Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МИЦЕЛИАЛЬНОГО ЛЕКТИНА БАЗИДИОМИЦЕТА GRIFOLAFRONDOSA (FR.) S.F. GRAY

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МИЦЕЛИАЛЬНОГО ЛЕКТИНА БАЗИДИОМИЦЕТА GRIFOLAFRONDOSA (FR.) S.F. GRAY"

jb -гът

На правах рукописи

Степанова Лада Викторовна

Выделение и характеристика мицелиалыгого лектнна базндиомнцета Grifóla frondosa (Fr.) S.F. Gray

03.00.07 — микробиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2008

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (И6ФРМ РАН, г. Саратов)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Никитина Валентини Евгеньевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпуннна Лидия Владимировна доктор биологических наук Красно польская Лариса Михайловна

Ведущая организация

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Зашита диссертации состоится «14» ц§£га 2008 года в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН и на сайте института л bppm.saratov.ru/obyavji і s.html

Автореферат разослан «12» феврали 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук В.Е. Никитина

РГАУ-МСХА нм?ии К.А. Т1:мйр>:з^"з ЦНЬ имени НУ.. ж.ли иве

ГЗвЬ.

ОКЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерес к высшим съедобным базидиомииетам (Basidiomyoetes) как источникам вкусной и полезной биомассы, содержащей различные биологически активные вещества, непрерывно возрастает. Научные изыскания, предваряющие и обосновывающие начало массового промышленного культивирования тех или иных грибов, как правило, лишь констатируют наличие каких-либо полезных свойств п активностей, характеризующих конкретный грибной объект с положительной стороны. В связи с этим изучение активных метаболитов базидисмиыетоа, определение их биологического действия в связи с аспектами их жизнедеятельности подлежат выяснению и представляют важную задачу.

Нельзя назвать случайным установленный факт, что практически все биологически актнвньк вещества, продуцируемые базидкальными грибами, являются либо гликанами, либо гликоконьюгатами (Ikekawa, 2001; Wasser, 2002). В научном сообщестяе уже сложилось представление об особом значении гликозилироваиия белков как неотъемлемой части углеводного обмена различных организмов, Это представление базируется на современных позициях гшжобиологии, доказыьвмжцгч, что важнейшая функция углеводов в метаболизме любь1Х организмов связана не только с энергетическим, но и биоинформационным потенциалом таковых, поэтому большое количество белков в организмах гликознлированы (Dwek, 1996; Drickamer, 1998; Reuter and Gabius, 1999). Функционирование некоторых метаболических систем, большей частью тех, что имеют экстраклеточную направленность, с использованием углеводного биоинформационного потенциала возможно благодаря осуществлению биоспецифического углевод-белкового взаимодействия. Подобное взаимодействие реализуется, в основном, с помощью лектинов, способных распознавать определенные углеводные детерминанты в клеточных структурах. То есть, если некоторые гликоэидные структуры s живой клетке представляют собой определенный информационный потен ни art (Laine, 1997; ScJis et ai., 200!),' то его реализация требует участия лектиновых субстанций (Lis and Sharon, 1998}.

Активные многосторонние исследования лектинов растений, животных и бактерий ярче подчеркивают существенный пробел в научных работах по изучению лектинов базидиомицетов. Это представляется особен но важным в отношении экогруппы базидиальных ксилотрофов, являющихся продуцентами важных иммуномодулирующих и противоопухолевых гликакое и гли ко протеинов, Анализ литературных данных показал, что исследования лектинов базидиоминетов немногочисленны и связаны, в основном, с выделением лектинов из плодовых тел, которые являются лишь кратковременными формированиями со строго определенной функцией. Крайне мало работ по изучению лектинов базидиомицетов на стадии дикариотнческого мицелия, основной и более значимой стадии роста грибного организма как биологического индивида. При этом подавляющее большинство исследований в этом направлении касаются представителей порядка Агариковых (Agartcales), вероятно, в силу наибольшего практического интереса к ним Отмечалось, что у представителей другого порядка • Афиллофоровых (Apliyllophorales) нли трутовиков - лектиновая активность обнаруживается редко iKÛoska, 2006). Несомненно, изучение лектинов как бноспецифических агентов в метаболизме базидиального ксилотрофа расширит спектр фундаментальных знаний о существовании и, возможно, реализации углеводного биоинформаиионного потенциала у этих организмов. Кроме того, подобные исследования имеют важное прикладное значение; лектнны различного происхождения, в том числе выделенные из некоторых высших грибов (Debray et ai, 1991; Guillot et at., 1990), выпускаемые как фармакологические препараты, широко применяются в медико-биологических исследованиях (Mody et а\., 1995; Gabius, 1998; Gabius et cl., 1998; Rüdiger et at., 2000).

Трутовик Grifbta ßoridosa, в силу исключительных свойств биомассы (к настоящему времен» ИЗ плодовых тел и мицелия выделено около 30 биологически активных веществ, большей частью, полисахаридов), является объектом пристального изучения. Однако научный поиск имеет ярко выраженный прикладной характер: основной мелью исследований является

обнаружение и описание Опололи чески ах-пганмх гдиканов и гликоксктьюгагов, обладающих медицш гским/фармакологическим эффектом. При этом материалом для работы являются, как правило, плодовые тела. Фундаментальный аспект шучения продукции и функционирования этих метаболитов в процессе развития самого бааидаомииета, нрактичесы! отсутствует. В доступной литературе обнаружена bccio 1 работа по выделению лекпша нз шюдовык тел этого гриба {Kawagistu eí Ы.. 1590b). На основании вышеизложенного, нами было предгрннято исследование его лектиноэой активности на стадии днкариотическою мицелия.

Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось обнаружение, выделение и характеристика .пектина с поверхности дикариотическою ми цели* баЗиднального ксяяотрофа G. frondosa штамм 0917,

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

t. Исследовать экстракты дикариотического мицелия G. frondosa 0917, полученного разными способами культивирования, и установить наличие у них пектиновой (i-ем агглютинирующей) активности.

2. Выделить гомогенный препарат лектнна с поверхности дикариотического мицелия <3. frondosa 0917, определить его yi леволную специфичность и локализацию.

3. Изучить некоторые физико-химические, о также иммунохимические свойства выделенного пектина.

4. Исследовать возможную роль лектин-углееодного распознавания как биоспецнфического взаимодействия при совместном культивировании О- frondosa 0917 с Azo.tpirUlum bras¡Unse Sp245 и его Омегон-Km мутантов.

5. Оценить влияние изучаемого лектнна на подвижность бактерий указанных штаммов в жидкой среде.

Научная новизна Впервые с поверхности дикариотического мицелия выделен и очищен лектни с молекулярной массой 67±1 кДа, установлена его углеводная специфичность, состав; описаны некоторые физико-химические и иммунохимические свойства.

Установлено, что пектин G. frondosa 0917 способен к связыванию, как со специфическими, так и с неспецифическими полиюкжальными антителами кролика и человека; последнее обусловлено взаимодействием лектнна с олигосахаридами антител.

Впервые показано, что, несмотря из качественно различную аффинность лектаиа при взаимодействии с молекулами гомологичных и нетомологмчнмх антител, количественно эти взаимодействия обусловлены образованием примерно одинакового количества связей, о чем свидетельствуют близкие величины изме! 1СИИЯ стандартной свободной энергии лил систем.

Показано, что Омегон-JCm мутанты штамма $р245 - штаммы КМСЛ8 и КМ 139, в клеточной стенке которых экспонирован ЛИСТ с гаптенным лектину мииелия ОПС1 распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма, чем в случае штаммов KM2S2 н КМ348, в состав клеточной стенки которых входит ЛПСТ!.

Выявлено, что мичелиальный лектин уменьшает подвижность бактерий А. brasslense Sp245 и КМ 139 (с ЛПС1) в жидкой среде.

Научно-практическая значимость Получен гомогенный препарат мицелиальиого лектнна G. /rotulosa 0917 с необычной углеводной специфичностью, который может применяться в исследованиях полимеров клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Установленное свойство лектина к распознаванию неспеиифнческих антител путем его взаимодействия с углеводной частью молекул антител свидетельствует в пользу активно развивающейся в настоящее время концепции об универсализме белок-углеводных бносисцнфнческнх взаимодействий как способа реализации эпигенетического углеводного кода Комплекс данных, полученных в настоящей работе, может послужить основой дальнейших фундаментальных исследований механизма функционирования лсктИ№-рецепторной системы у баацдиомицстоп.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и микологии ИБФРМ РАН по планам НИР в рам кал бюджетных тем: "Съедобные культивируемые грибы: физиология и биохимия" (направление 5,10), научный руководитель темы д.б.н,, зав. лаб. Никитина

В.Е., № гос. регистрации 01970008158; «Роль углевод ев яэывающнх глнкопротеи ков в процессах жизнедеятельности бактерий и грибов» (направление 5.10), научный руководитель темы д.б.н., зав. лаб. Никитина В.Е., К» гос. регистрации 01200606184. Работа выполнялась также при поддержке гранта РФФИ 04*48129_и «Лектины ксилотрофных 6 аз идиом ицетоа разных систематических групп». Материалы диссертации использованы при выполнении дипломной работы кафедры микробиологии биологического факультета СГУ нм. Н.Г, Чернышевского,

Наложения, выносимые на защиту

1. Проявление лектиновой активности, обнаруженной у экстрактов дикариотического мицелия G. frondosa 0917 в процессе кулыив ировавия на некоторых жидких и твердых средах, является наибольшим для легких смывов с поверхности 10-18-сугочного мицелия при твердофазном культивировании при использовании нативных эритроцитов кролика.

2. Лсктин, выделенный с поверхности дикариотнческого мицелия базндиальното ксилотрофа С- frondosa 0917, имеет молекулярную массу 67±1кДа и состоит то двух субъединиц по 3334 кДа,

3. Полученный лектин представляет собой гидрофильный термостабильный тликопрогеин с соотношением частей протеин; гликан как 3:1; проявляет высокую специфичность к линейному D-рамнану - ОПС1, выделенному из ЛПС1 грамотрииательных диаиотрофных рнзобактерий Л. brasitense Sp245.

4. Лектин G. frondosa 0917 взаимодействует как оо специфическими (к лекгину), так и с неспецифическими (к О-антигенам бактерий A. brasilense Sp245, S17) поликлональными кроличьими антителами, а также с у-глобулином человека. Связывание лектина с гомологичными антителами происходит с участием антигенсвязываюшето центра (Fab-фрагментов). Взаимодействие лектина с негомодогачными антителами обусловлено его связыванием с углеводной частью молекул антител.

5. Равновесные системы взаимодействия лектина G. frondosa 0917 с гомологичными и негомологичныьт иоликлональньгми антителами характеризуются различной степенью аффинности. Однако различие в величинах изменений стандартной свободной энергии ДG обеих систем несущественно, что говорит о примерно одинаковом количестве связей, участвующих в контакте молекул лектина и антител обоих типов.

6. При совместном культивировании базндиомицета С. frondosa 0917 и ризобакгернй А. brasitense штамма Sp245 и его Омегон-Km мутантов, дефектных по ЛПС, были установлены биоспецифнческие лсктин-уг.теводные взаимодействия, отражающиеся на морфологических характеристиках грибного мицелия. При этом с наименьшим антагонизмом распознаются штаммы Л brasiknsi. в клеточной стенке которых экспонирован ЛПС1

7. Лсктин G. frondosa 0917 в диапазоне концентраций 0.1—10 мкг/мл уменьшает подвижность азоспирнлл штаммов Sp245 и (СМ 139 (с ЛПС1); подобного влияния на клетки штаммов KM2S2 и KM34S (с Л ПСИ) не происходит.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 8 Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино. России, 2004), на 3-ей Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006), на 23-м Международном симпозиуме по углеводам (Уистлер, Канада, 2006), на 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, Россия, 2007), на 15-м Конгрессе европейских микологов (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на Всероссийской конференции с международным участием и Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, Россия, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «В а вило вс кие чтения - 2007» (Саратов, Россия, 2007).

Диссертационная работа обсуждена на расширенном заседании лаборатории микробиологии и микологии 28 ноября 2007 г.

Публикации, По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 статьи в отечественных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 1 стать« в зарубежном рецензируемом издании.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из мщения, обзора литературы, описания методов исследований, изложения и обсуждения результатов работы, заключения, выводов и списка датируемой литературы, включающего 227 источников. Объем диссертации составляет 131 машинописных страниц, Работа содержит 19 рисунков и S таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы вюючает подразделы: 1,1. Общая характеристика экогрушты базидиальных ксилотрофов, 1,2, Общие представления о лекшнах; 1.3. Лектины с позиці ей современной гдикобиолотии; 1.4. Лектииы блзидиальньга ксилотрофов.

СОБСТВЕННЫЕ 11ССЛ ЕДО BAIП Ш МАТЕР) ІАЛЬ! И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использована культура Grijblafrondosa (Fr.) S.F. Gray 0937, полученная из Коллекции культур баэидиомицетов Ботштческого института им. ВЛ. Комарова (Санкт-Петербург, Россия). С целью обнаружения и изучения динамики ироявления лскткио&ой активности гриба мицелий получали поверхностным и глубинным культивированием при 26°С на некоторых органических н синтетических средах. При этом использовали натмвные и трипсини тированные эритроциты кролика. Во время экспериментов л о въиьленню и исследованию свойств лекгин» рост культуры поддержи вали на чашках Потри с агаризованной средой на основе пивного сусла Материалом исследований являлся 18-суточныЙ дикарвотичсский мицелий. В хате жснернисігтов также использовались бактерии AzospirHlum brasüense Sp245 и сі» Омегон-Km мутанты - штаммы KMOtS, КМ139, КМ252 и КМ348, пол ученые в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН (Katzy <»(я/.; 1998).

Ікстракт поверхностно™ мииелня получали смывом 0,15М фосфатмо-солевым буфером (ФСБ, рН-7,2-7,4) с мицелиальной биомассы. Гель-фнльтраиня Подученный экстракт после фильтрования фракционировали на колонке (1,5x40см) с сефадексом G-75 с помощью детектора «UviconJ S II» (LKB, Швеция), при X = 280 нм, используя в качестве эшоента тот же буфер, Гемагглютинируюііше фракции отбирали, концентрировали на роторном испарителе и диалиювали протав дистиллированной воды в диализных трубках с пределом исключения б кДа (Sigraa-Aldrich, США). Ионообменная хроматография. Водный диализат помешали на диализ претив 0.02М ФСБ (рН-7.9), затем хромаггоірафировали на колонке (їх 10см) с DEAE —Тоуореаг! 6S0M, уравновешенной тем же буфером. Лектин элюировали раствором 0.25М NaCt, после выхода неадсорбнрованной фракции. Лектиновые фракции дважды диалнзовапи против дистиллированной воды, концеїггрировали пассивным упариванием и лнофильно высушивали. Реакцию гемагглютинацнн проводили полуколичественным методом двукратных разведений препарата лектниа (либо тестируемых фракций в процессе еьикления) u Q.15M ФСБ на стандартных планшетах для иммунологических реакций с использованием нзгивиых эршроцитов краінка Тігтром гемагглютилации считали наибольшее разведение препарата, при котором визуально сохраняется агглютинация эритроцитов, в сравнении с контрольной лункой. Специфичность лектин а определяли методом ингибнроадния реакции гемагглитшации различны™ углеводами. В качестве ингибиторов было протестировано 24 свободных углевода. Также были использованы ранее полученные препараты углеводных полимеров - О-спсцифических полисахаридов мембранных липопалисахарндов грамотрицагельных лиазспрофных бактерии Azospirillum brasiknse Sp 245, Л. trábense KBCt.A Itpofirum Sp59b. Ранее была исследована структура повторяющихся углеводных звеньев (моноуглеводный состав.

характер глнкоокдиых связей, абсолютная конфигурация) в составе лих полисахаридов (Vedonetïko et ai., 2002-, FedonenWo et of., 2004; Гсйопепко et al„ 2005), чго делает обоснованным их выбор в качестве тсст-ингибиторов Препараты любезно предоставлены сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН, Для проведения реакции i емаггдюггинзиии и ее ингнбировання готовили 2% cycjreimiio нативных эритроцитов кролика в 0, !5М ФСБ. Гс.п. - электрофорез проводили в вертикальной камере (Helicon. Россия), используя 15% поли акрила м иди ый гель с 0 1% доде пил сульфата натрия. Окраску гелей осуществляли азотнокислым серебром. А мн и о*и слот и ы ií анализ осуществляли на анализаторе ЛАД 339 (ЧССР). Гидролиз образна проводили 6Н HCl при 105°С в течение 24 ч. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Количество углеводов в растворах пектина определяли с помошъиэ фенол-сернокислотной реакции (Dubois « al-, 1956); качественный состав выявляли методом ТСХ, Пол и клепальные кроличьи антителя к дентину G. frondosa 0917 получали троекратным введением (с интервалом в 2 педели) кроликам в подколенные лимфатические узлы 0 5, 1.0 и 1.5 мг лектнна. который смешивали в соотношении 1:1 при первой им мук »ja пни с полным алыова(ггом Фрейнда, а при последующи* - с неполным адъювашоч. Фракции IgG получали m антисывороток осаждением сульфатом аммония (КоСот, Мейер. 1968). Концентрацию IgG в растворах определяли спектроскопически при длине волны Х»280 им, принимал оптическую плотность раствора IgG в кювете /Нем при концентрации белка I мг/мл равной 1.4 (Kabat, 1980). Получение «оикюгата лектнна С. frondosa 0917 » гомологичных антнтсл с часниими коллоидного золота (О) диамером 15 им осуществляли по методике {Roth, 19R2; 1983), Для проведения ичмунодот-аналт* взаимодействия меченого КЗ лектнна со специфическими и неснеиифическимн нолнклональными кроличьими антителами, а также коммерческим препаратом у-глобулина человека, использовали нитроцеллюлозные мембраны (t) - I Î мкм, «Millipore», США). Для предотвращения »«специфической сорбции метки на сайтах мембраны, своСюдкыч от образцов, подсушенную мембрану помешали в ФСБ с 0 01% Твин-20 н 0 1% ПЭГ 20000 (30 мни). С целью получения Fab- и F^-фрагмеитов. антитела к лектину и коммерческий препарат у-глобулина человека подвергали расщеплен ню но методике, предложенной в работе (Антитела. Методы..., 1991) с некоторыми модификациями. Твердофазный ПФА выполняли в полистироле вы X 96-л у ночных планшетах (Engvall el о/ . 1971) 1) качестве проб антигена нснользовали лектин, гантенимй О-ПС и комплекс этих веществ в разных концентрациях. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 им на нммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО ИЛ ЯП, Санкт-Петербург, Россия). О прел twine локализации лекиша проводили методом иммун«флюоресцентной микроскопии согласно методике, предложенной в работах 1 Пол лак, Ван Пор лен, 1987, Михайлов, Симирскнй, 1991), Пробы анализировали с помощью микроскопа «Leica PMI. В» (Германия), Для изучение чорфолого-культуральцы* характеристик колоний С. frondosa 0917 в совместны* культурах с А. brasílettse Sp245 и «o Омегон-Ь"ш мутантами суспензии бактериальных культур (1мл), выращенных «а мал îtho-coлевой среде в течение 1 сут. добавляли к 3-S-суточной культуре гриба на чашке Петри. С целью блокирования угле воде вяз ивающей области пектина, присутствующего на поверхности мкиедия, pacryuwft ™фы до внесения бактериальных культур подвергали предобработке препаратом ОПС1 (10 мкг/мл). Совместные культуры выращивали в термостате при 26°С, Согласно (Методы экспериментальной микологии. .. 1982), количественно рост совместных культур характеризовали с номошью (¡юрмулы ростового коэффициента (PK), модифицированной нами в применении к данным экспериментам:

PKj =■ dhgi 't, где i всегда равно 10 {сут).

Исследование недвижности бактерий в присутствии лектнна проводили с использованием специ;шьно разработанной программы компьютерного анализа

видеоизображения, полученного при просмотре препаратов "висячая капля" в фазоео-контрастнмй микроскоп Jenavai, соединенный е цифровой видеокамерой Sony DCR-TK V900E.

Onmi.-» достоверности результатов: значения /при п=5: от 2.6) no3.2S; 0.05 > Р > 0.03.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЁН Hli

0<¡nipyattii№, выделение " фшпка-шмичккп« свойства чицелналыюго лекции С. frondosa 091?

В ходе исследований экстрактов дикариотического мицелия базидиомицета С frondosa 0917, полученного разными способами культивирования, была обнаружена лектшюаая {гемагглюти пирующая) активность в отношении иатнвных эритроцитов кролика. При этом установлено, что наибольший стабильный титр лектнновой активности характере» лдя смывов с поверхности дикариотического мицелия 7-2|-суточиы\ культур в процессе роста на arapiiio ванном пивном сусле (рис. 1).

Pnt.l. Динамика лсктнмовой активности мипелия Ci fmndom 0917 в процессе роста на разных средах* (в отношении ндтнвнмх гритроцнтов кролика) Условные обозначения Жсинт -жидкая синтетическая среда, Жсусло - жидкое [шямя,- сусло, Лсинг - агаризо&аиная синтетическая среда; Acvcjiu - атари зова иное пивное cyc.Ni

U свят с этим ом л « принято решение о выделении искомой субстанции из смыва фосфатно-солевым буфером с поверхности биомассы lï-суточною мипелия, получении™ культивированием на этой сраде. Нами описывается дну хетал инн ый процесс выделения гомогенного лсктина m жстрактов с последовательным применением тель-фчльтрзции на декстраиовом носителе Sephadex G-7S и ионообменной хроматографии на аниопобменникс DEAt-Toyopeari 650M {рис. 2) Методом гель-электрофореза была установлена субьединичнач структура лектипа. представленная двумя полосами на уровне 33-34 кДа (рис.3). Согласно результатам многочисленных исследований, субъединичная структура является характерной для подавляющею большинства лсктннов различно!« происхождения. Значительная часть исследованных лектинов С азид иом и истов представлял и собой днмерм, состоящие ит небольших с^бьедтшн порядка нескольких десятков «Да (Lin ami Chou, 1984, Yalohgo et al.. 1488). Горзтдо меньшее количество лектинов имели мономерную структуру (Guillot et «/,.1 Wll), a также тетрамернуго (Konska et at.. 1994), Определение молекулярной массы нативного вещества методом гель-фил ыраи и и на ссфалексе в сравнении с модельным» белками показало, что время н «бьем

выхода лсктина с колонки совпадает с таковыми альбумина бычьего с молекулярной массой 67 кДа, взятого в равной концентрации.

Плотность при Л с 280 нм

Рие. 2. Профиль злюиин гемагг.іючіннруюг.их фракций в процессе ионообменной хроматографии на ОЕЛЕ-ТоуореагІ 650М

^ 9-І Л (ксллюлаза) Рис. 3./ІДС - электрофорез в 15% ИЛЛГ. Трек I-

^ лсктии </. 17, трек 2 - маркеры

66 5{БСА) ф ¿15 (овдльбумин)

■Ш ЗІ (карбоакгидраіа)

^ * 21.5 (ингибитор трипсина)

'ч"* (4 4 (лчюиим) I 2

С ломошыо фенол-сернокислотной реакции нами была выявлена углеводная составляющая в растворах локти на различных концентраций. По результатам всех опытов соотношение гликана н белка составляет 1:3 (табл. I). Анализ метолом ТСХ показал наличие глюкозы и глюкозам ян а в составе углеводной части. Многочисленные литературные данные свидетельствуют, что подавляющее большинство лектинов, выделенных из различных организмов, являются їли ко протеи нам и. широко варьирующими но количественному и качественному составу углеводной части.

Проведенное изучение аминокислотного состава вьіделениою пектина выявило наибольшее процентное содержание аминокислот с положительно заряженными К* группами - аргинина, лизина и гистидина. а также сравнимое с ними по величине содержание аминокислоты с отрицательно заряженной Ії-грушіой - аспарагн новой.

Отмечено также полное отсутствие серосодержащих аминокислот — ни стел на и метионина (табл. 2).

Тяблнма I

Соотношение белка и углевозов а растворах различной концентрации гомогенного препарата

лектнна G. frondosa 0917

Концентрация белка, м к г/мл Концентрация углевода, м кг/мл

1Ї 68 ± 0 24 4.21 ±0 07

28.23 ±0 73 8.78 ± 0 11

54.84 ± 1,64 17.83 ±0.29

110.4Í Jt 2,76 36 20 ± 0.97

218 14 ± 3 73 71 97 ± 1 12

Таблиця 2

Аминокислотный состав лектина мицелия G. frondosa 0917

Аминокислота % от суммы аминокислот Аминокислота % от суммы ами нок полот

Асп 8.2 Мет -

Тре 34 Иле 4.0

Сер 35 Лей 64

Глу 4 0 Тир 57

Про 5.7 Фен S.4

Пли 7,1 Гис 75

Ала 68 Трп 4 3

11нс - Лиз 75

Вії 50 Apr 85

Факт отсутствия последних либо их наличие в следовых количествах в аминокислотном составе, наряду с субьединичноП структурой, также является характерным пршнаком, отмеченным практически всеми исследователями в работах по изучению различных лектннов и агглютининов. Очевидно, отсутствие атомов серы, посредством которых в молекуле белка образуются прочные, стабили зируюшне структуру связи, играет не последнюю роль в лабильности локти нов как белковых молекул, участвующих в реализации широкого спектра адаптивных механизмов.

Титр агглютинации гомогенным лекгином в первоначальной концентрации 50 мкг/мл нативных эритроцитов кролика составлял 2048, эритроцитов человека 0 группы крови - 64. При определении углеводной специфичности изучаемого пектина было установлено, что пи один из взятых в эксперимент Mono-, ли-, аминосахаридов (всею 25}, а также некоторых гликолроизводных в концентрации до 0, IM не иигибировал агглютинацию нативных эритроцитов кролика. Согласно классификации, предложенной а работе (Gallagher. 1984), лектниы, в соответствии с их углеводной специфичностью, распределяются на две группы Первую составляют экзолектнны, к ней могут быть отнесены те, что связывают определенные внешние моносахариды (^восстанавливающих концов е сложных сахарндах; агглютинация такими лсктинами может быть ннгнбироеана низкими концентрациями свободных углеводов либо их метилглнкозндов. Вторую группу составляют эндолектины. способные к распознаванию лить сложных олигосахаридов. и агглютинацию ттимн лектинами можно ингнбнровать только специфическим м углеводными последовательностями. Поскольку не было обнаружено взаимодействия со свободными сахаридамн, н качестве ингибиторов были протестированы гомогенные

препараты углеводных полимеров - О-спецнфическнх полисахаридов мембранных линополисахаридов грамотрицательлых диазотрофных бактерий Azospirillum brasilense Sp 245, Л. trakense КЕЗСI, Л, Itpoferum Sp59b. Было установлено, что О-подисахарид A. brasilense Sp245 - линейный D- рамнан со следующей структурой повторяющегося звена ->2)-ÍJ-D-Rh^-(1 -»3 Va-D-íUia/H l -v3>a-D- Rhty>( I —»2 )-a-D-Rhap-( 1 2y-a-D-Rha^K! (Fedonenko e( 2002) а концеїгграцни 13,9 mkjAui кнгибируст агглютинацию в тіпре 4 выделенным лектином иативных эритроцитов кролика. Свободная рамноза не оказывала ингибнрующего влияния; возможно, это объясняется тем, что чистая рамноза существу ет только в виде L-эпимера, тогда как в составе пектасахаридного звена рамнана этот моноуглевод находится в D-форме. Поскольку такая конфигурация рамі юзы описала лишь в сложных полисахаридах некоторых микроорганизмов (Кочетков, 1996; Fedonenko et al., 2002), можно констатировать, что выделенное вещество, проявившее такую специфичность, является типичным зіиолектином, чувсіеитслы м имеино к кокформатианим модификациям аффинного полисахарида, которые обусловлены характером глнкоттлой связн ti эпимеризацней входящих в его состав моносахаридов (Gallagher, 1984; Gabius, 2000}. Ранее исследованный лектин из плодовых тел G. frondosa оказался, напротив, типичным жзолектином, так как проявлял высокую специфичность к Ы-ш1етшьО-галактоэамнну (K.awagish¡ e/oí., 1990)

По литературным данным, лектипы различного происхождения являются достаточно термосгабильными веществами, н температурный диапазон сохранения их активности широк. Наши исследовали* показали, что при нагревании раствора лектина в любой произвольной концентраті» до +50°С его акпівіюсп. практически не изменяется. Дальнейшее нагревание ведет к снижению титра гемагг.иогинации, проявление которой почти полностью утрачивается ири 70°С, При лиофильиом высушивании, как известно, концентрированные растворы лектина іюдверіалнсь длительному замораживанию до -70°С Пере растворенные препараты высушенного лектина сохраняли свою активность, Таким обр&юм, установленный в наших исйіедопаннях температурный диапазон сохранения іемаї тлю™ пирующей активности лектина G frondosa 0917 от -70°С до +50°С,

Присутствие лектина в легких смывах с поверхности піф позволило предположить, что шлрофнльный пектин слабо ассоциирован с клеточной стсикой мицелиальных гиф. Методом нммунофлюорссисшной микроскопии показано диффузное и неравномерное распределение лектина но поверхности гнф (рис. 4). Скопления лектина характерны для пряжек, образующихся в процессе днкариотнзаннн. а также для мелких («молодых») гифальных отростков.

Рнс.4. Локализация лектина на гифах

Ранее подобная локализации была описана для некоторых бактериальных лектинов (Аленькина, 1994; Карпуннна и др., 1995). Авторами подчеркивалось, что описываемые лектины не были связаны с какими-либо конкретными бактериальными фил а ментами, Однако бактериальные лектины равномерно распределялись по поверхности микробной клетки. Как известно, развитие любых морфо структур требует энергетических затрат, что провоцирует поступление значительного количества углеводов в район активного роста. Этот процесс тем более актуален для апикальных гиф, характеризующихся непрерывным ростом в изменяющихся условиях среды. Последнее обстоятельство вынуждает к расходу части энергии на адаптацию, что выражается, прежде всего, в изменении функционирования определенных ферментных систем. Согласно работе (Künska, 2006), лектины, с большой вероятностью, принимают участие в этих процессах в качестве контролирующего фактора либо посредством прямого связывания со свободными сахари дам к, либо воздействуя опосредованно через связывание с углеводной детерминантом в составе энзимов.

Нммунохимические свойства ми цели ильного-пектина С.frondosa 0917

Н ммун охи ми чески Й подход является весьма информативным при изучении поверхностных структур различных биологических объектов, поскольку специфические антитела представляют собой уникальные зонды, позволяющие, в частности, оценивать характер локализации и уровень продукции исследуемых соединений, а также влияние внешних факторов на их качественные и количественные характеристики. Полнкломальные антитела - это пул гетерогенных иммуноглобулинов, относящихся преимущественно к классу TgG н различающихся по антигенным свойствам, по молекулярному весу и заряду. Как известно, наличие перекрестной реакции антител определенного происхождения с какими-либо исследуемыми антигенами, однозначно свидетельствует о присутствии и антигене той антигенной детерминанты, к которой тестирующие антитела изначально были получены. Однако если в качестве антигена выступают вещества, способные к собственным специфическим взаимодействиям, то интерпретация полученных результатов может быть затруднена. Ц силу известной способности лектинов связываться с углеводной частью иммуноглобулинов, выделенных из крови экспериментальных животных и человека (Калинин и Куля кии а, 1998), пммунохнмнческая специфичном ь полученных на лектины антител нуждается в особых доказательствах, без которых интерпретация результатов может быть затруднена, В экспериментах по изучению иммунохимических свойств лсктииа была обнаружена его способность к связыванию, как с гомологичными, так и с пегомологичнымн пол нкл опальными антителами. ИФЛ взаимодействия лсктииа с гомологичными антителами, а также его комплекса с гаптенным ОПСI показал, что степень антиген кости .пектина невысока (таг значение поглощения - около 0.3). При этом в комплексе с гаптсном антигенные свойства лектина уменьшаются (рис. 5).

На рнсункс 6 показано, что лектин G. frondosa 0917, коиъюгированный с частицами коллоидного золота (КЗ), взаимодействовал с антителами к О-анти генам iрзмотрицател ьн ых бактерий A brasiUnse Sp245 и SI7, а также с коммерческим препаратом у-глобулина человека, использованными при анализе в качестве отрицательного контроля.

Выявленные взаимодействия поставили [тол сомнение специфичность связывания лектина с гомологичными антителами. В связи с этим мы предприняли дальнейшие исследования. Как известно, продуктами обработки антител растительным протеолитическнм ферментом папаииом являются так называемые Fab- и /-с-фрагменты. Образующиеся при расщеплении одной молекулы антител два Fob-фрагмента сохраняют способность реагировать с антигеном, поскольку содержат антиген-распознающие

области. Уч-фрагмеит молекулы антител антмген-рэспознающих сайтов не имеет (Porter, 1959).

S

0

1 I

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0.2 0,15 0,1 0.05 0

0,301 0.602 0,903 1,204 1,505 1,806 2,107 2,408

—♦— пектин lg титра разведения ■ -И-ОПС1

—Аг— КОМПЛЕКС

Рис, 5 Результаты ИФА взаимодействия лектина G./rondosa 0917 (SO мкг/мл>и комплекса лектмн+гаптек гаптенного ОПС (200 мкг/м;0 С ачтмтелами клектину

К лектику G./rondosa 091? К О-аиттеиу Л brasifeiae Sp24S К О-ангщеиу A brasilenst SI7 у-1 ,юГ)>лин человека

1'ис. ft. Результаты и мму код от-опалим взаимодействия кон ъюгата лектина с КЗ со специфическими и неспеинфи чески ми антителами

Поскольку проверка специфичности связывания грибного лектина с гомологичными антителами была необходимой, было предпринято растепление лапанном последних, а также у-глобулина человека в качестве контроля. На рисунке 7 показано последовательное злюированне продуктов растепления антител к лектнну в процессе ионообменной хроматографии. Согласно авторам метода (Антитела..., 1991), первый ник представлял собой фраки то /•^¿'-фрагментов. Выход фракции 5с-фрагмектов формировал второй пик, гораздо меньший но площади. Это соответствует теоретически ожидаемым результатам, так как при расщеплении одной молекулы антител образуется два /-"^Ь-фрагмента и один Гс-фрагмент.

Oî -

O.î

0,1 _

Градиент ФБ 0 01 - 0.3М

—г-10

20

SO ао 50

60

У.мл

Рнс. 7. Профиль VHOUHH антител ч лектйну после расщепления заданном

Идентификация (Jipai кентов была подтверждена взаимодействием с меченым КЗ протеином Л, Последний, как известно, распознает Fc-фрагмеиты молекул иммуноглобулинов(Досон и др., 1WI). Рисунок 8 демонстрирует результаты иммунодот-аналнза взаимодействия фракции с протеином А; как видно, предполагаемые фракции Fc-фрагментоа антител к лектину и у- глобулина человека проявили яркое взаимодействие с протеином А, тогда как взаимодействие предполагаемых фракций /■оЬ-фрагментоа с ним отсутствовало, С келью проверки специфичности связывания лектнна с гомологичными антителами, с помошыо и мчу полота было установлено, что рай-фрагменты специфичных антител взаимодействуют с меченым лсктином, но взаимодействия Faü-фрагментов у-глобулнна человека с .пектином не отмечалось (рис. 9).

— /-íit-фрлгменты антител клектику

.tsvM--Fafc-фрагыенты у-тлобулина человека

fcíTRft --fc-фрагмеиты антител к пектину

Fij^S"^г /-^-фрагменты у-глобулнна человека

Рве, 8, Результаты иммунодот-анализа взаимодействия фрагментов антитез с протеином А, конъюгироаанным с КЗ

^........... ... - -.....

^¿-фрагменты у-глобудина человека Раб-фрагменты антител к лектину

Рис. 9. Результаты и м му нодот-ai I ал и за взаимодействия Fûft-фрагментоа антител с коиьюгитом лектина G. frondosa 0917 с КЗ

Следовательно, связывание пектина с гомологичными антителами происходит с участием антиген связывающего центра, С учетом отсутствия связывания Fafr-фрагиентоа -¡«-глобулина человека с лектином, можно считать доказанным, что антиген связывающий центр молекул у-глобулина не участвует в их взаимодействии с лектином.

Учитывая собственную функциональную специфику лектнна, естественным было предположить участие взаимодействий «лектии-утлевод» в наблюдаемом иммунохимическом эффекте вместо взаимодействий «антиген-антитело». Как известно, в молекулах Tg всегда присутствует углеводная часть, которая у разных классов lg может отличаться по качественному составу, количеству и локализации углеводны* фрагментов (Raju el а!., 2000). В молекулах антител углеводы прикреплены но месту акцепторных трнпептидое Asn-X-Ser/Thr, где X — не Pro, но котором обычно идет глнкозилнрование белков (Reuier and Gabius, 1999).Очевидно, определенные олигосахарнды в составе антител способны образовывать связи с компетентной областью грибного лектнна, и главным лимитирующим фактором в таком случае является пространственная комплементарность углеводсвязывающей области лектнна, которая меняется при образовании комплекса с гаптенным полисахаридом. Подобные взаимодействия лежат в основе лектин-ферментного анализа, применяемого для исследования изменений состава углеводной части иммуноглобулинов разных классов (Калинин н Кул яки на, 1998; Петросян, 2006). Если взаимодействие исследуемого яектина с неспе пифически ми антителами происходит посредством контакта его углеводсвязывающей области с олнгосахаридами антител, то при блокировании этой области гаптенным полисахаридом, взаимодействие с антителами будет уменьшаться. В связи с >тим, методом ИФА были получены полу количественные характеристики иммунных взаимодействий лектнна, его комплекса с гаптенным ОПС (D-рамнаиом), а также чистого ranie и а в качестве контроля с неспеиифнческими антителами к О-антигену ри юбактерии Smorhizabmnt mehlon P22I Как показано на рисунке 10, взаимодействие лектнна с антителами характеризуется линейной зависимостью.

LM90 0,3 0,25 0,2 0,15 0.1 0.05 О

0,301

0,6021

0,9031

-лекгнн -комплекс -ОПС (контроль)

1.20JI

1,5052 lg титра

Рис, 10. Рсзулмзгы ИФЛ взаимодействия лектнна, гаи генного О! 1С и комплекса млектнн-гантен» с антителами к О-ангигеиу те Шоп Р221 По оси абсцисс указана степень разведения первоначальных концентраций проб антигенов

Кривая поглощения, характеризующая динамику згою взаи молей стен я при уменьшении концентрации лектнна. уже в тигре 1:16 от первоначальной концентрации антигена достигает минимального значения, и далее проходит вблизи контрольной кривой. Кривая взаимодействии комплекса лсктмиа с гантеном отличается меньшими

значениями поглощений, величина которых не зависит от степени разведения, что свидетельствует об отсутствии линейной зависимости. На основании полученных данных можно говорить о том, что уменьшение степени связывания комплекса «лектин—гаптен» с негомолотичиыми антителами связано, скорее всего, с блокированием ею углеводе вязы вающей способности, что, в свою очередь, говорит об участии функциональной специфики лектин а во взаимодействиях с негомологичными антителами.

Количественными характеристиками меж молекулярных взаимодействий, обуславливающихся суммарным действием всех сил в равновесной системе при обратимых взаимодействиях, являются термодинамические параметры • изменение энтальпии и энтропии рассматриваемой системы, отражающие энергетику взаимодействия, а также константа равновесия. Величина последней, в данном случае, будет зависеть от степени аффинности взаимодействующих молекул. Ясно, что понятие аффинности в случае взаимодействия лектина со специфическими антителами («антиген-антитело») отличается от а<|>финносги лектнна в комплексе лекгам-неспецифические антитела («лектин-углевод»). Поскольку как лектины, так и антитела являются частью представляющих активный интерес биосистем, нам показалось важным установление параметров их взаимодействия, с целью понимания явления двойственной биоспецифики лектнна и уточнения ПОНЯТИЯ «специфичность» в применении к наблюдаемым взаимодействиям.

В настоящее время с применением математического моделирования описан так называемый метод серийных разведений для установления параметров л и гаи д-реиелторного взаимодействия (Bobrovník, 2003). Метод основан на применении координат разведения (Bobrovník, 1999); его важным преимуществом перед ранее разработанными является то, что он позволяет определять искомые параметры взаимодействия даже в том случае, если лиганд и рецептор изначально находятся в смеси. Основная идея рзсс м атри еасм ого метода серийных разведений состоит в том, что использование закона действия масс для установления параметров лиганд-реце торного взаимодействия возможно не только в случае применения постоянной концентрации одного нз реагентов и постепенно увеличивающейся концентрации другого, на чем и основаны методы Клотца и Скетч ар да (Klotz, 1946; S catch artl, 1949), но также и в том случае, если концентрации обоих реагентов изменяются одновременно. При этом предложенные уравнения можно в равной степени использовать как при синхронном уменьшении концентраций реагентов (что проще всего реализовать разведением исследуемой смеси), так и при их синхронном увеличении (Вобровннк, 2004).

Закон действия масс для лиганд-рецепторнога взаимодействия имеет следующий

вид;

Kt-c/{i-c)(r-c}, (I)

где I - концентрация лиганда, г - концентрация связывающих центров рецептора, с -концентрация лиганд-рецепторного комплекса после достижения состояния динамического равновесия. Если концентрацию лиганда и рецептора уменьшить или увеличить в d¡ раз. то рассматриваемая система придет к равновесию с иной концентрацией комплекса Cí;

К, = а / (№ - c,)(rid, - с,). - (2)

В том случае, когда концентрация лиганда значительно превосходит концентрацию комплекса, то есть Hd¡» с,-, уравнение (2) можно упростить;

А',= с, IИ di ir¡d¡ - c¿). (3)

В работе (Uobrovnik. 2003) было показано, что уравнение (3) можно привести к следующему виду:

г/r,-äi+IKe. (4)

Очевидно, что в том случае, когда вместо молярных концентраций г и r¡ можно определять некие иные характеристики, пропорциональные данным величинам, например, величину поглощения в ИФА, То получается:

AaíAi = rfi + IK/, (5)

гдс/1« - л а/1, — r¡.

Также было показано (Боброииик, 2004), что, если исследуемые в ИФЛ антитела являются двухвалентными, то необходима соответствующая коррекция уравнения (5). После подобной коррекции уравнение преобразуется к виду:

AtlAi+^At'lA,2 - d¡AM¡ = rf, + /A>, (6)

откуда: ___

К,= 1/1 (Л*/А ¡ЛЛ t)A ? ■ d¡ Л JA¡~ rfj- (7)

В применении указанного метода к взаимодействию лектина <7. frondosa 0917 с антителами при ИФЛ, понятно, что в случае гомологичных антител расчет параметров нужно вести согласно уравнению (б), что вытекает из теории строения молекул антител н наличия s них 2-х петров специфического связывания антигена, а также полученных в ходе эксперимегпа доказательств специфического связывания изучаемого лектина с гомологичными антителами. Однако, в случае него молот ич ньгх антител определять параметры взаимодействия нужно, очевидно, согласно уравнению (5), поскольку, связывание антител с лектином по принципу «лектнн-углевод» вряд ли будет осуществляться Солее чем по одному «сайгу». По этой же причине можно с уверенностью допустить, что молярная концентрат« комплекса лектина (лиганда) с негомологичними антителами (рецептором) будет несравнимо ниже молярной концентрации чистого лектина, что является условием применения уравнений (Д)—(5). В соответствии с зтим. были проведены расчеты параметров взаимодействия лектина с антителами. В таблице 3 приведены данные но ИФЛ в <аимо действия изучаемого лектина со специфическими и неспецнфическими антителами.

Таблнця 3

Константы свя1ы«зкня лектина Ct.frotxdaui 0917 со сг^ецифическимн (СЛт) и неспенифнческимн (ПСАг) полнкломапьными антителами, рассчитанные но данным ИФЛ

Лскт ин М, - 67 кДа лог'лог і гекне При ИФЛ* Л/ х 10* моль"'

Абсолютная «онцентрання мкг/мл Количество естества *10"* моль СЛт НСЛт СЛт НСАт

200 2 941 і (1381 0 253

100 1471 ¡ 0 339 0.190 4 97 2 83

50 0 735 0318 0.157 6 85 4 63

25 0 368 0 276 0.110 8 75 6 39

12 і 0.1S4 ¡ 0342 0104 10J8 Л 06

6 25 0.092 - 0.18) і 0,102 13 99 8 33

'Средине значения от не менее 15 по результатам нескольких ИФЛ

Констан гы связывания (образования) взаимодействующих веществ в динамической равновесной системе, полученные согласно уравнениям (5)* (7), с учетом используемого в И ФА двукратного титрования проб, являются коли чсствеи и ы ч и характеристиками .пектина как антигена. Данные таблицы показывают, что величины констант связывания лектина (в одинаковых молярных концентрациях) с гомологичными антителами в среднем в два раза больше, чем таковые в случае неіомолоіичньгх антител.

Как известно, прочность образующегося комплекса реагентов характеризуется изменением стандартной свободной энергии ДС, при этом, чем более отрицательно значение ЛС*. тем прочнее связь (Мснлер, 1980). Изменение стандартной свободной

энергии üG" при образовании межмолекулярной связи определяется следующим соотношением с константой образования:

ДС" = -ЯГ1пК>= -UftJRTlgAy» —S.70S 1£А>кЦж/маль при 25*С, (8)

где R - газовая постоянная, Т - температура по Кельвину. Согласно (8), используя средние значения логарифмов приведенных комета«гг образования, были рассчитаны величины изменений стандартной свободной энергии ДС®. Эта величина при образовании связи «лсктнн G frondosa 0917-гомологичные антитела» в среднем составила -51.109 кДж/моль при 25"С; ДС* комплекса «лектин С. frondosa 0917-негомологичные антитела» в среднем равна —50.121 кДж/моль при 25"С. Таким образом, несмотря на различную (качественно и количественно) степень аффинности лсктина к антителам, энергия этих взаимодействий различается несущественно. Учитывая, что на образование одной водородной связи приходится около 5 кДж (Мецлер, 1980), можно предположить, что контакт молекул лсктина с антителами обеспечивают около 10-ти связеобразуеощих 011-групп. С позиций энергетики молекулярных взаимодействий нельзя назвать взаимодействие лсктина с одним типом антител более специфичным, чем с лр\ гим, хотя, с учетом более высоких величин констант связывания с гомологичными антителами, последние, очевидно, будут более конкурентоспособны за образование связей с лектином. Приведенные результаты являются иллюстрацией к решению вопроса о том, можно ли по результатам исследований на уровне гомогенных веществ, уже не являющихся частью живой системы, однозначно судить об их функционировании в системе? Контакт лсктина с гомологичными а1гтитсламн, осуществляемый посредством антигенсвязывающнх центров рецептора, в живой системе вызвал бы блокирование лектииа как антигена, а контакт лектииа с не гомологи*! ны ми антителами посредством связей, основанных на случайной пространственной комплемснтариости частей бномолекул определенной конформзиии. провоцировал бы, очевидно, совсем иной отклик системы. Поэтому в данном случае речь можег идти, вероятно, только о биологической специфичности, хотя на молекулярном jровне имеет место универсализм взаимодействий

Свойство ми цел налы ю то лсктина G. frondosa 0917 связываться как с гомологичными, так и с негомологичными антителами подтверждает принцип универсал ыюстн бноспенифическнх взаимодействий, обеспечивающих

биоинформационный поток. Взаимодействие «антиген-ааггнтсло» с этих позиций является частным случаем высокой аффинности от общего принципа специфических взаимодейст вий, в основе которых лежит топологическая комплементарпость биомолекул. Способность лсктина к подобному связыванию позволяет предполагать, что в углеводных детерминантах молекул не специфических антител, скорее всего, присутствуют ключевые олигосахаридныс звенья с комплементарной топологией свпреобразующих групп, которая, возможно, в данном случас обеспечивается наличием а-(1—»2 )-с вяза иного б-дезоксисахарида и (1-(1—»3) связи, что образует характерный «изгиб« цепи. В целом, (3-D-(I—»3)-связанные глнкопиранозы встречаются наиболее часто в составе биологически активных углеводных полимеров высших базидиомицетов (Mizuno et «/., 1996; Yadomae, 2000). Нозможио, пространственная геометрия олиго- и полисахаридов, обеспечиваемая именно этим типом связи, отобрана эволюционным процессом для передачи с и талон, немедленно запускающих защитно-адаптационные механизмы клегок высших базидиальиых грибов.

Изучение роли лектин - углеводных взаимодействий в контакте G. frondosa 0917 и рнтобактерпй A, brasüense

Многочисленными работами было показано, что лектин-угле водные взаимодействия лежат в основе процессов распознавания при становлении различного рода взаимоотношений между организмами и несут информационную нагрузку, влекущую, как правило, определенные изменения в жизнедеятельности организмов. Однако, в доступной литературе мало работ, посвященных исследованию роли лсктнн-

углеводных взаимодействий в жизнедеятельности грибов-базидиомицетов. Установленная специфичность миаелнального лектина О frondosa 0>917 к нетипичному углеводному полимеру О-рамнэну - ОНС] ЛПС A. brasttense Sp245 - является необычной.

Азоспириллы - трамотри нательные диазотрофы, относящиеся к альфа субклассу it роте оба ктери й. Особое внимание исследователей азоспириллы привлекают благодаря тому, что входят в ipynny рнзобактерий, стимулирующих рост растений (Planl Crowih-Promotirtg Bacteria: PGPR). Помимо способности фиксировать атмосферный азот, они оказывают положительное воздействие на рост и развитие растений, благодаря выделению в ризосферу фнтогормонов, витаминов и других биологически активных веществ (Woo el al., 2002).

Ранее было показано, что ЛПС1, экспонированный в качестве наружной мембраны клеточных оболочек мутантных штаммов A .brasttense КМО18 и КМ 139, имеет в своем составе ОПС1, в отличне от ЛИСП мутантных штаммов A. brasifense КМ252 и КМ348 с присутствующим в нем ОМС2, И состав наружных мембран клеток дикого штамма A.brasttense Sp24S входят ЛПС. имеющие оба ОПС (табл. 4) Оба OllC идентичны по структуре повторяющегося звена (линейный D-рамнан), но, очевидно, имеют несколько отличную конформашно, возможно, из-за присутствия фосфатов в качестве минорных заместителей (Федонеико и др., 2004). что делает ОПС1 углеводным тантеном для лектина G. frondosa 0917 при полном отсутствии сродства к лекшну у ОПС2. Поскольку в природе азоспириллы и ксилотрофные базидиомипеты занимают разные экологические ниши и не вступают в контакт между собой, представилось логичным задать вопрос, будет ли пектин-углеводное расп01навание существенным при искусственно спровоцированном контакте этих микроорганизмов и каким, положительным или отрицательным, будет характер этого взаимодействия? Обнаружение у лектина G. frondosa 0917 специфичности к ОПС1 A. brasttense Sp245 предоставило уникальную возможность изучения бноспенифичных взаимодействий при контакте in« чужеродных как в таксономическом, так и в экологическом плане, микроорганизмов. I) связи с этим нами предпринята попытка изучения роди дектин-усдеволиою распознавания как биоспецифнческого взаимодействия при совместном культивировании G. frondosa (ЯМ с A. brasttense Sp245 и его Оме гон-Km мутантов, дефектных по структуре ЛПС.

ТнОлиия 4

Характерно! и на штаммов A brasttense

Штаммы Xарактеріктика j Тип ЛПС Источник

Sp245 Дикмп тин , ЛИСІ : ЛИСП 1 Baldan і et al. ІШ|

КМО її Омегон-КМ му і ан I штамма Sp245 с инсеркией в ила ¡миле 120 МДа ЛПСІ [Katzyct al. 1498]

КМ 139 Омегон-КМ мутант иламма Sp245 с ннсерцией в плазмиде I2Ü МЛа J1I1CI [KaUyctal.lW]

КМ252 Омегон-КМ мутант штамма Йр245 с нисериней п плазмиде 120 МДа лисп |Kat¡yetal, I94S]

КМ 343 Омегон-КМ мутант штамма Sp245 с инссрциеЯ в плазмиде 120 МЛа лисп (Katryclat, 194 8]

Для реализации поставленной задачи необходимо было нолобрать условия эксперимента, при которых малейшие изменения в совместном развитии микроорганизмов немедленно отражались па морфолого-культуральных признаках и были явными Поскольку контакт целостных организмов реализуется посредством множественных биохимических схем с участием различных сигнальных механизмов (которые у базидиомицетов практически не изучались), возникал определенный риск неверной трактовки полутемны* результатов.

Во избежание некорректных объяснений иеследуемых явлений при контакте микроорган из мои параллельно, в качестве «ключевого», проводили эксперимент, условия которого отличались лишь кратковременной обработкой кончиков растущих мицелиальных гиф ОПС1, гаптеиным лектину мицелия G. frondosa 0917,

Результаты, полученные в ходе исследования морфолого-культуральных .характеристик колоний G. frondosa 0917 в совместных культурах с азоспирилламн, приведены на рисунке 11 и в таблице 5.

Риг, 11. Морфология колония G. frondosa 0917 в процессе кокультивирования со игтаммачм ,1. trafílense В, С- совместная культура с A. brasitense Sp245; D, Е- с КМ348. F, G- с КМ252; Н, I- с KM01S, J, К- с КМ 139 Л - юнпроль. числа» культура G. frondosa 0917; В, D, F, Н, J - совмещение налианых культур, С, E.G. S, К - совмещение культур после предобработки гифОПС!

Для совместной культуры со штаммами KM01S и КМ 139 (с ЛПС1) юна первичного контакта но периметру подсева представлена характерным кольцом воздушного редкого мнцелия (рис. 11 Н, J). В случае штаммов КМ252 и КМ8 (с ЛПСП) во всех опытах такая кольцевая юна была более четкой, ярче выраженной (рис, 11 D, F), что можно трактовать как более резкое проявление антагонизма. Такая трактовка сшс очевиднее, если сравнит!, указанные смешанные кульгуры с чистой (контрольной), мор|)юлогччески однородной культурой гриба (рис. ИД), а также с совместной культурой гриба с днким штаммом Sp245, которая по морфологии практически ничем не отличается от контроля (рис 11 В)

Заметные различия в морфологии мицелия в смешанных культурах наблюдали в опытах с предобработкой растущих гнф препаратом ОПС1 перед подсевом бактериальных культур, по сравнению с опытами но их совмещению без предобработки. Как видно на рис. 11 (С, Е, О, 1. К), морфологически мицелий более неоднороден, меньше диаметром, зона первичного контакта теперь выражена кольцом плотного мицелия, довольно четким и узким в случае со штаммами КМ018 и КМ139 (рис. 11 1, К). В кокультуре с КМ252 зона контакта более широкая н крайне неоднородная, с перемежающимися полосами и островками плотного и воздушного мнцелия (рис 11 Е, С); в совместной культуре с КМ348 контактная зона неоднородная и более узкая, кольцо плотного мицелия очень четкое. Неупорядоченная ai-pera пня тиф пи типу «барража» (плотный, прижатый к поверхности среды мниелпй в зоне первичного контакта) свидетельствует о напряженных адаптационных моментах в процессе распознавания «чужака» (Шиырева и др., 1998). Поскольку условия экспериментов отличались только кратковременной предобработкой кончиков гиф ОПС1, возможным обьяснением наблюдаемых явлений предположили

блокировку лектина гаптенным ему 0ПС1, что в конечном итоге привело к временному затруднению в контакте гиф с бактериальными клетками. Но в процессе дальнейшего роста выработка лектна растущими гифами привела к распознаванию н более скорой «идентификации» штаммов Sp245, KM0I8 н КМ 13*5 по сравнению со штаммами KM2J2 н КМ348, у которых зона противостояния гораздо ярче выражена, чем в случае с остальными.

Таким образом, в морфологии колонн» гриба «рн совместном культивировании были отмечены характерные различия, что в конечном итоге отразилось на PKj, РК, для чистой (контрольной) культуры гриба определен как 131.48 ± 3.85, Данные таблицы 5 показывают, что в сравнен«« с РК, чистой культуры, кокультуры с бактериями штаммов A, brasilense Sp24S, КМ018 и КМ 139 (с J11ICI) характеризуются большими значениями ГК,. Наименьшие значения РК, отмечены для смешанных кулыур с бактериями штаммов КМ252 н КМ348 (с ЛПС11). PKj в экспериментах с предобработкой мицелиальных гиф раствором OUCi отличаются, в целом, меньшими значениями, чем в экспериментах по совмещению чистых культур, но, в данном случае, значении РК, в культурах с КМ252 и КМ348 существенно ниже значений для совместных культур с КМ018 и КМ 139, Такие 'значения получены из-за коэффициента однородности, который для указанных »-»культур является самым низким (морфология чиислия крайне неоднородна).

1 яблк НА 5

Ростовые хцрак1срисгики колон и ft G frondosa 0911 при со в местом кулы нейронами и со штаммами A. brasilense

Штамм бактерий Совмещение культур без пре.тобработок Совмещение культур после предобработки гиф OIICI

J, мм РК, d, мм PK,

Sp243 79.86 ±2 U3 N3 74 ± 3.81 "¡3752 i 3~7бГ 73 4S± 1 85 ~72~íf*l'lT~ 88,14 * 2 44 87(Гй±2~0б

KM0I8 7f> 62 ± 1.83

КМ 139 75 5S ± 1 95 135 99 i J 94 72 U ± 1 78 Кб 56 * 1.97

КМ252 74 34 А 1 74 89 21 ± 2 27 71 79 ± 1.90 72 OJ * ГЯ2~~ 28 72*0 89 ^fsViÖW"

КМ348 75 fifi í 1 01 90 79 г 2 46

Из данных таблицы видно, что в случае „uikoi-o штамма A. brasilcnse Sp245 можно говорить о ростостнмулируюшем эффекте. Мутангные штаммы KM0I8 и KM139 практически не оказывают влияния на PK, мицелия. В случае мутантных штаммов КМ252 и КМ348 наблюдается ингибнрующий эффект, если судить по J'Kj. Однако но скорости колонизации среды все совместные культуры отличаются незначительно,

Изучение влияния .зектнна на поведение бактериальных клеток а некоторой степени моделирует события, возможные при к ot гг акте целостных организмов Отмечалось, что лектииы различного происхождения, если они проявляют одинаковую специфичность, способны оказывать схожее влияние на клетки и ткани. Так, ранее было покааано, что лектииы некоторых растений (WGA. яектин Solanum luberosum). проявляющие специфичность к Н-анетнл-[М>глюко1амииу, уменьшают подвижность клеток некоторых штаммов A, brautense на полужидких средах, индуцируя образование колоний, состоящих и> клеточных а1регатов, вместо концентрических макроколоний, Конканавалин Л и ФГЛ. имеющие другую специфичность, такою эффекта не провоцировали (Schetudko et at. 2007). Данные изучения влияния минелиадьного лектна на подвижность клеток показывают, что лектнн замедляет индивидуальную подвижность A. brasilense Sp245, причем длительность нккубянм« клеток бактерий с раствором .тектина (I мин или 30 Мин) существенной роли не ш рлет. Как показано на рис}нке 12, в диапазон концентраций лектина ы 0.1 до Í0 мкг/мл после инкубации в течение I мин происходит

снижение скорости движения А. Ьгаз!!еп5е Бр245 от 28.8±0.9 до 21.9±0.8 мки/с. Дальнейшее увеличение концентрации лсктинэ изменений скорости не вызывало

1 мнкуга инкубации • - 30 минут инкубации

О I 10 100 1000

кон 1и'Н грлиия л('кт имя. мкг/плл

Рнс. 12. влияние лектина С. /птгЬм 0917 на скорость движения бактерий А, ЬгозИете Йр245

Исследование подвижности бактерий мутаитных штаммов КМ 139, КМ252 и КМ348 до и после их инкубации с лектином в критической концентрации 10 мкг/мл в течение I мин показало, что под влиянием пектина скорость движения клеток КМ139 (с ЛПСГ) достоверно уменьшалась; скорость движения бактерий КМ252 и КМ348 (с ЛПСЛ) в присутствии пектина практически не изменялась (рис, 13).

30

1

Т

Ч

1

к К .30

1

е И

с;

%

£ 10

а

1

5

£

гЬ

□ матианде кул^турм 9 с л<*тнном < {Омкг'мд) (мки

•Л

К 4(3» КМ232

штачч

К ММ В

Рис, 13. Сравнительная характеристика изменений подвижности азосиирилл в присутствии мииелиалыюго лектииа

Мицелнальный лектнн С /гопЖпа 0917, хотя и имеет углеводную специфичность, принципиально отличную от вышеперечисленных растительных пектинов, пес же

вызывает замедление индивидуальной подвижности азоспирнлл, причем только у тех штаммов, в ЛПС которых экспонирован гаптенный лектину ОГ1С1, Следовательно, суть описываемого биологического эффекта не в углеводной специфичности лектнна вообще, а в том, чтобы посредством этой специфичности обеспечивался непосредственный контакт с поверхностью бактериальной клетки. То есть, в эффекте проявления биоспецифичсских лектин-углеводных взаимодействий также очень важным является высокое сродство к лектину самих углеводных рецепторов. Факт, что отмеченное нами замедление индивидуальной подвижности азоспнрилл имеет место лишь в оіраничснном диапазоне небольших концентраций инициального пектина, что ранее также отмечалось и дд* растительных лектинов со специфичностью к Ы-ацетил-р-Ь-глюкозамину (Scheludko el ai, 2007), говорит, скорее всего, о строго определенном количестве рецепторов для лектина иа поверхности бактериальных клеток. Таким образом, установленный факт, что бактериальные штаммы Sp245, КМ018 и КМ 139, в клеточной стенке которых экспонирован ЛПСІ с гаптенным лектину гриба ОПС1, распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма, а также то, что лектин оказывает влияние на подвижность бактерий штаммов Sp245 и КМ 139, свидетельствует об участии биоспецифичсских лектин-углеводных взаимодействий в первичном контакте мицелия G, frondosa 0917 и бактерий A. brasilense а процессе совместного культивирования, Лектин в данном случае является, скорее всего, неким селектирующим агентом, провоцирующим отклик только компетентных бактериальных клеток к обеспечивающим распознавался ьно-защнтную функцию лля гриба. Учитывая то, что ОПС1 и ОПС2 в составе ЛПСІ и ЛПСІІ бактерий имеют идентичное по химическому составу повторяющееся пентарамнановое звено, полученные результаты говорят в пользу существующей в гликобиологин точки зрения, что возможные, даже крайне незначительные, конформационные модификации углевода-peцентора существенно влияют на биоспецифическую активность лектина, и, в конечном итоге, на биологический ответ на уровне организмов.

Таким образом, представленные экспериментальные данные но выделению, характеристике н возможной функциональной роли мицелиального лектина базняиомицета С. frondosa 0917, а также подробный анализ этих данных с позиций современной лектннологии, подтверждают концепцию о лсктинах как агентах, играющих важную роль в потоке биоинформашш при процессах молекулярного/клеточного распознавания и адаптации. Полученные сведения о лектнне G. frondosa 0917, локализующемся на поверхности мнцелнальных гиф, показывают наличие структурных признаков, объединяющих его с лектнна ни, полученными из других базкднальных грибов (ди мерная структура, наличие углеводной части, отсутствие серосодержащих аминокислот), Однако углеводная специфичность получен ног« лектина кардинально отличается от подавляющего большинства подобных веществ базидиальной природы: лектин G. frondosa 0917, ие проявляющий сродства к свободным сахарам, блокируется линейным D-рамна ном в малых концентрациях, то есть является эндолсктином, Тот факт, что гаптенный лектину D-рамнан является ОПСІ наружной мембраны грамотриїюте льнон бактерии A. brasilense Sp245, позволяет предполагать, что эволюционное предназначение изучаемого грибного лектина как «агеша-дешифровщика» в переносе биоинформации заключается в том, чтобы распознавать по «ключевым» олигосахарндным звеньям биополимеры, широко представленные, как известно, в природе в поверхностных тканях растений н микроорганизмов. Понятно, что распознавание является первым этапом в процессах адаптации н защиты от антагонисток.

Данные сраинителъных расчетов степени аффинности (констаїгт равновесия) и изменения свободной энер«ии связывания лектина С. frondosa 0917 с антителами показывают, что комплекс лек™ на с не гомологичны ми антителами, обуславливающийся спецификой «лектин-углевод», и таковой с гомологичными антителами обеспечиваются примерно одинаковым количеством связей. Это служит в пользу концепции о

взаимодействии «антиген-антитело» как о частном случае высокой аффинности от общего приникла специфических взаимодействий, в основе которых лежит топологическая комплементарность молекул.

На основании полученных данных можно говорить о лектине G. frondosa 0917 как о факторе, характеризующемся достаточной универсальностью функционирования и выполняющем распознав ательно-защитную функцию в жизнедеятельности базидиомииета, Препарат лектнна С, frondosa 0917 может быть рекомендован для изучения клеточных полимеров грамотрицательных бактерий, а также для нммунохимических исследований, касающихся строения и функционирования антител.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена лектиновая активность в экстрактах дикариотического мицелия базиднального ксияотрофа G. frondosa 0917 при различных способах культивирования. Наибольшее проявление активности отмечено в отношении кативных эритроцитов кролика при использовании легких смывов поверхностного мицелия, полученного в процессе твердофазного культивирования,

2. Установлено, что лектин, выделенный из экстрактов поверхностного мицелия G. frondosa 0917, имеет молекулярную массу 67±1 кДа, состоит из двух субъединиц по 3334 кДа, и проявляет углеводную специфичность к линейному D-рамнану, который является ОПС1 наружной мембраны трамотрииатедьной бактерии Л. brasihnse Sp245.

3. Показано, что полученный лектин является гидрофильным термостабильным (с температурам диапазоном сохранения активности от —70 до +í0'Cj глнкопротсином с соотношением частей протеин: гликан как 3:1, Аминокислотный состав лектнна характеризуется наибольшим процентным содержанием аргинина, лизина, гметидина и аспарагнновой кислоты, а также полным отсутствием серосодержащих аминокислот метионина и цнетеина. В составе углеводной части определены глюкоза и глюкозамин.

4. Локализация лектнна на поверхности гиф мицелия характеризуется неравномерным и диффузным распределением с характерными скоплениями в пряжках и молодых гифальных отростках,

5. Обнаружено, что лектин G. frondosa 0917 способен к связыванию, как со специфическими, так и с неспецифическими пол нелокальными антителами кролика, а также с у-глобулином человека. Связывание пектина с гомологичными антнтедами происходит с участием. антигенсвязывающего центра (/^¿-фрагментов). Взаимодействие лектина с нсгомологичными антителами обусловлено его связыванием С углеводной частью молекул антител.

6. Впервые показано, что величины изменения суммарной свободной энергии A<f взаимодействий лектина с гомологичными и нсгомологичными антителами различаются несущесгветю, что говорит о примерно одинаковом количестве связей, участвующих в контакте молекул лектнна и антител обоих типов, хотя аффинность лектина к последним качестве! то отлична.

7. Лсктин-углеводные взаимодействия имеют место в процессах азаимораспсянавакия при контакте G, frondosa 0917 и бактерий A. brasiknse Sp245 и его Омегом-Km мутантов, дефектных по ЛПС. Показано, что совместные культуры с бактериями, в клеточной стснкс которых экснонирован ЛПС1 с гаптенным лектину мицелия ОПС1 (КМ018 и KMI39), характеризуются ббльшим pocrosbtM коэффициентом и наименьшим проявлением антагонизма, чем в случае совместных культур с аэоспиркдлами с ЛИСП (ОПС2) в составе клеточной стенки {КМ252 и KM34S).

8. Выявлено, что мицелиальный лектин в диапазоне концентраций 0.1-10 мкг/мл в течение 1 мин уменьшает подвижность в жидкой среде азоеннрнлл с ЛПС1 - А. brasilense Sp245 и его мутанта КМ 139. Подобного влияния на клетки штаммов КМ252 и КМ34И (с ЛИСП) не происходит.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Степанова Л. В., Ци вялее а ОМ., Ннкггина BE. Сравнительное исследование гемагглютинирующей активности ксилотрофнмх баз идиом и пето и разных систематических групп // Биология - наука XXI века: 8-я Международная Путинская школа« конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 мая 2004 г). Сборник тезисов. — Пущино; Изд-воПущиискогонаучногоцентраРАН,2004.-С. 162,

2. Никитина 8.Б., Цивилева О.М, Степанова Л.В., Лошинина Е.А. Поиск группоспецифичных. дектинов грибного происхождения // Успехи медицинской микологии. Под общ. научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. — М.: Национальная академия микологии, 2005. - Т. 5.-С. 201-205,

3. Степанова Л .В., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинииа Е.А., Гарибова Л.В., Тюрюкина Е. В, Гемагглютн пирующая активность некоторых базидиальяых ксилотрофов на стадии дикариотического мицелия // Микология и фитопатология. — 2006. -Т. 40, № 4. - С. 307-313,

4. Stepano'va L.V., Nikitina V.E„ Konnova S.A., Boyko A.S, Isolation and characterization of a sal i tie-soluble hemagglutinin from the bypha surface of dikaryotic mycelium of the xylotrophic basidiomycele Grifóla frondosa (Fr.) SF Gray strain 0917 // XXHIrd International Carbohy<trate Symposium (Whistler, Canada, July 23-28 2006). Book of abstracts. - Simon Fraser Univeisity, 2006. - P. 208,

5. Степанова Л.В., Бурьцин Г.Л., Никитина В.Е., Матора Л.Ю., Богатырев В,А, Изучение иммунохимических свойсгв мицелиального лекзина бааидиомицета Grtfóla frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917 //Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Ш Межрегиональная конференция молодых ученых (Саратов, 10-12 октября 2006 г). Сборник тезисов, — Саратов; Научная книга, 2006. - С. 29,

6. Степанова Л .В., Никитина В.Е., Шелудько АН. Совместное культивирование базидиомицета Grifóla frondosa (Fr.) S,F. Gray и ризобактерии AzospiriHum brasilense: значение специфических взаимодействий при первичном контактировании // Успехи медицинской микологии. — М.г Национальная академия микологии, 2007. — Т. 9. — С. 261-265.

7. Nikitina V E-, Tsívileva О.М., Vetchinkina E.P., Stepanova L.V., Loshchinina E.A. Lectins of xylotrophic basidiomycctcs Lentinus edades and Grifóla frondosa It XV Congress of European Mycologists (Saint-Retersburg, Russia, September 16-21, 2007). Abstracts. -St Retersburg: TREEART LLC, 2007. - P. 175.

8. Степанова Jl.В, Шелудько А.В., Никитина B.F.., Пономарева Е.Г. Участие лектина с поверхности мицелия базидиомицета Grifóla frondosa (Fr.) S F, Gray в биораспознавакии при контакте с бактериями рода Azospirüímn 11 Фунламентальньге и прикладные аспекты исследования си «биотических систем: Материалы Всероссийской конференции с международным участием (Саратов, 25-27 сентября 2007г). - Саратов; Научная книга, 2007, - С. 94.

9. Степанова Л,В., Ветчнпкнна Е.П., Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Никишиа В.Е. Влияние лектипов Grifóla frondosa (Fr.) S F. Gray и Lentinus edades (Berk.) Sing на инициацию их плодоношения It Вави.товские чтеиия-2007: Материалы международной конференции, посвященной 120-легию со дня рождения П И. Вавилова (Саратов, 2630 ноября 2007). - Саратов: Научная книга, 2007.-Т. I.-C. 199-200.

10. Степанова Jt.lt., Никитина В.Е,, Бойко А.С. Выделение и характеристика лектина с поверхности мицелия Grifóla frondosa (Fr.) S,F. Gray// Микробиология - 2007, — Т. 76, №4.-С. 488-493,

11. Sttpanova L.V., Schelud'ko A.V., Katsy E.I., Ponomareva E.G., and Nikitina V.E. The tole о fleet m-carbohydrate biospccific interactions between medicinal Bastdiomycetes mushroom Grifóla frondoso (Dicks : Fr.) S.F. Gray and AzospiriUum brastlensv during their co-cultivation// Int. J. Med Mushr.-2008,- Vol. 10, N I, - P. 65-72,

Подписано в печать 21.01 2008 Формат 60x84 1/16. Бум а га офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1.0 net, д. Тираж 100 эк?. Заказ №016,

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Сермш Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600 Саратов, ул. Московская, 152, офис 19, тел, 26-18-19,31-16-28