Лектины, их получение и применение в исследовании гликопротеинов клеточных мембран

Луцик, Максим Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лектины, их получение и применение в исследовании гликопротеинов клеточных мембран
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Лектины, их получение и применение в исследовании гликопротеинов клеточных мембран"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК

УКРАИНСКОЙ ССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. В. ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи

Л У Ц И К Максим Дмитриевич

УДК 591.818:547.963.1 +612.118.22

ЛЕКТИНЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ИССЛЕДОВАНИИ ГЛИКОПРОТЕИНОВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Специальность 03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КИЕВ— 1989

Работа выполнена г с Льзсзсксм отделен:« Института биохимии км. А.В.Лаклздкна АН УСС? и зо Львовской государственном медицинском институте ИЗ УССР

Ведущая организация - Институт биохимик им. А.Н.Бахз АН СССР

на заседании специализированного совета Л 016.07.01 при Институте биохимии ии. А.В.Пэллзднна АН УССР (252030, Киев, ул.Ле-октовича,9).

С диссертацией поено ознакомиться в библиотеке Института биохимик им. А.В.Пздладинэ АН УССР

Автореферат разослан 1989 г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.Я.Захарова

доктор бислогичес:шх наук, профессор С.АЛудинов

дсктг*р медицинских наук, стариий научный сотрудник Ю.В.Бездробный

Защита состоится

■ часов

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук С.В.Хярсенкс

Лектины представляют собой группу белков неиммунного происхождения, обладающих общий свойством специфично и обратимо связывать углеводы, не вызывая изменения их химической структуры (Kooourek, Horejsi, 1983). Ранее наряду с термином "лекти-ны" широко применялся термин "фитогемагглютинины" ( Tobiska, 1964),однако, учитывая то обстоятельство, что известны не только фито-, но и 0акто-,зоо- и др. лектины, а такие то, что иммунные гемагглютинины к лектинам не относят, более корректным следует признать термин "лектины" (Boyd, Shapleigh, 1954; Goldstein, Hayes, 1978; Степаненко, 1978; Франц, 1980).

Проблему, которой посвящена настоящая работа, можно сформулировать следующим образом: получение лектинов, исследование их свойств и применение в анализе состава и структуры гликопротеи-нов клеточных мембран. Она представляет одно из направлений более общей проблемы - лектины и их применение в биологии и медицине.

Актуальность проблемы исследования лектинов определяется, с одной стороны, широким использованием их в качестве биореагентов для решения разнообразных задач в биологии (цитологии, генетике, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии), биоорганической химии, клинической диагностике и др., а с другой - изучением функции лектинов в растительной и животной организме ( Simpson et al., 1978; Линевич,1979; Barondes, 1983; Королев,1984).

В качестве о'иореагентов лектины в первую очередь используют для очистки гликопротеинов, в том числе из клеточных мембран, и характеристики их углеводных групп (Lotan, Nioolson, 1979; irimura, Nioolson,, 1983) .Для этих целей они применяются наряду с антителами против углеводных детерминант, однако получение лектинов связано с меньшими затратами, чем в случае антител. Как инструменты исследования не следует противопоставлять монокло-нальные антитела и лектины, методика их применения в исследовании структуры углеводов практически одинакова, рационально использовать и лектины, и антитела для получения полезной информации.

Очистке.лектинов и их характеристике за рубежом уделяется значительное внимание. Ряд крупнейших фирм, производителей биохимических ре ктивов, наладили выпуск целой серии лектцнов.и их производных, которые широко применяются в научных Исследованиях.

Агглютинины, обладающие специфичностью к нэннозе, галактозе, М-ацетилгэлэкгоэаиину, и-ацётилглюкозамину представлены довольно значительным числом препаратов, в то время как ь-фукозо- и сиалоспецифичные лектины труднодоступны и получаются из дефицитного сырья. В нашей стране настоятельно необходим поиск новых сырьевых источников, получение и характеристика лектинов, эквивалентных по специфичности малодоступным зарубежный образцам.

Использование лектинов для изучения структуры и функции гли-колротеинов, в особенности клеточных мембран, представляется весьма важном и перспективным направлением. Несмотря на то, что гликопротеины играют важную роль в структурной организации и функции клеточных мембран, наши знания о них в настоящее время явно недостаточны (шссйвоп, 1974; Евгеньева,1977). По существ; имеется информация о структуре только гликофорина А мембран эритроцитов человека (Хьюз,1985). Это в значительной степени обусловлено трудностями получения достаточного количества чистых иеибранных гликопротеипов для проведения их анализа и устеновле ния структуры. В связи с этим чрезвычайно актуальной задачей становится резкое повышение чувствительности аналитических мето дов химии углеводов, для решения этой проблемы лектины представ ляют несомненный интерес. Во-первых, реакция связывания лектино с углеводными детерминантами обладает высокой чувствительность® благодаря использованию метки флиорохромом, ферментом или радис изотопом. Во-вторых, с помощью хроматографии на иммобилизиро-ванных лекгинах успешно решается проблема очистки мембранных гликопротеипов и гликопептидов. Если в области аффинной хроматографии не встречается принципиальных трудностей, то применен! лектинов в качестве специфических реагентов на углеводные груш нуждается в основательной разработке. В первую очередь это свя: но с ограниченным количеством лектинов с известной тонкой углеводной специфичностью. Под ней понимают сродство активного цен' ра лектина к углеводной детерминанте определенной структуры в составе глмкопротеинз или гликолипида.

Применение химической и энзиматической модификаций углевод цепей с последующим анализом связывания локтинов позволит суще' венио расширить арсенал методов определения структуры углеводн цопо? в глшеопротеинах и гликолкпидах.

Соетошто знчнпЯ в области исследования лектинов представл ется слсдуюйкм. Этап разработки технологии получения препарате лектинов с рэзличиол углеводной специфичностью, получение прои

юдиых и коньюгатов лектинов о ферментами и другими типами меток ¿окно считать завершенный. Используется главным образом аффинная сроматография не сорбентах, содержащих углеводные детерминанты, < который проявляют сродство лектини. В 70-х годах за рубежом был эсвоен промышленный выпуск препаратов, применяющихся в настоящее зремя а научных исследованиях. Продолжается поиск новых препаратов, которые в ряде случаев превосходят по специфичности ранее известные (например, сиалоспецифичный лектин из слизня 1Л.тах

Пяуиз),

К сожалению, этот аспект исследования лектинов не получил долкного развития в нашей стране. В результате мы не имеем прэк* тически ни одного выпускаемого промышленным способом препарата лектина или его производного, который можно было бы применить для структурных исследования гликопротеинов или клеточной поверхности. Это тем более достоЛно сожаления, что в нашей стране в 60-е годы проводились исследования т области лектинов и были получены новые оригинальные результаты (Потапов, 1970; Голынскап и др.,1979,1980).

В связи с этим в нашей работе (была начата в 1969 г.) один из аспектов был посвящен разработке методик очистки лектинов из различных источников. Получено ряд новых лектинов (см. таблицу I), разработаны методики с применением отечественных материалов. Предложенные методы, имеющие элемент новизны, могут служить основой для разработки промышленной технологии получения лектинов.

3 настоящее время разрзбатызаются следующие прикладные аспекты использования лектинов: применение в цито-и гистохимии для характеристики гликопротеинов и других гликоконьюгзтов в норме и в патологии; биохимический и структурный анализ клеточных и тканевых гликопротеиноз*; выявление групповых аллоантигенов в гематологии и судебной медицине; исследование механизмов взаимодействия макромолекул и клеток и процессов распознавания на молекулярном уровне. Несколько меньшее внимание уделяется разработке вопросов физиологической роли лектинов в различных биологических системах.

*Новым и перспективным методом характеристики гликопротеинов, присутствующих в биологическом материале в смеси с другими биополимерами, является комбинирование электрофореза в полнэкриламид-ном геле с последующим исследованием отдельных гликопротеиновых 'Нунций с помощью лектинов и модификации углеводных цепей (1г1тига. ЩсоХвоп, 1983,1984).Принципиально метод позволяет исследовать структуру углеводных групп гликопротеина без получения его з чир— том состоянии.

Цель нзией работы состояла в получении и характеристике чис тых лектинов с обращением особого внимания на углеводную специфичность и использование их в качестве реагентов для выявления и характеристики глинопротеинов клеточных мембран.

В процессе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Поиск новых источников для получения лектинов, разработка новых методов очистки и получение чистых лектинов, в том числе н вых препаратов, характеристика их физико-химических свойств и уг леводной специфичности.

2. Разработка методов получения меченых лектинов с целью визуализации их при ультраструктурных исследованиях клеточной поверхности и при биохимическом анализе мембранных глинопротеинов. В качестве меток использованы электронно-плотные вещества (фер-ритин, коллоидное золото}, ферменты (пероксидаза хрена},флюоресцентные красители (ФИТД, родаиииоульфонилфторид;.

3. Разработка методических подходов к исследованию гликопро-теинового соотэвэ плазматических мембран, характеристике их углеводных компонентов по связыванию лектинов с известной углеводной специфичностью.

Ч". Исследование электрофоретического спектра гликопротеинов мембран клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов здоровых людей), тимоцигов крысы, клеток зародышей рыб (вьюна}.

Научная новизна работы. Разработаны новые аффинные сорбенты для очистки лектинов на основе природных полисахаридов (гумии-арабикэ, галактоманнака пажитника, яичного белка - овогель). Сорбенты получвготся из доступных и дешевых материалов, они обратимо сорбируют большой набор различных ллстинов. Разработана система поиска и исследования лектинов с заданной углеводной специфичностью. Получены и охарактеризованы следующие новые препараты лектинов: крист. лектин гороха, лектин из омелы, лектин из коры бобовника анагиролистиого, лектин из икры вьюна (анти-В), лектины анти-Н из бузины травянистой и анти-л из горошка одно-парного(послодние два препарата разработаны совместно с и.И.Пои повьш);продложены оригинальные методики очистки агглютининов из сои, зародыше!! пшеницы, софоры ялонской.

Из описанных в литературе и воспроизведенных нами группоспе циничных лектинов, а также полученных впервые высокоспецифичных препаратов онти-В и анти-Н предложен набор для определения груп новых антигенов системы ЛВО, в также антигена и.

Модифицированы методы флюорохромировэния лектинов ФИТД и

родаминсульфонилфторидом, а такие получения коньюгатов лектин-пероксидазы с целью увеличения выхода и максимального сохранения свойотв целевого продукта. Впервые предложено использовать в качестве второго реагента в непрямых методах выявления связанных лактинов коньюгаты тиреоглобулина или асиалотиреоглобулина с пер-оксидазой.

Методом электронной цитохимии охарактеризогана углеводная структура поверхности клеток нейробластош С 1300 (совместно с сотрудниками Института биохимии им. А.В.Палладина д-ром мед. наук О.АДомутовспим и канд.биол.наук О.Ф.Передерий).

Описаны электрофоретичоские спектры мембранных гликопротеинов эритроцитов, тромбоцитов человека и кролика в норме, что монет служить отправным пунктом для исследования изменения мембранных гликопротеинов клеток при патологии. Изучены тзкке спектры гликопротеинов плазматичеоких мембран клеток зародышей вьюна и их изменения в процессе развития, состав гликопротеинов плазматических мембран тимоцитов крысы.

Научно-практическое значение работы. Разработанный методический подход к анализу состава гликопротеинов клеточных мембран с помощью электрофореза и связывания лектинов значительно расширяет информацию о составе макромолекулярных мембранных компонентов. Метод открывает новые возможности для исследования структуры углеводных групп гликопротеинов, особенно при ограниченной доступности материала. Предложенная система целенаправленного поиска лектинов может быть полезной в лабораториях, производящих этот поиск. Разработанные методики очистки лектинов могут слуяить основой для промышленной технологии производства-лектинов и их меченых производных.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на 12-м Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 197'+), симпозиуме СССР-ФРГ по химии пептидов и белков (Душанбе,1976), Ш и 1У Украинских бйохимических съездах (Донецк,1977; Днепропетровск, 1982), Ш Псессгазном биохимическом съезде (Рига,1974), Всесоюзном школе-семинаре "Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов" (Саратов,1985), Всесоюзной конференции lío гемодинамике и. микроциркуляции (Москва,1984), Республиканской конуеренции "Механизмы иммуностиыуляции" (Киев,1985), У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев,1986), Способ" получения фитогемэгглютинина внедрен на Олайнском заводе химреактивов. Публикации. По теме■опубликовано 56 научных работ, из них две

монографии, получено четыре авторских свидетельства.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, восьми глав, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 405 источников, среди них 52 отечественных авторов.

Обьекты и методы исследований

Сырьем для очистки лектинов служили семена сельскохозяйственных культур, растительный материал местного происхождения, а также приобретенный в ботанических садах Львовского и Киевского университетов. Мука семян канавалии мечевидной для получения конкэ-навалина А была любезно предоотавлена д-ром Х.францом (ГДР), листья горошка однопарного предоставлены д-ром М.И.Потаповым (Москва). Белковые железы улиток и икра вьюна местного происхождения.

В исследованиях использованы клетки крови (эритроциты, тромбоциты) человека и кролика, тимоциты крысы, клетки зародышей вьюна на стадии поздней бластулы, клетки нейробластомы С 1500.

Способы очистки лектинов и перечень полученных препаратов приведены в разделе "Результаты". Углеводную специфичность лектинов определяли методом угнетения гемагглютинвции в присутствии проотых Сахаров (Панасюк и др.,1980). Митогенную активность препаратов определяли по методу Мурхед (Линг, 1970) или по ¿акстону и Эвансу (1975).

В работе широко применялись методы электрофореза в различных средах: в агаровом геле, диск-электрофорез в полиакриламидном геле при рН 4,5 и 8,9, электрофорез в присутствии ДДС в градиенте пористости акрилэмидного геля по Леымли ^аеттИ, 1970), электрофорез в кислой среде в присутствии мочевины по Такаяма и соавт ^пкауата et а1., 1966), высоковольтный электрофорез полипептидов на бумаге, электроблотинг протеиногрэмм на лист нитроцеллюлозы (ТокМп ег а1., 1979). Широко использованы также хроматографичес-кие методы фракционирования белков на ионообменных материалах, гелях сефадекса и сефарозы, аффинной хроматографии на биоспеци-^ических сорбентах.

Основные результаты

А. Система целенаправленного поиска лектинов, разработанная на основании обследования около 300 видов растений с целью выявле ния фукоэоспецифичних лектинов (при участии В.А.Антонюка, Львове* мединститут), включает следующие основные положения.

1. Обследование материала растительного или животного происхождения на наличие лектинов с помощью реакции гемагглютинации. Следует применять эритроциты известной группы крови человека,кролика, других лабораторных животных. Отсутствие агглютинации с на-тивными эритроцитами не исключает появления ее с трипсинизирован-ными, палаинизированными либо обработанными другими способами эритроцитами. При поиске лектинов необходимо исследовать различные органы растений, не ограничиваясь семенами, обращать внимание на . фазу вегетации. В ряде случаев она может иметь решающее значение как для углеводной специфичности, так и для количественного выхода продукта.

2. Определение углеводной специфичности обнаруженных лектинов непосредственно в экстрактах или концентратах. Углеводная специфичность является важнейшей характеристикой лектина и, по сути, определяет его практическую ценность. Наиболее ценным представляется моноспецифичный лектин, т.е. проявляющий специфичность к одному из углеводов, встречающихся обычно в гликопротеинэх животных - к галактозе, фукозе, ианнозе, сиаловой кислоте, к-ацетил-галактозамину, н-ацетилглюкозамину. Особенно ощущается малая доступность препаратов, специфичных к ь-фукозе и сиаловой кислоте. Определение углеводной специфичности лучше проводить в концентратах лектинов, полученных путем высаливания сульфатом аммония, осаждения этанолом или ацетоном, так как при этом уменьшается влияние углеводных и других примесей экстракта.

3. Выбор соответствующего сырьевого источника для очистки лектина, который должен учитывать количественное содержание лектина (по титру гемагглютинации) и углеводную специфичность.

Разработка метода очистки лектина характеристика препарата и изучение взаимодействия с углеводсодержащими полимерами и глико-протеинами. Данный этап является нэиболее трудоемким и требует навыков в области химии белка.

5. Определение облаоти применения препарата в научных и лабо-раторно-диагностических исследованиях, целесообразность его крупномасштабного производства. Для этого необходимо также оценить выход продукта, сырьевую базу, необходимость интродукции или культивирования растения или разведения животного. Количественные выходы лектинов колеблются от 25 г (в случае конканава-лина А) до десятка миллиграммов из килограмма сырья; практически удобными являются источники, дающие выходы не менее 50 ыг из килограмма. Следует, однако, принять во внимание, что для лекти-

нов, представляющих особую ценность по углеводной специфичности, не имеет значения количественный выход продукта.

В результате проведенного нами поиска выявлены следующие перспективные сырьевые источники

ь-фу коз оспе цифичных лектинов: бобовник анагиролистнкй, корг (Laburnum enagyroides L. )i копытень европейский, корневища и ЛИСТЬЯ ( Абarun europaeum L. ), цветки мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.). Наличие лектина в последних двух источниках зависит от фазы вегетации (период цветения).

Галактозоспецифичных и Н-ацетилгалактозаыиноспецифичных лектинов: щирица хвостатая (Amarantus caudatus l.i ), бузина черная, все части растения (sambuous nigra l. ), бузина красная, все части рзстения^атЬисив racemosa L. ), птелея трехлистная

(Ptelea trifoliate L.).

Б. Получение препаратов лектинов и их характеристика.

для очистки лектинов методом аффинной хроматографии предложено два новых сорбента: гель из гуммиарабика или галактомачнана пажитника, сшитый эпихлоргидрином, и гель из яичного белка, полученный путем ооработки глютаровыи альдегидом. Гели иа гуммиарабика или гелэктомз¡¡нана были разработаны на основе обследования сорбционных свойств большого числа растительных кс:одей и слизей. Предлагаемые сорбенты отличаются простотой изготовления, дешевизной, стабильностью в эксплуатации, выоокой сорбционной емкостью и связыванием большого числа разнообразных лектинов.

Для очистки лектинов о определенной углеводной специфичность! можно рекомендовать следующие аффинные сорбенты:

для маниoso-, глюкозоспецифичных лектинов - гели сефадекса Г-75 - Г-200, овогель;

для лектинов, специфичных к ^-галактозе - частично гидролиз! ванпая егароза, гель гуммиарабика или галактомэннана, овогель;

для лектинов, проянляющих сродство к oL-галакгоэе - гель гуммиарабика или галактомэннана, овогель;

для лектинов, специфичных к н-ацетилгалактоэамину - частично гидролизованная сефароэа, овогель;

для лектинов, специфичных к H-ацетилглгокозамину - овогель; для лектинов, специфичных к сиаловой кислоте - иммобилизиро-дашшй иуцин слюнных желез крупного рогатого скота;

для L-фукозоспецифичных локтинов - имыобилизировэнный муцин кисти яичиика человека с активностью Н. Нами предпринима-

[ись попытки получения аффинного сорбента для фукозоопецифичных [ектинов на основа фукана водорослей, однако они не дали полоеи-:ельных результатов.

Перед сорбцией на аффинных сорбентах рекомендуем проводить гастичную очистку лектинов путей фракционного осандения сульфатом шиония, этанолом или ацетоном, с целью удаления веществ углевод-юй природы, которые часто блокируют адсорбции лектина на сорбен-се. В ряде случаев фракционное осавдение неэффективно. Как правило, это наблюдается при наличии в экстракте полисахаридов. В связи с этим приходится проводить адсорбцию лектина на ионообменни-ке, например, КМ-сефадексе. Среди других, полезных для очистки свойств лектинов мокио назвать их устойчивость к тепловой обработке (70°С, 10...15 мин), неосаждаеаость .риванолом по аналогии с гамма-глобулинами.сыворотки крови, очень много лектинов не сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 7,0 и ионной силе 0,03.

В работе получены и охарактеризованы лектины из 21 вида растений и животных, С учетом разделения некоторых образцов на отдельные изоформы число препаратов составило 23. Их перечень, краткая характеристика, принципы очистки приведены в табл.1.

В. Множественность молекулярных форм лектинов.

Обычно в биологическом материале имеется набор лектинов, различающихся по физико-химическим и иммунохииическим характеристи-■ нам. В ряде случаев углеводная специфичность отдельных молекулярных форы существенно различается, вследствие чего необходимо проводить разделение и очистку отдельных фори лектина для целей практического ИСПОЛЬЗОВЭНИЯ^НигрЬ'у, Goldstein,I977i Ebisu, Goldstein, 1973; Shibata et al.,1982),

В пределах каждой группы также наблюдается гетерогенность составляющих ее лектинов. Природа множественности молекулярных форм лектинов может быть классифицирована следующим образом. I,Различия преимущественно по молекулярной пассе вследствие агрегации в ди- и тетрэмерные молекулы, стабилизированные дисульфид-ными связями (лектин лимской фасоли, клещевины;.

2. Различия молекул преимущественно по заряду при одинаковой молекулярной массе. Различия обусловлены комбинированием двух отличающихся "о структуре полипептидных цепей в тетрамерную молекулу (фитогемэгглвтинин фасоли, лектины группы I семян Griffo-nia sioplicifolia,ближзйшзя аналогия - структура изоцюрм лактат-деглдрогеназы). Встречаются и другие варианты, один из которых

Таблица I

Перечень и краткая характеристика лекткнов, полученных в настоящей работе

■г и n/ni ! Наименование препарата | Мол. ! Ыол. ¡масса, ¡кДа ! |Субье-| динич-j 1 ная j •струк—j Углеводная специ- 1 Способ | ! очистки ! ! I ! I Литература*

(в скобках сокращенное обозначение) !формы 1 фичность

тура

i £ а 4 ь • - ь тг ь

I. Хонкзнавалин А (Соп А) 104 А, Аффинная хро- Agraval,Gold* stein,I%7.

*Т ОСсл/^с, матография на

сефадексе Г-100

г Лектин гороха (Р5Ь) А 48 ■05 <4% Та же Аффинная хро- Луцик ,1972; ß

В 48 Та же матография на Луцик и др., .

сефадексах Г-75-Г-200 1976.

3 Лектин чечевицы - 48 ¿2ß2 Та же Аффинная хро- Ticha.Entlicher,

матография на Kostif, Kocourek,

сефадексе 1970.

