Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лектины в процессе взаимодействия пшеницы с ассоциативными микроорганизмами рода AZOSPIRILLUM

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Лектины в процессе взаимодействия пшеницы с ассоциативными микроорганизмами рода AZOSPIRILLUM"

На правах рукописи

Гб од

2 ДПР Ьйэ

Иосипенко Ольга Александровна

ЛЕКТИНЫ В ПРОЦЕССЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПШЕНИЦЫ С АССОЦИАТИВНЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ РОДА АХОБРтшиМ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорга низмов РАН (ИБФРМ РАН г.Саратов) и на кафедре биохимии и биофизики Сара товского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.В.Игнатов кандидат сельско-хозяйственных наук, с.н.с. Г.И.Стадник

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ОЛ.Озерецкоеская

кандидат биологических наук, Э.И.Выскребенцева

Ведущее учреждение: Главный Ботанический садим. Н.В.Цицина РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 4.

Защита диссертации состоится "]4" мая 1996 г. в 1022 час. на заседании Диссер тационного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биоло гических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН пс адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН. Автореферат разослан "Ю" апреля 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.И.Азаркович

-3-

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Изучение механизмов воздействия микроорганизмов, окружающих растение, на его рост и развитие - важная и малоисследованная область биологии. Одними из таких микроорганизмов являются почвенные свободноживущие азотфикси-рующие бактерии рода Azospirillum, которые способны осуществлять ассоциативную (несимбиотическую) фиксацию атмосферного азота, а также снабжать растения важными для них метаболитами (например, фитогормонами). Однако при этом не образуется выраженных морфологических образований типа клубеньков, характерных для бобово-ризобиального симбиоза.

Молекулярные механизмы взаимодействия растений и микроорганизмов частично изучены при симбиотическом взаимодействии и воздействии фитопатоге-нов. В ряде работ показана существенная роль бактериальных липополисахари-дов, экзополисахаридов, белков-адгезинов на этапах узнавания и инфицирования микроорганизмами растения-хозяина (Mort, Bayer, 1980; Matthysse et al., 1981; Линевич и др., 1983; Dazzo, Sherwood, 1983; Косенко и др., 1988; Rohm, Werner, 1989). Данных касающихся взаимодействия корневой системы злаковых с ассоциативными азотфиксаторами, объем фактических данных о структуре, физико-химических свойствах клеточной поверхности, а также о биологической роли различных ее компонентов весьма ограничен. Наименее исследованной областью во взаимоотношениях в системе "растение-микроорганизм" являются его ранние этапы - узнавание, рецепция, включение механизмов контактного взаимодействия.

Одним из типов молекулярного взаимодействия в такой системе является углевод-белковое взаимодействие. В связи с этим особое внимание привлекают угле-вод-связывающие белки как наиболее важный компонент в системе узнавания растениями микроорганизмов. Такими белками являются и лектины - биологически активные вещества с уникальным свойством - способностью специфически и обратимо связывать углеводы (Линевич, 1979; Goldstein et al., 1975; Kocourek, Horejsi, 1983). Наиболее изучаемым лектином до последнего времени являлся агглютинин зародышей пшеницы (АЗП). С обнаружением пектиновой активности в корнях злаков такой же интерес вызывают и эти лектины. Во многих работах по изучению лектинов злаков (Peumans et al., 1982; Peumans, Stinissen, 1983; Peumans et al., 1983; Королев, 1984) высказаны предположения о возможных физиологических функциях и факторах их определяющих. Действительные функции лектинов

еще не выяснены и поэтому вопрос об их физиологической роли в растительны клетках, а тем более в процессах взаимодействия между растением и микрооргг низмами остается весьма актуальным.

В настоящее время накоплен ряд сведений о локализации лектинов пшеницы тканях и клетках, получены данные о некоторых физико-химических и 6иологиче ских свойствах. Одним из этих свойств является способность влиять на активност ферментов (Ferens, Morawiecka, 1985; Лахтин, 1986; Krapivina, Ignatov, 1988) агглютинировать микробные клетки (Lotan, 1975; Котусов и др., 1984). Имеютс данные об участии лектинов бобовых в явлениях узнавания и контактного взан модействия между партнерами (Calver et al., 1978; Dazzo et al., 1978; Dazzc Sherwood, 1983). Вместе с тем данных, касающихся участия лектинов злаков пр взаимодействии их корневой системы с ассоциативными азотфиксаторами, крайн мало. Требуется детальное изучение роли лектинов пшеницы в выполнении ряд жизненно важных функций в самом растении пшеницы, а также в процессах взаи модействия растений и микроорганизмов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основной целью данной работы было изучение роли лектина корней в процес се взаимодействия проростков пшеницы с ассоциативными микроорганизмам: рода Azospirillum. В связи с этим решались следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать лектины из корней гексаплоидных пшениц Са ратовская 29 и Мироновская 808;

2. Изучить взаимодействие лектина пшеницы Саратовская 29 с клетками раз личных штаммов азоспирилл;

3. Выяснить влияние инокуляции проростков пшеницы бактериями на показате ли активности лектинов и развития проростков;

4. Исследовать взаимодействие лектина пшеницы с высокомолекулярными ме таболитами азоспирилл (полисахаридными комплексами и бактериальным] лектинами) и фитогормонами;

5. Изучить влияние мутантов Azospirillum brasilense Sp 245 по синтезу ИУК и эк зогенной ИУК на активность лектинов и содержание эндогенных фитогормо нов в корнях проростков пшеницы.

