Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем

Вершинина, Зиля Рифовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем"

На правах рукописи

ВЕРШИНИНА ЗИЛЯ РИФОВНА

Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2010

003493273

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (ИБГ УНЦ РАН)

Научный руководитель: Доктор биологических наук

Баймиев Алексей Ханифович ИБГ УНЦ РАН

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Шакирова Фарида Минихановна ИБГ УНЦ РАН

Кандидат биологических наук Сафронова Вера Игоревна Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «<¿5 » РЗ_2010 г. в «I» часов

на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу. Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центр РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом - на сайте ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «.ЛМ » О»?_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. На сегодняшний день важнейшей задачей сельского хозяйства является обеспечение быстрорастущего населения земли продовольствием. Широкое внедрение в производство высокоурожайных сортов возможно лишь при наличии в почве больших количеств легкодоступных соединений азота и это является основным лимитирующим фактором повышения продуктивности агроэкосистем. Применение азотных удобрений не может полностью решить данную проблему, что обусловлено экономическими и экологическими причинами.

Микробиологическая фиксация атмосферного азота позволяет избежать значительных затрат энергетических ресурсов, так как осуществляется за счёт энергии Солнца. Кроме того, это единственный экологически чистый путь снабжения растений доступным азотом, при котором принципиально невозможно загрязнение почв, воды и воздуха (Умаров, 2001). В связи с этим одной из перспективных задач для сельского хозяйства является максимальное использование и преумножение симбиотического потенциала культурных растений.

Конечной целью большинства современных экспериментов симбиотической биоинженерии является создание устойчивых эндосимбиотических компартментов в растениях, которые в природе не вступают в эффективный азотфиксирующий симбиоз (КоуаЬкауа е1 а1., 2003; Гончар и др., 2007). Эти эксперименты основаны на том, что развитие подобных структур, в частности инфекционных нитей, симбиосом и самих клубеньков, можно рассматривать как совокупность реорганизованных процессов нормального гистогенеза и цитодифференцировки, регулируемых новыми сигналами, поступающими от микросимбионтов (Вгеичп, 1998). Поэтому успехи в изучении генетических систем азотфиксирующего симбиоза позволяют приступить к направленному повышению эффективности подобных мутуалистических взаимоотношений, а, также к созданию новых симбиотических комплексов. Одним из подходов для этого является модификация процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий, во время которых растение выбирает оптимального партнера из состава обширной и генетически разнородной микробной популяции (Тихонович, Проворов, 2005).

Азотфиксация при бобово-ризобиальном симбиозе является наиболее эволюциоино продвинутой и эффективной по сравнению с другими симбиотическими системами и создание небобовых трансгенных растений, вступающих в азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями является перспективным направлением в биоинженерии симбиотических систем. Одним из ключевых факторов на пути формирования бобово-ризобиального симбиоза являются лектины, которые обеспечивают узнавание растением-хозяином специфической для него бактерии. Эти белки, благодаря своим углеводсвязывающим свойствам, определяют избирательные взаимодействия растений с ризобиями, участвуя в адгезии бактерий к корневым волоскам, формировании инфекционных нитей и образовании клубеньков (Kijne et al., 1992). Поэтому эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов бобовых, позволяют расширять круг микросимбионтов растений и являются важным этапом в создании новых симбиотических систем.

Цель данного исследования заключалась в получении трансгенных по генам лектинов бобовых растений модельных корневых систем на люцерне посевной, астрагале путовом, облепихе крушиновидной, рапсе сорта Hanna и табаке линии SRI и изучении симбиотических взаимодействий полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Клонировать последовательности генов лектинов бобовых растений в векторе pCambia 1305.1 и трансформировать полученными конструкциями клетки Agrobacterium rhizogenes 15834.

2. Разработать методы получения трансгенных по генам лектинов «бородатых корней» на люцерне, астрагале, облепихе, рапсе и табаке.

3. Изучить симбиотические взаимодействия полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями.

4. Путем трансформации Agrobacterium lumefaciens создать трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и изучить симбиотические взаимодействия корней с микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum bv. viciae.

Научная новизна работы

Разработан метод получения трансгенных по генам лектинов бобовых

растений «бородатых корней» на астрагале, облепихе, рапсе и табаке. Впервые

показана возможность формирования клубенек-подобных структур на

актиноризных растениях с участием ризобий. Обнаружено усиление ризобиальной колонизации на трансгенных по гену лектина «бородатых корнях» рапса и табака. Созданы трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и впервые описаны скручивания корневых волосков полученных растений под воздействием микросимбионта гороха посевного. Впервые обнаружена спонтанная светонезависимая регенерация проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней».

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты расширяют представление об участии лектинов в формировании различных видов азотфиксирующего симбиоза. Разработанный экспериментальный подход, основанный на модификации процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий с помощью лектинов бобовых растений, в перспективе может быть использован для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями. Возможность спонтанной регенерации проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней» открывает новые перспективы в использовании астрагалов в качестве источников биологически активных веществ.

Конкурсная поддержка работы

Работа проводилась при финансовой поддержке программы «Государственная поддержка молодых российских ученых и ведущих научных школ России» (гранты МД-43.2008.4 и НШ-649.2008.4), ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (госконтракт 02.518.11.7138) и гранта по инновационным исследованиям «У.М.Н.И.К.» (ГР 001200850086).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 2-й международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), 2-м всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2007), всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений»

(Екатеринбург, 2008), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК.

Структура н объем диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах, содержит 17 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 313 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектами исследования в данной работе служили бобовые растения умеренного климата: люцерна посевная (Medicago sativa) и астрагал нутовый (Astragalus cicer)\ актиноризное растение: облепиха крушиновидная сорта Золотой початок (Hippophae rhamnoides L.); несимбиотрофные растения: рапс сорта Hanna (Brassica napus L. var. napus) и табак (Nicotiana tabaccum линии SRI).

В экспериментах были использованы ген семенного лектина гороха Pisum sativum (PSL) и химерные конструкции на основе этого лектииа, углеводсвязывающий участок которого заменен на аналогичные фрагменты ДНК, кодирующие углеводсвязывающие домены лектинов астрагала нутового Astragalus cicer (PSL/AGL), эспарцета песчаного Onobrychis arenaria (PSL/OAL) и клевера лугового Trifolium pratense (PSL/TPL) (Губайдуллин и др., 2006).

При проведении экспериментов по клонированию использовали штамм Е. coli XL1 -Blue и фагмиду pBluescript II KS(-), содержащую гены лектинов. Для трансформации растений была использована бинарная векторная конструкция pCambia 1305.1, для трансформации микросимбионтов в целях дальнейшего скрининга - вектор pCambia 1304. Для получения «бородатых корней» и трансгенных растений применяли штаммы A rhizogenes 15834 и A. tumefaciens AGL0, соответственно.

В опытах по выявлению симбиотических реакций на трансгенных корнях

использовали следующие микросимбионты: бактерии Sinorhizobium meliloti

(микросимбионт люцерны), Rhizobium leguminosarum bv. viciae (микросимбионт гороха), Rhizobium legiiminosarum bv. trifolii (микросимбионт клевера), бактерии из клубеньков эспарцета песчаного, близкие по генам 16SpPHK к PhyUobacter'mm trifolii (GenBank Ac. NoDQ372661), бактерии из клубеньков астрагала нутового, близкие по генам 16S рРНК к Agrobacterium lumefaciens (GenBank Ac. No. DQ372662), и актиномицеты Frankia (микросимбионты облепихи).

Методы исследования. Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, подготовку компетентных клеток, их трансформацию плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABl PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. Для экспериментов по оценке экспрессии гена лектина в «бородатых корнях» кДНК, комплементарную мРНК, получали при помощи фермента AMW ревертазы. Гистохимический gus-анапю проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с небольшими модификациями (Kosugi et al., 1990). Трансгенные растения табака получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок (Horsh, Fry, 1985). Для микротомирования полученных на «бородатых корнях» облепихи клубеньков использовали фиксатор Карнуа. Срезы толщиной 6-8 мкм окрашивали гематоксилином Бемера и водным раствором эозина и затем микроскопировали (Limpens et al., 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование химерных конструкции гена лектина в бинарном векторе pCambia 1305.1

Ген семенного лектина гороха (PSL), а также его производные PSL/AGL, PSL/OAL и PSL/TPL были клонированы в Т-ДНК вектора для трансформации

растений рСатЫа 1305.1 (рис.1). Поскольку в маркере устойчивости к антибиотику в экспериментах с «бородатыми корнями» не было необходимости (так как трансформированные ткани легко определяются по морфологии), мы выщепили из состава Т-ДНК вектора ген ИрЛ\, находящийся под контролем двойного конститутивного 358 промотора вируса мозаики цветной капусты, рестриктазой А7ю I и клонировали по этому сайту гены химерных лектинов и ген лектина РБЬ семян гороха. Тем самым мы одновременно решили проблему переноса «лишних» копий 35в промотора в геном трансгенных тканей, часто приводящую к «молчанию» целевого гена. Полученные генетические конструкции рСатЫа 1305.1-лектин были введены в клетки А. гЫго^епеъ 15834, содержащие Из-плазмиды дикого типа, методом электропорации.

Рис. 1. Схема клонирования генов химерных лектинов и гена лектина Р8Ь семян гороха в составе вектора рСатЫа 1305.1.

2. Получение трансгенных «бородатых корней» и композитных растений

Получение «бородатых корней» на проростках люцерны, астрагала, облепихи и рапса

В среднем через 3 недели после введения инсулиновым шприцем суспензии А. rhizogenes в гипокотиль 1-2 недельных проростков на месте ранения начинали расти «бородатые корни». На растениях, проколотых шприцем со стерильной средой ТУ, появления «бородатых корней» не наблюдали. Котрансформация Т-ДНК рСатЫа 1305.1-лектин в полученных корнях была подтверждена активностью содержащего интрон гена Р-Э-глюкоуронидазы, а также ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих участок гена лектина. Также на уровне мРНК была доказана конститутивная экспрессия гена лектина в трансформированных корнях. В качестве контроля были использованы «бородатые корни», полученные с помощью исходного нетрансформированного штамма А. rhizogenes 15834. Гистохимический и ПЦР анализы в этом случае дали отрицательный результат.

Получение «бородатых корней» на листовых пластинках табака Через неделю после инокуляции у всех листовых эксплантов табака по краям начинали появляться «бородатые корни». На контрольных не инокулированных эксплантах такие корни не были обнаружены.

Более 50% «бородатых корней», полученных с помощью штамма А. rhízogenes, несущего . рСатЫа 1305.\-psl, оказались

^трансформированными, что было подтверждено £1«-анализом и ПЦР на наличие и конститутивную экспрессию на уровне мРНК гена лектина. В качестве контроля были использованы «бородатые корни», полученные с помощью исходного штамма А. rhizogenes. Гистохимический и ПЦР анализы в этом случае дали отрицательный результат.

Получение композитных растений После того, как «бородатые корни» достигали в длину 3-4 см (по прошествии примерно 3-4 нед.), настоящий корень отрезали и растения пересаживали в стерильный вермикулит.

Проростки, состоящие из трансгенного корня и нетрансгенной надземной части, после 5 мес. роста отличались от контрольных растений, которые имели нормальный корень. Для них были характерны малый рост и/или большое количество стеблей/веток. Данный фенотип обусловлен активностью ауксинов и го1-генов, перенесенных в геном «бородатых корней» А. rhizogenes фюиГ й а!., 1995; О^еу, 1997).

3. Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ полученных клубеньков

Для оценки влияния лектина гороха и созданных на его основе гибридных лектинов на симбиотические реакции модельных растений мы провели обработку трансгенной корневой системы композитных растений различными микросимбионтами (табл. 1).

Симбиотические реакции модельных растений люцерны с корнями, трансгенными по Через месяц после обработки ризобиями /?. 1е%ит'то$агит Ьу. \4ciae композитных растений люцерны с корнями, трансгенными по гену лектина РБЬ, в ризосфере были обнаружены клубеньки, схожие с клубеньками, которые формирует ее естественный микросимбионт £ теШоИ (рис.2). Однако высев содержимого клубеньков на чашки Петри с целью идентификации сформировавшего их штамма ризобий показал, что клубеньки пусты, т.е. мы имеем дело с неинфицированными псевдоклубеньками.

Рис. 2. Псевдоклубеньки на люцерне с корнями, трансгенными по PSL (опыт№ 4).

Ранее сотрудниками лаборатории было показано, что экзогенная обработка лектином PSL ризобий R leguminosarum bv. viciae приводит к образованию на корнях люцерны огромных белых псевдоклубеньков, необычной гроздевидной формы (Баймиев и др., 2009). Псевдоклубеньки аналогичной формы наблюдали и Брилл с соавт. при трансформации люцерны геном ее собственного лектина MsLECl в антисенс-ориентации (Brill et al., 2004). Таким образом, можно сказать, что лектин PSL необходим на начальных стадиях взаимодействия М sativa с бактериями R leguminosarum bv. viciae и его влияния достаточно для развития неинфицированных клубеньков.