Г-100

4 Лектин из бобов фасоли 5 128 E,,;E-.L.; Сложный пента- Аффинная пре- Луцик , 1976.

(фитогеыэгглютинин, изо- сахарид ципитация ти-

ФГА) форм Из? Ч реоглобулином, аффинная хроматография на овогеле

* Пои отсутствия ссылки ппйпагат описан я няптоятяи пяЛпте.

3 4 5

5 1ектин семян белой акации 1,11 128 ■ ( RPL)

б Лектин из коры белой . Гете- 150 акации (/г..^»-» ) роге-

нен

7 Лектин из семян желтой I, И 60, акации (c^rL ) 120 -

8 Лектин соевых бобов - 120 ДА

9 Лектин омелы ■ I 120 (АВ)2

10 Лектин из арахиса {Pf/t) - 60 А?

II Агглютинин клещевик: I 120 (А В),

{RCA ) ¿

12 Токсин клещевины П 60 АВ

( «сг)

Не установлена He установлена

Не установлена ßÜQal

ß Qat t QalAtfc

Фракционное висали-вание, аффинная преципитация тиреогло-булннои

АфЛинная преципитация тиреоглооули-ном, адсороция на эритроцитах человека

Аффинная преципитация тиреоглобули-

HOM I

Аффинная хроматогра- Луцпк, н фия на геле гумми- 1983 ^ арабика или галакто- 1

панна на

Аффинная преципитат Хомутов-цкя тиреоглобулином скии и

др.,1986. Аффинная хроматогра- Kania, фия на гзле частично иыеп-гидролизованной сефа- brück et РОЗЫ ai.,1980.

Аффинная хтзоматогра- Луцик, фия на сефарозе, 1979

геяьфильтрация на се-фадексе Г-ЮО ■

То же

3 4

Ii. Лггл-хинин зэродалеЛ I, 36

Г.-СНГ.Щ ( VGA ) П.

14. Лектпн семян дурмана - 86

('< DSA. ;

15. Лектин кз клубней - 105

картофеля ( STA )

16. Лектин ия кош бобовника Гете- 130 онэгиролнстного 1 LAL ) роге-

нен

17. Агглютинин из бобов I, 500 лииокок ¿асолиСьвА ) П, 269 И. 138

13. Агглютинин из белоч- 4 79

ной келезк улитки изо-

(hpl ) $cd-

■ ЦЫ

19. Агглютинин из плодов бузина трэзяпистой

(GCc-A/A^t Та же

■Та хе AbQaX-FSAc.

QcUA/Лс.

Аффинная хт)омзто?ра- Луцик,1984. фия на овогеле

Гельфильтрация на сейадексе Г-ЮО. Аффинная хроматография на овогеле.

Фракционное высалива- Allen, ние и осаждение орг., Неиьег-растворителлми, ИОХ ка ger, целлюлозных ионосбменничдуз. ках. Аффинная хроматография на овогеле.

Фракционное осаядение Луцик, этанолом, гельйильтра- Автонюк, ция на сефадексе l'-iOO, 1984. ИОХ на ДЭАЭ-целлюлозе

Аффинная хроматография на овогеле, гель-фильтрация яа сефадексе Г-200 или сефа-розе 6В

Адсорбция на КМ-сефа-дексе,аффинная хроматография на сефадексе

Фракционное осаядение ацетоном,ИОХ на ДЭАЗ-

Хомутовс-

ккй и дг).,

1986 "

Хомутовский и др. 1986.

4 . 5

20. Агглютинин из икры вьюна С MFL )

изсг-

фор-мы

21. Агглатикин из горсш- Гете-ка однопзрного i/ic¡<x. роге-un-jt^o', анти-N нен

180

22. Литоген корней лаконоса (Рда)

изо-фсрм

32, 18

23. Лектин из семян сошоры японской (SJA)

изо-фор-иы

133

AB.

г 2 Фракционное высаливание Хомутоз-

сульфатом аммония,зстря- ский и др., хивание с эф1шоа,гель- . 1986. (Ьплырзция на сесрадексе Г-ЮО.

Не установлена Фракционное высаливание Луцик и сульфатом аымсния л аце- др.,1977 тоном, удаление примесей преципитацией риванолом, гельфильтвзцня I еэ сефадексё Г-ЮО. м

\л

То не Протез экстракта при ВогдезБоп,!

7э 5 МИН., ОСЭЕДеНИе ВехаГеМ примесей 5% хловно:; ег а1., кислотой, высаливание 1966. митогепа сулзфзтсм аммония

, Адсорбция на КМ-сефадексе, хомутов-* ' аффинная хрокзтограйия ский и г^г- па овогеле> гельйиль- др.,1986.

трация на сеээдексе Г-ЮО

исследован нами на примере лектина гороха. В некоторых случаях различия между полипепгидньши цепями трудно выявляются, например, в агглютинине Doiichos bifiorus , у которого цепи различаются ПО углеводному компоненту ( Carter, Etzler, 1975 . ).

3. Молекулярные формы различаются и по молекулярной массе, и по заряду вследствие существования различий в структуре образующих молекулу полипептидных цепей (фукозоспецифичный лектин Lotus tet-

ragonclobua , Pereira, - Kabat, 197^)•

Нами изучена природа множественности молекулярных форм лектина гороха. Он имает три формы, которые разделяются при диск-элек-трофорозе в щелочной системе при рН 8,9. В количественном отношении преобладают две формы, обозначенные нами А и В. Препаративно их выделили с помощью ШХ на КМ-целлюлозе. При анализе соствва полипептидных цепей чиотых изоформ с помощью электрофореза в мочевине по Такапме установлено, что различаются цепи J. мол. массы 7 кДа (см.рис, I). После разделения Аир цепей чистых молекулярных форм А и В лектина с. помощью гель-хроматографии на сефадексе Г-50 в1М уксусной кислоте и б М мочевине сравнивали их аминокислотный состав и пептидныо карты.

Рис Л. Сравнение молекулярных форм А и В лектина гороха методом электрофореза в акриламидном геле в мочевине по Такаямз и созвт. Обозначения: а,г - исходный препарат, б - чистая фракция А, в - чистая Фракция В, д - полипептидно/, цепь /> , о - полигюптидная цепь j, смеси изс^орм А и В лектина.

Выявлены различия в аминокислотном составе и на пептидных картах только цепей о(. , ^-цепи были идентичны. В составе ¿/д-цепи содержится на один остаток лизина больше, чем э (Ь^-цепи. При расщеплении трипсином в спектре образующихся полипептидов вместо одного из пептидов сЦ-цепи выявлялось.два новых пептида Ад-цепи, Из полученных результатов сделан вывод, что различия между молекулярными формами лектина гороха обусловлены аминокислотной заменой в ^-цепи молекулы (лизин'вместо аланина или валина).

Из установленной ранее четгертичной структуры молекулы аг-люгииина гороха (с^^)« а также наличия двух вариантов ¿-цепи следует, что структура формы А может быть представлена как

2* "олекулярной форме В соответствует .^2^2' Так1Ш о^Р3-зом, форма А имеет на два положительных заряда больше и является более щелочным белком, чем В, что согласуется с результатами электрофореза. Незначительная фракция с промежуточной электро-форетической подвижностью представлена гибридными молекулами

Г. Производные,лектинов, применяемые для изучения связывания агглютининов с гликопротеинами.

Для выявления связывания лектина с гликопротеинами используются методы, применяемые обычно в иммунохимии для выявления связывания антител. В прямых методах используются препараты ленгннов, меченые подходящей меткой: радионуклидом ( Н3, и*2-5), ферментом (пероксидазой хрена, кислой фосфатазой, глюко-зооксидазой), электронно-плотными веществами (ферритином,коллоидным золотом). В непрямых методах для выявления овязанного лектина используют меченые .реагенты, проявляющие сродство к лектинам. В качестве таких реагентов могут выступать нативные ферменты-гликолротеины (пероксидаза хрена для выявления конканавалина А, субфракция глюкозооксидазы для выявления агглютинина пшеницы), либо меченые гликопротеины (тиреоглобулин, вещество А+Н слизистой желудка и т.п.). Нами, в частности, предложен в качестве второго реагента на целый ряд лектинов коньюгат тиреоглобулина (асиэлотиреоглобулина») с пероксидазой хрена.

Для исследования взаимодействия лектинов с клеточной поверхностью и с мембранными гликопротеинэмн получены следующие производные лектинов: а)препэраты, флгаорохромированные 4-ИТЦ или

родаминсульфонилфторидом; б) коньюгаты агглютининов пшеницы, сои, 'арахиса, бобовника анагиролистного, тиреоглобулина и овомукоида с пероксидазой хрена; в) коньюгаты лектинов с ферритиноы; г)ком-плексы лектинов и гликопротеинов с коллоидным золотом, в методики флюорохромирования и коньгагирования с пероксидазой хрена введено ряд модификаций и уточнений, цель которых максимально сохранить биологические свойства лектина и получить наиболее высокий выход продукта.

Наибольший интерес, по нашему мнению, представляют препараты, меченые ферментами, в частности, пероксидазой. Их можно применят] как в световой и электронной микроскопии, так и в биохимических исследованиях взаимодействия лектина с гликопротеином или с клеточной поверхностью.

Изучение различных методик получения коньюгатов с пероксидазой показало, ЧТО наиболее Эффективен метод Nakane, Kawaoi,

(1974) в модификации Miller et al, (1974), При исследовании отдельных этапов реакции нами были введены изменения с целью ускорения процесса и оптимизации реакции. Детальное описание методики можно найти в соответствующих публикациях (Хомутовский и 'др 1986). Ниже кратко обсуждены основные моменты и внесенные нами дополнения. Принципиально метод состоит из следующих этапов: I) блокирование Н-концов пероксидазы динитрофторбензолом; 2) окн слоние углеводного компоненте пероксидазы периодатом! 3) присоединение необходимого белка к активированной пероксидазе через ельдимшшые связи типа Шиффовых оснований и стабилизации этих связей восстановлением боргидридом} 4) очистке коньюгата.

Этап окисления пероксидазы необходимо'вести при контролируем злзчешш рН. Предложенные нами условия ( блокирование Н-концов в среде 1>-ного бикарбоната, добавление какого количества пер-иодата натрия, чтобы установилось рН 6,8-7,2) обеспечивают.воспроизводимые результаты. Длительный диализ после окисления периостом мы заменили гольфильтрацией на сефадексе Г-25 в 0,01 Ы карбонате натрия. Для эффективного присоединения белка к.активированной пероксидазе требуется низкая ионная сила и щелочное рН для подавления диссоциации оминогрупп в белке, за счет которых происходит присоединение к пероксидазе. Нами также найдено, что защита центра лектина с помощью углеводов-ингибиторов не обязательно.

Наиболее простим методом очистки продукта является высали-ьпнкс эимсний сульфатом. Большинство коньюгатов осаждается при

40 ^-ноы насыщении соли, при которой нативная и модифицированная пероксидэза не ¿саждаютоя. Однако ряд коньюгатов, особенно пероксидаза, после осаядения очень плохо растворяются, поэтому для них нунно применять другие методы очистки. Лучшим является гельфильтрация на сефадексе Т-200 или сефгрозе в зависимости от молекулярной массы коньюгата.

Д. Исследование клеточной поверхности с помощью меченых пектинов.

