidase activity in lignin degradation by the white-rot fungus. Sporotrichum pulverulentum. / P. Ander, К. E. Eriksson // Arch. Microbiol. -1976.- V.109, № 1.- P. 1-8.

60. Agric. / Y. Asada, M. Miyabe, M. Kikkawa, and M. Kuwahara. // Biol. Chem.-1986.-P.525-529.

61. Assmann S.M. Cyclic AMP as a Second Messenger in Higher Plants. Status and Future Prospects. / S.M. Assmann. // Plant Physiol. -1995.- V. 108. -P. 885-889.

62. Hemagglutinating activiti in extract of mycelia from submerged mushroom cultures. / P.C. Banerjiie, A.K. Ghosh, S. Sendupta. // Appl. Environ. Microbiol. -1982.- V.44, N 4. -P. 1009-1011.

63. Brown E.G. Cyclic AMP and Higher Plants. / E.G. Brown, R.P. Newton. // Phytochemistry. -1981.- V. 20. -P. 2453-2463.

64. Braatz J.A. A rapid and effeicient method for the isolation of proteins from polyacrylamide gels. / J.A. Braatz, K.R. Mclntire // Prep. Biochem. -1977.-V. 7, № 6. -P. 495-509.

65. Chang C. The Two-Component Sydtem. Regulation of Diverse Signaling Pathways in Prokaryotes and Eukaryotes / C. Chang, R.C. Stewart. // Plant Physiol. -1998.- V. 117. -P. 723-731. .

66. Chang С. The Ethyleme Hormone Response in Arabiodopsis: A Eukaryotic Tow-Component Signaling System. / C. Chang, E.M. Meyerowitz. // Proc. Natl. Acad. Sci. -USA, 1995.- V. 92. -P. 4129-4133.

67. Coquoz J.L. et al. Arachidonic Acid Synthesis of Salicylic Acid. / J.L. Coquoz et al. // Biochemistry and Cell Biology. -1995.- V. 85. P. 1219-1224.

68. The use of cotton seed hulls for the cultivation of Pleurotus ostreatus sajor-caju in Australia. / K.Y. Cho, N.G. Nair, H.F. Bruniges, P.B. New. // Mushroom Sci. -1981.- N 11.- P. 679-690.

69. J. Biomed Mat. Res. / L.J. Chung, R.J. Schimidt, P. Hamlyn, R. Sagar. // -1997.- V. 28., N4. P. 463-469.

70. Biotechnol. Bioeng. / C. Crestini, B. Kovas, K. Giovannozi Sermanni. // -1996.- V. 50. N. 2.- P.207-210.

71. Interaction of Myoinositiol Triphosophatephytase Complex "with theл,

72. Receptor for Intracellular Ca Mobilization in Plants. / S. Dasgupta, D. Dasgupta, M. Sen, S. Biswas, B.B. Biswas. // Biochtmistry. -1996.- V. 35. P. 4994-5001.

73. Davies J.S. Purification of some tricarboxylic acid enzymes from beef heart using affinity elution chromatography. / J.S. Davies, R.H. Scoper. // Anal. Biochem. -1981.- V. 114, № 1. P. 19-27.

74. Dixon B. Cyclic AMP and Higher Plants. / B. Dixon. // Biotechnology. -1995.- V. 13, N. l.-P. 120-121.

75. Metabolism of leukotriens. / S. Demlieither, J. Kraus, G. Franz. //. Carb. Res. -1992.- V. 226, №. 2. P. 239-245ю

76. Biosci. Biotech. / K. Kenchi, O. Kananuchi, J. Jmasato, E. Kobayashi. // Biohem. 1994.- V. 58, N 9. - P. 1613-1618.

77. Drew S.W. et al. Chemicals foodstocks and fuel from lignin. / S.W. Drew et al. // AICHE Symp. Ser. -1978. -V. 74, N 181. -P.21-25.

78. Eriksson K.E. Advances in microbial delignification. / K.E. Eriksson. // Biotechnol. Adv. -1984. V.2, N 2. P. 149-160.

79. Evans C.S. Biodegradation Natural and Synthetic Materials. / C.S. Evans // Eds W. B. Betts. Springer-Verlag. -1991. P. 174.

80. Jnt Cont on Brassinosteroids:Abstracts. / J. Gartz, G. Adam, H. Vorbrodt. -1990. 8.p.

81. Inducing effect of brassinosteroid on the growth of mycelium culture Psilocybe cubensis./ J. Garts, J. Adam, F.M. Vorbrodt. // J. basic. Microbiol.-1989.-V. 29.-P. 347-352.

82. Brassinolide A plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen. / M.D. Grove, G.F. Spencer, W.K. Rohweder et al. // Nature (L-).- 1979.-V. 281.-P. 216-220.

83. Hakomori S. Carbogidrate-carbogidrate interaction. / S. Hakomori // Pure Appe. Chem. -1991. V.63, N4. P.473-482.

84. Chitin in Nature and Technology / R. Muzzarelli, C. Jenniaux, G.N. Gooday. London: Plenum Pres. - 1986. - P. 583.

85. Characterization of Hepta-Beta-Glucoside-binding Proteins in Soybean. / M.G. Hang, J.J Cheong, R. Alba, F. Cote. // Biochem Soc. Symp. -1994.- V. 60. -P. 101-112.

86. Metabolism of leukotriens. / S. Hammarstrom, L. Oring, K. Bernstrom // Mol. Biol. And Biochem. -1985.- V. 69. P.7.

87. Hamada K. Brassinolode in crop cultivation. / K. Hamada // Int. Plant Growth Regulatore in Agriculture FFTC. Book series FFTC.- 1986.- N 34. -P. 190-195.

88. Hammerschidt R. Lignification as a mechanism for induced systemic resistance in cucumber. / R. Hammerschidt, J. Kuc. // Physiological Plant Pathology. -1982.- V. 20. P. 61-71.

89. Brassinolide action on regulation of plant growth. / K. Hirai, S. Fujii, K. Honjo // Jap. J. Corp. Sci.-1991.- Vol. 60, N 1. P. 29-36.

90. Hill C.S. Transcriptional Regulation by Extracellular Signals: Mechanism and Specificity. / C.S. Hill ,R. Treisman. // Cell. -1995.- V. 80. P. 199-212.

91. Intracellular proteinases in microrganisms. / H. Holzer, H. Betz, E. Ebner. // Curr. Top. Cell. Regul. -1975.- V. 9. -P. 103-156.

92. Hunter Т. Protein Kinases and Phosphatases: the Yin and Signaling / T. Hunter//Cell. -1995.-V. 80. P.225-236.

93. Ingledew W.J. The Respirftory Chains of Escherichia coli. / W.J. Ingledew, R.K. Poole. // Microbiol. -1984.- P. 48-50.

94. Jamamura J. Abstr. Proc. IX -th Inter. / J. Jamamura, K. Cochran, // Congr. Cultuv. Edible Fungi. -Tokyo, 1974.- 262 p.

95. Jang Q. J., A guick and efficient method of making mushroom spawn. / Q.J. Jang, S.C. Jang. // Musnroom Sci. -1989.- V. 12. P. 631-643.

96. Physiology of wood-rotting Basidiomycetes. 1. Growth and nutrition in submerged culture in synthetic media. / M. Jennison, M. Newcomb, R. Htnderson . // Mycolodia. 1995.- V. 47. - P. 275-304.

97. Jenneth M. Detesting brassinosteroides in plant tissues. / M. Jenneth. // Meeting Society of Plant Physiology. -1994.-P. 140-149.

98. Aur Biol. Chem. / M. Kakuta, J. Sone, T. Umeda, et al., 1979.- 112 p.

99. Kavats K. Et al. Cytology of enduced systemic resistance of cu pcumber to Colletorichum lagenarium. / K. Kavats Et al. // Plant. -1991.- V. 183.p. 484-490.

100. Karlson P. Kurzes Lehrbuch der Bichtmie, 12 Aufl. / P. Karlson. // Georg Thieme Verlag, Stuttgart.- New York, 1984.-T 12.-P.25-32.

101. Metabolism of leukotriens. / K. Kifime, J. Jamaguchi, S. Kishimoto. //Trans. Soc. Biomat. -1988. -N. 11.- P. 216-221.

102. Metabolism of leukotriens. / K. Komastsu, J. Jamaguchi, S. Kishimoto. //Trans. Soc. Biomat.-1974.- P.26-21

103. Cyclic AMP and Higher Plants. / M. Kondo, H. Kato, N. Jokoe, et al.// Gann.- 1978.- P.268-270.

104. Lamb C.J. et al. Signals and Transduction Mechanisms for Activation of Plant Defenses agains Microbial Attack. // C.J. Lamb et al. / Cell -1989. -V. 56. -P. 215-224.

105. Lamb C.J. et al. Signals and Transduction Mechanisms for Activation of Plant Defenses agains Microbial Attack. /.C.J. Lamb et al. // Cell -1989. -V. 56.-P. 215-224.

106. Luo B. Brassinosteroids from higher plant. / B. Luo. // Zhiwu Shenglixne Tongxun. -1986. N 1. — P. 11-18.

107. Maczaki J. Biosci. Bioteeh. / J. Maczaki, J. Nakagawa. et al. // Biochem. -1993,- V. 57, № 9.- P. 1439-1442.

108. Manachure G. Aspect Photoperiodigues de la reproduction chez guelgues champignons. / G. Manachure // Bull. Soc. Bot. Fr. -1978.- V. 125, N5-6. -P. 243-262.

109. Mayer A.M. Polyphenol oxidases in plant. / A.M. Mayer, Harel. // Phytochemestry.- 1979.- V.18, P.193-215.

110. Mandava W. B. Plant growth-promoting brassinosteroids. / W. Mandava// Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. -1988.- Vol. 39. P. 23-29.

111. Toxicologi. / H. Moriyuki, M.J. Jshimura.-1980.- 223 p.

112. Brassins f new family of plant hormones from rape pollen. / J. Michell, N. Mandava, J.F. Worley Et al. // Natur (L-) - I970.-Vol. 225, N. 5257. - P. 10651069.

113. Chitin induces type IV collagen and elastic fiber in implanted nonvolen fublic of polyester. / S. Minami, J. Okamoto, K. Migatake, et al. // Carbohydrate polymers.- 1996. -V. 29., N. 4.- P. 295-299.

114. Protein Activation Stimulates Phospholipase D Signaling in Plants. / T. Minnik, S.A. Arisz, T. Vrije, A.G. Musgrave. // Plant Cell.- 1995.- V. 25 -P. 21972210.

115. One-Step Purification of the Beta-Glucan Elicitor-binding Protein from Soybean (Glycine max L.) Roots and Characterization of an Antipeptide Antiserum. / A. Mithofer, F. Lottspeich, J. Ebel. // Febs Lett.- 1996.- V. 381.- P. 203-207.

116. Chitin induces type IV collagen and elastic fiber in implanted nonvolen fabric of polyester// Carbohydrate polymers.-1996.- V. 29. N4. -P. 295-299.

117. Michell J. W. Mandoova N., Workey Y.F. Et al. Brassions a new family of plant hormones from rape pollen. / S. Minami, J. Okamoto, K. Migatake, et. al. // Nature (L-) -1970. -V. 225, N 5247.- P. 1065-1069.

118. Biosci. Biotech. / T. Mizuno, Y. Wasa, H. Yto, C. Suzuki, N. Ukai. // Biochem.- 1992- V. 56. N. 2.-P.368-342.

119. Shiitake growers hand-book. / R. Muzzrelli, G. Biagini, F. Pugnaloni et. ol. // Biomateriats. -1989.- V. 10. N3. -P. 598-599.

120. Namura U. Plant growth-promoting brassinosteroids. / U. Namura. // Japan Chem. Week.- 1988.- V. 29. N 1995.- P. 112-115.

121. Neumann I.D. et al. Intracellular localizatijn of heat shoch proteins tomato cell cultures. / I.D. Neumann et al. // Europ. J.Cell. Biol.-1987.-V. 43, N 1.-P. 71-76.

122. С haracterization and Partial Purification of an Oligopeptide Elicitor Receptor from Parsley (Petroselium crispum). / D. Nennistiel, D. Scheel, T. Nurnberger. // Febs Lett.- 1998.- V. 431.- P. 305-310.

123. Nillson T. Comparative sudy on thecellulotic activity of whit rot and brown -rot fungi. / T. Nilson. // Mater, und Organism.- 1974.- V.9, N 3.- P. 173198.

124. Macrophage activation with multi-porous beads prepared from partially deacetilated chitin. / K. Nishimura, S. Nishimura, H. Seo, et al. // J.Biomed. Mat. Res.- 1986.- V.20. N 8.- P.1359-1372.

125. Hamada K. Brassinolide in crip cultivation. / K. Hamada. // Jnt. Plant Growth Regulatare in Agariculture FFTC. Book series FFTC. 1986.-N 34.- P. 190-195.

126. Hartmann T. Prinzipion des pflanzliclun Sckundarstoffwechscels. / T. Hartman. // PI. Syst. Evol.- 1985. -V. 150. N 9-2.- P. 15-34.

127. Chitin in Nature and Technology. / L.A. Hadwiger, D.E. Kendira, B.W. Fristensky, Wagoker W. // 2001- V.78.-P.456-463.

128. Hakomori S. Carbogidrate carbogigrate interaction as an initial stop in cell recognition. / S. Hakomori. // Pure Appl. Chem.- 1991.- V. 63. N4. -P. 473482.

129. Brassinosssinolide action on regulation of plant grown. / K. Hirai, S. Fujii, K. Honjio. // Japan. J., Corp. Sci. 1991.- V. 60, N. 9. -P. 29-36.

130. О' Hara J. Y. Toxicol. / J.Y. СГ Hara. // Sci, 5.9,- 1981 V.651.-P.2438.

131. Arch. Biochem. / A. Paszezynski, V.B. Huynh, and R. Crawford. // Biophys.-2001-V. 244.-P. 750-765.

132. Prabha T.N. et al. Studies of polyphenoloxidases from tea leaves and mango peel. / T.N. Prabha. // Indian J. Biohemistry and Biophysiics. 1981. - V. 18, N6.-P. 402-405.

133. Prusakova L.D. Antistress action of brassinosteroids on cereals under drought condition. / L.D. Prusakova, S.I. Chizhova // Annual symposium " Physical-chemical bases of plant physiology". -Pushino, 1996.-P.55-56.

134. Przybylowiez P. Shiitake growers hand-book. Dubugue: Kendoll / P. Przybylowiez, J. Donoghae. // Hunt Publ. Co., -1991. -P.217 .

135. J. Biotechnol. N.N. Pozdnyakova, A.A. Leontievsky, O.V. Maltseva, and N.M. Myasoedova. -1993.-V.30.-P. 71-77.

136. Prylyloweiez P. Shitake growers hand-book. Dubugue: Kendoll. / P. Prylyloweiez, J. DonoghacJ. //Hunt Publ. Co., -1991.-P. 217 .

137. Regulation of mammalian pyruvate and branched-chain a-keto acid dehydrogenase complexes by phosphorylation-dephosphorytion. / I.J. Reed, Z. Damuni, M.L. Merryfield. // Curr. Top. Cell Regul. -1985.- V. 27.-P.41-49.

138. Laccasse from Pleurotus ostreatus. / G. Sannia, P. Giardina, M. Luna, M. Rossi, V. Bionocore. // Biotechnol. Letters. -1986.- V. 8, N 11.- P. 787-800.

139. Shimaza H. J. Toxicol. Sci. / H. Shimaza, K. Takeda, Ch. Onodera et al. 1980.-365p.

140. Sakamoto R., et al. Submeger cultur of ediblt fungi in high-consistency starch media. / R. Sakamoto, et al. // Agricultural chemistry ( Japan.) —1987-. V. 52., N2.-P. 83-90.

141. Sneath P.H. Endospore-forming gram-positive rods and cocci. / P.H. Sneath. // Berge's Mannual of Systematic Bacteriology. Baltimore; London; Los Angeles; Sydney: Williams and Wilkins,- 1986.-V.2.- P. 1104-1207.

142. Shirakova F.M. The influence of brassinolide on WGA and ABA level in what roots. / F.M. Shirakova, M.V. Bezrykoba. // Annuual symposium " Physical- chaccal brascs of plant physiology' Pusnchino.- 1996.- P. 56-57.

143. Schwalb M.N. Developmental Iy regulated proteases from basidiiomycetes Schizophyllum commune. / M.N. Schwalb. // J. Biol. Chem. -1987. V. 252, N 23.- P. 8435-8439.

144. Shirakova F.M., Bezrukova M.V. The influence of brassinolide on WGA and ABA level in wheat roots. / F.M. Shirakova, M.V. Bezrykoba. // Annual symposium "Physical-chemical bases of plant physiology". Pushchino.-1996. P. 56-57.

145. Song C.Y. et al. Synthetic medium for the production of submergad cultivation of Lentinus edodes. /C.Y. Song et. al. // Micology.- 1987. -V. 79, N. 6.-P. 866-876.

146. Stein B. D. et al. Histochemistry and ultrastructure of the induced resistance response of cucumber. / B.D. Stein et.al. // Journal of Phytopathology.-1993.- V. 137.- P. 177-188.

147. Suzuki S. Abstr. Procced. IX th Inter./ S. Suzuki, S. Oshima // Sci Congr. Cultiv. Edible fungi. -Tokyo, 1994.- P.24.

148. Stumm D. Role of papillae in the induced systemic resistance of cucumber. / D. Stumm. // Physiological and Molecular Plant Pathology.- 1986. -V. 29.- P. 405-410.

149. Stone J.M. Plant Protein Kinase Families ang Signal Transduction. / J.M. Stone, C. Walker. // Plant Physiol.- 1995.- V. 108.- P. 451-457.

150. Stanek M. Microorganisms and cultivated edible fungi. / M. Stanek. // Karstenia. -1988.- V. 18, N1.- P. 74-76.

151. Tan J. Conviert and effective methods for in virto cultivation of mycelium and fruiting bodies of L. edodes. / J. Tan, D. Moore. // Mycol. Res. -1992.-V. 96.-P. 12.

152. Takematsu T. Effect of brassinosteroids on growth and yields of crops. / T. Takematsu, Y. Tactnchi. // Proc. Ypn. Acad. Ser. В.- 1992.-V. 65. -P. 149151.

153. Tatsuziro J. Cultivation of Lentinus edodes. / J. Tatsuziro. // The biologi and cultivation of edible mushrooms. New Jork; San Francisco.- London, 1988.- V. 41, N22.- P. 461-473.

154. Tompson M.J. Advanced in brassinosteroides research and prosptcts for its agriculture appicftion. / M.J. Tompson, N.V. Mandava. // Steroides.- 1998. V. 38, N5.-P. 567-579.

155. Terashita T. Purification and some Properties of carboxyl proteinases in mycelium of Lentinus edodes. / T. Terashita, K. Oda. et. al // Agr. Biol. Chem.-1999.-V. 42, N9.-P. 1929.

156. Thorne C.J. Techniques in Protein and Enzyme. / С J. Thorne. // Biochemistry, Part I, Section В 104, Elsevier-North Holland.- 1998.-V.36.-P.415-420.

157. Trelease R.N. Cytochemical locflization of malate synthase in glyoxysomes. / R.N. Trelease, W.M. Becker. // J. Cell Biology.- 1994.- V. 60, N 2.- P. 483-495.

158. Tsao G. Tsa-nihg Production of oxalic alid by a wood-destrying fungi. / G. Tsao. // Adl. Microbiol.-2002 -V.l 1.- P.249-254.

159. Vernooij B. et al. Salicycic Asid is not the Translocated Signal Responsible for Inducing Systemic Acquired Resistance. / B. Vernooij. et al. // The Plant Cell.- 1994.- V. 6.- P. 959-965.

160. Waki Т. Production of cellulase infed bath culture. / T. Waki, K. Ishikawa. // Adv. Biotechn. Proc.: 6-th Int. Perment. Symp.- Toronto, 1981.- P. 359-364.

161. Wasser S.P. Medicinal mushrooms as a sonrce of antitumor and immunomodulating polysaceharides. / S.P. Wasser. -2002.- 326p.

162. Wasser S.P. Is a Widely cultivated culinary Medicinal Royal Sun Agaricus Jndud Agaricus brazei Murrill. / S.P. Wasser. -2002.-245p.

163. Wasser S.P. Trerapentic effects of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: A modern Perspective. / S.P. Wasser. -2003.-154p.

164. Westermark U. Carbohydrat-dependent enzymic qui none reduction during lignin degradation. / U. Westermark, K.E. Eriksson. // Acta. Chem. Scand.-1984.-V.28, N 2.- P.204-208.

165. Zhao Z. Jnt Cont on Brassinosteroids: Abstracts. / Z. Zhao, W. Dendru -1990.- 8.p.

166. Zhuang C., Mizuno T. et al. Cultivation of Lentinus edodes. / C. Zhuang, T. Mizuno. // Biochem.- 1993.- V. 57, N6.- P. 901-906.