Таблица 1. Варианты и результаты обработки корней контрольных (К) и композитных (комп) растений микросимбионтами

j № опыта Инокулируемое растение Ризобии (ицокулят) Лектин, который несут корни Фенотнпические ответы растения

1 К или комп Л/. sativa _ любой лектин +■ случаи его отсутствия видимых проявлений нет

2 К или комп М.sativa S. meliioti многочисленные розовые клубеньки

3 К или комп М.sativa R. leguminosarum bv. viciae — вилимых проявлений нет

4 комп М.sativa R. leguminosarum bv. viciae розовые клубеньки без бактерий

5 К или комп М.sativa бактерии из клубеньков О. arenaria — видимых проявлений нет

6 комп М.saliva бактерии из клубеньков О. arenaria скручивания корневых волосков

7 К или комп И.sativa R. leguminosarum bv. trifotii — видимых проявлений нет

8 комп М.sativa R. le^uminosaritm bv. trifolii РЯЬТРЬ скручивания корневых волосков

, 9 1С или комп М.saliva бактерии из клубеньков A. cicer — видимых проявлений нет

10 комп М.saliva бактерии из клубеньков А. cicer Рйилсь розовые клубеньки с бактериями

11 К или комп A. cicer — любой лектин + случаи его отсутствия видимых проявлений нет

12 lí или комп A. cicer бактерии из клубеньков A. cicer клубеньки с бактериями, скручивания корневых волосков

13 К или комп A. cicer R leginninosarum bv. viciae — видимых проявлений нет

14 комп A. cicer R. legnminosarum bv. viciae Р5С. скручивания корневых волосков

15 К или комп И rhamnoides — любой лекгин + случаи его отсутствия видимых проявлений нет

16 1С или комп // rhamnoides Frankia клубеньки в виде кораллов с актиномицетами

17 К или комп Я. rhamnoides R legnminasarum bv. viciae или R. le^utninosarum bv. trifolii видимых проявлений нет

18 К или комп Н. rhamnoides Frankia +R. Icguminosarum bv. viciae Frankia +R. leguminosarvm bv. trifolii — клубеньки в виде кораллов с актиномицетами

19 комп Н. rhamnoides Frankia + R. legtiminosartim bv. viciae клубеньки с разной морфологией: в виде кораллов, содержащие актиномнцеты; и округлые, содержащие ризобии

20 комп И. rhamnoides Frankia + R. leguminosarum bv. trifolii геь/трь клубеньки в виде кораллов с актиномицетами

21 К или комп В. napus — любой лектин + случаи его отсутствия видимых проявлений нет

22 К или комп В. napus R. legnminosarum bv. viciae или бактерии нз клубеньков/1. cicer адгезия клеток в среднем кол-ве 3.8 107 кл/г

23 комп В. napits R. leguminosarum bv. viciae j PSL адгезия клеток в среднем кол-ве 140 10 кл/г

24 комп В. napus бактерии из клубеньков A. cicer j PSL/AGI. адгезия клеток в среднем кол-ве 216 ¡0 кл/г

Симбиотические реакции модельных растений люцерны с корнями, трансгенными по РБиОАЬ, Р-ИЛП, и астрагала с корнями, трансгенными по РБЬ После инокуляции композитных растений люцерны с корнями, трансгенными по генуРБЬ/ТРЬ микросимбионтами Я ¡е^игмткатт Ьу. /г//о/гг, образования клубеньков не происходило, однако были обнаружены многочисленные изгибы и скручивания корневых волосков (рис. За). Аналогичные результаты были получены на «бородатых корнях» люцерны с Р8Ь/ОАЬ и астрагала с РвЬ, после обработки соответствующими штаммами ризобий (опыты № 6 и № 14).

Рис.3. Корневые волоски люцерны через двое суток после обработки Я. к^иттозагит Ьу. 1п/оШ на а) трансгенных по РЗЬ/ТРЬ (опыт № 8); Ь) нетрансгенных (опыт№ 7) «бородатых корнях».

Можно предположить, что наблюдаемая деформация корневых волосков вызывается действием лектина, т.к. просто инокуляция гетерологичными ризобиями такой эффект не вызывает (рис. ЗЬ). Причем корневые волоски деформируются именно в первые 20 дней после инокуляции, когда в нормальных условиях завязываются клубеньки, в то время как на 40 сутки скручиваний становилось заметно меньше, что подтверждает стимулирующий эффект лектина на симбиотические взаимодействия на стадии преинфекции.

Симбиотические реакции модельных растений люцерны с корнями, трансгенными по PSL/AGL После инокуляции композитных растений люцерны с корнями, трансгенными по гену РвЬ/АСЬ, ризобиями А. скег в ризосфере были обнаружены клубеньки (рис. 4), схожие с клубеньками, которые формирует 5. теШоН (опыт № 2). Рассев содержимого клубеньков на питательную среду выявил наличие в них бактерий, которые оказались идентичны бактериям,

использованным для инокуляции. Таким образом, в данном варианте наблюдались нетипичные симбиотические отношения между люцерной и клубеньковыми бактериями астрагала с образованием инфицированных клубеньков. Полученные результаты полностью совпадают с таковыми в работе, где применялась экзогенная обработка корней люцерны лектином РвЬ/АвЬ в присутствии ризобий из клубеньков А. скег (Баймиев и др., 2009).

Рис. 4. Клубеньки на люцерне с корнями, трансгенными по PSL/AGL (опыт№ 10)

Показано, что иногда чужеродные лектины способны усиливать чувствительность растений к факторам «чужих» ризобий. Например, трансгенный по гену лектина гороха PSL красный клевер становился отзывчивым не только на ризобии гороха R. leguminosarum bv. viciae, но и формировал псевдоклубеньки при инокуляции его неспецифичными Mesorhizobium loti и S. meliloti (Diaz et al., 2000).

В наших экспериментах лектин PSL/AGL способствовал понижению специфичности симбиоза люцерны посевной с микросимбионтами, возможно, благодаря тому, что замена углеводсвязывающего участка лектина гороха участком лектина астрагала изменила специфичность лектина к моносахаридам, расширив их спектр (Губайдуллин и др., 2006). В связи с этим можно предположить, что подобные гибридные лектины с «расшатанной» специфичностью к углеводам могут вызывать симбиотические реакции у более широкого круга ризобий, чем природные лектины, что мы, возможно, и наблюдали.

Симбиотичесте реакции модельных растений облепихи с корнями, трансгенными по PSL

Через три месяца после начала экспериментов трансгенные по генам лектинов PSL и PSL/TPL «бородатые корни» обрабатывали микросимбионтами: актиномицетами и ризобиями в различных вариантах. В качестве контроля были использованы те же сочетания микроорганизмов, но на трехмесячных растениях с естественной корневой системой и на композитных растениях с бородатыми корнями, не содержащими ген лектина.

Аналогично результатам, описанным в статье Diouf с соавт. (Diouf et al., 1995), клубеньки, полученные на трансгенных корнях через четыре недели после обработки монокультурой Frankia, не отличались по форме и размерам от клубеньков, полученных на соответствующих контрольных растениях, и представляли собой густые сплетения корней, разветвленных наподобие кораллов и прекративших рост (опыт№ 16). Клубеньки такой формы являются характерными для облепихи (Gardner et al., 1984). Трансгенность некоторых клубеньков была подтверждена наличием активности гена P-D-глюкуронидазы.

В опыте с обработкой монокультурой ризобий на контрольных и композитных растениях результатов инфицирования получено не было (опыт№ 17). В случае использования сочетаний «Frankia+R. leguminosarum bv. Irifolii» на контрольных и композитных растениях были получены лишь клубеньки, характерные для Frankia (опыт № 20).

При этом в эксперименте, где было использовано сочетание «Frankia -г R. leguminosarum bv. viciae» (опыт №19), через Змее, после обработки на трансгенных по гену PSL корнях облепихи, кроме обычных актиноризных клубеньков (рис. 5а), были получены структуры, отличающиеся от клубеньков, образуемых Frankia, малым количеством выростов модифицированных боковых корней и, скорее, напоминающие клубеньки бобовых (рис. 5Ь).

Поперечный срез структур выявил центральное расположение проводящих пучков и наличие активной меристемы, что является характерным для актиноризных клубеньков (Savka et al., 1992). На корнях контрольных нетрансгенных растений в этом варианте обработки были получены лишь клубеньки, идентичные образуемым Frankia (опыт№ 18).

Рис. 5. Клубеньки, полученные на композитных растениях облепихи с корнями, трансгенными по РвЬ (опыт№ 19): а) сходные с клубеньками, образуемыми Ьгапк1а\ Ь) сходные с клубеньками, образуемыми ЯЫгоЬ'тт

Для того, чтобы проверить, какие именно микросимбионты принимали участие в образовании клубенек-подобных структур, был проведен RAPD-анализ ДНК бактерий, выделенных из этих структур. В качестве сравнения использовались штаммы Frankia и R. leguminosarum. Анализируемые штаммы имели схожий RAPD-профиль с R. leguminosarum, и не было ни одного штамма, который бы имел фрагменты ДНК одинакового размера с Frankia. Таким образом, впервые была показана возможность формирования клубенек-подобных структур на актиноризных растениях с участием ризобий.

Можно предположить, что ризобии, благодаря лектину гороха посевного, прикрепились к корневым волоскам трансгенных корней и запустили цепь реакций, приводящих к образованию клубеньков. Одной из первых реакций этой цепи является образование преинфекционных нитей, которые впоследствии заселяются симбиотическими бактериями и становятся уже инфекционными нитями. Показано, что за образование этих структур отвечает недавно открытый ген SYMRK (от symbiosis receptor kinase, Markmann et al., 2008); данный ген встречается во всех растениях, которые способны сожительствовать хотя бы с одним из трех типов внутриклеточных симбионтов: грибов (микориза), актиномицетов (актинориза) и ризобий, при этом у растений, образующих клубеньки (актиноризные или ризобиальные) в геноме содержится вполне определенный "длинный вариант" гена SYMRK. Возможно, что и у полученных нами композитных растений облепихи трансклеточное распространение ризобий в кортексе корня до клубеньковых примордиев

происходило с участием преинфекционных нитей. Актиноризный тип строения клубенька при этом был продиктован растением-хозяином.

Симбиотические реакции композитных растений рапса и «бородатых корней», полученных па листовых пластинках табака Через три месяца после начала экспериментов трансгенные по генам лектинов РБЬ и РБЬ/АвЬ «бородатые корни» композитных растений рапса обрабатывали соответствующими штаммами ризобий (опыты №23, №24). В качестве контроля были использованы те же сочетания микроорганизмов, но на трехмесячных растениях с естественной корневой системой и на композитных растениях с бородатыми корнями, не содержащими ген лектина (опыт №22). Подсчет количества адсорбированных на поверхности корней ризобий показал увеличение численности бактерий на трансформированных корнях (в среднем =37 раз в случае Р8Ь и в = 57 в случае РБЬ/АвЬ) по сравнению с контрольными «бородатыми корнями» (табл. 2). Относительно большее количество адсорбированных на поверхности корней бактерий в случае композитных растений, несущих ген Р8Ь/АСЬ, возможно, объясняется тем, что гибридные лектины с расширенным спектром сахароспецифичности, прочнее связывают бактерии на первичных этапах симбиотического взаимодействия (Губайдуллин и др., 2006).

Таблица 2.

Количество ризобий, адгезированных на поверхности «бородатых корней»

«бородатые корни» бактерии Количество бактерий, адгезированных на корешках, кл/гхЮ7 Повтор-ность

табак рапс

конт. - 2.01 -2.25 3.76-3.81 10

PSL R. legtminosarum bv. viciae 22.6-38.2 105-175

PSL/AGL из клубеньков Astragalus cicer - 165-266

^трансформированные геном лектина гороха и контрольные (без этого гена) «бородатые корни» на эксплантах табака были обработаны микросимбионтом гороха посевного К. 1е&ап\по5агит. Подсчет количества адсорбированных на поверхности корней ризобий показал более чем на порядок увеличение численности бактерий на трансформированных Р8Ь

корнях (в среднем = 14 раз) по сравнению с контрольными «бородатыми корнями» (табл. 2).

Табак (Nicotiana tabaccum) и рапс (Brassica napus L. var. napus) входят в число несимбиотрофных видов растений, которые не вступают в симбиоз ни с ризобиями, ни с актиномицетами, поэтому"большой интерес вызывает создание искусственных ассоциативных симбиозов этих растений с клубеньковыми бактериями. На сегодняшний день существуют лишь несколько работ с описанием попыток создания азотфиксирующих симбиотических ассоциаций табака с различными микросимбионтами, в частности, с цианобактериями (Баулина и др., 1984; Горелова и др., 2004) и ризобиями (Gibson et al., 1976). Для рапса же показано, что при обработке целлюлазой и пектолиазой корневых волосков проростков в присутствии ризобий происходит образование клубеньков, морфологически и структурно подобных клубенькам бобовых и обладающих незначительной нитрогеназной активностью (Cocking et al., 1991). Следовательно, если обеспечить специфическое взаимодействие ризобий с трансгенными по гену лектина корневыми волосками, то можно добиться если не получения настоящих клубеньков, то хотя бы полноценных ассоциативных отношений между несимбиотрофными растениями и ризобиями.

