Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Углеводная специфичность и структурная характеристика лектина из семян Butea frondosa

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Углеводная специфичность и структурная характеристика лектина из семян Butea frondosa"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи ПАДОАНАБХЛН САРАСЩША

УГЛЕВОДНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕКТИНА ИЗ СЕМЯН-Buíea frondosa.

03.00.03 Молекулярная Околотая

Авторефэрат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии имени М.М.Шемякина АН СССР

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Демин В.В.

Официальные оппоненты - доктор химических наук

Егоров Ц.А.

кандидат биологически наук Лахтин В.М

Ведущая организация - Институт микробиологии и вирусологии им. Заболотного, Киев, АН УССР

Защита состоится 1991 Г.

в час. на заседании бпециализированного совета Д.002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 '

С диссертацией можно ознокомится в библиотеке Института биоорганической химии АН СССР.

Автореферат разослан " г. ^

Ученый секретарь /)

специализированного совета ИБХ АН СССР /и/л

кандидат химических наук */ ш\ " /Ъ.А.Несмянов

Актуальность проОлемы . Лектины, углеводсвязивзвдие белки неимунной природы, составляют важный класс белковых молекул, значительно различающихся по своей структуре к углеводной специфичности. Способность этих белков связывать углеводы сделала их незаменимым инструментом в биологических и медицинских исследованиях. Важное применение лектины находят в клеточной биологии и иммуннологии, где используются для контроля за состоянием клеточной поверхности. В медицине лектины маяно използовать как готовое простое средство для определения иммунитета пациентов к различным заболеваниям ( в том числе и к СПИДу), специфическое взаимодействие некоторых лектинов с раковыми клетками позволяет использовать их для определения индекса злокачественности опухоли. В биотехнологии с помощью лектинов производят препаративное ' и аналитическое выделение,' а также характеризуют и биополимеры, содержащие сахара. Наиболее дешевым источником лектинов являются

растения, богатые этими лектинами. Поэтому выделение и изучение углеводной специфичности растительных лекткноз представляет интерес с практической и научной стороны.

Цель работы .Настоящая работа поезяцена - выделению галактозо-специфкчных лектинов из Butea frondosa, выяснению их тонкой углезодной специфичности и структурных характуркстик, включая определение молекулярного веса и N- ' концевых аминокислотных последовательностей образующих их шлипептидов.

Научная - новизна и практическая значимость раДоты Определена углеводная . в. том числе олигосахаридная специфичность и. проведена частичное определение структуры двух лектинов.

ВЫДв^ОНКЫХ КЗ СЙ-ЯЙ ¿7*0РуСИОЗС. t ЧТО ОТКрЬ'ВЗЭТ возможность

анализа о лиге с ахаридных последовательность гдккоконьюгатов. Так как лектгаы находят широкое применение в биологии, медицине и промышленности, выделение и изучение каждого нового лектина открывает ноше возможности для та использования. Методы, примененные в работе для определения углеводной специфичности, . могут быть применены для изучения других лектинов. Сравнение частичной аминокислотной последовательности данного лектина с аминокислотными последовательностями других известных белков данного класса могут внести вклад в изучение проблемы взаимосвязи их функции и особенностей структуры.

Апробация полученных данных. Результата работы доложены на симпозиуме ШГЕЙЬЕС в Тарту/Таллин,(1989), на симпозиуме ЗЖЕКЬЕС в Берлине, (1991 > и на VI Европейском симпозиуме по углеводам в Еданбурге (1991). публикации основные материалы диссертации опубликованы в печатных работах. Список приведен в конце реферата. Обь ем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего наименование. Она изложена на 116 страницах, включая 16 рисунков и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАбОт" Лектины бобовых: обние мечты (Обзор литературы) Вводная часть, посвящена обсуждению проблем очистки лектшюв бобовых в связи с проблемой изолектинов и агрегирования. Далее, следует рассмотрение обеих структурных свойств лектинов семейства

Isgur.tríeseos. Особое внимание уделено классификации этих лектинов на основе их субъединичного состава и углеводной специфичности. Рассмотрена циклическая пармутация

аминокислотной последовательности лектинор ообоетх, которая приводит к максимальной гомологии. Особое внимание уделено углеводной специфичное™ лектинов из этого семейства (и особенно тех из них, которые специфичны к галактозе) в связи с их структурой и проблемами выделения.

2.Выделение лектинов из Butea frondosa Полная процедура выделения лектинов приведена на схеме I.

Схем I.

Выделение и очистка лектинов В. frondosa ,

i

СЕМЕНА

_Т_•

Измельчения семян и фильтрация полученной суспензии

_f_

|~Преципитсция суспензии 70% (NH^SO^

_ А__

Отмывка преципитата, диализ и центрифугирование =£> грубый экстракт

«■■^■■■■■«■■■■■■■■■шшааг

Аффинная хроматография на макропористом стекле с привязанным GolNacorí - 3 Gal/?

|| Лектин FIJ ^Лектин FÜ

Известно, что сданм из эффективных к мягких способов экстракции лектипсв из растительных тканей является их обработка солевыми растворами. В данном случае _ белки экстрагировали из предварительно измельченных семян 0,9% раствором NaCl. После осаздения белковой фракции TáKoro экстракта сульфатом аммония (700 г/л) и растворения осадка в дистиллированной воде с последующим удалением остатков сульфата аммония диализом получали грубый экстракт, обладающий гемагглютинируюцей активностью. В более ранних работах для выделения из грубого экстракта лектинав применяли хроматографию на аффинном сорбенте с a-Gal в качестве специфического лигаяда. Полученные авторами этих работ данные то углеводной специфичности позволили предположить, что аффинные сорбенты, содержащие в качестве лиганда р-галактозу и ее производные могут оказаться более эффективными. Поэтому были испытаны сорбенты со следующими лигандами для выделения лектина из В. frondosa'. GalMJCHgCHgCHgNH-Galp=»SG6H4NH(p)-GalMHC (S JNHfCHg )5С0-Лиганды были присоединены соответственно к макропористому стеклу (2000 2), сефарозе и солозе. Однако, ни один из сорбентов Ее связывал лектин в заметной степени (активность элюата проверялась по его способности агглютинировать-эритроциты кроне А). Так как описанный ранее лектин агглютинировал эритроциты человека групп крови А и В, были предприняты попытки выделить его на сорбентах (матрица - -макропористое стекло) со следующими лиг ладами:

№Са1=»2

аа1р=0СН2СН2СН,НН- (В,-г1)

Са1а1 »3

Са1о1=»ЗСа1рОСН2СН2СН21Ш- (В^)

Уиса1=»2

Са1НАСа1=»ЗСа1э1-ОСН2СН2СН21Ш- (А^) Оказалось, что лишь последний из сорбентов, содержащий в качестве лигавда иммобилилзованный А-дисахарид, эффективно связывает (1мкг/мл сорбент)яектин, агглютинирующий эритроциты группы крови А и соответствующий описанному ранее лективу по данным электрофореза в ПААГ.

Профиль элюции белка с колонки показан на рис.2. Грубый экстракт наносит на колонку, предварительно уравновешенную 0,9% ШС1. Фракция И элшруется 5% галактозой, фракция УII - 5% галактозой, содержащей 0,92 ИаС1. После диализа обе фракции проявляют агглютинирующую активность. Этапы выделения и выхода белков суммированы в табл.1.

После дополнительной очистки с помощью препаративного капиллярного электрофореза анализ Л-концевой последовательности показал индивидуальность полученных белков.

Таблица I Выделение лектинов из I кг семян Burea frondosa

Экстракт

Фракция FI

Фракция FlС

Концентрация белка Объем

Всего белка Общая ахтлютини-рувдая активность (титр) *) Специфическая агглютинирующая активность

(титр/мг белка)»*) Доля активности,г

8,1 мг/мл 1000 мл 81000 мг

259200

32 100

0,8 мг/мл 50 мл 40 мг

I7I840

4296 66,2

0,6 мг/мл 66 мл 39,6 мг

20480

512 7,9

*) титр определяли как максимальную величина разбавления раствора, все еще вызывающего гемагглютинацию эритроцитов группы крови А

**) относительно экстракта _ _ ______

А 280 1.0

; 0.S 0.6

i

i 0.4' 0.2-

у______

Ю

2

•27 ■26 •25 ■2* .23

Э о

0

1

е

9

3 :

3 )

X I

а

ч>

с. I

а.,

Е ¡ а !

20 ¿Ü 60 SfO 1Ó0 1¿0 140 Объем, ш

Рис.1. Выделение лектинов из семян Butea frondosa аффинной хроматографией на колонке (1x10 см) с иммобилизованным на макпо-пористом стекле дисахаридом GalNAc<x1=3Galp

I Нанесение экстракта из семян

II Промывание 0.9S NaCl

III Элюция 5% галактозой

IV Введение 0,9t NaCl в элюирупций буфер

f} специфичность лектикоэ ИЗ Bufcea. fГСT'.dr гз.

Обычно специфичность лектина определяют уровне

моносахаридов или олигосахаридсй, которые лучше всего ингибируут агглютинацию, клеток, вызванную эт'-м лектином. Но, так как ингибироззние гемагглютинации требует большого расхода ингибиторов и дает лишь полуколичествзнкые результаты, мы разработали твердофзгную аналитическую систему, основанную на ингибировании взаимодействия лектина (сорбированного на пластике) с водорастворимым конъюгатом А^-ПАА-биотш различными низко- и высокомолекулярными сахаридамя (см. табл. 2 иЗ). Выбор А-дисахарида в качестве связывающего лиганда в данной тест-системе связан с его активностью при аффинном выделении лектина. Результат взаимодействия (ингибярсвзния) количественно оценивался при помощи конъюгата авидин-пероксидаза. Тест-система показала высокую воспроизводимость результатов, низкое фоновое зкзчение к оказалась достаточно чувствительной. В то яе время, величины относительной иЕГКбирувщей способности моносахаридов, полученные в данной тест-системз и в реакция торможения гемагглютинации, практически совпадали.

Табл.2 демонстрирует значительное различие в ингибировании полученных лектиков ?! и FII синтетическими и природными углеводами и конъюгатают.

Так как лектнн ' был первоначально охарактеризован как Gal-связываычий, мы в первую очередь изучили влияние на взаимодействие. с ' FI и PII структурных изменений в

Таблица. 2 Ингийирование двух форм лектина из ВМеа /гопЗоза низкомолекулярными сехаридами

ИНГИБИТОР

КОНЦЕНТРАЦИЯ 502-Н0Г0 ИНГИ6ИР0ВАНИЯ ИЛИ (МАКСИМАЛЬНОЙ ВЕЛИЧИНЫ ИНГИБИРОВАНИЯ)

Р I

шаль мг/мл

Т II ММОЛЬ мг/мл

Риса1-2Са1р-Ер 0,1 ИеиАСаг-бЬас 0,4 СаЦиСр-5Р№02 0,5

Н(тап1)-зр 0,7

Ай1 0.7

Са1р1 -4ЙС 0,74

СаШАса-зр 1,3

Са1р-ЗРйШ2 1,5

Са1а-{|Ш? 1,6

Ga3.p1-4С1сИАср-зр1,7 Са1р1-ЗС1сНАСр-зр2,О ваШАс *2,3

Са1р-0РЫЮ2 3,0

СаШЛсо.-НШ' 3,0 Са1$-зр 6,0

Б-Рио (б-дезокси-В -Ла! Б,0

Са1р-0Ва1 6,0

й,О

Са1а-ОМе 9,0

Са1р-БЕ1: 9,0

Са1р-0Ме 10,0

Са1р1-4С1сНДсэ_др

0,03 0,24 0,2

0,5 0,26

0,25

0,5

0,5

0,5 0,9 1,0 0,5 0,9.

1.0

2,0

1.0 1,6 1 4

\\в 2,0 2,0

<И

В21-6 1,6(4335)1,0(43%)

3(4256) 1 (42%)

Са1р-1ШРЬ-4-СН3 7(37%) СаШср-аг

Са1ИАса1-§ СаШАср-зр Са1р1-4С1с-о1 Gal.pl-ЗСаШАс р-зр

Са1а1 -ЗСаШАс а-зр

Аг1(тш I)

3(33%)

3(31%) н.и

н.и

н.и в.и

2(37%) 1(33%)

2(31%)

0,4

0,8(33%) 1,3

н.о*** 1.2

н.о 0.7 6(42%)

3,3

0,9(38%) 0,08 0.2 1,6

1,4(43%) 6,0(35%)

н.и"*' 7,0(38%) 25 3,0 9,0 .10,0

0,12

0,5(33%)-0,48

H.о 0,46

н.о 0,26 2(42%)

I.1

0,5(38%) 0,045 0,05 0,5

0,5(43%) 2,0(35%)

2,0(38%) 4,5 0,6 2,0 2,0

н.и.

3(19%). 4(32%) 2

0.1

3(33%)

1 (19%) 1(32%) 0.9

0,06 1(33%)

2(302) 1(30%)

3(28%) •3(25%)

0.5(28%) 2(25%)

Таблица 3. ¿агибирование двух форм лектинэ из Butea frondosa полиакриламгчзыми производными сахаридов и природными группоспецифнческими веществами.

ИНГИБИТОР*

КОНЦЕНТРАЦИЯ 50-5-Н0Г0 ШГИбИРОВАНШ ИЛИ (МАКСИМАЛЬНОМ ВЕЛИЧИНЫ ИНГИбИРОВАНИЯ)

ммоль

Н<тш I )-ПАА 0,01 Ай1-ПАА 0,03

GallíAca-IIAA 0,05 Galß-ПАА О,ОТ

^at В,

F I

Н,

sal ;sal

ЬеЬ-ПАА В,

0.32

МГ/ШГ 06009 0,03

0,025

0,03

0,03

0,15

0,1Т

0,44 0,5(35%)

0,5(35fc)

nat.

Fuca(1,3)galp-ПАА 1 (42%) 1 (42%)

ЪбГ-ПАА 1,1 Í 44%) 1 (44%) L-Fuca-ПАА Н.И

Р II шаль мг/мл

0,02 0,03

0,01 0,1

н.о

н.о н.о 0,4

0,018 0,03

0,005 0,06 0,02

Н.О*"

н.о

н.о 0,03

0,1

Н.о н.о 0,2

ПАА-'голиакриламид, БСА -бычий сывороточный альбумин, HUF -митилумбеллиферил, Lact - лактоза, sp= -0(С1£ ^NHCOCEj, ^^ ,

Bnat* ^nat" суммарная фракция гликопртеинсв из человеческих

эритроцитов груш крови А, В и Н, ^-GalNAcad ,3)Galß-sp, ^

- Calad ,3)Galß-sp, Агг1(тип I) - GalNAca(1,3)Са1р(1,3)glcNAc.

***Н.О- не определялась, н.и - не инглбирует.

Проверенные в качестве ингибиторов, но оказавпиеся неактивными по отношению к обеим формам лелтина из В.frondosa вещества: L-Ага, L-Araß-HUP, GalN"HCl, D-Gul, D-GalA, U-Tal, L-Fuca-MUF, Galß-HUP, 3-0-All-Galß-Bzl, 6-0-Tr-Galß-Bzl, GalNAcs-HUF, Galß(1,3)GalKAca-sp,nGal«(1,4)Glc (мальтоза), Gala(1,4)Galpd ,4)Glc, (GalNAcJgGalß-sp, LeP-sp, Atrl-sp. Btrl-sp, GlcNAcß-ПАА,

Fuca.1-nAA, Gala(1,3) GalNAca-IIAA.

D-галактопиранозильном цикле, а именно конфигурации атомов углерод. ".-1. с С-3, С-4, и различных заместителей при С-1 -С-6.

Гиб роксгии при С-3 u С-4. дллильное производное по гидроксильной груше С-ОН , а также D-гулоза, отличающаяся от D-галактозы конфигурацией при атоме углерода С-3, полностью теряют способность взаимодействовать с обеими формами лектина. D-Глюкоза и К-ацетил-Б-глЕкозамин, имеющие противоположную D-галактозе конфигурацию при С-4, также неактивны. Поэтому моею утверждать, что для связывания обеими формами Б. frondosa конфигурация при С-3 (зкваториалннй гидроксил)и С-4 (аксиальный гндроксил)пиравознога цикла D-галактозы являются необходимым условием.

Группа СН20Й. Ь-АраСиноза_, а такке арабинозид (Ь-Агар-ШР ) > которые отличаются от D-галактозы отсутствием всей гидрокскметилъной группы при С-5, не взаимодействуют с обеими формаг.ш лектина, такке как и D-галактуроновая кислота (СООН вместо CHgOH). Алкилирование объемистым трифзкилметклом (D-галактоза » 5-0-Tr~Gal-p-0Bzl) также дает неактивное производное. Однако D-фукоза ^ (результат замены гидроксиметильной группы на метальную) равнозначна Е-галзктозе во взаимодействии с FI, а по отношению к PII заметно, в 5 раз,-активнее. По-видимому, сайтом узнавания является только метиленовая груша в CHgOH, а гидроксильная во взаимодействии с лектином не участвует. Последнее обстоятельство становится существенным при рассмотрении олигосзхяридной специфичности

S Ю

лектлнов (см. ниже): можно отдать, что гликозилирсванная по С-6 галактоза способна связываться с лектином, хотя требования к заместители могут быть достаточно жесткими (судя по тому, что тритильное производное-неактивно). Интересно, что PII (но не FI) заметно взаимодействует не только с D-, но и с L-фукозой, но только в полимерной форме,, в виде Гиса-ПАА, что можно интерпретировать как наличие в активном центре лектина сайта узнавания группы CHg (или CHg) со значительным вкладом в общую энергию взаимодействия.

Лгмжансвая часть: О, S и N-ш.нхи- и арилгликозиды D-гсиашозы и Я-ацешл-В-гсиатазсшина. Влияние агликона в простых галактозидах и галактозаминидах на взаимодействие с лектином из В. frondosa можно рассматривать как с точки зрения конфигурации гликозидной связи, так и природы агликона. При сравнении активности галахтозидов с небольшой агликояовой частью, таких как Galp-sp, Galp-OBsl, Gala-OMe, Galp-SSt, Galp-Oííe, а т arase галактозы, видно отсутствие влияния конфигурации гликозидной связи на взаимодействие с лектином FI, и напротив, заметное влияние на взаимодействие с лектином PII. Интересно, что с лектином PII оба аномерных метилгалактозида взаимодействуют значительно активнее самой галактозы, что можно объяснить положительным взаимодействием метальной группы с активны!,1 центром ВРА II. Введение ароматического агликона (нитрофенила, метилумбеллиферила) сказывается на активности значительно сильнее, чем алифатического: с одной стороны, GalKAcp-SPhNOg и Gala-MU? являются одними из сильнейших мономерных ингибиторов ■ (см. табл. 2), с другой стороны,

Э-MU?-производные обоих моносахаридов неактивны вовсе.

Существенна Цлльтая активность ароматических гликозидов по сравнению с Gal и GalNAc отмечена для шопа растительных лектинов того же семейства бобовых, что и Butea frondosa. Для ряда лектинов с известной аминокислотной последовательностью обнаружено совпадение по аминокислотам Leu81, Val89, Phe111,

1Q1 019

Fhe , Phe , которые, как установлено с помощью рентгеноструктурных данных, в случае Con А образуют гидрофобный участок, способный взаимодействовать с ароматическим агликоном. Не исключено, что- аналогичный гидрофобный кластер определяет

о

второй участок связывания (если первым считать фрагмент С ОН, С4ОН, ) и для лектинов из В. frondosa. Второй участок связывания дает основание предполагать у FI и PII наличие о.шгосахаридной специфичности, причем разной для форм I и II.

Олигосахаридхая специфачносжь. Данные по связыванию моносахаридов и их производных позволяют предположить следующий обобщенный активный фрагмент олигосахаридной цепи

з

R ОСНг

Н0/7\ I

R .

Звено гсишяпо-конфйгурацгси может быть терминальным (I? = Н, Е? = ОН или ННАс) или внутренним, причем з последнем случае принципиально не запрещены замещения по С-6 (R3 = моно- или олигосахарид) и Cr2 (R?0 = моно- или олигосахарид);

о

upeдгсчтктельнув кснфЕгурациз R' на основании данных по взаимодействию с моносахаридами и гликозидамя предсказать не представляется возможным.

Изучение выбранных по данному принципу олигосахаридов показало значительное большую активность некоторых из них относительно Па1 или GalNAc^ Так, дисахарид Fuca1=»2Galp-sp ("базовый" моносахарид Gal замещен по G-2) связывался с обеими фермами лектгаа в 60 раз сильнее, чем Galp-sp (табл. 2), в то время как изомер, Fuca1a3Galp-sp, был совсем неактивен. Производное лактозы, в котором галактозное звено замещено по С-6 нейраминовой кислотой, Neu5Aco2=»6Galp1=>4Glc, активнее лактозы. Заметный эффект при наращивании цепи со стороны агликона (R1 ) достигается в случае лактозы (сравниваем Galp1=>4Glc с Gal), а также в случае А-дасахарида, GalNAca1e3Galp-sp, который втрое активнее GalNAc по отношению к обеим формам лектина; переход от GalNAc к терминальному дисахариду антигена Форссмана, GalHAca1a3GaINAcp-sp, приводит к заметному ухудшению взаимодействия FI, но, напротив, к значительному (семикратному) увеличению взаимодействия FII. Однако максимальное увеличение взаимодействия наблюдается для дисахарида Galp1=>3GlcNAcp-sp, который в 300 раз активнее галактозы, причем столь значительный эффект характерен только для FII. '

Таким образом, на уровне дисахаридов специфичность лектина I можно определить как Fuca1=2Gal, то есть лектин является Н-специфическйм; в то же время достаточно активны (табл. 2) лактоза (а также сизлиллактоза) и ¿-дисахарид. Лектин II имеет

примерно одинаковое сродство к коровому дисахариду типа 1, Са1р1=>3(31сНАср ь терминальному дксахариду антигена ФорСсмана, Са1ЛАса1 =30а1НАср; все дисахариды, отличающиеся от этих двух конфигурацией гликозидной связи между моносахаридами, конфигурацией С-4 восстанавливающего звена, связью 1=»4 вместо 1=3, а также заменой ШАс на ОН, взаимодействуют с Р11 значительно слабее (табл. 2).

Интересно, что оптимальными для взаимодействия с данными лектинами являются дисахаридЕые структуры, а родственные три- и тетрасахариды менее активны. Так, трисахарид А, Са1КАса1 дЗ (Риса.1 )0а1р-эр, фрагментам» которого являются хорошо связывающиеся с обеими .формами лектина дисахариды Гиса1=»20а1 и Са1НАса1=*ЗСа1. не взаимодействует с Р1 и РИ. Трисахарид А (тип 1), СаХЫАсоЛ«ЗйаХр1 =^ЗЙеКАс, фрагментам;! которого являются высокоактивные по отношению к РП дисахариды Са1р1 вЗЙсКАс и аа1ИАса1=»ЗСа1,в высокой концентрации,ингабирует этот лектин только на 25« а с Р1 совсем нэ взаимодействует. Трисахарид Н (тип 1), Риса.1 =2Са1р1 =>ЗС1сНЛср, в семь раз менее активен чем собственный терминальный фрагмент, в составе тетрасахарида Ьеь Риса1=2Са1 совсем неактивен, и лишь полимерная форма Ье15 слабо взаимодействует с Р1. Единственным исключением является трисахарид Иеи5Аса2=>60а1р1-401с, который примерно вдвое лучше взаимодействует с РГ, чем лактоза.

Полимерные производные сахаридов и природные вещества с групповой специфичностью крови. Так как с природными гликоконъюгатами взаимодействие лектинов практически всегда поливалентно, было интересно сравнить между собой мономерные"

(табл. 2) и полимерные (табл. 3) формы сахаридов. Как видно из данных . таблиц, относительная активность в ряду полимеров сохраняется такой же, как и в ряду мономеров. Концентрации 50Ж-ного ингибирования лектина полимерами в 25 - 90 раз ниже (т.е. константы связывания в 25 - 90 раз выше")', чем соответствующих моновалентных, сахаридов. Полимерный эффект имеет место, хотя величина его не очень значительна. В качестве примера более ярко выраженного полимерного эффекта можно привести ингибирование агглютинации эритроцитов лектином •. малярийного плазмодия, которое осуществляетсяконъюгзтом С1сНАс20БСА по сравнению с ИсКАс в 100.000 раз эффектавнееГ' При взаимодействии лекттов с ттолимер-св'йзашшш углеводами может наблюдаться ярко выраженная зависимость связывания от плотности углеводного лигаядэ на полимере, что выражается в наличии оптимального для взаимодействия количества лигаядов на молекулу полимера и, по-видимому, отражает реальную топографию биологического узнавания лектина и природного гликоконъюгата. Чтобы оценить значимость лигандной плотности для лектинов из В. /гопйоза, мы синтезировали три серии полиакриламидных конысгатов, с Са1р, Са1НАс<» и в каждой серии содержание сахарида было 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35% (мольн.). Коньюгаты с различным содержанием лиганда во всех трех сериях практически не отличались между собой по взаимодействию с лектинами (данные не показаны), что, наряду с довольно низким полимерным эффектом (см. выше), говорит о малой чувствительности выделенных лектинов к эпитопной плотности углеводных лигандов.

Интересно, что даже низкого в данном случае полимерного

:;®sicra ' мотет быть достаточно для того, чтобы придать неактивным (в гцентрации до 10 ммоль) мономерным лигандам способность взаимодействовать с лектином в данной тест-стстеме. Зго относится к трем L-фукозосодеркащим соединениям, Puca-sp, ?ucai^Gal3-sp и Le3 (см. нижние строки табл. 3).

Результаты взаимодействия лектина с природными

гру1гпосвдцЕф!1Ч8Скши веществами (суммарными глгасопротешами) из

зрит^цкмв а слшы следует интерпретировать с осторожностью,

*r.î. ■;:;-< йтв вавд&сгсва представляют собой весьма гетерогенную

•'•"fin^, прагем ;гя кавдого гликопротеина характерна еще и

^»крогешюогь по углеводным цапям. Тем не менее, общие

закономерности строения углаводных цепей названных

гликопротеинов известны, приведенные в таблице 2 данные за

некоторым исключением с ними согласуется. Так, более высокая

активность веществ от доноров группы А по сравнению с В и Н,

отражает большее сродство лектинов к синтетическим производным с терминальным GalNAca.. Можно иидеть и обратную ситуацию:

вещества из слюны имеют коровым участком дисахарид типа 1,

Galpl=3ClcNAc, а вещества из - эритроцитов - типа 2,

Galp1»4GlcNAc. однако лектин I,' предпочитающий дисахарид типа

2, лучше взаимодействует с веществами' кз славы, и наоборот.

Величины концентраций . 50%-ного ингибирования природными

грушоспецц£ическими веществами относительно невелики, если

сравнивать с лучшими синтетическими полимерными ингибиторами.

Это говорит о перспективности" поиска значительно более

афЕиннных, чем групгоспецифические. природных рецепторов FI и

PII, а полученная информация о дисахаридной специфичности

лектинов.может сделать эти поиски целенаправленным;!.

4. Структурное исследование лектинов. 55Э Bute a frondosa

Результаты элёктрофореза в 12% полиакриламидном геле в диссоциирующих условиях показывают, что в состав белка каждой фракции входит по два полипептида с молекулярными массами 33 и 35 кДа ( Рис.2 ).

97 —

67 «» •

42 &

30 ^

21 -- M Ъ

' i 'а з

Рис.2. SDS-электрофорез фракций PI ' и PII в 12,5% полиакриламидном геле, окраска нитратом серебра. I - стандартные белки (фосфэрилаза Ь из мышц кролика - 97 хДа, бычий сывороточный альбумин - 67кДа, овальбумин - 43 кДа, кзрбоангидраза быка- ЗОкДа, ингибитор тршсина - 21 кДа, лизоцим из белка куриных яиц - Ï4 кДа), 2 - ?1, 3 - FII.

Для всех четырех полипептидов определена частичная N-концевая аминокислотная последовательность. Для этого полученные при электрофорезе полосы переносили на полпвишшцшндифторидные мембраны методом электроблотингз и определяла аминокислотную

последовательность на газофазном секвенаторе. Как видно из табл. 4, как „ желые, так и легкие цепи FI и FII имеют

Таблица 4 Частичная аминокислотная последовательность лектннов из растений семейства бобсвых: конканавалина А (Con-А), лектина из Crotalarta Júnceas (Crot) и легкого и тяжелого (33, 35) голипептидов лектшов F-I и F-II из Butea frondosa

Con TNALHFMFNQFSKDQKD1ILQGDAT

Crot AEEQSFSSTKFSTDQPN1ILQGDAT

F-I(33) TNTDSFTPSKFKP N-Q PN1KKQGDAT

I

P-I (35) TNTDSPTFSKFKPNQPMLILQGDAT

V

F-II(33,35)T NTD-SFTFSKFKPLQPNL

одинаковую первичную структуру N-концевой области молекулы в пределах 20 аминокислотных остатков. У полшептида FI-33 в положении 19 обнаруживаются 2 аминокислоты: изолейцин и лизин. В случае PI-35 в этом положении также детектируются аминокислоты: изолейцин и валин. Для полипептидов 35 кДа и 33 кДа, относящихся к FII, показана идентичность первычной структуры их N-терминальных фрагментов до позиции 18. Эти результаты определенно указывают на присутсвие изоформ. Сопоставление этих последовательностей с известными первичными структурами других ле'ктинов показывает наличие гомологии с некоторыми из них (табл.5) Наиболее значительная гомология наблюдается с N-концевой областью лектина из Crotolarla Jmceae'. передней частью молекулы (123-147 аминокислотные остатки)

N с

конканавалина А (12 остатков). Два аминокислотных остатка Phe и Pñe11 консервативны для всех сравниваемых лектинов. Кроме того, Ser^ консервативен и для лектинов- семейства PhaseoZeae.

Исходя из приведенных данных можно предположить, что структуры тяжелых и легких полипептвдов И и Р11 идентичны, а различия в свойствах обусловлены различным числам цепей, входящих в состав их молекул. Такое предположение согласуется с имеющимися данными для •других лектинов, в том числе и принадлежащих к семейству бобовых. Так, например, для одноцепочечных лектинов из (У(з1аг(а /гогЧЬилйО и конканавалина А показано одновременное существование в растворе смеси форм различной степени олигомеризации: димерной, тетрамерной, и октамерной. Способность к образованию олигомеров характерна и для исследуемого лектина. '___| дед

Объем, ш _

Рис.3. Гель фильтрация ©акция лектинов на колонке ÍSK 3000 S W7,5x 600 мм (Toyo Soda, Japan). Стандартные белки для калибровки: каталаза - 232 кДа, альдолаза - 158 кДа, альбумин 67 кДа, овальбумин 43 кДа, голубой декстран 2000 кДа.

Однако, при гет>фильтрации в среде, содержащей 0.05М фосфата натрия, рН 5,5, Q.IM сульфат натрия, и 5% глицерин, и FI и FII сходят с колонки размерам 7,5 z 500 мм с TSK 3000 SW (Тоуо Soda, Япония) одним пиком, соответствующим молекулярной массе 250 КДа (Рис 3). Поэтому в настоящее время нельзя исключить, что различия в свойствах FI и FII обусловлены особенностями структуры С-концевых областей полипептидов. Электрофорез в диссоцирувдих условиях показывает в обоих случаях наличие двух полкпептидов 33 и 35 КДа, присутствующих, в эквимолярных количествах, и минорного компонента 70 КДа, являющегося, по- -видимому, гетбродимером двух основных цепей. Существующие в этих условиях комплексы образованы, очевидно, четырьмя такими . гетеродимерами.

j

выводы

1. Из семян Batea frondosa аффинной хроматографией выделены два лектина: FI и FII

2. Проведена частичная структурная характеризация выделенных лектинов, включающая определение молекулярного веса, N-концевой аминокислотной последовательности.

3.Разработана тест-система для определения специфичности лектинов из Batea frondosa.

4.Показано, что обе. " формы лектина являются Gal/GalNAc-связывающими, причем форма FII лучше чем FI связывается с GalNAc. ; ; .

5.Определена' олиго ' сахариднаяспецифичнссть . лектинов:

FI показывает максимальное сродство к . Fu6x1=2Gal

(грутоспецифическому дасахариду Н) и Neu5Aca2=6Galpt=4Glc (нейраминозиллактозе); FII - к Gal$1=3GlcNAc (коровому дисахариду" ища I) и GlcNAca1=3GalNAcp (дасахариду антигена Форссмана).

j

Основное . содержание диссертации изложено в, следующих публикациях 4 '

1. S.Padmanabhan, М.К.Р.Агаша, .Hemagglutinins from Cucurbltaceas. Indian Journal of pure and applied biology, 19ЭТ,у 2, p.41-44.

2. S.Padmanabhan,' M.K.P.Amma, Preliminary observations on the Butea frondosa lectins. BooK of abstracts INTERLEC 11s 1989, p.54.

3. O.E.Galsnlna, S.Padmanabhan, E.Yu. Korchaglna, T.7. Zeralyanukhina, V.V.Demln, N.V. Boyln, Molecular forms and carbohydrate specificity ot lectins from Butea frondosa. Book or abstracts INTERLEC 13, 1991, p.13

4. O.E. Galanlna, S.Padmanabhan, • E.Yu. Korchaglna, T.V.ZeralyanuMilna, V.V.Demln, N.V.Bovln, Carbohydrate

speclflcty 0i lectins from Butea frondosa. Book or

abstracts Eurocarb, 1991, p

5; О.Е.Галанкна, С.Падманабхан, Е.Ю Корчагина,

Т.В.Землянухина, В.В.Демин, Н.В.Бовин, "Специфиность .пектина из

Butea frondosa",Биоорган, химии, 1992

б. S.Padmanabhan, V.V.Demln, I.N.Telezhlnskaya, E.Zaltseva,

T.B.Golubeva, O.Yu.Chertov, Studies on the N-terminal sequences of lectins isolated from the seeds oi Butea frondosa В lowed Scl. 1992, v.N , p

a