Выделение и характеристика мицелиального лектина базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray

Степанова, Лада Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и характеристика мицелиального лектина базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика мицелиального лектина базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray"

На правах рукописи

003 1G531G

Степанова Лада Викторовна

Выделение и характеристика мицелиального лектина базидиомицета Grifóla frondosa (Fr.) S.F. Gray

03 00 07 — микробиология 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

i з мь? да

Саратов - 2008

003165316

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН, г Саратов)

Научный руководитель доктор биологических наук

Никитина Валентина Евгеньевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Карпунина Лидия Владимировна доктор биологических наук Краснопольская Лариса Михайловна

Ведущая организация Институт биохимии и генетики Уфимского

научного центра Российской академии наук

Защита диссертации состоится «14» марта 2008 года в 10 00 на заседании диссертационного совета Д 002 146 01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г Саратов, проспект Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН и на сайте института http //www lbppm Saratov ru/obyav_dis html

Автореферат разослан «12» февраля 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета у

доктор биологических наук Никитина

ОЬЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Интерес к высшим съедобным базидиомицетам (Basidiomycetes) как источникам вкусной и полезной биомассы, содержащей различные биологически активные вещества, непрерывно возрастает Научные изыскания, предваряющие и обосновывающие начало массового промышленного культивирования тех или иных грибов, как правило, лишь констатируют наличие каких-либо полезных свойств и активностей, характеризующих конкретный грибной объект с положительной стороны В связи с этим изучение активных метаболитов базидисмицетов, определение их биологического действия в связи с аспектами их жизнедеятельности подлежат выяснению и представляют важную задачу

Нельзя назвать случайным установленный факт, что практически все биологически активные вещества, продуцируемые базидиальными грибами, являются либо гликанами, либо гликоконъюгатами (Ikekawa, 2001, Wasser, 2002) В научном сообществе уже сложилось представление об особом значении гликозилирования белков как неотъемлемой части углеводного обмена различных организмов Это представление базируется на современных позициях гликобиологии, доказывающих, что важнейшая функция углеводов в метаболизме любых организмов связана не только с энергетическим, но и биоинформацконным потенциалом таковых, поэтому большое количество белков в организмах гликозилированы (Dwek, 1996, Dnckamer, 1998, Reuter and Gabius, 1999) Функционирование некоторых метаболических систем, большей частью тех, что имеют экстраклеточную направленность, с использованием углеводного биоинформационного потенциала возможно благодаря осуществлению биоспецифического углевод-белкового взаимодействия Подобное взаимодействие реализуется, в основном, с помощью лектинов, способных распознавать определенные углеводные детерминанты в клеточных структурах То есть, если некоторые гликозидные структуры в живой клетке представляют собой определенный информационный потенциал (Lame, 1997, Solls el al, 2001), то его реализация требует участия лектиновых субстанций (Lis and Sharon, 1998)

Активные многосторонние исследования лектинов растений, животных и бактерий ярче подчёркивают существенный пробел в научных работах по изучению лектинов базидиомицетов Это представляется особенно важным в отношении экогруппы базидиальных ксилотрофов, являющихся продуцентами важных иммуномодулирующих и противоопухолевых глнканов и гликопротеинов Анализ литературных данных показал, что исследования лектинов базидиомицетов немногочисленны и связаны, в основном, с выделением лектинов из плодовых тел, которые являются лишь кратковременными формированиями со строго определенной функцией Крайне мало работ по изучению лектинов базидиомицетов на стадии дикариотического мицелия, основной и более значимой стадии роста грибного организма как биологического индивида При этом подавляющее большинство исследований в этом направлении касаются представителей порядка Агариковых (Agaricales), вероятно, в силу наибольшего практического интереса к ним Отмечалось, что у представителей другого порядка - Афиллофоровых (Aphyllophorales) или трутовиков - лектиновая активность обнаруживается редко (Könska, 2006) Несомненно, изучение лектинов как биоспецифических агентов в метаболизме базидиального ксилотрофа расширит спектр фундаментальных знаний о С5шествовании и, возможно, реализации углеводного биоинформационного потенциала у этих организмов Кроме того, подобные исследования имеют важное прикладное значение лектины различного происхождения, в том числе выделенные из некоторых высших грибов (Debray et al, 1991, Guillot et a1, 1990), выпускаемые как фармакологические препараты, широко применяются в медико-биологических исследованиях (Mody et al, 1995, Gabius, 1998, Gabius et al, 1998, Rüdiger et Ы , 2000)

Трутовик Grifóla frondosa, в силу исключительных свойств биомассы (к настоящему времени из плодовых тел и мицелия выделено около 30 биологически активных веществ, большей частью, полисахаридов), является объектом пристального изучения Однако научный поиск имеет ярко выраженный прикладной характер основной целью исследований является

обнаружение и описание биологически активных гликанов и гликоконьюгатов, обладающих медицинским/фармакологическим эффектом При этом материалом для работы являются, как правило, плодовые тела Фундаментальный аспект изучения продукции и функционирования этих метаболитов в процессе развития самого базидиомицета, практически отсутствует В доступной литературе обнаружена всего 1 работа по выделению лектина из плодовых тел этого гриба (Kawagishu et al, 1990b) На основании вышеизложенного, нами было предпринято исследование его лектиновой активности на стадии дикариотического мицелия

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось обнаружение, выделение и характеристика лектина с поверхности дикариотического мицелия базидиального ксилотрофа G frondosa штамм 0917

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи

1 Исследовать экстракты дикариотического мицелия G frondosa 0917, полученного разными способами культивирования, и установить наличие у них лектиновой (гемагглютинирующей) активности

2 Выделить гомогенный препарат лектина с поверхности дикариотического мицелия G frondosa 0917 определить его углеводную специфичность и локализацию

3 Изучить некоторые физико-химические, а также иммунохимические свойства выделенного лектина

4 Исследовать возможную роль лектин-углеводного распознавания как биоспецифического взаимодействия при совместном культивировании G frondosa 0917 с Azospirdlum brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов

5 Оценить влияние изучаемого лектина на подвижность бактерий указанных иггаммов в жидкой среде

Научная новизна Впервые с поверхности дикариотического мицелия выделен и очищен лектин с молекулярной массой 67± 1 кДа, установлена его углеводная специфичность, состав, описаны некоторые физико-химические и иммунохимические свойства.

Установлено, что лектин G frondosa 0917 способен к связыванию, как со специфическими, так и с неспецифическими поликлональными антителами кролика и человека, последнее обусловлено взаимодействием лектина с олигосахаридами антител

Впервые показано что, несмотря на качественно различную аффинность лектина при взаимодействии с молекулами гомологичных и негомологичных антител, количественно эти взаимодеисгвия обусловлены образованием примерно одинакового количества связей, о чем свидетельствуют близкие величины изменения стандартной свободной энергии этих систем

Показано, что Омегон-Km мутанты штамма Sp245 - штаммы КМ018 и КМ 139, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1 с гаптенным лектину мицелия ОПС1 распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма, чем в случае штаммов КМ252 и КМ348, в состав клеточной стенки которых входит ЛПСП

Выявлено что мицелиальный лектин уменьшает подвижность бактерий А brasdense Sp245 и КМ 139 (с ЛПС1) в жидкой среде

Научно-практическая значимость Получен гомогенный препарат мицелиального лектина G frondosa 0917 с необычной углеводной специфичностью, которы"' может применяться в исследованиях полимеров клеточной стенки грамотрицательных бактерий Установленное свойство лектина к распознаванию неспецифических антител путем его взаимодействия с углеводной частью молекул ангител свидетельствует в пользу активно развивающейся в настоящее время концепции об универсализме белок-углеводных биоспецифических взаимодействий как способа реализации эпигенетического углеводного кода Комплекс данных, полученных в настоящей работе, может послужить основой дальнейших фундаментальных исследований механизма функционирования лектин-рецепторной системы у базидиомицетов

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках бюджетных тем "Съедобные культивируемые грибы физиология и биохимия" (направление 5 10), научный руководитель темы дбн, зав лаб Никитина

В Е , Xa roc регистрации 01970008158, «Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (направление 5 10), научный руководитель темы дбн, зав лаб Никитина ВЕ, № гос регистрации 01200606184 Работа выполнялась также при поддержке гранта РФФИ 04-48129 а «Лектины ксилотрофных базидиомицетов разных систематических групп» Материалы диссертации использованы при выполнении дипломной работы кафедры микробиологии биологического факультета СГУ им H Г Чернышевского

Положения, выносимые на защиту

1 Проявление лектиновой активности, обнаруженной у экстрактов дикариотического мицелия G frondosa 0917 в процессе культивирования на некоторых жидких и твердых средах, является наибольшим для легких смывов с поверхности 10-18-суточного мицелия при твердофазном культивировании при использовании натнвных эритроцитов кролика

2 Лекпш, выделенный с поверхности дикариотического мицелия базидиалыюго ксилотрофа G frondosa 0917, имеет молекулярную массу 67±1кДа и состоит из двух субъединиц по 33-34кДа

3 Полученный лекгин представляет собой гидрофильный термостабильный гликопротеин с соотношением частей протеин гликан как 3 1, проявляет высокую специфичность к линейному D-рамнану - ОПС1, выделенному из ЛПС1 грамотрицательных диаютрофных ризобактерий A brasúense Sp245

4 Лекпш G frondosa 0917 взаимодействует как со специфическими (к лектину), так и с неспецифическими (к О-антигенам бактерий A brasilense Sp245, S17) поликлональными кроличьими антителами, а также с у-глобулином человека Связывание лектина с гомологичными антителами происходит с участием антигенсвязывагощего центра (Fab-фрагментов) Взаимодействие лектина с негомологичными антителами обусловлено его связыванием с углеводной частью молекул антител

5 Равновесные системы взаимодействия лектина G frondosa 0917 с гомологичными и негомологичными поликлональными антителами характеризуются различной степенью аффинности Однако различие в величинах изменений стандартной свободной энергии ДG обеих систем несущественно, что говорит о примерно одинаковом количестве связей, участвующих в контакте молекул лектина и антител обоих типов

6 При совместном культивировании базидиомицета G frondosa 0917 и ризобактерий А brasilense штамма Sp245 и его Омегон-Кт мутантов, дефектных по ЛПС были установлены биоспецнфические лектин-углеводные взаимодействия, отражающиеся на морфологических характеристиках грибного мицелия При этом с наименьшим антагонизмом распознаются штаммы A brasilense, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1

7 Лектин G frondosa 0917 в диапазоне концентраций 0 1-10 мкг/мл уменьшает подвижность азоспирилл штаммов Sp245 и КМ139 (с ЛПС1), подобного влияния на клетки штаммов КМ252 и КМ348 (с ЛПСП) не происходит

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 8 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино, Россия, 2004), на 3-ей Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006), на 23-м Международном симпозиуме по углеводам (Уистлер, Канада, 2006), на 5-м Всероссийском Конгрессе rio медицинской микологии (Москва, Россия, 2007), на 15-м Конгрессе европейских микологов (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, Россия, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, Россия, 2007)

Диссертационная работа обсуждена на расширенном заседании лаборатории микробиологии и микологии 28 ноября 2007 г

Публикации По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в отечественных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 1 статья в зарубежном рецензируемом издании

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, изложения и обсуждения результатов работы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 227 источников Объем диссертации составляет 131 машинописных страниц Работа содержит 19 рисунков и 5 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подразделы 1 1 Общая характеристика экогруппы базидиальных ксилотрофов, I 2 Общие представления о лектинах, 1 3 Лектины с позиций современной гликобиологии, 1 4 Лектины базидиальных ксилотрофов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использована культура Grifóla frondosa (Fr) S F Gray 0917, полученная из Коллекции культур базидиомицетов Ботанического института им В Л Комарова (Санкт-Петербург, Россия) С целью обнаружения и изучения динамики проявления лекгииовой активности гриба мицелий получали поверхностным и глубинным культивированием при 26°С на некоторых органических и синтетических средах При этом использовали нативные и трипсинизированные эритроциты кролика Во время экспериментов по выделению и исследованию свойств лектина рост культуры поддерживали на чашках Петри с агаризованной средой на основе пивного сусла Материалом исследований являлся 18-суточный дикариотический мицелий В ходе экспериментов также использовались бактерии Azospirillum brastlense Sp245 и его Омегон-Кт мутанты - штаммы КМ018, КМ139, КМ252 и КМ348, полученые в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН (Katzycía/, 1998)

Экстракт поверхностного мицелия получали смывом О 15М фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН-7 2-7 4) с мицелиальной биомассы Гель-фильтрация Полученный экстракт после фильтрования фракционировали на колонке (I 5x40см) с сефадексом G-75 с помощью детектора «Uvicord S И» (LKB, Швеция), при X - 280 нм, используя в качестве элюента тот же буфер Гемагглютинирующие фракции отбирали, концентрировали на роторном испарителе и диализовали против дистиллированной воды в диализных трубках с пределом исключения 6 кДа (Sigma-Aldnch, США) Ионообменная хроматография Водный диализат помещали на диализ против 0 02М ФСБ (рН-7 9), затем хроматографировали на колонке (1х 10см) с DEAE - Toyopeaii 650М, уравновешенной тем же буфером Леютш элюировапи раствором 0 25М NaCl, после выхода неадсорбированной фракции Лектиновые фракции дважды диализовали против дистиллированной воды, концентрировали пассивным упариванием и лиофилыю высушивали Реакцию гемагглютинации проводили полуколичественным методом двукратных разведений препарата лектина (либо тестируемых фракций в процессе выделения) в О 15М ФСБ на стандартных планшетах для иммунологических реакций с использованием нагивных эритроцитов кролика Тигром гемагглютинации считали наибольшее разведение препарата, при котором визуально сохраняется агглютинация эритроцитов, в сравнении с контрольной лункой Специфичность лектина определяли методом ингибирования реакции гемагглютинации различными углеводами В качестве ингибиторов было протестировано 24 свободных углевода Также были использовакы ранее полученные препараты углеводных полимеров - О-специфических полисахаридов мембранных липополисахаридов грамотрицательных диазотрофных бактерий Azospirillum brasilense Sp 245, A irakense КВС1, A lipoferum Sp59b Ранее была исследована структура повторяющихся углеводных звеньев (моноуглеводный состав,

характер гликозидных связей, абсолютная конфигурация) в составе этих полисахаридов (Fedonenko et al, 2002 Fedonenko et al, 2004, Fedonenko et al 2005), чго де iaei обоснованным их выбор в качестве тест-ингибиторов Препараты любезно предоставлены сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН Для проведения реакции гемагпютинации и ее ингибирования готовили 2% суспензию нативных эритроцитов кролика в 0 15М ФСБ Гель - эчсктрофорез проводили в вертикальной камере (Helicon Россия), используя 15% полиакриламидный гель с 0 1% додецилсульфата натрия Окраску гелей осуществляли азотнокислым серебром Аминокислотный анализ осуществляли на анализаторе AAA 339 (ЧССР) Гидролиз образца проводили 6Н HCl при 105°С в течение 24 ч Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976) Количество углеводов в растворах лектина опредезяли с помощью фенол-сернокислогной реакции (Dubois et al 1956) качественный состав выявляли методом ТСХ Ноликлоиальпые hpo iii4i,ii антитела к лектину G frondosa 0917 получали троекратным введением (с интервалом в 2 недели) кроликам в подколенные лимфатические узлы 0 5 1 0 и 1 5 мг пектина который смешивачн в соотношении 1 I при первой иммунизации с полным адыовантом Фрейнда а при последующих - с неполным адъювантом Фракции IgG получали И) антисывороток осаждением сульфатом аммония (Кэбог Мейер, 1968) Концентрацию IgG в растворах определяли спектроскопически при длине волны А.=280 нм принимая оптическую пчотность раствора IgG в кювете /=1см при концентрации белка I мг/мт равной 1 4 (Kabat, 1980) Получение коныогата лектина G frondosa 0917 и гомологичных антител с частицами коллоидного золота (KÍ) диамером 15 нм осуществили по методике (Roth 1982, 1983) Для проведения нммунодот-анализа взаимодействия меченого КЗ лектина со специфическими и неспецифическими потикчональными крочичьимн антителами, а также коммерческим препаратом у-глобулина чечовска использовали нитроцетлюлозные мембраны (d = I 5 мкм, «Millipore» США) Для предотвращения неспепифической сорбции метки на сайтах мембраны, свободных от образцов подсушенную мембрану помещали в ФСЬ с 0 01% [ вин-20 и 0 1% ПЭГ 20000 (30 мин) С целыо получения Fab- и Fc-фрагментов антитела к лектину и коммерческий препарат у-глобучина человека подвергали расщеплению по методике претчоженнон в работе (Антитела Методы 1991) с некоторыми модификациями Твер шфашый ИФА выпочняли в полистироловых 96-луночных планшетах (Engvall et al 1971) В качестве проб антигена использовали лектин, гаптенный О-ПС и комплекс этих веществ в разных концентрациях Измерения оптической пчотности исследуемых проб проводи ш при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО ИЛИП Санкт-Петербург Россия) Определение локализации лектина проводили методом иммунофтюоресцентной микроскопии согласно методике предложенной в работах (Пот idK Ван Норден 1987, Михайлов, Симирский, 1991) Пробы анализировали с помощью микроскопа «Leica DMLB» (Германия) Дтя изучения морфолого-культура.||.ны\ характеристик' колоний G frondosa 0917 в совместных культурах с А brasdense Sp245 и его Омегон-Km митингами суспензии бактериальных культур (1мл), выращенных на малатно-солевой среде в течение I сут добавтячи к 3-5-суточной культуре гриба на чашке Петри С цетыо блокирования углеводсвязывающей области лектина присутствующего на поверхности мицечия, раст\щис шфы до внесения бак!ериальных культур подвергали предобработке препаратом ОГ1С1 (10 мкг/мл) Совместные культуры выращивали в термостате при 26°С Согласно (Методы экспериментачыгои микотогии 1982), количественно рост совместных культур характеризовали с помощью форму ты ростового коэффициента (PK) модифицированной нами в применении к данным экспериментам

PK, = dhgj i где t всегда равно 10 (сут)

Исследование подвижности бактерии в присутствии лектина проводили с испочьзованием специально разработанной программы компькнерного анализа

видеоизображения, полученного при просмотре препаратов "висячая капля" в фазово-контрастный микроскоп Jenaval, соединенный с цифровой видеокамерой Sony DCR-TRV900F..