Создание искусственных азотфиксирующих ассоциаций культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. На сегодняшний день уже выделены штаммы Rhizobium, которые. успешно колонизируют в природе корни небобовых растений. Например, показано, что наиболее перспективными штаммами для создания азотфиксирующих ассоциаций риса являются ризобии клевера R. leguminosarum bv. Irifolii R4, так как эти бактерии способны колонизировать корни и заселять межклетники, способствуя увеличению урожая (Biswas et al., 2000; Chi et al., 2005; Perrine-Walker et al., 2007). В случае кукурузы и латука в качестве подобного штамма можно использовать ризобии фасоли R. leguminosarum bv.phaseoli Р31 и RI, которые успешно колонизируют корни этих растений в почве (Chabot et al., 1996; Gutierrez-Zamora, Martínez-Romero, 2001). Использование лектинов бобовых растений в качестве трансгенов может стать следующим шагом к получению стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями.

4. Создание полностью трансгенных по гену лектина растений

Как уже было отмечено, трансгенные «бородатые корни» - это модель корневой системы для изучения симбиотических взаимодействий. Однако объективная оценка влияния лектинов бобовых растений на симбиоз требует создания полностью трансгенных по генам лектинов модельных растений.

На сегодняшний день самым распространенных подходом для создания трансгенных растений является трансформация с помощью Agrobacterium tamefaciens. Хотя методы агробактериальной трансформации разработаны для большинства видов сельскохозяйственных культур, они применимы в пределах каждого вида только к немногим генотипам (сортам), которые регенерируют in vitro с высокой частотой. Поэтому создание трансгенных по генам лектинов модельных симбиотрофных и несимбиотрофных растений является достаточно трудоемкой задачей.

Создание трансгенных растений табака

В данной работе были созданы трансгенные по гену лектина гороха PSL модельные растения табака Nicotiana tabaccum линии SRI. Трансгенность полученных растений была подтверждена ПЦР на присутствие и экспрессию на уровне мРНК гена лектина PSL, а также анализом активности gu.v-гена в тканях листа. Проведенный гистохимический анализ показал, что полученные растения-регенеранты обладали сильной gus-активностью, и после инкубации сегментов листьев этих растений в гистохимическом реактиве появлялось характерное синее окрашивание. Максимальная интенсивность окрашивания наблюдалась в мезофильных клетках листа, а также в его проводящих тканях.

Укорененные побеги табака в дальнейшем были использованы для

получения семян. Во втором поколении F2 оценивали экспрессию гена лектина

и влияние этого белка на симбиотические реакции с R. legitminosarum bv. viciae.

После обработки корней трансгенных растений этим микросимбионтом с

помощью микроскопирования были выявлены немногочисленные скручивания

корневых волосков, которых не наблюдалось в случае обработки данными

бактериями контрольных растений без гена лектина. Подобные деформации,

несомненно, являются следствием адгезии бактерий к поверхности корневых

волосков и их колонизации благодаря связыванию с лектином гороха

посевного, что говорит о правильном синтезе и функциональности данного

белка в трансгенном табаке. Однако для инициации полноценных

симбиотических взаимоотношений необходимы факторы, которые

¡8

присутствуют у актиноризной облепихи и отсутствуют у несимбиотрофного табака. Поиск данных факторов и должен стать задачей исследователей в ближайшем будущем.

Спонтанная регенерация трансгенных по гену пектина проростков астрагала из культуры «бородатых корней» Одним из интересных способов получения растений, несущих нужный ген, является регенерация трансгенных растений из культуры «бородатых корней». Известно, что практически половина видов двудольных растений спонтанно регенерируют из такой культуры, что намного облегчает трансформационный процесс.

В данной работе через 2 месяца культивирования композитных растений астрагала нутового с корнями, трансгенными по гену лектина гороха РвЬ, а также контрольных композитных растений (без РЯЬ) было выявлено образование на «бородатых корнях» оранжевых каллусных структур (рис. 6а), из которых появлялись вторичные корни, что является характерным для трансформированных корней многих двудольных растений (СЬ^еу, 1997).

Рис. 6. а) Каплусные структуры (указаны стрелкой), сформировавшиеся на «бородатых корнях» через 2 месяца; Ь) и с) трансгенные проростки астрагала нутового (указаны стрелками), спонтанно регенерировавшие из каллуса на «бородатых корнях» спустя 6 месяцев после посадки композитных растений на вермикулит.

Регенерация проростков астрагала нутового из каллуса наблюдалась через 6 месяцев культивирования у 55% композитных растений (рис. 6Ь и 6с). Известно, что подобная регенерация может зависеть или не зависеть от освещения (Christey, 1997). В работах, посвященных Astragalus sinicus L., регенерация была гормонозависимой и светонезависимой (Cho, Widholm, 2002).

В случае астрагала нутового регенерация происходила без экзогенной гормональной обработки, но также была светонезависимой.

Трансгенность полученных растений была подтверждена ПЦР на присутствие и экспрессию на уровне мРНК генов PSL, гоПЗ, а также анализом ■ активности giw-гена в тканях листа. "

Через 5 месяцев культивирования регенерированные проростки отличались от контрольных растений астрагала нутового того же возраста в 6 раз большей биомассой корней и в 2 раза большей биомассой надземной части. Повышенная продуктивность, а также такие черты регенерированных проростков, как короткие междоузлия, высокая разветвленность и узкие листья обусловлены активностью rol- генов, перенесенных в геном растения A. rhizogenes (Сhristey, 1997).

Возможность спонтанной регенерации проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней» предполагает, что и другие представители рода Astragalus, в частности редкие и эндемичные виды, возможно, также могут обладать такой способностью. Регенерация надземной части растения превращает культуру «бородатых корней» в полноценный источник БАВ, и таким образом, решается проблема недостатка лекарственного сырья без

ущерба для популяции редких видов Astragalus.

* * *

Использование лектинов бобовых растений в качестве трансгенов является перспективным направлением в биоинженерии симбиотических систем. В данной работе были обнаружены нетипичные симбиотические реакции с гетерологичными штаммами ризобий на трансформированных лектином корнях люцерны и астрагала; показана возможность формирования клубенек-подобных структур этими микросимбионтами на «бородатых корнях» актиноризных растений и обнаружены специфические реакции на обработку ризобиями на трансгенных корнях несимбиотрофных растений.

Таким образом, возможность симбиотических взаимодействий между ризобиями и трансгенными по генам лектинов корнями открывает новые горизонты на пути рационализации азотного питания важных сельскохозяйственных культур за счет расширения их симбиотический азотфиксирующей активности и создания новых симбиотических взаимоотношений.

выводы

1. На основе вектора для генетической трансформации растений pCambia 1305.1 созданы конструкции, содержащие в области Т-ДНК ген семенного лектина гороха PSL, а также его производные PSL/AGL, PSL/OAL и PSL/TPL под управлением 35S промотора вируса мозаики цветной капусты.

2. Созданы композитные растения люцерны, астрагала, облепихи и рапса с корнями, трансгенными по изучаемым генам лектинов, и нетрансгенной надземной частью.

3. Обнаружены нетипичные симбиотические реакции на трансгенных по генам лектинов корнях люцерны после инокуляции соответствующими этим лектинам микросимбионтами (искривление корневых волосков и псевдоклубеньки), а также получены клубеньки, содержащие микросимбионты астрагала на корнях, трансформированных PSL/AGL.

4. Впервые показана возможность формирования клубенек-подобных структур, содержащих ризобии, на корнях актиноризного растения (облепиха), трансгенных по гену лектина гороха и обработанных совместно ризобиями R. leguminosarum bv. viciae (симбионт гороха) и актиномицетами рода Frankia (симбионт облепихи).

5. Экспрессия гена лектина бобовых в корнях рапса и табака способствует адсорбции на них ризобий, что может быть использовано для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с азотфиксирующими бактериями.

6. Созданы модельные растения табака Nicoüana tabaccum линии SRI, трансгенные в F2 по гену лектина гороха PSL. После обработки корней трансгенных растений микросимбионтом гороха выявлены скручивания корневых волосков, подтверждающие участие лектинов в запуске первичных симбиотических реакций.

7. Обнаружена спонтанная светонезависимая регенерация трансгенных проростков А. cicer из культуры «бородатых корней», что может быть использовано для культивирования астрагалов в качестве источников биологически активных веществ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вершинина ЗР., Баймиев А.Х., Чемерис А.В. Симбиотические реакции корней облепихи (Hippophae rhamnoides L.) трансгенных по гену пектина гороха посевного // Физиология растений. -2010. - Т. 57, №1. - С. 108— 116.

2. Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х. Разработка метода получения трансгенных бородатых корней, несущих гибридные лектины бобовых, на облепихе, рапсе и люцерне // III Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых «Научное и экологическое обеспечение современных технологий», Уфа, 2006. - С. 71-72.

3. Баймиев А.Х., Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю. Получение облепихи с трансгенными корнями несущими химерные гены лектинов бобовых растений // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006. - С. 24.

4. Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х., Вершинина З.Р., Куликова O.JI. Генетическое биоразнообразие популяций ризобий Sinorhizobium meliloti, вступающих в симбиоз с бобовыми родов Medicago и Melilotus произрастающих в Башкортостане // Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна. Москва, 2006. - С. 35.

5. Вершинина З.Р. Спонтанная регенерация проростков астрагала нутового {Astragalus cicer) из трансгенных «бородатых корней» // Школа-семинар молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Бкомика - наука XXI века», Уфа, 2007. - С. 20.

6. Вершинина З.Р., Князев А.В., Баймиев Ал. X. Получение рапса (.Brassica napus) трансгенного по гену лектина гороха. // Школа-семинар молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века», Уфа, 2007. - С. 18-19.

7. Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х. Получение трансгенных по гену лектина бородатых корней на люцерне, облепихе и рапсе // Материалы докладов Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007. - Часть 3. -С. 229-230.

8. Баймиев А.Х., Князев А.В., Вершинина З.Р. Генетическая

модификация рапса (Brassica napus) для исследования влияния экспрессии

чужеродных белков на симбиотические реакции // Сборник материалов 2-го Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности», Москва, 2007. - С. 18.

9. Дмитрюкова М.Ю., Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х. Разработка метода получения трансгенных «бородатых корней» и клубеньков на облепихе // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», Саратов, 2007. - С. 25

10. Вершинина З.Р. Получение небобовых трансгенных растений, вступающих в симбиоз с ризобиями // Материалы 2-й Международной школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», Уфа, 2007. - С.29-

11. Вершинина З.Р. Использование лектинов бобовых для повышения урожайности культурных растений // Материалы XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, 2008. - Том I, Подсекция 1. - С. 12-13.

12. Яруллина Л.Г., Баймиев Ал.Х., Вершинина З.Р., Максимов И.В. Активные формы кислорода и формирование бобово-ризобиального симбиоза // Материалы международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург, 2008.-С. 462-464.

13. Вершинина З.Р., Баймиев А.Х. Симбиотические реакции трансгенных бородатых корней, полученных на облепихе (Hippophae rhamnoides L.), с актиномицетами и ризобиями // Материалы V съезда съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2008. - С. 9.

14. Вершинина З.Р. Использование лектинов бобовых для повышения урожайности рапса (Brassica napus L.) // Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 2009. - Том I, Подсекция 1. - С. 6.

15. Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х. Симбиотические реакции люцерны с корнями трансгенными по гену лектина гороха // Аграрная Россия. - 2009. -Специальный выпуск. - С. 79,

30.

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», заказ № 230, тираж 100, печать л. 2,0, 450054, пр. Октября, 71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вершинина, Зиля Рифовна

Список сокращений и условных обозначений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Разнообразие азотфиксирующих микробно-растительных симбиозов в природе.

1.1.1. Общие положения.

1.1.2. Эндосимбиозы.

1.1.3. Эктосимбиозы.

1.2. Сходства и различия бобово-ризобиального и актиноризного симбиозов.

1.2.1. Инфекционный процесс и клубенекобразование.

1.2.2. Гены симбиотической азотфиксации и их регуляция.

1.2.3. Специфичность симбиоза.

1.3. Роль пектинов в азотфиксирующем симбиозе.

1.3.1. Общая характеристика лектинов растений.

1.3.2. Лектины бобовых растений.

1.3.3. Функции лектинов в азотфиксирующем симбиозе.

1.4. «Бородатые корни» как модель корневой системы в симбиотических взаимодействиях.

1.5. Биоинженерия симбиотических систем.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы.

2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПЦР генов лектинов.

2.3. Реактивы и материалы.

2.4. Составы использованных стандартных водных растворов.

2.5. Методы исследований.

2.5.1. Выделение и очистка ДНК растений.

2.5.2. Выделение и очистка РНК растений.

2.5.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.5.4. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях.

2.5.5. Подготовка компетентных клеток Е. coli.

2.5.6. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК

2.5.7. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом.

2.5.8. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.5.9. Синтез кДНК.

2.5.10. Полимеразная цепная реакция.

2.5.11. Клонирование генов лектинов бобовых растений в вектор pCAMBIA 1305.

2.5.12. Приготовление компетентных клеток Agrobacterium sp.

2.5.13. Электропорация клеток Agrobacterium sp.

2.5.14. Получение композитных растений.

2.5.15. Анализ ß-глюкоуронидазной (gus) активности.

2.5.16. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака.

2.5.17. Обработка «бородатых корней» на люцерне, астрагале и облепихе микросимбионтами.

2.5.18 Обработка «бородатых корней» микросимбионтами на рапсе и табаке.

2.5.19. Идентификация клубенекобразующего штамма.

2.5.20. Микроскопирование клубеньков, образованных на «бородатых корнях» облепихи.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Клонирование химерных конструкций гена лектина в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1.

3.2. Получение трансгенных «бородатых корней» и композитных растений.

3.2.1 .Получение «бородатых корней» на люцерне посевной.

3.2.2. Получение «бородатых корней» на астрагале нутовом.

3.2.3. Получение «бородатых корней» на облепихе крушиновидной.

3.2.4. Получение «бородатых корней» на рапсе.

32.5. Получение «бородатых корней» на листовых пластинках табака.

3.2.6. Получение композитных растений.

3.3. Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ полученных клубеньков.

3.3.1. Эксперименты над композитными растениями люцерны.

3.3.2. Эксперименты над композитными растениями астрагала с PSL.

3.3.3. Эксперименты над композитными растениями облепихи.

3.3.4. Эксперименты над композитными растениями рапса и «бородатыми корнями», полученными на листовых пластинках табака.

3.4. Создание полностью трансгенных по гену лектина растений.

3.4.1. Создание полностью трансгенных по гену лектина PSL растений табака.

3.4.2. Спонтанная регенерация трансгенных по гену лектина PSL проростков астрагала из культуры «бородатых корней».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем"

Синтез, транспортировка, хранение и внесение азотных удобрений связаны со значительными энергозатратами и уже сейчас на эти цели приходится около 35% суммарного энергопотребления в сельском хозяйстве. С другой стороны, массовое применение азотных удобрений приводит к эвтрофикации водоемов, ухудшению качества питьевой воды, и, в конечном счете, влияет на такие глобальные процессы как изменение климата и разрушение озонового слоя. Микробиологическая фиксация атмосферного азота позволяет избежать громадных затрат энергетических ресурсов, так как осуществляется за счёт энергии Солнца. Кроме того, это единственный экологически чистый путь снабжения растений доступным азотом, при котором принципиально невозможно загрязнение почв, воды и воздуха (Умаров, 2001). В связи с этим, одной из перспективных задач для современного сельского хозяйства является максимальное использование и преумножение симбиотического потенциала культурных растений.

Наиболее интенсивно азотфиксация протекает при образовании эндосимбиозов, когда микроорганизм проникает внутрь тканей или даже в клетки хозяина, как в случае бобово-ризобиального и актиноризного симбиозов. Но не все культурные растения образуют подобные клубеньковые симбиозы, и, зачастую, их участие в азотфиксации ограничивается ассоциативными симбиотическими взаимодействиями с различными почвенными диазотрофами.

Конечной целью большинства современных экспериментов симбиотической биоинженерии является создание устойчивых эндосимбиотических компартментов в растениях, которые в природе не вступают в эффективный азотфиксирующий симбиоз. Несмотря на то, что инфекционные нити, симбиосомы и сами клубеньки являются структурами, уникальными для симбиоза, их развитие можно рассматривать как совокупность реорганизованных процессов нормального гистогенеза и цитодифференцировки, регулируемых новыми сигналами, поступающими от микросимбионтов (Вгешт, 1998). Поэтому успехи в изучении генетических систем азотфиксирующего симбиоза позволяют приступить к направленному повышению эффективности подобных мутуалистических взаимоотношений, а также к созданию новых симбиотических комплексов. Одним из подходов для этого является модификация процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий, на которых растение выбирает оптимального партнера из состава обширной и генетически разнородной микробной популяции (Тихонович, Проворов, 2005).

Азотфиксация при бобово-ризобиальном симбиозе является наиболее эволюционно продвинутой и эффективной, по сравнению с другими симбиотическими системами и создание небобовых трансгенных растений, вступающих в азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями является перспективным направлением в биоинженерии симбиотических систем.

Одним из ключевых факторов на пути формирования бобово-ризобиального симбиоза являются лектины, которые обеспечивают узнавание растением-хозяином специфической для него бактерии. Эти белки, благодаря своим углеводсвязывающим свойствам, определяют избирательные взаимодействия растений с ризобиями, участвуя в адгезии бактерий к корневым волоскам, формировании инфекционных нитей и образовании клубеньков (Купе е1 а!., 1992).

В ряде работ ключевая роль лектинов убедительно доказана экспериментами, в которых внедрение гена лектина одних видов бобовых растений в другие приводило к тому, что последние приобретали способность дополнительно нодулироваться новым для них видом ризобий (Hirsch et al., 1995). Поэтому эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов бобовых, позволяют расширять круг микросимбионтов растений и являются важным этапом в создании новых симбиотических систем.

Цель данного исследования заключалась в получении трансгенных по генам лектинов бобовых растений модельных корневых систем на люцерне посевной, астрагале нутовом, облепихе крушиновидной, рапсе сорта Hanna и табаке линии SRI и изучении симбиотических взаимодействий полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Клонировать последовательности генов лектинов бобовых растений в векторе pCAMBIA 1305.1 и трансформировать полученными конструкциями клетки Agrobacterium rhizogenes 15834.

3. Изучить симбиотические взаимодействия полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями.

4. Путем трансформации Agrobacterium tumefaciens создать трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и изучить симбиотические взаимодействия корней с микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum bv. viciae.

Научная новизна работы

Разработан метод получения трансгенных по генам лектинов бобовых растений «бородатых корней» на астрагале, облепихе, рапсе и табаке. Впервые показана возможность формирования клубенек-подобных структур на актиноризных растениях с участием ризобий. Обнаружено усиление ризобиальной колонизации на трансгенных по гену лектина «бородатых корнях» рапса и табака. Созданы трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и впервые описаны скручивания корневых волосков полученных растений под воздействием микросимбионта гороха посевного. Впервые обнаружена спонтанная светонезависимая регенерация проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней».

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление об участии лектинов в формировании различных видов азотфиксирующего симбиоза. Разработанный экспериментальный подход, основанный на модификации процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий с помощью лектинов бобовых растений, в перспективе может быть использован для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями. Возможность спонтанной регенерации проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней» открывает новые перспективы в использовании астрагалов в качестве источников БАВ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-й международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), 2-м всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2007), всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), международной научной . конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах, содержит 17 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 313 работ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Вершинина, Зиля Рифовна

выводы

6. Созданы модельные растения табака Nicotiana tabaccum линии SRI, трансгенные в F2 по гену лектина гороха PSL. После обработки корней трансгенных растений микросимбионтом гороха выявлены скручивания корневых волосков, подтверждающие участие лектинов в запуске первичных симбиотических реакций.

Заключение

Изучение азотфиксирующих симбиозов относится к ряду актуальных современных биологических проблем, и получение новых симбиозов растений с азотфиксирующими микроорганизмами является приоритетным направлением для создания экологически ориентированного сельского хозяйства. Главной причиной тому являются проблемы загрязнения окружающей среды, связанные с применением азотных удобрений. Подобных проблем можно избежать в случае микробиологической азотфиксации, но не все сельскохозяйственные культуры способны вступать в эффективный азотфиксирующий симбиоз.

Симбиоз бобовых растений с бактериями рода КЫгоЫит характеризуется высоким уровнем ассимиляции атмосферного азота, поэтому изучение механизма образования подобного симбиоза, факторов специфичности, определяющих возможность формирования азотфиксирующих клубеньков штаммом ризобий на конкретном растении, имеет вместе с теоретическим, также и огромный практический интерес.

Одними из важнейших факторов специфичности для бобово-ризобиального симбиоза являются лектины, и модификация процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий с помощью этих белков - это интересный экспериментальный подход для получения новых симбиозов растений с азотфиксирующими микроорганизмами.

Перед нами стояла задача получить трансгенные по генам лектинов корни на модельных растениях люцерны, астрагала, облепихи, рапса и табака и изучить симбиотические реакции полученных корней с различными микросимбионтами. Выбор модельных растений был обусловлен следующими причинами: люцерна благодаря высокой клубенек-образующей отзывчивости; астрагал как представитель рода, являющегося перспективным источником различных лекарственных веществ; облепиха как типичное актиноризное растение; рапс и табак как несимбиотрофные растения.

При обработке трансгенных по гену пектина гороха PSL корней люцерны микросимбионтом R. leguminosarum bv. viciae были обнаружены неинфицированные клубеньки, типичные по форме для люцерны. В случае трансгенных по генам PSL/OAL и PSL/TPL корней, в присутствии бактерий из клубеньков Onobiychis arenaria и R. leguminosarum bv. trifolii соответственно, образования клубеньков не происходило, однако были обнаружены многочисленные изгибы и скручивания корней. Подобных реакций не наблюдалось в контрольных вариантах, что подтверждает стимулирующий эффект лектина на симбиотические взаимодействия люцерны на стадии преинфекции.

При инокуляции трансгенных по гибридному гену PSL/AGL корней люцерны микросимбионтом A. cicer, на корнях также были обнаружены характерные для люцерны клубеньки. Рассев содержимого клубеньков на питательную среду выявил наличие в них бактерий, которые оказались идентичны бактериям, использованным для инокуляции. Таким образом, в данном варианте наблюдались нетипичные симбиотические отношения между люцерной и клубеньковыми бактериями астрагала с образованием инфицированных клубеньков. Вероятно, это объясняется расширенной специфичности гибридного PSL/AGL к углеводам.

В экспериментах с композитными растениями облепихи, где было использовано сочетание естественного микросимбионта облепихи Frankia с микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum bv. viciae, на трансгенных по гену PSL корнях, кроме обычных актиноризных клубеньков, были получены структуры, отличающиеся малым количеством выростов модифицированных боковых корней и, скорее, напоминающие клубеньки бобовых. Поперечный срез структур выявил центральное расположение проводящих пучков и наличие активной меристемы, что является характерным для актиноризных клубеньков. RAPD-анализ бактерий, выделенных из этих структур, выявил присутствие среди них ризобий ЯЫюЫит итгпоБагит и отсутствие актиномицетов рода РгапЫа. Таким образом, впервые была показана возможность формирования клубенек-подобных структур на актиноризных растениях с участием ризобий.

Исследовано влияние экспрессии гена лектина на колонизацию трансгенных по генам РБЬ и РБЬ/АвЬ корней рапса соответствующими микросимбионтами. Эксперименты показали многократное, более чем на порядок увеличение численности бактерий на трансформированных корнях (в среднем « 37 раз в случае Р8Ь и в « 57 в случае РЭЬ/АОЬ), по сравнению с контрольными корнями. После обработки трансгенных по гену РЭЬ корней табака ЯЫгоЫит, \egwmnosarum с помощью микроскопирования были выявлены немногочисленные скручивания корневых волосков, которых не наблюдалось в случае обработки данными бактериями контрольных растений без гена лектина. Таким образом, экспериментальный подход, основанный на симуляции процессов узнавания на стадиях преинфекции с помощью лектинов бобовых растений, в перспективе может быть использован для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями.

Полноценная оценка влияния лектинов бобовых растений на симбиоз требует создания полностью трансгенных по генам лектинов модельных растений. Одним из интересных способов получения растений, несущих нужный ген, является регенерация трансгенных растений из культуры «бородатых корней». В данной работе была впервые обнаружена спонтанная светонезависимая регенерация проростков А. а'сег, что открывает новые перспективы в использовании астрагалов в качестве источников БАВ, а также в качестве модельных бобовых растений в экспериментах по расширению специфичности симбиоза.

Создание искусственных азотфиксирующих симбиозов культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. Полученные результаты имеют не только теоретическое, расширяющее наши представления об участии лектинов в формировании различных видов азотфиксирующего симбиоза, значение, но и практическое, так как возможность симбиотических взаимодействий между ризобиями и трансгенными по генам лектинов корнями открывает новые горизонты на пути рационализации азотного питания важных сельскохозяйственных культур за счет расширения их симбиотический азотфиксирующей активности и создания новых симбиотических взаимоотношений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вершинина, Зиля Рифовна, Уфа

1. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.Х., Чемерис A.B. Влияние природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями // Прикладная биохимия и микробиология. — 2009. — Т. 45, № 1.-С. 84-91.

2. Баулина О.И., Агафодорова М.Н., Корженевская Т.Г., Гусев М.В., Бутенко Р.Г. Цианобактерии в искусственно созданной ассоциации с каллусной тканью табака // Микробиология. 1984. — Т. 53, № 6. - С. 9971002.

3. Берцова Ю. В., Демин О. В., Богачев А. В. Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у Azotobacter vinelandii II Успехи биологической химии : Сб. 2005. - Т. 45. - С. 205-234.

4. Глаголева О.Б., Ковальская Н.Ю., Киреев И.И., Лобакова Е.С., Умаров М.М. Паранодуляция рапса при инокуляции азотфиксирующими ризосферными бактериями // Микробиология. — 1997. № 66. - С. 545-552.

5. Горелова O.A., Лобакова Е.С., Корженевская Т.Г. Инфекционная активность изолированных из природных симбиозов цианобактерий в отношении несимбиотрофных растений // Вестн. Московского ун-та. Сер. 16, Биология. 2004. - № 3. - С. 39-44.

6. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев : Наукова думка, 1973. 591 с.

7. Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Создание гибридных лектинов с новыми углеводсвязывающими свойствами // ДАН. 2006. - Т. 411, № 5. - С. 687-688.

8. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: Наука, 2002. 282 с.

9. Доросинский JI.M. Клубеньковые бактерии и нитрагин. JL: Колос, 1970. -191 с.

10. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений (лабораторное руководство). М.: Мир, 1991. — 173 с.

11. Иванушкина Н.Е., Кочкина Г.А., Ступарь О.С. Специфика микромицетных комплексов прикорневой зоны и клубеньков актиноризных растений // Микробиология, 1994. Т. 63, № 5. - С. 909-916.

12. Игнатов В.В. Биологическая фиксация азота и азотфиксаторы // СОЖ. — 1998.-№9.-С. 28-33.

13. Карпунина JI.B. Значение углевод-белкового узнавания и роль лектинов при формировании различного рода азотфиксирующих систем // Успехи соврем, биологии. 2002. - Т. 122, № 6. - С. 548-556.

14. Ковальская Н.Ю., Лобакова Е.С., Умаров М.М. Формирование искусственного азотфиксирующего симбиоза у растений рапса {Brassica napus var. napus) в нестерильной почве // Микробиология. 2001. - Т. 50, № 5.-С. 701-708.

15. Коць С.Я. Пектины бобовых растений как фактор эффективного симбиоза : обзор // Физиология и биохимия культурных растений. 2007. — Т. 39, №6.-Р. 463—475.

16. Коць С.Я., Береговенко С.К., Кириченко Е.В., Мельникова H.H. Особенности взаимодействия растений и азотфиксирующих микроорганизмов. Киев: Наукова думка, 2007. — 315 с.

17. Кретович В.А. Биохимия усвоения азота воздуха растениями. — М.: Наука, 1994.-168 с.

18. Лобакова Е.С. Ассоциативные микроорганизмы растительных симбиозов // Авт-т на соис. уч. ст-ни д.б.н. М. — 2004. — 48 с.

19. Льошина Л.Г. Клггинш i молекулярно-генетичш мехашзми симбюзу та асощативно1 взаемоди мйфооргашзм1вз рослинами у ризосфер! // Бюпошмери i юптина. 2009. - Т. 25, № 1 - С. 27-38.

20. Новикова Н.И. Современные представления о филогении и систематике клубеньковых бактерий // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 4. -С. 437-450.

21. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений. М.: Наука, 1985. 289 с.

22. Проворов H.A. Взаимосвязь между таксономией бобовых и специфичностью их взаимодействия с клубеньковыми бактериями // Ботан. журнал. 1992. - Т. 77, № 8. - С. 21-32.

23. Проворов H.A. Происхождение и эволюция бобово-ризобиального симбиоза // Ж. Общ. Биол. 2001. - Т. 62. - С. 472-495.

24. Проворов H.A. Растительно-микробные симбиозы как эволюционный континуум // Журн. общ. биологии. 2009. - Т. 70, № 1. - С. 10-34.

25. Проворов H.A. Специфичность взаимодействия клубеньковых бактерий и бобовых растений и эволюция симбиоза // С.-х. биология. — 1985. -№ 3. С. 34-47.

26. Проворов H.A., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами // Журнал общей биологии. -2002. Т. 63, № 6. - С. 451-472.

27. Проворов H.A., Тихонович И.А. Экологогенетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами // С.-х. биология. — 2003. № 3. - С. 11—25.

28. Радчук В.В., Блюм Я. Б. Успехи и проблемы генетической трансформации растений семейства крестоцветных // Цитология и генетика. -2005. -№ 3. С. 13-29.

29. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав и использование. Семейство Hydrangeaceae — Haloragaceae / Ред. Соколова П.Д. Л.: Наука, 1987. Т. 3. - 328 с.

30. Садовникова Ю.Н., Беспалова Л.А., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы является фактором роста для бактерии Azospirilliim brasilense II Докл. Акад. наук. 2003. - Т. 389, № 4. - С. 544-546.

31. Тильба В.А., Бегун С.А., Якименко М.В. Использование штаммов ризобий сои для стимулирования роста и оздоровления сельскохозяйственных культур (опыты с зернобобовыми культурами и томатами) // Вестн. РАСХН. 2004. - № 5. - С. 28-30.

32. Тихонович И.А., Проворов H.A. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. СПб.: Наука, 1998. — 194 с.

33. Тихонович И.А., Проворов H.A. Принципы селекции растений на взаимодействие с симбиотическими микроорганизмами // Вестник ВОГиС. -2005. Т. 9, № 3. - С. 295-305.

34. Тихонович И.А., Проворов H.A. Пути использования адаптивного потенциала систем "растение-микроорганизм" для конструирования высокопродуктивных агрофитоценозов // С.-х. биология. — 1993. — № 5. С. 36^6.

35. Умаров М.М. Современное состояние и перспективы исследований микробной азотфиксации // Перспективы развития почвенной биологии. М.: МАКС Пресс, 2001. С. 47-56.

36. Умаров М.М., Бурлуцкая Т.Р., Давидович О.Г., Матвеева Н.Г. Влияние инокуляции бактериями рода Pseudomonas на процессы азотного цикла вризосфере небобовых растений // Микробиология. 1994. - Т. 63, № 2. - С. 326-333.

37. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В. Современные представления о предпологаемых функциях лектинов растений // Журн. общ. биологии. — 2007. Т. 68, № 2. - С. 109-125.

38. Ю.А. Гончар, О.В. Надкернична, I.B. Волкова Формування штучного симбюзу азосшрил з рослинами шоковищ // Мпсробюлопя i бютехнолопя. — 2007. -№ 1.-С. 27-33.

39. Яковлев Г.П. Бобовые земного шара. JL: Наука, 1991. - 144 с.

40. Abe М., Kawamura R., Higashi S., Mori S., Shibata M., Uchiumi T. Transfer of the symbiotic plasmid from Rhizobium leguminosarum bv. trifolii to Agrobacterium tumefaciens II J. Gen. Appl. Microbiol. 1998. - V. 44, N 1. - P. 65-74.

41. Abe M., Sherwood J.E., Hollingsworth R.I., Dazzo F.B. Stimulation of clover root hair infection by lectin-binding oligosaccharides from the capsular and extracellular polysaccharides of Rhizobium trifolii I I J. Bacteriol. 1984. — V. 160. -P. 517-520.

42. Achouak W., Normand P., Heulin T. Comparative phylogeny of rrs and nifiü genes in the Bacillaceae // hit J Syst Bacteriol. 1999. - V. 49. - P. 961-967.

43. Akasaka Y., Mii M., Daimon H. Morphological alterations and root nodule formation in Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy roots of peanut (Arachis hypogaea L.) 11 Ann. Bot. 1998. - Y. 81. - P. 355-362.

44. Alazard D., Duhoux E. Development of stem nodules in a tropical forage legume, Aeschynomene afrcispera I I J. Exp. Bot. — 1990. — Y. 41. — P. 1199—1206.

45. Allen O.N., Allen E.K. The Leguminoseae: a source book of characteristics, uses and nodulation. Madison: The University of Wisconsin Press, 1980. 343 p.

46. Badenoch-Jones J., Flanders D.J., Rollfe B.G. Association of Rhizobium strains with roots of Trifolium repens II Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49, N6.-P. 1511-1520.

47. Banerjee M., Yesmin L. Sulfur-oxidizing plant growth promoting rhizobacteria for enhanced canola performance. US Patent. 2002. N. 07491535.

48. Banfalvi Z., Sakanyan V., Koncz C., Kiss A., Dusha I., Kondorosi A. Location of nodulation and nitrogen fixation genes on a high molecular weight plasmid of R. meliloti II Mol. Gen. Genet. 1981. - V. 184. - P. 334-339.

49. Bashan Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture // Biotech. Adv. 1998. - V. 16, N 4. - P. 729-770.

50. Bauer P., Poirier S., Ratet P., Kondorosi A. MsENOD12 expression is linked to meristematic activity during development of indeterminate and determinate nodules and roots // Mol. Plant Microbe Interact. 1997. - V. 10. - P. 39-49.

51. Bauer W.D. Infection of legumes by rhizobia // Annu. Rev. Plant Physiol. -1981.-V. 32.-P. 407-409.

52. Benoit L.F., Berry A.M. Flavonoid-like compounds from seeds of red alder (Alnus rubra) influence host nodulation by Frankia (Actinomycetales) // Physiol. Plant. 2006. - V. 99. - P. 588-593.

53. Benson D.R. Isolation of Frankia strains from alder actinorhizal root nodules // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V. 44. - P. 461-465.

54. Benson D.R., Clawson M.L. Evolution of the actinorhizal plant symbioses II Prokaryotic nitrogen fixation: a model system for analysis of biological process. / Eds Triplett E.W. Horizon Scientific Press: Wymondham, UK, 2000. P. 207224.

55. Berg R.H., Liu L., Dawson J.O., Savka A.M., Farrand S.K. Induction of pseudoactinorhizae by the plant pathogen Agrobacterium rhizogenes // Plant Physiol. 1992. - V.98. - P. 777-779.

56. Berry A.M., Sunell L.A. The infection process and nodule development // The Biology of Frankia and Actinorhizal Plants. / Eds Schwintzer C.R., Tjepkema J.D. N. Y.: Academic Press, 1990. -P. 61-81.

57. Bimboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 7. - P. 1513-1523.

58. Bishop P.E., Premakumar R. Alternative nitrogen fixation systems // Biological nitrogen fixation. / Eds Stacey G., Burris R.H., Evans H.J. N.Y.: Chapman and Hall, New York., 1992. P. 736-762.

59. Biswas J.C., Ladha J.K., Dazzo F.B., Yanni Y.G., Rolfe B.G. Rhizobial inoculation influences seedling vigor and yield of rice // Agron. J. — 2000. — V. 92. P. 880-886.

60. Biswas J.C., Ladha J.K., Dazzo F.B., Yanni Y.G., Rolfe B.G. Rhizobial inoculation influences seedling vigor and yield of rice // Agron. J. 2000. - V. 92. -P. 880-886.

61. Blauenfeldt J., Joshi P.A., Gresshoff P.M., Caetano-Anollés G. Nodulation of white clover (Trifolium repens) in the absence of Rhizobium II Protoplasma. — 1994.-V. 179. — P.106-110.

62. Bogusz D., Llewellyn J.D., Craig S., Dennis S.E., Appleby A.C., Peacock J.W. Nonlegume hemoglobin genes retain organ-specific expression in heterologous transgenic plants II Plant Cell. 1990. - V. 2. - P. 633-641.

63. Bohlool B.B., Schmidt E.L. Lectins: a possible basis for specificity in the Rhizobium-legume symbiosis // Science. 1974. —V. 185. — P. 269-275.

64. Boisson-Dernier A., Chabaud M., Garcia F., Bécard G., Rosenberg C. and Barker D.G. Hairy roots of Medicago truncatula as tools for studying nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbioses // Mol. Plant-Microbe Interact. — 2001. V. 14.-P. 693-700.

65. Bolhuis H., Severin I., Confurius-Guns V., Wollenzien U.I.A., Stal L.J. Horizontal transfer of the nitrogen fixation gene cluster in the cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes II The ISME Journal. 2010. - V.4. - P. 121-130.

66. Brelles-Marino G., Costa G.A., Boiardi J.L. Enhancement of infection thread formation by Rhizobium etli incubated with bean seed lectin // Microbiol. Res. 1996. - V. 151. - P. 243-246.

67. Brewin C.R., Andrews B., Gotlib I.H. Psychopathology and early experience: A reappraisal of retrospective reports // Psychological Bulletin. 1993. -V. 113.-P. 82-98.

68. Brewin N.J. Novel symbiotic organelles in the Rhizobium-legume interaction // Biology of Plant-Microbe Interactions. V. 4 / Eds Tikhonovich I.A., Lugtenberg B.J.J., ProvorovN.A. St.-Petersburg: Biont, 2004. P. 476^182.

69. Brewin NJ. Tissue and cell invasion by Rhizobium: the structure and development of infection threads and symbiosomes // The Rhizobiaceae. / Eds Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P JJ. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, 1998. -P. 417-429.

70. Brill L. M., Fujishige N. A., Hackworth C. A., Hirsch A. M. Expression of MsLECl transgenes in alfalfa plants causes symbiotic abnormalities // Mol. Plant Microbe Interact. 2004. - V. 17, N 1. - P. 16-26.

71. Burggraaf A.J.P., van der Linden J., Tak T. Studies on the localization of infectible cells on Alnus glutinosa roots I I Plant and Soil. 1983. - V. 74. - P. 175-188.

72. Caetano-Anolles G., Wrobel-Boerner E., Bauer W.D. Growth and movement of spot inoculated Rhizobium meliloti on the root surface of alfalfa // Plant Physiol. 1992. - V. 98. - P. 1181 -1189.

73. Capoen W., Goormachtig S., de Rycke R., Schroeyers K., Holsters M. SrSymRK, a plant receptor essential for symbiosome formation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. - V. 102. -P.10369-10374.

74. Capone I., Spano L., Cardarelli M., Bellincampi D., Petit A., Costantino P. Induction and growth properties of carrot roots with different complements of Agrobacterium rhizogenes T-DNA // Plant Mol. Biol. 1989. - V. 13. - P. 43-52.

75. Carpenter E.J. Marine cyanobacterial symbioses // Biol. Environ. Proc. R. Ir. Acad. -2002. V. 102.-P. 15-18.

76. Carpenter E.J., Janson S. Intracellular cyanobacterial symbionts in the marine diatom Climacodium frauenfeldianum II J. Phycol. — 2000. — V. 36. — P. 540-544.

77. Carsolio C., Campos F., Sanchez F., Rocha-Sosa M. The expression of a chimeric Phaseolus vulgaris nodulin 30-GUS gene is retricted to the rhizobially infected cells in transgenic Lotus corniculatus nodules // Plant Mol. Biol. 1994. — V. 26.-P. 1995-200.

78. Chabot R. H., Antoun H., Kloepper J., Beauchamp C. Root colonization of maize and lettuce by bioluminescent Rhizobium leguminosarum biovar phaseolus //Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 2767-2772.

79. Chaboud A., Lalonde M. Lectin binding on surfaces of Frankia strains // Can. J. Bot. 1983. - V. 61. - P. 2889-2897.

80. Chao W.L. Antagonistic activity of Rhizobium spp. against beneficial and plant pathogenic fungi II Lett. Appl. Microbiol. 1990. - V. 10, N 5. - P. 213215.

81. Chatarpaul L., Chakravarty P., Subramaniam P. Studies in tetrapartite symbioses. I. Role of ecto- and endomycorrhizal fungi and Frankia on the growth performance of Alnus incana II Plant Soil. 1989. - V. 118. - P. 145-150.

82. Chen W., Xie Y., Chen T. Studies on para-nodulation of wheat and nitrogen fixation //10 Int. Congr. on Nitrogen fixation: Abst. St.-Petersburg, 1995. P. 358.

83. Cho H., Widholm J. M. Improved shoot regeneration protocol for hairy roots of the legume Astragalus sinicus II Plant Cell Tissue Organ Cult. 2002. -V. 69, N3.-P. 259-269.

84. Christey M. C. Transgenic crop plants using Agi-obacterium rhizogenes-mediated transformation // Hairy roots: culture and applications / Harwood Acad. Pub., Amsterdam, 1997. P. 99-110.

85. Clewell D.B., Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular DNA form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. - V. 62, N 4. - P. 1159-1166.

86. Cocking E.C., Davey M.R. Nitrogen from the air for non-legume crops // Chem. Industry. 1991. - P. 831-835.

87. Cohen S., Chang A., Hsu L. Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria Genetic Transformation of E. coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1972.-V. 69.-P. 2110-2114.

88. Collier R., Fuchs B., Walter N., Lutke W.K., Taylor C.G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology // Plant J. 2005. -V.43.-P. 449-457.

89. Colpaert N., Tilleman S., van Montagu M., Gheysen G., Terryn N. Composite Phaseolus vulgaris plants with transgenic roots as research tool // Afr. J. Biotechnol. 2008. - V. 7, N 4. - P. 404-408.

90. Dalton D.A., Baird L.M., Langeberg L., Taugher C.Y., Anyan W.R., Vance C.P., Sarath G. Subcellular localization of oxygen defense enzymes in soybeaniGlycine max L. Merr.) root nodules // Plant Physiol. 1993. - V. 102. - P. 481489.

91. Dazzo F.B., Napoli C.A., Hubbell D.H. Adsorption of bacteria to roots as related to host specificity in the Rhizobium-clover symbiosis // Appl. Envir. Microbiol.-1976.-V. 32, N 1. P. 166-171.

92. Dazzo F.B., Truchet G.L, Sherwood J.E. Alteration of the trifolin A-binding capsule of Rhizobium trifolii -0403 by enzymes released from clover roots // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V. 44. - P. 478^90.

93. Dazzo F.B., Truchet G.L. Interactions of lectins and their saccharide receptors in the Rhizobium-legume symbiosis // J. Membr. Biol. 1983. - V. 73. -P. 4-11.

94. Deasey M. C., Matthysse A. G. Interactions of wild type and a cellulose-minus mutant of Agrobacterium tumefaciens with tobacco mesophyll and tobacco tissue culture cells // Phytopathology. 1984. - V. 74. - P. 991-994.

95. Denarie J., Cullimore J. Lipo-oligosaccharide nodulation factors: a new class of signalling molecules mediating recognition and morphogenesis // Cell. 1993. -V. 74.-P. 951-954.

96. Devine T.E., Kuykendall L.D. Host genetic control of symbiosis in soybean {Glycine max L.) // Plant and Soil. 1996. - V. 186.-P. 173-187.

97. Diaz C.L., Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., Lugtenberg B.J.J., Kijne J.W. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium-legume symbiosis // Nature. 1989. - V. 338. - P. 579-581.

98. Diaz C.L., Spaink H.P., Kijne J.W. Heterologous rhizobal lipochitin oligosaccharides and chitin oligomers induce cortical cell divisions in red clover root, transformed with the pea lectin gene // Mol. Plant Microbe Interact. 2000. -V. 13.-P. 268-276.

99. Diaz C.L., Van Spronsen P.C., Bakhuizen R., Logman G.J.J., Lugtenberg B J J., Kijne J.W. Correlation between infection by Rhizobium leguminosarum and lectin on the surface of Pisum sativum L. roots // Planta. — 1986. V. 168. - P. 350-358.

100. Diouf D., Diop T.A., Ndoye I. Actinorhizal, mycorhizal and rhizobial symbioses: how much do we know? // Air. J. Biotechnol. 2003. - V. 2, N 1. - P. 1-7.

101. Diouf D., Gherbi H., Prin Y., Franche C., Duhoux E., Bogusz D. Hairy root nodulation of Casuarina glauca: a system for the study of symbiotic gene expression in an actinorhizal tree // Mol. Plant Microbe Interact. 1995. - V. 8. -P. 532-537.

102. Djordjevic M.A., Zurkowski W., Shine J., Rolfe B.G. Sym plasmid transfer to various symbiotic mutants of Rhizobium trifolii, R. leguminosarum and R. meliloti // J. Bacterid. 1983. - V. 156, N 3. - P. 1035-1045.

103. Du M., Wu X. J., Ding J., Hu Z. B., White K. N., Branford-White C. J. Astragaloside IV and polysaccharide production by hairy roots of Astragalusmembranaceus in bioreactors // Biotechnol. Lett. — 2003. — V. 25, N 21. P. 1853-1856.

104. Duhoux E., Diouf D., Gherbi H., Franche C., Ahee J., Bogusz D. Le nodule actinorhizien II Acta Bot. Gallica. 1996. -V. 143. - P. 593-608.

105. Ebeling S., Kundig C., Hennecke H. Discovery of a rhizobial RNA that is essential for symbiotic root nodule development // J. Bacteriol. 1990. - V. 173, N. 20.-P. 6373-6382.

106. Elmerich C., Dezamaroczy M., Arsene F. et al. Regulation of nif geneexpression and nitrogen-metabolism in Azospirillum II Soil Biol. Biochem. — 1997. V. 29, N 5-6. - P. 847-852.

107. Filippini F., Rossi V., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P.M., Lo Schiavo F., Terzi M. A plant oncogene as a phosphatase. // Nature. 1996. - V. 379.-P. 499-500.

108. Flandung M., Gieffers W. Resistance reactions of leaves and tubers of rolC transgenic tetraploid potato to bacterial and fungal pathogens. Correlation with sugar, starch and clorophyll content // Physiol. Mol. PI. Pathol. 1993. - V. 42. -P. 123-132.

109. Forni C., Gentili S., Van Hove C., Grilli Caiola M. Isolation and characterizatior of the bacteria living in the sporocarps of A. filiculoides II Lam. Ann. Microbiol. 1990. - V. 40. - P. 235-243.

110. Franssen H.J., Vijn I., Yang W.C., Bisseling T. Developmental aspects of the Rhizobiwn-lQgume symbiosis // Plant Mol.Biol. 1992. - V. 19. - P. 89-107.

111. Fred E.B., Baldwin I.L. and McCoy E. Root nodule bacteria and leguminous plants // Univ. Wis. Stud. Sci. 1932. - N 5.

112. Gamas P., de Niebel F.C., Lescure N., Cullimore J.V. Use of a subtractive hybridization approach to identify new Medicago truncatula genes induced duringroot nodule development // Mol. Plant Microbe Interact. 1996. - V. 9. - P. 233242.

113. Gao J., Terefework Z., Chen W., Lindstrom K. Genetic diversity of rhizobia isolated from Astragalus adsurgens growing in different geographical regions of China//J. Biotechnol. — 2001. V. 91.-P. 155-168.

114. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells //Exp. Cell Res. 1968. V.50. -P. 151-158.

115. Gardner I.C., Clelland D.M., Scott A. Mycorrhizal improvement in non-leguminous nitrogen fixing associations with particular reference to Hippophae rhamnoides L. // Plant Soil. 1984. - V. 78. - P. 189-199.

116. Gatehouse J.A., Bown D., Evans I.M., Gatehouse L.N., Jobes D., Preston P., Croy R.R.D. Sequence of the seed lectin from pea (Pisum sativum L.) // Nucleic Acids Res. 1987. -V. 15, N 18. - P. 7642.

117. Gazzanelli G., Malatesta M., Pianetti A., Baffone W., Stocchi V., Citterio B. Bacteria associated to fruit bodies of ectomycorrhizal fungus Tuber borchii H Vittad. Symbiosis. 1999. - V. 26. - P. 211-222.

118. Geurts R., Franssen H. Signal transduction in Rhizobium-'mduced nodule formation // Plant Physiol. 1996. - V. 112. - P. 447^153.

119. Gibson A.H., Child J.J., Pagan J.D., Scowcroft W.R. The induction of nitrogenase activity in Rhizobium by non-legume plant cells // Planta. — 1976. — V. 128, N3,-P. 233-242.

120. Giri A. Narasu M.L. Transgenic hairy roots. Recent trends and applications // Biotechnol. Adv. 2000. - V. 18. - P. 1-22.

121. Glagoleva O.B., Kovalskaya N.U., Umarov M.M. Endosymbiosis formation between nitrogen-fixing bacteria Pseudomonas caryophylli and rape root cells // Endosymbiosis Cell Res. 1996. - Vol.Abst. 11. - P. 147-158.

122. Graham D.E. The Isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. — V. 85, N 2. - P. 609— 613.

123. Guan C., Pawlowski K., Bisseling T. Nodulation in legumes and actihorhizal plants // Nitrogen fixation: fundamentals and applications. / Eds Tikhonovich I.A. et al. Kluwer Acad. Publ., The Netherlands, 1995. P. 49-59.

124. Guan C., Wolters D.J., van Dijk C., Akkermans A.D.L., van Kämmen A., Bisseling T., Pawlowski K. Gene expression in ineffective actinorhizal nodules of Alnus glutinosa II Act. Bot. Gall. 1996. - V. 143. - P. 613-620.

125. Gusev M.V., Korzhenevskaya T.G., Pyvovarova L.V., Baulina O.I., Butenko R.G. Introduction of a nitrogen-fixing cyanobacterium into tobacco shoot regenerates // Plant. 1986. - V. 167, N 1. - P. 1-8.

126. Gutiérrez-Zamora M.L., Martínez-Romero E. Natural endophytic association between Rhizobium etli and maize {Zea mays L.) // J. Biotechnol. — 2001.-V. 91.-P. 117-126.

127. Halverson L.J., Stacey G. Signal exchange in plant-microbe interactions // Microbiol. Rev. 1986. - V. 50, N 2. - P. 193-225.

128. Hamblin J., Kent S.P. Possible role of phytohemagglutinin in Phaseolus vulgaris L. // Nature New Biol. 1973. - V. 245. - P. 28-29.

129. Hamill J. D., Lidgett A. J. Hairy root cultures — opportunities and key protocols for studies in metabolic engineering // Hairy roots: Culture and

130. Applications. / Eds Doran P. Harwood Academic Publishers. Amsterdam, 1997. -P. 1-30.

131. Hanahan D. Studies on transformation of E. coli with plasmids // J.Mol.Biol. 1983.-V. 166,N4.-P. 557-580.

132. Hansen J., J0rgensen J.E., Stougaard J., Marcker A.K. Hairy roots a short cut to transgenic root nodules // Plant Cell Rep. - 1989. - V. 8. - P. 12-15.

133. Hara-Nishimura I., Inoue K., Nishimura M. A unique vauolar processing enzyme responsible for conversion several proprotein precursors into the mature forms // FEBS Letters. 1991. - V. 294. - P. 89-93.

134. Hardarson G. Methods for enhancing symbiotic nitrogen fixation // Plant and Soil.-1993.-V. 152. P. 1-17.

135. Harrison M.J., Dewbre G.R. and Liu J. A Phosphate transporter from Medicago truncatula involved in the acquisition of phosphate released by arbuscular mycorrhizal fungi // Plant Cell. 2002. - V. 14. - P. 2413-2429.

136. Henzi M.X., Christey M.C., McNeil D.L. Factors that influence Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea L. var. italica) // Plant Cell Rep. 2000. - V. 19. - P. 994-999.

137. Hirel B., Miao G.H., Verma D.P.S. Metabolic and developmental control of glutamine synthetase genes in legume and non legume plants // Control of plant gene expression. / Eds Verma D.P.S. CRC Press, Boca Raton, FL, 1993. P. 443458.

138. Hirotani M., Zhou Y., Rui H., Furuya T. Cycloartane triterpene glycosides from the hairy root cultures of Astragalus membranaceus II Phytochemistry. — 1994. V. 37, N 5. - P. 1403-1407.

139. Hirsch A.M., Brill L.M., Lim P.O., Scambray J., Van Rhijn P. Steps toward defining the role of lectins in nodule development in legumes // Symbiosis. — 1995. -V. 19.-P. 155-173.

140. Hirsch A.M., LaRue T.A. Is the legume nodule a modified root or stem or an organ sui generis! II Crit. Rev. Plant Sci. 1997. - V. 16, N 4. - P. 361-392.

141. Hirsch A.M., Wilson K.J., Jones J.D., Bang M., Walker V.V., Ausubel F. M. Rhizobium meliloti nodulation genes allow Agrobacterium tumefaciens and Escherichia coli to form pseudonodules on alfalfa 11 J. Bacteriol. 1984. - V. 158, N3.-P. 1133-1143.

142. Hoagland D.R., Arnon H.I. The water-culture method for growing plants without soil / Calif. Exp. Agric. Stat. Cir(347), Berkeley, 1950. 32 p.

143. Hoflich G., Wiehe W., Buchholz C.H. Rhizosphere colonization of different crops with growth promoting Pseudomonas and Rhizobium bacteria // Microbiol. Res. 1995. - V. 150. -P. 139-147.

144. Hooykaas P.J.J., Snijdewint F.G.M., Shilperoort. Identification of the Sym plasmid of Rhizobium leguminosarum strain 1001 and its transfer to and exspression in other rhizobia and. Agrobacterium tumefaciens II Plasmid. — 1982. — V. 8. P. 73-82.

145. Hooykaas P.J.J., van Brussel A.A.N., Dulk-Ras H.D., Von Slogteren G.M.S., Schilperoort. Sym-plasmid of Rhizobium trifolii expressed in defferent rhizobial species and Agrobacterium tumefaciens II Nature. — 1981. — V. 291. — P. 351-353.

146. Horsh R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.C., Fraley R.T. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985. -V. 227.-P. 1229-1231.

147. Huang C.-Y. Factors effect on the nitrogen fixation of rhizobia in the symbiotic rhizobium-callus tissue 1. Carbon sources // Taiwania. 1983. - V. 28, N l.-P. 138-145.

148. Jacobsen-Lyon K., Jensen O.E, Jorgensen E.J., Marcker A.K., Peacock J.W., Dennis S.E. Symbiotic and nonsymbiotic hemoglobin genes of Casuarina glauca II Plant Cell. 1995. -V. 7. - P. 213-223.

149. James E.K., Olivares F.L. Infection and colonization of sugar-cane and other gramineous plants by endophytic diazotrophs // Crit. Rev. Plant Sci. 1998. - Vol. 17,No l.-P. 77-109.

150. Jayaraman V., Das H.R. Interaction of peanut root lectin (PRAII) with rhizobial lipopolysaccharides // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1381, N 1. -P. 7-11.

151. Jefferson R.A. Assaying Chimeric Genes in Plants: The GUS Gene Fusion System // Plant Mol. Biol. Rep. 1987. - V. 5. - P. 387-405.

152. Jensen J.S., Marcker K.A., Otten L., Schell J. Nodule-specific expression of chimaeric soybean leghaemoglobin gene in transgenicLotus corniculatus // Nature 1986. -V. 321. - P. 669-674.

153. Jeong S.-C., Myrold D.D. Genomic fingerprinting of Frankia microsymbionts from Ceanothus copopulations using repetitive sequences and polymerase chain reactions // Can. J. Bot. 1999. - V. 77. - P. 1220-1230.

154. Jorgensen J.-E., Stougaard J., Marcker A., Marcker K.A. Root nodule specific gene regulation: Analysis of the soybean nodulin N23 gene promoter in heterologous symbiotic systems // Nucl. Acids Res. — 1988. V. 16. — P. 3940.

155. Joshi P.A., Caetano-Anolles G., Graham E.T., Gresshoff P.M. Ontogeny and ultrastructure of spontaneous nodules in alfalfa {Medicago sativa) 11 Protoplasma. -1991.-V. 162,N l.-P. 1-11.

156. Kato G., Maruyama Y., Nakamura M. Involvement of lectins in Rhizobium-pea recognition // Plant Cell Physiol. 1981. - V. 22. - P. 759-771.

157. Kennedy I.R., Pereggerk L.L., Wood C. et al. Biological nitrogen fixation in non-leguminous field crops facilitating the evolution of an effective association between Azospirillum and wheat // Plant Soil. 1997. - Vol. 194, N 1-2. - P. 6579.

158. Kereszt A., Li D., Indrasumunar A., Nguyen C.D., Nontachaiyapoom S., Kinkema M., Gresshoff P.M. Agrobacterium rhizogenes-mQdlated transformation of soybean to study root biology // Nat. Protoc. 2007. - V. 2. - P. 948-952.

159. Kijne J.W., Bauchrowitz M.A., Diaz C.L. Root lectin and Rhizobia II Plant Physiol. 1997. - Y. 115. - P. 869-973.

160. Kijne J.W., Diaz C.L., Pater S. Lectins in the symbiosis between Rhizobia and leguminous plants // Adv. Lectin Res. / Eds Franz H., van Driessche E., Kasai K.J. Berlin: Ullstein Mosby., 1992. P. 15-50.

161. Kosugi S., Ohashf Y., Nakajima K., Arai Y. An Improved Assay for Glucuronidase in Transformed Cells: Methanol Almost Completely Suppresses a

162. Putative Endogenous ß -Glucuronidase Activity // Plant Sei. 1990. - V. 70. - P. 133-140.

163. Krol M.J., Kobus J., Fuk B. Wiazanie azotu w parabrodawkach korzeni zboz przez Azospirillum lip. i Ac in. like // Zezz. Nauk. Pol. / AR Szczecinie. - 1997. — N68.-C. 153-161.

164. Macknight R.C., Reynolds P.H.S., Farnden K.J.F. Analysis of the lupin Nodulin-45 promoter: conserved regulatory sequences are important for promoter activity // Plant Mol. Biol. 1995. - V. 27. - P. 457-466.

165. Markmann K., Giczey G., Parniske M. Functional adaptation of a plant receptor kinase paved the way for the evolution of intracellular root symbioses with bacteria // PLoS Biol. - 2008. - V. 6, N 3. - P. 68.

166. Martinez-Romero E. Recent developments in Rhizobium taxonomy // Plant Soil.-1994.-V. 161, N 1.-P. 11-20.

167. Matthysse A.G. Role of bacterial cellulose fibrils in Agrobacterium tumefaciens infections // J. Bacteriol. 1983. -V. 154. - P. 906-915.

168. Matthysse A.G., Holmes K.V., Gurlitz R.H.G. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumefaciens during attachment to carrot cells // J. Bacteriol. 1981.-V. 145.-P. 583-595.

169. Menze A., Mollers C. Transformation of different Brassica napus cultivars with three different strains of Agrobacterium rhizogenes II Proc. 10th Int. Rapeseed Congress. -1999. CD-ROM.

170. Miller I.M., Baker D.D. Nodulation of actinorhizal plants by Frankia strains capable of both root hair infection and intercellular penetration // Protoplasma. -1986.-V.131.-P. 82-91.

171. Miller J.H Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab., 1972. 432 p.

172. Mody B., Modi V. Peanut agglutinin induced alterations in capsular and extracellular polysaccharide synthesis and ex-planta nitrogenase activity of cowpea rhizobia // J. Biosci. 1987. - V. 12. - P. 289-296.

173. Muñoz J.A., Coronado C., Pérez-Hormaeche J., Kondorosi A., Ratet P., Palomares A.J. MsPG3, a Medicago sativa polygalacturonase gene expressed during the alfalfa-Rhizobium meliloti interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1998. -V. 95.-P. 9687-9692.

174. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. — P. 473-497.

175. Mylona P, Pawlovski K, Bisseling T. Symbiotic nitrogen fixation // Plant Cell. 1995. - V. 7. - P. 869-885.

176. Nie Y.E., Vesk M., Kennedy I.R., Srickandarajah S., Lane E., Tchan Y.T. Structure of 2,4-D induced 125 paranodules with Rhizobium on wheat // Phytochem. (Life Sci. Adv.). 1992. - N 11. - P. 67-73.

177. Nie Y.F. Nitrogen fixation in 2,4-D forced associative wheat-diazotroph system // Intern. Workshop Assoc. Interactions Nitrogen-Fix. Bact. Plants (Saratov, June 5-8, 1995): Abstr. Saratov, 1995. P. 32-34.

178. Nilsson O., Olsson O. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots // Physiol. Plant. — 1997. V. 100.-P. 463-473.

179. Normand P., Orso S., Cournoyer B., Jeannin P., Chapelon C., Dawson J., Evtushenko L., Misra A.K. Molecular phylogeny of the genus Frankia and related genera and emendation of family Frankiaceae II Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. — V. 46.-P. 1-9.

180. Nutman P.S. Genetics of symbiosis and nitrogen fixation in legumes // Proc. Roy. Soc.- 1969.-V. 176. P. 417—437.

181. Obertello M., Sy M.O., Laplaze L., Santi C., Svistoonoff S., Auguy F., Bogusz D., Franche C. Actinorhizal nitrogen fixing nodules: infection process, molecular biology and genomics // Afr. J. Biotechnol. 2003. - V. 2. - P. 528538.

182. Okubara P.A., Fujishige N.A., Hirsch A.M., Berry A.M. Dg93, a nodule-abundant mRNA of Datisca glomerata with homology to a soybean early nodulin gene//Plant Physiol.-2000.-V. 122.-P. 1073-1079.

183. Oldroyd G.E., Downie J.A. Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. - V. 59. - P. 519546.

184. Otten L., Heifer A. Biological activity of the rolB-like 5' end of the A4-orf8 gene from the Agrobacterium rhizogenes TL-DNA // Mol. Plant-Microbe Interact. -2001.-V. 14.-P. 405-411.

185. Pawlowski K. Nodule-specific gene expression // Physiol. Plant. -1997. V. 99.-P. 617-631.

186. Pawlowski K., Bisseling T. Rhizobial and actinorhizal symbioses: What are the shared features? // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 1899-1913.

187. Perrine-Walker F.M., Prayitno J., Rolfe B.G., Weinman J.J., Hocart C.H. Infection process and the interaction of rice roots with rhizobia // J. Exp. Bot. -2007. V. 58. - P. 3343-3350.

188. Petit A., Kühle A., Marcker K.A., Tempé J. Transformation and regeneration of the legume Lotus corniculatus: a system for molecular studies of symbiotic nitrogen fixation // Mol. Gen Genet. 1987. - V. 207. - P. 245-250.

189. Peumans W.J., Barre A., Hao Q., Rougé P., van Damme, Els J.M. Higher plants developed structurally different motifs to recognize foreign glycans // Trends Glycosci. Glycotechnol. 2000. - V. 12, N 64. - P. 83-101.

190. Pheler M., Petit M., Martin L., Duhoux E., Tempe J. Transformation and regeneration of a nitrogen-fixing tree, Allocasuarina verticillata II Lam. Biotechnol. 1991. - V. 9. - P. 461^166.

191. Porter J. R. Host range and implications of plant infection by Agrobacterium rhizoge?7es II Crit. Rev. Plant. Sei. 1991. - V. 10. - P. 387-421.

192. Prin Y., Rougier M. Preinfection events in the establishment of Alnus-Frankia symbiosis: study of the root hair deformation step // Plant Physiol. 1987. -V. 6.-P. 99-106.

193. Quandt H.J., Puehler A., Broer I. Transgenic root nodules of Vicia hirsuta: A fast and efficient system for the study of gene expression in indeterminate-type nodules // Mol. Plant Microbe Interact. 1993. — V. 6, N 6. - P. 699-706.

194. Rai A.N., Soderback E., BergmannB. Cyanobacterium-plant symbioses // New Phytol. 2000. - V. 147. - P. 449-481.

195. Ramlov B.K. Laursen B.N., Stougaard J., Marcker A.M. Site-directed mutagenesis of the organ-specific element in the soybean leghemoglobin Lbc3 gene promoter // Plant J. 1993. - V. 4. - P. 577-580.

196. Ribeiro A., Akkermans A.D.L., van Kämmen A., Bisseling T., Pawlowski K. A nodule-specific gene encoding a subtilin-like protease is expressed in early stages of actinorhizal nodule development // Plant Cell. 1995. - V. 7. - P. 785794.

197. Ritchie N.J., Myrold D.D. Geographic distribution and genetic diversity of Ceanothus infective Frankia strains // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. -P.1378-1383.

198. Rojas N.S., Perry D.A., Li C.Y., Friedman J. Influence of actinomycetes on Frankia infection, nitrogenase activity and seedling growth of red alder // Soil Biol. Biochem. 1992. - V. 23. - P. 1043-1049.

199. Rosenberg C., Boistard P., Denarie J., Casse-Delbart F. Genes controlling early and late functions is simbyosis are located on a megaplasmid in R. meliloti II Mol. Gen. Genet. 1981. -V. 184. - P. 326-333.

200. Rosenberg C., Casse-Delbart F., Dusha I., David M., Boucher C. Megaplasmids in the plant-associated bacteria R. meliloti and Pseudomonas solanacearum II J. Bacteriol. 1982. - V. 150. - P. 402^06.

201. Roth L.E. and Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen fixing soybean nodules: The symbiosome membrane comes from three sources // Eur. J. Cell Biol. 1989. - V. 49. - P. 13-23.

202. Rouge P., Pere D., Bourne Y. In vitro cleavage of the Lathyrus nissolia isolectin//Plant Sci.- 1989.-V. 62.-P. 181-189.

203. Russo R.O. Evaluating alder-endophyte {Alnus acuminata-Frankia-Mycorrhizae) interactions // Plant Soil. 1989. - V. 118. - P. 151-155.

204. Saha U., Sen M. Nitrogenase activity of diazotrophic strains of Candida tropicalis II Proc. Indian. Acad. Sci. (Plant Sci.). 1990. - V. 100, N 5. - P. 353359

205. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratoryj

206. Manual, 2 edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Cold Spring Lab., 1989.-1626 p.

207. Savka M.A., Liu L., Farrand S.K., Berg R.H., Dawson J.O. Induction of hairy roots or pseudoactinorhizae on Alnus glutinosa, A. acuminata and Elaeagnus angustifolia by Agrobacterium rhizogenes II Acta Ecol. — 1992. — V. 13. — P. 423— 431.

208. Sawada H., Kuykendall L.D., Young J. M. Changing concepts in the systematics of bacterial nitrogen-fixing legume symbionts // J. Gen. Appl. Microbiol.-2003.-V. 49.-P. 155-179.

209. Scheres B., van Engelen F., van der Knaap E., van de Wiel C., van Kämmen A., Bisseling T. Sequential induction of nodulin gene expression in the developing pea nodule // Plant Cell. 1990b. - V. 8. - P. 687-700.

210. Schlaman H.R.M., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Regulation of nodulation gene expression by NodD in rhizobia // J. Bacteriol. — 1992. V. 174. - P. 5177— 5182.

211. Schumulling T., Schell J., Spena A. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development // EMBO J. — 1988. V. 7. - P. 26212629.

212. Scott M.P., Jung R., Müntz K., Nielsen N.C. A protease responsible for post-translational cleavage of a conserved Asn-Gly linkage in glycinin, the major seed storage protein of soybean // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. - V. 89. - P. 685-662.

213. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // Gel electrophoresis of nucleic acids. A practical approach. IRL Press; Oxford, 1982. -P. 3976.

214. Sekar C., Prasad N.N., Sundaran M.D. Enhancement of polygalacturonase activity during auxing induced paranodulation and endorhizospphere colonization of Azospirillum in rice roots // Indian J. Exp. Biol. — 2000. — V. 38, N 1. P. 8083.

215. Selim S. La symbiose Casuarina-Frankia. Optimisation de la croissance et approche biologique de la reconnaissance micro-organisme-plante hôte. These d'Université Paris Sud. 236 p.

216. Shiztliffe S.J., Vessey J.K. A nodulation (Nod+/Fix-) mutant of Phaseolus vulgaris L. has nodule-like structures lacking peripherial vascular bundles (Pvb—) and is resistant to mycorrhizal infection (Myc-) // Plant Sei. 1996. - V. 118. - P. 209-220.

217. Spaink H.P., Weinmann J., Djordjevic M.A., Wijffelman C.A., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Genetic analysis and cellular localization of the Rhizobium host specificity-determining NodE protein // EMBO J. 1989. - V. 8. -P. 2811-2818.

218. Spano L., Mariotti D., Cardarelli M., Branca C., Costantino P. Morphogenesis and auxin sensitivity of transgenic tobacco with different complements of Ri T-DNA // Plant Physiol. 1988. - V. 87. - P. 479-483.

219. Sprent J.I. Nodulation in Legumes. Kew Royal Botanical Gardens: Cromwell Press Ltd., 2001. 146 p.

220. Sprent J.I., Raven J.A. Evolution of nitrogen-fixing root nodules symbioses // Biological Nitrogen Fixation: Achievements and Objectives. / Eds Stacey G., Burris R.H., Evans H.J. Chapman and Hall, New York, 1992. P. 461 -196

221. Stacey G., Paau A.S., Brill W.J. Host recognition in the Rhizobium-soybean symbiosis II Plant Physiol. 1980. - V. 66. - P. 609-614.

222. Stiller J., Martirani L., Tuppale S., Chian R.-J., Chiurazzi M., Gresshoff P.M. High frequency transformation and regeneration of transgenic plants in the model legume Lotus japonicus II J. Exp. Bot. 1997. - V. 48. - P. 1357-1365.

223. Stougaard J. Regulators and regulation of legume root nodule development // Plant Physiol. -2000. -V. 125. P. 531-540

224. Stougaard J., Sandal N., Gren A., Kühle A., Marcker K.A. 5' Analysis of the soybean leghemoglobin IbcS gene: Regulatory elements required for promoter activity and organ specificity II EMBO J. 1987. - V. 6. - P. 3565-3369.

225. Sullivan J.T., Ronson C.W. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis island that integrates into a phe-tRNA gene // Proc. Natl. Acad. Sci. -1998.-V. 95.-P. 5145-5149.

226. Suominen L., Roos C., Lortet G., Paulin L., Lindstrom K. Identification and structure of the Rhizobium galegae common nodulation genes: Evidence for horizontal gene transfer // Mol. Biol. Evol. 2001. - V. 18. - P. 907-916.

227. Swensen S., Mullin B. Phylogenetic relationships among actinorhizal plants. The impact of molecular systematics and implications for the evolution of actinorhizal symbiosis //Physiol. Plant. 1997. -V. 99. - P. 565-573.

228. Swensen S.M. The evolution of actinorhizal symbioses: Evidence for multiple origins of the symbiotic association // Am. J. Bot. 1996. - V. 83. - P. 1503-1512.

229. Szabados L., Ratet P., Grunenberg B., de Bruijn F J. Functional analysis the Sesbania rostrata leghemoglobin gLbc3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants // Plant Cell. — 1990. — V. 2. — P. 973-986.

230. Terefework Z., Kaijalainen S., Lingstrom K. AFLP fingerprinting as a tool to study the genetic diversity of Rhizobium galegae isolated from Galega orientalis and Galega officinalis II J. Biotechnol. 2001. - V. 91. - P. 169-180.

231. Truchet G., Barker D.G., Camut S., de Billy F., Vasse J., Huguet T. Alfalfa nodulation in the absence of Rhizobium II Mol. Gen. Genet. — 1989. V. 219. - P. 65-68

232. Truchet G., Roche P., Lerouge J., Vasse J., Camut S., de Billy F., Prome J.-C., Denarie J. Sulphated lipo-oligosacharide signals of R. meliloti elicit root nodule organogenesis in alfalfa // Nature. 1991. - V. 3 51. - P. 670-673.

233. Truchet G., Rosenberg C., Vasse J., Julliot J.S., Camut S., Denarie J. Transfer of Rhizobium meliloti pSym genes into Agrobacterium tumefaciens: host-specific nodulation by atypical infection // J Bacteriol. — 1984. V. 157, N 1. - P. 134-42.

234. Uozumi N. Large-scale production of hairy root // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004. - V. 91. - P. 75-103.

235. Varma, A., Sudha S., Franken P. Piriformospora indica — a cultivable plant growth promoting root endophyte with similarities to arbuscular mycorrhizal fungi 11 Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 2741-2744.

236. Vasse J., de Billy F., Camut S., Truchet G. Correlation between ultrastructure, differentiation of bacteroids and nitrogen fixation // J. Bacteriol. -1990. V. 172. - P. 4295-4306

237. Vilaine F., Casse-Delbart F. Independent induction of transformed roots by the TL and TR regions of the Ri plasmid of agropine type Agrobacterium rhizogenes II Mol. Gen. Genet. 1987. - V. 206. - P. 17-23.

238. Wall L.G. The actinorhizal symbiosis // J. Plant Growth Regul. 2000. - V. 19.-P. 167-182

239. Walter N., Vega O. A review on beneficial effects of rhizosphere bacteria on soil nutrient availability and plant nutrient uptake // Rev. Fac. Nal. Agr. 2007. — V. 60.-N. 1.-P. 3621-3643.

240. Webster G., Jain V., Davey M.R., Gouch C., Vasse J., Denarie J., Cocking E.C. The flavonoid naringenin stimulates the intracellular colonization of wheat roots by Azorhizobium caulinodans II Plant Cell Environ. — 1998. V. 21. - P. 373-383.

241. White F.F., Nester E.W. Hairy root: plasmid encodes virulence traits in Agrobacterium rhizogenes II J. Bacteriol. 1980. - V. 141, N 3. - P. 1134-1141.

242. Wilson J.K. Over five hundred reasons for abandoning the cross-inoculation groups of the legumes // Soil Sei. 1944. - V. 58. - P. 61-69.

243. Yamamoto K., Konami Y., Kusui K. Purification and characterization of a carbohydrate-binding peptide from Bauhinia purpurea lectin // FEBS Letters. — 1991.-V. 281.-P. 258-262.

244. Yamamoto K., Konami Y., Osawa T. Alteration of the carbohydrate-binding specificity of the Bauhinia purpurea lectin trough the preparation of a chimeric lectin // J. Biochem. 1992a. - V. 111. - P. 87-90.

245. Yamamoto K., Konami Y., Osawa T. Carbohydrate-binding peptides from several anti-H(0) lectins // J. Biochem. 1992b. - V. 111. - P. 436^139.

246. Yamamoto M., Yoshizaki K., Kishimoto T., Ito H. IL-6 is required for the development of Thl cell-mediated murine colitis // J. Immunol. — 2000. V. 164. -P. 4878^4882.

247. Yang W.C., Horvath B., Hontelez J., van Kämmen A., Bisseling T. In situ localization of Rhizobium mRNAs in pea root nodules: ni/A and nifii localization // Mol. Plant Microbe Interact. 1991. - V. 7. - P.276-281.

248. Yelton M.M., Mulligan J.T., Long S.R. Expression of Rhizobium meliloti nod genes in Rhizobium and Agrobacterium backgrounds // J. Bacteriol. 1987. — V. 169, N7.-P. 3094-3098.

249. Yemysev V.T. Associative symbiosis of soil diazotrophic bacteria and vegetable crops // Eurasian soil sei. 1994. - V. 26. - P. 42—57.

250. Young N.M., Oomen R.P. Analysis of sequence variation among legume lectins: a ring of hypervariable residues forms the perimeter of the carbohydrate-binding site // J. Mol. Biol. 1992. - V. 228. - P. 924-934.

251. Zhang X.X., Turner S.L., Guo X.W., Yang H.J. The common nodulation genes of Astragalus sinicus rhizobia are conserved despite chromosomal diversity // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, N 7. - P. 2988-2995.

252. Zheng Z., Liu D., Song C., Cheng C., Hu Z. Studies on chemical constituents and immunological function activity of hairy root of Astragalus membranaceus II Chin. J. Biotechnol. 1998. - V. 14, N 2. - P. 93-97.

Информация о работе

Вершинина, Зиля Рифовна
кандидата биологических наук
Уфа, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы