Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Агглютинины Rhizobium Leguminosarum 252 и их роль во взаимодействии с растениями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Агглютинины Rhizobium Leguminosarum 252 и их роль во взаимодействии с растениями"

На правах рукописи

СОБОЛЕВА Елена Федоровна

АГГЛЮТИНИНЫ РМИОВШМ 1-ЕвиМ1Ы08АРШМ 252 И ИХ РОЛЬ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С РАСТЕНИЯМИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1998

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроо| ганизмов Российской Академии Наук (ИБФРМ РАН г. Саратов).

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Карпунина Л.Е

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Щербаков А.А

академик АЕ, доктор медицинских наук, профессор Куляш Ю.В.

Ведущая организация: Саратовский государственный университет

им. Н.Г. Чернышевского

Защита состоится " 27 " октября 1998 г. в Ю00 на заседании диссертац! онного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском пр| тивочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, ул.Университетская, 46;

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб"

Автореферат разослан «^7 » сентября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I

Актуальность темы. Биологическая фиксация азота является одной из уальных проблем современной биологии. Усвоение бобовыми растения-биологического азота оказывает положительное влияние на рост, разви-и, в конечном счете, на урожайность ценных сельскохозяйственных ьтур таких как горох, фасоль, соя, клевер, люцерна, люпин, являющихся ювным источником пищевого и кормового белка. В связи с этим симбио-еское сообщество бобовых растений с клубеньковыми бактериями, в ко-ом и осуществляется процесс фиксации азота, изучается очень интен-но. Одним из перспективных подходов в понимании формирования сим->за является изучение тонких молекулярно-биохимических механизмов имодействия бактериальных и растительных клеток на ранних этапах рмирования симбиотической системы.

В литературе, по проблеме бобово-ризобиального симбиоза, сложилось цее представление о молекулярных механизмах "узнавания" симбионтов, оторых ведущая роль отводится лектин-углеводным взаимодействиям гго F. е! а1., 1975; Оагго Р. е! а1., 1977). Однако, до сих пор, практически всех публикациях изучаются только растительные лектины, бактериаль-же клетка выступает в качестве носителя углеводных рецепторов невич Л.И., 1979; Линевич Л.И. с соав., 1982; йагго Р.В. е! а!., 1980; ||оо1 В.В. е1 а!., 1974). А между тем, обнаружение агглютинирующих бел-на поверхности ризобий (Неитапп \/\/. 1968; Купе и Ж. е! а!., 1983) дает можность предположить более активную роль компонентов бактериаль-поверхности в процессах, вносящих свой вклад в эффективность взаи-(ействия бактерий с растением-хозяином. Изучение агглютининов у ризо-могло бы способствовать более полному пониманию молекулярных ос-в межклеточных и межвидовых взаимодействиях, а также внести опре-1енный вклад в фундаментальные исследования физиологической роли штининов ризобий в бобово-ризобиальной системе. Поскольку углевод-белковое узнавание играет ведущую роль в формиро-ии многоклеточных организмов и межвидовых сообществ как паразитиче-<, так и симбиотических (Линевич Л.И., 1979), исследование белков-1Ютининов (пектинов) как компонентов узнающей системы имеет большое ^биологическое значение.

Дель и задачи исследования. Цель работы состояла в выделении, еделении физико-химических свойств белков-агглютининов клеточной

поверхности бактерий /?Л/гоЬ/ит ¡едит'тозагит 252, и изучении их роли взаимодействии с растениями. В связи с этим были поставлены следуюи задачи:

1. Выделить агглютинины Я. Iедит'тозагит 252 и изучить их физи химические свойства.

2. Получить мутант, дефектный по гемагглютинирующей активности.

3. Определить роль агглютининов в прикреплении ризобиальных клето корням гороха.

4. Изучить взаимодействие агглютининов ризобий с фракциями корней го ха и слекгином корней гороха, пшеницы.

5. Выявить влияние агглютининов Я. Iедит'тозагит 252 на функциониро ние гидролитических и дыхательных ферментов корней проростков го ха.

Научная новизна. Впервые с клеточной поверхности почвенных аз фиксирующих симбиотических бактерий ЯЫгоЫит ¡едиттозагит 252 вы, лены белки-агглютинины, несвязанные с какими-либо филаментами.

Были изучены некоторые физико-химические свойства агглютининов Iедиттозагит 252.

Показано, что агглютинины ризобий могут играть роль адгезинов на чальных этапах формирования симбиотической системы "растение - бак рия".

Получен мутант Я. Iедиттозагит 252/7, дефектный по гемагглюти рующей активности.

Установлено взаимодействие агглютининов Я. ¡едит'тозагит 252 с фр циями корней проростков гороха и лектинами корней гороха и пшеницы.

Выявлены рецепторы, ответственные за связывание с агглютининами зобий.

Обнаружено влияние агглютининов Я. Iедиттозагит 252 на активно гидролитических и дыхательных ферментов растительной клетки.

Практическая значимость. Одним из перспективных направлени! решении ряда экономических и экологических проблем современного се ского хозяйства, является возможность замены минеральных удобрений бактериальные, что требует более глубокого и всестороннего изуче! взаимодействия растений с микроорганизмами.

Процесс прикрепления (адгезия) ризобий к корням бобовых являе первым этапом в многоступенчатом инфекционном процессе, ведущиг азотфиксирующему симбиозу, от эффективности которого, в конечном итс

висит урожайность ценных бобовых культур. Кроме того, изучение и пони-1ние молекулярных основ этого процесса поможет не только в получении роших урожаев, но и в защите растений от инфекции. Изучение агглютининов ризобий может способствовать дальнейшему по-анию молекулярных основ взаимодействия "бактерия-растение", эктерия-бактерия", а так же внести определенный вклад в фундаменталь-1е исследования физиологической и функциональной роли лектинов в са-|й бактериальной клетке.

Материалы диссертационной работы нашли применение при подготовке ограмм спецкурса "Взаимоотношение растений и микроорганизмов" и ецпрактикума "Методы препаративной биохимии" для студентов дневного зечернего отделений биологического факультета Саратовского госунивер-гета им. Н.Г.Чернышевского.

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке кур-вых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ. Полученные препараты агглютининов Я. Iедиттовагит 252 используются и проведении плановых научно-исследовательских работ в лаборатории 13иологии растительной клетки ИБФРМ РАН.

Применение и использование материалов диссертации подтверждается этветствующими актами.

На защиту выносятся следующие основные положения:

Выделение и изучение физико-химических свойств агглютининов \eguminosarum 252.

Определение роли белков-агглютининов в процессе прикрепления ризо-биальных клеток к корням гороха.

Выявление взаимодействия агглютининов с фракциями корней проростков гороха и лектинами корней растений.

Обнаружение бактериальных и растительных рецепторов агглютининов /?. \eguminosarum 252.

Влияние агглютининов Я. Iедит'тозагит 252 на активность гидролитических и дыхательных ферментов растительной клетки. Работа выполнена в лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН в соот-гствии с плановой тематикой "Физиолого-биохимическая роль белков-лютининов клеточной поверхности бактерий" (№ гос. регистрации Э10022283).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы пред-авлялись на Международном Рабочем совещании по ассоциативному

взаимодействию азотфиксирующих бактерий с растениями (Саратов, Рос

1995); Второй Европейской конференции по азотфиксации (Познань, Поль

1996); Втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, Россия 19! Международной пектиновой конференции "1п1ег1ес - 17" (Вюрцбург, Гер ния 1997) и на отчетных конференциях ИБФРМ РАИ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ в отечеств ной и зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, т глав, включающих обзор литературы, описания материалов и методов следования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заклк ния, выводов и списка использованных литературных источников. Раб изложена на 119 страницах, иллюстрирована 24 рисунками и содержит таблиц. Список использованных литературных источников включает 172 именований, в том числе 124 зарубежных.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор представлен в первой главе, где дано общее нятие о агглютининах (лектинах) бактерий. Рассмотрено участие лекти растений в углевод-белковом взаимодействии. Обсуждена роль бактериа ных агглютининов в процессе взаимодействия бактерий с растениями

Материалы и методы

Объектом исследований служил штамм ЯЫгоЫит Iедиттовагит уюае 252, полученный из Всесоюзной коллекции /?/?¡гоЫит ВНИИСХМ Санкт-Петербург, Пушкин) и мутант этого штамма ПЫгоЫит 1едит'тоза1 252/7, дефектный по гемагглютинирующей активности, полученный нами вместно с лабораторией генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Се тов).

Культуру Я. /едитюозагит 252 и Я. Iедит'тозагит 252/7 выращивали 28°С в течение 3-х суток на жидкой синтетической среде Ковалеве (Ковалевская Т.М., 1984). Для культивирования штаммов бактерий испс зовали также гороховую среду (Ежов Г.И., 1981).

Белки-агглютинины выделяли с бактериальной поверхности трижды мытых 0,15 М физиологическим раствором клеток ризобий (6000д по 10 м по методу Эшдата (ЕзЬс]а1 У. е1 а1., 1978).

Очистку белков проводили, гель-фильтрацией на колонке, используя но-ель Toyopearl HW-55. В качестве элюэнта использовали ацетатный бур рН=3,6-3,8 (0,2 М). Выход белковых фракций регистрировали на лрибо-Uvicord S-ll (LKB) при 278 нм. Содержание белка определяли по методу гдфорд (Bradford М.А., 1976).

Гемагглютинирующую активность белков определяли реакцией гемагглю-1ации с самопроизвольным осаждением эритроцитов (Lis Н., 1972). Молекулярные массы белков определяли с помощью диск-!югрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом рия (SDS) (Laemmli V., 1970). Белки окрашивали 0,2% раствором Кумасси >50 (Гааль Э. с соав., 1982) или 0,1% раствором серебра (Блохин Д.Ю., S8).

Аминокислотный состав белков и аминосахара определяли на аминокис--ном анализаторе ААА-339 (ЧССР) (Под ред. В.Г. Конарева., 1973). Моносахаридный состав изучали методом газожидкостной хроматогра-и (Dishe Z., 1947).

Для определения специфичности агглютининов применяли метод подавая его активности углеводами (Луцик М.Д. с соав., 1981). В работе ис-ьзовали 28 углеводов (0,3 М) фирмы "Serva".

Оценку адгезивных свойств бактериальных клеток на эритроцитах крови ювека проводили по методу Брилиса (Брилис В.И. с соав., 1986). Изучение адгезии клеток ризобий на корнях проростков гороха сорта Ула-¡ский юбилейный, проводили изотопным методом с использованием 1-1"С) глюкозы. Счет радиоактивности вели в толуол-тритоновом сцинтил-оре (Остерман Л.А. 1983) жидкостным сцинтиляционным счетчиком 1211 ;k-Beta (LKB-Wallac). Количество бактериальных клеток определяли с по-дью спектротурбидиметрического метода (Shchyogolev S. Yu. et al., 1981). Фракцию экзокомпонентов получали методом мягкого фосфатно-солевого 1=7,2) смыва с корней проростков гороха. Мембранную фракцию получали ем растирания корней проростков с помощью кварцевого песка, удаления (орастворимых белков и дальнейшей экстракцией 1%-м раствором трито-Х-100 (Полевой В.В. с соав., 1978).

Взаимодействие бактериального агглютинина с ризобиальными полиса->идами изучали методом интерфазных колец преципитации в геле (Kato et al.. 1980).

Антитела к агглютининам R. leguminosarum 252 получали путем иммуни-[ии кроликов. При этом вводили подкожно в 6 точек спины 40-50 мкг/мл

препарата агглютинина в смеси с равным объемом адъюванта Фрей1 (Berquist N. et al., 1970).

Реакцию иммунодота проводили на нитроцеллюлозных фильтр (диаметр пор 1.5 мкм, "Synpor") (Егоров А.Н. с соав., 1991) с использовав коллоидного золота диаметром 10-30 нм, стабилизированного протеиног (Bogatyrev V.A. et al., 1992).

Для переноса белков с гелевой пластинки на нитроцеллюлозный м бранный фильтр использовали метод электроблотинга (Burnett W.N., 1981 Получение мутанта штамма R. leguminosarum 252 осуществляли хи ческим мутагенезом, используя нитрозогуанидин (Adelberg Е.А. et al., 1965 Суммарную активность протеолитических ферментов определяли по тоду Preston et al.(Ермаков А.И., 1987).

р-Глюкозидазная активность была определена по методу Ki-Sun Kwon Sun Kwon et al., 1978).

Определение малатдегидрогеназной активности проводили по мет< Е.Г. Сальковой и Ю.В. Звягинцевой (Ермакова А.И. 1987).

Определение активности НАДН-дегидрогеназы проводили по методу I левого (Полевой В.В. с соав., 1986).

Определение активности сукцинат- и лаю-атдегидрогеназ проводили методу Сысоева А.Ф и Красной Т.С. (Плешков Б.П., 1985).

Результаты экспериментов подвергали статистической обработке (Ой| И.А. 1960).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физико-химические свойства агглютининов Rhizobium leguminosarum 252

Используя методы белковой химии с поверхности клеток leguminosarum 252 были выделены два белка, обладающие гемагглюти рующей активностью, условно обозначенные нами как Ri и R2 с молекул ными массами 47 и 45 кДа (рис. 1). Как было ранее показано, агглютининь leguminosarum 252 располагаются равномерно по всей поверхности бакте альной клетки и не связаны с какими-либо фибриллярными структуре (Карпунина Л.В. с соав., 1995).

Агглютинины по своей природе являются гликопротеинами. Аминокисг ный состав характеризовался большим содержанием кислых аминокисг отсутствием цистина и качественно не отличался друг от друга.

67,0 -

43,0

Основными идентифицируемыми когипонен- кДа ами углеводной части обоих агглютининов были люкоза, галактоза, манноза и глюкозамин.

Несмотря на широкий спектр применяемых тлеводов специфичность к простым углеводам 1е была обнаружена.

В связи с поиском возможных рецепторов для 1гглютинин0в ризобий изучали способность агг-1Ютининов, на примере Я^, взаимодействовать с 30 0 _ неклеточными полисахаридами и липополиса-:аридами, находящимися на поверхности /?. ?дит'юозагит 252. рис

Явно выраженные кольца Преципитации были агглютининов Я. ¡едиттовагит бнаружены через сутки при взаимодействии „„А „

1 1 - белки-маркеры: ВБА (67 кДа),

гглютинина ^ как с липополисахаридами, так и овальбумин (43 кДа), карбоан-

нефракционированными экзогликанами (рис. гидраза (30 кДа);

2 - агглютинин Р,;

)• 3 - агглютинин Я2.

Таким образом, проведенные исследования показали, что рецепторами изобиальных агглютининов являются не простые сахара или ди- и трисаха-иды, а углеводы более сложного строения, в частности полисахариды тех

I

1 2 3 1 Электрофореграмма

1 2 3 4 5 6

эис. 2 Взаимодействие агглютинина Н /едиттоэагит 252 с несанкционированными экзогли-нами (1, 2, 3.) и липополисахаридами (4, 5, 6) этого же штамма Верхняя водная фаза - раствор лютинина К: (мкг мл) 1 4 - 500. 2 5 - 250 3.6 -1 25. нижняя гелевая фаза - желатин (3 %) и :твор полисахарида (1 мг мл) в соотношении 1 1

же ризобиальных клеток, из которых были выделены агглютинины.

2. Характеристика мутантных клеток Я. 1едит1позагит 252/7,

дефектных по гемагглютинирующей активности

Для выяснения роли агглютининов в процессах, происходящих пр взаимодействии бактерий с растениями, предполагалось получение мутант дефектного по гемагглютинирующей активности. Такие клетки ризобий быт получены из штамма Я. Iедиглюовагит 252 с помощью нитрозогуанидина обозначены как Я. ¡едит'товагит 252/7.

Отсутствие гемагглютинирующей активности у клеток мутантного штамм мы первоначально связывали с отсутствием агглютининов на их поверхн! сти. Однако этот факт не нашел подтверждения в наших дальнейших иссл< дованиях. С поверхности клеток Я. Iедит'тозагит 252/7 были выделены де белка, условно обозначенные как и Р'2. По белковому профилю и по вр< мени выхода с колонки белки мутантного штамма совпадали с агглютинин! ми родительского штамма и По данным диск-электрофореза в 10' ПААГ с БОЭ была установлена молекулярная масса, которая, как оказалос была идентична молекулярной массе агглютининов клеточной поверхност родительского штамма и равнялась соответственно 47 и 45 «Да. Отсутствк гемагглютинирующей активности у мутантных клеток, как видно, не быг связано с отсутствием агглютининов на их поверхности, а происходило, во можно, либо за счет каких-то структурных изменений в этих белках, что, конечном счете, приводило к утрате их основного биологического свойства способности к агглютинации, либо причиной потери агглютинирующей акти! ности могло стать блокирование углеводсвязывающих сайтов другими би( логическими структурами.

В пользу первого предположения говорят данные аминокислотного сост; ва этих соединений. Сравнительным анализом аминокислотного состава аг лютининов родительского и мутантного штамма выявлены, наряду с I* сходством, и некоторые различия. Сходным являлось большое содержав серина, глицина, лейцина, небольшое содержание аргинина, отсутствие ци тина. Как агглютинины исходного штамма, так и агглютинины мутанта о держали в своем составе большое количество кислых аминокислот. Одна! агглютинины Я. Iедитюозагит 252 содержали в 2 раза меньше глутаминовс кислоты, чем белки Я. Iедит'тозагит 252/7, и в 1,5 раза меньше аспарагин вой кислоты. Различие проявлялось в отсутствии метионина и тирозина агглютининах мутантного штамма.

В пользу второго предположения гово-ят исследования "смывов", образуемых а первых стадиях выделения агглютини-ов с поверхности клеток ризобий при об-аботке клеток фосфатно-солевым буфе-ом рН=7,2. Методом гель-электрофореза градиенте 7,5-15% ПААГ с SDS в ;мыве" клеток родительского штамма ыла обнаружена белковая полоса, кото-ая отсутствовала в "смыве" клеток му-энтного штамма, (рис. 3). Роль этого елка пока неизвестна, но поскольку он ыходит достаточно легко в "промывные оды" после грубой очистки клеточной оверхности исходного штамма и остается на поверхности мутантных кле-эк, то, возможно, находясь на внешней мембране, он образует комплекс с гглютинином и блокирует тем самым его агглютинирующие свойства.

. Изучение роли агглютининов Rhizobium leguminosarum 252 в адгезии к корням проростков гороха

В настоящее время для многих почвенных бактерий Klebsiella, seudomonas, в том числе и Rhizobium (Heumann W., 1968; Kijne J., 1983; aahtela K. et al., 1985), достаточно хорошо известно, что пили бактерий, вы-элняют роль адгезинов в прикреплении бактерий к растениям. Относитель-э агглютининов почвенных азотфиксирующих бактерий, непилийного прохождения, таких сведений имеется немного (Smit G. et al., 1989) и они не эскрывают в полной мере значения этих белков.

Как показали электронно-микроскопические исследования на поверхности теток Rhizobium leguminosarum 252, выращенных при 28°С, было обнаруже-э значительное количество пилей. В то время как при 1ГС клетки либо не иели пилей, либо их было незначительное количество.

При изучении адгезии ризобиальных клеток, выращенных в разном тем-эратурном режиме, к эритроцитам крови человека было установлено, что гсутствие пилей или их незначительное количество при 11°С не приводило отсутствию адгезии, а наоборот, индекс адгезивности микроорганизмов был эльше, чем при температурном режиме 28°С (4,4 и 3,4 соответственно). Эти энные хорошо коррелировали с гемагглютинирующей активностью ризоби-

1 2 Рис. 3 Электрофореграмма "смыва" с клеток:

1 - R. leguminosarum 252/7, 2-R. leguminosarum 252.

альных клеток, которая при 11°С была выше, нежели при оптимальной тег пературе 28°С. Титр агглютинации разнился в два раза.

Процесс адгезии не ингибировался также маннозой и галактозой, являн щимися специфическими гаптенами к адгезинам пилийного происхождения.

Полученные результаты позволили говорить о том, что в адгезии ризоб! альных клеток могли участвовать агглютинины непилийного присхождения.

При выяснении роли агглютининов в npi креплении клеток ризобий к корням прор< стков гороха использовали изотопный м< тод. Результаты проведенных экспериме1 тов показали, что клетки ризобий адсорб! ровались на корнях проростков гороха. Бь ло замечено, что предварительная обр; ботка корней агглютинином (R0 / leguminosarum 252 приводила к уменьш< нию адсорбированных бактерий на корня гороха. В контрольных вариантах при обр< ботке корней BSA, конканавалином (СопА), лектином Bacillus polymyxa 1461 ингибирования прикрепления ризобий к ко| ням гороха не наблюдалось (рис. 4).

Таким образом, экспериментально показано, что агглютинины ризоби! расположенные на внешней мембране, выполняют роль адгезинов в проце< се прикрепления бактерий к корням растений. Подтверждают это и экспер! менты проводимые с мутантными клетками.

Изучение изотопным методом прикрепления клеток мутантного штамм; дефектного по гемагглютинирующей активности к корням гороха показал! что, как и клетки родительского штамма, они также адсорбировались на ко; нях, однако количество их было в 2,6 раза меньше, чем клеток родительск< го штамма (табл. 1). Отсутствие агглютинирующей активности у клеток риз< бий, как оказалось, сказывалось на их прикреплении к корням растений, чт

Таблица

Количество клеток R. leguminosarum 252 и R. leguminosarum 252/7, _прикрепившихся к корням проростков гороха_

Штаммы Количество прикрепившихся клеток P

M ± m

R. leguminosarum 252 0,31х10ь± 0,05x105 -

R leguminosarum 252/7 0,12x10=± 0,03x105 < 0,01

250

Рис. 4 Прикрепление клеток R. leguminosarum 252 к корням проростков гороха: 1 - корни без предобработки; корни после обработки: 2 - агглютинином R. leguminosarum 252 (Rt), 3 - BSA, А - Con А, 5 - лектином Bacillus polymyxa 1460 (Jli)

позволяет говорить о том, что в адгезивном процессе, наряду с различными поверхностными структурами бактерий и растений в прикреплении клеток ризобий к корням проростков гороха, важную роль играют и агглютинины, локализованные на клеточной поверхности этих бактерий.

4. Взаимодействие агглютининов ризобий с фракциями корней гороха

Участие агглютининов в проявлении адгезивных свойств бактерий позволило предположить определенную роль бактериальных лектинов в процессах межклеточных взаимодействий по отношению к растительным корням.

В связи с поиском возможных рецепторов со стороны макросимбионта мы изучали способность агглютининов - Р, и взаимодействовать с фракцией экзокомпонентов (Фэ) и с мембранной фракцией (Фм) корней гороха.

Проведенные исследования методом иммунодота показали, что агглютинины Я. ¡едит'тозагит 252 взаимодействуют как с фракцией экзокомпонентов, так и с мембранной фракцией корней проростков гороха.

Дальнейшими экспериментами были выявлены белки фракций проростков корней гороха, ответственные за связывание с агглютининами Я. 'едитюозагит 252 (рис. 5, 6).

кДа

94 -6743-

I

- 105

- 76

- 40

кДа

946743-

- 103

- 55

30 -

30-

- 28

- 17

- 10 1 2 3

Рис. 5 Белки фракции экзокомпонентов юрней проростков гороха, взаимодействующие с агглютининами RJegumirosarum 252.

1 - белки-маркеры фосфорилаза (94 кДа),

BSA - (67 кДа). овальбумин (43 кДа). кар-бангидраза (30 кДа)

2 - белки фракции взаимодействуюшие с R-.

3 - белки фракции, взаимодействуюшие с R2

14,4- —

1 2 3 Рис. 6 Белки мембранной фракции корней проростков гороха, взаимодействующие с агглютининами R.leguminosarum 252.

1 - белки-маркеры: фосфорилаза (94 кДа). BSA -

(67 кДа). овальбумин (43 кДа). карбангидраза (30 кДа), L-лактальбумин (14,4 кДа)

2 - белки фракции, взаимодействуюшие с R..

3 - белки фракции, взаимодействуюшие с R2

В результате проведенных опытов было выявлено, что из фракции экзо-компонентов с Ri взаимодействовали белки с молекулярными массами 40 и 105 кДа; с R2 - 10, 17, 76 кДа. Из мембранной фракции с R- взаимодействовали белки с молекулярными массами 55, 103 кДа; с R2 - 28 кДа.

Мы полагаем, что способность бактериальных агглютининов взаимодействовать с растительными белками может приводить к образованию ассоциативных связей (мостиков) между растением-хозяином и микросимбионтом.

5. Взаимодействие агглютининов ризобий с пектинами корней

гороха и пшеницы

Симбиотические взаимодействия между бобовыми растениями и ризоби-альными клетками изучаются давно, и долгое время существовала точка зрения, что клетки ризобии не способны к успешному взаимодействию с поверхностью однодольных растений. И только в последнее время появились немногочисленные публикации, показывающие отсутствие узкой специфичности у ризобий, и роль поверхностных белков в этом взаимодействии (Smit G., Logman Т. et al., 1989). Smit с соав. (Smit G., Kijne J. et al., 1989) считают, что белок рикадгезин, локализованный на поверхности бактерий семейства Rhizobiaceae и ответственный за первый этап прикрепления к кончику корневого волоска бобовых растений, принимает участие в специфическом прикреплении к кончикам корневых волосков однодольных растений - пшеницы, ячменя.

Наши исследования также показали возможность взаимодействия

_■•<>- ризобиальных агглютининов как с ■»«

лектином растения-хозяина (гороха), " так и с лектином пшеницы (рис. 7).

abed Вышеизложенные сведения ука-

РИС. 7 Взаимодействие агглютининов R. зывают на т0 чт0 взаимодействие legummosarum 252 R, (a), R2 (Ь) с лектином корней

гороха и R, (с). R2(d) с лектином корней пшеницы между растением и бактериями на

начальных этапах инфицирования необходимо рассматривать как многоступенчатый процесс, состоящий из серии чередующихся взаимодействий, которые определяются не только узнающей способностью растений, но и бактерий.

6. Изучение влияния агглютининов Л Iедит'тоэагит 252 на активность некоторых гидролитических ферментов растительной клетки

Физиологическая роль бактериальных лектинов, как показывают работы последних лет, не сводится только к функциям адгезинов. В литературе встречаются сведения о взаимодействии лектинов с ферментами.

При формировании бобово-ризобиального симбиоза, как известно, одним из важнейших этапов является проникновение ризобий в инфекционную нить. Условием проникновения является размягчение стенок корневых волосков бобовых растений (Ципддгеп Н. е1 а1., 1961; РаЬгаепэ О. е! а1., 1959). Электронно-микроскопические исследования позволили обнаружить четкие зоны гидролиза клеточной стенки с адсорбированными ризобиями в месте инфекции (СаПаЬат Р.А. е! а1., 1981).

Агглютинины ризобий как было нами ранее показано (Кагрипта 1_.В. е{ а1., 1997), способны уменьшать в различной степени активность ряда гидролитических ферментов в самой бактериальной клетке.

Вполне возможно, что при взаимодействии бактериальных клеток с бобовыми, агглютинины ризобий, локализованные на поверхности наружной мембраны бактерий, могут функционировать как эффекторы некоторых гидролитических ферментов и в растительной клетке.

Проведены исследования по изучению влияния агглютининов ризобий на [3-глюкозидазую и протеолитическую активности корней проростков гороха (табл. 2).

Таблица 2

Влияние агглютининов Я?. \eguminosarum 252 на активность гидролитических ферментов корней проростков гороха

Опыт

Ферменты Контроль Р!2

М + т М±т Р М ± т Р

протеолитические (мг ала/мин/мг) 0,012 ±0,0018 0,022 ±0,0023 <0,01 0,020 ±0,0024 <0,05

Р-глюкозидаза (мМ/мин/мг) 0,003 ±0,0004 0,006 ±0,0005 <0,001 0,005 ± 0,0003 <0,001

Как видно из приведенных в таблице экспериментальных данных, агглютинины Я. ¡едиттозагит 252 увеличивали активность р-глюкозидазы и суммарную протеолитическую активность корней проростков гороха. Таким образом, не исключается возможность того, что агглютинины ризобий, находящиеся на поверхности ризобиальных бактерий, являются своеобразными

активаторами некоторых гидролитических ферментов растительной клетки тем самым способствуя проникновению ризобиальной клетки в ткани расте ния при формированиии бобово-ризобиального симбиоза.

7. Изучение влияния агглютининов /?. Iедигт'позагит 252 на

активность дегидрогеназ растительной клетки

Формирование бобово-ризобиального симбиоза предусматривает струк турное и функциональное взаимодействие бактериальной и растительно! клеток. Способность агглютининов ризобий взаимодействовать с белкам! мембранной фракции клеток корней проростков гороха позволило нам пред положить, что возможно агглютинины ризобий способны оказывать какое-т< влияние на функциональное состояние мембраны растительной клетки. Од ним из критериев, характеризующих состояние мембранного аппарата расти тельной клетки, может являться определение активности некоторых мем бранносвязанных дыхательных ферментов, например, дегидрогеназ (табл 3).

Определение активности малат-, лактат-, НАДН-дегидрогеназ в корня; проростков гороха показало, что инкубация корней а агглютининами как с Р^ так и с К2 не приводит к заметному изменению активности этих ферментов Полученные данные указывают на отсутствие каких-либо действий аггглюти нинов ризобий на эти ферменты.

Таблица :

Влияние агглютининов И. Iедит'тозагит 252 на активность дегидрогеназ корней проростков гороха

Ферменты Контроль М ± т Опыт

Р Иг Р

М ± т М ± т

Малатдегидрогеназа (ДЕ/мин/мг) 0,022 ± 0,004 0,020 ± 0,004 >0,1 0,030 ±0,007 >0,1

Лактатдегидрогеназа (мМ/мин/мг) 0,007 ± 0,0007 0,007 ± 0,0004 >0,1 0,006 ±0,0005 >0,1

НАДН-дегидрогеназа (ДЕ/мин/мг) 0,002 ± 0,0003 0,002 ± 0,0004 >0,1 0,003 ±0,0005 >0,1

Сукцинатдегидрогеназа (мМ/мин/мг) 0,006 ± 0,0008 0,020 ± 0,005 <0,02 0,010 ±0,001 <0,0'

При исследовании ферментативной активности сукцинатдегидрогеназы I корнях проростков гороха инкубированных с и Р?2 нами было обнаружен« достоверное увеличение активности этого фермента. Активность сукцинат

}егидрогеназы в корнях проростков гороха инкубированных с ^ была в 3,3 эаза, с в 1,7 раза выше по сравнению с контролем.

Увеличение активности сукцинатдегидрогеназы может свидетельствовать )б увеличении функциональной активности митохондрий, поскольку из лите-)атурных данных известно, что сукцинатдегидрогеназа является единствен-1ым из ферментов цикла трикарбоновых кислот локализованный на внутрен-сей мембране митохондрий (Игамбердиев А.У. с соав., 1994). Данное дейст-те агглютининов аналогично действию белков теплового шока, которые рачительно увеличивали функциональную активность митохондрий при (ействии высоких температур на растение (Войников В.К. с соав., 1988).

ВЫВОДЫ

1. С поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Я. Iедитюозагит 252 выделены два агглютинина с молекулярными массами 47 и 45 кДа, являющиеся по своей природе гликопротеинами. Аминокислотный состав характеризуется большим содержанием кислых аминокислот и отсутствием цистина. В состав углеводной части агглютининов входят глюкоза, манноза, галактоза и глюкозамин.

2. Показано, что агглютинины Я. 1едитюо8агит 252 принимают участие в прикреплении бактерий к корням гороха. Доказательством участия агглютининов ризобий в качестве адгезинов являются исследования проводимые с клетками мутантного штамма, дефектного по гемагглютини-рующей активности. Изотопным методом выявлено снижение количества прикрепившихся мутантных клеток в 2,6 раза по сравнению с клетками родительского штамма.

3. Обнаружено взаимодействие агглютининов Я. Iедитюозагит 252 с фракцией экзокомпонентов и мембранной фракцией корней проростков гороха, выявлены растительные белки, ответственные за связывание с бактериальными агглютининами.

4. Установлено, что агглютинины ризобий обладают способностью связываться не только с пектином растения-хозяина, но и с пектином пшеницы.

5. Впервые показано, что агглютинины Я. Iедиглюовагит 252 оказывают влияние на активность гидролитических ферментов и маркерных мембранных дегидрогеназ. В корнях проростков гороха , инкубированных с агглютининами, обнаружено достоверное увеличение протеолитиче-

ской и р-глюкозидазной активностей и значительное возрастание ак тивности сукцинатдегидрогеназы растительной клетки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карлунина Л.В., Никитина В.Е., Колтунова Е.Ф., Косенко Л.В., Пацевг М.А., Чернева И.Н. Взаимодействие агглютинина Rhizobiun leguminosarum 252 с ауто- и растительными рецепторами // Микробио логический журнал, 1995, т.57, №1. С.64-70.

2. Карпунина Л.В., Савенкова Н.Н., Владимирова М.В., Колтунова Е,Ф. Никитина В.Е. Агглютинины Rhizobium leguminosarum и их роль вс взаимодействии с растениями // Известия РАН. Серия биологическая

1996, №6, С.698- 704.

3. Karpunina L.V., Pronina О.А., Soboleva E.F., Nikitina V.E. Study of the functions of Rhizobium agglutinins // Program Abstr. 2nd European Nitroger Fixation Conference & NATO. Advanced Research Workshop. Septembei 8-13, 1996, Poznan, Poland, P. 137.

4. Соболева Е.Ф., Карпунина Л.В. Участие агглютининов Rhizobiun leguminosarum 252 в адгезивном процессе // "Проблемы общей биологии и прикладной экологии" Сборник трудов молодых ученых. Под. ред В.Г. Шляхтина, СГУ. Вып. №1, 1997. С.13-15.

5. Соболева Е.Ф., Карпунина Л.В., Никитина В.Е. Влияние белков-агглютининов Rhizobium leguminosarum 252 на активность сукцинатдегидрогеназы корней гороха // Тезисы стендовых сообщений. Второй съезд Биохимического общества РАН. 19-23 мая 1997, Москва. С.234.

6. Karpunina L.V., Soboleva E.F., Pronina О.А. Study of the effect о Rhizobium leguminosarum 252 agglutinins on the activities of certair hydrolytic enzymes // lnterlec-17. 17th International Lectin Meetinc Würzburg (Germany), September 24-27, 1997. P. 16.

7. Карпунина Л.В., Пономарева Е.Г, Соболева Е.Ф., Никитина В.Е. Изуче ние бактерицидных и фунгицидных свойств белков-агглютининоЕ (пектинов) почвенных азотфиксирующих бактерий // Биотехнология

1997. №3. С.10-13.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соболева, Елена Федоровна, Саратов

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ И МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Соболева Елена Федоровна

Агглютинины ИМгюЫит 1еецт1позашт 252 и их роль во взаимодействии с растениями

03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н, с.н.с. Карпунина Л.В.

Саратов, 1998

Содержание

Введение ................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие "агглютинины (лектины)"....................................11

1.2. Бактериальные агглютинины..............................................13

1.3. Основные представления об углевод-белковом взаимодействии бактерий с растениями..................................22

1.3.1. Участие лектинов растений в углевод-белковом взаимодействии бактерий с растениями..........................23

1.3.2. Роль агглютининов бактерий во взаимодействии бактерий с растениями..............................................................25

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследований, условия культивирования..........32

2.1.1. Среды, используемые для культивирования микроорганизмов..................................................................................33

2.2. Методы......................................................................................33

2.2.1. Выделение и очистка агглютининов ризобий..................33

2.2.2. Определение гемагглютинирующей активности................34

2.2.3. Определение молекулярной массы белков........................35

2.2.4. Определение аминокислотного состава белков..............35

2.2.5. Определение углеводного состава....................................36

2.2.6. Определение углеводной специфичности агглютининов 36

2.2.7. Определение адсорбции клеток ризобий на эритро-

цитах крови человека..........................................................37

2.2.8. Определение адсорбции клеток ризобий на корнях проростков гороха................................................................38

2.2.9. Выделение фракций корней проростков гороха..............39

2.2.10. Метод интерфазных колец преципитации в геле............40

2.2.11. Получение антител к агглютининам ризобий..................40

2.2.12. Метод иммунодота..................................................................41

2.2.13. Метод электроблотинга........................................................41

2.2.14. Получение мутанта, дефектного по гемагглютиниру-ющей активности....................................................................42

2.2.15. Определение активности ферментов..................................43

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Физико-химические свойства агглютининов 1?. топоБагит 252.................................... 48

3.2. Характеристика мутантных клеток 1?. 1 ерилИпоБагит 252/7, дефектных по гемагглютинирующей активности 57

3.3. Изучение роли агглютининов 1?. 1е^ит1поБагит 252

в адгезии к корням проростков гороха............. 61

3.4. Взаимодействие агглютининов ризобий с фракциями корней гороха.................................... 67

3.5. Взаимодействие агглютининов ризобий с лектином корней гороха, пшеницы........................... 76

3.6. Изучение влияния агглютининов Я. 1е^т1поБагиш 252 на активность гидролитических ферментов растительной клетки................................... 79

3.7. Изучение влияния агглютининов /?. 1е^т1позагит

252 на активность дегидрогеназ растительной

клетки......................................................................................8?

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................96

ВЫВОДЫ......................................................................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................100

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BSA - бычий сывороточный альбумин

SDS - додецилсульфат натрия

IgG - иммуноглобулины

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ИАМ - индекс адгезивности микроорганизмов

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ТТХ - 2,3,5-трифенил тетразолий хлористый

WGA - лектин пшеницы

ПААГ - полиакриламидный гель

СопА - конканавалин А

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ГА - гемагглютинирующая активность

Ri и R2 ~ агглютинины R. leguminosarum 252

Fs - фракция зкзокомпонентов корней гороха

Fm - мембранная фракция корней гороха

вв

яла I I

Актуальность темы. Биологическая фиксация азота является одной из актуальных проблем современной биологии. Усвоение бобовыми растениями биологического азота оказывает положительное влияние на рост, развитие и, в конечном счете, на урожайность ценных сельскохозяйственных культур таких как горох, фасоль, соя, клевер, люцерна, люпин, являющихся основным источником пищевого и кормового белка. В связи с этим симбиотическое сообщество бобовых растений с клубеньковыми бактериями, в котором и осуществляется процесс фиксации азота, изучается очень интенсивно. Одним из перспективных подходов в понимании формирования симбиоза является изучение тонких молекулярно-биохимических механизмов взаимодействия бактериальных и растительных клеток на ранних этапах формирования симбиотической системы.

В литературе, по проблеме бобово-ризобиального симбиоза, сложилось общее представление о молекулярных механизмах "узнавания" симбионтов, в которых ведущая роль отводится лектин-углеводным взаимодействиям (1, 2). Однако, до сих пор, практически во всех публикациях изучаются только растительные лектины, бактериальная же клетка выступает в качестве носителя углеводных рецепторов (3-6). А между тем, обнаружение агглютинирующих белков на поверхности ризобий (7, 8) дает возможность предположить более активную роль компонентов бактериальной поверхности в процессах, вносящих свой вклад в эффективность взаимодействия бактерий с растением-хозяином. Изучение агглютининов у ризобий могло бы способствовать более полному пониманию молекулярных основ в межкле-

точных и межвидовых взаимодействиях, а также внести определенный вклад в фундаментальные исследования физиологической роли агглютининов ризобий в бобово-ризобиальной системе.

Поскольку углевод-белковое узнавание играет ведущую роль в формировании многоклеточных организмов и межвидовых сообществ как паразитических, так и симбиотических (3), исследование белков-агглютининов (лектинов) как компонентов узнающей системы имеет большое общебиологическое значение.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в выделении, определении физико-химических свойств' белков-агглютининов 'клеточной поверхности бактерий 1?Ы2оЫит 1е(?ит1поБагит 252, и изучении их роли во взаимодействии с растениями. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выделить агглютинины ¡е^иттоБагит 252 и изучить их физико-химические свойства.

2. Получить мутант, дефектный по гемагглютинирующей активности.

3. Определить роль агглютининов в прикреплении ризобиальных клеток к корням гороха.

4. Изучить взаимодействие агглютининов ризобий с фракциями корней гороха и с лектином корней гороха, пшеницы.

5. Выявить влияние агглютининов /?. 1е^иттоБагит 252 на функционирование гидролитических и дыхательных ферментов корней проростков гороха.

Научная новизна. Впервые с клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих симбиотических бактерий КЫгоЫит 1е^ит1поБагит

252 выделены белки-агглютинины, несвязанные с какими-либо фила-ментами.

Были изучены некоторые физико-химические свойства агглютининов 1е&ит1поБагит 252.

Показано, что агглютинины ризобий могут играть роль адгези-нов на начальных этапах формирования симбиотической системы "растение - бактерия".

Получен мутант Л. ¡едиттоБагит 252/7, дефектный по гемагг-лютинирующей активности.

Установлено взаимодействие агглютининов 1?. 1едит1позагит 252 с фракциями корней проростков гороха и лектинами корней гороха и пшеницы.

Выявлены рецепторы, ответственные за связывание с агглютининами ризобий.

Обнаружено влияние агглютининов 1?. 1едипйпоБагит 252 на активность гидролитических и дыхательных ферментов растительной клетки.

Практическая значимость. Одним из перспективных направлений в решении ряда экономических и экологических проблем современного сельского хозяйства является возможность замены минеральных удобрений на бактериальные, что требует более глубокого и всестороннего изучения взаимодействия растений с микроорганизмами.

Процесс прикрепления (адгезия) ризобий к корням бобовых является первым этапом в многоступенчатом инфекционном процессе, ведущим к азотфиксирующему симбиозу, от эффективности которого, в конечном итоге, зависит урожайность ценных бобовых культур. Кроме того, изучение и понимание молекулярных основ этого процесса по-

может не только в получении хороших урожаев, но и в защите растений от инфекции.

Изучение агглютининов ризобий может способствовать дальнейшему познанию молекулярных основ взаимодействия "бактерия-растение "бактерия-бактерия", а так же внести определенный вклад в фундаментальные исследования физиологической и функциональной роли лектинов в самой бактериальной клетке.

Материалы диссертационной работы нашли применение при подготовке программ спецкурса "Взаимоотношение растений и микроорганизмов" и спецпрактикума "Методы препаративной биохимии" для студентов дневного и вечернего отделений биологического факультета Саратовского госуниверситета им. Н.Г. Чернышевского.

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ.

Полученные препараты агглютининов /?. 1е^ит1поБагит 252 используются при проведении плановых научно-исследовательских работ в лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН.

Применение и использование материалов диссертации подтверждается соответствующими актами.

На защиту выносятся следующие основные положения;

1. Выделение и изучение физико-химических свойств агглютининов Л. 1е^иттоБагит 252.

2. Определение роли белков-агглютининов в процессе прикрепления ризобиальных клеток к корням гороха.

3. Выявление взаимодействия агглютининов с фракциями корней проростков гороха и лектинами корней растений.

4. Обнаружение бактериальных и растительных рецепторов агглютининов 1?. 1е£ит1по5агит 252.

5. Влияние агглютининов ¡1. ¡е^иттоБагит 252 на активность гидролитических и дыхательных ферментов растительной клетки.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии ИВФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой "Физиолого-биохимическая роль белков-агглютининов клеточной поверхности бактерий" (№ гос. регистрации 01910022283).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлялись на Международном Рабочем совещании по ассоциативному взаимодействию азотфиксирующих бактерий с растениями (Саратов, Россия 1995); Второй Европейской конференции по азотфиксации (Познань, Польша 1996); Втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, Россия 1997); Международной лектиновой конференции "1п-1ег1ес - 17й (Вюрцбург, Германия 1997) и на отчетных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 24 рисунками и содержит 10 таблиц. Список использованных литературных источников включает 172 наименований, в том числе 124 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Понятие "агглютинины (лектины)"

В последнее время все большее внимание исследователи уделяют изучению углеводсвязывающих белков-агглютининов (лектинов). Это связано с тем, что лектины присутствуют в любой биологической системе, в любом живом организме на разных уровнях организации. Они участвуют в процессах углевод-белкового узнавания, обладают широким спектром действия и находят применение в различных областях биологии и медицины.

Открытие лектинов связывают с работами Н. Stilmark в Дерп-тском университете, который в 1888 г. в своей докторской диссертации описал метод выделения и свойства рицина - первого лектина, полученного из клещевины Ricinus communis (9). Сам термин "лектины" был предложен Boyd и Shapleigh (10), он берет свое начало от латинского глагола "legere" - различать, выбирать. Название отражало первую область применения лектинов - типирование групп крови, где предполагалось использование этих белков, единственным источником которых тогда считали растения. Несколько позднее были открыты лектины животных, грибов и микроорганизмов (11, 12). Сразу после обнаружения агглютининов нерастительной природы начались оживленные дискуссии о названиях этих соединений и о возможности их включения в группу лектинов. И до настоящего времени многие авторы (3, 13-15) пытаются дать свое определение термина "лек-тин", однако наиболее емким и отражающим суть, по-видимому, можно считать определение Kocourec и Horeosi: "лектины - агглютинирую-

щие белки неиммунной природы, способные специфически и обратимо связывать углеводы гликоконьюгатов без изменения химической структуры углеводных лигандов". Согласно этому определению, к лектинам относят не только поливалентные белки, способные агглютинировать клетки или преципитировать гликоконьюгаты, но также и некоторые моновалентные белки из растительных и бактериальных токсинов (16-18).

Если до конца 70-х годов нынешнего столетия исследования посвящены в основном изучению лектинов растительного и животного происхождения, то в 80-е годы стали появляться одно за другим сообщения о микробных лектинах. Интерес исследователей к этой группе лектинов объясняется тем, что лектины, выделенные из микроорганизмов, могут быть использованы наряду с растительными, и они, к тому же, имеют ряд преимуществ. Так, в настоящее время существуют штаммы - продуценты лектинов с высокой активностью и самой разнообразной углеводной специфичностью. Кроме того, микроорганизмы быстро растут, являются хорошим и удобным объектом для биотехнологии, их лектинпродуцируюшая способность может быть улучшена методами генной инженерии. Необходимо учитывать также и то, что при получении микробных лектинов не используются продукты белкового питания человека, как в случае выделения многих лектинов из растений и животных.

Среди лектинов микробного происхождения интенсивно изучаются лектины бактерий. Причинами повышенного внимания являются данные о ведущей роли бактериальных лектинов во взаимодействии "патоген-хозяин" (19-22) и участие бактериальных агглютининов в формировании различного рода азотфиксирующих систем.

1.2. Бактериальные агглютинины

Бактериальные гемагглютинирующие белки впервые были описаны Kraus, Ludwig в 1902 году (23). Была отмечена агглютинация кроличьих эритроцитов культурами и фильтратами некоторых видов стафилококков и Vibrio. Гемагглютинины оказались термолабильными; они разрушались при нагревании до 58-60°С в течение 30 минут.

В последующие годы перечень бактерий, проявляющих гемагглю-тинирующию активность (ГА), очень быстро пополнялся. Работы этого периода чаще всего носят описательный характер и посвящены обнаружению все новых видов и штаммов бактерий, в основном энтеропа-тогенных, способных агглютинировать эритроциты различных млекопитающих и человека. В 1908 г. появились первые сообщения об обнаружении гемагглютинина у эшерихий, тесно связанного с бактериальной клеткой и отсутствующего в супернатантах и фильтратах культур (24). Обработанные формалином бактерии не утратили ГА. Из 18 изученных штаммов Е. coli только 12 агглютинировали эритроциты различных животных. Как впоследствии оказалось, такая селективная гемагглютинация являлась характерным свойством многих бактериальных гемагглютининов (25). Позднее рядом авторов было показано, что некоторые бактериальные токсины (например, токсины эшерихий, стафилококков, бацилл) агглютинировали не только эритроциты, но и лейкоциты, тромбоциты, сперматозоиды различных животных (26-28).

В одном из первых, достаточно полном обзоре по бактериальным гемагглютининам, вышедшем в 1955 году, были подытожены все имеющиеся к тому времени сведения о гемагглютининах бактерий, рассматривались разные типы вызываемой бактериями гемагглютинации, однако подчеркивалось, что механизм этого явления остается неиз-

вестным (20).

И только благодаря развитию таких современных методов исследования, как электронная микроскопия, иммунохимия, рентгенострук-турный анализ, благодаря совершенствованию методов выделения и очистки белков, стало возможным выявление и изучение клеточных структур, ответственных за агглютинирующие свойства бактерий.

Наиболее изученными являются бактерии Clostridium botulinum, продуцирующие несколько типов лектинов (гемагглютининов) - А, В, С, D, и Е (29-31). Из культуральной среды С. botulinum типа А и С. botulinum типа В методом ионообменной хроматографии были выделены два типа белков, агглютинирующих эритроциты человека и некоторых видов животных (32). Первая культура продуцировала агглютинин А, который находился в комплексе с нейротоксином типа А. Агглютинин В с более низкой агглютинирующей активностью образовывал комплекс с нейротоксином ти