Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая активность лектинов бактерий рода Azospirillum

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность лектинов бактерий рода Azospirillum"

На правах рукописи

ПОНОМАРЕВА Елена Геннадьевна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕКТИНОВ БАКТЕРИЙ РОДА Агоэрти-шм

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1997

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растении и микроорганизмов Российской Академии Наук (ИБФРМ РАН г. Саратов).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук , старший научный сотрудник

В.Е.Никшпшш

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик МААН

Гладилин Г.П..

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Щербаков А'. А.

Ведущая организация: Саратовский государственный университет

им. Н.Г.Чернышевского

Защита состоится " 22 " октября 1997 г. в 10ч. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан 15 сентября 1997 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

профессор Г.А.Корнеев,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Леклииы относятся к широко распространенным в природе углсводсвязывающнм белкам неиммуноглобулиновой природы, обладающие общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры.

Лектпны, локализованные на клеточных поверхностях, обнаружены в организмах, стоящих на самых разных уровнях эволюционного развития - от вирусов и микроорганизмов до млекопитающих и человека.

В последние годы значительно возрос научный интерес к лектинам и агглютининам бактерий. Одной из главных причин повышенного внимания являются данные о ведущей роли бактериальных лектинов во взаимодействии патоген-хозяин. Показано, по эти белки, включая экзотоксины, принимают участие в специфической адгезии Зактерлй к животным клеткам, которая предшествует развитию инфекционного процесса (Алс1ег55оп В. е1 а1., 1981. Ногшагк 8.,е1 а1., 1989.)

Важное значение имеют исследования, связанные с поиском, выделением и применением лектинов. Однако, на дальнейшем развитии этих исследований может отрица-[елыю сказаться отставание в исследовании роли лектинов, оценке их биологической

1КТИВНОСТИ.

Для разработки научно-обоснованного подхода направленного выбора лектинов 1ри их практическом применении необходимо выявление как общих закономерностей механизма углевод-белкового взаимодействия и его информационных возможностей, гак и особенностей, характерных для конкретных биологических систем ассоциативных).

Очень актуально при изучении взаимоотношений микро- и макроорганизмов уста-юпление сопряженности лектин-углеводных взаимосвязей с системой иммунитета жи-ютных и растении. Поэтому, хотя все тенденции развития современной лектинологии гажнм, необходимо уделить особое внимание пониманию роли лектина при межклеточных и межмолекулярных взаимодействиях. Не менее важно изучение биологиче-:кой активности лектинов бактерий и для понимания их роли в самой бактериальной слетке, и одновременно во взаимодействии с микро- и макроорганизмами.

Бактерии являются богатым источником получения широкого спектра лектинов и гоэтому они представляют несомненный интерес. В свете дальнейших перспектив в ^пользовании лектинов как биологически активных веществ в медицине (вакцины, шмуномодуляторы), экспериментальной биологии (тонкие аналитические реагенты |ри выделении и очистке гликоконыогатов, исследовании углеводных рецепторов па юпсрхности живых объектов), сельском хозяйстве (симбиоз, защита растений), изу-1сние их биологической активности становится особенно важным и актуальным. Од-юврсменно, с обнаружением бактериальных лектинов, появляется реальная возмож-юсп. получения высокоактивного препарата лектина с редкой углеводной спецнфич-юсп.ю в достаточном количестве, в любое время и по доступной цене.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена обнаружению и ис-;ледованшо биологической активности лектинов бактерий рода АгозртИит: взаимо-(ейегшно с компонентами корней пшеницы, бактерицидной и фунгицидной активно-:гям, митогенной и противоопухолевой активностям, взаимодействию с компонента-.ш плазмы крови; а также получению высокоактивного препарата фукозоснецифич-гого лектина. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1 .Охарактеризовать взаимодействие лектина азоспнрилл с корнями пшеницы

2.Оценить нитрогеназную активность азоспирилл в присутствии активного фуко-

зоспецифичного лектнна на поверхности клеток

3.Выяснить, обладает ли фукозоспецифичный лектин бактерицидной и фуппщнд-ной активностью

4.Выявить митогенную и противоопухолевую активность фукозоспецнфичногс лектнна азоспирнлл.

5.Изучить возможность использования лектинов для исследования плазмы крови человека.

6.Подобрать оптимальные условия выращивания азоспирнлл для получения высокоактивного препарата лектнна.

Научная новизна. Впервые было показано, что лектин азоспирнлл с редкой фу-козной специфичностью способен оказывать как стимулирующее, так и ингибирую-щее действие на прорастание зерновок пшеницы.

Установлено, что отсутствие активного лектина на поверхности клеток уменьшает нитрогеназную активность азоспирнлл.

Впервые показано, что фукозоспецифичный лектин обладает бактерицидными свойствами по отношению к некоторым патогенным бактериям.