Оценка достоверности результатов: значения / при п=5: от 2 61 по 3.28; 0.05 > Р> 0.03.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаружение, выделение н физико-химические свойства мнцелнального лектина G. frondosa 0917

В ходе исследований экстрактов дикариотического мицелия базидиомицета G. frondosa 0917, полученного разными способами культивирования, была обнаружена лектиновая (гемагглютинирующая) активность в отношении нативных эритроцитов кролика. При этом установлено, что наибольший стабильный титр лектиновой активности характерен для смывов с поверхности дикариотического мицелия 7-21-суточных культур в процессе роста на агаризовапном пивном сусле (рис. 1).

ОЗсут

Я 15сут 021сут

Рис.1. Динамика лектиновой активности мицелия G. frondosa 0917 в процессе роста на разных средах (в отношении нативных эритроцитов кролика) Условные обозначения Жсинт -жидкая синтетическая среда, Жсусло - жидкое пивное сусло; Асинт - агаризованная синтетическая среда, Асусло — агаризованное пивное сусло

В связи с этим было принято решение о выделении искомой субстанции из смыва фосфатно-солевым буфером с поверхности биомассы 18-суточного мицелия, полученного культивированием на этой среде. Нами описывается двухстадийиый процесс выделения гомогенного лектина из экстрактов с последовательным применением гель-фильтрации на декстрановом носителе Scphadex G-75 и ионообменной хроматографии на анионобменнике DEAE-Toyopearl 650М (рис. 2). Методом гель-электрофореза была установлена субъединичная структура лектина, представленная двумя полосами на уровне 33-34 кДа (рис.3). Согласно результатам многочисленных исследований, субъединичная структура является характерной для подавляющего большинства лектинов различного происхождения. Значительная часть исследованных лектинов базидиомииетов представляли собой димеры, состоящие из небольших субъединиц порядка нескольких десятков кДа (Lin and Chou, 1984. Yatohgo et al., 1988). Гораздо меньшее количество лектинов имели мономерную структуру (Guillot et ai. 1983), а также тетрамерную (Konska et al.. 1994). Определение молекулярной массы нативного вещества методом гель-фильтрации на сефадексе в сравнении с модельными белками показало, что время и объем

выхода лектина с колонки совпадает с таковыми альбумина бычьего с молекулярной массой 67 кДа, взятого в равной концентрации.

Плотность при \ = 280 им

Рис. 2. Профиль элюции гемагглютинируюших фракций в процессе ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650М

94 6 (целлюлаза) Рис. 3. ДДС - электрофорез в 15% Г1ААГ, Трек 1

лектин G. frondosa 09! 7, грек 2 - маркеры

(§ 66 5 (БСА) в 45 (овальбумин)

SSЩ ■

31 (к-арбоанги драча) т ' 21.5 (ингибитор трипсина) 14.4 (лизоиим)

I 2

С помощью фенол-сернокпслотной реакции нами была выявлена углеводная составляющая в растворах лектина различных концентраций. По результатам всех опытов соотношение гликана и белка составляет 1:3 (табл. 1). Анализ методом Т'СХ показал наличие глюкозы и глюкозамина в составе углеводной части. Многочисленные литературные данные свидетельствуют, что подавляющее большинство лектипов. выделенных из различных организмов, являются гликопротеинами, широко варьирующими по количественному и качественному составу углеводной части.

Проведенное изучение аминокислотного состава выделенного лектина выявило наибольшее процентное содержание аминокислот с положительно заряженными R-группами - аргинина, лизина и гистидина, а также сравнимое с ними по величине содержание аминокислоты с отрицательно заряженной R-группой - аспарагиновой.

Отмечено также полное отсутствие серосодержащих аминокислот - цистеина и метионина (табл 2)

Таблица 1

Соотношение белка и углеводов в растворах различной концентрации гомогенного препарата

лектинаG frondosa 0917

Концентрация белка, мкг/мл Концентрация углевода, мкг/мл

13 68 ±0 24 4 21 ±0 07

28 23 ± 0 73 8 78 ± 0 11

54 84 ± 1 64 !7 83 ± 0 29

110 42 ±2 76 36 20 ± 0 97

218 14 ± 3 73 71 97± 1 12

Гаи.in ца 2

Аминокислотный состав лектина мицелия G frondosa 0917

Аминокислота % от суммы аминокислот Аминокисюга % от суммы аминокислот

Асп 82 Мет -

Тре S 4 Иле 40

Сер 35 Лей 64

Глу 40 Тир 57

Про 5 7 Фен 5 4

Гли 7 1 Гис 75

Ала 68 Трп 43

Цис - Лиз 75

Вал 50 Apr 85

Флкт отсутствия последних либо их наличие в следовых количествах в аминокисютном составе, наряду с субъединичной структурой также является характерным признаком отмеченным практически всеми исследователями в работах по изучению различных тектннов и агглютининов Очевидно, отсутствие атомов серы, посредством которых в молекуле белка образуются прочные, стабилизирующие структуру связи играет не последнюю роль в лабильности тектинов как белковых молекул, участвующих в реализации широкого спектра адаптивных механизмов

Титр агглютинации гомогенным лектином в первоначальной концентрации 50 мкг/мл нагивных эритроцитов кролика составлял 2048 эритроцитов человека 0 группы крови - 64 При определении углеводной специфичности изучаемою лектина было установлено, что ни один из взятых в эксперимент моно- ли- аминосахаридов (всего 25), а также некоторых гликопроизводных в концентрации до 0,1М не ингибировал агглютинацию нативных эритроцитов кротика Согласно классификации предложенной в работе (Gallagher, 1984), пектины, в соответствии с и\ углеводной специфичностью, распредетяются на две группы Первую составляют экютектины, к ней могут быть отнесены те, что связывают определенные внешние моносахариды невосстанавливающих концов в сложных сахаридах, агглютинация такими леминами может быть ингибирована низкими концентрациями свободных углеводов либо их метилгликозидов Вторую группу составляют эндолектины способные к распознаванию лишь сложных олигосахаридов и агглютинацию этими лектинами можно ингибировать только специфическими углеводными последовательностями Поскольку не было обнаружено взаимодействия со свободными сахаридамн в качестве ингибиторов были протестированы гомогенные

препараты углеводных полимеров - О-специфических полисахаридов мембранных липополисахаридов i рамотрицательных диазотрофных бактерий Azospirillum brcisilense Sp 245, A. irakense КВСI, A. Upoferum Sp59b. Было установлено, что О-полисахарид /(. brasilense Sp245 - линейный D- рамнан со следующей структурой повторяющегося звена ->2)-P-D-Rhap-(l->3)-a-D-Rhap-(l-»3)-a-D-Rh^?-(I-»2)-o-D-Rhap-(1-»2)-a-D-Rhap-(l-> (Fedoncnko et at., 2002) в концентрации 13.9 мкг/мл ингибирует агглютинацию в титре 4 выделенным лектином нативных эритроцитов кролика. Свободная рамноза не оказывала ингибирующего влияния; возможно, это объясняется тем, что чистая рамноза существует только в виде L-эпимера, тогда как в составе пентасахаридного звена рамнана этот моноутлевод находится в D-форме. Поскольку такая конфигурация рамнозы описана лишь в сложных полисахаридах некоторых микроорганизмов (Кочетков, 1996; Fedonenko el al„ 2002), можно констатировать, что выделенное вещество, проявившее такую специфичность, является типичным эндолектином, чувствительным именно к копформативнмм модификациям аффинного полисахарида, которые обусловлены характером гликозидной связи и эпимеризацией входящих в его состав моносахаридов (Gallagher, 1984; Gabius, 2000). Ранее исследованный лектин из плодовых тел G. frondosa оказался, напротив, типичным экзолектином. так как проявлял высокую специфичность к Ы-ацетил-О-гапактозамину (Kawagishi el at.. 1990 ).

По литературным данным, лектины различного происхождения являются достаточно термостабильными веществами, и температурный диапазон сохранения их активности широк. Наши исследования показали, что при нагревании раствора лектина в любой произвольной концентрации до +50°С его активность практически не изменяется. Дальнейшее нагревание ведет к снижению титра гемагглютинации, проявление которой почти полностью утрачивается при 70°С. При лиофильном высушивании, как известно, концентрированные растворы лектина подвергались длительному замораживанию до -70°С. Перерастворенные препараты высушенного лектина сохраняли свою активность. Таким образом, установленный в наших исследованиях температурный диапазон сохранения гемагглютинирующей активности лектина G. frondosa 0917 от -70°С до +50°С.

Присутствие лектина в легких смывах с поверхности гиф позволило предположить, что гидрофильным лектин слабо ассоциирован с клеточной стенкой мицелиальных гиф. Методом иммунофлюоресцентной микроскопии показано диффузное и неравномерное распределение лектина по поверхности гиф (рис. 4). Скопления лектина характерны для пряжек, образующихся в процессе дикариотизацин, а также хчя мелких («молодых») гифальных отростков.

Рис.4. Локализация лектина на гифах

Ранее подобная локализация была описана для некоторых бактериальных лектинов (Аленькина, 1994, Карпунина и др, 1995) Авторами подчеркивалось, что описываемые лектины не были связаны с какими-либо конкретными бактериальными филаментами Однако бактериальные лектины равномерно распределялись по поверхности микробной клетки Как известно, развитие любых морфоструктур требует энергетических затрат, что провоцирует поступление значительного количества углеводов в район активного роста Этот процесс тем более актуален для апикальных гиф, характеризующихся непрерывным ростом в изменяющихся условиях среды Последнее обстоятельство вынуждает к расходу части энергии на адаптацию, что выражается, прежде всего, в изменении функционирования определенных ферментных систем Согласно работе (Kónska, 2006), лектины, с большой вероятностью, принимают участие в этих процессах в качестве контролирующего фактора либо посредством прямого связывания со свободными сахаридамн, либо воздействуя опосредованно через связывание с углеводной детерминантой в составе энзимов

Иммуиохнмическпе свойства минелиального лектина С frondosa 0917

Иммучохимический подход является весьма информативным при изучении поверхностных структур различных биологических объектов, поскольку специфические антитела представляют собой уникальные зонды, позволяющие, в частности, оценивать характер локализации и уровень продукции исследуемых соединений, а также влияние внешних факторов на их качественные и количественные характеристики Полик тональные антитела — это пул гетерогенных иммуноглобулинов, относящихся преимущественно к классу IgG и различающихся по антигенным свойствам, по молекулярному весу и заряду Как известно наличие перекрестной реакции антител определенного происхождения с какими-пибо исследуемыми антигенами, однозначно свидетельствует о присутствии в антигене той антигенной детерминанты, к которой тестирующие антитела изначально были получены Однако есчи в качестве антигена выступают вещества, способные к собственным специфическим взаимодействиям, то интерпретация полученных результатов может быть затруднена В силу известной способности пектинов связываться с углеводной частью иммуноглобулинов, выделенных из крови экспериментальных животных и человека (Калинин и Кулякина, 1998), иммунохнмическая специфичность полученных на лектины антител нуждается в особых доказательствах, без которых интерпретация резулыаюв может быть затруднена В экспериментах по изучению иммунохимических свойств лектина была обнаружена его способность к связыванию, как с гомологичными так и с негомологичными поликлональными антителами ИФА взаимодействия лектина с гомологичными антителами, а также его комплекса с гаптенным ОПС1 показал, что степень антигенности чектина невысока (max значение поглощения - около 0 3) При этом в комплексе с гаптеном антигенные свойства лектина уменьшаются (рис 5)

На рисунке 6 показано, что лектин G frondosa 0917, конъюгированный с частицами коллоидного золота (КЗ), взаимодействовал с антителами к О-антигенам грамотрицательных бактерий A brasilense Sp245 и S17, а также с коммерческим препаратом -у-глобулина человека исполыованными при анализе в качестве отрицательного контроля

Выявленные взаимодействия поставили под сомнение специфичность связывания лектина с гомологичными антителами В связи с этим мы предприняли дальнейшие исследования Как известно, продуктами обработки антител растительным протеолитическим ферментом папаином являются так называемые Fab- и fc-фрагменты Образующиеся при расщеплении одной молекулы антител два /-ai-фрагмента сохраняют способность реагировать с антигеном, поскотьку содержат антиген-распознающие

области, /-с-фрагмеит молекулы антител антиген-распознающих сайтов не имеет (Porter, 1959).

о 0,4

тг 0,35

s 0,3

а.

= 0,25

s s 0,2

3 0 15

L. 0,1

1= 0.05

0,301 0,602 0,903 1,204 1,505 1,806 2,107 2,408

—лектин lg титра разведения -в-ОПС1 —комплекс

Рис. 5 Результаты ИФА взаимодействия лектина О. frondosa 091 7 (50 мкг/мл) и комплекса лектин+гаптен гаптенного ОПС (200 мкг/мл) с антителами к лектину

К пектину О. frondosa 0917

#'5;f/ --4.- К О-антигеиу A. brasHense Sp245

• ~r.\: : <- К О-антигену A. brasilense SI7

Ijfc ' ® ... - у-пюбулин человека

Рис. 6. Результаты иммунодот-аншнгза взаимодейстимя коиъюгата лектина с КЗ со специфическими и неспецифичсскими антителами

Поскольку проверка специфичности связывания грибного лектина с гомологичными антителами была необходимой, было предпринято расщепление папаином последних, а также у-глобулина человека в качестве контроля. Па рисунке 7 показано последовательное элюирование продуктов расщепления антител к лектину в

процессе ионообменной хроматографии. Согласно авторам метода (Антитела____ 1991),

первый пик представлял собой фракцию ГаЬ-фрагментов Выход фракции ^-фрагментов формировал второй гшк, гораздо меньший по площади. Это соответствует теоретически ожидаемым результатам, так как при расщеплении одной молекулы антител образуется два /га6-фрагмекта и один Рс-фрагмент.

0.2

Градиент ФБ 0.01 - 0.3М

V, мл

Рнс. 7. Профиль элюции антител к лектину после расщепления папаином

Идентификация фрагментов была подтверждена взаимодействием с меченым КЗ протеином А. Последний. как известно, распознает /""офрагменты молекул иммуноглобулинов (Досон и др.. 1991). Рисунок 8 демонстрирует результаты иммунодот-анализа взаимодействия фракций с протеином А; как видно, предполагаемые фракции Ис-фрагментов антител к лектину и у-глобулина человека проявили яркое взаимодействие с протеином А, тогда как взаимодействие предполагаемых фракций /чзб-фрагментов с ним отсутствовало. С целью проверки специфичности связывания лектина с гомологичными антителами, с помощью иммунодота было установлено, что /га6-фрагмснты специфичных антител взаимодействуют с меченым лектином, но взаимодействия Раб-фрагментов у-глобулина человека с лектином не отмечалось (рис. 9).

/•аб-фрагменты антител клектину Гай-фрагменты у-глобулина человека Гс-фрагменты антител к лектину /чг-фрагменты у-глобулина человека

Рис. 8. Результаты иммунодот-анализа взаимодействия фрагментов антител с протеином А, конъюгированным с КЗ

/^¿-фрагменты у-глобулина человека /^¿-фрагменты антител к лектину

■."•'■r.S»

Рис. 9. Результаты иммунодот-анализа взаимодействия /^¿-фрагментов антител с конъюгатом лектина G. frondosa 0917 с КЗ

Следовательно, связывание лектина с гомологичными антителами происходит с участием антигенсвязывающего центра. С учетом отсутствия связывания /'"аб-фрагментов у—глобулина человека с лектином, можно считать доказанным, что антигенсвязывающий центр молекул -у—глобулина не участвует в их взаимодействии с лектином.

Учитывая собственную функциональную специфику лектина, естественным было предположить участие взаимодействий «лектин—углевод» в наблюдаемом иммунохимическом эффекте вместо взаимодействий «антиген-антитело». Как известно, в молекулах Ig всегда присутствует углеводная часть, которая у разных классов Ig может отличаться по качественному составу, количеству и локализации углеводных фрагментов (Raju el al, 2000). В молекулах антител углеводы прикреплены по месту акцепторных трипептидов Asn-X-Ser/Tlir, где X - не Pro, по которым обычно идет гликозилирование белков (Reuter and Gabius, 1999).Очевидно, определенные олигосахариды в составе антител способны образовывать связи с компетентной областью фибного лектина, и главным лимитирующим фактором в таком случае является пространственная комплементарность углеводсвязывающсй области лектина. которая меняется при образовании комплекса с гапгенным полисахаридом. Подобные взаимодействия лежат в основе лектнн-фермснтного анализа, применяемого для исследования изменений состава углеводной части иммуноглобулинов разных классов (Калинин и Кулякина, 1998; Петросян, 2006). Если взаимодействие исследуемого лектина с неспецифическими антителами происходит посредством контакта его утлеводсвязывагощей области с олигосахаридами антител, то при блокировании этой области гаптениым полисахаридом, взаимодействие с антителами будет уменьшаться. В связи с этим, методом ИФА были получены полуколичественные характеристики иммунных взаимодействий лектина. его комплекса с гаптенным ОПС (D-рамнаном), а также чистого гаптена в качестве контроля с неспецифическими антителами к О-антигену ризобактерии Sinorhizobium meliloli Р221. Как показано на рисунке 10, взаимодействие лекгина с антителами характеризуется линейной зависимостью.

D 490 0.3 0,25 0.2 0,15 0,1 0.05 0

0.301

0,6021

0,9031

лектин комплекс

ОПС (контроль)

1.2041 1,5052 Ig титра

Рис. 10. Результаты ИФА взаимодействия лектина. гаитенного ОПС и комплекса «лектин— гаптен» с антителами к О-антигену 5. теШои Р22 I По оси абсцисс указана степень разведения первоначальных концентраций проб антигенов

Кривая поглощения, характеризующая динамику угого взаимодействия при уменьшении концентрации лектина, уже в гифе 1:16 от первоначальной концентрации антигена достигает минимального значения, и далее проходит вблизи контрольной кривой Кривая взаимодействий комплекса лектина с гаптеном отличается меньшими

значениями поглощений, величина которых не зависит от степени развеления, что свидетельствует об отсутствии линейной зависимости На основании полученных данных можно говорить о том, что уменьшение степени связывания комплекса «лектин-гаптен» с негомологичными антителами связано, скорее всего, с блокированием его углеводсвязывающей способности, что, в свою очередь, говорит об участии функциональной специфики лектина во взаимодействиях с негомологичными антителами Количественными характеристиками межмолекулярных взаимодействий, обуславливающихся суммарным действием всех сил в равновесной системе при обратимых взаимодействиях, являются термодинамические параметры - изменение энтальпии и энтропии рассматриваемой системы, отражающие энергетику взаимодействия, а также константа равновесия Величина последней, в данном случае, будет зависеть от степени аффинности взаимодействующих молекул Ясно что понятие аффинности в случае взаимодействия лектина со специфическими антителами («антиген-антитело») отличается от аффинности лектина в комплексе лектин—неспецифические антитела («лектин-углевод») Поскольку как лектины, так и антитела являются частью представляющих активный интерес биосистем нам показалось важным установление параметров их взаимодействия с целью понимания явления двойственной биоспецифики лектина и уточнения понятия «специфичность» в применении к наблюдаемым взаимодействиям

В настоящее время с применением математического моделирования описан так называемый метод серийных разведений для установления параметров лиганд-рецепторного взаимодействия (Bobrovmk, 2003) Метод основан на применении коордииат разведения (Bobrovmk, 1999), его важным преимуществом перед ранее разработанными является то, что он позволяет определять искомые параметры взаимодействия даже в том случае, если лиганд и рецептор изначально находятся в смеси Основная идея рассматриваемого метода серийных разведений состоит в том что использование закона действия масс для установления параметров лиганд—рецепторного взаимодеиствия возможно не только в случае применения постоянной концентрации одною из реагенте и постепенно увеличивающейся концентрации другого, на чем и основаны метозы Клотца и Скетчарда (Klotz, 1946, Scatchard, 1949), но также и в том случае еспи концентрации обоих реагентов изменяются одновременно При этом предложенные уравнения можно в равной степени использовать как при синхронном уменьшении концентраций реагентов (что проще всего реализовать разведением исследуемой смеси), так и при их синхронном увеличении (Бобровник 2004)

Закон действия масс для лиганд-рецепторно!о взаимодействия имеет следующий

вид

*,= с/(/-с)(г-с), (I)

где I - концентрация тиганда, г - концентрация связывающих центров рецептора, с -концентрация лшанд-рецепторного комплекса not те достижения состояния динамическою равновесия Если концентрацию лиганда и рецептора уменьшить или увеличить в d, раз, то рассматриваемая система придет к равновесию с иной концентрацией комплекса с,

Кг-с,/ (Ud, - c,)(r/d, - с,) (2)

В том счучае когда концентрация лиганда значительно превосходит концентрацию комплекса то есть Hd, » с„ уравнение (2) можно упростить

Кг - с, / Hd, (rid, - с,) (3)

В работе (Bobrovmk 2003) бьпо показано, что уравнение (3) можно привести к счедуюицему виду

г! г, = d, + IK(4)

Очевидно, что в том случае когда вместо молярных концентраций гиг, можно опредечять некие иные характеристики пропорциональные данным везичинам, например, величину пот лощения в ИФА, то получается

A„!A, = d, + lKf, (5)

где Ао ~ г, а А, ~ г.

Также бьпо показано (Бобровник, 2004), что, если исследуемые в ИФА антитела являются двухвалентными, то необходима соответствующая коррекция уравнения (5) После подобной коррекции уравнение преобразуется к виду

А„!А, +^A02/A2-dlAM, = d, + /Kf, (6)

откуда

Kf= MI (Ао/А, +^А„2/А,2- d,A,M,-dj (7)

В применении указанного метода к взаимодействию лектина G frondosa 0917 с антителами при ИФА понятно, что в случае гомологичных антител расчет параметров нужно вести согласно уравнению (6) что вытекает из теории строения молекул антител и наличия в них 2-х центров специфического связывания антигена, а также полученных в ходе эксперимента доказательств специфического связывания изучаемого лектина с гомологичными антителами Однако в случае негомологичных антител определять параметры взаимодействия нужно, очевидно, согласно уравнению (5), поскольку, связывание антител с лектином по принципу «лектин-углевод» вряд ли будет осуществиться более чем по одному «сайту» По этой же причине можно с уверенностью допустить что молярная концентрация комплекса лектина (лиганда) с негомологичными антителами (рецептором) будет несравнимо ниже молярной концентрации чистого лектина что является условием применения уравнений (3)—(S) В соответствии с этим, были проведены расчеты параметров в ¡аимодействия лектина с антителами В таблице 3 приведены данные ио ИФА взаимодеиствия изучаемого лектина со специфическими и неспецифическими антителами

Таблица 3

Константы связывания 1ектина С frondosa 0917 со специфическими (САт) и неспецифическими (НСАг) поликтоналышчи антителами, рассчитанные поданным ИФА

Лект ин М, 67 кДа nor потение при ИФА* К/ МО'моль"'

Абсолютная концентрация м кг/мп Количество вещества х 10"* моль САт НСАт САт НСАт

200 2 941 i 0 381 0 253

100 1471 , 0 339 0 190 4 97 2 83

50 0 735 0 318 0 157 6 85 4 63

25 0 368 0 276 0 НО 8 75 6 39

12 5 0 184 0 242 0 104 10 38 8 06

6 25 0 092 0 183 0 102 13 99 8 33

"Сретнис значения от не менее 15 по результатам нескольких ИФА

Константы святыиания (образования) взаимодействующих веществ в динамической равновесной системе, полученные согласно уравнениям (5) - (7), с учетом исполыуемого в ИФА двукратного титрования проб являются количественными характеристиками тектина как антигена Данные табтицы показывают, что величины констант связывания лектина (в оттшаковых молярных концентрациях) с гомологичными антителами в среднем в два paw больше чем таковые в случае негомологичных антител

Как известно прочность образующегося комптекса реагентов характеризуется изменением стандартной свободной энергии AG", при этом чем более отрицательно значение АС/' тем прочнее связь (Мсцлер 1980) Изменение стандартной свободной

энергии А С? при образовании межмолекулярной связи определяется стедукэщим соотношением с константой образования

Дбй = -ЛПп/Г/= -2-303/?rigA/-=-5 708 l^k-Дж/моль при 25°С, (8)

где R - газовая постоянная, Т - температура по Кельвину Согласно (8), используя средние значения логарифмов приведенных констант образования, были рассчитаны величины изменений стандартной свободной энергии Д(/ Эта величина при образовании связи «лектин G frondosa 0917-гомологичные антитела» в среднем составила -51.109 кДж/моль при 25°С, А(/'комплекса «лектин G frondosa 0917- негомологичные антитела» в среднем равна -50 121 кДж/моль при 25°С Таким образом, несмотря на различную (качественно и количественно) степень аффинности лектина к антителам энергия этих взаимодействий различается несущественно Учитывая, что на образование одной водородной связи приходится около 5 кДж (Мецлер, 1980), можно предположить, что контакт молекул лектина с антителами обеспечивают около 10-ти связеобразующих ОН-групп С позиций энергетики молекулярных взаимодействий нельзя назвать взаимодействие лектина с одним типом антител более специфичным, чем с другим хотя, с учетом более высоких величин констант связывания с гомологичными антителами, последние очевидно, будут более конкурентоспособны за образование связей с лектином Приведенные результаты являются иллюстрацией к решению вопроса о том, можно ли по результатам исследований на уровне гомогенных веществ, уже не явзяющихся частью живой системы однозначно судить об их функционировании в системе9 Контакт лектина с гомологичными антитезами, осуществляемый посредством антигенсвязывающих центров рецептора в живой системе вызвал бы блокирование лектина как антигена, а контакт лектина с негомологичными антителами посредством связей, основанных на случайной пространственной комплементарности частей биомолекут определенной конформации провоцировал бы, очевидно, совсем иной отклик системы Поэтому в данном случае речь может идти, вероятно, только о биологической специфичности хотя на мопеку тярном уровне имеет место универсализм взаимодействий

Свойство мицетиалыюго лектина G frondosa 0917 связываться как с гомологичными гак и с негомологичными антителами подтверждает принцип универсальности биоспецифических взаимодействий, обеспечивающих

биоинформационпый поток Взаимодействие «антиген-антитело» с этих позиций является частным случаем высокой аффинности от общего принципа специфических взаимодействий в основе которых лежит топологическая комплементарпость биомотекул Способность лектина к подобному связыванию позволяет предполагать, чго в углеводных детерминантах молекул неспецифических антител, скорее всего, присутствуют ключевые олигосахаридные звенья с комплементарной топологией связеобразующих групп которая, возможно в данном случае обеспечивается наличием а-(1—>2)-связанного 6-дезоксисахарида и (]-(1 —-3) связи, что образует характерный «изгиб» цепи В целом, ¡Í D-(1—»3)-связанные iликопиранозы встречаются наиболее часто в составе биологически активных упеводных полимеров высших базидиомицетов (Mizuno el al 1996 Yadomae, 2000) Возможно, пространственная геометрия олиго- и полисахаридов, обеспечиваемая именно этим гипом связи отобрана эволюционным процессом для передачи сигналов, немедленно запускающих защитно-адаптационные механизмы кпегок высших базидиальных грибов

Изучение роли лектнн - углеводных взаимодействии в контакте G frondosa 0917 н рнзобактернн A brasilense

Многочистенными работами было показано, что лектин-углеводные взаимодействия тежат в основе процессов распознавания при становлении различного рода взаимоотношений между организмами и несут информационную нагрузку, влекущую, как правило определенные изменения в жизнедеятельноеги организмов Однако в доступной литературе мало работ, посвященных исследованию роли лектин-

углеводных взаимодействий в жизнедеятельности грибов-базидиомицетов Установленная специфичность мицелиального лектина G frondosa 0917 к нетипичному углеводному полимеру D-рамнану - ОПС1 ЛПС A brasdense Sp245 - является необычной Азоспирнллы - грамотрицательные диазотрофы, относящиеся к альфа субклассу протеобактерий Особое внимание исследователей азоспириллы привлекают благодаря тому, что входят в группу ризобактерий, стимулирующих рост растений (Plant Growth-Promoting Bacteria PGPR) Помимо способности фиксировать атмосферный азот, они оказывают положительное воздействие на рост и развитие растений, благодаря выделению в ризосферу фитогормонов, витаминов и других биологически активных веществ (Woo et al, 2002)

Ранее было показано что ЛПС1 экспонированный в качестве наружной мембраны клеточных оболочек мутантных штаммов A brasdense КМ018 и КМ139, имеет в своем составе ОПС1, в отличие от ЛПСП мутантных штаммов A brasdense КМ252 и КМ348 с присутствующим в нем ОПС2 В состав наружных мембран клеток дикого штамма A brasdense Sp245 входят ЛПС имеющие оба ОПС (табл 4) Оба ОПС идентичны по структуре повторяющегося звена (линейный D-рамнан), но, очевидно, имеют несколько отличную конформацию, возможно, из-за присутствия фосфатов в качестве минорных заместителей (Федоненко и др , 2004), что делает ОПС 1 углеводным гаптеном для лектина G frondosa 0917 при полном отсутствии сродства к лектину у ОПС2 Поскольку в природе азоспиритлы и ксилотрофные базидиомицеты занимают разные экологические пиши и не вступают в контакт между собой, представилось логичным задать вопрос, будет ли лектин-углеводное распознавание существенным при искусственно спровоцированном контакте этих микроорганизмов и каким положительным или отрицательным, будет характер этого взаимодействия'' Обнаружение у лектина G frondosa 0917 специфичности к ОПС1 A brasdense Sp245 предоставило уникальную возможность изучения биоспецифичных взаимодействий при контакте )гих чужеродных как в таксономическом так и в экологическом плане микроорганизмов В связи с этим нами предпринята попытка изучения роли лектин-yi зеводною распознавания как биоспецифического взаимодействия при совместном ку 1ьтивировании G frondosa 0917 с A brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов дефектных по структуре ЛПС

Тлбзиця 4

Характеристика штаммов A brasdense

lili ам мы Характеристика Тип ЛПС Источник

Sp245 Дикий тип ЛПС1 ЛПСП [Baldani et al 1983]

KM0I8 Омегон-КМ мутант штамма Sp245 с инсерцией в тазмиде 120 МДа ЛПС1 [Katzyetal 1998]

КМ 139 Омегон-КМ мутант штамма Sp245 с инсерцией в плазмиде 120 МДа ЛПС1 [ Katzy et al 1998]

КМ252 Омегон-КМ мутант штамма Sp245 с инсерцией в плазмиде 120 МДа ЛПСП [Katzyetal 1998]

КМ348 Омегон-КМ мутант штамма Чр245 с инсерцией в пзазмиде 120 МДа ЛПСП [Katzyetal, 1998]

Дзя реализации поставленной задачи необходимо было подобрать усчовия эксперимента при коюрых малейшие изменения в совместном развитии микроорганизмов немедзенио отражались на морфолого-культуральных признаках и были явными Поскольку контакт целостных организмов реализуется посредством множественных биохимических схем с участием раззичных сшнаяьных механизмов (которые у базидиомицетов практически не изучались), возникал определенный риск неверной трактовки полученных результатов

Во избежание некорректных объяснений исследуемых явлений при контакте микроорганизмов параллельно, в качестве «ключевого», проводили эксперимент, условия которого отличались лишь кратковременной обработкой кончиков растущих мицелиальных гиф ОПС1, гаптенным лектину мицелия G. frondosa 0917.

Результаты, полученные в ходе исследования морфолого-культуральных характеристик колоний G. frondosa 0917 в совместных культурах с азоспириллами, приведены на рисунке 11 и в таблице 5.

Рис. 11. Морфология колоний G. frondosa 0917 в процессе кокультивирования со штаммами А. brasiiense В, С- совместная культура с A. brastlense Sp245. D, Е- с КМ348; F, G- с КМ252. Н. I- с КМ018, .1, К.- с КМ139. А контроль, чистая культура G. frondosa 0917; В, D, F, 11, J - совмещение нативных культур; С, Г. G. 1. К - совмещение культур после предобработки гиф ОПС1

Для совместной культуры со штаммами КМ018 и KM 139 (с ЛПС1) зона первичного контакта по периметру подсева представлена характерным кольцом воздушного редкого мицелия (рис. 1 1 Н. .1). В случае штаммов КМ252 и КМ348 (с ЛПСП) во всех опытах такая кольцевая зона была более четкой, ярче выраженной (рис 1 1 D, F), что можно трактовать как более резкое проявление антагонизма. Такая трактовка еще очевиднее, если сравнить указанные смешанные культуры с чистой (контрольной), морфологически однородной культурой гриба (рис. IIA), а также с совместной культурой гриба с диким штаммом Sp245. которая по морфологии практически ничем не отличается от контроля (рис 11В)

Заметные различия в морфологии мицелия в смешанных культурах наблюдали в опытах с предобработкой растущих гиф препаратом ОПС 1 перед подсевом бактериальных культур, по сравнению с опытами по их совмещению без предобработки. Как видно на рис. 1 1 (С, Е, G, I, К), морфологически мицелий более неоднороден, меньше диаметром; зона первичного контакта теперь выражена кольцом плотного мицелия, довольно четким и узким в случае со штаммами КМ01 8 и КМ139 (рис. 1 1 1. К). В кокультуре с КМ252 зона контакта более широкая и крайне неоднородная, с перемежающимися полосами и островками плотного и воздушного мицелия (рис 11 Е. G); в совместной культуре с КМ348 контактная зона неоднородная и более узкая, кольцо плотного мицелия очень четкое. Неупорядоченная агрегация гиф по типу «барража» (плотный, прижатый к поверхности среды мицелий в зоне первичного контакта) свидетельствует о напряженных адаптационных моментах в процессе распознавания «чужака» (Шнырева и др.. 1998) Поскольку условия экспериментов отличались только кратковременной предобработкой кончиков гиф ОПС1, возможным объяснением наблюдаемых явлений предположили

блокировку лектина гаптеииым ему ОПС1, что в конечном итоге привело к временному затруднению в контакте гиф с бактериальными клетками Но в процессе дальнейшего роста выработка лектина растущими гифами привела к распознаванию и более скорой «идентификации» пггаммов Sp245, КМ018 и КМ 139 по сравнению со штаммами КМ252 и КМ348, у которых зона противостояния гораздо ярче выражена, чем в случае с остальными

Таким образом, в морфологии колоний гриба при совместном культивировании были отмечены характерные различия, что в конечном итоге отразилось на PKj PKj для чистой (контрольной) культуры гриба определен как 131 48 ± 3 85 Данные таблицы 5 показывают, что в сравнении с РК, чистой культуры, кокультуры с бактериями штаммов A brasilense Sp245, КМ018 и КМ139 (с ЛПС1) характеризуются большими значениями РК, Наименьшие значения РК, отмечены для смешанных культур с бактериями штаммов КМ252 и КМ348 (с ЛПС11) РК, в экспериментах с предобработкой мицелиальных гиф раствором ОПС1 отличаются в цепом меньшими значениями, чем в экспериментах по совмещению чистых ку чьтур но в данном стучае, значения PKj в культурах с КМ252 и КМ348 существенно ниже значений дня совместных культур с КМ018 и КМ139 Такие значения получены из-за коэффициента однородности, который для указанных кокупьтур является самым низким (морфотогия мицелия крайне неоднородна)

Таблица 5

Ростовые характеристики кочоний С frondosa 0917 при совместном культивировании со штаммами Л brasüense

Штамм бактерий Совмещение ку тьтур без п ре юб работок Совмещение культур после предобработки гиф ОПС1

d, мм РК, d, мм РК,

Sp245 79 86 ± 2 03 143 74 ± 3 81 73 45 ± 1 85 88 14 ±2 44

KM0I8 76 62 ± 1 88 137 92 ± 3 76 72 57 ± 1 71 87 08 ±2 06

КМ 139 75 55 ± 1 95 135 99 ± 3 94 72 13 ± 1 78 86 56 ± 1 97

КМ252 74 34 ± 1 74 89 21 ±2 27 71 79 i 1 90 28 72 ±0 89

КМ348 75 66 ± 1 91 90 79 ± 2 46 72 03 ± I 82 28 81 ±0 87

Из данных таб шцы ви mo что в стучае дикою штамма A brasilense Sp245 можно говорить о ростостичулируюшем эффекте Мутантные штаммы KM0I8 и KMI39 практически не оказывают влияния на РК, мицелия В случае мутантных штаммов КМ252 и КМ348 наблюдается ингибирующий эффект ести судить по РК, Однако по скорости котонизации среды все совместные культуры отличаются незначительно

Изучение влияния 1ектина на поведение бактериальных клеток в некоторой степени моделирует события возможные при кон ¡акте целостных организмов Отмечалось что пектины раличного происхождения, если они проявляют одинаковую специфичность способны оказывать схожее втияние на клетки и ткани Так, ранее быто показано, что лектины некоторых растений (WGA тектин Solanum tuberosum) проявляющие специфичность к Ы-ацетил-р-Б-!люкозамину, уменьшают подвижность клеток некоторых штаммов I brasilense на полужидких средах индуцируя образование колоний состоящих из клеточных агрегатов, вместо концентрических макроколоний Конканавалнн А и ФГА имеющие другую специфичность, такого эффекта не провоцировали (ScheJudko el al 2007) Данные изучения втияния мицелиальною пектина на подвижность клеток показывают что лектин замедчяет индивидуальную подвижность A brasilense Sp245 причем длительность инкубации клеток бактерий с раствором пектина (1 мин или 30 мин) существенной роли не играет Как показано на рисунке 12, в диапазоне концентраций лектина от 0 I до 10 мкг/мл после инкубации в течение 1 чин происходит

снижение скорости движения А. ЬгазИепье Бр245 от 28.8±0.9 до 21.9±0.8 мкм/с. Дальнейшее увеличение концентрации лектина изменений скорости не вызывало

- 1 минута инкубации

- 30 минут инкубации

g 20

'i 10

о 1 ю юо юоо

концен трация лектина. мкг/мл Рис. 12. Влияние лектина С. /гопс!оза 091 7 на скорость движения бактерий А. hrasiien.se 8р245

Исследование подвижности бактерий мутантных штаммов КМ 139. КМ252 и КМ348 до и после их инкубации с .пектином в критической концентрации 10 мкг/мл в течение 1 мин показало, что под влиянием лектина скорость движения клеток КМ 139 (с ЛПС1) достоверно уменьшалась; скорость движения бактерий КМ252 и КМ348 (с ЛПС11) в присутствии лектина практически не изменялась (рис, 13).

□ нативные культуры

□ им Кубани я с лектином (10 мкг/мл) 1 мин

Sp2T5

Рис. 13. Сравнительная характеристика изменений подвижности азоспирилл в присутствии мицелиалыюго лектина

Мицелиальный лектин С. принципиально отличную от

frondosa 0917. хотя и вышеперечисленных

имеет углеводную специфичность, растительных лектинов, все же

993601520032

вызывает замедление индивидуальной подвижности азоспирилл, причем только у тех штаммов, в ЛПС которых экспонирован гаптенный лектину ОПС1 Следовательно, суть описываемого биологического эффекта не в углеводной специфичности лектина вообще, а в том, чтобы посредством этой специфичности обеспечивался непосредственный контакт с поверхностью бактериальной клетки То есть, в эффекте проявления биоспецифических лектин-углеводных взаимодействий также очень важным является высокое сродство к лектину самих углеводных рецепторов Факт, что отмеченное нами замедление индивидуальной подвижности азоспирилл имеет место лишь в ограниченном диапазоне небольших концентраций мицелиального лектина, что ранее также отмечалось и для растительных лектинов со специфичностью к Ы-ацетил-р-О-глюкозамину (Scheludko et al, 2007), говорит, скорее всего, о строго определенном количестве рецепторов для лектина на поверхности бактериальных клеток Таким образом, установленный факт, что бактериальные штаммы Sp245, КМ018 и КМ139, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1 с гаптенным лектину гриба ОПС1, распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма, а также то, что лектин оказывает влияние на подвижность бактерий штаммов Sp245 и КМ 139, свидетельствует об участии биоспецифических лектин-углеводных взаимодействий в первичном контакте мицелия G frondosa 0917 и бактерий Л brasilense в процессе совместного культивирования Лектин в данном случае является, скорее всего, неким селектирующим агентом, провоцирующим отклик только компетентных бактериальных клеток и обеспечивающим распознавательно-защитную функцию для гриба Учитывая то, что ОПС1 и ОПС2 в составе ЛПС1 и ЛПСН бактерий имеют идентичное по химическому составу повторяющееся пентарамнановое звено, полученные результаты говорят в пользу существующей в гликобиологии точки зрения, что возможные, даже крайне незначительные, конформационные модификации углевода—рецептора существенно влияют на биоспецифическую активность лектина, и, в конечном итоге, на биологический ответ на уровне организмов

Таким образом, представленные экспериментальные данные по выделению, характеристике и возможной функциональной роли мицелиального лектина базидиомицета G frondosa 0917, а также подробный анализ этих данных с позиций современной лектинологии, подтверждают концепцию о лектинах как агентах, играющих важную роль в потоке биоинформации при процессах молекулярного/клеточного распознавания и адаптации Полученные сведения о лектине G frondosa 0917, локализующемся на поверхности мицелиальных гиф, показывают наличие структурных признаков, объединяющих его с лектинами, полученными из других базидиальных грибов (димерная структура, наличие углеводной части, отсутствие серосодержащих аминокислот) Однако углеводная специфичность полученного лектина кардинально отличается от подавляющего большинства подобных веществ базидиальной природы лектин G frondosa 0917, не проявляющий сродства к свободным сахарам, блокируется линейным D-рамнаном в малых концентрациях, то есть является эндолектином Тот факт, что гаптенный лектину D-рамнан является ОПС1 наружной мембраны грамотрицательной бактерии A brasdense Sp245, позволяет предполагать, что эволюционное предназначение изучаемого грибного лектина как «агента-дешифровщика» в переносе биоинформации заключается в том, чтобы распознавать по «ключевым» олигосахаридным звеньям биополимеры, широко представленные, как известно, в природе в поверхностных тканях растений и микроорганизмов Понятно, что распознавание является первым этапом в процессах адаптации и защиты от антагонистов

Данные сравнительных расчетов степени аффинности (констант равновесия) и изменения свободной энергии связывания лектина G frondosa 0917 с антителами показывают, что комплекс лектина с негомологичными антителами, обуславливающийся спецификой «лектин-углевод», и таковой с гомологичными антителами обеспечиваются примерно одинаковым количеством связей Это служит в пользу концепции о

взаимодействии «антиген-антитело» как о частном случае высокой аффинности от общего принципа специфических взаимодействий, в основе которых лежит топологическая комплементарность молекул

На основании полученных данных можно говорить о лектине G frondosa 0917 как

0 факторе, характеризующемся достаточной универсальностью функционирования и выполняющем распознавательно—защитную функцию в жизнедеятельности базидиомицета Препарат лектина G frondosa 0917 может быть рекомендован для изучения клеточных полимеров грамотрицательных бактерий, а также для иммунохимических исследований, касающихся строения и функционирования антител

ВЫВОДЫ

1 Обнаружена лектиновая активность в экстрактах дикариотического мицелия базидиального ксилотрофа G frondosa 0917 при различных способах культивирования Наибольшее проявление активности отмечено в отношении нативных эритроцитов кролика при использовании легких смывов поверхностного мицелия, полученного в процессе твердофазного культивирования

2 Установлено, что лектин, выделенный из экстрактов поверхностного мицелия G frondosa 0917, имеет молекулярную массу 67±1 кДа, состоит из двух субъединиц по 3334 кДа, и проявляет углеводную специфичность к линейному D-рамнану, который является ОПС1 наружной мембраны грамотрицательной бактерии Л brasilense Sp245

3 Показано, что полученный лектин является гидрофильным термосгабильным (с температурным диапазоном сохранения активности от -70 до +50'С) гликопротеином с соотношением частей протеин гликан как 3 1 Аминокислотный состав лектина характеризуется наибольшим процентным содержанием аргинина, лизина, гистидина и аспарагиновой кислоты, а также полным отсутствием серосодержащих аминокислот метионина и цистеина В составе углеводной части определены глюкоза и глюкозамин

4 Локализация лектина на поверхности гиф мицелия характеризуется неравномерным и диффузным распределением с характерными скоплениями в пряжках и молодых гифальных отростках

5 Обнаружено, что лектин G frondosa 0917 способен к связыванию, как со специфическими, так и с неспецифическими поликлональными антителами кролика, а также с у-глобулином человека Связывание лектина с гомологичными антителами происходит с участием антигенсвязывающего центра (.Раб-фрагментов) Взаимодействие лектина с негомологичными антителами обусловлено его связыванием с углеводной частью молекул антител

6 Впервые показано, что величины изменения суммарной свободной энергии ДС5 взаимодействий лектина с гомологичными и негомологичными антителами различаются несущественно, что говорит о примерно одинаковом количестве связей, участвующих в контакте молекул лектина и антител обоих типов, хотя аффинность лектина к последним качественно отлична

7 Лектин-углеводные взаимодействия имеют место в процессах взаимораспознавания при контакте G frondosa 0917 и бактерий A brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по ЛПС Показано, что совместные культуры с бактериями, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1 с галгенным лектину мицелия ОПС1 (КМ018 и КМ139), характеризуются большим ростовым коэффициентом и наименьшим проявлением антагонизма, чем в случае совместных культур с азоспиридпами с ЛПСП (ОПС2) в составе клеточной стенки (КМ252 и КМ348)

8 Выявлено, что мицелиальный лектин в диапазоне концентраций 0 1-10 мкг/мл в течение 1 мин уменьшает подвижность в жидкой среде азоспирилл с ЛПС1 - А brasilense Sp245 и его мутанта КМ 139 Подобного влияния на клетки штаммов КМ252 и КМ348 (с ЛПСП) не происходит

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Степанова Л В, Цивилева О М , Никитина В Е Сравнительное исследование гемагпютинирутогцей активности ксилотрофцых базидиомицетов разных систематических групп // Биология - наука XXI века 8-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 мая 2004 г) Сборник тезисов -Пущино Изд-во Пущинского научного центра РАН, 2004 - С 162

2 Никитина BE, Цивилева ОМ, Степанова Л В, Лощинина ЕА Поиск группоспецифичных лектинов грибного происхождения // Успехи медицинской микологии Под общ научной редакцией акад РАЕН Ю В Сергеева - М Национальная академия микологии, 2005 - Т 5 - С 201-205

3 Степанова Л В , Никитина В Е , Цивилева О М , Лощинина Е А , Гарибова Л В , Тюрюкина Е В Гемагглютинирующая активность некоторых базидиальных ксилотрофов на стадии дикариотического мицелия // Микология и фитопатология -2006 -Т 40, №4 - С 307-313

4 Stepanova L V., Nikitina V Е , Konnova S А , Boyko A S Isolation and characterization of a saline-soluble hemagglutinin from the hypha surface of dikaryotic mycelium of the xylotrophic basidiomycete Grifola jrondosa (Fr) S f- Gray strain 0917 // XXIIIrd International Carbohydrate Symposium (Whistler, Canada, July 23-28 2006) Book of abstracts - Simon Fraser University, 2006 - P 208

5 Степанова Л В , Бурыгин Г Л , Никитина В Е , Матора Л Ю , Богатырев В А Изучение иммунохимических свойств мицелиального лектина базидиомицета Grifola frondosa (Fr ) S F Gray 0917 // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой III Межрегиональная конференция молодых ученых (Саратов, 10-12 октября 2006 г) Сборник тезисов - Саратов Научная книга, 2006 - С 29

6 Степанова Л В , Никитина В Е , Шелудько А В Совместное культивирование базидиомицета Grifola frondosa (Fr ) S F Gray и ризобактерии Azospirillum brasilense значение специфических взаимодействий при первичном контактировании // Успехи медицинской микологии - М Национальная академия микологии, 2007 - Т 9 - С 261-265

7 Nikitina V Е , Tsivileva О М , Vetchinkina Е Р , Stepanova L V , Loshchimna Е A Lectins of xylotrophic basidiomycetes Lentinus edodes and Grifola frondosa Н XV Congress of European Mycologists (Saint-Retersburg, Russia, September 16-21, 2007) Abstracts - St Retersburg TREEART LLC, 2007 -P 175

8 Степанова Л В, Шелудько А В , Никитина В Е , Пономарева Е Г Участие лектина с поверхности мицелия базидиомицета Grifola frondosa (Fr) S F Gray в биораспознавании при контакте с бактериями рода Azospirillum II Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем Материалы Всероссийской конференции с международным участием (Саратов, 25-27 сентября 2007г) - Саратов Научная книга, 2007 - С 94

9 Степанова Л В , Ветчинкина Е П , Шелудько А В , Пономарева Е Г, Никитина В Е Влияние лектинов Grifola frondosa (Fr) S F Gray и Lentinus edodes (Berk) Sing на инициацию их плодоношения // Вавиловские чтения-2007 Материалы международной конференции, посвященной 120-летию со дня рождения НИ Вавилова (Саратов, 2630 ноября 2007) - Саратов Научная книга, 2007 -Т 1 -С 199-200

10 Степанова Л В , Никитина В Е , Бойко А С Выделение и характеристика лектина с поверхности мицелия Grifola frondosa (Fr) S F Gray // Микробиология - 2007 - T 76, №4 -C 488-493

11 Stepanova L V., Schelud'ko A V , Katsy E 1 , Ponomareva E G , and Nikitina V E The role of lectm-carbohydrate biospecific interactions between medicinal Basidiomycetes mushroom Grifola frondosa (Dicks Fr) S F Gray and Azospirillum brasilense during their co-cultivation // Int J Med Mushr -2008 - Vol 10, N I -P 65-72

Подписано в печать 21 01 2008 Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Гарнитура Times New Roman Печать R1SO Объем 1.0 печ л Тираж 100 экз Заказ №016

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю Б Свидетельство № 3117 410600 Саратов, ул Московская, 152, офис 19, тел 26-18-19 51-16-28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанова, Лада Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика экогруппы базидиальных ксилотрофов

1.1.1. Биологически активные вещества, обуславливающие полезные свойства базидиальных ксилотрофов

1.1.2. Grifola frondosa как типичный трутовик - ксилотроф

1.2. Общие представления о лектинах

1.3. Лектины с позиций современной гликобиологии

1.3.1. Лектины: попытки классификации

1.3.2. Лектины и углеводный код

1.3.3. Факторы лектиновой активности

1.3.3.1. Субъединичная структура лектинов

1.3.3.2. Посттрансляционная модификация и множественные формы лектинов

1.3.3.3. Расширенный центр связывания лектина с рецептором: конфигурационная и конформационная селективность связывающих сайтов

1.3.3.4. Гидрофобное связывание

1.3.4. Лектин-рецепторная система как реализация эпигенетического углеводного кода: организация и функционирование

1.4. Лектины базидиальных ксилотрофов

1.4.1. Лектины базидиомицетов: общая характеристика

1.4.2. Лектины базидиомицетов-ксилотрофов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Культуры микроорганизмов, использованные в работе

2.2. Условия выращивания микроорганизмов

2.3. Основные реактивы, использованные в работе

2.4.Выделение лектина с поверхности дикариотического мицелия

2.5. Постановка реакции гемагглютинации и получение нативных эритроцитов кролика

2.6. Определение специфичности выделенного лектина

2.7. Гель - электрофорез в денатурирующих условиях

2.8. Изучение химического состава лектина

2.9. Исследование морфолого-культуральных характеристик колоний G. frondosa 0917 в совместных культурах с A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантами

2.10. Изучение влияния препарата мицелиального лектина G. frondosa 0917 на подвижность клеток азоспирилл

2.11. Получение поликлональных кроличьих антител к лектину

G. frondosa

2.12. Мечение лектина и специфических антител коллоидным золотом

2.13. Иммунодот-анализ на нитроцеллюлозной мембране

2.14. Получение Fab- и Fc- фрагментов антител

2.15. ИФА взаимодействия лектина со специфическими и . неспецифическими антителами

2.16. Определение локализации лектина G. frondosa

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Обнаружение, выделение, физико-химические свойства и локализация мицелиального лектина G. frondosa

3.1.1. Обнаружение и динамика лектиновой активности экстрактов дикариотического мицелия G. frondosa

3.1.2. Выделение лектина G. frondosa

3.1.3. Определение молекулярной массы лектина

3.1.4. Определение гликановой составляющей в растворах лектина

3.1.5. Углеводная специфичность лектина

3.1.6. Анализ химического состава лектина

3.1.7. Влияние температуры на стабильность лектина

3.1.8. Локализация лектина на мицелиальных гифах

3.2. Иммунохимические свойства мицелиального лектина

G. frondosa

3.2.1. Выявление специфичности связывания лектина G. frondosa

0917 с гомологичными антителами

3.2.2. Изучение взаимодействия лектина G. frondosa 0917 с негомологичными антителами методом ИФА

3.2.3. Расчет параметров взаимодействия лектина G. frondosa 0917 со специфическими и неспецифическимими антителами

3.3. Изучение роли лектин - углеводных взаимодействий в контакте

G. frondosa 0917 и ризобактерий A. brasilense

3.3.1. Исследование морфолого-культуральных характеристик колоний G. frondosa 0917 в совместных культурах с A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантами

3.3.2. Изучение влияния мицелиального лектина G. frondosa 0917 на подвижность клеток азоспирилл

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика мицелиального лектина базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray"

Актуальность проблемы. Интерес к высшим съедобным базидиомицетам (Basidiomycetes) как источникам вкусной и полезной биомассы, содержащей различные биологически активные вещества, непрерывно возрастает. Научные изыскания, предваряющие и обосновывающие начало массового промышленного культивирования тех или иных грибов, как правило, лишь констатируют наличие каких-либо полезных свойств и активностей, характеризующих конкретный грибной объект с положительной стороны. В связи с этим изучение активных метаболитов базидиомицетов, определение их биологического действия в связи с аспектами их жизнедеятельности представляют важную задачу.

Нельзя назвать случайным установленный факт, что практически все биологически активные вещества, продуцируемые базидиальными грибами, являются либо гликанами, либо гликоконъюгатами (Ikekawa, 2001; Wasser, 2002). В научном сообществе уже сложилось представление об особом значении гликозилирования белков как неотъемлемой части углеводного обмена различных организмов. Это представление базируется на современных позициях гликобиологии, доказывающих, что важнейшая функция углеводов в метаболизме любых организмов связана не только с энергетическим, но и биоинформационным потенциалом таковых, поэтому большое количество белков в организмах гликозилированы (Dwek, 1996; Drickamer, 1998; Reuter and Gabius, 1999). Функционирование некоторых метаболических систем, большей частью тех, что имеют экстраклеточную направленность, с использованием углеводного биоинформационного потенциала возможно благодаря осуществлению биоспецифического углевод-белкового взаимодействия. Подобное взаимодействие реализуется, в основном, с помощью лектинов, способных распознавать определенные углеводные детерминанты в клеточных структурах (как, например, в метаболической схеме процессов адгезии ризобиальных клеток к тканям корней бобовых и инициации симбиоза, в реализации которых критическая роль отведена лектинам бобовых растений-макросимбионтов (Баймиев и др., 2005). То есть, если некоторые гликозидные структуры в живой клетке представляют собой определенный информационный потенциал (Laine, 1997; Solis et al., 2001), то его реализация требует участия лектиновых субстанций (Lis and Sharon, 1998).

Активные многосторонние исследования лектинов растений, животных и бактерий ярче подчёркивают существенный пробел в научных работах по изучению лектинов базидиомицетов. Это представляется особенно важным в отношении экогруппы базидиальных ксилотрофов, являющихся продуцентами важных иммуномодулирующих и противоопухолевых гликанов и гликопротеинов. Анализ литературных данных показал, что исследования лектинов базидиомицетов немногочисленны и связаны, в основном, с выделением лектинов из плодовых тел, которые являются лишь кратковременными формированиями со строго определенной функцией. Крайне мало работ по изучению лектинов базидиомицетов на стадии дикариотического мицелия, основной и более значимой стадии роста грибного организма как биологического индивида. При этом подавляющее большинство исследований в этом направлении касаются представителей порядка Агариковых (Agaricales), вероятно, в силу наибольшего практического интереса к ним. Отмечалось, что у представителей другого порядка - Афиллофоровых (Aphyllophorales) или трутовиков - лектиновая активность обнаруживается редко (Konska, 2006). Несомненно, изучение лектинов как биоспецифических агентов в метаболизме базидиального ксилотрофа расширит спектр фундаментальных знаний о существовании и, возможно, реализации углеводного биоинформационного потенциала у этих организмов. Кроме того, подобные исследования имеют важное прикладное значение: лектины различного происхождения, в том числе выделенные из некоторых высших грибов (Debray et al., 1991; Guillot et al., 1990), выпускаемые как фармакологические препараты, широко применяются в медико-биологических исследованиях (Mody et al., 1995; Gabius, 1998; Gabius et al., 1998; Rudiger et al, 2000).

Трутовик Grifola frondosa, в силу исключительных свойств биомассы (к настоящему времени из плодовых тел и мицелия выделено около 30 биологически активных веществ, большей частью, полисахаридов) является объектом пристального изучения. Однако научный поиск имеет ярко выраженный прикладной характер: основной целью исследований является обнаружение и описание биологически активных гликанов и гликоконъюгатов, обладающих медицинским/фармакологическим эффектом. При этом материалом для работы являются, как правило, плодовые тела. Фундаментальный аспект изучения продукции и функционирования этих метаболитов в процессе развития самого базидиомицета, практически отсутствует. В доступной литературе обнаружена всего 1 работа по выделению лектина из плодовых тел этого гриба (Kawagishi et al., 1990b). На основании вышеизложенного, нами было предпринято исследование его лектиновой активности на стадии дикариотического мицелия.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось обнаружение, выделение и характеристика лектина с поверхности дикариотического мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa штамм ["> 0917.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать экстракты дикариотического мицелия G. frondosa 0917, полученного разными способами культивирования, и установить наличие у них лектиновой (гемагглютинирующей) активности.

2. Выделить гомогенный препарат лектина с поверхности дикариотического мицелия G. frondosa 0917, определить углеводную его специфичность и локализацию.

3. Изучить некоторые физико-химические, а также иммунохимические свойства выделенного лектина.

4. Исследовать возможную роль лектин-углвводного распознавания как биоспецифического взаимодействия при совместном культивировании G. frondosa 0917 с Azospirillum brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов.

5. Оценить влияние изучаемого лектина на подвижность бактерий указанных штаммов в жидкой среде.

Научная новизна. Впервые с поверхности дикариотического мицелия выделен и очищен лектин с молекулярной массой 68±1 кДа, установлена его углеводная специфичность, состав; описаны некоторые физико-химические свойства.

Дана характеристика полученного лектина как антигена, включающая не только качественные, но также и количественные параметры его взаимодействия с антителами. Было установлено, что лектин G. frondosa 0917 способен к связыванию, как со специфическими, так и с неспецифическими поликлональными антителами кролика; последнее обусловлено взаимодействием лектина с олигосахаридами антител.

Впервые показано, что, несмотря на качественно различную аффинность лектина при взаимодействии с молекулами гомологичных и негомологичных антител, количественно эти взаимодействия обусловлены образованием примерно одинакового количества связей, о чем свидетельствуют близкие по значению величины изменения стандартной свободной энергии этих систем.

Установлено, что лектин-углеводные взаимодействия имеют место в процессах взаимораспознавания при спровоцированном контакте G. frondosa 0917 и бактерий A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по ЛПС. При этом мутантные штаммы - КМ018 и КМ139, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1 с гаптенным лектину мицелия ОПС1 распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма, чем в случае штаммов КМ252 и КМ348, в состав клеточной стенки которых входит ЛПСН.

Выявлено, что мицелиальный лектин уменьшает подвижность бактерий A. brasilense Sp245 и КМ139 в жидкой среде.

Научно-практическая значимость. Получен гомогенный препарат мицелиального лектина G. frondosa 0917 с необычной углеводной специфичностью, который может применяться в исследованиях полимеров клеточной стенки грамотрицательных бактерий, а также для иммунохимических исследований, касающихся строения и функционирования антител. Комплекс данных, полученных в настоящей работе, может послужить основой дальнейших фундаментальных исследований механизма функционирования лектин-рецепторной системы у базидиомицетов.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии (JIMM) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках бюджетных тем: "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (направление 5.10), научный руководитель темы д.б.н., зав. JIMM Никитина В.Е., № гос. регистрации 01970008158; «Роль углеводсвязывающих гликопротеинов в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (направление 5.10), ''' научный руководитель темы д.б.н., зав. JIMM Никитина В.Е., № гос. регистрации 01200606184. Работа выполнялась также при поддержке гранта РФФИ 04-48129а «Лектины ксилотрофных базидиомицетов разных систематических групп». Материалы диссертации использованы при выполнении дипломной работы кафедры микробиологии и физиологии растений биологического факультета СГУ им. Н.Г. Чернышевского.

Положения, выносимые на защиту

1. Проявление лектиновой активности, обнаруженной у экстрактов дикариотического мицелия G. frondosa 0917 в процессе культивирования на некоторых жидких и твердых средах, является наибольшим для легких смывов с поверхности 10-18-суточного мицелия при твердофазном культивировании при использовании нативных эритроцитов кролика.

2. Лектин, выделенный с поверхности дикариотического мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa 0917, имеет молекулярную массу 67±1кДа и состоит из двух субъединиц по 33-34 кДа.

3. Полученный лектин представляет собой гидрофильный термостабильный гликопротеин с соотношением частей протеин: гликан как 3:1; проявляет высокую специфичность к линейному D-рамнану — ОПС1, выделенному из ЛПС1 грамотрицательных диазотрофных ризобактерий A. brasilense Sp245.

4. Лектин G. frondosa 0917 взаимодействует как со специфическими (к лектину), так и с неспецифическими (к О-антигенам бактерий Sp245, SI 7) поликлональными кроличьими антителами, а также с у-глобулином человека. Связывание лектина с гомологичными антителами происходит с участием антигенсвязывающего центра (/^-фрагментов). Взаимодействие лектина с негомологичными антителами обусловлено его связыванием с углеводной частью молекул антител.

5. Равновесные системы взаимодействия лектина G. frondosa 0917 с гомологичными и негомологичными поликлональными антителами характеризуются различной степенью аффинности. Однако различие в величинах изменений стандартной свободной энергии A G° обеих систем несущественно, что говорит о примерно одинаковом количестве связей, участвующих в контакте молекул лектина и антител обоих типов.

6. При совместном культивировании базидиомицета G. frondosa 0917 и ризобактерий A. brasilense штамма Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по ЛПС, установлены биоспецифические лектин— углеводные взаимодействия, отражающиеся на морфологических характеристиках грибного мицелия. При этом с наименьшим антагонизмом распознаются штаммы A. brasilense, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1 с гаптенным ОПС1.

7. Лектин G. frondosa 0917 в диапазоне концентраций 0.1-10 мкг/мл уменьшает подвижность азоспирилл штаммов Sp245 и КМ139 (с ЛПС1); подобного влияния на клетки штаммов КМ252 и КМ348 (с ЛПСП) не происходит.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 8 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино, Россия, 2004), на 3-ей Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006), на 23-м Международном симпозиуме по углеводам (Уистлер, Канада, 2006), на 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, Россия, 2007), на 15-м Международном конгрессе европейских микологов (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, Россия, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, Россия, 2007).

Диссертационная работа обсуждена на расширенном заседании лаборатории микробиологии и микологии 28 ноября 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в отечественных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 1 статья в зарубежном рецензируемом издании.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, изложения и обсуждения результатов работы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 227 источников. Объем диссертации составляет 131 машинописных страниц. Работа содержит 19 рисунков и 5 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Степанова, Лада Викторовна

выводы

1. Обнаружена лектиновая активность в экстрактах дикариотического мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa 0917 при различных способах культивирования. Наибольшее проявление активности отмечено в отношении нативных эритроцитов кролика при использовании легких смывов поверхностного мицелия, полученного в процессе твердофазного культивирования.

2. Установлено, что лектин, выделенный из экстрактов поверхностного мицелия G. frondosa 0917, имеет молекулярную массу 67±1 кДа, состоит из двух субъединиц по 33-34 к Да и проявляет углеводную специфичность к линейному D-рамнану, который является ОПС1 наружной мембраны грамотрицательной бактерии A. brasilense Sp245.

3. Показано, что полученный лектин является гидрофильным термостабильным (с температурным диапазоном сохранения активности от -70 до +50°С) гликопротеином с соотношением частей протеин: гликан как 3:1. Аминокислотный состав лектина характеризуется наибольшим процентным содержанием аргинина, лизина, гистидина и аспарагиновой кислоты, а также полным отсутствием серосодержащих аминокислот метионина и цистеина. В составе углеводной части определены глюкоза и глюкозамин.

4. Локализация лектина на поверхности гиф мицелия характеризуется неравномерным и диффузным распределением с характерными скоплениями в пряжках и молодых гифальных отростках.

5. Установлено, что лектин G. frondosa 0917 способен к связыванию, как со специфическими, так и с неспецифическими поликлональными антителами кролика, а также с у-глобулином человека. Связывание лектина с гомологичными антителами происходит с участием антигенсвязывающего центра (Тчгб-фрагментов). Взаимодействие лектина с негомологичными антителами обусловлено его связыванием с углеводной частью молекул антител.

6. Впервые показано, что величины изменения суммарной свободной энергии AG0 взаимодействий лектина с гомологичными и негомологичными антителами различаются несущественно, что говорит о примерно одинаковом количестве связей, участвующих в контакте молекул лектина и антител обоих типов, хотя аффинность лектина к последним качественно отлична.

7. Пектин-углеводные взаимодействия имеют место в процессах взаимораспознавания при спровоцированном контакте G. frondosa 0917 и бактерий A. brasilense Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по ЛПС. Показано, что совместные культуры с бактериями, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1 с гаптенным лектину мицелия ОПС1 (КМ018 и КМ139), характеризуются большим ростовым коэффициентом и наименьшим проявлением антагонизма, чем в случае совместных культур с азоспириллами с ЛПСП (ОПС2) в составе клеточной стенки (КМ252 и КМ348).

8. Выявлено, что мицелиальный лектин в диапазоне концентраций 0.1-10 мкг/мл в течение 1 мин уменьшает подвижность в жидкой среде азоспирилл с ЛПС1 - A. brasilense Sp245 и его мутанта КМ139. Подобного влияния на клетки штаммов КМ252 и КМ348 (с ЛПСП) не происходит.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные впервые экспериментальные данные по выделению, характеристике и возможной функциональной роли мицелиального лектина базидиомицета G. frondosa 0917, а также подробный анализ этих данных с позиций современной лектинологии, подтверждают концепцию о лектинах как агентах, играющих важную роль в потоке биоинформации при процессах молекулярного/клеточного распознавания и адаптации. Полученные сведения о лектине G. frondosa 0917, локализующемся на поверхности мицелиальных гиф, показывают наличие структурных признаков, объединяющих его с лектинами, полученными из других базидиальных грибов (димерная структура, наличие углеводной части, отсутствие серосодержащих аминокислот). . Однако углеводная специфичность полученного лектина кардинально отличается от подавляющего большинства подобных веществ базидиальной природы: лектин G. frondosa 0917, не проявляющий сродства к свободным сахарам, блокируется линейным. D-рамнаном в малых концентрациях, то есть является эндолектином. Тот факт, что гаптенный лектину D-рамнан является ОПС1 наружной мембраны грамотрицательной бактерии A. brasilense Sp245, позволяет предполагать, что эволюционное предназначение изучаемого грибного лектина как «агента-дешифровщика» в переносе биоинформации заключается в том, чтобы распознавать по «ключевым» олигосахаридным звеньям биополимеры, широко представленные, как известно, в природе в поверхностных тканях растений и микроорганизмов. Понятно, что распознавание является первым этапом в процессах адаптации и защиты от антагонистов.

Свойство мицелиального лектина G. frondosa 0917 связываться как с гомологичными, так и с негомологичными антителами подтверждает принцип универсальности биоспецифических взаимодействий, обеспечивающих биоинформационный поток. Способность лектина к связыванию с неспецифическими антителами позволяет предполагать, что в углеводных детерминантах молекул антител, скорее всего, присутствуют ключевые олигосахаридные звенья с комплементарной топологией связеобразующих групп, которая в данном вероятном случае обеспечивается наличием а-(1—>2)-связанного 6-дезоксисахарида и р-(1—»3) связи, что образует характерный «изгиб» цепи. Данные сравнительных расчетов степени аффинности (констант равновесия) и изменения свободной энергии связывания лектина G. frondosa 0917 с антителами показывают, что комплекс лектина с негомологичными антителами, обуславливающийся спецификой «лектин-углевод», и таковой с гомологичными антителами обеспечиваются примерно одинаковым количеством связей. Это служит в пользу концепции о взаимодействии «антиген-антитело» как о частном случае высокой аффинности от общего принципа специфических взаимодействий, в основе которых лежит топологическая комплементарность молекул.

Как уже упоминалось, [3-D-(l—>3)-связанные гликопиранозы встречаются наиболее часто в составе биологически активных углеводных полимеров высших базидиомицетов. Если оценивать этот факт в свете концепции переноса информации с помощью углеводного кода, то, возможно, пространственная геометрия олиго- и полисахаридов, обеспечиваемая именно этим типом связи, отобрана эволюционным процессом для передачи информационных сигналов, немедленно запускающих защитно-адаптационные механизмы клеток высших базидиальных грибов.

Установленное отсутствие взаимодействия исследуемого лектина с ОПС2, который наряду с ОПС1 входит в состав ЛПС мембраны A. brasilense Sp245 и также является линейным D-рамнаном, демонстрирует один из принципов парадигмы углеводного кода: даже минорные изменения углевода-рецептора, которые могут иметь место при незначительном присутствии/введении заместителей (а ОПС1 отличается от ОПС2 большим содержанием фосфатов), не будут восприниматься лектином-«дешифровщиком», если эти изменения влекут за собой конформационные модификации углевода, а, следовательно, и топологию его связеобразующих групп. Последнее приобретает особую важность для эндолектинов, так как для взаимодействия с ним должна быть топологическая комплементарность не одного, а нескольких углеводов, фиксированных гликозидными связями в олигомерном звене. Избирательность углеводной специфики лектина G. frondosa 0917 позволила показать, что, в конечном итоге, она обуславливает специфический ответ на уровне целостных организмов при их контакте, несмотря на то, что этот контакт был спровоцирован искусственно, и в природе G. frondosa и A. brasilense занимают разные экологические ниши и не встречаются.

Таким образом, в настоящей работе существенным представляется то, что лектин базидиомицета не просто выделен и исследован как гомогенный препарат, но впервые на основании углеводной специфичности экспериментально продемонстрирована и проанализирована его функциональная роль в контексте парадигмы общебиологического характера - участие в обеспечении переноса информации эпигенетического углеводного кода. На основании полученных данных можно говорить о лектине как о факторе, выполняющем распознавательно-защитную функцию в жизнедеятельности базидиомицета. Каким образом осуществляется анализ информации, поданной лектином мицелиальной клетке, какие механизмы задействуются при этом, - ответы на эти вопросы планируются как продолжение фундаментальных исследований в этом направлении.

Препарат лектина G. frondosa 0917 может быть рекомендован для изучения клеточных полимеров грамотрицательных бактерий, а также для иммунохимических исследований, касающихся строения и функционирования антител. Полученные специфические антитела к лектину планируется использовать в дальнейших исследованиях по выявлению уровня экспрессии лектина тканями гриба на разных стадиях морфогенеза. Антитела также могут применяться при изучении степени гомологии лектинов, продуцируемых разными штаммами вида G. frondosa.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанова, Лада Викторовна, Саратов

1. Аленькина С.А. Физико-химические и адгезивные свойства лектинов азоспирилл. Дисс. . канд. биол. наук. Саратов: РНИПЧИ «Микроб», 1994.

2. Антонюк В.А. Характеристика лектина из плодовых тел Boletus luridus Schff. ex Fr. // Микол. и фитопатол. 1997. - Т. 31. - С. 35-41.

3. Антитела. Методы: Кн.1: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. М.: Мир, 1991.-287 с.

4. Бобровник С. А. Влияние концентрации лиганда на точность определения параметров лиганд-рецепторного взаимодействия методом серийных разведений // Укр. 6ioxiM. журн. 2004. - Т. 76, № 3. - С. 142148.

5. Бухало. А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. — Киев: Наукова думка, 1988. 144 с.

6. Гарибова Л.В., Сидорова И.И. Грибы. Энциклопедия природы России. -М.: ABF, 1997.-352 с.

7. Губайдуллин И.И. Гибридные лектины с измененными углеводсвязывающими свойствами и их влияние на бобово-ризобиальный симбиоз. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Уфа: ГОУ ВПО Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА, 2005. - 23 с.

8. Калинин Н.Л., Кулякина М.Н. Метод оценки углеводспецифичного взаимодействия иммуноглобулинов с биотинилированными лектинами // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. - Т. 34, № 1. - С. 66-69.

9. Карпунина Л.В., Вишневецкая О.А., Богатырев В.А., Никитина В.Е., Итальянская Ю.В. Определение локализации лектинов, агглютининовпочвенных азотфиксирующих бактерий // Микробиология. 1995. - Т.64, № 4.-С. 453-457.

10. Коннова О.Н. Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum. Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 2006. — 20 с.

11. Королев Н.П. Функции лектинов в клетках // Итоги науки и техники. Сер. Общие проблемы физ.-хим. биологии. Т. 1. - М.: ВИНИТИ, 1984. -351 с.

12. Кочетков Н.К. Необычные моносахариды компоненты О-антигенных полисахаридов микроорганизмов // Успехи химии. - 1996. — Т. 9.-С. 799-835.

13. Лахтин В.М. Лектины регуляторы метаболизма // Биотехнология. -1986, №6.-С. 66-79.

14. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3-х томах. Т.2. - М.: Мир, 1985.-368 с.

15. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Вища школа, 1981. - 156 с.

16. Методы экспериментальной микологии. Справочник / Под общ. ред. И.А. Дудка. Киев: Наукова думка, 1982. - 551с.

17. Мецлер Д. Биохимия. В 3-х томах. Т. 1. М.: Мир, 1980.-408 с.

18. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М.: Наука, 1991. - 272 с.

19. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. М.: Мир, 1995. - 343 с.

20. Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Пономарева Е.Г., Соколов О.И. Влияние лектинов азоспирилл на способность семян к прорастанию // Известия АН. Сер. биол. 2004. - № 4. - С. 431-435.

21. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорган, химия. — 1998. — Т. 24, № 7. — С. 483— 501.

22. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-536 с.

23. Патент № 2237719 РФ, МКИ С12 Р19/04. Способ получения липополисахаридов / Г.Л. Бурыгин, Л.Ю. Матора, С.Ю. Щеголев (РФ). 4 с.

24. Поллак Д., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. - 74 с.

25. Петросян A.M. Исследование гликозилирования парапротеинов и анализ их электрофоретической подвижности у больных множественной миеломой // Укра'шьский медичний часопис. 2006. - № 3 (53). - С. 106— 111.

26. Пономарева Е.Г., Емельянова Н.В., Никитина В.Е., Захарова Н.Б. Воздействие бактериального лектина на функциональную активность лимфоцитов // Журн. микробиол. 2007. - № 2. - С. 60-65.

27. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйшая школа, 1973.-320 с.

28. Токин Б.П. Общая эмбриология. М.: Высшая школа, 1977. - 509с.

29. Шнырева А.В,, Дружинина И.С., Дьяков Ю.Т. Генетическая структура комплекса Pleurotus ostreatus sensu lato на территории Московской области //Генетика.- 1998.-Т. 34, № 12.-С. 1610-1618.

30. Цивилева O.M., Никитина В.Е., Гарибова JI.B., Завьялова JI.A., Игнатов В.В. Гемагглютинирующая активность Lentinus edodes (Berk.) Sing ,Lentinula edodes (Berk.) Pegler. // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 1. - С. 38-44.

31. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова JI.B. Влияние состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes II Прикл. биохим. микробиол. 2005а. - Т. 41, № 2. - С. 200-203.

32. Abbas А.К., Unanue E.R., Karnovsky M.J. Current techniques for the detection of surface Ig on lymphocytes // Tech. Biochem. Biophys. Morphol. -1976.-Vol. 3.-P. 139-176.

33. Abeijon C., Mandon E.C., Hirschberg C.B. Transporters of nucleotide sugars, nucleotide sulfate and ATP.in Golgi apparatus // Trends Biochem. Sci. -1997. Vol. 22. - P. 203-207.

34. Alen'kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. Effect of Azospirillum lectins on the activities of wheat-root hydrolytic enzymes // Plant Soil. 2006. - Vol. 283.-P. 147-151.

35. Baldani V.L.D., Baldani J. I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - Vol. 29. - P. 924-929.

36. Barak R., Elad Y., Mirelman D. Chet I. Lectins: a possible basis for specific recognition in interaction of Trichoderma and Sclerotium rolfsii II Phytopathology. 1985. - Vol. 75, N 4. - P. 458-462.

37. Barbierio C., Zanelli Т., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1988. - Vol. 36. - P. 87-90.

38. Bobrovnik S.A. New systems of coordinates in the study of ligand-receptor interaction // Ukr. Biochim. Zh. 1999. - V. 71. - P. 110-122.

39. Bobrovnik S.A. Ligand-receptor interactions: a new method for determining the binding parameters // J. Biochem. Biophys. Methods. 2003. - Vol. 55. - P. 71-86.

40. Boulianne R.P., Liu Y., Aebi M., Lu B.C., Kues U. Fruiting body development in Coprinus cinereus: regulated expression of two galectins secreted a non-classical pathway // Microbiology. 2000. - Vol. 146, N 8. - P. 18411853.

41. Boyd W.C., Shapleigh E. Specific precipitating activity of plant agglutinins (lectins) // Science. 1954. - Vol. 119. - P. 419.

42. Bradford M. A rapid and sensitive method for a quatification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

43. Brechtel R., Watzig H., Rudiger H. The lectin from the mushroom Pleurotus ostreatus: a phosphatase-activating protein that is closely associated with an a-galactosidase activity//Plant Sci.-2001.-Vol. 160.-P. 1025-1033.

44. Brockhausen I., Schachter H. Glycosyltransferases involved in N- and O-glycan biosynthesis // Glycosciences: status and perspectives / Eds. Gabius H.J. and Gabius S. London-Weinheim: Chapman & Hall, 1997. - P. 79-113.

45. Conrad F., Rudiger H. The lectin from Pleurotus ostreatus: purification, characterization and interaction with phosphatase // Phytochemistry. 1994. Vol. 36,N2.-P. 277-283.

46. Cooper D.N.W., Boulianne R.P., Charlton S., Farrell E.M., Sucher A., Lu B.C. Fungal galectins, sequence and specificity of two isolectins from Coprinus cinereus/П. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, N3.-P. 1514-1521.

47. Cuatrecasas P. Interaction of wheat germ agglutinin and concanavalin A with isolated fat cells // Biochemistry. 1973. - Vol. 12. - P. 1312-1323.

48. Cuatrecasas P. and Tell G.P.E. Insulin-like activity of Concanavalin A and wheat germ agglutinin direct interactions with insulin receptor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1973. - Vol. 70, N 2. - P. 485^89.

49. Cummings R.D., Kornfield S. Fractionation of asparagines-linked oligosaccharides by serial lectin-agarose affinity chromatography // J. Biol. Chem. 1982b. - Vol. 257. - P. 11235-11240.

50. De Mey J. Colloidal gold probes in immunocytochemistry / Immunocytochemistry. Practical applications in pathology and biology // Eds. Polak J.M., VanNoorden S. Bristol: Wright, 1983. - P. 82.

51. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grass:recharacterization of microorganisms and dinitrogen fixing sites // Symposium on

52. Nitrogen Fixation / Eds. Newton W.E. and Nijmans C.J. Washington State

53. Univ.: Pullman, 1976. P. 518-538.

54. Dodd R.B., Drickamer K. Lectin-like proteins in model organisms: implications for evolution of carbohydrate-binding activity // Glycobiology. -2001.-Vol. 11,N5.-P. 71R-79R.

55. Dorland L., van Halbeek H., Vliegenthart J.F.G., Lis H., Sharon N. Primary structure of the carbohydrate chain of soybean agglutinin. A reinvestigation by NMR // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256. - P. 7708-7711.

56. Doyle R.J. Contribution of the hydrophobic effect to microbial infection // Microbes Infect. 2000. - Vol. 2, N 4. - P. 391-400.

57. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. -Vol. 28.-P. 350-356.

58. Dunitz J.D. Win some, lose some: enthalpy entropy compensation in weak intermolecular interactions // Chem. Biol. - 1995. - Vol. 2, N 11. - P. 709-712.

59. Drickamer K. Two distinct classes of carbohydrate recognition domains in animal lectins // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263. - P. 9557-9560.

60. Drickamer K., Taylor M. E. Evolving views of protein glycosylation // Trends. Biochem. Sci. 1998. - Vol. 23.-P. 321-324.

61. Dwek R.A. Glycobiology: toward understanding the function of sugars // Chem. Rev. 1996. - Vol. 96, N 2. - P. 683-720.

62. Edelman G.M., Cunningham B.A., Gall W.E., Gottlieb P.D., Rutishauser U., Waxdal M.J. The covalent strucrure of an entire yG immunoglobulin molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. - Vol. 63. - P. 78-85.

63. Elad Y., Barak R., Chet I. Possible role of lectins in mycoparasitism // J. Bacterid.- 1983.-Vol. 154, N3.-P. 1431-1435.

64. Elgavish S., Shaanan B. Lectin-carbohydrate interactions: different folds, common recognition principles // Trends Biochem. Sci. 1997. - Vol. 22, N 12. -P. 462^467.

65. Engvall E., Jonsson K., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent essay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labeled antigen and antibody-coated tubes // Biochem. Biophys. Acta. 1971. -Vol. 271.-P. 427-435.

66. Entlicher G., Jesenska K., Jarosova-Dejlova L., Jarnik M., Kocourek J. Isolation and characterization of a lectin from the stinkhorn mushroom (.Phallus impudicus L. ex Pers.) // Lectins, Biol. Biochem. Clin. Biochem. 1985. — Vol.4.-P. 491-503.

67. Etzler M.E., MacMillan S., Scales S., Gibson D.M., James D.W., Cole D., Thayer S. Subcellular localization of two Dolichos biflorus lectins // Plant Physiol. 1984. - Vol. 76. - P. 871-878.

68. Evans C. Laccase activity in lignin degradation by Coriolus versicolor. In vivo and in vitro studies // FEMS Microbiol. Lett. 1985. - Vol. 27. - P. 339343.

69. Faye L., Chrispeels M.J. Transport and processing of the glycosylated precursor of concanavalin A in jackbean // Planta. 1987. - Vol. 170. - P. 217224.

70. Fedonenko Yu.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - Vol. 337. - P. 869872.

71. Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Shashkov A.S., Konnova

72. A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V., Knirel Yu.A. Structure of the O-polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum irakense KBC1 // Carbohydr. Res. 2004. - Vol. 339.-P. 1813-1816.

73. Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Kocharova N.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of O-polysaccharide from the Azospirillum lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2005. — Vol. 340.-P. 1259-1263.

74. Fernandez-Alonso M., Canada F.J., Jimenez-Barbero J., Guevas G. Molecular recognition of saccharides by proteins. Insights on the origin of carbohydrate-aromatic interactions // J. Am. Chem. Soc. 2005. - Vol. 127, N 20.-P. 7379-7386.

75. Fleischmann G., Mauder I., Illert W., Rudiger H. A one-step procedure for isolation and resolution of the Phaseolus vulgaris isolectins by affinity chromatography // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1985. - Vol. 366. - P. 10291032.

76. Franz H., Ziska P., Kindt A. Isolation and properties of three lectins from Mistletoe (Viscum album L.) // Biochem. J. 1981. - Vol. 195, N 2. - P. 481—484.

77. Furukawa K., Ying R., Nakajima Т., Matsuki T. Hemagglutinins in fungus extracts and their blood group specificity // Exp. Clin. Immunogenet. 1995. -Vol. 12.-P. 223-231.

78. Gabius H.-J., Unverzagt C., Kayser K. Beyond plant lectin histochemistry: preparation and application of markers to visualize the cellular capacity for protein-carbohydrate recognition // Biotech. Histochem. 1998. - Vol. 73, N 5. -P. 263-277.

79. Gabius H.-J. The how and why of protein-carbohydrate interaction: a primer to the theoretical concept and a guide to application in drug design // Pharmaceut. Res. 1998. - Vol. 15. - P. 23-30.

80. Gabius H.J. Biological information transfer beyond the genetic code: the sugar code // Naturwissenschaften. 2000. - Vol. 87. - P. 108-121.

81. Gabius H.-J., Andre S., Kaltner H., Siebert H.-C. The sugar code: functional lectinomics // Biochim. Biophys. Acta. 2002. - Vol. 1572, N 2-3. - P. 165-77.

82. Gagneux P., Varki A. Evolutionary considerations in relating oligosaccharide diversity to biological function // Glycobiology. 1999. - Vol. 9, N8.-P. 747-755.

83. Galbraith W., Goldstein I.J. Phytohemagglutinin of the lima bean (Phaseolus lunatus). Isolation, characterization and interaction with type A blood group substance // Biochemistry. 1972a. - Vol. 11, N 21. - P. 39763984.

84. Galbraith W., Goldstein IJ. Lima bean (Phaseolus lunatus) lectin // Methods in Enzymol. New York: Academic Press, 1972b. - Vol. 28, Part B. -P. 318-323.

85. Gallagher- J.T. Carbohydrate-binding properties of lectins: a possible approach to lectin nomenclature and classification // Biosci. Rep. 1984. -Vol. 4.-P. 621-632.

86. Gao Q.P., Seljelid R., Chen H.Q., Jiang R. Characterization of acidic heteroglycans from Tremella fuciformis Berk, with cytokin stimulating activity // Carbohydr. Res. 1996. - Vol. 288. - P. 135-142.

87. Garver F.A., Chang L., Mendicino J., Isobe Т., Osserman E.F. Rrimary structure of a deleted human lambda type immunoglobulin light chain containing carbohydrate: protein Sm XII Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. - Vol. 72. - P. 4559^4563.

88. Goldstein I.J., Hayes C.E. The lectins: carbohydrate binding proteins of plants and animals // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. - 1978. - Vol. 35. - P. 127-340.

89. Goldstein I.J., Hughes R.C., Monsigny M., Osawa Т., Sharon N. What shoud be called a lectin? // Nature. 1980. - Vol. 285. - P. 66.

90. Guillot J., Genaud L., Gueugnot J., Damez M. Purification and properties of two hemagglutinins of the mushroom Laccaria amethystina // Biochemistry. -1983. Vol. 22. - P. 5365-5369.

91. Guillot J., Breton A., Damez M., Dusser M., Gaillard-Martinie В., Millet M. Use of lectins for a comparative study of cell wall composition of different anaerobic rumen fungal strains // FEMS Microbiol. Lett. 1990. - Vol. 67. - P. 151-156.

92. Guillot J., Giollant M., Damez M., Dusser M. Isolation and characterization of a lectin from the mushroom Lactarius deliciosus // J. Biochem. 1991. - Vol. 109.-P. 840-845.

93. Guillot J., Giollant M., Damez M., Dusser M. Intervention des lectines fongiques dans les evenement precoces de reconnaissance arbre/champignon au cours de la formation des ectomycorhizes // Acta Bot. Gallica. 1994. - Vol. 141.-P. 443-447.

94. Guillot J., Konska G. Lectins of higher fungi // Biochem. System. Ecol. -1997. Vol. 25, N 3. - P. 203-230.

95. Hardi В J. The glycosidic linkage flexibility and time-scale similarity hypotheses // J. Mol. Struct. 1997. - Vol. 395. - P. 187-200.

96. Helenius A., Aebi M. Intracellular function of N-glycans // Science. 2001. -Vol. 291.-P. 2364-2369.

97. Helmi M:, Lombard S., Pieroni G. Ricin RGA (60): evidence for its phospholipase activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - Vol. 258.-P. 252-255.

98. Herman E.M., Shannon L.M., Chrispeels M.J. Concanavalin A is synthesized as a glycoprotein precursor // Planta. 1985. - Vol. 165. - P. 2329.

99. Hilschmann N., Craig L.C. Amino acid sequence studies with Bence Jones proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965. - Vol. 53. - P. 14031409.

100. Hirano S., Matsuura Y., Kusunoki M., Kitagawa Y., Katsube Y. Two crystalline forms of a lectin from Flammulina velutipes II J. Biochem. 1987. -Vol. 102.-P. 445-446.

101. Hirsch A.M. Role of lectins (and rhizobial exopolysaccharides) in legume nodulation // Curr. Opin. Plant Biol. 1999. - Vol. 2. - P. 320-326.

102. Hoedemaeker F.J., van Eijsden R.R., Diaz C.L., Sylvia de Pater В., Kijne J.W. Destabilization of pea lectin by substitution of a single amino acid in a surface loop //Plant Mol. Biol. 1993. - Vol. 22, N 6. - P. 1039-1046.

103. Hooper L.V., Manzella S.M., Baenziger J.U. The biology of sulfated oligosaccharides // Glycosciences: status and perspectives / Eds. Gabius H.J. and Gabius S. -London-Weinheim: Chapman & Hall, 1997. P. 261-276.

104. Ikekawa T. Beneficial effects of edible and medicinal mushrooms // Int. J. Med. Mushr. 2001. - Vol. 3. - P. 291-298.

105. Kabir S., Rosenstreich D.L. Binding of bacterial endotoxin to murine splen lymphocytes // Infect. Immunol. 1977. - Vol. 15. - P. 156-164.

106. Капеко Т., Oguri S., Kato S.-I., Nagata Y. Developmental appearance of lectin during fruit body formation in Pleurotus cornucopiae II J. Gen. Appl. Microbiol. 1993. - Vol. 39. - P. 83-90.

107. Katsy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in the production of lipopoly saccharides 11 Plasmid. 1998. - Vol. 40. - P. 73-83.

108. Kawagishi H., Nomura A., Mizuno Т., Kimura A., Chiba S. Isolation and characterization of lectin from Grifola frondosa fruiting bodies // Biochim. Biophys. Acta. 1990b. - Vol. 1034. - P. 247-252.

109. Kawagishi H.,Mori H., Uno A., Kimura A., Chiba S. A sialic acid-binding lectin from the mushroom Hericium erinaceum И FEBS Lett. 1994. - Vol. 340. -P. 56-58.

110. Kawagishi H., Mitsunaga S.I., Yamawaki M., Ido M., Shimada A., Kinoshita Т., Murata Т., Usui Т., Kimura A., Chiba S. A lectin from mycelia of the fungus Ganoderma lucidum II Phytochemistry. 1997. - Vol. 44. - P. 7-10.

111. Klostergaard G.L.M., Kraus A.L., Grossberg A.L. Pressman D. Arginine as a contact residue in the hafter binding site of protein 315// Immunochemistry. -1977.-Vol. 14.-P. 107-110.

112. Klotz I.M. The application of the law of mass action to binding by proteins. Interaction with calcium // Arch. Biochem. 1946. - Vol. 9. - P. 109-116.

113. Kobata A., Endo T. Immobilized lectin columns: useful tools for fractionation and structural analysis of oligosaccharides // J. Chromatogr. 1992. -Vol. 597.-P. 111-122.

114. Kochibe N., Furukawa K. Purification and properties of a novel fucose-specific hemagglutinin of Aleuria aurantia II Biochemistry. 1980. - Vol. 19. -P. 2841-2846.

115. Kocourek J., Horejsi V. Defining a lectin // Nature. 1981. - Vol. 290. - P. 188.

116. Kocourek J., Horejsi V. A note on the recent discussion on the definition of the term "lectin" // Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry. Vol. 3 / Eds. T.C. Bog-Hansen, G.A. Spengler. Berlin, New York: Walter de Gruyter, 1983.-P. 3-6.

117. Konska G., Guillot J., Dusser M., Damez M., Botton B. Isolation and characterization of an N-acetyllactosamine-binding lectin from the mushroom Laetiporus sulfureus // J. Biochem. 1994. - Vol. 116, N 3. - P. 519-523.

118. Konska G. Lectins of higher fungi (Micromycetes) Their occurrence, physiological role, and biological activity // Int. J. Med. Mushr. - 2006. - Vol. 8, Nl.-P. 19-30.

119. Kretz O., Greppy E.E., Boulanger Y., Dirheimer G. Purification and some properties of bolesatine, a protein inhibiting in vitro protein synthesis from the mushroom Boletus satanas (Boletaceae) // Arch. Toxicol. Suppl. 1989. - Vol. 13.-P. 422-427.

120. Krieg N.R., Dobereiner J. Genus Azospirillum (Tarrand, Krieg and Dobereiner, 1979). In: Bergey's Manual of systematic bacteriology, Williams & Urlkins, Baltimore; London, 1984. - P. 99-104.1. V V

121. Kuniak L., Karacsonyi S., Augusti J., Ginterova A., Szechenyl S., Kravarik D., Dubaj J., Varju J. A new fungal glucan and its preparation. World Patent 9312243.24.06.1993.

122. Laine R.A. The information-storing potential of the sugar code // Glycosciences: Status and Perspectives / Eds. Gabius H.-J., Gabius S. London; Weinheim: Chapman & Hall, 1997. - P. 1-14.

123. Lavelle E.C., Grant G., Pusztai A., Pfuller U., O'Hagan D.T. Mucosal immunogenicity of plant lectins in mice // Immunology. 2000. - Vol. 99. - P. 30-37.

124. Lemieux R.U. How water provides the impetus for molecular recognition in aqueous solution // Acc. Chem. Res. 1996. - Vol. 29. - P. 373-380.

125. Licastro F., Crishna M., Kretz O., Dirheimer G., Creppy E.E., Stripe F. Mitogenic activity and immunological properties of bolesatine, a lectin isolated from the mushroom Boletus satanas II Int. J. Biochem. 1993. - Vol. 25, N 5. - P. 789792.

126. Lin J.-Y., Chou T.-B. Isolation and characterization of'a lectin from edible mushroom, Volvariella volvacea II J. Biochem. 1984. - Vol. 96. - P. 35-40.

127. Lin Yu., Su A. Isolation, characterization and haemagglutination of the lectin from Fistulina hepatica II Natur. Prod. Res. Develop. 2004. - Vol. 16, N 4. - P. 420.

128. Lis H., Sharon N. Lectins as molecules and as a tools // Annu. Rev. Biochem. 1986.-Vol. 55.-P. 35-67.

129. Lis H., Sharon N. Lectins: carbohydrate-specific proteins that mediate cellular recognition // Chem. Rev. 1998. - Vol. 98. - P. 637-674.

130. Lord J.M. Precursors of ricin and Ricinus communis agglutinin // Eur. J. Biochem. 1985. -Vol. 146. - P. 410-416.

131. Luscher-Mattli M. Effect of the mitogenic lectin concanavalin A on the thermotropic behavior of glycosyl free cationic lipids and their mixtures with zwitterionic lipids // Biopolymers. - 1989. - Vol. 28, N 4. - P. 799-817.

132. Maeda Y.Y., Watanabe S.T., Chihara C., Rokutanda M. Denaturation and renaturation of a p-1,6; 1,3-glucan, lentinan, associated with expression of T-cell mediated responses // Cancer Res. 1988. - Vol. 48. - P. 671-675.

133. Maltseva О. V., Niku-Paavola M.-L., Leontievsky A. A., Myasoedova N. M., Golovleva L. A. Ligninolytic enzymes of the white rot fungus Panus tigrinus II Biot. Appl. Biochem. 1991. - Vol. 13. - P. 291-302.

134. Mansfield M.A., Peumans W.J., Raikhel N.V. Wheat-germ agglutinin is synthesized as a glycosylated precursor // Planta. 1988. - V. 173. - P. 482-489.

135. Masaoka H., Shibata K., Yamaguchi H. Topological and functional characterization of the N-glycans of soybean (Glycine max) agglutinin // J. Biochem. 1999.-Vol. 126.-P. 212-217.

136. Merritt E.A., Sarfaty S., van den Akker F., L'Hoir C., Martial J.A., Hoi W.G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide // Protein Sci. 1994a. - Vol. 3, N 2. - P. 166-175.

137. Merritt E.A., Sixma Т.К., Kalk K.H., van Zanten B.A., Hoi W.G. Galactose-binding site in Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (CT) // Mol. Microbiol. 1994b. - Vol. 13, N 4. - P. 745-753.

138. Miller I.B., Noyes C., Heinrikson R., Kingdon H.S., Yachnin S. Phytohemagglutinin mitogenic proteins. Structural evidence for a family of isomitogenic proteins // J. Exp. Med. 1973. - Vol. 138, N 4. - P. 939-951.

139. Miller I.B., Hsu R., Heinrikson R., Yachnin S. Extensive homology between the subunits of the phytohemagglutinin mitogenic protein derived from Phaseolus vulgaris И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - Vol. 72. - P. 13881391.

140. Mirkov Т.Е., Shrispeels M.J. Mutation of Asnl28 to Asp of Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L) eliminates carbohydrate binding and biological activity // Glycobiology. 1993. - Vol. 3, N 6. - P. 581-587.

141. Mizuno Т., Zhuang C. Maitake, Grifola frondosa: pharmacological effects // Food Rev. Int. 1995. - Vol. 11.-P. 135-149.

142. Mizuno Т., Yeohlui P., Kinoshita Т., Zhuang C., Ito H., Mayuzumi Y. Antitumor activity and chemical modification of polysaccharides from Niohshimeji mushroom, Tricholoma giganteum II Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1996.-Vol. 60.-P. 30-33.

143. Mody R., Joshi S., Chaney W. Use of lectins as diagnostic and therapeutic tools for cancer // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 1995. - V. 33. - P. 1-10.

144. Morgan W.T.J., Watkins W.M. The inhibition of the haemagglutinins in plant seeds by human blood group substances and simple sugars // Br. J. Exp. Pathol. 1953. - Vol. 34. - P. 94-103.

145. Murphy L.A., Goldstein I J. Five a-D-galactopyranosyl-binding isolectins from Bandeireae simplicifolia seeds // J. Biol.Chem. 1977. - Vol. 252. - P. 4739-4742.

146. Nagai K., Yamaguchi H. Direct demonstration of the essential role of the intramolecular high-mannose oligosaccharide chains in the folding and assembly of soybean (Glycine max) lectin polypeptides // J. Biochem. 1993. - Vol. 113. - P. 123-125.

147. Parker D., Fothergill J.J., Wadsworth D.C. В lymphocyte activation by insoluble antiimmunoglobulin: induction of immunoglobulin secretion by a T cell-dependent soluble factor // J. Immunol. 1979. - Vol. 123. - P. 931-941.

148. Pavelka M. Topology of glycosylation a histochemist's view // Glycosciences: status and perspectives / Eds. Gabius H.J. and Gabius S. London-Weinheim: Chapman & Hall, - 1997. - P. 115-120.

149. Pemberton R.T. Agglutinins (lectins) from British higher fungi // Mycol. Res.-1994. Vol. 98, N 3. - P. 277-290.

150. Peumans W.J., Hao Q., van Damme E.J.M. Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? // FASEB J. 2001. - Vol. 15. -P. 1493-1506.

151. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit y-globulin and antibodies with crystalline papain // Biochem. J. 1959. - Vol. 73. - P. 119-126.

152. A68. Quiocho, F.A., Vyas, N.K., Spurlino, J.C. Atomic interactions between proteins and carbohydrates // Trans. Am. Crystallogr. Asoc. 1991. - Vol. 25. - P. 23-35.

153. Quinn J.M., Etzler M.E. Isolation and characterization of a lectin from the roots of Dolichos biflorus II Arch. Biochem. Biophys. 1987. - Vol. 258. - P. 535-544.

154. Raz A., Meromsky L., Lotan R. Differential expression of endogenous lectins on the surface of nontumorigenic, tumorigenic, and metastatic cells // Cancer Res. 1986. - Vol. 46, N 7. - P. 3667-3672.

155. Reuter G., Gabius H.-J. Eukaryotic glycosylation — whim of nature or multipurpose tool? // Cell. Mol. Life Sci. 1999. - Vol. 55. - P. 368-422.

156. Rini J.M. Lectin structure // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. -Vol. 24.-P. 551-577.

157. Rini J.M., Lobsanov Y.D. New animal lectin structures // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. - Vol. 9. - P. 578-584.

158. Riorden J.F., McElvany K.D., Bordens C.L. Arginyl residues: anion recognition sites in ensymes // Science. 1977. - Vol. 195. - P. 884-886.

159. Roberts L.M., Lamb F.I., Pappin D.J.C., Lord J.M. The primary sequence of Ricinus communis agglutinin in comparison with ricin // J. Biol. Chem. 1985. -Vol. 260.-P. 15682-15686.

160. Roth J. The preparation of protein A-gold complexes with 3 nm and 15 nm gold particles and their use in labeling multiple antigens on ultrathin sections / Histochem. J. 1982. - Vol. 14.-P. 791-801.

161. Roth J. The colloidal gold marker system for light and electron microscopic cytochemistry / Techniques in immunocytochemistry // Eds. Bullock G.R., Petrusz P. London: Academic, 1983. - Vol. 2. - P. 217.

162. Roth J. Application of lectin-gold complexes electron microscopic " localization of glycocojugates on thin sections / J. Histochem. Cytochem. 1983.-Vol. 31.-P. 987-999.

163. Rudiger H., Gabius H.-J. Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions1. Л—-'and applications//Glycoconjugate J.-2001.-Vol. 18.-P. 589-613.

164. Sacchettini J.C., Baum L.G., Brewer C.F. Multivalent protein-carbohydrate interactions. A new paradigm for supermolecular assembly and signal transduction // Biochemistry. 2001. - Vol. 40. - P. 3009-3015.

165. Sage H.J., Vazquez J.J. Studies on a hemagglutinin from mushroom Agaricus campestris II J. Biol. Chem. 1967. - Vol. 242, N 1. -P. 120-125.

166. Samner J.B. The globulins of the jackbean, Canavalia ensiformis II J. Biol. Chem.-1919.-Vol. 37.-P. 137-142.

167. Samner J.B., Howell S.F. The identification of the hemagglutinin of the Jack bean with concanavalin A // J. Bacterial. 1936. - Vol. 32. - P. 227-237.

168. Scatchard G. The attraction of proteins for small molecules and ions // Ann. N.Y.Acad. Sci. 1949. - Vol. 51. - P. 660-672.

169. Sears P., Wong C.H. Enzyme action in glycoprotein synthesis // Cell. Mol. Life Sci. 1998. - Vol. 54. - P. 223-252.

170. Sell S. Development of restrictions in the expression of immunoglobulin specificities by lymphoid cells // Transplant. Rev. 1970. - Vol. 5. - P. 22-44.

171. Sharon N., Lis H. Carbohydrates in cell recognition // Sci. Am. 1993. -Vol. 268,N l.-P. 82-89.

172. Sharon N., Lis H. Lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules // Glycobiology. 2004. - № 14. - P. 53-62.

173. Slifkin M., Doyle R.J. Lectins and their use in clinical microbiology // Clin. Microbiol. 1990.-Vol. 3,N3.-P. 197-218.

174. Stillmark H. Uber Ricin, ein giftiges Ferment aus den Samen von Ricinus communis und einigen anderen Euphorbiaceen. Ph.D. Thesis, Univ. of Dorpat (Tartu), Estonia, 1888. — c- ,

175. Toone E.J. Structure and energetics of protein-carbohydrate complexes // Curr. Opin. Struct. Biol. 1994. - Vol. 4. - P. 719-728.

176. Torano A., Tsuzukida Y., Liu Y.V., Putnam F.W. Location and structural significance of the oligosaccharides in human IgAl and IgA2 immunoglobulins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 2301-2305.

177. Tsivileva O.M., Nikitina V.E., Garibova L.V., Ignatov V.V. Lectin activity of Lentinus edodes II International Microbiology. 2001. - Vol. 4, N 1. - P. 4145.

178. Ukawa I., Ito H., Hisamatsu M. Antitumor effects of (1—>3) P-D-glucan and (l-^6)P-D-glucan purified from newly cultivated mushroom Hatakeshimeju сLyophyllum decastes Sing.) J. Biosci. Bioeng. 2000. -Vol. 90. - P. 98-104.

179. Varki A. Factors controlling the glycosylation potential of the Golgi apparatus // Trends Cell Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 34-40.

180. Villalobo A., Gabius H.J. Signaling pathways for transduction of the initial message of the glycocode into cellular responses // Acta Anat. 1998. - Vol. 161.-P. 110-129.

181. Vyas, N.K. Atomic features of protein-carbohydrate interactions // Curr. Opin. Struct. Biol. 1991. - Vol. 1. - P. 732-740.

182. Wang H.X., Ng T.B., Ooi V.E.C., Liu W.K., Chanf S.T. A polysaccharide-peptide complex from culture mycelia of the mushroom Tricholoma mongolicum with immunoenhancing and antitumor activities // Biochem. Cell. Biol. 1996. -Vol. 74.-P. 95-100.

183. Wang H., Ng T.B., Ooi Vincent E.C. Lectins from mushrooms // Mycol. Res. 1998. - Vol. 102. - P. 897-906.

184. Wang H., Ng T.B., Liu Q. Isolation of a new heterodimeric lectin with mitogenic activity from fruiting bodies of the mushroom Agrocybe cylindracea II Life Sci. 2002. - Vol. 70, N 8. - P. 877-885.

185. Wang H., Ng T.B., Liu Q. A novel lectin from the wild mushroom Polyporus adusta II Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. -Vol. 307, N 3. -P. 535-539.

186. Wasser S.P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. -Vol. 60.-P. 258-274.

187. Wasserman R.L., Capra J.D., Immunoglobulins // The Glycoconjugates / Eds. M.I. Horowitz and W. Pigman. New York: Academic Press, 1977. - P. 323-348.

188. Wei W.-Z.and Lindquist R.R. Wheat-germ agglutinin iniciates monocytoid cell killing of non-antibody-coated erithrocytes // Immunology. 1983. - Vol. 49:-P. 617-623.

189. Weis W.I., Drickamer K., and Hendrickson. Structure of a C-type,mannose-binding protein complexed with an oligosaccharide // Nature. 1992. - Vol. 360. -P. 127-134.

190. Winterburn P.J., Phelps C.F. The significance of glycosylated proteins // Nature. 1972. - Vol. 236. - P. 147-151.

191. Woo S., Fogliano V., Scala F., Lorito M. Synergism between fungal enzymes and bacterial antibiotics may enhance biocontrol // Antonie Van Leuwenhoek.-2002.-Vol. 81.-P. 353-356.

192. Wool I.G., Gliick A., Endo Y. Ribotoxin recognition of ribosomal RNA and a proposal for the mechanism of translocation. Trends Biochem. Sci. 1992. -Vol. 17.-P. 266-269.

193. Yadomae T. Structure and biological activities of fungal p (1 —>3) glucans // Yakugaku Zasshi. -2000. -Vol. 120.-P. 413-431.

194. Yagi F., Miyamoto M., Abe Т., Minami Y., Tadera K., Goldstein I J. Purifcation and carbohydrate-binding specificity of Agrocybe cylindracea lectin // Glycoconjugate J. 1997. - Vol. 14. - P. 281-288.

195. Yagi F., Hiroyama H., Kodama S. Agrocybe cylindracea lectin is a member of the galectin family // Glycoconjugate J. -2001. -V. 18, N 10. P. 745-749.

196. Yatohgo Т., Nakata M., Tsumuraya Y., Hashimoto Y., Yamamoto S. Purification and properties of a lectin from the fruitbodies of Flammulina velutipes II Agric. Biol. Chem. 1988. - Vol. 52, N 6. -P. 1485-1493.

197. Yokoyama K., Yano О., Terao Т., Osawa T. Purification and biological activities of pokeweed {Phytolacca americana) mitogens // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - Vol. 427. - P. 443-448.

198. Yokoyama K., Terao Т., Osawa T. Carbohydrate-binding specificity of pokeweed mitogens // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 358. - P. 384-387.

199. Yoshida M., Kato S.-I., Oguri S., Nagata Y. Purification and properties of lectins from mushroom, Pleurotus cornucopiae II Biosci. Biotech. Biochem. -1994. Vol. 58, N 3. -P. 498-501.

200. Zhuang C., Mizuno Т., Ito H., Shimura K., Sumiya Т., Kawada M. Antitumor activity and immunological property of polysaccharides from mycelium of liquid-cultured Grifola frondosa II Nippon Shokuhin Kogyoл Gakkaishi. 1994a. - Vol. 41. - P. 724-732.

201. Zhuang C., Mizuno Т., Ito H., Shimura K., Sumiya T. Chemical modification and antitumor activity of polysaccharides from the mycelium of liquid-cultured Grifola frondosa II Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 1994b. -Vol. 41.-P. 733-740.

Информация о работе

Степанова, Лада Викторовна
кандидата биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Выделение и характеристика мицелиального лектина базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы