Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние лектина бацилл на цитокиновую активность фагоцитов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние лектина бацилл на цитокиновую активность фагоцитов"

На правах рукописи

ГОРЕЛЬНИКОВА Елена Александровна

ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНА БАЦИЛЛ НА ЦИТОКИНОВУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ

03.00.07 — микробиология 14.00.36 —аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

Саратов — 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный агарный университет им. Н,И. Вавилова»

Научные руководители: доктор биологических наук

Карпунина Лидия Владимировна доктор биологических наук Тихомирова Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич доктор медицинских наук, профессор Дсвдариани Зураб Леванович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

Защита диссертации состоится /с/,^.//// ^ 2006 года в^^часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный агарный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410600, г. Саратов, ул. Театральная пл., 1, Тел./факс (88452) 69-23-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный агарный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколова», 335.

Автореферат разослан М.4 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук у Л.В. Карпунина

/ -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Внимание исследователей к различным аспектам изучения лектинов, относящихся к биологически активным белкам с широким спектром действия, связано с перспективами их использования в биологии и экспериментальной медицине. За последние годы в лектинологии наметился переход от изучения лектинов растительного и животного происхождения к изучению микробных лектинов. Значительно возрос интерес к лектинам, выделенным из непатогенных бактерий (Линевич, 1979; Лахтин, 1992; Никитина 2001; Карпунина, 2002; 2005; Шендеров, Лахтин, 2004). Эта тенденция не случайна: микробные лектины, выделенные из непатогенных бактерий, характеризуются высокой удельной активностью, большим разнообразием по углеводной специфичности и, что немаловажно, малым токсическим действием на макроорганизм. Специфически связываясь с углеводной детерминантой клеточной поверхности, лектины способны не только блокировать воздействие на клетку тех или иных неблагоприятных факторов, но и специфически активизировать внутриклеточные метаболические процессы, т.е. изменять функциональное состояние клеток и тканей (Луцик, 1985; Мухачёва, 2004; Абросимова, 2006). Являясь биологически активными веществами, бактериальные лектины потенциально могут обладать иммуномодулирующими свойствами, что и было показано в работах ряда авторов (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др. 2003; Тихомирова, 2005).

Наиболее актуальным является направление исследований, связанное с изучением провоспалительных цитокинов. Из литературных данных известно, что в иммунном ответе на ряд инфекционных агентов огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с формированием острой фазы воспалительной реакции, опосредованной синтезом провоспалительных цитокинов (Фрейдлин, 1995; Сепиашвили, 2003; Agace, 1993; Yao, 1995). Основными продуцентами провоспалительных цитокинов в организме являются клетки моноцитарно-фагоцитарной системы. Чрезвычайный интерес в настоящее время представляет проблема коррекции иммунного статуса, в том

числе и с участием бактериальных лектинов. Однако, сведений о влиянии лектинов микробного происхождения на продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами в изученной литературе обнаружено не было. Поэтому, исследование влияния лектина Paenibacillus polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов является интересной и актуальной задачей.

Цель работы состояла в исследовании in vivo и in vitro влияния лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами при фагоцитозе бактерий и инфекционном процессе.

Задачи исследования:

1. Изучить синтез провоспалительных цитокинов перитонеальными и альвеолярными макрофагами интактных мышей при фагоцитозе бактерий in vitro,

2. Изучить влияние бактериального лектина Jill P.polymyxa 1460 in vivo на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами мышей при фагоцитозе бактерий.

3. Провести сравнительный анализ действия лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на сшггез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе грамположительных и грамотрицательных бактерий.

4. Исследовать взаимодействие лектина ЛИ P.polymyxa 1460 in vitro с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов и выявить цито кинс и i гтез и ру ю щу ю активность в этих условиях.

5. Оценить цитокиновый статус организма экспериментальных животных при моделировании стафилококковой, эшерихиозной и иерсиниозной инфекции на фоне действия лектина ЛИ P.polymyxa 1460.

Научная новизна

Впервые in vivo и in vitro изучено влияние лектина ЛИ, выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий P.polymyxa 1460, специфичного к галактозамину, глкжуроновой кислоте, фруктозе-1,6-дифосфату, глюкозамину, на синтез провоспалительных цитокинов перитонеальными и альвеолярными макрофагами при фагоцитозе бактерий.

Показано, что введение лектина мышам усиливает синтез макрофагами интерлейкина-1 (ИЛ-1) и фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) при фагоцитозе ш vitro бактерий Staphylococcus aureus 1006 и Escherichia coli Ca 53, но снижает при фагоцитозе Yersinia enterocolitica 295-82.

Установлено снижение содержания ИЛ-1 и ИЛ-б в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой, эшерихиозной, иерсиниозной инфекции и ФНО-а при стафилококковой инфекции на фоне действия лектина.

Показано, что специфическое взаимодействие лектина JHI P.polymyxa 1460 с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов способствует изменению продукции цитокинов.

Практическая значимость

Полученные данные вносят существенный вклад в познание спектра биологической активности бактериальных лектинов и открывают перспективы их возможного использования в биологии и экспериментальной медицине.

По материалам диссертационной работы написаны методические рекомендации для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии «Изучение влияния лектинов бацилл на синтез цитокинов макрофагами» (в соавторстве с Е.И. Тихомировой, О.В. Кочергиной, Е.С. Мухачсвой и JI.B. Карпуниной), рекомендованные учебно-методической комиссией и одобренные Учёным советом биологического факультета СГУ (протокол №2 от 4 ноября 2003 г.)- Материалы диссертационной работы нашли применение при чтении лекций по курсу «Микробиология» для студентов и аспирантов Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова, по курсу «Молекулярная иммунология» для студентов биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Введение лектина ЛИ P.polymyxa 1460 мышам неоднозначно влияет на способность макрофагов к синтезу ИЛ-1, ФНО-а при фагоцитозе ш vitro разных

видов , бактерий: цитокинсннтезирующая активность усиливается при фагоцитозе Б.аигет 1006 и Е.соИ Са 53, но снижается при фагоцитозе У. еШегосо1Шса 295-82.

2. Лектин ЛИ Р.ро1утуха 1460 специфически взаимодействует с .поверхностными структурами альвеолярных и перитонеальпых макрофагов,

изменяя их цитокинсинтезирующую активность.

3. Лектин ЛИ способствует снижению в сыворотке крови мышей ИЛ-1 и ИЛ-б при стафилококковой, эшерихиозной, иерсиниозной инфекции; ФНО-а -при стафилококковой инфекции.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: втором конгрессе «Научная молодёжь на пороге XXI века» (Россия, Томск, 2001); третьем конгрессе «Науки о человеке» (Россия, СГМУ, Томск, 2002); Международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление, Иммунитет» (Россия, Санкт-Петергбург, 2002); первой и второй региональных конференциях молодых учёных: «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Россия, ИБФРМ РАН, Саратов, 2002; 2004); межрегиональной научной конференции молодых учёных и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа (Россия, Саратов, 2003); объединённом иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004); конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2002, 2003, 2004 гг. (СГАУ им. Н.И. Вавилова, Саратов), региональной конференции молодых учёных «Вавиловские чтения - 2005» (Россия, Саратов, 2005); международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Россия, Ульяновск, 2006).

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы, переименованной впоследствии с 20.09.2006 г. в кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины Федерального

государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологически-активных веществ (леюинов) в регуляции метаболизма растений и животных».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, двух глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 123 страницах, иллюстрирована 22 рисунками и содержит 1 таблицу. Список использованных литературных источников включает 148 наименований, в том числе 66 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлся лектин ЛИ, выделенный с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Paenibacillus. polymyxa (Bacillus polymyxa) 1460 (Карпунина, 1993). Культура P.polymyxa 1460 была получена из Чешской коллекции микроорганизмов (СММ). Лектин ЛИ выделяли по методу Л.В. Карпуниной (2002).

В работе использовали бактерии: Staphylococcm aureus 100 б, S.aureus 209-Р, Escherichia coli Са 53, полученные из коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского; E.coli Ol, Yersinia enterocoliiica 295-82, Y.enterocolitica 12» полученные из музея культур микроорганизмов кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».

Перитонеальные макрофаги (ПМФ) забирали из брюшной полости мышей, альвеолярные макрофаги (АМФ) получали из лёгких мышей по общепринятой методике (Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001). В качестве доноров макрофагов использовали беспородных белых мышей-самцов, весом - 18-20 г, возрастом - 2-3 месяца.

Число жизнеспособных макрофагов определяли методом эксклюзии трипанового синего (Лимфоциты:..., 1990; Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001).

При моделировании процесса фагоцитоза in vitro лектин бацилл в концентрации 0,4 мкг/мл вводили мышам внутрибрюшинно по 0,2 мл. Исследования проводили через 1,3,5 и 7 суток после введения лектина.

Провоспалительные цитокины: фактор некроза опухоли а (ФНО-а), интерлейкин 1 (ИЛ-1), интерлейкин 6 (ИЛ-6) определяли с помощью тест-систем иммуноферментных моноклональных, разработанных ГосНИИОЧБ (г. Санкт-Петербург) и производимых фирмами АО «Иммунодиагностика» (г. Санкт-Петербург) и ТОО «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург).

При изучении влияния лектина ЛН in vivo на цитокинсинтезирующую активность макрофагов ФНО-а, ИЛ-1 определяли в среде культивирования АМФ и ПМФ с бактериями через 30 минут, 1, б, 12 и 24 часа фагоцитоза.

Для доказательства специфического взаимодействия лектина ЛН с поверхностью макрофагов Проводили эксперименты с белком, не обладающим лектиновыми свойствами - бычьим сывороточным альбумином (БСА) и с лектином ЛИ (0,004 мкг/мл), блокированным специфичными к нему углеводами (D-галактозамином, глюкуроновой кислотой, фруктозо-1,6-дифосфатом и глюкозамином).

При моделировании инфекционного процесса использовали суточные культуры S.aureus 209-Р, E.coli 01 и Y,enterocolitica 12, Бактерии вводили белым мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно в дозе 5 тыс. кл./мл. Лектин ЛН в концентрации 0,4 мкг/мл вводили белым мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно за 24 часа и через 1 час после заражения. Через 1, 6 и 24 часа мышей умерщвляли

транслокацией шейных позвонков, брали кровь из сердца, получали сыворотку по общепринятой методике (Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001) и определяли в ней содержание провоспалительных цитокинов.

Статистическую обработку результатов производили по общепринятым методам с использованием t-критерия Стьюдента (Ашмарина, Васильев, Амбросов, 1974; Воробьёв, Елсуков, 1989). Также использовали приложение Excel из пакета Microsoft Office 2003.

Влияние лектина ЛИ Paenibacitiuspolymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами при фагоцитозе бактерий Первоначальным этапом наших исследований было изучение влияния in vitro лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез ИЛ-1 и ФНО-а макрофагами в процессе фагоцитоза in vitro грамположительных бактерий S.aureus 1006. Результаты исследований позволили установить, что макрофаги, выделенные из организма мышей через сутки после введения лектина, активнее синтезировали провоспалительные цитокнны, чем контрольные макрофаги из организма интактных мышей. Наибольшая концентрация цитокинов в среде культивирования фагоцитирующих макрофагов наблюдалась к б часам процесса фагоцитоза стафилококка. Отмечено, что перитонеальные макрофаги были более активными в продукции цитокинов, чем альвеолярные. Макрофаги, выделенные из организма мышей на 3 сутки после введения лектина, активно синтезировали ФНО-а через 30 минут, 1 и 6 часов фагоцитоза in vitro бактерий, при этом ПМФ также были более активны в продукции цитокинов, чем АМФ. На 5 сутки после введения лектина содержание ФНО-а было на уровне контроля (для ПМФ) и даже ниже его (для АМФ) к 6 часам инкубации макрофагов с бактериальным клетками. Как в отношении ФНО-а, так и в отношении ИЛ-1, ПМФ проявляли большую цито ки »синтез н рую щую активность. На 7 сутки после введения лектина наблюдалась общая тенденция к снижению синтеза цитокинов макрофагами по сравнению с данными, полученными на 1, 3 и 5 сутки эксперимента (рис. 1).

o.i бы S.auraualOOS

или

«NO -et'

через сутки после введения лектияа ЛИ

ИЛ-1

•но-*-

6,9 боа З.аигашЮОб

вр*!*«,*

•р*МЯ, ч

через 3 суток после введения лектина ЛЫ

ИП-1

»H9>tC

200

О.»«« s.aumwiaos

через 5 суток после введения лектина ЛИ

ярамя, ч

ИП-1

«НО'Ы»

o.se«

S.MteutlOOC ■^—и «играла ПМ»

Вр*1М,Ч

-«omponk пи» —««нтрол» МИФ —iir-ПМ»

через 7 суток после введения лектина Л11

1 в арашч, ч

мнфыш AM* -У>-ПМ» «V*-AM»

Рис. 1. Синтез цитокинов макрофагами мышей при фагоцитозе Змигеиз 1006 в различные сроки после введения лектина ЛП

В связи с отличиями в строении клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток и возможном отличии в их рецепторном аппарате, представляло интерес посмотреть влияние данного лектина на синтез провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1 макрофагами при фагоцитозе грамотрицательных бактерий E.coli Са53 и Y. enter ocolitica 295-82.

В процессе исследований было обнаружено, что через сутки после введения лектина бацилл наблюдалось снижение синтеза ИЛ-1 альвеолярными и перитонеальными макрофагами при фагоцитозе E.coli Са 53. На 3 сутки после введения лектина, синтез ИЛ-1 и ФНО-а перитонеальными макрофагами увеличивался к 6 часам процесса фагоцитоза эшерихий, но был ниже контрольных значений. Через 5 суток после введения лектина концентрация цитокинов в среде культивирования фагоцитирующих клеток была выше контрольных значений на всех стадиях фагоцитоза. На 7 сутки после введения в организм мышей лектина ЛИ альвеолярные макрофаги активнее синтезировали \ ФНО-а, а перитонеальные — ИЛ-1 при фагоцитозе in vitro эшерихий (рис. 2). Было замечено, что цитокинсинтезирующая активность альвеолярных макрофагов была выше, чем перитонеальных во все сроки исследования.

Полученные данные позволили сделать предположение, что увеличение цитокиновой активности макрофагов из организма мышей после введения лектина ЛИ P.potymyxa 1460 может быть объяснено либо непосредственной их стимуляцией путём связывания лектина с соответствующими рецепторами, либо опосредованным взаимодействием лектина с Toll-рецепторами или их структурными аналогами, которые ответственны за активацию синтеза цитокинов.

Сравнение цитокиновой активности макрофагов в процессе фагоцитоза грамположительных и грамотрицательных клеток показало большую эффективность при фагоцитозе S.aureus 1006 на 1 и 3 сутки, в процессе фагоци-

ип-1

12

|10. | '

I 4

I 2

О

♦НО»

ЭОмкн

1ч

ИЛ-1

через сутки после введения лектина ЛН

»НО-иС

20

Е 14 12 | 10 в

| 6 I * " 2

О

-% 17.«

I 1 111 I 16» »

через 3 суток после введения лектина Л11

«1-1 ФИО

через 5 суток после введения лектина ЛИ

ФИО -

ИЛ-1

25 30 13 10 а в

15ч

«омтрвль Г1М* ■ »'"иоитраль ДМ* ■ ¿1—ПМФ • ■ »ц »

ком (роль ММ> "»Л—ПМР —**-АМ»

через 7 суток после введения лектина ЛИ Рис. 2. Синтез цитокинов макрофагами мышей при фагоцитозе Е. соИ Са 53 в различные сроки после введения лектина ЛИ

тоза E.coli Са 53 - на 5 и 7 сутки после введения мышам лектина. При этом перитонеальные макрофаги были более активны в синтезе цитокинов при фагоцитозе стафилококка, а альвеолярные - при фагоцитозе эшерихий.

Аналогичные исследования были проведены и в отношении фагоцитоза Y.enterocolitica 295-82 (рис. 3). Показано, что через сутки после введения мышам лектина, синтез цитокинов макрофагами снижался к 6 часам фагоцитоза in vitro иерсиний, Макрофаги, выделенные на 3 и 5 сутки, обладали сходной активностью цитокинов: концентрация ФНО-а снижалась до уровня контроля к 6 часам процесса фагоцитоза; а содержание ИЛ-1 в среде культивирования АМФ с иерсиниями было ниже контрольных значений. На 7 сутки после введения лектина синтез ФНО-а в процессе фагоцитоза in vitro был ниже контрольных значений (для ПМФ) или на уровне контроля (для АМФ).

При сравнении влияния лектина на синтез цитокинов при фагоцитозе E.coli Са53 и Y.enterocolitica 295-82, можно отметить понижение содержания цитокинов в среде культивирования макрофагов с иерсиниями. Одним из объяснений полученных результатов возможно является наличие в клетках иерсиний Yop белков, которые препятствуют высвобождению ФНО-а макрофагами. С другой стороны, факт снижения содержания цитокинов в среде культивирования макрофагов с Y.enterocolitica 295-82 на завершающих стадиях процесса фагоцитоза, вероятно, может быть связан с аутокринной регуляцией функций макрофагов данными цитокинами при их связывании с зкспрессированными на поверхности в процессе активации рецепторами.

Таким образом, сравнительный анализ влияния лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов в процессе фагоцитоза грамположительных и грам отрицательных бактерий показал, что их содержание зависит от объекта фагоцитоза. Можно сделать предположение, что действие лектина на фагоциты связано не только с особенностями строения клеточной стенки бактерии и наличием факторов патогенности возбудителя, но и со спецификой рецепторных структур.

ИЛ-1

®но-К

30 мин

{-♦-ншрм* ПМ» ■ ■ нащил* »МФ-Ч^-ПМФ)

30 мин

ИЛ-1

через сутки после введения лектина ЛИ

ЭОмян

ь ПИ# —-кдрм АМ» -П-11Ц« *М» |

ИЛ-1

через 3 суток после введения лектина ЛИ

ФИО -

|—^наитрм» пни —«-^«омурдь МЯ> -*>—ПМ> \

через 5 суток после введеншглектина ЛИ

ИЛ-1

Э0МА4

Е

о

через 7 суток после введения лектина ЛИ

Рис. 3. Синтез цитокинов макрофагами мышей при фагоцитозе У.еШегосЫШса 295-82 в различные сроки после введения лектина ЛИ

Исследование специфичности влияния лектина ЛИ ш vitro на синтез

провоспалительных цитокинов С целью подтверждения участия лектина в синтезе цитокинов фагоцитирующими макрофагами in vitro определяли изменение количества цитокиков, продуцируемых фагоцитирующими макрофагами под влиянием лектина ЛП, блокированного специфичными углеводами и под влиянием белка, не обладающего лектиновыми свойствами — бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Одинаковое количество цитокинов, синтезируемых контрольными ГГМФ и ПМФ под действием блокированного лектина, явилось свидетельством специфичного взаимодействия лектина ЛП P.polymyxa 1460 с поверхностными структурами перитонеальных макрофагов. Данное взаимодействие могло быть обусловлено наличием необходимых углеводных гаптенов на поверхности макрофагов для лектина бацилл. Увеличение количества ФНО-а, продуцируемого альвеолярными макрофагами под действием лектина ЛП, блокированного специфичными углеводами, свидетельствовало о том, что на молекулярном уровне лектин ЛП P.polymyxa 1460 помимо специфического взаимодействия с рецепторными структурами альвеолярных макрофагов может участвовать и в различных неспецифических реакциях (рис. 4),

Вконтроль ПМФ оконтроль АШ> v ' Ш Т1МФ + лектнн F1AW3: * ло пгн

Рис. 4. Синтез цитокинов макрофагами лри фагоцитозе Y.enterocolitica 295-82 на фоне действия in vitro лектина ЛП, блокированного смесью углеводов

При изучении влияния на синтез цитокинов белка нелектиновой природы — БСА показано значительное уменьшение синтеза ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а по сравнению с контролем и альвеолярными макрофагами под действием лектина бацилл. Это свидетельствовало о неспецифическом связывании БСА с поверхностью макрофагов.

Представленные отличия в синтезе ФНО-а, ИЛ-1 и ИЛ-6 макрофагами при действии in vitro БСА и лектина ЛП, а также результаты экспериментов по влиянию лектина, блокированного смесью углеводов, показывают возможность специфического связывания лектина ЛП с поверхностными рецепторами макрофагов. Данное специфическое взаимодействие лектина с поверхностными рецепторами макрофагов возможно приводит к изменению метаболизма клеток макрофагов, способствуя их более активному синтезу цитокинов при фагоцитозе S.aureus 1006 и E.coli Са53, а также приводит к снижению цитокинсинтезирующей активности в случае с Y.enterocolitica 295-82.

Влияние лектина ЛИ на цитокиновый статус мышей при моделировании инфекционного процесса В дальнейших экспериментах представляло интерес оценить действие лектина бацилл на содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных при моделировании инфекционного процесса, вызываемого S.aureus 209-Р, E.coli Ol, Y.enterocolitica 12. Было показано, что введение бактериального лектина P.pofymyxa 1460 за 24 часа и через 1 час после заражения изменяет цитокиновый статус экспериментальных животных при моделировании инфекционного процесса. Отмечена тенденция к снижению содержания ИЛ-1 и ИЛ-6 при всех моделируемых инфекциях независимо от схемы введения лектина (рис. 5.). Уменьшение концентрации этих цитокинов было наиболее выражено при эшерихиозной инфекции. При стафилококковой и иерсиниозной инфекции через б и 24 часа после заражения отмечена разная степень снижения содержания цитокинов в зависимости от схемы введения лектина и срока инфекционного процесса. Для ФНО-а отмече-

(¡>НО - о1

ИП-1

160

2 1Ю

1 120

в" то

э ао

1 ее

I ло

й 20

г 0

®но -

время, ч вреия, ч

при моделировании стафилококковой инфекции

МЛ-1

при моделировании эшсрихиозной инфекции

5 Я

5 ео

■ с 60 £ 40

I 30

I И

I 10

* а

ШШшк,

орош, Ч

пЗ.аигоцз 20^

Рбзз Г :*т иОп) пект. О ^ а^'С .' 7С.ЭР ' ' -^.т 1 ч О 3 дтаи? 209-Р* лйкт, 24 ч

и п-е

ео

с 3

1;

¿0

г"

30

! 20

X о Ш

*

С

1т

□ Оеэ

01 + такт. 14

ОЕсоИ 01 □ Е.МО* ■* локт.

оно - 4

ИЛ-1

МЯ-0

н

□ р&ГЛ}, Ч

1 | я го|

" „иШ^,

14

ипо.'.ч), ч

(кц г; Т и V Сп, "С-С';' С.1

ии.цшегосгШсэ ^ - . '.'г 1 ч йУ.йп!ег<жсМ«:а 15 * гкю, 1?

при моделировании иерсиниозной инфекции Рис. 5. Содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей при моделировании инфекционного

процесса на фоне действия лектина

но снижение содержания в сыворотке крови мышей при стафилококковой инфекции независимо от схемы введения лектина. Показано динамическое увеличение содержания ФНО-а при введении лектина за 24 часа до инфицирования Y.enierocolitica 12. При эшерихиозной инфекции увеличение содержания ФНО-а происходило через 1 и 6 часов и зависело от схемы введения лектина (рис. 5). Описание функционирования системы лектин -макрофаг — синтез цитокинов представляется весьма сложной задачей. Во многом этому способствует синергизм действия провоспалительных цитокинов и их аутокринная регуляция самим макрофагом в ответ на проникновение инфицирующих агентов. Анализируя возможные механизмы влияния лектина бацилл на продукцию провоспалительных цитокинов, можно предположить его связывание с рецепторами на поверхности моноцитов/макрофагов, что в свою очередь изменяет синтез этих цитокинов. v

Таким образом, . представленные исследования свидетельствуют о влиянии лектина бацилл на цитокинсинтезирующую активность макрофагов при фагоцитозе бактерий и инфекционном процессе. Вполне возможно с помощью бактериальных лектинов можно осуществлять коррекцию иммунного статуса инфицированных животных на фоне развития тяжёлого патологического процесса. Полученные результаты вносят существенный вклад в представление о биологической активности лектинов микробного происхождения, особенно в отношении клеток иммунной системы.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что лектин ЛИ P.polymyxa 1460 in vivo оказывает влияние на цитокинсинтезирующую способность макрофагов при фагоцитозе S.aureus 1006, E.coti Са 53, Y.eñterocolitica 295-82.

2. Впервые показано, что введение лектина ЛП.в концентрации 0,4 мкг/мл белым мышам усиливает синтез провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-а макрофагами на 1 и 3 сутки при фагоцитозе S.aureus 1006 и на 5 и 7 сутки при фагоцитозе E.coli Са 53.

3. Впервые обнаружено, что лектин бацилл JIIX снижает синтез ШТ-1 и ФНО-а макрофагами при фагоцитозе Y.enterocolitica 295-82 по сравнению с контрольными фагоцитирующими клетками.

4. Выявлены различия в цыто ки н с и нтезир у ю ще й способности перитонеальных и альвеолярных макрофагов на фоке действия лектина ЛП in vivo: ПМФ активнее синтезировали Ш1-1 и ФНО-а, чем АМФ при фагоцитозе S.aurem 1006, а при фагоцитозе E.coli Ca 53 более активными были АМФ.

5. Показано, что изменение цитокинсинтезирую щей активности альвеолярных и перитонеальных макрофагов обусловлено специфическим взаимодействием лектина ЛИ с их поверхностными структурами. При действии лектина ЛП, блокированного специфичными углеводами, цитокин-синтезиругощая активность макрофагов не изменялась по сравнению с контролем. Использование в аналогичных условиях белка нелектиновой природы - БСА значительно уменьшало синтез ИЛ-1, Ш1-6, ФНО-ot по сравнению с контролем и макрофагами под действием лектина.

6. Установлено, что лектин Л11 способствует снижению б сыворотке крови мышей ИЛ-1 и ИЛ-6 при стафилококковой, зшерихиозкой, иерсиниозной инфекции; ФНО-а при стафилококковой инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

L Кочергина О.В., Новосёлова (Горельникоаа) Е.А., Мухачёва Е.С., Тихомирова Е.Й., Карпунина Л.В. Влияние бактериального лектина на активность процесса фагоцитоза и индукцию цитоесинов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Тез. первой региональной конференции молодых учёных, Саратов, 26 - 27 марта 2002. - Саратов, 2002. - С. 34 - 36.

2. Новосёлова (Горельникоза) Е.А., Кочергина О.В., Мухачёва Е.С. Влияние лектина Л II Bacillus polymyxa на индукцию цитокинов // Науки о

человеке: Сб. статей третьего конгресса мол. учёных и специалистов, Томск, 16-17мая2002, —Томск, 2002.-С. 185-186.

3. Кочергина О.В., Новосёлова (Горельникова) Е.А., Мухачёва Е.С. Влияние лектина Л II Bacillus polymyxa 1460 на активность процесса фагоцитоза И Науки о человеке: Сб. статей третьего конгресса мол. учёных и специалистов, Томск, 16-17 мая 2002. - Томск, 2002. - С. 175 - 176.

4. Горельникова Е.А. Тихомирова Е.И.. Кочергина О.В. Рудик Д.В., Мухачёва Е.С. Синтез провоспалительных цитокинов макрофагами мышей при действии лектина Л II Paenibacillus polymyxa 1460 // Актуальные проблемы медицины и биологии: Сб. научных работ, Томск,

2003.-Вып. 2.-С. 106-107.

5. Кочергина О.В., Тихомирова Е.И., Горельникова Е.А., Рудик Д.В., Карпунина Л.В. Изменение фагоцитарной активности макрофагов при действии лектина Л11 Paenibacillus polymyxa 1460 // Актуальные проблемы медицины и биологии: Сб. научных работ, Томск, 2003. — Вып. 2,-С. 112-114.

6. Тихомирова Е.И, Абросимова О.В., Горельникова Е.А., Карпунина Л.В. Особенности фагоцитоза патогенных бактерий и индукция цитокинов на фоне действия бактериального лектина // Russion Journal of Immunology. —

2004.-V.9.-P. 55.

7. Горельникова E.A., Абросимова O.B. Влияние лектина бацилл на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе Yersinia enterocolitica // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Тез. второй региональной конференции мол. учёных, Саратов, 26-28 октября 2004. - Саратов, 2004. - С. 29 - 30.

8. Абросимова О.В., Горельникова Е.А. Анализ активности фагоцитоза энтеропатогенных бактерий на фоне действия лектина Paenibacillus polymyxa ft Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Тез. второй региональной конференции мол. учёных, Саратов, 2628 октября 2004. - Саратов, 2004. - С. 28 - 29.

9. Горельникова Е.А., Абросимова О.В., Тихомирова Е.И., Карпуиина Л.В, Синтез ИЛ-1 и ФНО-а макрофагами мышей на фоне действия бактериального лектина // Успехи современного естествознания, - 2004.— №4.-С. 104-105.

10. Абросимова G.B., Горельникова Е.А., Тихомирова Е.И., Карпунина Л.В. Некоторые аспекты действия бактериального лектина на ф аго цитир у ющ ие макрофаги мышей Н Успехи современного естествознания. - 2004.- №4. - С. 97-98.

11. Горельникова Е.А., Тихомирова В.И., Карпунина Л.В. В л такие лектина Paenibacillus polymyxa на синтез дитокинов при фагоцитозе Yersinia enterocolitica И Вавиловские чтения -- 2005: Материалы конференции, посвященной 11 S-й годовщине со дня ровдения академика Н.И. Вавилова, 23 — 25 ноября 2005, секция ветеринарии и биотехнологии. — Саратов, 2005. - С. 31-34.

12. Горельникова Е.А., Тихомирова Е.И., Карпу к кж Л.В. Цитокинсинтезирующая активность макрофагов в процессе фагоцитоза бактерий при действии лектина РаетЬасШш polymyxa // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2006. - №1. — С. 17-20.

13. Карпунина Л.В., Тихомирова Е.И., Горельникова Е.А. Лектик бацилл в изучении синтеза цитокинов при фагоцитозе некоторых энтеробактерий // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Материалы международной конференции, 21-23 июля 2006, Ульяновск, 2006. - Ульяновск, 2006. - С. 100 - 102.

Подписано в печать 19.10.2006 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 064.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель СерманЮ.Е. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19,51-16-28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горельникова, Елена Александровна

Список условных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лектины и их биологическая активность.

1.2. Цитокины и их основные свойства.

1.2.1. Провоспалительные цитокины.

1.3. Влияние лектинов на индукцию цитокинов.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Объекты исследования.

2.1.2. Выделение, очистка и использование лектина ЛИ РаетЬасШш ро1утуха 1460.

2.1.3. Выделение альвеолярных и перитонеальных макрофагов.

2.1.4. Моделирование процесса фагоцитоза.

2.1.5. Моделирование инфекционного процесса на фоне действия лектина.

2.1.6. Определение провоспалительных цитокинов.

2.1.7. Статистическая обработка результатов.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Определение синтеза провоспалительных цитокинов макрофагами интактных мышей при фагоцитозе бактерий.

2.2.2. Изучение влияния бактериального лектина ЛИ Р.ро1утуха 1460 на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе бактерий.

2.2.3. Исследование взаимодействия лектина ЛИ с поверхностными рецепторами макрофагов и определение цитокинсинтезирующей активности.

2.2.4. Влияние лектина ЛИ на цитокиновый статус мышей при моделировании инфекционного процесса.

2.2.4.1. Влияние лектина ЛИ на цитокиновый статус мышей при моделировании стафилококковой инфекции.

2.2.4.2. Влияние лектина на содержание цитокинов при моделировании эшерихиозной инфекции.

2.2.4.3. Влияние лектина на содержание цитокинов при моделировании иерсиниозной инфекции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние лектина бацилл на цитокиновую активность фагоцитов"

Актуальность работы

Внимание исследователей к различным аспектам изучения лектинов, относящихся к биологически активным белкам с широким спектром действия, связано с перспективами их использования в биологии и экспериментальной медицине. За последние годы в лектинологии наметился переход от изучения лектинов растительного и животного происхождения к изучению микробных лектинов. Значительно возрос интерес к лектинам, выделенным из непатогенных бактерий (Линевич, 1979; Лахтин, 1992; Никитина 2001; Карпунина, 2002; 2005; Шендеров, Лахтин, 2004). Эта тенденция не случайна: микробные лектины, выделенные из непатогенных бактерий, характеризуются высокой удельной активностью, большим разнообразием по углеводной специфичности и, что немаловажно, малым токсическим действием на макроорганизм. Специфически связываясь с углеводной детерминантой клеточной поверхности, лектины способны не только блокировать воздействие на клетку тех или иных неблагоприятных факторов, но и специфически активизировать внутриклеточные метаболические процессы, т.е. изменять функциональное состояние клеток и тканей (Луцик, 1985; Мухачёва, 2004; Абросимова, 2006). Являясь биологически активными веществами, бактериальные лектины потенциально могут обладать иммуномодулирующими свойствами, что и было показано в работах ряда авторов (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др. 2003; Тихомирова, 2005).

Наиболее актуальным является направление исследований, связанное с изучением провоспалительных цитокинов. Из литературных данных известно, что в иммунном ответе на ряд инфекционных агентов огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с формированием острой фазы воспалительной реакции, опосредованной синтезом провоспалительных цитокинов (Фрейдлин, 1995; Сепиашвили,

2003; Agace, 1993; Yao, 1995). Основными продуцентами провоспалительных цитокинов в организме являются клетки моноцитарно-фагоцитарной системы. Чрезвычайный интерес в настоящее время представляет проблема > коррекции иммунного статуса, в том числе и с участием бактериальных лектинов. Однако, сведений о влиянии лектинов микробного происхождения на продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами в изученной литературе обнаружено не было. Поэтому, исследование влияния лектина Paenibacillus polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов является интересной и актуальной задачей.

Цель работы состояла в исследовании in vivo и in vitro влияния лектина Jill P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами при фагоцитозе бактерий и инфекционном процессе.

Задачи исследования:

1. Изучить синтез провоспалительных цитокинов перитонеальными и альвеолярными макрофагами интактных мышей при фагоцитозе бактерий in vitro.

2. Изучить влияние бактериального лектина ЛИ P.polymyxa 1460 in vivo на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами мышей при фагоцитозе бактерий.

3. Провести сравнительный анализ действия лектина ЛИ Р.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе грамположительных и грамотрицательных бактерий.

4. Исследовать взаимодействие лектина ЛИ Р.polymyxa 1460 in vitro с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов и выявить цитокинсинтезирующую активность в этих условиях. .

5. Оценить цитокиновый статус организма экспериментальных животных при моделировании стафилококковой, эшерихиозной и иерсиниозной инфекции на фоне действия лектина ЛИ P.polymyxa 1460.

Научная новизна

Впервые in vivo и in vitro изучено влияние лектина ЛИ, выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий P.polymyxa 1460, специфичного к галактозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозе-1,6-дифосфату, глюкозамину, на синтез провоспалительных цитокинов перитонеальными и альвеолярными макрофагами при фагоцитозе бактерий. Показано, что введение лектина мышам усиливает синтез макрофагами интерлейкина-1 (ИЛ-1) и фактора некроза опухоли-a (ФНО-а) при фагоцитозе in vitro бактерий Staphylococcus aureus 1006 и Escherichia coli Ca 53, но снижает при фагоцитозе Yersinia enterocolitica 295-82.

Установлено снижение содержания ИЛ-1 и ИЛ-6 в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой, эшерихиозной, иерсиниозной инфекции и ФНО-а при стафилококковой инфекции на фоне действия лектина.

Показано, что специфическое взаимодействие лектина ЛИ P.polymyxa 1460 с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов способствует изменению продукции цитокинов.

Практическая значимость

Полученные данные вносят существенный вклад в познание спектра биологической активности бактериальных лектинов и открывают перспективы их возможного использования в биологии и экспериментальной медицине.

По материалам диссертационной работы написаны методические рекомендации для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии «Изучение влияния лектинов бацилл на синтез цитокинов макрофагами» (в соавторстве с Е.И. Тихомировой, О.В. Кочергиной, Е.С. Мухачёвой и Л.В. Карпуниной), рекомендованные учебно-методической комиссией и одобренные Учёным советом биологического факультета СГУ (протокол №2 от 4 ноября 2003 г.). Материалы диссертационной работы нашли применение при чтении лекций по курсу «Микробиология» для студентов и аспирантов Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова, по курсу «Молекулярная иммунология» для студентов биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Введение лектина Jill P.polymyxa 1460 мышам неоднозначно влияет на способность макрофагов к синтезу ИЛ-1, ФНО-а при фагоцитозе in vitro разных видов бактерий: цитокинсинтезирующая активность усиливается при фагоцитозе S.aureus 1006 и E.coli Са 53, но снижается при фагоцитозе Y.enterocolitica 295-82.

2. Лектин ЛИ P.polymyxa 1460 специфически взаимодействует с поверхностными структурами альвеолярных и перитонеальных макрофагов, изменяя их цитокинсинтезирующую активность.

3. Лектин ЛИ способствует снижению в сыворотке крови мышей ИЛ-1 и ИЛ-6 при стафилококковой, эшерихиозной, иерсиниозной инфекции, ФНО-а - при стафилококковой инфекции.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: втором конгрессе «Научная молодёжь на пороге XXI века» (Россия, Томск, 2001); третьем конгрессе «Науки о человеке» (Россия, СГМУ, Томск, 2002); Международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Россия, Санкт-Петергбург, 2002); первой и второй региональных конференциях молодых учёных: «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Россия, ИБФРМРАН, Саратов, 2002; 2004); межрегиональной научной конференции молодых учёных и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа (Россия, Саратов, 2003); объединённом иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004); конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2002, 2003, 2004 гг. (СГАУ им. Н.И. Вавилова, Саратов), региональной конференции молодых учёных «Вавиловские чтения - 2005» (Россия, Саратов, 2005); международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Россия, Ульяновск, 2006).

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы, переименованной впоследствии с 20.09.2006 г. в кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологически-активных веществ (лектинов) в регуляции метаболизма растений и животных».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, двух глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 123 страницах, иллюстрирована 22 рисунками и содержит 1 таблицу. Список использованных литературных источников включает 148 наименований, в том числе 66 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Горельникова, Елена Александровна

108 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что лектин J1II P.polymyxa 1460 in vivo оказывает влияние на цитокинсинтезирующую способность макрофагов при фагоцитозе S.aureus 1006, E.coli С а 53, Y.enterocolitica 295-82.

2. Впервые показано, что введение лектина ЛИ в концентрации 0,4 мкг/мл белым мышам усиливает синтез провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-а макрофагами на 1 и 3 сутки при фагоцитозе S.aureus 1006 и на 5 и 7 сутки при фагоцитозе E.coli Са 53.

3. Впервые обнаружено, что лектин бацилл ЛИ снижает синтез ИЛ-1 и ФНО-а макрофагами при фагоцитозе Y.enterocolitica 295-82 по сравнению с контрольными фагоцитирующими клетками.

4. Выявлены различия в цитокинсинтезирующей способности перитонеальных и альвеолярных макрофагов на фоне действия лектина ЛИ in vivo: ПМФ активнее синтезировали ИЛ-1 и ФНО-а; чем АМФ при фагоцитозе S.aureus 1006, а при фагоцитозе E.coli Са 53 более активными были АМФ.

5. Показано, что изменение цитокинсинтезирующей активности альвеолярных и перитонеальных макрофагов обусловлено специфическим взаимодействием лектина ЛИ с их поверхностными структурами. При действии лектина ЛИ, блокированного специфичными углеводами, цитокин-синтезирующая активность макрофагов не изменялась по сравнению с контролем. Использование в аналогичных условиях белка нелектиновой природы - БСА значительно уменьшало синтез ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а по сравнению с контролем и макрофагами под действием лектина.

6. Установлено, что лектин ЛИ способствует снижению в сыворотке крови мышей ИЛ-1 и ИЛ-6 при стафилококковой, эшерихиозной, иерсиниозной инфекции, и ФНО-а при стафилококковой инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лектинология в настоящее время является одной из интенсивно развивающихся областей современной микробиологии. Использование в медико-биологических исследованиях лектинов растительного происхождения имеет определённые ограничения из-за токсичности, приводящей в ряде случаев к возникновению дизадаптационных изменений внутри клеток и как следствие - к её разрушению, что значительно затрудняет оценку динамики изучаемого процесса (Линевич, 1979, Лахтин, 1992; 1994). В этой связи более перспективным является изучение микробных лектинов, выделенных из непатогенных бактерий (Никитина 2001; 2005; Карпунина, 2002; 2005). Бактериальные лектины, связываясь с поверхностью мембраны и изменяя расположение поверхностных белков и гликопротеинов, потенциально могут обладать иммуномодулирующими свойствами. Поэтому всё большее внимание исследователей уделяется изучение влиянию лектинов на функциональное состояние клеток иммунной системы (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др. 2003; Тихомирова, 2005).

Известно, что провоспалительные цитокины продуцируются, секретируются и действуют через рецепторы на клетках иммунного ответа при развитии острой воспалительной реакции (Сепиашвили, 2003). Контакт с возбудителем является сигналом секреции моноцитами/макрофагами провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-а (Фрейдлин, 1995; Agace, 1993; Yao, 1995). Дезорганизация в системе цитокинового каскада ведёт к серьёзным нарушениям деятельности иммуноцитов, поэтому вовлечение бактериальных лектинов в регуляцию синтеза цитокинов клетками врождённого иммунитета животных имеет важное практическое значение.

Однако, в изученной литературе сведений о влиянии лектинов микробного происхождения на продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами обнаружено не было. В связи с вышеизложенным представляло интерес изучить влияние лектина ЛН Paenibacillus polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами при фагоцитозе бактерий и инфекционном процессе.

Первоначальным этапом наших исследований было изучение влияния in vitro лектина ЛИ P.polymyxa 1460, специфичного к D-галактозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозе-1,6-дифосфату и D-глюкозамину, на синтез ИЛ-1 и ФНО-а макрофагами в процессе фагоцитоза in vitro грамположительных бактерий S.aureus 1006. Результаты данного эксперимента позволили установить, что макрофаги, выделенные из организма мышей через сутки после введения лектина, активнее синтезировали провоспалительные цитокины, чем контрольные макрофаги из организма интактных мышей. Наибольшая концентрация цитокинов в среде культивирования фагоцитирующих макрофагов наблюдалась к 6 часам процесса фагоцитоза стафилококка. Отмечено, что перитонеальные макрофаги были более активными в продукции цитокинов, чем альвеолярные. Макрофаги, выделенные из организма мышей на 3 сутки после введения лектина, активно синтезировали ФНО-а через 30 минут, 1 и 6 часов фагоцитоза in vitro бактерий, при этом ПМФ также были более активны в продукции цитокинов, чем АМФ. На 5 сутки после введения лектина содержание ФНО-а было на уровне контроля (для ПМФ) и даже ниже его (для АМФ) к 6 часам инкубации макрофагов с бактериальным клетками. Как в отношении ФНО-а, так и в отношении ИЛ-1, ПМФ проявляли большую цитокинсинтезирующую активность. На 7 сутки после введения лектина наблюдалась общая тенденция к снижению синтеза цитокинов макрофагами по сравнению с данными, полученными на 1, 3 и 5 сутки эксперимента.

В связи с отличиями в строении клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток и возможном отличии в их рецепторном аппарате, представляло интерес посмотреть влияние данного лектина на синтез провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1 макрофагами при фагоцитозе грамотрицательных бактерий E.coli Са53 и Y.enterocolitica 295-82.

В процессе исследований было обнаружено, что через сутки после введения лектина наблюдалось снижение синтеза ИЛ-1 альвеолярными и перитонеальными макрофагами при фагоцитозе E.coli Са 53. На 3 сутки после введения лектина, синтез ИЛ-1 и ФНО-а перитонеальными макрофагами увеличивался к 6 часам процесса фагоцитоза эшерихии, но был ниже контрольных значений. Через 5 суток после введения лектина концентрация цитокинов в среде культивирования фагоцитирующих клеток была выше контрольных значений на всех стадиях фагоцитоза. На 7 сутки после введения в организм мышей лектина ЛИ перитонеальные макрофаги активнее синтезировали ФНО-o, альвеолярные - ИЛ-1 при фагоцитозе in vitro эшерихий. Было замечено, что цитокинсинтезирующая активность альвеолярных макрофагов была выше, чем перитонеальных во все сроки исследования.

Полученные данные позволили сделать предположение, что увеличение цитокиновой активности макрофагов из организма мышей после введения лектина ЛИ P.polymyxa 1460 может быть объяснено либо непосредственной их стимуляцией путём связывания лектина с соответствующими рецепторами, либо опосредованным взаимодействием лектина с То11-рецепторами или их структурными аналогами, которые ответственны за активацию синтеза цитокинов.

Сравнение цитокиновой активности макрофагов в процессе фагоцитоза грамположительных и грамотрицательных клеток показало большую эффективность при фагоцитозе S.aureus 1006 на 1 и 3 сутки, в процессе фагоцитоза E.coli Са 53 - на 5 и 7 сутки после введения мышам лектина. При этом перитонельные макрофаги были более активны в синтезе цитокинов при фагоцитозе стафилококка, а альвеолярные - при фагоцитозе эшерихий.

Аналогичные исследования были проведены в отношении фагоцитоза Y.enterocolitica 295-82. Показано, что через сутки после введения мышам лектина, синтез цитокинов макрофагами снижался к 6 часам фагоцитоза in vitro иерсиний. Макрофаги, выделенные на 3 и 5 сутки, обладали сходной активностью цитокинов: концентрация ФНО-а снижалась до уровня контроля к 6 часам процесса фагоцитоза, а содержание ИЛ-1 в среде культивирования альвеолярных макрофагов с иерсиниями было ниже контроля. На 7 сутки после введения лектина синтез ФНО-а в процессе фагоцитоза in vitro был ниже контрольных значений (для ПМФ) или на уровне контроля (для АМФ).

При сравнении влияния лектина на синтез цитокинов при фагоцитозе E.coli Са53 и Y.enterocolitica 295-82, можно отметить понижение содержания цитокинов в среде культивирования макрофагов с иерсиниями. Одним из объяснений полученных результатов возможно является наличие в клетках иерсиний Yop белков, которые препятствуют высвобождению ФНО-а макрофагами. С другой стороны, факт снижения содержания цитокинов в среде культивирования макрофагов с Y.enterocolitica 295-82 на завершающих стадиях процесса фагоцитоза, вероятно, может быть связан с аутокринной регуляцией функций макрофагов данными цитокинами при их связывании с экспрессированными на поверхности в процессе активации рецепторами.

Таким образом, сравнительный анализ влияния лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов в процессе фагоцитоза грамположительных и грамотрицательных бактерий показал, что их содержание зависит от объекта фагоцитоза. Можно сделать предположение, что действие лектина на фагоциты связано не только с особенностями строения клеточной стенки бактерии и наличием факторов патогенности возбудителя, но и со спецификой рецепторных структур.

С целью подтверждения участия лектина в синтезе цитокинов фагоцитирующими макрофагами in vitro определяли изменение количества цитокинов, продуцируемых фагоцитирующими макрофагами под влиянием лектина ЛИ, блокированного специфичными углеводами; и под влиянием белка, не обладающего лектиновыми свойствами - бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Одинаковое количество цитокинов, синтезируемых контрольными ПМФ и ПМФ под действием блокированного лектина, явилось свидетельством специфичного взаимодействия лектина Jill P.polymyxa 1460 с поверхностными структурами перитонеальных макрофагов. Данное взаимодействие могло быть обусловлено наличием необходимых углеводных гаптенов на поверхности макрофагов для лектина. Увеличение количества ФНО-а, продуцируемого альвеолярными макрофагами под действием лектина, блокированного специфичными углеводами, свидетельствовало о том, что на молекулярном уровне лектин Jill P.polymyxa 1460 помимо специфического взаимодействия с рецепторными структурами альвеолярных макрофагов может участвовать и в различных неспецифических реакциях.

При изучении влияния на синтез цитокинов белка нелектиновой природы - БСА показано, что он значительно уменьшал синтез ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-oí по сравнению с контролем и с альвеолярными макрофагами под действием лектина, что свидетельствует о неспецифическом связывании БСА с поверхностью макрофагов.

Представленные отличия в синтезе ФНО-а, ИЛ-1 и ИЛ-6 макрофагами при действии in vitro БСА и лектина, а также результаты экспериментов по влиянию лектина, блокированного смесью углеводов, показывают возможность специфического связывания лектина ЛИ с поверхностными рецепторами макрофагов. Данное специфическое взаимодействие возможно приводит к изменению метаболизма клеток макрофагов и способствует более активному синтезу цитокинов при фагоцитозе S.aureus 1006 и E.coli Са53, и снижению цитокинсинтезирующей активности в случае фагоцитоза Y.enterocolitica 295-82.

В дальнейших экспериментах представляло интерес оценить действие лектина бацилл на содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных при моделировании инфекционного процесса изучаемыми бактериями. Результаты данных исследований показали, что введение бактериального лектина Р.ро1утуха 1460 изменяет цитокиновый статус экспериментальных животных: отмечена тенденция к снижению содержания ИЛ-1 и ИЛ-6 при всех моделируемых инфекциях независимо от схемы введения лектина. Уменьшение концентрации этих цитокинов было наиболее выражено при эшерихиозной инфекции.

При стафилококковой и иерсиниозной инфекции через 6 и 24 часа после заражения отмечена разная степень снижения содержания цитокинов в зависимости от схемы введения лектина и срока инфекционного процесса. Для ФНО-а отмечено снижение содержания в сыворотке крови мышей при стафилококковой инфекции независимо от схемы введения лектина. Показано динамическое увеличение содержания ФНО-а при введении лектина за 24 часа до инфицирования У.еШегосоПИса 12. При эшерихиозной инфекции увеличение содержания ФНО-а происходило через 1 и 6 часов и зависело от схемы введения лектина.

Описание функционирования системы лектин - макрофаг - синтез цитокинов представляется весьма сложной задачей. Во многом этому способствует синергизм действия провоспалительных цитокинов и их аутокринная регуляция самим макрофагом в ответ на проникновение инфицирующих агентов. Анализируя возможные механизмы влияния лектина бацилл на продукцию провоспалительных цитокинов, можно предположить его связывание с рецепторами на поверхности моноцитов/макрофагов, что в свою очередь, изменяет синтез этих цитокинов.

Таким образом, представленные исследования свидетельствуют о влиянии лектина бацилл на цитокинсинтезирующую активность макрофагов при фагоцитозе бактерий и инфекционном процессе. Вполне возможно с помощью бактериальных лектинов можно осуществлять коррекцию иммунного статуса инфицированных животных на фоне развития тяжёлого патологического процесса. Полученные результаты вносят существенный вклад в представления о биологической активности лектинов микробного происхождения, особенно в отношении клеток моноцитарно-фагоцитарного звена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горельникова, Елена Александровна, Саратов

1. Абросимова О.В., Тихомирова Е.И., Карпунина JÏ.B. Изучение функциональной активности макрофагов на фоне действия лектина Paenibacillus polymyxa II Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2006. - №1. - С. 3 - 6.

2. Ашмарин И.П., Васильев H.H., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. JL: Ленинград, ун-т, 1974.-76 с.

3. Балаболкин И.И., Намазова Л.С., Ковальчук Л.В., Иванов В.Г., Осмоновская C.B., Зябкина А.Г. Интерлейкины-1 и 2 в патогенезе бронхиальной астмы у детей // Иммунология. 1994. -№1. - С. 33-36.

4. Билалов Ф.С., Туйгунов М.М., Габидуллин З.Г., Мамбетова Э.Ф., Аминев P.A. Escherichia coli у иммунокомпрометированных лиц // Медицинская иммунология. 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 332-333.

5. Богдашин И.В., Дыгай A.M., Шерстобаев Е.Ю, Шахов В.П., Гольдберг Е.Д. Роль тимуса в регуляции синтеза цитокинов клетками костного мозга при стрессе//Иммунология. 1991.-№5.-С. 30-32.

6. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Голкочева Е. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002. - №1. - С. 84-90.

7. Васильева Г.И., Иванова И.А., Тюкавкина С.Ю. Цитокины общая система гомеостатической регуляции клеточных функций // Цитология. - 2001. - Т. 43, №12. - С. 1101-1111.

8. Васильева Г.И., Иванова И.А., Тюкавкина С.Ю Кооперативное взаимодействие моно- и полинуглеарных фагоцитов опосредованное моно-и нейтрофилокинами // Иммунология. 2000. - № 5. - С. 11-16.

9. Васильева Г.И., Иванова И.А., Киселёва А.К., Дорошенко Е.П., Беспалова И.А. Монокин- и нейтрофилокининдуцирующая активность первой фракции чумного микроба // Биотехнология. 2002. - №2. - С. 12-19.

10. Витковский Ю.А. Блокировка интерлейкина 4 и 10 изменяет гемостатические свойства лимфоцитов // Иммунология. 1999. - №5. - С. 20-23.

11. Воробьев В.Я., Елсуков А.И. Теория и эксперимент. Минск: Выща шк., 1989.- 109 с.

12. Вядро М.М. Цитокины и их роль в патогенезе и терапии инфекций // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т. 35, №9. - С. 12-14.

13. Городечный П.П., Зурочка A.B., Гриценко В.А., Кузбмина Е.Е. Анализ влияния факторов персистенции S.aureus на продукцию цитокинов лейкоцитами периферической крови условно-здоровых лиц //Медицинская иммунология. 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 259-260.

14. Горудко И.В., Тимошенко A.B. Действие сигнальных ингибиторов на выход лизоцима из нейтрофилов человека, активированных лектином из коры бузины чёрной (Sambucus nigra) // Биохимия. 2000. - Т.65, №8. -С. 1107 -1113.

15. Горячева Л.Г., Ботвиньева В.В., Романцов М.Г. Применение циклоферона в педиатрии: пособие для врачей. М.: СПб., 2003. - 112 с.

16. Громыхина Н.Ю. Участие стволовой кроветворной клетки в механизмах иммуностимулирующего эффекта интерлейкина-1 у мышей // Иммунология. 1995. -№2. - С. 29-31

17. Долгушин И.И. Матер. 7 Всерос. Общ. эпидемиол. микробиол. и паразитол. -М, 1997.-Т.2-С. 87-88.

18. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.:Медицина, 1985 -240 с.

19. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы общей патологии. СПб.: Элби, 2001. -624 с.

20. Зубов С.Г., Окулов В.Б. Молекулярные механизмы действия фактора некроза опухолей а и трансформирующего фактора роста ß в процессе ответа макрофага на активацию // Иммунология. 2001. - №5. - С. 18-21.

21. Карпунина Л.В., Вишневецкая O.A., Никитина В.Е., Мельникова У.Ю. Лектины Bacillus polymyxa: локализация, участие во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология. 1993. Т. 62, №2. - С. 307 - 313.

22. Карпунина Л.В. Роль агглютинирующих белков азотфиксирующих бацилл и ризобий в жизнедеятельности бактерий и при взаимодействии с растениями: Дис.док. биол. наук. Саратов, 2002. - 315 с.

23. Карпунина Л.В. Роль агглютинирующих белков ризобий и азотфиксирующих бацилл при взаимодействии с растениями // В кн.: Молекулярные основы взаимодействий ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2005. - С.98 - 117.

24. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьёв A.A. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб.: Гиппократ, 1992. 256 с.

25. Коваленко Э.А. Внеклеточные лектины бактерий // Микробиологический журнал. 1990. -Т.52, №3. - С. 240-241.

26. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция // Иммунология. 1995. - № 1. - С. 4 - 7.

27. Ковальчук Л.В., Соболев Б.Н., Ганковская Л.В., Юдин A.A. Анализ молекулярного взаимодействия в системе: IL-Iß IL-IRA - IL-1R // Иммунология. - 2001. - № 1. - С. 6 - 10.

28. Ковальчук JI.B., Хореева М.В., Иванюшко Т.П. Комплекс естественных иммунопептидов в лечении раневого процесса // В кн.: I съезд иммунологов России: Тез. докл. Новосибирск, 1992. - С. 220.

29. Козлов В.А., Громыхина Н.Ю. Интерлейкин-1: роль в иммунитете // Иммунология. 1987. - №4. - С. 24-30.

30. Козлов В.А. Некоторые аспекты проблемы цитокинов // Цитокины и воспаление. 2002. - №1. - С. 5-8.

31. Кондратьева И.А., Воробьёва И.В., Буракова О.В. Практикум по иммунологии: Учебное пособие / Под ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова М.: МГУ, 2001. - 224 с.

32. Костюшко A.B., Маркелова Е.В. К вопросу о влиянии возбудителя пневмонии на Т-клеточную дихотомию // Медицинская иммунология. -2006.-Т. 8, №2-3.-С. 147-148.

33. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1980.-496 с.

34. Курлович H.A., Тимочко В.Р., Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Варницына В.В., Паромова Я.И. Уровень цитокинов плазмы крови при стафилококковой инфекции // Медицинская иммунология. 2006. - Т. 8, №2-3.-С. 276.

35. Лахтин В.М. Лектины регуляторы метаболизма // Биотехнология. - 1986. -№6.-С. 66-72.

36. Лахтин В.М. Лектины в исследовании белков и углеводов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология / ВИНИТИ, 1987. Т.2. - 288 с.

37. Лахтин В.M. Специфичность лектинов микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. - Т.28, №4. - С. 483 - 501.

38. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Молекулярная биология. 1994. - Т.28, №2. - С. 245 - 273.

39. Лахтин В.М. Роль белков с лектиновыми свойствами в функционировании системы комплемента // Цитокины и воспаление. 2002 - Т. 1, № 2. - С. 1112.

40. Лимфоциты: методы: Пер с анг. / Под ред. Дж. Клауса. М.: Мир, 1990. -393 с.

41. Линевич Л.И. Лектины и углевод-белковое узнавание на разных уровнях организации живого // Успехи биологической химии. М. - 1979. - Т.20. -С. 71-94.

42. Луцик М.Д., Панасюк E.H., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Вища шк., 1981. -156 с.

43. Луцик М.Д. Лектины: Биологические свойства и применение в гистохимии // Биохимия человека и животных. 1985. - Вып. 9. - С. 69-76.

44. Луцик А.Д., Детюк Е.С., Луцик М.Д. Лектины в гистохимии. Львов: Вища шк., 1989.- 112 с.

45. Ляшенко A.A., Уваров A.A. К вопросу о систематизации цитокинов // Успехи современной биологии.-2001.-Т. 121, №6.-С. 589-603.

46. Мальцева H.H. Активность азотфиксации и азотфиксирующие микроорганизмы ризосферы озимой ржи // Микробиологический журнал. -1992.-Т. 54, №6.-С. 10-16.

47. Мастериак Т.Б. Адыовантные свойства и влияние иммуномодуляторов на активность 5'- нуклеотидазы макрофагов // Иммунология. 1994. - №4. - С. 23 -26.

48. Мельникова У.Ю. Лектины Bacillus polymyxa: физико-химические и биологические свойства: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 2000. - 120 с.

49. Мухачёва Е.С. Влияние лектина Paenibacillus polymyxa на некоторые метаболические процессы животных: Дис.канд. биол. наук. Саратов, 2004.- 139 с.

50. Никитин Д.И., Васильева Л.В., Лохмачева Р.А. Новые и редкие формы почвенных микроорганизмов. М.: Наука, 1966. - С. 38-40.

51. Никитина В.Е., Итальянская Ю.В., Карпунина Л.В. Изучение роли гемагглютининов (лектинов) почвенных азотфиксирующих бактерий // Учёные записки Тартуского университета, 1989. Т.2. - С. 25-31.

52. Никитина В.Е. Лектины азоспирилл: свойства, биологическая активность и перспективы их практического применения: Дис.док. биол. наук. -Саратов, 2001.-317 с.

53. Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Бугаева И.О., Пономарёва Е.Г., Тихомирова Е.И. Лектины в иммунологии: науч.-информ. пособие. -Саратов, 2001.-28 с.

54. Никонова М.Ф., Кондратенко И.В., Кузьмина Е.Г., Ярилин А.А., Хахалин Л.Н., Шахтарина C.B. Фенотипическая характеристика лимфоцитов крови с помощью определения рецепторов к лектинам // Иммунология. 1991. - № 5.-С. 27-30.

55. Петров Р.В., Павлюк A.C. Ковальчук JI.B., Заречнева Н.В., Ульянова Т.Ю. Константинова A.A. Интерлейкинзависимые иммунодефициты человека // Иммунология. 1987. - № 4. - С. 20-24.

56. Пол У., Сильверстайн А., Купер М. Иммунология. М.: Мир, 1987-1988. -Т.1.-476 с.

57. Пономарёва Е.Г. Биологическая активность бактерий рода Azospirillum: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 1997. - 105 с.

58. Попова О.В., Гультяев М.М., Шепелева Т.К., Ющук Н.Д. Влияние иерсиниозной инфекции на основные показатели клеточного иммунитета // Медицинская иммунология. 2004. - Т. 6, № 3-5. - С.327.

59. Потапнев М.П. B-лимфоциты. Цитокинобразующая функция // Иммунология. 1994. - №4. - С.4 - 8.

60. Редайтене Э., Тамулявичене И. Влияние некоторых противоревматических препаратов на образование интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли a in vitro II Иммунология. 1997. - №3. - С. 28 - 34.

61. Рябинченко Е.В., Веткова Л.Г., Бондаренко В.М. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов // Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. 2003. -№3. - С. 98-105.

62. Сепиашвили Р.И. Основы физиологии иммунной системы. М.: Медицина-Здоровье, 2003. - 240 с.

63. Симбирцев A.C. Биология семейства интерлейкина-1 человека // Иммунология.- 1998.-№3,-С. 9-17.

64. Симбирцев A.C. Новые подходы к клиническому применению рекомбинантного ИЛ-1/3 человека // Иммунология. 1998а. - №6. - С. 44-45.

65. Симбирцев A.C. Новые подходы к применению рекомбинантного ИЛ-1/3 человека // Медицинская иммунология. 1999. - Т. 1, № 1-2. - С. 141-146.

66. Симбирцев A.C. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма//Цитокины и воспаление.-2002.- Т.1, №1.- С. 9-16.

67. Симбирцев A.C. Клиническое применение препаратов цитокинов // Иммунология. 2004. - № 4.- С. 247-251.

68. Соболева Е.Ф. Адгезины Rhizobium leguminosarum 252 и их роль во взаимодействии с растениями: Дис. канд. биол. Наук. Саратов, 1998 -114 с.

69. Тихомирова Е.И., Заднова С.П., Волох O.A., Карпунина JT.B., Щербаков A.A. Лектин вакцинного штамма Yersinia pestis EV и изучение его иммунобиологических свойств // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2003.-№ 1.-С. 51-55.

70. Тихомирова Е.И. Эколого-иммунологические аспекты резистентности при инфекции и иммунизации (экспериментальные исследования на моделях лабораторных и диких грызунов): Дис. док. биол. наук. Саратов, 2005. -420 с.

71. Тотолян A.A., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы I И. СПб.: Наука, 2000. -231 с.

72. Фрейдлин И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети // Иммунология. 1995. - №3. - С. 44 - 48.

73. Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции // Иммунология. 2001. - №5. - С. 4 - 7.

74. Фрейдлин И.С., Тотолян A.A. Клетки иммунной системы III IV. СПб.: Наука, 2001. -390 с.

75. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. - Т.4, №3. - С. 248-266.

76. Шендеров Б.А., Лахтин В.М. Лектины новая потенциальная категория физиологически активных функциональных пищевых ингредиентов // Вестник восстановительной медицины. - 2004. - №1. - С. 33 - 37.

77. Ярилин A.A. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. 608 с.

78. Agace W., Hedges S., Andersson H., Andersson J., Ceska M., Svanborg C. Selective cytokine production by epithelial cells following to Escherichia coli II Infect. Immun. 1993. -V. 61, № 2. - P. 602-609.

79. Arai K., Lee F., Miyajima A., Miyotake S., Arai N., Yokota T. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses // Annual. Rev. Biochem. -1990.-V.59.-P. 783-836.

80. Arend W.P. Malyak M, Guthridge C.J, Gabay C. Interleukin-1 receptor antagonist: Role in biology // Annu. Rev. Immunol. 1998. - V. 16. - P. 27-55.

81. Bach F.H., Alter B.J., Solliday S,Zoschke DC, Janis M. Lymphocyte reactivity in vitro. II. Soluble reconstituting factor permitting response of purified lymphocyte // Cell. Immunol. 1970. - V. 1. - P. 219-227.

82. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Ed. C. Garrity. Springer N.Y., 2001.-V.l.-776 p.

83. Beuscher H.U., Rodel F., Forsberg A., Rollinghoff A. Bacterial evasion of host immune defense: Yersinia enterocolitica encodes a suppressor for tumor necrosis factor alpha expression // Infect. Immun. 1995. - V. 63, № 4. - P. 1270-1277.

84. Billian A. Cytokine Grouth Facor Rev. 1996. - V.7. - P. 25 - 34.

85. Boland A., Cornelis G.R. Role of YopP in suppression of tumor necrosis factor alpha release by macrophages during Yersinia infection // Infect Immun 1998. -V. 66.-C. 1878-1884.

86. Boyden S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antygen on polymorpho-nuclear leukocytes // J. Exp. Med. 1962. - V.l 15. - P. 453-466.

87. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V.72, №5. - P. 248 - 254.

88. Brightbill H., Modlin R. Toll-like receptors: molecular mechanisms of the mammalian immune response // Immunology. 2000. - V. 101. - P. 1-10.

89. Chomarat p., Vannier E., Deshanet I., Rissoan M., Banchereau I. Balance IL-1 receptor antagonist / IL-ljS in rheumatoid synovium and ids regulation by IL-4 and IL-10// Immunology.- 1995. -V. 154.-P. 1432-1437.

90. Collier W' de Miranda. Bacterien-haemagglutination // J. Microbiol. Serol. -1955.-V.21.-P. 133-140.

91. Cvetkovic J., Wallberg-Johnson S., Stegmayr B. Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis are associated with polymorphisms of TNF-alpha, IL-1 beta, and Il-IRa genes // J. Rheumatol. 2002. - V. 29. - P. 212-219.

92. De Ley J. DNA Base Composition, Flagellation and Taxonomy of the Genus Rhizobium I I J. Gen Microbiol. 1965. - V. 41. - P. 85-91.

93. Dobereiner J. Phisiological aspects of N2 fixation by grass-bacteria assotiations // In Resent developments in Nitrogen Fixanion. London: Academic Press. - 1977. -P. 513-522.

94. Eshdat Y., Sharon N. Recognitory bacteriol sarface lectins whish mediate its mannose-specific adherense to eucaryotio Cells // Biol. cell. 1984. - V.51- P. 259-266.

95. Fernandez-Botran R., Chiltron P., Ma Y. Soluble cytokine receptors: their role in immunoregulation, disease and therapy // Adv. Immunol. 1996. - V. 63. - P. 269-336.

96. Fontana A., McAdam K., Kristensen F., Weber E. Biological and biochemical characterization of an interleukin 1-like factor from rat C6 glioma cells // Eur. J. Immunol. 1983. - V.13. - P. 685-689.

97. Gilboa-Garber N. Possible application of Pseudomonas aeruginosa leclins // Avsstacts 8-th International congress of baceriology and applied microbiology division, 18-23 August, 1996. Ierusalim, Israel. - 1996. - 92 p.

98. Gol-Winkler R. Parakrine action of transforming growth factors I I Clin. Endocriol. Metab. 1986. - V. 15. - P. 99-115.

99. Guyot G. Uber die bakterille Haemagglutinayion // Azbl. Bakt., 1. Abt. Orig. -1908.-V.47.-P. 640-653.

100. Hanson D., Murphy P. Demonstration of interleukin 1 activity in apparently homogeneous specimens of the pi 5 form of rabbit endogenous pyrogen // Infect. And Immun. 1984. - V.45. - P. 483-490.

101. Henderson B., Poole S., Wilson M. Bacterial modulins: a novel class of virulence factors, which cause host tissue pathology by inducing cytokine synthesis//Microbiol. Rev. 1995.-V. 60.- P. 316-341.

102. Hou L., Sasaki H., Stashenko P. Toll-Like Receptor 4-Deficient Mice Have Reduced Bone Destruction following Mixed Anaerobic Infection // Infect. Immun. 2000. - 68(8). - P. 4681-4687.

103. Hubbard S.R. Structural analysis of receptor tyrosine kinases // Prog. Bioph. Mol. Biol. 1999. - V. 71. - P. 343-358.

104. Hunter C., Chizzoniter R., Remington J. IL-10 is required for IL-12 to induce production of IFN-y by NK cells: role for IL-1/3 in the T-cell-independed mechanism of resistance against intracellular pathogens // J. Immunol. 1995. -V. 155.-P. 4347-4354.

105. Hari Y., Urwyler A., Hurni M., Yawalkar N., Dahinden C., Wendland T., Braathen. Distinct serum cytokine levels in drug and measles-induced exanthema // Int Arch Allergy Immunol. 1999. - V. 120, №3. -P. 225-229.

106. Kawakami K., Qureshi M.H., Koguchi Y., Zang T., Okamura H., Kurimoto M., Saito A. Role of TNF-a in Induction of Fungicidal Activity of Mouse

107. Peritoneal Exudate Cells against Cryptococcus neoforrmans by IL-12 and IL-18 // Cellular Immunology. 1999. - V. 93. - P. 9-16.

108. Kocourek J., Horejsi V. Lectins: Biology, Biochememistry, and Clinical Biochemistry// Ed. T.C Bog-Hansen. Berlin, New York: Walter de Gruyter. -1983.-V.3.- P. 3-6.

109. Kohyama T., Liu X., Wen F., Kobayashi T., Fang Q., Ade S., Cieslinski L., Barnette M.S., Rennard S.I. Cytokines modulate cilomilast response vin lung fibroblaste // Cellular Immunology. 2004. - V. 111. - P. 297-302.

110. Kraus R„ Ludwig S. Uber Bakterienhaemagglutinine und Antihaemagglutinine // Wiener Klinische Wochenschrift. 1902. - V.15. - P. 120.

111. Kurosaka K., Watanable N., Kobayashi Y. Production of Proinflammatory Cytokines by Resident Tissue Macrophages after Phagocytosis of Apoptotic Cells // Cellular Immunology. 2001. - V. 211. - P. 1-7.

112. Lam C.W.K., Wong C.K. Cytokines and chemokines as markers of acute infection // Clinical Laboratory International. 2006. - V. 30, № 1. - P. 16-19.

113. Lord P., Wilmoth L., Mizel S.B., McCall C.E. Expression of interleukin-1 alpha and beta genes by human blood polymorphonuclear leukocytes // J. Clin. Invest.- 1991. V.87. -P. 1312-1321.

114. Matthysse A., Gurlist R.H. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumefaciens during attachment to carrot cells // Y. Bacteriol. 1988. - V.145. - P. 586-595.

115. Malyak M.F., Smith J., Abel A.A., Hance K.R., Arend W.P. The Differential Production of Three Forms of IL-1 Receptor Antagonist by Human Neutrophils and Monocytes // J.Immunol. 1998. - V. 161. - P. 2004-2010.

116. Moore A.W., Becking Z.H. Nitrogen fixation by Bacillus strains isolated from Nigerian soils //Nature (London). 1963. -V. 198. - P. 915-916.

117. Ofek I., Goldhar J., Keisari Y. and Sharon N. Nonopsonic Phagocytosis of Microorganisms // Annual Review of Microbiology. 1995. - V. 49, №10. -P. 239-276.

118. Ogaard A., Biork K., Bukholm G., Berdal B. Correlation betuen adhesion of Pseudomonas aeruginosa bacteria to cell surface and the presence of some factors related to virulence // Acta path. Microbiol., Immunol. Scand. 1985. Sect. B. -P. 1203-1117.

119. Oppenheim J., Feldman M. Cytokine Refefence. London: Academic Press, 2000.-2015 p.

120. Paul W.E. Pleiotropy and redundancy: T cell-derived lymphokines in the immune response // Cell. 1989. - V.54. - P. 521-524.

121. Rappolee D.A., Mark D., Banda M.J., Werb Z. Would macrophages express TGF-a and other growth factor in vivo: analysis by mRNA phenotyping // Science. 1988.-V. 241. - P. 708-712.

122. Ress R.C. Cytokines: their role in regulating immunity and the response to infection // Rev. Med. Microbiol. 1992. - V.3. - P. 9-14.

123. Sarcer M.R., Neyt C., Stainier I., Cornelis G The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD // J. Bacteriol. 1998. -V. 180.- P. 1207-1214.

124. Sauder D.N., Dinarello C.A., Morhenn V.B. Langerhans cell production of interleukin-1 // J. Imvest. Derm. 1984. - V.82. - P. 605-607.

125. Sharief M.K., Henteges R. Association between tumor necrosis factor-alpha and disease progression in patients with multiple slerosis // New Engl. J. Med. -1991.-V. 325.-P. 467-472.

126. Sharon N., Eshdat Y., Silverblatt F., Ofek I. Bacterial adherence to cell surface sugars // Adhesion and Microorganisms Pathogenecity. London: Pitmann Press, 1981.-P. 119-134.

127. Sibille V., Reynolds H. State of the art: macrophages and polymorphonuclear neutrophils in lung defence and injury // Amer. Rev. Respir. Dis. 1990. -V. 141.-P. 471-501.

128. Smith R.S. Is schizophrenia caused by excessive production of interleukin-2 and interleukin-2 receptor by gastrointestinal lymphocytes? // Med. Hypothesis. -1991.-V. 34.-P. 225-229.

129. Smith R.S. The cytokine theory of headache // Med. Hypotheses. 1992a. -V. 39. - P. 168-174.

130. Smith R.S. A comprehensive macrophage-T-lymphocyte theory of schizophrenia. // Med. Hypothesis. 19926.- V. 39. - P. 248-257.

131. Stevens M.G., Olsen S.C., Cheville N.F. Comparative effects of bovine cytokines on cattle and bison peripheral blood mononuclear cell proliferation // Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1997. - V. 20, №2. - P. 155-162.

132. Stilmark P.H. Über Ricin, ein giftiges Ferment aus der Samen von Ricinus communis und einigen äderen Euphorbiaceaen. Inaug. Dissertation. Doprat, 1888.-P. 96.

133. Strieter R.M., Kunkel S.L., Bone R.C. Role of tumor necrosis factor-alpha in disease states and inflammation // Crit. Care. Med. 1993. - V. 21. - P. 447-463.

134. Studnicka-Benche A., Steiner G., Petera P., Smolen J.S. Tumor necrosis factor alpha and its soluble receptors parallel clinical disease activity in systemic lupus erythematosus // Br. J. Rheum. 1996. - V. 3 5. - P. 1067-1074.

135. Sugii S., Horiguchi Y., Uemura T. Haemagglutinating activity of trypsinized Clostridium perfringens enterotoxin // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V.34, №2. - P.205-209.

136. Svensson I.A., Sehad E.M., Sundstrrom M. Staphylococcal enterotoxin A, D and E structure and Function including mechanism of T-cell superantigenicity // Preparative Biochemistry, Biotechnology. 1997. - V.27. - P. 111-114.

137. Takahashi M., Kobayashi Y. Cytokine production in association with phagocytosis of apoptotic cells by immature dendritic cells // Cellular Immunology. 2003. - V. 226. -P. 105-115.

138. Vaisman N., Hahn T., Karov Y., Sigler E., Barak Y., Barak V. Changes in cytokine production and impaired hematopoiesis in patients with anorexia nervosa: the effect of refeeding // Cytokine. 2004. - V. 26. - P. 255-261.

139. Yao L., Bengualid V., Lowy F.D., Gibbons J.J.,Hatcher V.B., Berman J.W. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces cytokine gene expression // Infect. Immun. 1995. - V. 63, № 5. - P. 1835-1839.

140. Zimecki M. Cytokiny w regulacji odpowiedzi immunologicznej // Kosmos (RP). 1992. - V.41.-P. 439-449.