Впервые на примере бластогенной трансформации лимфоцитов человеческой крови, показано, что фукозоспецифичный лектин азоспирнлл обладает митогенной активностью.

Впервые установлено, что фукозоспецифичный лектин азоспирнлл способен проявлять противоопухолевую активность на уровне целого организма.

Предпринята попытка использования лектинов азоспирнлл в исследовании плазмы крови человека.

Практическая значимость. Изучение биологической активности бактериальных лектинов дает возможность оценить их роль во взаимодействии с микро- и макроор-ганизмамн, способствует широкому их применению в различных областях экспериментальной биологии (в гистохимии - исследование углеводных рецепторов; микробиологии - изучение процессов вирусной и микробной инфекции; биофизике - изучение структурных поверхностей) и медицине. Обнаружение у фукозоспецифичного лектина азоспирнлл таких биологических активностей как митогенная, противоопухолевая, бактерицидная, а также специфическое взаимодействие его с компонентами плазмы крови и мембранами эритроцитов при некоторых заболеваниях человека, делают весьма перспективным применение данного лектнна в качестве диагностического и лечебного препарата.

Кроме того появляется реальная возможность получения высокоактивного комер-ческого препарата лектина из бактерий с редкой углеводной специфичностью в достаточном количестве, в любое время и по доступной цене.

Материалы диссертационной работы нашли применение па кафедре биохимии, биофизике СГУ при проведении занятий со студентами. Использовались для учебных исследований на кафедре клинической лабораторной диагностики СГМУ. Применение и использование материалов диссертации подтверждается соответсвующимн актами.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1.Взаимодействие лектинов азоспнрилл с компонентами корней пшеницы

2.Влияние присутствия активного фукозоспецифичного лектина на нитрогеназную активность азоспирнлл.

3.Определение митогенной и противоопухолевой активности фукозоспецифичного лектина.

4.Использованне лектинов азоспирилл в исследованиях плазмы крови человека.

5.Подбор оптимальных условий выращивания азоспирилл для получения высоко активного препарата фукозоспецифичного лектина.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой "Физиолого-биохнмическая роль белков-агглютининов клеточной поверхности бактерии" (№ гос. регистрации 01910022283, научный руководитель Н.Е.Никитина).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлялись на 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага,1988), II Международном семинаре-симпозиуме по сверхпродукиии микробных метаболитов (ЧССР,1988), I республиканской конференции, посвященной 100-летию открытия первого лектина (Тарту, Таллин, 1988), Международной лектнновой конференции "Interlec-П" (Тарту ,1989), VIII Восточно-европейском симпозиуме по биологической фиксации азота "Nitrogenfix-92" (Саратов 1992), Международном Рабочем совещании по ассоциативному взаимодействию азотфикснрующих бактерий с растениями (Саратов, 1995) и на отчетных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура II объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 105 сграницах, иллюстрирована 13 рисунками и содержит 5 таблиц. Список использованных литературных источников включает 128 наименований, в том числе 77 зарубежных.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор представлен в первой главе, где дано общее понятие о лек-тинах бактерий. Рассмотрены физиологические свойства лектинов бактерий. Обсуждена биологическая активность известных бактериальных лектинов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штаммы: Azospirillum brasilense Sp7, полученный от. Т.А.Калининской из института микробиологии РАН (г. Москва), обладающий специфичностью к L-фукозе, Azospirillum lipoferum 59b полученный из ВКМ (В-1519), специфичный к L-арабинозе и глюкуроновой кислоте; Azospirillum brasilense 75 и Azospirillum lipoferum 43 специфичные к L-арабинозе, L- рамнозе и к бариевой соли глюкозо-6-монофосфорной кислоты соответственно, выделенные из под пшеницы Саратовская 29 и идентифицированные сотрудниками ИБФРМ РАН; а также Azospirillum brasilense Sp7.2.3. полученный транспозонным мутагенезом из типового штамма A.brasilense Sp7.

Микроорганизмы выращивали на жидких средах: на оптимизированной среде для A.brasilense Sp7 (Dobereiner J., Day J.M.,1976), на среде, предложенной Sabasivan L. и Neyra (1985) для выращивания A.brasilense и A.lipoferum. Выращивание проводили в течение 18 часов при 37°С. Клетки центрифугированием отделяли от культуральной жндкосгн и использовали для выделения лектинов. Выделение препаратов проводили методом Эшдата (Hshdat G.et al, 1988).

Для обнаружения лсктиновой активности использовали реакцию агглютинации с нативнымн эритроцитами человека и трипсинпзированными эритроцигамн кролика по методу Луцика М.Д. (1980).

Очистку лектинов проводили гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75 (30x2,2 см). В качестве элюентов использовали 0,1М СНзСООН (рН4,8), буферно-солевой раствор (рН-7,1). Выход белковых фракций регистрировали на приборе Uvicord SII(LKB) при 278 нм.

Антитела к лектинам получали введением кроликам подкожно очищенного лскти-на в концентрации 80 мкг/мл с 1 мл адъюванта Фрейнда в 3 приема с интервалом в 2 недели. Выделение IgG проводили методом, описанным Егоровым A.M. с соавг.(1991).

Метод иммунодота проводили на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах (0 пор1,5 мкм) (БгоровА.М. с соавг.,1991) с использованием коллоидного золота диаметром 10-30 нм, стабилизированного протеином А.

Белок определяли но методу Бредфорд (1976).

Пшеничные зерна проращивали в растворах лектина в течение 3-х дней. Средняя длина корней сравнивалась с длиной корней, выращенных в физиологическом растворе. Экспериментальные данные статистически обрабатывали (ОйвинИ.А., I960).

Фракция экзокомпонентов корней проростков пшеницы представляла собой мягкий фосфатно-солсвой смыв. Мембранную фракцию получали при растирании корней, с удалением неспецифнчных водорастворимых белков. Осадок экстрагировали тритоном Х-100. Тритон удаляли методом гель-центрифугирования (Horicomc Т. et al., 1984).

Нитрогеназную активность оценивали по восстановлению ацетилена на газовом хроматографе ЛХН-80МД (Hardy R.W. et al, 1976).

Бактерицидные свойства изучали методом газонного посева тест культуры. На поверхности вырезали лунки и заполняли растворами лектина. О наличии бактерицидных свойств судили по образованию стерильных зон вокруг лунок. Фунгицндные свойства изучали аналогичным методом.

Противоопухолевый эффект изучали на нелинейных крысах с опухолью РМК-1. Для оценки роста опухолей применяли метод эквивалентных экспонент по Н.М.Эмануэлю (1979).

При изучении митогенной активности использовали лимфоциты периферической крови человека 0(1) группы. Лимфоциты выделяли в градиенте плотности фиколла (Хейфец Л.Б., 1973). К 2 мл суспензии добавляли 0,2мл раствора лектина (500 мкг/мл). Инкубацию проводили при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг в течение 90 часов. Морфологический учет результатов проводили на мазках, фиксированных меганолом и окрашенных по Романовскому-Гнмзе.

Изучая взаимодействие бактериального лектина с компонентами плазмы крови использовали свежую донорскую кровь различной групповой принадлежности. Плазму отделяли центрифугированием при 3000g в течение 10 минут.

При подборе оптимальных условий выращивания были использованы мегоды математического планирования эксперимента.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Роль лектинов во взаимодействии с растениями Влияние лектина А.ЬгахИепве Бр7 на скорость прорастания зерновок пшеницы.

На поверхности клеток азоспирилл обнаружены лектнны, которые представляют интерес с точки зрения понимания их возможной роли в процессах образования эффективных ассоциативных систем бактерий с высшими растениями.

Взаимодействие между растительными и бактериальными клетками представляет собой сложный процесс, затрагивающий целый ряд поверхностных молекулярных структур не только растений, но и бактерий. В работах ряда авторов (Никитина с со-ав1,1996, А1епкта е! а!, 1992) было показано участие лектинов азоспирилл в адгезии к корням пшеницы и, в конечном счете, в формировании азотфикенрующей ассоциации.

Однако взаимодействие бактериального лектина азоспирилл непосредственно с растением не ограничивается, по-видимому, только его ролью в адгезии. Возможно, что лектин бактерий, взаимодействуя с растительной клеткой определенным образом влияет на ее рост и развитие, поскольку, в основе активности лектинов лежит феномен обратимого взаимодействия их с углеводами, который определяет несколько типов биологических реакций.

Исследования, проведенные с фукозоспецифичным пектином обнаружили его активирующее и ингибирующее влияние в отношении растительной клетки. Дальнейшие эксперименты позволили определить концентрацию белка, при которой наблюдалось активирование и ингибирование эффекта в отношении растительной клетки. Изучали влияние концентраций фукозоспецифичного лектина на скорость прорастания зерновок пшеницы Саратовская 29. Зерновки проращивали в растворе лектина с концентрацией 500, 50, 10, 1 мкг/мл в течение 4-х суток. Средняя длина корней полученных проростков сравнивалась с длиной корней контрольных проростков, выращенных в физиологическом растворе. Установлено, что раствор лектина с концентрацией белка 500 мкг/мл полностью подавляет способность семян пшеницы к прорастанию. При снижении концентрации лектина в 50 раз наблюдается стимуляция прорастания зерновок. С дальнейшим снижением концентрации стимулирующий эффект лектина ослаблялся и при разведении исходного раствора в 500 (1 мкг/мл) раз корни полученных проростков по длине практически не отличались от контроля (табл. 1).

Таблица 1

Влияние различных концентраций лектина А.ЬгазПете Бр7 на длину корней проростков пшеницы

концентрация лектина, мкг/мл длина корней проростков пшеницы, мм Уровень значимости (Р)

500 11.0.

5(1 28,80 ± 0,25 < 0,001

10 44,00 ± 0,05 < 0,001

1 19,60 ±0,09 < 0,050

контроль 17,00 ±0,10 -

Примечание: и.о. - корни не образуются

Полученные результаты показали, что фукозоспецифичный лектин оказывал стимулирующее действие на прорастание зерновок и па увеличение длины корней проростков в концентрации 10 мкг/мл, концентрация же лектина 500 мкг/мл подавляла способность зерновок пшеницы к прорастанию.

В литературе мы не встретили исследований, объясняющих данный феномен.

Можно предположить, что лектин выполняет роль сигнальной молекулы при взаимодействии бактериального лсктина с корнями проростков и его действие аналогично действию ИУК (индолил уксусная кислота).

Взаимодействие лекгинов азоспнрилл с фракциями корней пшеницы

Полученные нами данные показали, что фукозоснецифнчный лектин проявляет стимулирующую или ингнбирующую активность к прорастанию зерновок пшеницы, влияет на длину корней проростков. Однако неизвестно каким образом Происходит взаимодействие, с какими компонентами корней пшеницы взаимодействуют лектины азоспнрилл.

Проведенные исследования методом иммунодота на нитроцеллюлозе с коллоидным золотом показали, что лектины типовых штаммов азоспнрилл (А.ЬгазИепхе Бр7 и А.Иро/егит 59Ь) связывают компоненты корней проростков пшеницы слабо, особенно А.Про/егит 59Ь. Лектины же штаммов А.ЬгазИепье 75 и А.Иро/егит 43, выделенные из-под пшеницы Саратовская 29 взаимодействуют с этими компонентами гораздо более интенсивно. Однако нами были замечены различия в характере связывания корневых фракций лектинами. Так, лектин А.ЬгаяНепзе 75 проявлял более выраженную реакцию с экзокомпонентамн корней и реакция ингибировалась при добавлении специфических Сахаров. Напротив лектин А.Иро/егит 43 связывался с мембранной фракцией и это связывание частично ннгибировалось углеводными гаптенами, в тоже время, взаимодействие этого лектина с экзокомпонентамн корней проявлялось слабее и не ннгибировалось сахарами, что указывает на неспецифический характер связывания.

Для получения более полной картины взаимодействия лектина азоспнрилл с компонентами корней проростков пшеницы были проведены эксперименты, показывающие наличие взаимодействия между бактериальным лектином и лектином корней пшеницы. Указанное взаимодействие ннгибировалось углеводным гаптеном (N1-ацетил-О-глюкозамином) лектина корней пшеницы. Видимо, взаимодействие происходит за счет Ы-ацетилглюкозамина, присутствующего в углеводной части бактериального лектина.

Полученные в нашем исследовании данные свидетельствуют как о специфическом, так и о неспецифическом связывании лектина с компонентами корней проростков пшеницы. Селективность в связывании тех или иных компонентов, возможно отражает функциональные особенности лектннов разных штаммов.

Таким образом, можно говорить о том, что взаимодействие лектинов азоспнрилл с компонентами корней проростков пшеницы является начальным этапом в проявлении его биологической активности в отношении макроорганизмов.

2. Изучение нитрогеназной активности бактерий А.ЬгазИепзе Бр7 в зависимости от присутствия активного лектина.

Являясь почвенными азотфиксирующими бактериями, клетки азоспнрилл фиксируют атмосферный азот, трансформируя его в форму наиболее благоприятную для утилизации растениями. Ряд работ четко свидетельствует о способности азотфикси-рующих бактерий передавать фиксированный азот растениям. В тоже время, как известно, бактерии рода АгозрМИит способны к образованию ассоциаций с корнями злаковых растений, в которых немаловажную роль играет бактериальный лектин. Известно, что, например, лектин пшеницы индуцировал ннтрогеназную активность некоторых азоспнрилл. Поэтому, существует вероятность, что и лектины бактерий способны оказать влияние на ннтрогеназную активность клеток азоспнрилл.

Для выяснения этого предположения была изучена нитрогеназная активность у Л.ЬгтИете Бр7 и его мутанта по гемагглютинирующей активности А.ЬгаяНен.че Йр7.2.3., полученного методом транспозонного мутагенеза.

При изучении нитрогеназной активности как родительского штамма, так и мутант ного, установлено, что оба штамма обладают способностью фиксировать азот. Однако, нигрогеназная активность у мутантного штамма меньше, чем у родительского (табл.2).

Таблица 2

Нитрогеназная активность А.ЬгавИеме Бр 7 и его мутанта дефектного по гемагглютинирующей активности А.ЬгазИете 8р 7.2.3. (нМ этилена на I мкг сухого вещества клетки)

Штамм M ±m P

A.brasilense Sp7 207,0+19,0 -

A.brasilense Sp 7.2.3. 153,0+ 7,7 <0,05

Таким образом, проведенные исследования показали, что отсутствие активного лектина на поверхности клеток сказывается и на нитрогеназной активности азоспи-рилл.

3. Бактерицидная и фунгицидная активности фукозоснецифичного лектина азоспирклл

Установление взаимоотношений между клетками азоспирилл и растением начинается с их дистанционных взаимодействий. В процессе своего развития растение выде-ляег различные вещества: простые сахара и аминокислоты, являющиеся хорошей питательной средой для почвенных микроорганизмов. Однако благоприятные условия привлекают не только азоспирилл, но и другие микроорганизмы, в том числе н патогенные для растения. Поскольку известно, что па поверхности азоспирилл находится пектин, который обладает биологической активностью, можно предположить, что его присутствие в почве оказывает влияние на жизнеспособность почвенной микрофлоры, оказавшейся вблизи корневых проростков.

При изучении бактерицидных свойств лектина, выделенного с поверхности штамма A.brasilense Sp7, было обнаружено, что лектин азоспирилл не угнетает рост таких бактерий, как Agrobacterium radiobacter, Xantomonas campestris, E.coli. Однако, он ока-зываст бактерицидное действие на рост Staphylococcus aureus в концентрации 50 мкг/мл и на рост Erwinia carotovora в концентрации 500 и 1000 мкг/мл. При исследовании фунгицидных свойств оказалось, что лектин азоспирилл не оказывает какого-либо влияния на грибы штаммов Drechslera teres UK u Drechslera teres vera, Aspergillus niger.

Информации о возможном механизме бактерицидного действия бактериальных пектинов в используемых нами литературных источниках мы не обнаружили. Однако, исследования Мирельмана и его коллег (1975) по ингибированию роста грибов под влиянием лектина пшеницы показали, что лектин связывался с верхушкой гифы, инги-бировал синтез хитина и тормозил рост гифы. Эти данные позволили сделать предположение, что связавшись с чужой бактериальной клеткой, фукозоспецифичный лектин ингибирует определенные ферментативные процессы, необходимые для жизнедеятельности клетки и прекращает ее рост.

4.Мптогаи1ая активность фукозоспецифнчного лектина азоспирилл.

Все более широкое использование лектинов в качестве реагентов и средств исследования в экспериментальной биологии и медицине требует дальнейшего изучения биологической активности бактериальных лектинов. В настоящее время из лектинов микроорганизмов обнаружены митогенные свойства лишь у лектинов вируса гриппа и лектинастафилококка.

Биологическая активность лектинов обусловлена их взаимодействием с различными рецепторами мембран клеток мишеней, модификацией тонкой структуры и функцией самих мембран, что в свою очередь, вызывает целый каскад изменении в метаболизме клеток. Одним из наиболее ярких, наглядных биологических эффектов, основанных на влиянии лектинов на клеточные мембраны, является рост и пролиферация лимфоцитов (Nowell et al, 1960, Djwning et al, 1968, Greaves et al, 1973).

При изучении митогенной активности фукозоспецифнчного лектина наиболее характерные изменения морфологии лимфоцитов наблюдались после 80 часов контакта с лектином.

Более трети всех живых клеток трансформировались в типичные бласты - крупные клетки (16-130 мкм) с большим центрально расположенным ядром с дисперсным хроматином, с резко базофильной цитоплазмой, в которой иногда видны вакуоли. В некоторых из этих клеток отчетливо видны фигуры митоза.

Около четверти всех клеток находились в "переходной форме" - так называемые большие лимфоциты с признаками трансформации в бласты, с увеличенным по сравнению с малыми лимфоцитами ядром. 40% клеток представляли собой малые лимфоциты - небольшие клетки с темным компактным ядром и узкой полоской светлой цитоплазмы (табл.3).

Таблица 3

Митогенная активность фукозоспецифнчного лектина A.brasiknse Sp7 в культуре лимфоцитов человека

Условия опыта Время культивирования ч Малые и средние лимфоциты, % Типичные бласты, % Большие лимфоциты, % Митозы, %

Лектин (титр ГА : 16) 90 42,0 35,0 23,0 3,0

Контроль 90 98,6 0,6 0,8 -

Таким образом, установлена достаточно выраженная бластогенная трасформацня человеческих лимфоцитов под влиянием фукозоспецифнчного лектина А.Ь/шИа/ие Бр7.

5.Противоопухолевая активность фукозоспецифнчного лскпша

В предыдущих исследованиях нами была установлена выраженная бластная трансформация человеческих лимфоцитов под влиянием фукозоспецифнчного лектина азоспирилл. Поэтому, учитывая довольно высокую митогенную активность фукозоспецифнчного лектина азоспирилл, были проведены исследования его противоопухолевой активности на уровне целого организма. В работе использовали нелинейных крыс с опухолью РМК-1. Крысы подопытной группы (27 животных) получали препарат бактериального лектина с концентрацией 500 мкг/мл подкожно по 0,25 мл около опухоли 2 раза в неделю. Контрольной группе крыс (10 животных) вводили по 0,25 мл изотонического раствора хлористого натрия. Эксперимент проводили в течение 28 дней.

В результате проведенных исследований отмечены следующие эффекты в под-ОПЫ1ПОЙ группе животных (табл.4). У 18,5% животных опухоли полностью исчезли; у 44,4 % - наблюдалось уменьшение опухолей; у 37,1% рост опухолей продолжался, однако наблюдалось торможение роста.

Таблица 4

Противоопухолевый эффект фукозоспецифичного лектина А.ЬгаьНете Бр7

Группа Средняя площадь сечения опухолевого узла, мм2 Средняя удельная скорость роста опухоли, мм2 Эффект

Конгрольная (10 крыс) 66,961+4,02 0,057 + 0,0106 II

Опытная (27 крыс), полная peí ресспя опухолей (18,5%) Неполная регрессия опухолей (44,4%) Гост опухолей (37,1%) 11,646 ± 1,4 Р<0,01 48,016 ± 2,01 0,041 + 0,0113 1Д

Примечание: Y¡¿ - удельная скорость роста опухоли контрольной группы.

У0 - удельная скорость роста опухоли в опытной группе

Таким образом, у всех животных с раком молочной железы отмечен выраженный противоопухолевый эффект фукозоспецифичного лектина.

Вполне возможно предположить, что бактериальный лектнн имитирует, подобно пшеничному лектину, действие антител в случае антнтелзависимого лизнса опухоли макрофагами. Как известно, обязательным условием лизиса является тесный контакт между макрофагом и клеткой - мишенью, который осуществляется через противоопухолевые антитела. Было показано, что ряд лектинов растений (пшеничный лектин, ФГА, Кон Л) способны индуцировать контакт макрофагов с опухолевыми клетками (Кир15и е1 а1, 1980).

С другой стороны, возможно, что под влиянием фукозоспецифичного лектина им-мунокомпетентные клетки образуют вещества, получившие название лимфокинов. Сюда относятся ннтерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей. Именно стимуляцией двух последних групп лимфокинов исследователи объясняют тот факт, что некоторые лектины - сильные митогены (ФГА, Кон А) - обладают в той или иной мере противоопухолевой активностью. Лимфокины обладают разнообразным биологическим действием - регулируют иммунологические реакции, стимулируют и угнетают рост клеток, подавляют миграцию макрофагов, проявляют цитотоксическое действие (Вонтешок,1975, Петров с соавт.,1974).

6.Взаимодействие лектинов азоспирилл с компонентами плазмы крови

Выявление мнтогенной и противоопухолевой активности фукозоспецифичного лектина делает возможным использование его для исследований в биологических и медицинских экспериментах, для дальнейшего применения в виде препарата.

Известно, что исследование белков плазмы может дать информацию о течении М1Ю1 их заболеваний (в первую очередь - диагностика и прогноз заболеваний печени и почек, а также - лимфоретикулярных злокачественных заболеваний). Многие белки плазмы имеют наследственные варианты, некоторые из них (варианты гаптоглобинов, фансферинов) являются общими для различных популяций людей, в то время как

другие (отсутствие липопротеинов или иммуноглобулинов) встречаются редко, но важны из-за их связи с клиническими синдромами.

Все имеющиеся в литературе сведения о преципитации лектннами глнкопротепнои плазмы крови или мембран эритроцитов получены с использованием лектинов растительного происхождения. Мы не встретили ни одной, подобного рода, публикации, посвященной бактериальным лектинам.

В связи с этим важно было выяснить, обладают ли способностью реагировать с гликоиротеинами плазмы крови и мембран эритроцитов пектины азоспирилл, выделенные с поверхности клеток.

При добавлении лектина Л.йгсиг'/е/ие 5р7 к нативной плазме реакция преципитации наблюдалась практически только с плазмой 0 группы крови.

Представляется важным то обстоятельство, что взаимодействие фукозосиецифич-ного лектина азоспирилл с плазмой крови пациентов с некоторыми заболеваниями (например, с нарушением мозгового кровообращения) сопровождается образованием массивного преципитата, состав которого довольно резко отличается от состава преципитата нормальной плазмы.

Лектины других штаммов азоспирилл дают довольно отчетливую реакцию преципитации с плазмой практически всех групп крови. В состав преципитатов также входят гликопротеины зоны «[-глобулинов, причем распределение отдельных гликоиро-тсинов носит четко выраженный группоспецифичный характер. Эти данные вызывают особый интерес, т.к. лектины азоспирилл, за исключением лектина А.ЬгазИепэе Бр7, не проявляли групповой специфичности в реакции с эритроцитами.

7. К вопросу о получении препарата фукозоспецифичного лектина А.ЬгаэИепхе Бр7

Обнаружение и изучение свойств фукозоспецифичного лектина азоспирилл продемонстрировало, насколько интересно в научном и важно в практическом отношении продолжать более глубокое исследование лектинов бактерий. Появляется возможность более широкого их применения в медицинских, биологических, биотехнологических целях.

Ввиду все возрастающей потребности в препаратах лектинов, особенно моноспе-цифичиых, каковыми являются фукозоспецифичные лектины, изыскание новых источников для получения этих препаратов является актуальной задачей. Наряду с этим возрастает и потребность в получении высокоактивного препарата лектина. Наиболее распространено получение фукозоспецифичного лектина из растительного сырья, однако растение из которого получают лектин с этой уникальной специфичностью считается редким и на территории нашей страны не произрастает.

Изучение влияния различных факторов среды культивирования на гемагглютпни-руюшую активность, с целью оптимизации условий выращивания и повышения выхода лектина явилось первым этапом в разработке условий для получения высокоактивного препарата фукозоспецифичного лектина с целью более глубокого изучения его активности и механизма взаимодействия.

При подборе оптимальных условий культивирования бактерий были использованы методы математического планирования экспериментов. Первый этап оптимизации условий культивирования бактерий состоял в выявлении из числа возможных факторов только тех, которые действительно оказывают существенное влияние на рост и гемагглютинирующую активность. С этой целью был поставлен отсеивающий эксперимент по схеме случайного баланса (Максимов В.Н., 1969). Статистическая обработка результатов позволила выделить четыре наиболее существенных фактора. Для

Л.ЬгазНенхе Йр7 этими факторами явились содержание в среде солей магния и кальция, рН, температура. Затем для определения оптимального количественного уровня каждого из выделенных факторов был поставлен полный факторный эксперимент по схеме ортогональных латинских прямоугольников. В схему планирования были включены еще три фактора: источники азота, источники углерода и витамины. В результате, максимальные положительные эффекты на лектиновую активность бактерий штамма Л.ЬгазИеме 8р7 оказали: магний сернокислый - 0,3 г/л; кальций хлористый - 0,01 г/л, рП=9, температура - 38°С, в качестве источника углерода - глюкоза, источника азота триптофан - 0,14 г/л и витамин Вп - 0,0001 г/л. По полученным данным была составлена оптимизированная среда выращивания (табл.5).

Таблица 5

Состав оптимизированной среды

Исходная среда, г/л Оптимизированная среда, г/л

К2НРО4 - 0,1 К2НР04 - 0,1

КН2РО4 - 0,4 КН2РО4 - 0,4

1^04 - ОД Мй304 - 0,3

№С1 - 0,1 №С1 - 0,1

СаСЬ - 0,026 СаСЬ - 0,01

Ре304 - 0,017 Ре304 - 0,017

№2Мо04 - 0,002 №2Мо04 - 0,002

Малат - 3,0 Глюкоза! - 2,5

- Триптофан- 0,14

- Витамин В12- 0,0001

рН - 6,8 рН-9

1=37°С 1=39°С

Тигр ГА-1:8 Титр ГА - 1:32

Выход биомассы - 0,62 Выход биомассы - 0,48

При использовании сред с оптимизированными уровнями наиболее существенных факторов гемагглютинирующая активность бактерий повышалась в четыре раза.

Необходимо отметить, что признак лектиновой активности не является стабильным. В исследованиях была отмечена закономерность: условия неблагоприятные для роста культуры, стимулировали активность лектина. Поэтому было исследовано влияние некоторых химических и физических факторов на гемагглютинирующую активность бактерий.

Оказалось, что этиловый спирт оказывает ингнбирующее влияние на гемагглютинирующую активность лектина А.ЬгахИете Йр7. Ацетат натрия в концентрации от 4% до 8% резко стимулировал гемагглютинирующую активность лектина, тритон Х-100 и натрий ЭДТА не оказывали существенного влияния.

Температурный фактор также влиял на гемагглютинирующую активность лектина. Он оказывал влияние на гемагглютинирующую активность при экстремальных, неблагоприятных для роста культуры температурах ~12°С, -18°С, +43°С в четырех временных интервалах - 10 мин., 30 мин., бОмин., 120мин. Наиболее благоприятной температурой для проявления гемагглютинирующей активности бы ли температуры -12°С и +43°С. В этом температурном режиме гемагглютинирующая активность стабильна и превышает контроль в два раза.

Как показали результаты экспериментов не удалось подобрать условий культивирования одинаково благоприятных для стимулирования гемагглютинирующей актив-

ности и для наращивания биомассы, и в связи с этим обстоятельством, при выращивании бактерий в непрерывной культуре можно предложить двухстадийный процесс: на

первой стадии наращивание биомассы, на второй - создание условий для стимуляции

лектиновой активности.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что лсктины азоспирилл взаимодействуют с компонентами корней пшеницы. Установлено, что лектин A.brasilense Sp7 специфичный к фукозе, в разных концентрациях (от 500 до 10 мкг/мл) оказывает регулирующее влияние на способность зерновок пшеницы к прорастанию.

2. Обнаружено, что отсутствие активного лектин а на поверхности бактериальных клеток коррелирует с нитрогеназной активностью клеток азоспирилл.

3. Показано, что фукозоспецифичный лектин обладает бактерицидным действием в отношении некоторых патогенных бактерий. Фунгисгатическое действие лектина не было выявлено.

4. Установлена достаточно выраженная бластогенная трансформация человеческих лимфоцитов под влиянием лектина штамма A.brasilense Sp7, что свидетельствует о митогенных свойствах бактериального лектина.

5. Отмечен выраженный противоопухолевый эффект бактериального лектина штамма A.brasilense Sp7 в экспериментах по противоопухолевой активности на уровне целого организма.

6. Показана возможность использования бактериального фукозоспецнфичного лектина для исследования плазмы крови пациентов с некоторыми заболеваниями.

7. Подобраны оптимальные условия выращивания азоспирилл для получения высокоактивного препарата фукозоспецнфичного лектина.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Никитина В.Е., Итальянская Ю.В., Пономарева Б.Г. Влияние условий культивирования на рост и продукцию фукозоспецнфичного лектина.//В кн.: Тезисы докладов II Международного семинара-симпозиума по свсрхпродукцни метаболитов, ЧССР, 1988. С.192.

2.Karpunina L., Ponomareva Е., Kuraksina S. Haemagglutinins of genus Azospirillum bacteria publV/M01 Intern. Congres of Biochemistry, July 10-15, 1988, Prague,Czechoslovakia.P.52.

3.Никитина В.E., Итальянская Ю.В., Карнунина JI.B., Пономарева Е.Г., Куракснна С.К., Федорова Л.С., Позднякова Л.И. Изучение биологической роли гемагглюти-нинов (пектинов) почвенных азотфиксирующих бактерии.//С6. Всссоюз. Конференции "Изучение и использование лектинов", Тарту, 1989.С.25.

4.1talianskaya Ju.V., Nikitina V.E., Ponomareva E.G., Bogatyriov V.A. Azospirillum lectins in the investigation of bacteria-plant roots interactions.//11th Intern. Lectin Conf., Tartu,Estinia, June 4-9,1989.P.28.

5.Итальянская Ю.В., Никитина B.E., Пономарева Ii.Г., Лленькина С.А. Лсктины бактерий рода Azospirillum.//Тезисы Всссоюз. Конференции "Изучение и применение лектинов", Тарту, 1989. Т.1. С. 179. ó.Nikitina V.E., Karpunina L. V., Ponomareva E.G., Alcnkina S.A., Savenkova N.N., Mclnikova U., Vishneveskaya О. A.Lectins and agglutinins of soil nitrogen fixing bacteria and their role in plant-bacterium interactions.// VU! th Eastern Europe Syinp. On biological nitrogen fixation. 1992.Abstr., Saratov.P. 35. 7.Никитина B.E., Аленькина С.А., Итальянская IO.I3., Пономарева Е.Г. Очистка и

сравнение пектинов с клеточной поверхности активных и неактивных по гемагг-лютннации клеток азоспирилл.//Биохимия, 1994, вып.5, С.656.

8.Ponomareva E.G., Nikitina V.E. Studies of lectin activity of Azospirillum brasilense Sp7 under certain growth conditions.//Book of Abstr.Intem. workshop on associative interactionsof nitrogen-fixing bacteria with plants, Saratov,Russia, June 5-8,1995,P.67.

9.Итальянская Ю.В., Никитина B.E., Пономарева Е.Г. Влияние условий культивирования на лектиновую активность и прирост биомассы клеток Azospirillum brasilense 8р7.//Биотехнология, 1995, N.12, С.29.

Ш.Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова Н.Н. Изучение роли лектинов клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы //Микробиология, 1996, Т.65, вып.2, С.165.

Подписано к печати 6.08.97. Ответственный за выпуск Мельников А.Г. Объем! п. л. Тираж 100. Заказ 21.

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.