Исследования проведены на клетках нейробластомы С 1300 с применением морфологических методов выявления рлектинсвязывающих рецепторов. Локализацию мест связывания лектинов на поверхности клеток нейробластомы выявляли с помощью флюоресцентной микросколии и на уль'траструктурном уровне'- с помощью просвечивающей электронной микроскопии, применяя метку лигандов коллоидным золотом, ферритином или пероксидазой. В прямых методах метили непосредственно препараты агглютининов, а в непрямых методах в качестве второго реагента использовали пероксидаэу хрена для выявления конканавалина А (вага1;, Аугшпеав, 1973) или меченый тиреоглобулин {Хомутовский и др.,1986). Использовали префиксиро-ванные клетки, поэтому полученные результаты распределения рецепторов лектинов характеризуют их исходное оостсяние в клеточной мембране и не отражают их динамику пооде связывания лиганда.

в преварительных экспериментах для количественной оценки связывания различных лектинов о клетками нейробластомы определяли количество связываемого ФИ'ГЦ-меченого лектина а аликвота-ки клеточной суспензии. Выраженное в относительных единицах (количество наиболее слабо связываемого лектина тетрагонолобуса принимали за I), связывание других лектинов составляло: лектин бобовника внагиролиетного - 1,5, чечевицы - 4, лек?ин арахиса - I, 1,5, улитки - 5, зародышей пшеницы-- 8, клещевины - 10, лимской фасоли - 10, конканавалина А -.10,

При флюоресцентной микроскопии наиболее интенсивная флюоресценция отмечалась с конканавалином А, агглютининами пшеницы, клещевины, улитки. Фукозоспецифичные лектины, а также агглютинины арахиса, сои, софоры японской очень слабо связывались с интактными клетками нейробластомы.

При анализе распределения рецепторов лектинов на поверхности клеток методом ультраструктурной цитохимии установлены следую-

щие закономерности. Конканзвэлин А связывался равномерным слоем по всему периметру плазматической мембраны клетки. Другой мэн-нозоспецифичный лектин - агглютинин чечевицы - связывался в виде изолированных гранул, неплотно и равномерно распределенных по клеточной поверхности. Рецепторы лектина арахиса выявлялись в виде единичных гранул метки на поверхности мембраны. Плотно были распределены рецепторы агглютининов клещевины и зародышей пшеницы. Для них характерно неравномерное, клэстерирозанное распределение, причем для агглютинина пшеницы более выраженное.

В некоторых случаях отмечалась очень высокая локальная концентрация рецепторов лектина пшеницы на аксошшх холмиках. Количество рецепторов для агглютинина улитки было большим, сравнимое с таковым для агглютинина клещевины, распределение по поверхности равномерное. Лектин бобовника, специфичный к ь -фукозе, связывался с поверхностью клетки в виде единичных сайтов, иногда отмечались группировки из нескольких гранул метки. Для этого лектинз характерно неодинаковое связывание о клеточной популяцией, что свидетельствует о ео гетерогенности. Для пектинов арахиса и сои отмечает следовое связывание с поверхностью ингакпшх клеток нейробластомы. Связывание лектина сои резко увеличивалось пооло обработки клеток трипсином, а лектина арахиса - после де-сиалчрования клеток нейрэнинидозой. При атом распределение рецепторов било плотным и равномерным.

На основании полученных данных о связывании и распределении локтинов и их углеводной специфичности мокно сделать выводы, что на поверхности клеток нейробластомы имеется достаточно много гли*1 копротеинов с Н-гликозилышми цепями. О .и содержат остатки К-аце-тил-лактозпмпна, в большинстве сиалировэнные, что характерно для Н-гликозилькых цопей гликопротеинов. Относительно слабое связывание локтина чечевицы свидетельствует о наличии трехантешшх цепей кли об отсутствии остатка фукозы при первом К-зцетилглюкоз-гмиио углеводной цепи. Особенностью клеток нейробластомы является наличие большого количества остатков Н-ацстил-ь/1) га лактоза мина, что встречается довольно редко. Ь-Фукозние детерминанты на поверхности клеток представлены в очень небольшом количестве. Связывание лектина орахисв' после десизлирования поверхности клетки свидетельствует о наличии О-гликозпльних целей в гликопротеинах, еднпко для характеристики их количественного соотношения с Я-гликсзилышми цепями дпшшх пока недостаточно.

Очснидно, что морфологический анализ евпзынзпип лектинов с

поверхностью клетки дает весьма неполную информацию о количественных характеристиках связывания и о составе популяции молекул, связывающих тот или иной лектлн. Для решения этих вопросов необходимо привлечение биохимических методов анализа; в частности, с целью изучения состава популяции гликопротеинов нами разработан метод электрофоретического разделения мембранных компонентов с последующим анализом связывания лектинов о репликой электрофо-реграммы на листе нитроцеллюлозы и характеристики углеводных компонентов отдельных гликопротеиновых фракций.

Е. Анализ мембранных гликопротеинов методом электрофореза и связывания лектинов.

Электрофорез е градиенте пористости полнакрилаиидного геля в присутствии ДДС натрия представляет собой мощный аналитический метод исследования состава мембранных компонентов, прежде всего полипептидов. Получаемую с его поиищью информацию можно существенно расширить за счет выявления на электрофореграмме наряду с полипептидаыи также гликопротеинов, нуклеиновых кислот, ферментов, рецепторов гормонов и т.п. физиологически активных макромолекул. Лектшш, в частности, предоставляют очень хорошую возможность для идентификации и исследования гликопротеинов: используя препараты с различной специфичностью к углезодным детерминантам, можно характеризовать углеводные группы отдельных гликопротеинов.

Анализ включает следующие этапы: I) электрофорез солюбили-зированных мембран в полиакриламидном геле в присутствии ДДС нат* рия; 2) перенос злектрофореграммы, на лист нитроцеллюлозы типа Миллипор НА; 3) обработка реплик лектинами и выявление лектинсвя-зывающих фракций.

Принципиально важным является метод переноса электрофореграмн из акриламидного геля на лист нитроцеллюлозы (' ТоиМп et а1., 1979). Проведение реакции на поверхности нитроцеллйлозного листка значительно Улучшает контакт между реагирующими веществами и ускоряет смену реагентов и процессы отмывки. Мы проводили этот процесс в аппарате собственной конструкции, элемент новизны которого заключается■ в том, что гель с нитроцеллмозной мембраной помещается между двумя керамическими пластинами. Они обеспечивают тесный контакт Голя с мембраной и не создают значительного сопротивления электрическому току.

При прямом методе визуализации последовательность обработки была следующей: I) обработка нитроцеллюлозных реплик раствором

0,05 % твина-20 в ЗФР, содержащем 0,1 мэкв Са2+ и ып2+ в течение 15...20 мин; 2) инкубация в растворе коньюгата лекгинпероксидазы в ЗФР-твин 20 в течение 2-12 ч при 3) отмывание от избытка несвязанного лектина холодным ЗФР-твин, 20} Ч) проявление активности пероксидазы с помощью реактива Карновского 5.,.10 мин при комнатной температуре.

В непрямом методе выявления связывания лектинов последовательность обработки следующая: I) обработка реплик ЗФР - твин-20, как в прямом методе; 2) инкубация в растворе нативного лектина в ЗФР - твин-20, концентрация лектина 10-25 мкг/мл в течение 2..Л ч при 4°С; 3)' отмывка от несвязанного лектина ЗФР-твин 20; 4) инкубация в растворе 5 мкг/мл пероксидазы (для выявления кон-канавалина А) или 10 мкг/мл коньюгата асиалотиреоглобулин-перок-сидазы в течение 2...3 ч при 4°С; 5), отмывка от несвязанного фер-иента; 6) проявление активности пероксидазы реактивом Карновского в течение 5...10 мин при комнатной температуре.

Важным длп успешного проведения реакции является правильный подбор концентрации мечбных перокоидазой реагентов. При этом ре-' командуем ориентироваться по активности пероксидазы в реагенте, в не по тиру гемагглютинации. Мы пользовались такими разведениями, при которых 8ликвот8 в 5 мкл, нанесенная нэ нигроцеллюлозный фильтр в виде пятна диаметром 5 им,четко проявлялась реактивом Карновского в течение 10 мин. Исключение представляет коныогат агглютинина пшеницы о пероксидазой, обладающий выраженной неспе-цифичоскоа сорбцией на нитроцеллюлозе. Для снижения интенсивности фона мы применяли в 10 раз меньшую концентрацию этого реагента, чем для обычных коныогатов, и удлиняли.вг-эмя инкубации до 12-16 ч.

Непрямой метод'выявления связывания лектинов имеет то преимущество, что в ном попользуются нативные лектины и нет опасности изменения их углеводной специфичности вследствие присоединения метки. Применимость метода ограничивается наличием реагента, специфично выявляющего связанный дектин. Наиболее простыми реагентами. токого типе являются гликопротеины с ферментативной активностью, например, пероксидаза хрена для конканавалина А. К сожалению, для выявления других лектинов она неприемлема. Альтернатив«-ним вариантом специфического реагента для выявления лектинов являются антитела против них, однако они должны быть приготовлены длп кокдего конкретного лектина. В нэмих исследованиях реагентом длп выявления лектинов служил тиреоглобулин, меченый перокоидазой ИЛИ МТЦ. Данный гшиконротсин обладает сродством ко многим

лектинам, в частности, чечевицы, гороха, клещевины, а после де-сиэлирования нейраминидазой он взаимодействует с агглютининами сои, софоры, лнмской фасоли. Это позволяет использовать его в качестве реагента для, целого ряда лектинов.

Гликопротеины плазматических мембран клеток крови.

Эритроциты, человека.. Состав полипептидов и гликопротеинов эритроцитарных мембран, человека изучен достаточно хорошо, в связи с чем данный обьект- использован нами для выяснения возможностей разработанной нами методики. На рис. 2 схематически представлен спектр полипептидов и гликопротеинов теней эритроцитов человека, полученный с помощь» электрофореза в градиенте пористости акриламидного геля в присутствии ДДС и проявления рээлич-' ними лектинами, мечеными пероксидазой или ФНТЦ.

С помощью окраски ШИК выявлено три группы гликопротеинов -ШИК-1 (гликофорин А),включающую четыре фракции, ЫИК-2, содержащую три фракции,.ШЙК-3, в которой выявлялись одна-две фракции. Разделение групп гликопротеинов на фракции обусловлено высокой разрешающей опоообяостыо градиентного ЛААГ. Следует'отметить, что большинство гликопротеиновых фракций не совпадали с белковыми зонами, окрашенными куыасси голубым Р-250.

С помощью лектинов чечевицы, клещевины и пшеницы выявлялось две главные фракции гликопротеинов - белок зоны 3 (переносчик анионов) и диффузно мигрирующая зона с мол. массой 37...60 кДа. Следует особо подчеркнуть, что данные гликопротеины на окрашивались с помощью ИИК-реэкции. Лектии чечевицы выявлял также слабо выраженную зону с мол. массой 20 кДа, отличающуюся от ЕПК-3. Следует также отметить, что конканавалин А не связывался с мембранными гликопротеинами эритроцитов человека. Это соответствует неэгглютинируемости эритроцитов человека данным лектином. ■ Отсутствие окрашивания рассматриваемых гликопротеинових фракций с помощью ШИК-реэкции свидетельствует о невысоком содержании в них углеводов. Известно, что белок зоны 3 эритроцитов человека содержит 5...8?» углеводов, при этом углеводные цепи связаны с полипептидом К-гликозильной связью ( Нзсо1роп, 197^; Черницкий, Воробей,1981). Таким образом, реакция ШИК в большинстве случаев не выявляет мембранных гликопротеинов, содержащих Я-гликозильные цепи, этот пробел можно восполнить только с помощью "окрашивания" лектинами.