- 5 ~

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Выделены и охарактеризованы лектины корней гексаплоидных пшениц Саратовская 29 и Мироновская 808, показана их идентичность с АЗП по основным физико-химическим свойствам и выявлены сортовые различия по соотношению изоформ. Впервые показано селективное взаимодействие лектина пшеницы Саратовская 29 с клетками ассоциативных микроорганизмов рода Azospirillum. С использованием метода дот-блот анализа выявлено его взаимодействия с поверхностными структурами азоспирилл - кислыми зкзополисахаридами и бактериальными пектинами. Показано влияние мутантов азоспирилл с измененным синтезом ИУК на физиолого-биохимическое состояние проростков пшеницы Саратовская 29. Обнаружены элементы сходства и различия в ответных реакциях проростков пшеницы как на инокуляцию микроорганизмами, так и на воздействие чистыми фитогормонами. Впервые показана связь изменения активности лектина из корней проростков пшеницы Саратовская 29 и содержания эндогенных фитогормонов АБК и ИУК под влиянием экзогенной ИУК. Выявлено влияние лектина пшеницы на ИУК-зависимое растяжение клеточной стенки (КС) колеоптилей пшеницы.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Результаты работы могут служить теоретической предпосылкой для дальнейшего изучения молекулярных процессов, протекающих в корневой системе развивающихся проростков пшеницы с целью установления физиологической роли растительных лектинов и их участия в растительно-микробных взаимодействиях. Препараты корневого лектина пшеницы, полученные автором, используются для проведения плановых научно-исследовательских работ в институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. Материалы работы нашли применение на кафедре биохимии и биофизики Саратовского госуниверситета им. Н.Г.Чернышевкого при проведении занятий со студентами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были представлены на международных конференциях "Interlec-10" - Prague (Czechoslovakia), 1988; "Interlec-11" - Tartu (Estonia), 1989; "Interlec-13" - Berlin (Germany), 1991; VIII Eastern European Symposium on Biological Nitrogen Fixation "Nitrogenfix-92" - Saratov (Russia), 1992; III Всероссийском съезде общества физиологов растений - Санкт-Петербург (Россия), 1993; 1

European Nitrogen Fixation Conference - Szeged (Hungary), 1994; NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms - Sarvar (Hungary), 1994; 16 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology - New Delhi (India), 1994.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ в виде статей и тезисов в отечественных и зарубежных изданиях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, 4-х глав результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на страницах, содержит 13 рисунков и 11 таблиц, список литературы, включающий 16 7 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили семена гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum L. Саратовская 29 (яровая) и Мироновская 808 (озимая) и штаммы ассоциативных микроорганизмов рода Azospirillum - A.brasilense Sp7, A.brasilense Sp 75, A.brasilense Sp 245 и его мутанты по синтезу ИУК.

Проращивание семян растений. Для .поверхностной стерилизации семена пшеницы обрабатывали 20 мин 4% Са(ОС1)з с промежуточной промывкой стерильной дистиллированной водой, выдерживали 18 часов при 4°С и повторяли стерилизацию Са(ОС1)г в течение 5 минут. Семена проращивали от 3 до 7 суток в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водой при 22-24°С. Затем проростки высаживали в стерильные пробирки на жидкую минеральную среду (Barbierí, 1986) и выращивали в течение 2 недель.

Выращивание бактерий. Микроорганизмы выращивали на среде Dobereiner (1976) в течение 18 часов. Концентрацию бактерий определяли спектротурбиди-метрически (Щеголев, 1984).

Выделение лектинов пшеницы и их очистка. Препараты лектинов выделяли из зерна и проростков пшеницы. После гомогенизации зерен экстракцию белков проводили 0.05 н НС1 5 мМ ЭДТА, 5 мМ аскорбиновой кислоты в соотношении 1:5 в течение 2 ч при комнатной температуре. Гомогенат проростков пшеницы

эксграгировали - 12 мМ фосфатно-солевым буфером (0.15 М NaCl) в присутствии 1 мМ ФМСФ (ингибитор протеаз) в том же соотношении. Затем его центрифугировали при 6000 g 15 мин. В полученном супернатанте доводили рН до 7.5-8.0 и вновь центрифугировали при 15000 g 15 мин. Для дальнейшей очистки суперна-танта использовали аффинную хроматографию на М-ацетил-О-глюкозамин-Toyopearl HW 65 (ToyoSoda, Япония) или хитине (на колонке 3.0x4.0 см со скоростью 2 мл/мин). Нанесение образца проводили в 20 мМ фосфатном буфере (рН 7.5). Далее снимали неспецифически связанные белки градиентом концентрации NaCl от 0 до 0.5 М. Затем проводили элюцию лектинов 0.05 н НС1.

Последующее разделение лектина пшеницы на изоформы проводили на колонке с SP-Toyopearl 650 М в системе 20 мМ формиата натрия рН 3.8, градиент NaCl 0-0.5 М. Выход белков регистрировали при >.=280 нм на Uvicord SII (LKB, Швеция).

Реакцию гемагглютинации (РГА) и определение углеводной специфичности лектинов проводили по стандартной методике (Луцик и др., 1981). Методом инги-бирования реакции агглютинации изучали взаимодействие АЗП с препаратами полисахаридов азоспирилл (ЛПБК и ПС). В качестве контроля ставили реакции агглютинации лектина пшеницы, ЛПБК и ПС с трипсинизированными эритроцитами кролика.

ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. Электрофорез проводили по Laemmli (1970).

Определение концентрации белка в растворе. Для определения концентрации белка применяли модифицированную методику Sedmak (1977), метод Lowry, в модификации Peterson (1989) или спектрофотометрически при А280 - А260 (Дарбре, 1989).

Спектрофотометрическое титрование пектинов. Для измерений дифференциальных спектров поглощения растворов лектинов в 0.5 М NaCl на фосфатном буфере (рН 6.8) использовался Specord М-40 (ГДР). Измерения проводили в диапазоне 250-350 нм, спектральная ширина щели в исследуемой области 100 см-'. Оптическую плотность определяли с точностью ± 0.002. Для измерений были использованы две пары термостатированных (+0.2°С) кювет, толщиной 1 см, в две из которых вносили 1.3 мл раствора белка (1.3-3.2 мМ), а в другие - такой же объем буфера. Спектрофотометрическое титрование проводили 4-

метилумбешшферильным производным Ы-ацетил-О-глюкозамином (4-Ме-11тЬ-ацеггил-О-глюкозамин) в концентрации 250 мМ в том же растворе при длине вс ны 316.3 им. Значение констант ассоциации (Ал) были определены из график, координатах Скэтчерда.

Метод дот-блот анализа. Для изучения углевод-белковых взаимодейств (корневого лектина, полисахаридов и бактериальных лектинов) применяли мет дот-блот анализа с использованием нитроцеллюлозных фильтров фирмы "Бупрс №4 (ЧССР) по методике (^а1угеуе1 а1., 1992).

Инокуляция проростков пшеницы. Поверхностно стерилизованные семена пе] носили на чашки Петри с 3.5% агаром. Через 2-3 суток проросшие семена пере! сили в пробирки с минеральной средой и выращивали при 22-24°С и 12-ти часов< световом дне. Инокуляцию проводили на 5-7 день микроорганизмами дозой 1 бактериальных клеток на растение.

Обработка проростков растений фитогормонами. Поверхностно стерилиз ванные семена пшеницы помещали в растворы фитогормонов на 24 часа, а затеи кюветы с фильтровальной бумагой, смоченной растворами с АБК и ИУК (Р1ик: Семена проращивали при 20°С в течение 72 часов.

Определение содержания эндогенных фитогормонов в корнях растений. Соде жания свободных эндогенных фитогормонов определяли по методике Кислина др., (1983).

Определение растяжения клеточной стенки (КС) колеоптилей проводили 1 методу Бояркина (1966).

Выявление пектиновой активности в субклеточных фракциях корней проростк пшеницы. Корни 7-ми суточных проростков гомогенизировали, промыв предвар тельно охлажденной дистиллированной водой, в 3-х кратном объеме буфера: 0. М трис-НС1, 5 мМ ДТТ, 0.1 мМ ФМСФ, 10 мМ ЭДТА, 0.5 М сахарозы при рН 7 Гомогенат фильтровали через капрон и фракционировали по схеме (Алексид: 1986). Фракции, обогащенные соответственно клеточными стенками (КС), ядра! (Я), митохондриями (МХ), микросомами (М) получали методом дифференциал ного центрифугирования. Солюбилизацию полученных фракций, осуществляли буфере 0.05 М трис-НС1, 0.1% тритон Х-100. После инкубации в течение 1 часа п комнатной температуре фракции вновь центрифугировали в течение 20 минут п]

-920000 g и 100000 g, и определяли гемагглютинирующую активность в полученных

супернатантах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнительная характеристика пектина корней пшеницы и АЗП По своим основным физико-химическим свойствам корневые лектины пшениц, выделенные нами мало отличались

Таблица 1

Константа связывания АЗП и корневого лектина пшеницы Саратовская 29 с 4-Ме-итЬ->?-ацетил-0-глюкозамином

Лектины Ка 103, М-1

АЗП 35

Корневой лектин пшеницы 30

от АЗП - имели одинаковую м.м субъединиц (18 кД), углеводную специфичность к N-aneTiui-D-глюкозамину и его олигомерам.

Используя абсорбционный вариант оптической спектроскопии в ближней УФ-области (250-350 нм), были определены Ка комплекса лектин-углевод с помощью дифференциальных спектров поглощения. В качестве титранта использовали 4-Ме-итЬ-М-ацетил-О-глюкозамин, в спектре которого имеется достаточно ин тенсивная полоса поглощения при 316.3 нм. Так как константа связывания комплекса "лектин-углевод" при снижении температуры увеличивается, то равновесные параметры процесса

связывания 4-Me-Umb-N-auerarc-D-

Рис. 1. Изолектиновый состав АЗП и глюкозамина с лектинами определяли лектина 3-ДНевных корней пшеницы: А -

при г=10°С. Сродство к данному моно- яровая пшеница Саратовская 29, Б -

озимая пшеница Мироновская 808, I -сахариду корневого лектина было И30ф0рмы АЗП, II - изоформы лектина

немного меньше, чем у АЗП (таб. 1). корней пшеницы, I - 3 - изоформы

Разделение лектинов на изоформы про-Небольшая разница в Ка АЗП и корне- водили на колонке (1x8 см) SP-Toyopearl

вого лектина связана, по всей видимо- 650М (Japan) сти, с изоформным составом этих лектинов.

2*

N фрмям

При определении изоформного состава лектины корней мягкой яровой и оз! мой пшениц содержали все три изоформы, характерные для гексаплоидных пик ниц, что свидетельствует об отсутствии специфических лектинов в корнях пшени (рис. 1). У озимой пшеницы изоформный состав АЗП при прорастании изменяло незначительно, соотношение изоформ АЗП и корневого лектина оставалось прг мерно на одном уровне. Наблюдаемое преимущественное содержание изоформы и значительное снижение изоформы 2 и 3 в корнях яровой пшеницы Саратовска 29 свидетельствует о наличии сортовых особенностей в регуляции синтеза изс форм в процессе прорастания семян пшеницы и может представлять интерес дл выяснения физиологической роли лектинов в корнях растений. В культурально среде, где выращивали проростки пшеницы Саратовская 29 (3-4 суток), так ж была обнаружена гемагглютинирующая активность с титром 1:8 и специфично стью к Ы-ацетил-Э-глюкозамину, что свидетельствует о выходе лектина пшениц! во внешнюю среду и возможном участии его в процессах взаимодействия с микрс организмами.

Распределение лектинов в субклеточных фракциях корней проростков пшеницы.

Из корней семисуточных проростков пшеницы Саратовская 29 были выделен! следующие субклеточные фракции: растворимая (цитозольная фракция) и фрак ции, полученные методом дифференциального центрифугирования, обогащенны соответственно: 1) клеточными стенками и ядрами, 2) митохондриями, 3) микрс сомами (таб.2). Наибольшую удельную лектиновую активность имела фракци митохондрий (54.9% от общей лектиновой активности). Лектиновая активност цитозольной фракции составляла 14%. Изучение субклеточной локализации 1

Таблица:

Распределение лектиновой активности в субклеточных фракциях корней семисуточных проростков пшеницы Саратовская 29

Субклеточные фракции Концентрация белка, мкг/мл Титр РГА, ЕА Удельная лектиновая активность, титр РГА/мкг/мл % от общей лектиновой активности

Митохондрии 87 4096 47.1 54.9

Микросомальная 240 4096 17.1 20.1

Клеточная стенка + ядра 27 256 9.5 11.1

Цитозольная 170 2048 12.1 14.1

активности лектинов (как растворимых, так и мембраносвязанных) в растительных клетках дает возможность уточнить физиологические функции этих белков в растении.

Изменение лектиновой активности, роста н развития корней пшеницы Саратовская 29 при взаимодействии с ассоциативными микроорганизмами рода ЛгояртИит

Влияние пектина пшеницы на агглютинацию клеток азоспирилл Используя дот-блот анализ с меченым коллоидным золотом лектином пшеницы, нами была выявлена реакция се-

лективного взаимодействия клеток трех штаммов азоспирилл с лектином пшеницы (рис. 2). Более компетентными партнерами в этом взаимодействии показали себя штаммы А.ЬгсиИепзе 5р 245 и Бр 75, выделенные из корней пшениц, по сравнению с типовым штаммом А.ЪгаыЧете Бр 7. Результат реакции очень нагляден, так как при положительной реакции на нитроцел-

1

Щ 'jQ Q-\&

.Jí

* t

О ■ O ÍH-O,

п

KS

JC

3

к

цы связан с частицами коллоидного

Рис. 2. Взаимодействие лектина пшени-пюлозных мембранах через 30-60 ми- цы, меченного коллоидным золотом (0.01

мг/мл), с клетками азоспирилл нут появляется красное окрашивание, (начальшя концентрация 4x10' кле-

обусловленное тем, что лектин пшени- ток/мл, с последующим 2-х кратным разведением) 1. A.brasílense Sp 7 золота, которые и дают подобный 2. A.brasilense Sp 75

. , г. 3. A.brasilense Sp 245

эффект. Реакция агглютинации инги- v

К - контроль, лектин меченный колло-

бировалась специфическими углевода- идным золотом без бактерий

ми. Это свидетельствует о том, что лектин взаимодействует с поверхностными углеводными компонентами азоспирилл.

2

«г

Изменгние лектиновой активности и развития корней пшеницы при инокуляции аз о спириллами Бактерии рода АгояршИит, известные как свободноживущие почвенные азот фиксирующие микроорганизмы, способны образовывать ассоциации с корням) злаковых растений. Инокуляция семисуточных проростков пшеницы Саратовска 29 штаммами азоспирилл и совместная культивация в течение 6-7 суток в наши: опытах вызывала увеличение длины боковых корней при уменьшении их числа 1 увеличение сырого веса корней (таб. 3).

Таблица

Влияние инокуляции проростков пшеницы Саратовская 29 клетками азоспирилл на удельную пектиновую активность и рост корней.

(среднее по 10 растениям)

Удельная Вес корней

Белок, мг/мл Титр РГА лектиновая мг/растение

Варианты активность титр/мг белка М±т р<0.05

Контроль 4.4+0.2 16 3.6±0.3 81.8+6.2

А.ЬгаяИепзе Бр 7 4.8+0.2 16 3.3+0.2 85.5±6.5

А.ЬгазИеюе Бр 75 5.3±0.1 32 4.5±0.2 95.4±5.9

А.ЪгазПеюе Бр 245 6.2+0.3 32 5.2+0.4 86.6±5.8

При этом наблюдалось увеличение содержания общего белка и титра РГА экстрактах корней, инокулированных клетками азоспирилл. Изменение удельно гемагглютинирующей активности корней проростков зависело от штамма. Во: можно, стимуляция роста корневой системы в ответ на инокуляцию происходит и только за счет азотфиксирующей активности бактерий, но и в немалой степен может объясняться синтезом этими микроорганизмами фитогормонов или други метаболитов.

Изменение лектиновой активности, роста и развития корней пшеницы под влиянием метаболитов азоспирилл

Взаимодействие с углеводными компонентами клеточной поверхности азоспирилл В работе использовали лектин пшеницы и 2 препарата липополисахари; белкового комплекса (ЛПБК), выделенные из капсул клеток АгозртИит ЬгазИеп. Бр 7, кислый внеклеточный полисахарид (ПС), выделенный из клеток Аго$р1гШи, brasilen.se Бр 7 и кислый экзополисахарид, выделенный с поверхности А205р1гШи

ЬгазИепзе Бр 245. Было изучено взаимодействие этих соединений методом ингиби-рования РГА. В качестве контроля ставили реакцию агглютинации лектином пшеницы, ЛПБК и ПС с трипсинизированными эритроцитами кролика. Полученные данные представлены в таблице 4. Препараты ПС (1) из А. ЬгсиИеме Бр 7 не вызывали реакцию агглютинации эритроцитов кролика и не ингибировали ее при взаимодействии лектина пшеницы с эритроцитами кролика. Это указывает либо на отсутствие взаимодействия между лектином пшеницы и препаратами ПС данного штамма либо, это взаимодействие очень слабое.

Таблица 4

Ингибирование РГА препаратами полисахаридов, выделенных с поверхности азоспирилл

Варианты 1:2 1:4 1:8 Титр РГА 1:16 1:32 1:64 1:128

АЗП + + + + + + +

ПС(1) - - - - - - -

ПС(2) - - - - - - -

АЗП+ПС(1) + + + + + + +

АЗП+ПС(2) - - - - - + +

ПС (1) - кислый экзополисахарид с поверхности А.ЬгазИепзе Бр 7 ПС (2) - кислый экзополисахарид с поверхности А.ЬгжЧете Бр 245 Исходная концентрация ПС - 2 мг/мл; АЗП - 0.034 мг/мл

В отличие от препаратов полисахаридов из штамма Бр 7 кислый экзополисахарид с поверхности клеток АгоэртИит ЬгазИепзе 5р 245 ингибировал реакцию агглютинации лектина пшеницы с эритроцитами кролика. Ингибирующий эффект проявлялся при концентрации полисахарида - 0.064 мг/мл (концентрация АЗП 0.34 мкг/мл). Эта способность ПС, по-видимому, связана с тем, что в его состав входят наряду с галактозой, рамнозой, ксилозой и другими моносахарами - ами-носахара, в том числе и Ы-ацетил-Р-глюкозамин, являющийся специфическим углеводом для АЗП. Полученные результаты были подтверждены методом дот-блот анализа с использованием лектина пшеницы, меченного коллоидным золотом. Кислый ПС, выделенный с поверхности штамма Бр 245, в концентрации 5 мг/мл раститровывали на планшете двукратным разведением и проводили дот-блот анализ с лектином пшеницы на нитроцеллюлозном фильтре. Минимальная концентрация ПС, реагировавшая с лектином, равнялась 0.039 мг/мл, что хорошо согласуется с данными, полученными первым методом. Таким образом, можно считать установленным факт взаимодействия лектина пшеницы с одним из бактериальных ПС, что может играть существенную роль в ассоциативном взаимодей-

ствии азоспирилл и пшеницы. Совместная семисуточная культивация проростко1 пшеницы Саратовская 29 с препаратами ПС и ЛПБК, добавляемыми в среду вы ращивания в концентрации 0.05 мг/мл, вызывала незначительные изменения 1 росте и развитии корней пшеницы. В качестве контроля использовали декстра! той же концентрации. Добавляемый в среду выращивания кислый ПС по своем; действию на проростки пшеницы не отличался от ЛПБК (таб. 5).

Таблица'.

Влияние полисахарида, выделенного с поверхности клеток А.ЬгазИепзе, на лектиновую активность и развитие проростков пшеницы Саратовская 29

(среднее по 30 растениям)

Варианты Общий белок, мг/мл Титр РГА Удельная лектиновая активность, титр/мг белка Сырой вес корней, мг/1 растение Сырой вес проростка, мг/1 растение

Контроль 3.13+0.26 16 5.1410.42 140.6±16.9 353±12

Декстран 3.13±0.!8 16 5.26±0.37 100.2±0.5 282±1

ПС (Бр 245) 3.41 ±0.11 16 4.66±0.17 111.9+10.7 310+7

ЛПБК (Бр 7) 3.66±0.09 16 4.33±0.09 96.5±7.1 285±9

Оба препарата вызывали по сравнению с декстраном увеличение содержани: общего белка, титр РГА оставался на уровне контроля, то есть бактериальны! полисахаридные препараты не индуцировали дополнительный синтез лектин; корней пшеницы, при этом удельная лектиновая активность несколько снижалас (9-17%). В колебаниях величины сырого веса проростков пшеницы (вес корней • вес стебля) не найдено определенной закономерности. Возможно, кислый полиса харидный компонент АгоьриШит ЬгаьИете Бр 245 обеспечивает совместно с лек тином пшеницы только механизм взаимодействия партнеров и индуцирует тег самым первую фазу ассоциативного взаимодействия азоспириллы и растения пше ницы.

Взаимодействие с бактериальными лектинами Бактерии рода АгозрЬШит являются продуцентами поверхностных лектинов агглютининов, имеющих гликопротеидную природу. Мы изучали взаимодействи лектина пшеницы с лектинами бактерий, выделенными с поверхности клето АгозртИит Ьтахйепзе Бр 7, А.ЬгснИеже Бр 75, А.ЬгазИепэе Бр 245, методом дот-бло анализа. При концентрации лектина пшеницы 0.02-0.5 мг/мл и бактериальны лектинов 0.1-0-.3 мг/мл реакция взаимодействия между ними была ярко выражен; Не наблюдалось различий во взаимодействии лектина пшеницы и лектинов, выд(

ленных из разных штаммов азоспирилл. Ингибирование активных центров бактериальных лектинов специфичными для них гаптенами (для А.ЬгазИеюе Бр 7 фуко-пиранозид, для А.brasilen.se Бр 75 - арабиноза, рамноза, манноза, для А.ЬгазИепзе Эр 245 - глюкоза, манноза) не влияло на реакцию взаимодействия лектинов пшеницы с бактериальными лектинами. Это свидетельствует о том, что такое взаимодействие лектина пшеницы связано с углеводной частью бактериальных лектинов, а состав которой, по всей видимости, входит Ы-ацетил-Б-глюкозамин, специфиче-:кий углевод для лектина пшеницы.

По данным Никитиной и др., (1988) лектин, выделенный с поверхности А.ЬгазИепзе Бр 7, оказывал регулирующее влияние на скорость прорастания семян цненицы. В нашей работе изучалось влияние совместной культивации семисуточ-1ых проростков пшеницы Саратовская 29 с препаратами бактериальных лектинов, )ыделенных с поверхности штаммов А.ЬгазИепзе Бр 7 и Бр 75 (в концентрации 0.1-).3 мг/мл) на развитие и лектиновую активность корней (таб. 6).

Таблица 6

Влияние бактериальных лектинов, выделенных с поверхности азоспирилл, на лектиновую активность и развитие проростков пшеницы Саратовская 29

(среднее по 20 растениям)

Варианты Общий белок, мг/мл Титр РГА Удельная лектиновая активность, титр/мг белка Сырой вес корней, мг/1 растение Сырой вес проростка, мг/1 растение

Сонтроль 2.61+0.43 16 6.2510.95 98.515.3 270+27

1ектин А.ЬгазПепве Бр 7 3.45+0.05 16 4.65+0.05 93.3+2.6 271137

1ектин А.ЬтПепБе Бр 75 3.2510.15 16 4.9510.25 84.8+5.2 269117

Добавление в среду выращивания проростков пшеницы бактериальных лекти-юв вызывало увеличение содержания общего белка на 23-30% и снижение удель-;ой лектиновой активности при неизменном титре РГА. Сырой вес проростков по равнению с контролем не менялся. Таким образом, лектин пшеницы выступает в роцессе ассоциативного взаимодействия пшеницы с бактериями азоспирилл в ачестве элемента распознающе-связывающей системы. Его роль определяется в сновном его взаимодействием как с ПС бактериальных клеток, так и с бактери-льными лектинами гликопротеидной природы.

Взаимодействие с фитогормонами, синтезируемыми клетками азоспирилл

Ряд исследователей отмечает влияние гормонов на биосинтез лектина в корня: молодых проростков пшеницы (Яа1к1ге1 й а1., 1986, Саштие е1 а!., 1988).

Фитогормоны, продуцируемые и выделяемые ассоциативными микроорганиэ мами во внешнюю среду, могут так же оказывать определенное воздействие н уровень содержания корневого лектина и, тем самым, на протекание физиологиче ских процессов в клетках растения.

В наших опытах с добавлением в среду прорастания семян пшеницы Саратов екая 29 фитогормонов АБК и ИУК и инкубации в течение трех суток наблюдаемо действие на рост и развитие корней и гем агглютинирую щей активности зависел от концентрации вносимых гормонов. Используя принцип системного подхода диапазоне изученных концентраций от 10~5 М до 1(И0 М, и стандартные систем! расчета в программе Statgгaphics, мы показали изменения титра РГА, веса и длин! корней (рис. 3). Модель достоверна на общепринятом уровне значимости. Об гормона с увеличением концентрации ведут к ингибированию роста, тогда ка показатели реакции гемагглютинации увеличиваются, причем действие АБК в дв раза сильнее, чем действие ИУК. При действии АБК в концентрации 1СН М прс исходит подавление роста и развития проростков пшеницы.

РГА Вес корней, Длина корней,

конц.ИУК ^конц.АБК ^конц.ИУК 1% конц.АБК % конц.ИУК ^конц.АБ;

Рис. 3. Трехмерное изображение влияния экзогенных фитогормонов на РГА, вес и длину корней 3-х суточных проростков пшеницы Саратовская 29.

Изменения, происходящие под влиянием совместного действия угнетающ!

рост и развитие корней концентраций ИУК Ю-5 М + АБК Ю-5 М, более значител

ны, чем их действие в отдельности.

Совместная 6-7 суточная культивация 7 суточных проростков пшеницы Саратовская 29 с фитогормонами выявила те же закономерности в изменении показателей, что и для 3-х дневных проростков.

В работе ряда авторов (ВагЫеп е1 а1., 1986, ВагЫеп, ваШ, 1993) с различными микроорганизмами и их мутантами с измененным синтезом ИУК показано, что ответ корневой системы растений при бактериальной инокуляции объясняется в основном продукцией микроорганизмами фитогормонов. Нами проведены опыты по инокуляции семисуточных проростков пшеницы Саратовская 29 АгозрггШит ЬгазИеюе Бр 245 и 2 мутантами, Агозр1гШит ЪгшИгпзг Бр 245.90 (суперпродуцент ИУК) и АгояртПит ЬгазИепзе Бр 245.63 (потерявший способность синтезировать ИУК, но синтезирующий антраниловую кислоту). Из данных таблицы 7, видно, что инокуляция проростков штаммами Бр 245 приводит на 14 сутки к увеличению сырого веса корней (увеличивалась длина боковых корней) и снижению удельной лектиновой активности, рассчитанной на единицу сырого веса корней.

Таблица 7

Влияние инокуляции 14 суточных проростков пшеницы Саратовская 29 А:озр1гШит Ьга$Иете Бр 245 и его мутантами (107 кл/мл) на лектиновую активность и рост корней (среднее по 10 растениям)

Варианты Вес корней, г Титр РГА/г сырого веса

Контроль 0.10 160

А.ЬгазИете 245 0.13 123

А.ЪгазИеюе 245.90 (ИУК++) 0.08 200

А.ЪгсхИеюе 245.63 (ИУК-) 0.09 177

Суперпродуцент ИУК штамм Бр 245.90 приводит к уменьшению числа и длины боковых корней, снижению веса корней и увеличению удельной РГА. Изменения, вызываемые инокуляцией штаммом Бр 245.63 менее значительны и показатели мало отличаются от контроля. Полученные данные позволяют предположить, что ответ корневой системы проростков пшеницы при бактериальной инокуляции в значительной степени объясняется синтезом фитогормонов, в частности ИУК, в физиологических для растений концентрациях.

Лектин пшеницы в некоторых процессах клеточного метаболизма

Взаимосвязь лектиновой активности с уровнем содержания эндогенных фитогормонов в корнях проростков пшеницы Полученные нами данные по изменению лектиновой активности корней проростков под действием экзогенных фитогормонов и под влиянием инокуляции му-

тантами штамма Бр 245 по синтезу ИУК позволили приступить к изучению отве ных реакций гормональной системы корней пшеницы Саратовская 29 на действ! этих же факторов.

При инокуляции проростков пшеницы Саратовская 29 с мутантами по синте: ИУК, мы наблюдали уменьшение содержания свободной эндогенной ИУК г сравнению с контролем (таб. 8). Причем, штамм, дефектный по синтезу ИУК (5 245.63) вызывал наименьшее изменение в содержании, тогда как штамм Бр 245 Бр 245.90 вызывали значительное снижение содержания эндогенной ИУК.

Таблица

Влияние инокуляции проростков пшеницы Саратовская 29 штаммами азоспирилл на содержание в корнях эндогенной индолил-3-уксусной кислоты

_Варианты_ИУК, мкг/г сырого веса_

Контроль 2.40 Экзогенная ИУК 1 (Н М 0.04 А.ЬгазИепье 245 (ИУК+) 0.70 А.ЬгазИегие 245.90 (ИУК++) 0.02 А-ЬгавИете 245.63 (ИУК-)_]А0_

Тир

Фт.иойг ГГААяг

сирого кса . бежа

80

'70

«в

И «

Зв 2« I*

Рис. 4. Влияние экзогенной ИУК, вносимой в среду выращивания, на содержание эндогенных фитогормонов и лек-тиновую активность в корнях проростков пшеницы Саратовская 29 1-ИУК 2-АБК 3-удельная РГА Коэффициенты корреляции между эндогенными фитогормонами и удельной РГА

АБК-РГА =-0.98+0.01 ИУК-РГА =+0.69±0.31 АБК/ИУК - РГА = -0.7910.21

Как видно из рис. 4 низкие конце: трации ИУК (10-'° М) вызывали увел! чение содержания эндогенной АБ1 содержание эндогенной ИУК уменьш; лось. С увеличением концентрат: вносимой в среду выращивания экз! генной ИУК (Ю-МО-4 М) происходи; снижение содержания АБК, изменен! в содержании эндогенной ИУК бы; незначительны. Изменения удельнс лектиновой активности корней прор стков пшеницы под влиянием внос: мых различных концентраций ИУ обратно пропорционально связаны изменением содержания в корнях АБ (коэффициент корреляции равен 0.98+0.01). .

Рассчитанные уравнения линейной регрессии показали, что полученные ре-ьтаты достоверны с вероятностью 0.95±0.01. Выявленная корреляция между тнновой активностью корней проростков пшеницы и содержанием эндогенных гогормонов позволяет предположить связь их физиологических функций в тках растений.

Влияние лектина пшеницы на ИУК-зависимое растяжение клеточной стенки колеоптилей пшеницы Из литературы известно явление ИУК - зависимого растяжения клеточной яки растения, возможно, в этих процессах могут принимать участие и лектины 1Лимбетоваидр„ 1986, Takayuki, Yoshio, l987,Takayuki, 1987). В нашей работе, используя биотест растяжения клеточной стенки колеоптилей, >не максимальной компетентности колеоптилей (1.5-2.0 см) мы не обнаружили яния лектина пшеницы на ИУК-зависимое растяжение. На более зрелых коле-илях (длина 3.5-5 см) выявлено ингибирование лектином пшеницы (0.125 *ш) процессов растяжения клеточной стенки под влиянием ИУК (табл. 9).

Таблица 9

Влияние лектина пшеницы(0.00б-0.05 мг/мл) на ИУК-зависимое растяжение клеточной стенки колеоптилей пшеницы (длина отрезков колеоптилей, см)

Концентрация ИУК, М

Варианты 10-5 10-« Ю-' 1(Н

Контроль 3.4 3.4 3.4 3.4

ИУК 4.1 4.3 4.4 3.8

ИУК + АЗП 4.2 4.3 3.9 4.3

Таким образом, возможная физиологическая функция лектина пшеницы в гке зависит от целого ряда факторов: возраста клеток, концентраций эндоген-; фитогормонов и количеством самого лектина в клетке. Существующая систе-регуляции метаболизма в клетке включает целый ряд взаимосвязанных и взаи-ависимых реакций. Эндогенная система фитогормонов контролирует реализа-) основных физиологических процессов на различных уровнях: геном, мембра-с одной стороны, и сама находится под контролем этих систем с другой сторо-Ауксины как гормоны, действующие на широкий спектр ростовых и других цессов развития растений, вызывают изменения экспрессии генов. На ранних iax действия фитогормонов включаются специфические рецепторные белки,

что отражает экспрессию первичных генов-мишеней, продукты этих генов регул] руют экспрессию других генов, это приводит к каскаду вторичных эффекте (Пирузян, 1990).

Выяснению эндогенных функций лектина пшеницы в значительной степе} может способствовать изучение соединений, с которыми он взаимодейству! внутри растения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований показана идентичность лектинов ко ней проростков гексаплоидных пшениц - агглютининам зародышей пшениц i молекулярной массе, углеводной специфичности, константе ассоциации с углев дами, числу изоформ. Выявлены сортовые различия по соотношению изоформ молекуле лектина. Лектиновая активность в корнях семисуточных проросло пшеницы Саратовская 29 была связана в первую очередь с митохондриями, зате\ микросомальной фракцией, клеточной стенкой и ядрами. До 15% лектиновой а тивности связано с цитозольной фракцией.

В настоящее время существует ряд модельных систем, позволяющих интена но разрабатывать элементы теории ассоциативности. Одной из таких части] моделей является взаимоотношение азоспирилл со злаками. На основании npoi денных исследований и анализа литературы установлено, что лектин пшенш участвует в прикреплении клетки микроба к растению. Однако, мы предположи; что роль лектина пшеницы этим не адраничивается. Он может влиять на процес метаболизма в клетках азоспириллы, в том числе на синтез ими ИУК. Посколь азотфиксация азоспирилл и продукция ауксинов являются, вероятно ведущи факторами, определяющими позитивное воздействие этой бактерии на рост развитие растений (Tien et al., 1979, Levanony et al., 1989, Costacurta, Vanderleyd 1995), естественно можно высказать предположение о влиянии этого фитогормс на развитие корней проростков пшеницы и их лектиновую активность. Учасп лектина корней в процессе взаимодействия проростков пшеницы с ассоциатив; ми микроорганизмами - азоспириллами - можно условно разделить на два этап;

1. Контактное взаимодействие: лектин пшеницы взаимодействует с целы клетками азоспирилл (при этом выявляется штаммовая специфичность) и с вы

;омолекулярными продуктами их метаболизма - полисахаридными комплексами i бактериальными пектинами.

2. Взаимное влияние метаболитов партнеров ассоциации: а) стимулирующее ¡лияние низких концентраций лектина пшеницы (0.5-1.2 мг/мл) на ряд показателей 1етаболизма азоспирилл, в том числе и на увеличение синтеза низкомолекулярно-о метаболита - ИУК. б) влияние фитогормона ИУК на лектиновую активность орней, их развитие (длина и вес), на содержание в корнях эндогенных фитогормо-:ов АБК и ИУК. Изменение содержания лектина в корнях отрицательно коррели-ует с содержанием в них АБК (коэффициент корреляции - 0.9810.01) и, по-идимому, лектин находится в корнях под контролем АБК.

Связь АБК и ИУК с синтезом лектина в корнях пшеницы подтверждается ра-отами Raikhel (1986), Cammue (1988), Шакирова и др.(1990) и Максимов и др. 1993). В то же время, лектин пшеницы, по нашим предположениям, может влиять а рост клеток корня растяжением. Лектин пшеницы (0.006-0.012 мг/мл) ингибиро-ал ИУК-зависимое растяжение клеточных стенок колеоптилей пшеницы, взятых ами в качестве тест-системы. Вероятно, полученные результаты могут свидетель-гвовать о том, что лектин пшеницы является не только связующим элементом на ачальной стадии взаимодействия макро- и микропартнеров, но и, наряду с фито-эрмонами ИУК и АБК может участвовать в клеточном метаболизме и развитии орней пшеницы при ассоциативном взаимодействии ее с азоспириллами.

ВЫВОДЫ

Выделены и охарактеризованы лектины из корней гексаплоидных пшениц Саратовская 29 и Мироновская 808, идентичные пектинам из зародышей пшениц по основным физико-химическим показателям и изоформному составу, но имеющие сортовые различия в % соотношении 3-х изоформ.

Впервые показано селективное взаимодействие лектина пшеницы Саратовская 29 с клетками ассоциативных микроорганизмов Azospirillum brasilense, инокуляция которыми, в свою очередь, вызывала изменения удельной лектиновой активности и показателей роста корней. Наибольшие изменения этих показателей вызывали штаммы Sp 75 и Sp 245, выделенные из корней пшениц. Показано взаимодействие лектина пшеницы с кислым экзополисахаридом (штамм Sp 245) и бактериальными лектинами (Sp 7 и Sp 245), выделенными с

поверхности азоспирилл, в состав которых входит М-ацетил-Б-глюкозамн специфичный углевод для лектина пшеницы.

4. Установлено, что инокуляция штаммом Sp 245 и его мутантами по синтезу ИУ как и различные концентрации экзогенной ИУК, вызывали изменения удельн< лектиновой активности и показателей развития проростков пшеницы. Макс мальные изменения вызывал штамм Sp 245.90 - суперпродуцент ИУК.

5. Впервые показана связь удельной лектиновой активности корней проросло пшеницы под влиянием различных концентраций экзогенной ИУК с содерж нием в корнях эндогенных фитогормонов АБК и ИУК (коэффициенты коррел ции соответственно равны - -0.98 и +0.69).

6. Биологическая значимость лектина корней пшеницы в ассоциации с азоспири лой определяется как его взаимодействием с высокомолекулярными продукт ми метаболизма бактерий, так и его влиянием на баланс эндогенных фитого монов АБК и ИУК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Ignatov V.V., Selivanov N.Yu., Stadnik G.I., Iosipenko O.A. Cereal germ lectins Book of abstr. Int. Lectin Conf. Interlec-IO, Prague, Czechoslovakia - 1988. - P.36

2. Iosipenko O.A., Selivanov N.Yu., Evtushenko I.Ya., Stadnik G.I., Ignatov V. Change of wheat lectin isoform content during seed germination.// Book of abs Int. Lectin Conf. Interlec-11, Tartu, -1989 -P.28.

3. Karpunina L.V., Trikhacheva U.Yu., Nikitina V.E., Stadnik G.I., Iosipenko O. Study of the interaction of Bacillus polymyxa lectins with the wheat root lectin; Book of abstr. Int. Lectin Conf. Interlec-13, Berlin, Germany, -1991 - Part 11. P.2

4. Iosipenko O.A., Kalashnikova E.E., Stadnik G.I., Ignatov V.V. The role of pla lectins in the processes of plant-microorganism interaction.// 8th East. Eur. Syn on Biological N2-fixation, Saratov, Russia, Sept. 22-26,1992, abstr. P.61

5. Иосипенко O.A., Иосипенко А.Д., Стадник Г.И., Игнатов В.В. Изменение 4 зиолого-биохимических показателей проростков пшеницы Саратовская при инокуляции Azospirillum brasilense Sp 245 и его мутантами.// 3 Съезд Bi росс, общества физиологов растений. 24-29 июня 1993 г., С.-Петербург: Тези докл. 1993. Т. 6. С. 592.

Iosipenko O.A., Selivanov N.Yu., Evtushenko I.Ya., Stadnik G.I., Ignatov V.V. Changes of lectin isoform content during seed germination.// Lectins: Biology, Biochemistry and Clinical Biochemistry / Eds. A. Kallikorm, T.C. Bog-Hansen. -Saint Louis: Sigma Chemical Company, 1993. V. 8. Man. 2-51. Iosipenko O.A., Iosipenko A.D., Stadnik G.I., Ignatov V.V. Lectins of wheat seedlings roots in the interactions of plants with bacteria of the genus AzospirillumJI Abstr. of the 1st Eur. Nitrogenfixation Conf., Szeged, Hungary, August 28-September 2, 1994. P. 91.

Ignatov V.V., Antonyuk L.P., Iosipenko A.D., Iosipenko O.A., Selivanov N.Yu., Sergeeva E.I., Stadnik G.I. Interaction between the partners of association "wheat -Azospirillum brasiletise Sp 245".// Abstr. of the NATO Advances Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms, Sarvar, Hungary, September 4-7, 1994. P. 8.

Iosipenko O.A., Iosipenko A.D., Stadnik G.I., Ignatov V.V. The effect of inoculation of wheat seedlings with Azospirillum brasilense Sp 245 and its mutants on some physiological and biochemical characteristics of roots.//Abstr. of the 16th Congr. of Biochemistry and Molecular Biology, New Delhi, India, September 19-22, 1994, V. 2. P. 78.

Игнатов В.В., Антонюк JI.П., Стадник Г.И., Иосипенко А.Д., Иосипенко О.А., Селиванов Н.Ю. Физиолого-биохимические аспекты ассоциативных отношений азоспириллы со злаками.// Тез. докл. 9-го Баховского коллоквиума по азотфик-сации. Москва. 24-26 янв. 1995. С. 6. Ignatov V.V., Stadnik G.I., Iosipenko О.А., Selivanov N. Yu., Iosipenko A.D., Sergeeva E.I. Interaction between the partners of association "wheat - Azospirillum brasilense Sp 245".// Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Physiology, Ecology./ Ed. Fendrik I. - NATO ASI Series. V. 6,- Berlin: SpringerVerlag, 1995. P. 271-278.

Иосипенко O.A., Стадник Г.И., Игнатов В.В. Лектины корней проростков пшеницы в процессах взаимодействия растения с ассоциативными микроорганизмами рода AzospirillumJI Прикладная биохимия и микробиология. 1996. №4. (в печати).