2'Л

ггр

■ по I ч с

Ш//.

М/т

П-ог. ШИН РКй' 5М' 1СС ПСА Щв ш" НН" Ш вЖ

Рис.2. Электрофорез белков и гликопротеинов теней эритроцитов человека (схема). Прот,- схема нротеинограммы в сравнении с оригинальной электрофсреграымои теней эритроцитов группы А. Цифры слева - мол. масса (кДа), цифры справа -индексы полипептидных фракций по номенклатуре Фэрбенкса (ЕаЬ-ъапкв et аХ., 1971). ШМ - окраска гликопротеинов с помощью реакции ШИК. Сокращенные обозначения лектинов приведены под соответствующими схемами элоктрофорегрзыы.

"Обработку лектинаии проводили после десиалирования кислот-

ныи гдролизоы.

Представленная картина специфична для эритроцитов группы О (ЪоЬ.ЬАЬ ) или А ( НИ,).

Лектины арахиса и сон взаимодействовали с фракциями гликопротеинов только после десиалирования мягким кислотным гидролизом, при этой лектин арахиса выявлял фракции, в точности совпадающие с ШК-положигелышми зонами. Окрашивание лектином (то намного чувствительнее ШИК-реакции, особенно в случае перокси-даэной метки. Это позволило выявить еще'несколько дополнительных минорных фракций в области ШИК-2 и ШИК-З. Известно, что лектин арахиса проявляет наиболее высокое сродство к дисахариду ОаХ^Хг-ЗБаХПАс , составляющему основу О-гЛикозильных цепей. Сиалированные цепи этого типа преобладают в гликофорине А и,

вероятно, других ШИК-иоложительных фракциях эритроцитов. Количество углеводов в этих гликопротеинах обычно высокое и составляет 40...60 вследствие чего они .легче выявляются с ггомошыо окраски ШИК и плохо окрашиваются на белок. После десиалироватшп они интенсивно связывают лектин арахиса. Точное совпадение ШИК-положителышх и РЯА-положительних фракции указывает, что лектин арахиса мошю применять для выявления О-гликозилышх цепей в составе гликопротеинов.

Агглютинин сои, в отличие от арахиса, связывался только с некоторыми деснэлиро-ваннши фракциями в области li'IM-I и Ш1Ж-3. Из этого следует вывод, что лектин сои также взаимодействует с О-гликэнзми, однако, в отличие от арахиса, он проявляет более высокую, селективность к углеводным детерминантам.

С помощью группоспецифичных лектинов (анти-Н, анти-А и анти-В) нами установлено, что антигенные детерминанты системы ABO имеются в нескольких гликопротеинах. Помимо белка-переносчика анионов они содержатся в гликопротеиновдй фракции с мол. массой 37...50 кДа, содержащей N-гликс нлыше цепи. Лектины тетрагоно-лобуса пурпурного, бобовника анагиролистного, улитки проявляли вцсокую селективность и взаимодействовали только с гликопротеи-нами соответствующей групповой принадлежности. Благодаря высокой чувствительности пероксидззной метки, лектин улитки наряду с двумя главными фракциями выявлял еще 5 минорных'гликопротеинов с мол. кассой I8...2'f кДа, содержащих антигенную детерминанту А. Лектин софоры не обладал высокой избирательностью к групповому антигену В, для лектина лимской фасоли отмечалось значительное неспецифическое связывание с фракциями мол. массы 72 п 68 кДа.

При сравнении перокси71азного и флюоресцентного методов визуализации лектинов установлено, что чувствительность первого знз-т чительно выше, но при этом возможно появление артефактов вследствие цсопецифического связывания реагентов. Поэтому для достоверной интерпретации результатов необходимо учитывать данные, полученные обеими способами.

Существенным достоинством флюоресцентного метода визуализации лектина является простота контроля за ходом реакции, а такие возможность удаления лектина из реплики электрофорегрзммы путем отмывания ее в растворе углевода-ингибитора, после чего электрофорегрзмму можно обрабатывать новым лектином. Таким образом, на одной электрофореграмме можно определить положение гликопротеинов, связывающих различные лектинн, что немаловажно

для точного сопоставления и идентификации компонентов.

Эритроциты кролика. Количество гликопротеинов, свяаывающих лектини, в -мембранах эритроцитов кролика больше, чей у человека, Возможно, это обусловлено тем, что распределение 'их ша электро-фореграммэ более дискретно, Ыаннозоспецйфичные лектины, в той числе и конканавалин А, свяаывались с белковыми зонами 8, 4.1, 4.3, 5.1. Агглютинины клещевины и пшеницы интенсивно связывались с гликофорином А, четырьмя-пятыо фракциями в области пептидов 4...5, весьма слабое связывание отмечалось с белкой зоны 3. Лектин сои очень слабо, вероятно [¿¿специфично, взаимодействовал с белком 2.1 /аикирином/. Групцоспецифичные лектины (тетрагоно-лобуса, улитки, софоры, лимской фасоли), а также лектины бобовника анагиролистного с гликопротеинами эритроцитов кролика не взаимодействовали, что согласуется с неагглютинируемостыо этих клеток лектинзми данной группы.

Тромбоциты человека, Гликопротеинн тромбоцитов принимают непосредственное участие в функции этих форменных элементов. В настоящее время в составе тромбоцитов различают от 10 до 12 фракций гликопротеинов: фактор УС1, гликопротеин с мол.массой 2би кДа, тромбинореактивный белок тромбоспондин (160 кДа), фракции, обозначаемые индексами 1э (145 кДа), 1ь (135 кДа), 1с,Па(125 кДа), ПЬ (115 кДа), Ш (105 кДа), П (95 кДа), У (нсОгевог а1., 1980; Мого1 et а!., 1984; ок^а въ а!., 1985). При некоторых наследственных заболеваниях отмечается тесная взаимосвязь между отсутствием или уменьшением количества отдельных фракций гликопротеинов и функциональной неполноценностью тромбоцитов, в частности, недостаточность гликолротеина I при синдроме Бернарэ-Сулье, гликопротеинэ Ш при тромбастении Гланцмана {.1ис18оп,А1^ее, 1981). Сказанное свидетельствует об актуальней анализа полипептидного и гликопротеинового состава' тромбоцитов и перспективности его применения в клйнико-лабора торных исследованиях.

Нами исследован состав полипептидов и гликопротеинов интакт-ных тромбоцитов человека и полученных из них мембран с помощью лектинов. Результаты схематически прздставлены на рис, 3. В про-теинограмме выявлено до-47 фракций, которые воспроизводились при повторном анализе тромбоцитов одного и того же донора.

При окраске геля с помощью реакция ШИК выявлялось около II гликопротеинов, из которых шесть проявлялось отчетливо (зоны I, 2, 4, 5.1, 5.2, 7,8); наиболее интенсивная ЦИК-положительная фракция имела мол. массу 130 кДа и била идентифицирована нами

с гликокзлицином. Выявляемый лектинами спектр гликопротеинов был намного сложнее, тем при окраске ИИК (рис.3), оценку связывания пектинов с основными гликопротеинозыми фракциями си. табл.2.

Mü,t. . г:'л и

frei. MS ConH LCL KU UGR № Ш' SJA"

Рис.3. Схема белкового и гликопротеинового состава интэктннх тромбоцитов человека.

Обозначения: Prot.- протеинограммэ (приведена нумерация фракций и их мол. масса в кДа), fas - гликогрэмма, окрашенная ШИК; под лектинсгрэммами указано, с каким агглютинином проводилась "окраска";

^обработка проведена после десиолирования мягким кислотным гидролизом реплик.

На'схеме и таблице не приведено ряд лектинов, которые не взаимодействовали с гликопротеинами тромбоцитов. К ним относятся лектин бобовника анагиролистного, агглютинин улитки, софоры. Но имзющимся данным можно дать'следующую характеристику оснозных гликопротешговых фракций. Зона с мол. массой 300 гсДэ представляет собой гликопротеин с высоким содержанием углеводов (ШК-поло-жительная), углеводные цепи представлены как N-гликанами (взаимодействие с конканзвалином А, агглютинином чечевицы), так и О-гликанэии (взаимодействие с лектинои арахиса после десиалиро-нлния,' з тлк'Ю с агглютинином шюнншО- 'Громбоспендин является

Таблица 2

Характеристика взаимодействия лектинов с главными фракциями гликолротеинов интэткных тромбоцитов человека

1иоответсвующая!1иол. I Взаимодействие с лектинаыи

Гликопротеин Iполипептидная Шаоса -1-

1 зона I кда ! _I_1 I_

X ьиО + + - + + -

Тромооспондин 4 180 3+ 3+ 3+ 3+ - +

1а 5 155 - + , . + + + ±

' I 5.1/5.2 130 + + + 2+ 3+ 2+

(гликокалицин)

П 6 115 2+ + . + + + -

Ш 7 105 3+ 3+ + 3+ + -

1У 8 90 - + - - - -

- 10 75 2+ + - + - -

- 10.2 60 + 2+ + + + +

- 14.2 32 + 2+ + 2+ - +

- 17 20 3+ 3+ + 3+ - -

^взаимодействие после предварительного десиалирования.

гликопротеинои о высоким содержанием углеводов, которые представлены Н-гликозилпшыи цепями. Гликоколицин - один из основных гликопротеинов мембран тромбоцитов, содержит очень большое количество углеводов, плохо окрашивается на белок и резко ОТК-поло-иителышй. Его угло одныо цепи представлены О-гликэнами, так как он связывает лектин арахиса после десиалирования и не взаимодействует с конканавалином А и лектинсм чечевицы.

Гликопротеип Ш содержит главным образом Л-гликозильные цепи, возможно, однако, небольшое количество 0-гликозильных цепей. Гликопротеип с мол. массой 20 кДа не описан в литературе, по характеристикам взаимодействия с лектннаии соответствует гликопроте инам, содержащим Н-гликозлльные цепи. '

Помимо интатктных тромбоцитов исследовали состав трон0оцитарных мембран, получениых после обработки клеток сапонином. Установлено, что после отмывания водорастворимых белков исчезали полш.ептидные зоны с индексами 1.3, 6.10, 14, появлялись новые фракции с индексами За, 36,'5.1а, 5.16, 10.2, 14.3. При окраске ШИК выявлялись идентичные с интактными тромбоцитами фракции гликопротеинов. Б спектра лектин-связывающих гликопротеинов отмеча-.лись различия в положении некоторых минорных компонентов,

основные же фракции гликопротеинов были идентичны тэковнм у ип-тактных тромбоцитов.

Для сравнения исследовали также спектр гликопротеинов тромбоцитов кролика. Отмечено близкое сходство полилепгпдного и гли-копротеинового состава с таковым у "человека, вместе с тем общее количество фракций было меньше. Особенно ото заметно на лекти-нограммэх, окрашенных агглютининами клещевины и пшеницы.

Применение в качестве объекта исследования эритроцитов и тромбоцитов человека, гликопротеиновнй состав которых описан в литературе сравнительно хорошо (Черницкий, Воробей, 1981; Кого! et al., 1984; Okita et al., 1985), позволяет четко определить те возможности и преимущества, которые открывает применение лек-тинов в анализе гликопротеинов на электрофореграммв. Во-первых,ь это существенное расширение информации о составе гликопротеинов объекта за счет высокой чувствительности метода, которая намного превышает таковую всех известных в настоящее время методов выявления гликопротеинов. Благодаря этоуу достоинству нам удалось показать значительно больш.ю сложность гликопротеинового спектра майоран эритроцитов и тромбоцитов человека, чем описано в литературе, и выявить ряд новых гликопротеиновых фракций в этих клетках. Во-вторых, лектины позволяют дифференцировать типы углеводных цепей, в частности, И- и О-гликозильные цепи. Этим, однако, не исчерпываются возможности лектинов и в дальнейшем несомненно будут раскрываться новые аспекты по мере совершенствования метода и использования новых препаратов агглютининов.

Гликопротеинн плазматических мембран тимоцитов крысы. Тимо-циты получали путем дезинтеграции вилочковой железы половозрелых беспородных белых крыс массой 180...200 г. Клетки суспендировали в ЗФР, содержащем 5 мМ t'oCi2 и 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина или 10% сыворотки крови крысы. При супрэвиталь-. ной окраске трипановым синим количество живых клеток составляло 85%. Относительно большое число мертвых клеток обусловлено тем, что не проводилось очистки тимоцитов с помощью центрифугирования из фиколл-верографине (плотность 1,079) вследствие больших потерь клеточного материала на этом этапе.

На основании проведенных на ми исследований по очистке мембран путем раэруиения тимоцитов и дифференциального центрифугирования либо экстрагирования мембранных компонентов рзстворзми детергентов предпочтение было отдано последнему методу. В роботе испсль-

зовали препараты мембранных компонентов тимоцитов, полученные путей оолюбилизации забуференныи I %-ным тритоном Х-100 теней тимоцитов, предварительно лизированных сапонином.

При электрофорезе на протеинограмме выявлялось до 50 фракций, расположение которых было воспроизводимым.. . . Окраска методом ШИК выявляла слабо окрашенную зону в области мол.массы 150 кДа. Из примененных лекгинов наибольшее количество гликопротеинов выявлял конканавалин А (I?). Лектин чечевицы проявлял меньшее количество фракций (8), которые совпадали с фракциями, связывающими конканавалин А. Лектин арахиса после десиалирования гликопротеинов' мягким кислотным гидролизом интенсивно связывался с глико-протеиновой фракцией 150 кДа, а также выявлял ряд минорных фракций в области мол. масс 16...45 кДа.

Гликопротеин с иол. массой 150 кДа представляет несомненный интерес, так как он взаимодействовал практически со всеми использованными лектинаыи, Это указывает на наличие как Я-, так и 0-гликозильных цепей в структуре молекулы. Ионно предполагать, что гликопротеиновая фракция с массой 24 кДа соответствует антигену Thy . в облвсти мол. масс 50...70 кДа находятся, вероятно, полипептидные цепи уц , $ и % мембранных форм иммуноглобулинов, которые содержат углеводные цепи; в составе мембран тимоцитов находятся также гликопротеины большого комплекса гистосовмести-иости - liUC. Точная идентификация этих мембранных компонентов по данным связывания лектинов без ыоноспецифических антисывороток не представляется, однако, возможной.

Гликопротеины плазматических мембран клеток зародышей вьюна. Рост и дифференцировка клеток в эмбриогенезе сопровождается существенным изменением химической структуры клеточной поверхности. ' Весьма значительный вклад в эти изменения вносят углеводные компоненты гликопротеинов ( Feizi,I985}Raeaier,Raedler,I985). Очевидно, что первым этапом ийучения этих изменений является анализ состава мембранных гликопротеинов клеточных поверхностей, исследование структуры углеводных цепей каждого гликопронеина 'и выявление изменений, которые происходят с шши на разных этапах эмбриогенеза.

В нашей работе объектом исследования служили эмбрионы рыбы вьюна на стадии поздней блзстулы-раиней гаструлы. Преимуществом этого объекта является возможность получения эмбриональных клеток в сравнительно большом количестве на заданном этапе развития. Получение изолированных клеток из зародышей, очистка и харак-

теристика плазматических мембран из них были разработаны нами и опубликованы ранее (Яуцик и др.,1983,1986). Анализ гликопротеи-нового спектра мембранного препарата проводили разработанным нами способом о применением лектинов, предварительные результаты опубликованы (Луцик И др., 1986). Ниже приведены результаты анализа гликопротеинов плазматических мембран клеток зародышей вьюна.

Электрофоретический спектр полипептидов и гликопротеинов охематично представлен нэ рис.

¡Ш-

Рп! да ст,я иси рм"

РисД. Схема белкового и гликопротеинового состава плазматических мембран клеток зародышей вьюна. Обозначения: Рго1;г протеинограыма (схема и слева оригинал; приведены индексация зон и их-мол. масса в кДа). раб- окраска нэ гликопротеины с помощью реакции ШИК. Конкзнавалин А выявляли с помощью пероксидэзы, в других случаях использовали флюоресцирующие фитц-лектины. Обработку РЯА проводили после предварительного деснэлированпя гликопротеинов кислотным гидролизом.

- зг -

На протеинограмме выявлялось до 38...40 фракций, которые были воспроизводимы. Индексация зон и мол. ыасср соответствующих полипептидов приведены в табл.3. При окраске гликопротеинов методой ШИК очень слабо проявлялась только одна фракция с мол. массой 150 кДа; она соответствовала очень слабо выраженной зоне на протецнограмме. При анализе лектинограмм установлено, что после десиалировэния гликопротеина лектин арахиса связывался главным образом с фракцией с мол. массой 150 кДа. Кроме того, выявлялось еще 3-4 слабо выраженных зоны с мол.массой 40, 27 и 17 кДа. Без десиалировэния леилн арахиса не взаимодействовал с 'мембранными гликопротеинами.

Таблица 3.

Молекулярная масса поли.;уптидов плазматических мембран зародышевых клеток вьюна.

(Относительная ! I относительная

Индекс зоны!молекулярнан ! Индекс зоны ! молекулярная ¡масса, кда ! ! масса, кДа

I 108 7.5 32

2 102 7.6 31

2.1 98 7,7 30

2.2 ■ 92 8 29

2.3 86 9 27

2.4 .7 10 26

'2.5 75 II 24,5

3 70 12 23,5

3.1 .2 13 22,5

3.2 57 14 21

4 53 15 20

5 50 16 . 19

6.1 46 17' 18

6.2-6.5 45-40 ' 18 16

7.1 39 ' 19 15

7.2 37 20 14

7.3 36 ;:o.i ■ 12,5

7.4 34 21 11,5

22 10

Весьма сложный спектр гликопротеинов выявлял конканавалин А (15 фракций), которые, однако, . ■ ■ проявлялись с небольшой интенсивностью. В спектре гликопротеинов выделялись зоны с мол. массой 150 кДа, 68 и ¿8 кДа. Близкие по специфичности конкана-валину А лектины чечевицы и гороха связывались примерно с половиной гликопротеинов, взаимодействующих с конканавалином А. Агглютинин зародышей пшеницы связывался только с тремя зонами с мол. массой 150, 70 и '¿0 кДа. Агглютинин сои,-а также фукозо-специфичные и избирательные к групповым антигенам крови лектины не взаимодействовали с гликопротеипзми зародышей вьюна. Из полученных данных следует, что преобладающим по количеству гли-копротеином плазматических мембран зародышевых клеток вьюна является гликопротеин о мол. массой 150 кДа, который содержит главным образом О-гликозильные цепи и только небольшое количество Я-гликанов. Гликопротеины с А/-гликозилышми цепями представлены в небольшом количестве, однако в качественном отношении их состав весьма слолсен.

Для дальнейшего исследовэшг наибольший интерес представляет гликопротеин с мол. массой 150 кДа. По массе он близок группе гликопротеинов, найденных в клетках зародышей мышей и кур (увоморулин, ь-САМ), которые имеют значение в осуществлении межклеточной адгезии И контакта ( Peyrierag et al., 1983; Gallin et al., 1983). Представляет интерес то, что эта-'гликопротеино-вая фракция отсутствует в плазматических мембранах дифференцированных клеток вьюна - в печени и эритроцитах. Выделение этого белка в чистом состоянии позволит определить его состав и свойства, а также разработать методы его количественного определения в тканях, что даст возможность изучить его функциональное значение^ процессе роста и дифференцировки клеток.

К. Лектины как реагенты на групповые антигены крови.

СО времени открытия БОЙДОМ И Регуэрой ( Boyd.Recuera, i9'+9) специфичного анти-А лектина было найдено довольно много растительных агглютининов, специфичных к групповым антигенам крови человека (см. Mkeiä, 1957; Потапов,1963; TobiSka, 1964). Наибольшее количество лектинов обнаружено к групповым антигенам Н(0) и А. Немногочисленные лектины анти-В находят главным образом в икре рыб (Колоколова, Потапов, 1976). Найдены также лектины, специфичные к-антигенам J},li,Leb. Данные о группоспецифичных лектинах можно найти в работах Потапова (1970), Brown, Hunt, (1978), Petrynink, (1979). Результаты собственных исследований

группоспецифичных пектинов, в той числе полученных впервые, представлены ниже.

Лектин анш-н из плодов бузины травянистой (батьисив еьи1из/ описан Ц.И.Потаповым. Нами получен в очищенной состоянии. Установлено, что в процессе счистки специфичность анти-Н снижается. Так, экстракт из плодов имеет следующие титры: анти-Н 1:128, анти-А 1:2, акти-В 1:2; после очистки на ДЭАЗ целлюлозе титры составляли; анти-Н 1:128, анти-А 1:8, анти-В 1:16, Ощищенный препарат обладал значительно более высоким титром, чем исходный экстракт, но для нег. ядности сравнения взято его разведение, близкое по активности экстракту.' Из простых Сахаров активность пектина угнетали галактоза, лактоза, Й-ацетилгалак-тозаиии (в концентрации 6,2->...25 мМ) в меньшей степени раффиноза и ь-арабиноза.

Принимая во внимание,'что для диагностики антигена Н достаточен очищенный, но высокоспецифичный препарат лектина, нами предложено проводить очистку и концентрирование лектина из плодов бузины травянистой осаждением белка из экстракта двумя объемами ацетона при комнатной температуре, при этом удаляется основная масса пигмента, мешающего четкой регистрации результатов гемагглютинации, избирательность к антигену Н остается достаточно высокой.

Лектин анти-А ¡.лимской фасоли. Полученный на ж препарат агглютинировал эритроциты различных групп в следующих титрах: анти-Н - О, анти-А 1:2048, внти-В 1:32; специфичность анти-А не абсолютная, но ,. лета точно высокая для практического использования. Препарат гетерогенен, количественно преобладает фракция о мол. массой125 кДа и в небольшом количестве полимерные формы с массой 250 и 500 кДа. Бри исследовании серологической специфичности изофори установлено, что агрегированные фориы лектина обладают оолее высокой специфичностью анти-А, чем фракция с мол, массой 125 кДа.

лектин анти-А из белочных желез виноградной улитки; Полученный нами препарат проявлял практически абсолютную специфичность анти-А, агглютинировал эритроциты только второй группы в титре 1:4096 и не реагировал с эритроцитами первой и третьей групп. По данным литературы, агглютинин улитки не выявляет редких разновидностей А-антигена со слабой активностью, поэтому при определении групповой принадлежности крови, предназначенной для ге-мотрансфузии, его используют в комплексе с другими анти-А реагентами.

Лектин анти-В из иксы вьюна. Данный лектин впервые выявлен и получен в чистом состоянии в не шей работе. Он обладает абсолютной специфичностью анти-З и агглютинирует только эритроциты третьей группы в титре 1:1024. По углеводной специфичности лектин четко дифференцирует сi и -аномеры галактозы; раффиноза в 125 раз более эффективный ингибитор, чем лэктоза. Именно этим обьясняется высокая селективность лектина к антигену В, в котором углеводной детерминэнтой является остаток «¿Р-галактозы.

Для, практических целей вполне достаточно использование очищенного препарата, который в концентрации 5 иг/мл четко агглютинируем только эритроциты группы В в титре 1:32.

Лектин анти-Н из горошка однопэрного ( vicia unijuça д.вг./ Агглютинин выявлен вперзые Винером, однако внимание на него как' на серологический реагент обратил 1.5.И.Потопов (1У76). В соавторстве с М.И.Потаповым нами впервые получен чистый лектин из листьев горошка однопарного и изучена его углеводная и серологическая специфичность. Препарат был гомогенным' при электрофорезе в аланин-ацетэтной системе рН 4,5 и мигрировал несколькими фракциями при электрофорезе в трис-глнщшовой системе рН 8,9. Лектин является гликопротеином и содержит 12 % углеводов. Установлено, что он обладает очень сильной агглютинирующей активностью - агглютинирует эритроциты группы ОЯ в титре 1:327680, что соответствует концентрации 30 нг/мл, Агглютинация ,эритроцитов o;j наблюдается при более высокой концентрации лектина I мкг/ мл, что соответствует титру 1:10240. Простые углеводы но блокировали активность агглютинина.

С целью повышения серологической специфичности антп-k нами изучено влияние некоторых веществ, добавляемых в среду, на специфичность агглютинации. Установлено, что при проведении реакции гемагглгатннэции в присутствии 1,5...2 U мочевины специфичность энти-Н лектина существенно повышается: титр анти-N составляет 1:256 при полном отсутствии агглютинации эритроцитов группы М. Подобный результат наблюдался в присутствии 0,05 И мальтозы, однако агглютинирующая активность лектина относительно исходного значения при этом снижалась намного сильнее, чем в 1,5 M мочевине.

Нэ основании проведенных исследований нами предложен препарат специфичного анти-М агглютинина, который монет применяться вместо сыворотки зити-Н. Для получения специфичного реагента анти-П готовят 2 ¡&-ный раствор лиофилизированного очищенного препарата "лектина горошка однопарного на физиологическом соле-

вой растворе, содержащей 12 % мочевины, и используют так же, как и сыворотку для определения антигена H эритроцитов. Реагент агглютинирует эритроциты только групп N и UN, В литературе описан препарат анТИ-N лектина ИЗ семян Vicia graminea ( Prigent et al., al,, 1976), однако данное сырье чрезвычайно труднодоступно, в то время как горошек однопэрний произрастает в нашей стране на территории Сибири и Дальнего Востока.

ВЫВОДЫ

1. Разработана система поиска и получения лектинов с заданной углеводной специфичностью. Она включает следующие этапы: а)обрледование растительного и \:ивотного материала на наличие лектинов; б) определение углеводной специфичности обнаруженных лектинов в экстрактах или концентратах; в) выбор сырьевого источника для получения лектина на основании количества его в материале и углеводной специфичности; г) разработка метода очистки лектина, исследование физико-химических свойств и подробная характеристика углрводной специфичности; д) определение области применения препарата, целесообразность его производства как реагента, обеспечение сырьевой базы.

2. Предложены новые аффинные сорбенты для очистки лектинов: сшитый глштзровым альдегидом гель из яичного белка (овогель),обладающий сродством к лектинам с различной специфичностью и наиболее высокой сорбционной емкостью к Н-ацетилглюкозаминоспецифич-ным препаратам, гели из галактоманнана пажитника и гуммиарабика, обладающие избирательнистью и высокой емкостью к галактозо- и И-ацетилгалактозами.юспецифичньш лектинам.

3. Получены препараты чистых лектинов из 21 источника и изучены их свойства. Впервые получены препараты из омелы, коры бобовника анагиролистного, горошка однопапного (специфичность анти-Н), икры вьюна (специфичность энти-В), бузины травянистой (анти-Н),

а также кристаллический лектин гороха.

4. Изучены методы получения производных лектинов и предложены усовершенствование способы получе.шя агглютининов, меченых флюоресцентными метками (ФИТЦ, родаминсульфонилфторид), перокси-дазой хоенз, ферритином, коллоидным золотом. В качестве реагента для для непрямого цитохимического выявления лектинов предложено использовать меченый тиреоглобулпн icootb. асиалотнреоглобулин). Установлено, что из апробированных методов маркирования наименьшее влияние на углеводную специфичность лектина оказывает флюо-

ресцентная метка, затем следует метка коллоидным золотом и конью-гирование с пероксидэзой. Для получения достоверных данных о специфичном связывании лектина с гликопротеином необходимо использовать несколько зго меченых производных.

5. Разработан метод выявления гликопротеинов на элоктрофоре-граммах и характеристики их углеводных цепей. Метод включает электрофорез исследуемого образца в ПАЛГ, электроперенос форе-граммы на листок нитроцеллюлозы, изучение связывания набора лек-тинов с отдельными фракциями. Обязательными составляющими набора является конкэнэвалин А, агглютинины чечевицы, клоцевины, фасоли, пшеницы и арахиса. По чувствительности метод намного превосходят способы выявления гликопротеинов с помощью красителей, в ряде случаев, он является единственным, позволяющим достоверно иденти фицировать гликопротеины.

6. На модели мембран эритроцитов человека установлено, что с помощью лектинов можно дифференцировать Я- и О-гликозильные цепи гликопротеинов. Я-гликозильные цепи выявляют по связыванию конканавалина А, агглютининов чечевицы, гороха, клещевины, фасоли. Для идентификации О-гликоэильных цепей гликопротеины, иммо-билизированные на. нитроцеллюлоэных репликах, десиэлируют мягким кислотным гидролизом и затем определяют связывание лектина арахиса. При параллельном исследовании эритроцитов кролика показаны видовые различия мембранных гликопротеинов крол;(кэ и человека.

7. Проведен анализ глпкопротеинового спектра плазматических мембран тромбоцитов человека и кролика, тимоцигов крысы, клеток зародышей вьюна на стадии гзструлы. В тромбоцитах человека наряду с известными фракциями гликопротеинов выявлены новые лектян-свяэывающие фракции с невысоким молекулярным весом. Исследование гликопротеинового спектра мембран клеток крови (эритроцитов и тромбоцитов) человека представляет интерес для клинико-лаборатор-ной диагностики, в особенности при врожденной патологии.

8. Впервые получены и охарактеризованы плазматические мембраны- клеток зародышей вьюна на стадии ранней гзструлы. При исследовании их гликопротеинового состава выявлена специифчная для зародышевых клеток.глшеопротеинозая фракция с мол. массой 150 кДа, которая предположительно может иметь значение в установлении межклеточных контактов в эмориогенезе вьюна.

9. Исходя из полученных в работе группоспецифлчпых лектинов (анти-Н бузины травянистой, анти-А из улитки и лпмской фасоли, анти-В из икры вьюна, анти-К из горошка однопарного) предложены

диагностические реагенты для определения групповых антигенов крови о высоко!! серологической специфичностью.

10. Предложена методика анализа мембранных глнкопротеинов клеток путем сочетания морфологических и биохимических подходов. С помощью максимально возможного набора лектинов морфологическим методом определяют характер углеводных детерминант на поверхнос-1 ти клетки, в также набор лектинов, проявляющих наибольшее сродство к мембранным гликопротеннаы. 3 дальнейшем с помощью биохимических ыетодов определяют спектр глнкопротеинов, с которыми взаимодействует каждый лектин, идент.фицируют углеводные детерминанты отдельных гликопротеиновых фракций, после чего следует получить гликопротешш в чистом состоянии и исследовать их функциональное значение.

ОСНОВНОЕ СОДШАНИь ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ АВТОРА:

1. Способ получения (¿ьиопрецишшшэ// Авт.свид.'й 395 005. -Бюлл.изобретений, -1973. -¡¡235. -С. 14 (в соавт.с Литвином И.Ц.)

2. Количественное определение аминокислот в белковых гидро-лизатах методом тонкослойной хроматографии// Химия природных соединений. -1974. -1,22. -С.197-200 (в соавт. с Литвином И.И., Монастырский В.А., Алексевичем Я.И.).

3. Получение и свойства кристаллического антитиреоидного фи-топреципитина из семян гороха// Биохимия. -1974. -Т.39. -¡¡;4. -C.3II-8I5.

4. Получение и свойства растительных белков с ыитоганныш и агглютинирующими способностями// И Всесоюзный биохимический съезд, рефераты научных сообщений. -Рига, 1974. 412. -С,303. (в соавт,

с Литвином И.П., Монастырским В.А.,Кириченко К.З.,Кипиани Э.К., Луциком А.Д.).

5. Сравнительное исследование фитогемагглютининов,полученных из растений различных семейств// ХП международный ботанический конгресс, -Л.¡Наука. -197b, -T.I.-C.27 (в соавт. с Луциком А.Д., Кириченко Н.В., Кипиэни Э.К.).

6. Получение фитогемагглютининов о помощью специфической преципитации тиреоглобулином// Лабор. дело. -1975. -¡¡211. -С,660-661,

7. Применение фигогемэгглютининов в онкологии// Вопр.онкологии. -1975. -Т.21. -¡¡210. -C.I03-III.

8. Противоопухолевые саоПстм ^итогбиагглптининз из омелы// ДАН УССР. -Сер. Б. -1975. -Мб. -Ц.543-545.

9. Preliminary X-ray studies of crystals of mitogenic lectin from pea seeds// Симпозиум СССР-ФРГ по химии пептидов л бэл-

ков. -Душанбе,1976. Тезисы докл. -М.:Наука. -1976. -С.Ю2(в созвт. с Еэбулевич Н.Е., Бркзгуновым В.Л., Кокодьшяком И.П., '.'с ли к- Аде мп-ном В.Р., Мокульской Т.Д., Мокульским М.А.).

10. Изучение гетерогенности кристаллического онтитирсоидного фитопреципитинз // Биохимия. -1976. -Т.41. -),°9. -C.I576-I583 (в соэвт. с Кириченко Н.В., Крищишин II.В., Кокодыняком И.П.).

11. Preliminary X-ray studies of crystals of mitogenic lectin from pea seeds//J.Nol.Biol. -1976. -V.IOI. -N 3. .P."-35-437.

(в cojBT. с Брызгуновкм В.А,, Мелик-Адамяном В.P., Мокульским М.А.).

12. Способ получения фитогемагглютинина // Авт.свид.1й571 276. -Билл, изобрет. -1977. -ИЗ3. -С. 19 (в соавт. с НиедроИ И.Кг., Малеем С.М.). *

13. Фитогемэгглютинин'апти- из листьев горошка одноларного// Пробл. гематол. -1977. -№6. -С.48-52.(в соавт. с Потаповым М.И., Кириченко Н.В.).

14. Гетерогенн1сть кристал! того лектину гороху та б1олог1чна активн1сть окремих фракц1й // И Украинский биохимический сьезд, тезисы докладов. -Донецк,1977. -КиевгНаукова'думка. -1977. -С.203. (в созвт. с Литвином И.И., Крищииин Н.В., Кокодыняком И.П.).

15. Саморегистрирующий денситометр для дисковых электрофоро-грамм // Лебор. дело. -1977. -№3. -С.506-507 (в'соавт, с Кокодыняком И.П., Крищишин Н.В., Кириченко Н.В.).

16. The toxocity and antitumor activity of three individual fractions of lectins fi'om Ricinus communis seeds// Neoplamna. -1977. -N 3.-.P. 341-343 (в соавт. с Луцнком А.Д., Кипиани Э.К.,

Крупко Л.Е.).

17. Оценка реакции блэсттрэнсфсрмации лимфоцитов с помощью флюоресцентной микроскопии // Лабор, деле. -1978. -№2. -С.116 (в созвт. с Крищишин Н.В.),

18. Экспериментальное исследование посмертных изменений тканевых структур с применением лектинов клещевины обыкновенной// Суд. мед. экспертиза. -1979. -№'+. -С.31-33 (в соавт. с Зеленгуро-вым В.1.1., Луцнком Л.Д., Петровской Н.Ю.).

19. Ъиооноопецифичти препарат лектина энти-Н из листьев горошка однопарного// Лабор. дело. -1980. -¿5. -С.312-313 (в совт. с Потаповым U.U., Кириченко Н.В.).

20. Лектины// -Львов:Еица школа. -1981. -156 с. (в соавт, с Луциком А.Д., Цанасда.ои E.H.).

21. АктивацХя п1ифоцкх1в I утворення л1ищок1н1в п1д впливоа неспецнф1чних стимулятор1в - лект!ш1в//1У Украинский биохимический сьезд, тезисы докладов. Днепропетровск,1982. -Киев:Наукова дуыкэ. -I982.-4.I. -С.87-88.

22. Пор1вняльнэ оц1нка метод1в с 'ержання мембран 1з еритроци-т1в// Там se. -1982. -4.2. -С.80-81 (в соавт. с Лукьяненко A.B.).

23. Одерканнн гл1копроте1н1в з плазиатичних мембран печ1нки щур1в з допомогою 1ыоб1л1зоваьих лектин1в// Там не. -4.2. -С.82. (в соавт. с Кусенем С.И., Лукьяненко A.B., Кориневской A.B.).

24. Новый фукозоспецифичный лектин из коры бобовника золотой дождь: очистка, свойства, иымунохимическая специфичность// Биохимия. -1982.-Т.47. -жЮ. -C.I7I0-I7I5 (а соавт. с Антонюком В.А.).

25. Способ получения фукозоспецифичного лектина// Авт. свнд. te 967 484,-Бюлл. изобрет. -1982. -N>39. -С. 36-37 (в соавт. о Антонюком В.А.).

26. Сезонные изменения титра гемагглатинации и сродства к углеводам экстрактов растений, содержащих фукозоспецифичные лектины// Физиология растений. 1982. -Т.29. -Кгб. -C.I2I9-I224 )в соавт. с Антонюком В.А., Ладной Л.Я.).

27. Фитолектины во флоре УССР к специфичность связывания ими углеводов// Растит. ; сурсы. -1983. -'¿2. -C.I5I-I59 (в соавт. с Антонюком В.А., Ладной Л.Я.).

28. Методы исследования углеводной специфичности лектинов// Методические рекоыоидации МЗ УССР. -Львов. -1983. -22 с (в соавт. с Панасюком E.H., Антонюком В.А., Луциком А.Д.,Ладной Л.Я.).

29. Очистка лектина сои и его (¿лиоресцирующих и ферритиновых производных с помощью аффннной хроНатогрэфиа на геле галактомэн-нала// Приклад, биохимия и микробиол. -1983. -К4. -С.454459.

30. Электронно-микроскопический ачализ рецепторно-цитоскелет-ного комплекса эндотелнальных клеток// Всесоюзная научная конференция "Актуальные вопросы нарушения гемодинамики и регуляции микро-циркуллции в клшшке а эксперименте", тезисы докладов. -11. -1984. -С.91-92 (в соавт. с Мироновым A.A., Мироновым В.А.).

31. Новый еффишшй сорбент для очистки лектинов и его примснс;;; для очистки агглютинина из зародышей пшениц^// Укр. биохим.курн. -1984. -tt. -С.383-387.

32. Лектины как селективные гистохимические реагенты для выявления гликопротеиновых рецепторов клеточных мемб ран/республиканская конференция патологоанатомов Лит ССР, тезисы докладов, -Каунас,1984. -С.62-63 (в созвт. с Луцмком А.Д., Бировьш В.В.).

.33. Электронная микроскопия клеточной поверхности эндотелио-цитов// XXXIX Всесоюзная научная сессия, посвященная Дню радио, тезисы докл. -М.:Родпо и связь, 1984. -4.1. -С.103 ( в соавт. с Мироновым A.A., Мироновым В.А.).

34. Прибор для лиофнльного высушивания/Депонированная рукопись, MPI. -1984. -Разд.22. -Публ.1697 (в соавт. с Кокодыняком И.П..)

35. Лектиновые рецепторы в сосудистом эндотелии// В кн.: Адаптивные и компенсаторные механизмы микроциркуляции. -М.:Изд.П МОЛЧИ. -1984. -С.25-29 (в созвт. с Карагановым Л.Л., Мироновым З.А., Мироновым A.A.). .

36'. Seme approaches to screening and preparation of new blood group specific lectins// Interlec 6, abstracts of the international meeting on lectins. -Fornan, 19^'t. -P. 115.

37. Препараты лектиноз для диагностики групповых антигенов крови// П Всесоюзный съезд гематологов, тезисн докл. -Львов,1985. -С.308-309 (в созвт. с Луцкком А.Д.).

38. Лектины как биороагенты в иммунологических исследованиях// Республиканская конференция "Механизмы иммуностимуляции", тезисы докл. -Киев:Паукова думка, 1985. -С.135-136.

39. Сравнительная оценка гуморальных препаратов тимуса, способных индуцировать пролиферативный ответ кортикальных тимоцитов

на действие митогенов// Там же. -С.166-167 (в созвт. с Михной М.Г., Полушкиной Е.Б.,Ярилиным А.А.,Арионом В.А.).

40. Применение иимуноферментного анализа для количественного определения рецепторов к лектину арахиса на поверхности тимоцитов// П Всесоюзное совещание "Культивирование клеток животных и человека, тезисы докл. -Пущано, 1985. -С.Ю0(в соаат. с Михной М.Г., Степановой E.H., Лиознером А.Л., Ярилиным A.A.).

41. Метод высукилэния электрофорегрэмм в пластинах полиакрил-амидного геля// Лабор. дело. -1986. -ß II. -С.53-54 (в соавт. с Дробот Л.Б.).

42. Применение лектшгов для изучения структуры и функции гликопротеинов// У Всесоюзный биохимический сьсзд, тезисы докладов. -Киев, 1986. -;,!.:Наука, 1985. -T.I. -C.270-27I.

43. Изучение поверхности Т- и В- лимфоцитов с помощью лекти-нов//Там see. -Т.З. -С.35 ( в соавт. с Хомутовским O.A., Передерни О.Ф., Юрченко О.В., Ветровой А.П.).

44. Очистка и частичная хаоактеристика плазматических мембран клеток зародышей вьюна// Онтогенез. -1986. -Т.17. -fö 3. -С.323-329 ( в соавт. с Кусенеы С.И., Лукъяненко A.B.).

45. Меченые лектины в изучении клеточной поверхности// Архив анатомии, -1986. -Т.90. -123. -С.83-94 (соавторы Караганов ЯД.,, Миронов В.А., Миронов A.A.).

46.Лектины: биологические свойства и применение в иммунологии// Биохимия животных и человека. -1985. -Вып.9. -С.69-76,

4?. Вплив фази вегетацП рослин на активн1сть лектин1в, спе-циф1чних до вуглеводГв групп галакт^зн// Укр. ботан. журнал. -1906. -Т.43. -Й4. -С.21-25 ( в соавт. с Антонюком В.А.).

48. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран// Киев:Наукова думка, 1936. -167 с. (в соавт. с Хомутовский O.A., Передерни О.Ф.).

49 . Исследование электрофоретических спектров гликопротеи-коз плазматических мембран зародышевых и печеночных клеток вьюна// Онтогенез. -1986. -Т.17. -Ь5. -С.470-480 ( в соавт. с Дробот Л.Б., Кусенеы С.И., Калынюком П.П.).-

50. 0 локализации рецепторов лектинов на поверхности клеток нейроблзстоыы С 1300// Эксперимент, онкология. -1986. -Т.8. -Й4. -С.31-45 (в соавт. с Хомутовский O.A., Передерий О.Ф., Погорелой Н.Х., Чубченко С.Л., Юрченко О.В.).

51. Исследование рецепторов на поверхности клеток лимфошшх линий с помощью лектинов// Эксперимент, онкология. -1986. -Т.8. ->*5. -C.25-2ö ( в сс-звт. с Хокутсаокиь; O.A., Передерий О.Ф., Ветровой Fi.it.« JOjHew.j 0.«,. нинчукоы и.Г.),

52. Рецепторы лектинов в слюнных железах крыс в процессе поотнэтального раэвития//Архнв анатомии. -1986. -Т.91. -(¿8. -С.27-35 (в соавт. с Луцшсом А.Д;, Ящэнко М.А.,Детюк Е.С.).

53. Лектины// Химическая энциклопедия. -М.гСоветская энциклопедия, 1987,-Т.2. -С.

5^-. Исследование мембранных гликопротеинов эритроцитов человека с применением лектинов// Укр. биохим, журнал. -1987. -Т.59. -К? 6. -С.3-9 (в соавт. с Кусенем С.И.).

55. Гликопротеины клеточной оболочки чумного микроба//8 Все- • союзная конференция "Химия и биохимия углеводов", тезисы докладов. -Тбилиси,1987, -С.132 (в соавт, с Щербаковым A.A., Конновыи Н.П., Анисимовьш П.И.).

56. Комплексное титрование активности препаратов тимуса ин витро// Иммунология. -1986. -Ы. -С.23-26 (в соавт. с Ярилиным A.A., Мирошниченко И.В., Михной М.Г., Полушкиной Е.Б.).

Информация о работе

Луцик, Максим Дмитриевич
доктора биологических наук
Киев, 1989
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Лектины, их получение и применение в исследовании гликопротеинов клеточных мембран ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Лектины, их получение и применение в исследовании гликопротеинов клеточных мембран"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лектины, их получение и применение в исследовании гликопротеинов клеточных мембран
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия