Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рибосомные и кодирующие белок (gyrB, alkB и parE) гены бактерий рода Geobacillus и использование их в таксономии и экологии

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рибосомные и кодирующие белок (gyrB, alkB и parE) гены бактерий рода Geobacillus и использование их в таксономии и экологии"

На правах рукописи

Коршунова Алена Викторовна

РИБОСОМНЫЕ И КОДИРУЮЩИЕ БЕЛОК (дугВ, аШВ ирагЕ) ГЕНЫ БАКТЕРИЙ РОДА СЕОВАС1ЫиБ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИХ В ТАКСОНОМИИ И ЭКОЛОГИИ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I 5 СЕН 2014

Москва-2014

005552668

005552668

Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научные руководители: доктор биологических наук доктор биологических наук

Алешин Владимир Вениаминович Назина Тамара Николаевна

Официальные оппоненты.

Яненко Александр Степанович, доктор биологических наук, профессор, Государственный научный центр РФ ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, заместитель директора.

Кузнецов Борис Борисович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, заместитель директора.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН)

Защита состоится « 17 » октября 2014 г. в 11 часов 0 Р минут на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университета имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 12, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.bio.msu.ru.

Автореферат диссертации разослан " \в " CQUTJ&Ji 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических

_ И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Термофильные углеводородокисляющие бактерии рода Geobacillus являются обычными обитателями высокотемпературных нефтяных пластов (Назина, Беляев, 2004). В процессе окисления н-алканов нефти геобациллы образуют биосурфактанты, что обусловливает их большой биотехнологический потенциал для повышения нефтеизвлечения. Надежное обнаружение углеводородокисляющих геобацилл в микробном сообществе нефтяного пласта позволяет принимать решение о возможности применения биотехнологий повышения нефтеизвлечения, основанных на активации нефтеокисляющих бактерий. В период после первого описания рода Geobacillus (Nazina et al., 2001) были предложены 19 новых видов, размывающих границы существующих видов и рода. В 2010-2012 годах на основании анализа генов 16S рРНК была начата новая ревизия рода. Часть видов была перенесена в новые роды (Aeribacillus, Caldibacillus), а ряд видов объединен в подроды (Minana-Galbis et al., 2010; Dinsdale et al., 2011; Coorevits et al., 2012). Последовательности генов 16S рРНК представителей рода Geobacillus очень близки, а у ряда видов эти гены не различаются. Таким образом, существует необходимость в поиске новых генетических маркеров или признаков, позволяющих осуществить внутривидовую и межвидовую дифференциацию геобацилл. Эти сведения необходимы также для обнаружения геобацилл в микробных сообществах и выявления их метаболической активности.

На настоящий момент показана возможность использования генов «домашнего хозяйства» бета-субъединиц гиразы (gyrB) и топоизомеразы IV (рагЕ) для уточнения филогенетического положения представителей родов Pseudomonas (Izumi et al., 2007, Anuj et al., 2009), Vibrio (Luo and Hu, 2008), Paenibacillus (Wu et al., 2010) и др. на видовом уровне. Продукты генов gyrB и рагЕ принимают непосредственное участие в процессе репликации ДНК и разделения дочерних клеток. Высказано предложение об использовании генов gyrB и рагЕ для идентификации бактерий на внутри- и межвидовом уровне в качестве альтернативы метода ДНК-ДНК гибридизации (Suzuki et al„ 2001, Wang et al., 2007).

Анализ генов 16S рРНК в сочетании с анализом генов дополнительных путей метаболизма является наиболее востребованным молекулярно-биологаческим подходом при изучении микробных сообществ. Выбор генов в качестве дополнительного маркера во многом зависит от предполагаемого ключевого биогеохимического процесса, осуществляемого сообществом. В экосистеме заводняемых высокотемпературных нефтяных пластов особый интерес представляет процесс аэробного окисления нефти и ее компонентов. У мезофильных бактерий, деструкторов н-алканов, наиболее часто в качестве дополнительного гена-маркера используют ген алкан-монооксигеназы (аШЗ), ключевого фермента аэробной деградации н-алканов (van Beilen et al., 2005). К началу нашей работы появились первые сообщения об обнаружении у термофильных бактерий Geobacillus thermoleovorans 70 и Geobacillus thermoglucosidasius TR2 фрагментов

последовательности alkB-гена (Sharkey et al., 2004; Marchant et al., 2006). Таким образом, представлялся актуальным анализ генов 16S рРНК геобацилл в сочетании с генами alkB, кодирующими ключевые ферменты деградации н-алканов.

Отдельной проблемой является доказательство функциональной активности геобацилл в природном местообитании. В настоящее время метаболически активные компоненты сообщества выявляют путем применения анализа генов 16S рРНК, полученных на основе тотальной РНК сообщества (Mills et al., 2004, 2005). Обнаружена прямая корреляция между высоким количеством рРНК и метаболической активностью микроорганизма. Сравнение библиотек клонов генов 16S рРНК, созданных на основе ДНК и РНК, позволяет выявить метаболически активные группы прокариот (Mills et al., 2004, 2005; Михайлова, 2012).

В имеющихся публикациях идентификацию и детекцию геобацилл в природных образцах в основном осуществляли на основании анализа генов 16S рРНК, поскольку сведения о других рассматриваемых генах-маркерах (gyrB, рагЕ и гены деградации углеводородов) у геобацилл практически отсутствовали (Назина и соавт., 2000; 2006; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003; Dahle et al., 2008; Mnif et al., 2011). Таким образом, представляется актуальным исследование генов, перспективных как для идентификации и обнаружения бактерий рода Geobacillus в природных сообществах, так и для доказательства их метаболической активности.

Цель и задачи исследования. Целью работы является поиск и сравнительная характеристика белок-кодирующих генов бета-субъединицы гиразы, бета-субъединицы топоизомеразы IV и алкан-гидроксилазы у термофильных нефтеокисляющих бактерий рода Geobacillus и оценка возможности использования этих генов для определения таксономического положения геобацилл и их обнаружения в составе микробных сообществ высокотемпературных нефтяных пластов.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.

1. Определить первичную структуру генов gvrB и топоизомеразы IV у новых и известных штаммов бактерий рода Geobacillus и оценить возможность их использования для таксономии геобацилл.

2. Определить первичную структуру генов alkB у 11-ти штаммов, принадлежащих к роду Geobacillus.

3. Разработать праймеры для детекции разных алкан-гидроксилаз и исследовать разнообразие и локализацию генов alkB в геноме углеводородокисляющей бактерии Geobacillus subterraneus штамм К, а также транскрипцию генов alkB в зависимости от стадии роста культуры и используемых углеводородных субстратов.

4. Определить филогенетическое разнообразие микроорганизмов в культурах термофильных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературных нефтяных пластов методом клонирования и секвенирования генов 16S рРНК и alkB, полученных на основе тотальных ДНК и

РНК культур.

Научная новизна работы. Впервые определены последовательности генов бета-субъединицы гиразы и топоизомеразы IV у 18 штаммов геобацилл, и показана возможность использования этих генов для определения таксономического положения бактерий рода СеоЪасШиз. В геномах 11 исследованных штаммов геобацилл выявлено от трех до семи генов алкан-гидроксилаз, из которых только два являются универсальными для всех штаммов. Показано высокое сходство нуклеотидных последовательностей генов а1кВ родов СеоЬасИ/«5 и ЛАог/ососсг«, что свидетельствует об отсутствии видовой специфичности генов а!кВ и не позволяет использовать их в качестве единственного маркера для определения таксономической принадлежности геобацилл в природных экосистемах. Впервые показана хромосомная локализация генов а1кВ в геноме углеводородокисляющей бактерии СеоЬасНЫ тоб/еггаиег« штамм К. С использованием разработанных праймеров к 8-и генам а!кВ исследована их транскрипция в зависимости от стадии роста культуры и используемых углеводородных субстратов. Выявлен высокий уровень транскрипции генов а1кВ-%ео5, а\кВ-%ео6 и а1кВ-%ео4 при росте бактерии <3. £!(6/еггалег(£ К на н-алканах, что подтверждает участие белковых продуктов этих генов в деградации н-алканов. Определена функциональная роль трех из семи генов а!кВ. При росте на н-алканах с разной длиной углеродной цепи (//-С16Н34 и Н-С22Н46) в экспоненциальной фазе обнаруживается мРНК а!кВ^ео5 и а1кВ^еоб, имеющих высокий уровень сходства между собой, а в начале стационарной фазы обнаруживается мРНК а!кВ^ео4. Впервые созданы библиотеки 16Б рДНК на основе ДНК и РНК культур углеводородокисляющих бактерий из нефтяных пластов. Анализ библиотеки, созданной на основе РНК, свидетельствует о доминировании геобацилл в культурах из высокотемпературных нефтяных пластов и дает более полное представление о метаболически активных группах микроорганизмов.

Практическая значимость работы. Оптимизированы условия выделения ДНК и РНК из биомассы геобацилл с последующей амплификацией генов 16Э рРНК и а1кВ. Созданы праймеры для детекции разных алкан-гидроксилаз в накопительных культурах и природных образцах. Сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов бета-субъединицы гиразы и топоизомеразы IV рекомендован в качестве признака, альтернативного ДНК-ДНК гибридизации для внутри- и межвидовой идентификации бактерий рода СеоЬасШиз.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на Ш-ой и V Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2009), на международном симпозиуме по микробиологии подземных экосистем (155М 2008) (Шизуока, Япония, 2008); на Пятом Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009); на 2-м международном симпозиуме по прикладной микробиологии и молекулярной биологии нефтяных

систем (ISMOS2, Орхус, Дания, 2009), и на Международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 обзор и 5 материалов отечественных и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает разделы «Введение», «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Материалы диссертации изложены на 123 страницах и включают 21 рисунок и 7 таблиц. Список литературы включает 12 отечественных и 213 зарубежных наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы. В работе использовали как чистые бактериальные культуры, так и пробы пластовой воды из нагнетательной скважины, переведенной на режим обратного самоизлива (проба 8 м3), и из добывающей скважины 1017-3 высокотемпературной залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган. Пробы пластовой воды использовали в качестве посевного материала для получения накопительных культур аэробных термофильных углеводородокисляющих бактерий.

Гены бета-субъединиц гиразы и топоизомеразы IV исследовали у 18 штаммов рода Geobacillus. Штаммы [С. uzenensis UT (DSM 13551х = VKM В-22297) и X (VKM В-2228); G. subterraneus 34т (DSM 135521" = VKM В-22261), К и Sam; G. gargensis GaT (DSM 15378х = VKM В-2300т); G. jurassiens DS1T(DSM 15726T = VKM B-23017) и DS2; Geobacillus sp. vw3-ln; Geobacillus sp. 1024; Geobacillus sp. 46 и 49; Geobacillus sp. 3Feng] были выделены из высокотемпературных нефтяных пластов и из горячих источников сотрудниками ИНМИ РАН. Штаммы G. slearothermophilus DSM 22т и G. thermoleovorans DSM 5366т были получены из германской коллекции микроорганизмов, штамм G. thermocatenulatus VKM В-12597 - из всероссийской коллекции. Штаммы Geobacillus sp. 1017; Aeribacillus sp. G8m выделены Д.Ш. Соколовой в ходе исследования микробного сообщества высокотемпературных нефтяных пластов:

Гены деградации н-алканов исследовали у бактерий G. stearothermophilus DSM 22т; G. uzenensis UT; G. subterraneus 34т и К; G.jurassicus DS1T; G. thermocatenulatus VKM B-1259T; G. gargensis GaT; G. thermoleovorans DSM 5366т; и y штаммов, определенных по результатам анализа генов 16S рРНК, gyrB ирагЕ как G. thermoglucosidasius 3Feng; G. toebii B1024 и G. toebii vw3-ln.

В качестве хозяина для векторов, содержащих фрагменты генов-мишеней, использовали штамм Esherichia coli Z85 (Fermentas, Литва). Штамм поддерживали на среде LB (бакто-триптон - 10.0 г/л;

дрожжевой экстракт - 5.0 г/л, NaCl - 10 г/л) с тетрациклином (12 мкг/мл). Для отбора клонов, содержащих вектор, в среду LB дополнительно вносили ампициллин (100 мкг/мл), изопропил-бета-D-тиогапактопиранозид и X-gal.

Состав сред и условии культивирования. Для выделения геномной ДНК, штаммы геобацилл выращивали на богатой среде (бакто-триптон, 5.0 г/л; дрожжевой экстракт, 2.5 г/л, рН 7.0). Для выделения РНК бактериальные культуры выращивали на минеральной среде (К2НРО4 - 2.0 г/л; NaH2P04- 0.5 г/л; (NH4)2S04, 1.5 г/л; MgS04 - 7ШО, 0.1 г/л; CaCh - 2№0, 0.132 г/л; раствор микроэлементов 1 мл, рН 6.8-7.2). Субстратами служили индивидуальные н-алканы, ацетат калия или глюкоза (0.5-2 % об./об.). Бактерии растили в стационарном режиме при температуре 60°С.

Накопительные культуры углеводородокисляющих бактерий получали путем посева пластовой воды на минеральную среду со смесью С10-С22 н-алканов в качестве субстрата роста. Посевы инкубировали при 60°С. Третий пересев полученных накопительных культур углеводородокисляющих бактерий (обозначенных 8мЗ и 1017-3) в среде с н-алканами использовали для выделения нуклеиновых кислот и молекулярно-биологического анализа сообщества.

Молекулярно-биологические методы. Выделение ДНК и РНК. Тотальную ДНК из культур выделяли, используя набор «Diatom,mDNAprep» (Биоком, Москва), согласно рекомендациям фирмы изготовителя с небольшими модификациями.

Тотальную РНК выделяли с использованием тризола («TRIzol Reagent», Invitrogen) согласно прилагаемой инструкции с небольшими модификациями. Полученные препараты РНК очищали от остаточной ДНК с помощью ДНКазы (Силекс, Россия), в количестве 0.5 единиц активности на реакцию. Обратную транскрипцию проводили с использованием праймеров «случайные гексамеры» и M-MLV обратной транскриптазы (Силекс, Россия).

Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса с небольшими модификациями.

Полученные препараты плазмидной и геномной ДНК и тотальной РНК анализировали с помощью электрофореза в 0.8-1.0% агарозном геле. Концентрацию нуклеиновых кислот определяли с помощью спектрофотометра ND-1000 (NanoDrop, США) в соответствии с рекомендациями производителя

Подбор праймеров. Последовательности праймеров конструировали с использованием программ BioEdit, Lasergene v. 5.06 DNASTAR и Oligo v. 6.0. В ходе выполнения работы были сконструированы специфичные праймеры к восьми гомологам alkB и к последовательности гена gyrB штамма G. sublerraneus К для проведения ПЦР-РВ, родоспецифические праймеры для амплификации фрагментов генов gyrB и рагЕ бактерий рода Geobacillus.

Амплификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для амплификации фрагментов генов alkB использовали вырожденные олигонуклеотидные праймеры; прямой Alk-BFB (5'-CGT ACG GSC AYT TCT ACR TCG A-3') и обратный Alk-BRB (5'-CGG RTT CGC GTG RTG

RT-3'). ПЦР проводили в следующем режиме: активация полимеразы (5 мин при 94 °С); 35 циклов, включающих денатурацию ДНК (0.5 мин при 94°С), отжиг праймеров (0.5 мин при 60°С) и элонгацию (0.5 мин при 72°С); и финальную элонгацию (8 мин при 72°С).

Фрагменты генов 16S рРНК амплифицировали с использованием универсальных праймеров 8-27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 519r (5'-G(T/A)ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3') (Edwards et al., 1989) при 30 циклах реакции (0.5 мин - 94°С, 0.5 мин - 50°С, 0.5 мин -72°С).

Амплификацию гена gyrB проводили в 2 этапа. На первом этапе использовали вырожденные праймеры Up-IdeA (5'- GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYG-3') и Up -2R(5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTC-AT-3') (Yamamoto and Harayama, 1995) при 35 циклах реакции (0.5 мин - 94°С, 1 мин - 60°С, 1 мин - 72°С). На втором этапе проводили реамплификацию ПЦР продуктов либо с праймерами Up-IS (5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3') и Up-2Sr (5 '-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3'), комплементарными 5' области вырожденных праймеров Up-1-deA и Up-2R (Yamamoto and Harayama, 1995), либо со специально сконструированными для геобацилл прямыми праймерами gyrBs-G(gyrl-G) (ACGGACGAACGGGTTGA(GACGGA-TGAACGGGTCGA)) в сочетании с праймером Up-2Sr. Для избирательной амплификации гена рагЕ использовали сконструированные родоспецифические праймеры top2F-geo (5'-GGNAARTTYGGNCAAGGC-3') и toplR-geo (5'-GCRTCKGTCATRATRATCACTTTGTC-3')/top3R-geo(5'-TTYTKCGGATTGCGCSMYTG-3'). ПЦР проводили по схеме: денатурация ДНК (95°С - 3 мин) и 35 циклов реакции, состоящей из денатурации (94°С - 1 мин), отжига праймеров (55°С - 1 мин) и элонгации (72°С - 1 мин). Полученные в ходе ПЦР фрагменты ДНК анализировали в 1% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. ПЦР-продукты очищали путем переосаждения ДНК раствором этанола с 0.75 М ацетата аммония при комнатной температуре.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили с использованием «7500 Fast Real-time PCR System» (Applied Biosystems, США). Реакцию проводили в 25 мкл с использованием набора «Реалити ТМ» (ИМБ РАН, Москва), содержащего однократный ПЦР буфер и стабилизатор, 0.2 mM dNTP, 0.3 ед. Taq-полимерэзы, ROX и SYBR Green в качестве красителей (ЗАО «Синтол», Россия). Амплификацию проводили в следующем режиме: денатурация ДНК (95°С - 10 мин) и 40 циклов реакции, состоящей из денатурации (95°С - 15 сек), отжига праймеров и элонгации (63°С - 1 мин). Назальный уровень порога числа циклов (Ct - threshold cycle) устанавливали по отрицательному контролю - реакции ПЦР в отсутствие матрицы.

Клонирование и секвенирование. Фрагменты генов 16S рРНК, alkB, gyrB и рагЕ секвенировали напрямую с помощью соответствующих праймеров или клонировали в вектор pTZ57R/T (Fermentas, PCR Cloning Kit). Трансформацию проводили с помощью электропоратора

8

MicroPulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories). Отбор трансформантов, проверка наличия вставки в векторе и ее сиквенс были проведены по стандартной методике. Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе «ABI 3730 DNA Analyzer», используя набор ABI PRISM BigDye™ Terminator v 3.1 (Applied Biosystems, США).

Нуклеотидные последовательности анализировали с помощью программы Blast в базе данных NCBI GenBank, редактора BioEdit , пакета программ DNA Star и алгоритма CLUSTALW. Построение бескорневых филогенетических деревьев проводили по методу связывания ближайших соседей с помощью пакета программ TREECONW. Полученные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК, gyrB и рагЕ геобацилл помещены в GenBank под номерами: gyrB - GU459227-GU459239; GU323951, GU323952;рагЕ- GU459240-GU459250; GU323953, GU323954; 16S рРНК-GU459251, GU459252. Нуклеотидные последовательности генов alkB - под номерами EF534128-EF534180.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2Л. Определение первичной структуры генов гиразы {gyrB) и топоизомеразы IV (рагЕ)

у бактерий рода Geobacillus Создание праймерое к генам gyrB и рагЕ и их амплификация. Сравнение последовательностей генов gyrB из полных геномов Geobacillus kaiistophilus HTA 426 и G. thermodenitrificans NG80-2 обнаружило необходимость доработки ранее предложенных праймеров Up-1 и Up2R к гену гиразы бактерий (Yamamoto and Harayama, 1995).

В результате в праймере Up-1 был удален 3'- концевой нуклеотид А. Амплификация с использованием модифицированного праймера Upl-deA дала положительный результат для 10 штаммов геобацилл. Прямое секвенирование полученных ампликонов удалось для G. stearothermophilus DSM 22Т, G.jurassicus DS1T, Geobacillus sp. 1017, 8m3, B1024 и vw3-l. Только для первых 4-х штаммов полученная последовательность соответствовала гену gyrB, а для штаммов В-1024 и vw3-l она соответствовала гену бета-субъединицы топоизомеразы IVрагЕ. Клонирование и последующий анализ ампликонов для оставшихся 4-х штаммов геобацилл обнаружили как последовательности гена gyrB, так и рагЕ в каждой библиотеке.

Таким образом, используемые вырожденные праймеры были не всегда специфичны для гена gyrB, что отмечалось и ранее (Kasaiet al., 1998; Watanabe et al., 2001). Для решения проблемы были разработаны и применены праймеры, избирательно специфичные к гену gyrB ( праймер gyrBs-G в паре с вырожденным праймером Up-2) и гену рагЕ (праймеры toplF-geo и top3F-geo в паре с top2R-geo) геобацилл (рис. 1). Для проведения ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на матрице штамма G. subterraneus К были разработаны праймеры gyrl-G и gyr2-G, из которых прямой праймер

gyrl-G подобран с учетом его отжига в паре с ир2Я. Амплификация с полученными праймерами дала положительный результат для всех исследуемых штаммов за исключением ПЦР с праймерами к гену рагЕ на ДНК штамма 8тЗ.

Филогенетический анализ. Для проверки возможности использования генов %угВ и рагЕ в качестве дополнительного инструмента в изучении видового состава геобацилл был проведен филогенетический анализ этих генов внутри рода СеоЬасШш. Филогенетические деревья, построенные по последовательностям генов £угВ и рагЕ, сравнивали между собой и с филогенетическим деревом, основанном на последовательностях генов 16Э рРНК. Были использованы как полученные в данном исследовании последовательности генов 16Б рРНК, и рагЕ, так и референтные последовательности из ОепВапк.

ир1-(1еА

5'-£п-В (1930п.н.) -3' - 1272п.н. -

854 п.н.

ц\т1-0

146 п.н

о\т2-С

л

ир2Я

>

1ор1Р^ео

У-рагЕ (1940 п.н.)-3'

1158 п.н.

920 п.н.

1орЗР-цео

I

1ор2Я-аео

Рисунок 1. Места отжига вырожденных и специфичных праймеров для амплификации генов £угВ и рагЕ геобацилл. Черными прямоугольниками обозначены места отжига праймеров на последовательности гена ёугВ, белыми - 5'- концевая часть праймеров ир1-с1еА ир2Я с искусственной последовательностью для прямого секвенирования ПЦР продукта.

Согласно филогенетическому анализу, большинство последовательностей генов 16S рРНК геобацилл попадает в I кластер, уровень межвидового сходства в котором находится в пределах 97.6-100% (рис. 2). Полученное значение сходства сравнимо с внутривидовым уровнем для геобацилл (99.8-100%), что затрудняет идентификацию видовой принадлежности внутри I кластера. При сравнении последовательностей gyrB разделение на кластеры соответствовало и дополняло топологию 16S рРНК-дерева. Так, I кластер достоверно (значение бутстреп-поддержки 100%) разделился на 5 подкластеров (IA-IE), внутри которых уровень сходства последовательностей (94.5100%) был значительно выше, чем между ними (84.4-90.6%) (рис. За). На аналогичном рагЕ-переве структура кластера I полностью соответствовала полученной при анализе гена gyrB (уровень сходства последовательностей внутри подкластеров составлял 95.6-100%, между подкластерами -86.3-93.3%) за единственным исключением: на этом дереве подкластер IA достоверно распался на два кластера - IA-1, объединивший типовые штаммы видов G. gargensis и G. thermocatenulatus, и IA-2, объединивший референтные штаммы Y412MC61, G. kaustophilus НТА426 и новый штамм 1017 (рис. 36).

2.2. Идентификация представителей рода Geobacillus на основе сравнительного филогенетического анализа генов 16S рРНК и генов gyrB и тоиоизомеразы IV и оценка возможности использования последних для таксономии геобацилл

Филогенетические деревья, построенные на основе сравнения последовательностей gyrB и рагЕ, дало больше информации о видовой принадлежности геобацилл, чем последовательность гена 16S рРНК. Так, штаммы G. Jurassiens DS1T, G. thermocatenulans B1259T, G. stearothermophilas DSM227, имеющие 99% сходства генов 16S рРНК, разделились по последовательностям генов gyrB и рагЕ на отдельные ветви кластера со сходством 86-91% и 76-85% соответственно (рис. 3). Согласно результатам анализа филогенетического сходства генов I6S рРНК штамм 3Feng был идентифицирован как представитель G. thermoglucosidasius, а штамм В1024 принадлежал к виду G. toebii. Результаты анализа последовательностей генов gyrB и рагЕ подтвердили филогенетическую отдаленность этих штаммов от других представителей рода Geobacillus. Глубина различий последовательностей gyrB и рагЕ составила 15-25% против 5%, полученных при сравнении последовательностей генов 16S рРНК этих штаммов. Основываясь на топологии gyrB- и рагЕ-деревьев можно подтвердить предварительную идентификацию нового штамма 46, как представителя вида G. stearothermophilus, штамма vw3-ln - как G. toebii vw3-ln, референтного штамма G11МС16- как представителя вида G. thermodenitrificans, а также идентифицировать новые штаммы 49 и 1017 и референтный штамм Y412MC61 как представителей вида G. kaustophilus. Филогенетическое дерево, основанное на сравнении последовательностей гена gyrB и рагЕ, выявило необходимость уточнения видовой принадлежности штаммов

0.02

юо р

95

89

в. ^егто1еоуогат Р5М 5366т (226923) в. ктШорМЫз НТА426 (МС_006510)

в. катЮрМЫ КС1МВ 8547т (Х60618)

в. ткат 35-1Т(А^93805)

в. НШатая Ы-Зт (АУ044055)

веоЬасШш ер, У412МС61 (ТОАСЕРО1000009)

( СеоЬасШт ер. 49 (СШ94001)

I СеоЬасШт ер. 1017 (Си459251)

99 р (?. зГеаго/ИегторИИю РЭМ 22ТШ294817)

СеоЬасШт ей. 46 Г 04994000) в. еагретк Оат (АУ193888) О. ФегтосаГепиШчз Р5М 730т (226926)

СикшжшЛШ1(АУЗ 12404) в. тгазысиз Р52 (АУЗ12405) & цгелегей ит (АР276304) 991 в. тепет/я X (АР276305) С. ¡шЬ/еггалеия 5ат(АР276308) О. зиЫеггапем 34т (АР276306) в. зиЫеггапет К(АР276307)

веоЬасП1ы* ер. БИМС 16 СМг_АВУН01000002) С. гкегтодепагфсам РЭМ 465т (226928) С. 1Иегтос1еп1М/1сат N080-2 (>1С_009328) ]00| С. therm0gluc0sidashls АТСС43742т(АВ021197)

*■ СеоЬасШт ер. ЗРеп§ (011994002) — С. саШхуШ1уПсиз РБМ 97-9871" (АР067651) СеоЪасШш зр. wcн70 (ыг_Авио 1000010) ; С. ЮеЬИ ВК-1Т (АРЗ 26278)

СеоЬасШт ер. 1024 (ОШ94003) СеоЬасШт ер. \луЗ-1 (Си994004) С. /ерШатат в55-97Т (АУ563003) | щ

ГС. раПШш РЭМ 3670т (№_026515) . СеоЬасШт $р. 8тЗ (ОШ59252) IV - в. ¿ейг/иТГТ(АГ564616) | V

< (Зе 100 '

р Сес

ч"

1001_Г

II

Рисунок 2. Филогенетическое дерево представителей рода СеоЬасШт, основанное на нукпеотидных последовательностях гена 16Б рРНК (штаммы, для которых нами определены последовательности гиразы и топоизомеразы подчеркнуты). Последовательности, определенные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом. Цифрами показана достоверность ветвления, определенная на основании 1000 реплик бутстреп-анализа.

а)

Г Ceobacillus sp. Y412МС61 (ACEDOIOOOOO.I), 1 С. Lauslophilui HTA426 (ВА000043) 100 LGWÍKWibsp. 49(GU459234) гС. jiugraui С«1 (GU459237) ""Т-й. Исгтоса1ти1аш\Ш B-IZ59I(GU3239J2) — СсоЫкШтsp. I017<GU459235) 100 . С. HrwMlurmvrhtlu, DSM 22T(GU459238) L СмЫкШм sp. 46 (GU459239) С. nzmmb X (GU459232) О. nsmaah LT (GU4592331 С.¡uruyskus IIS2 (GU459229) G. jura шею I)SIT(GU45922S) 10()| CeobacUhíssf. Gi IMC16 (ABVJ10I000007) IC. tHcmodmimfmm NGM-2 (CPQOGS57)

II)

100

G. juJ>toTan>'j,i34,(GU4592i0)

С. и№тш'|п К (GU459227) С. иЛлталгн Sm(GU45923l)

- С. (Avrmo4Í«cfl.viíí«síM* (GU323951) —Gcobacilluí sp. WCH70 (АВШ1000015)'

— íífoíoriWossp. Km3 (GU459236)

|lll¡ IV

6)

0.05

100

100Г Gratante 1017 (GU45924S) L (ktéütíHm sp. 49 (G U99400SI С. ШЯорМш HTA426 (BA00IXM3),

ОаЬаШф. У412МС61 (ACEDOIOOOOOJ) 1001 С. gargmsis GaT (GU459247)

IC. thcmocatmulütus VKM B- 1259T (GU323953)

100

100

C/itr«si«iDSIT<GU43924]) C.Kfn<7HBtT(GU459245| G. «ívw»iiX (GU459244) Г Geobacillus sp. 46 (GU994006) L C.JMí

wariithcrmophiliii DSM22*(GU459249) 100 - ¿!№6flfiíííeíp.GllMC16 (ABVH01000007) I O. Ihrmodcnilrfflcam NG80-2 (CP000557I C. utlm/mК (011459242) G. íüblen-aneas 34r (G U4 59241) G. subímmis Sam (GU45M40) ~ C. (AiTmoJi;/tíí-wiV(lími3KeBg(GU459246.t Gt&tMn W.WCH70 (ABUO1000015)

100

гСи/Writesp. »»3-1 (GU459250) 109' СпЫсЯюу. В-1024 (GU323954)

U-l

Рисунок 3. Филогенетическое дерево представителей рода СеоЬасШиз, основанное на нуклеотидных последовательностях генов (а) ирагЕ (б). Последовательности, определенные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом. Масштаб указывает количество нуклеотидных замен на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления согласно бутстреп-анализу (1000 реплик).

G. jurassiens DS1T и DS2, G. uzenensis X и UT и отнесения их к одному виду. Для штаммов G. thermocatenulans В-1259т и G. gargensis GaT также рекомендовано уточнить таксономическое положение.

Таким образом, сравнительный анализ последовательностей генов топоизомераз II типа -гиразы и топоизомеразы IV, свидетельствуют о возможности использования их для дифференциации видов рода Geobacillus в качестве филогенетических маркеров, дополняющих анализ генов 16S рРНК. Уровень генетической дистанции последовательностей генов gyrB и рагЕ большинства видов рода Geobacillus значительно превышает таковой, определенный на основании сравнения генов 16S рРНК: он достигает 30% для генов gyrB и 25% - для генов рагЕ, не опускаясь при этом ниже 10% для обоих генов. При этом топология соответствующих деревьев, хотя и коррелирует с таковой 16S-pPHK-дерева, оказывается значительно более сложной, позволяя достоверно выделить отдельные ветви (подкластеры), в значительной степени коррелирующие с видовой структурой рода Geobacillus.

2.3. Поиск генов ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий рода Geobacillus и определение первичной структуры алкан-гндроксилаз

Настоящий этап работы проводился совместно с к.б.н. Е.М. Михайловой (ИНМИ РАН) (Турова и соавт., 2008; Назина и соавт., 2011). Осуществлен поиск генов ключевого фермента окисления н-алканов биодеградации углеводородов у 11 штаммов термофильных нефтеокисляющих бактерий рода Geobacillus. В результате амплификации с праймерами к ключевому ферменту окисления н-алканов - алкан-монооксигеназе (alkB) для всех штаммов был получен положительный результат. Сиквенс и анализ клонированных фрагментов длиной около 500 п.н. показал, что каждый штамм геобацилл содержал несколько гомологов гена alkB, число которых превышало 3. Всего выявлено 8 вариантов гена alkB геобацилл (alkB-geol, alkB-geo2, alkB-geoS, alkB-geo4, alkB-geo5, alkB-geoö, alkB-geo7, alkB-geo8) (табл. 1). Уровень сходства между разными гомологами геобацилл составлял 59.7-96.7%.

Результаты анализа не выявили какой-либо закономерности распределения гомологов в зависимости от вида и штамма геобацилл. Схожий набор гомологов обнаружен у штаммов разных видов: гомологи alkB-geol-alkB-geo4 для G. thermocatenulatus В-1259т, G. stearothermophilus DSM 22т и G. gargensis GaT; гомологи a!kB-geoI-alkB-geo5 для G. thermocatenulatus 3Feng и G.toebii В1024. Набор гомологов y штаммов одного вида (например, у G. subterraneus 34ти G. subterraneus К, у G. toebii В1024 и G. toebii vw3-ln) наоборот отличался. Последовательности гомологов alkB-geol и alkB-geo4 были обнаружены у всех исследованных штаммов геобацилл (табл. 1). Наиболее редкими оказались гомологи alkB-geo7 и alkB-geo8. Гомолог alkB-geo7 был обнаружен у 2 штаммов: G. uzenensis UT и G. toebii vw3-ln. Гомолог alkB-geo8 выявлен только у G. stearothermophilus 22т. Филогенетический анализ фрагментов alkB генов исследованных ,

Таблица 1. Разнообразие последовательностей гена alkB у бактерий рода Geobacillus

Гомолог генов алкан-монооксигеназы alkB alkB-geol alkB-geo2 alkB-geo3 a!kB-geo4 alkB-geoS alkB-geo6 alkB-geo7 alkB- geo8

alkB4 alkB4 ЫкВЗ alkB3 alkB2 alkB2 alkB alkBl

Ближайший ген согласно (Rhodococcus (R. erythro- (Nocardia (R. erythro- (R. erythro- (R. erythro- (природ- (Rhodo-

BLAST erythropolis polis NRRL sp. H17-1) polis NRRL polis 50-V) polis NRRL: ный клон coccus

NRRL B-16531) B-16531) B-16531) B-16531) alkG4-35k) sp.Q15)

Сходство ДНК* (АК5), % 99.2(100) 90.0(98.6) 87.3(89.7) 96.7(96.6) 95.4(100) ; 99.0(100) 69.8(71.2) 70.0(67. 4)

G. gargensis GaT + + + +

G. jurassiens DSI1 + + + + +

G. stearothermophilus 22T + + + + +

G. subterraneus 34T + + +

G. subterraneus К + + + +

G. thermocatenulatus B-1259T + + + +

G. thermoglucosidasius 3Fcng + + + + +

G. thermoleovorans 5366r + + + + + +

G. toebii В1024 + + + + +

G. toebii vw3-ln + + + + + +

G. uzenensis Ur + + + + + +

'Сходство последовательностей ДНК между ближайшим а!кВ геном из вепВапк и аШВ генами геобацилл.

^Сходство аминокислотного состава (АК) между транслированными последовательностями ближайшего ЫкВ гена из вепВапк и ЫкВ гомологами

штаммов геобацилл свидетельствовал о том, что последовательности а!кВ^ео1, а!кВ^ео4 и а!кВ-%еоб были практически идентичными, соответственно, а!кВ4-, а!кВЗ- и лШ?2-гомологам ЯИос!ососсш егуЛгороИз N111*1- В-16531 и ЛИос1ососсиз эр. 015 (\Vhyte е1 а1, 2002), три другие были близки к ним, и только два наиболее редких гомолога (а!кВ^ео7 и а1кВ-$ео8) были уникальными. По ГЦ-составу гомологи а1кВ-генов геобацилл были также ближе к хромосомной ДНК родококков, чем к хромосомной ДНК и генам «домашнего хозяйства» (гесЫ и гроВ) геобацилл. Это может свидетельствовать о появлении у геобацилл генов а1кВ в результате горизонтального межвидового переноса.

Исследование гомологов алкан-монооксигеназы а/кВ у <7. яиЫеггапем К. Для проверки гипотезы о возможном обнаружении других гомологов генов а!кВ у геобацилл при расширении выборки клонов или использовании других методов исследования, был выбран штамм й. зиЫеггапеиз К. В результате клонирования продукта ПЦР с вырожденными праймерами к генам а!кВ штамма й. ¡иЫеггапет К получено 95 клонов. Секвенирование и последующий филогенетический анализ фрагментов гена а!кВ клонов показал, что кроме обнаруженных ранее у штамма гомологов гена а1кВ - а1кВ^ео1, а!кВ^ео2, а!кВ^еоА и а1кВ-£ео6, в геноме О. зиЫеггапеия К присутствуют гомологи аШЗ-£еоЗ и о/А'В-^ео5.

В параллельном эксперименте на матрице тотальной ДНК штамма К была проведена реакция ПЦР-РВ с использованием специфичных праймеров для всех 8 гомологов гена аШВ. Реакция подтвердила присутствие в геноме С. зиЫеггапеиь К обнаруженных среди клонированных последовательностей гомологов а!кВ^ео\ - а/Ш-^еоб, а также позволила выявить еще один гомолог - а1кВ-^ео1. Гомолог а1кВ^ео8 у штамма К не был выявлен перечисленными методами. Экспериментально показано, что геобациллы могут содержать большее число гомологов, чем было выявлено на основании первичного анализа библиотеки клонов генов а1кВ. Таким образом, увеличение количества клонов, содержащих вставку фрагментов генов а!кВ, в геномной библиотеке, и применение специфичных праймеров позволило выявить у штамма (7. зиЬ1еггапеш К семь из восьми известных генов-гомологов геобацилл, вместо четырех, обнаруженных при первичном исследовании. По-видимому, аналогичный результат можно ожидать и для других штаммов геобацилл.

2.4. Локализация генов а!кВ в геноме углеводородокисляющей бактерии СеоЬасШиэ

яиЫеггапеиз штамм К

Обнаруженное близкое родство большинства а!кВ генов-гомологов геобацилл аналогичным генам родококков позволяет предположить участие этих генов в процессах горизонтального переноса. Как известно, в процесс переноса наиболее часто вовлекаются адаптационные гены, расположенные на плазмидах. Для определения локализации генов а1кВ в геноме й. хиЫеггапеш К было проведено раздельное выделение хромосомной и плазмидной ДНК из выращенной биомассы

Показано, что штамм содержит плазмиду размером около 100 тыс. п.н. Контроль чистоты полученного препарата плазмидной ДНК осуществляли путем постановки ПЦР с праймерами к генам 16Б рРНК и &угВ, имеющим хромосомную "локализацию. Последующая амплификация фрагмента гена а/Ш с использованием вырожденных праймеров (А1к-ВРВ и А1к-ВЯВ) на полученных препаратах дала положительный результат только на матрице хромосомной ДНК (данные приведены в диссертации). Полученные результаты свидетельствуют о хромосомной локализации генов а!кВ в геноме исследуемого штамма б. ¡иЫеггапеиз К.

2.5. Детекция мРНК генов а1кВ у бактерии С. зиЫеггапеих К при росте на к-алканах

Для определения функциональной роли генов-гомологов у штамма С. $иЫеггапеи$ К, в геноме которого обнаружено 7 из 8 гомологов гена ЫкВ, методом ПЦР-РВ исследовали образование матричной РНК (мРНК) гомологов при росте культуры на н-гексадекане (н-Ск,Нз4) и н-докозане (н-С22Н46) при 60°С (рис. 4а). В качестве отрицательно контроля проводили амплификацию на кДНК из культуры О. зиЫеггапеиэ К, выращенной на глюкозе и ацетате.

В экспоненциальную фазу при росте й. зиЫеггапень К на глюкозе образования мРНК не наблюдалось. Однако при росте на ацетате обнаружена мРНК гомолога aIkB-geoЗ. Результаты анализа мРНК гомологов а!кВ, синтезируемых в экспоненциальную фазу при росте на н-алканах с разной длиной углеродной цепи (С16 и С22), оказались идентичными. В обоих случаях наблюдалось образование мРНК гомологов а\кВ-%ео5 и a¡kB-geo6, а мРНК других гомологов не было обнаружено (рис. 46).

В связи с этим было исследовано образование мРНК гомологов а!кВ штаммом К, растущим на С16 и С22 н-алканах в начале стационарной фазы (ООг.оо 0.71 и 0.54 соответственно). При росте на обоих субстратах в начале стационарной фазы также наблюдалось совпадение результатов: обнаруживалась мРНК одного и того же гомолога а1кВ^ео4 (рис. 4в).

Таким образом, длина цепи исследованных окисляемых н-С]бНэ4 и н-СггШб н-алканов не влияла на дифференциальную транскрипцию генов-гомологов ЫкВ у бактерии С. тЬ/еггапеиз К. Избирательная транскрипция разных гомологов ЫкВ зависела от условий роста культуры. В экспоненциальной фазе роста при оптимальных условиях транскрибировались гомологи ЫкВ^ео5 и a¡kB-geo6, а в стационарную фазу при ухудшении условий роста транскрибировался alkB-geo4.

Полученные результаты позволяют судить о функциональной роли трех из восьми обнаруженных генов-гомологов ЫкВ у геобацилл. Условия индукции ферментов, детерминированных не только редкими гомологами а!кВ^ео7 и а!кВ^ео8, но и универсальным для всех геобацилл а!кВ^ео! и близким к нему а1кЪ-%ео2, остаются неизвестными. Возможно, эти варианты фермента индуцируются другими углеводородными компонентами нефти или в иных условиях роста, что нуждается в дальнейших исследованиях.

а)

б) С|г>: экспоненциальная фаза в) С16: стационарная фаза

12345678 М 12345678

Рисунок 4. а). Кривая роста й. ьиЫеггапеиз К в средах с С]бНз4 и С22Н46 (Ск,; С22) н-алканами в качестве единственного источника углерода и энергии при 60°С. б) Электрофореграммы продуктов реамплификации со специфичными праймерами к гомологам а1кВ генов геобацилл, полученных на матрице кДНК культур в. зиЫеггапеиБ К, растущих на «-гексадекане (Слй), в экспоненциальную (б) и стационарную (в) фазы роста. Условные обозначения: М - маркер молекулярного веса ДНК, 1-8 - амплификация со специфическими праймерами к гомологам а1кВ-geol - alkB-geo8 соответственно.

2.6. Филогенетическое разнообразие генов 168 рРНК и а1кВ в библиотеках клонов, полученных на основе ДНК и РНК из накопительных культур аэробных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературного нефтяного пласта Разнообразие генов 165 рРНК в библиотеках клонов накопительных культур. Настоящий этап работы проводился совместно с к.б.н. Е.М. Михайловой (ИНМИ РАН) и к.б.н. Н.М. Шестаковой (ИНМИ РАН) (Шестакова Н.М. и соавт., 2011). Накопительные культуры термофильных углеводородокисляющих бактерий из призабойной зоны нагнетательной скважины (культура 8мЗ) и из добывающей скважины (культура 1017-3) нефтяного месторождения Даган, полученные в среде со смесью С10-С22 н-алканов, использовали для выделения тотальной ДНК и

РНК. РНК использовали в качестве матрицы для обратной транскрипции и синтезировали первую цепь кДНК. Такой подход впервые применен для выявления метаболически активных микроорганизмов из нефтяных пластов. В призабойной зоне (проба 8 м3) нагнетательной скважины вода обогащена растворенным кислородом, температура колеблется от 40 до 60°С. В пробе из добывающей скважины (1017-3) микроорганизмы находятся в анаэробных условиях при постоянной температуре не ниже 60°С. Обе пробы пластовой воды использовали для получения накопительных культур аэробных углеводородокисляющих бактерий. Из каждой культуры на основе ДНК и РНК было создано по 2 библиотеки. Всего было проанализировано 265 клонов.

Бактериальное сообщество пластовой воды из зоны нагнетательной скважины (проба 8 м3) оказалось более разнообразным по сравнению с сообществом воды из добывающей скважины 10173 (рис. 5). В ДНК-библиотеке генов 16S рРНК (проба 8 м3) доминировали филотипы мезофильных бактерий рода Pseudomonas (почти 50% исследованных клонов) и термофильных бактерий родов Tepidiphilus (26%) и Geobacillus (19%). Однако в РНК-библиотеке численно преобладали j последовательности бактерий родов Geobacillus (55% клонов) и Pseudomonas (32%), а последовательности представителей рода Tepidiphilus, несмотря на их высокую долю в ДНК-библиотеке, в РНК-библиотеке не обнаруживались. Минорные компоненты в ДНК-библиотеке включали гены 16S рРНК бактерий родов Acinetobacter, Gordonia, Carnobacteriwn и Caulobacter, а I в РНК-библиотеке — Thermoanaerobacterium, Lapillicoccus, Sphingomonas и Lactococcus.

В библиотеках, созданных на основе РНК и ДНК микроорганизмов пластовой воды из добывающей скважины, большинство составляли клонированные последовательности геобацилл (98.7% и 31.0% соответственно). Доля последовательностей бактерий рода Pseudomonas в ДНК-библиотеке составляла 1.3%, в РНК-библиотеке - 11.3%. Минорные компоненты сообщества были обнаружены только в РНК-библиотеке и включали последовательности бактерий родов Shigella, Gordonia, Leuconostoc, Williamsia и Methy/obacterium.

Разнообразие alkB генов в библиотеках клонов накопительных культур. Препараты ДНК и кДНК из обеих накопительных культур использовали в качестве матрицы для ПЦР с вырожденными праймерами для гена alkB. При использовании ДНК обеих культур синтез ПЦР-продуктов не наблюдали, наработка фрагментов гена alkB обнаружена только на матрице кДНК. Данный факт служил свидетельством того, что при росте культур 8мЗ и 1017-3 на углеводородах происходит заметная экспрессия гена alkB. В библиотеке клонов генов alkB культуры 8мЗ (41 клон) были обнаружены гомологи alkB-geo2 и alkB-geo4, в библиотеке культуры 1017-3 (51 клон) - гомологи alkB-geol и alkB-geo4. Сходство полученных последовательностей с аналогичными гомологами генов alkB составило 98-99%.

Выделение представителей родов Geobacillus и Pseudomonas из накопительных культур. Микробиологическими методами из культур выделены термофильные и мезофильные аэробные

А

Рисунок 5. Разнообразие генов 168 рРНК и 16Б крДНК в библиотеках клонов, полученных из тотальных ДНК и РНК накопительных культур углеводородокисляющих бактерий, выделенных из пластовой воды нагнетательной скважины (А) и из добывающей скважины (Б) нефтяного месторождения Даган.

бактерии, принадлежащих согласно анализу генов 16S рРНК и gyrB к видам Geobacillus stearothermophilus и Pseudomonas putida соответственно. Выделенные штаммы рода Pseudomonas росли на н-гексадекане в качестве единственного источника углерода и энергии при 30-37°С и не росли при 60°С. Однако амплификация с вырожденными праймерами к гену alkB дала отрицательный результат.

Хотя основными компонентами обеих накопительных культур являются геобациллы и псевдомонады, обнаружение транскриптов генов alkB и доминирование доли 16S рРНК бактерий рода Geobacillus указывает на геобацилл как наиболее вероятных функционально активных деструкторов углеводородов в изучаемом сообществе накопительных культур. Таким образом, изучение биоразнообразия микроорганизмов методом анализа генов 16S рРНК, полученных на основе ДНК микробного сообщества, позволяет обнаружить компоненты сообщества, вероятно, предпочтительно выявляемые использованными праймерами, тогда как наиболее достоверное представление о метаболически активных микроорганизмах дает изучение генов 16S рРНК, полученных на основе РНК микробного сообщества.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы проводятся интенсивные исследования экологии и биотехнологического потенциала бактерий рода Geobacillus. Выделен ряд новых видов геобацилл, способных образовывать термостабильные ферменты (рестриктазы, кнназы, дегидрогеназы, ДНК-полимеразы и др.). Показано широкое распространение геобацилл в высокотемпературных нефтяных пластах и образование ими поверхностно-активных метаболитов. В связи с высоким сходством генов 16S рРНК у представителей разных видов геобацилл имеется ряд проблем, связанных с идентификацией геобацилл. Показано использование геобациллами сырой нефти, ароматических углеводородов, в то же время гены, кодирующие алкан-монооксигеназу, ответственную за окисление н-алканов, оставались мало изученными. Настоящее исследование посвящено поиску генов, позволяющих прояснить вопросы таксономии геобацилл и их метаболической функции в микробном сообществе нефтяных пластов.

На примере термофильных бактерий рода Geobacillus выполнен анализ генов gyrB и рагЕ. К генам gyrB и рагЕ геобацилл были подобраны специфичные праймеры для проведения родоспецифической ПЦР и амплификации в режиме реального времени. Определена первичная структура гена ß-субъединицы гиразы {gyrB) и гена топоизомеразы IV (рагЕ) у 18 штаммов геобацилл. Показано, что филогенетический анализ последовательностей генов gyrB и рагЕ служит полезным дополнением к анализу гена 16S РНК и ДНК-ДНК гибридизации и позволяет установить таксономическое положение бактерий рода Geobacillus на видовом уровне, как в чистых культурах, так и составе микробного сообщества. На основе сравнительного филогенетического анализа

полученных последовательностей генов &гВ, рагЕ и 16Б рРНК у разных видов рода СеоЬасШиз показано попарное сходство & 1Негтоса1епи!а1и.<; - О. gargeпsis, (7. /ига.ш'си.$ - й. тепепж, б. Цшатсю — в. хгйсат, что свидетельствовало о необходимости уточнения таксономического статуса этих видов. Полученные в настоящей работе результаты обнаружения сходства генов ёугВ и рагЕ у ряда видов были использованы зарубежными исследователями (Соогеукз е1 а1., 2012) при выполнении последней ревизии рода СеоЪасШт.

У 11 штаммов геобацилл, использующих н-алканы, обнаружено восемь гомологов гена а1кВ ключевого фермента окисления н-алканов-алкан-монооксигеназы (ЫкВ^ео!, а!кВ^ео2, а1кВ^еоЗ, а1кВ-%ео4, а!кВ^ео5, а1кВ^ео6, а1кВ^ео7, а!кВ^ео8). Показано, что гены а!кВ у геобацилл локализованы на хромосомной ДНК. Гомолога гена а\кВ геобацилл не обладают видовой специфичностью. Последовательности а1кВ^ео1 и а1кВ^ео4 обнаружены у всех исследованных штаммов геобацилл, тогда как набор остальных гомологов варьирует у разных штаммов. В геноме б. ¡иЬ!еггапеиз К выявлены семь гомологов гена ЫкВ, за исключением а!кВ^ео8. Впервые для термофильных прокариот показано, что один штамм бактерий может содержать до семи гомологов гена алкан-гидроксилазы. Филогенетический анализ а!кВ генов геобацилл обнаружил их высокое сходство с ЫкВ генами родококков: совпадение по нуклеотидной и аминокислотной последовательности для некоторых гомологов составило 100%. Таким образом, гены а!кВ геобацилл не могут служить единственным молекулярным маркером для обнаружения и идентификации бактерий рода СеоЬасШиз в составе микробного сообщества.

При исследовании уровня мРНК гомологов гена ЫкВ у штамма & ьиЫеггапет К показано, что в деградации среднецепочечных и длинноцепочечных и-алканов принимают участие белковые продукты гомологов а!кВ^ео4, а!кВ^ео5 и ЫкВ^еоб. Гомологи а1кВ^ео5 и ЫкВ^еоб экспрессируются в клетке в экспоненциальной фазе при оптимальных условиях роста. Гомолог а1кВ^ео4 экспрессируется в стационарной фазе при недостатке ростовых субстратов.

Впервые методом анализа двух клонотек генов 165 рРНК и 16Э крДНК, созданных на основе тотальных ДНК и РНК микробного сообщества, определено геномное разнообразие микроорганизмов, и показано доминирование геобацилл в накопительных культурах термофильных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературных нефтяных пластов. Обнаружение среди клонированных последовательностей транскриптов ЫкВ, близких а1кВ^ео\, а1кВ^ео2 и ЫкВ-geo4 геобацилл, 16Э крДНК и генов 16Б рРНК бактерий рода СеоЬасШиз свидетельствует о присутствии и функциональной активности геобацилл в культурах термофильных углеводородокисляющих бактерий из нефтяных пластов.

выводы

1. Впервые на основании определения последовательностей генов Д-субъединицы гиразы и топоизомеразы IV (вугВ и рагЕ) и их филогенетического анализа у 15 штаммов бактерий рода йеоЬасШш показана возможность использования этих генов для уточнения таксономического положения геобацилл.

2. Определены фрагменты последовательностей гена аШВ у 11 штаммов бактерий рода йеоЪасШих, растущих на С1бНз4-С2>Н4бн-алканах, и выявлено 8 гомологов гена а!кВ, близких по нуклеотидной и аминокислотной последовательности алкан-гидроксилазам бактерий рода Ююйососсиз. Впервые у термофильных прокариот обнаружено, что в одном штамме может содержаться от трех до семи гомологов, из которых только два являются универсальными для исследованных штаммов геобацилл. Показана хромосомная локализация генов а!кВ в геноме штамма й. ьиЫеггапет К.

3. Разработаны праймеры для 8 гомологов гена а\кВ геобацилл, и определено разнообразие и функциональная роль ряда гомологов а!кВ у штамма С. ¡иЫеггапеив К. Показано, что при росте на н-алканах гены а1кВ^ео5 и а!кВ^еоб экспрессируются в клетке в экспоненциальной фазе роста, а ген а1кВ^ео4 - в стационарной фазе, что указывает на участие белковых продуктов этих генов в деградации н-алканов.

4. Впервые накопительные культуры углеводородокислящих бактерий из нефтяных пластов исследованы методом анализа библиотек клонов гена 165 рРНК и а!кВ, созданных на основе ДНК и РНК. Анализ библиотек клонов генов 16Б рРНК, созданных на основе РНК культур, дает более полное представление о метаболически активных микроорганизмах и свидетельствует о доминировании геобацилл в культурах аэробных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературных нефтяных пластов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи из перечня журналов, рекомендованных ВАК РФ:

1. Турова Т.П., Назина Т.Н., Михайлова Е.М., Родионова Т.А., Екимов А.Н., Машукова A.B.. Полтараус А.Б. Гомологи ЫкВ гена термофильных бактерий рода GeobaciUus II Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 2. С. 247-257.

2. Турова Т.П., Коршунова A.B.. Михайлова Е.М., Соколова Д.Ш., Полтараус А.Б., Назина Т.Н. Применение анализа сходства нуклеотидных последовательностей генов gyrB и рагЕ для дифференциации видов рода GeobaciUus II Микробиология. 2010. Т. 79. № 3. С. 376-389.

3. Шестакова Н.М., Коршунова A.B.. Михайлова Е.М., Соколова Д.Ш., Турова Т.П., Беляев С.С., Полтараус А.Б., Назина Т.Н. Сравнение библиотек клонов, полученных на основе ДНК и РНК из накопительных культур аэробных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературного нефтяного пласта//Микробиология. 2011. Т. 80. № 1. С. 63-73.

4. Коршунова A.B.. Турова Т.П., Шестакова Н.М., Михайлова Е.М., Полтараус А.Б., Назина Т.Н. Детекция и транскрипция генов биодеградации н-алканов (а!кВ) в геноме углеводородокисляющей бактерии GeobaciUus subterraneus штамм К // Микробиология. 2011. Т. 80. № 5. С. 669-678.

5. Назина Т.Н., Михайлова Е.М., Шестакова Н.М., Соколова Д.Ш., Ивойлов B.C., Коршунова A.B.. Турова Т.П., Полтараус А.Б., Беляев С.С., Иванов М.В. Биодеградация нефти и гены alkB аэробных термофильных бактерий из нефтяных пластов. Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН. Вып. 16. Термофильные микроорганизмы / Ин-т микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Отв. редактор В.Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 2011. С. 193-216.

Тезнсы докладов

1. Mikhailova Е.М., Shestakova N.M., Rodionova Т.A., Mashukova A.V.. Tourova T.P., Nazina T.N., Poltaraus A.B. Alkane hydroxylase homologues and its localization in thermophilic bacteria of the genus GeobaciUus. In Abstract Book: 7th Int. Symp. for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, November 16-21, 2008. P. 172.

2. Машукова A.B.. Турова Т.П., Михайлова Е.М., Алешин В.В., Назина Т.Н., Полтараус А.Б. Использование сравнительного анализа последовательностей гена gyrB для видовой идентификации бактерий рода GeobaciUus. Пятый Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Материалы Пятого Московского международного конгресса, часть 2 (Москва, 16-20 марта, 2009 г.). М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. С. 340-341.

3. Машукова (Коршунова) А.В.. Турова Т. П. Михайлова Е.М., Назина Т.Н., Полтараус А. Б. Гены биодеградации углеводородов у термофильных бактерий рода Geobacillus: строение и функции / Сборник тезисов Международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 13-16 апреля 2009. С. 164.

4. Shestakova N.M., Mikhailova Е.М., Mashukova A.V., Tourova T.P., Poltaraus А.В., Nazina T.N. Alkane hydroxylase genes in thermophilic bacteria of the genus Geobacillus and in enrichment cultures of hydrocarbon-oxidizing bacteria from a high-temperature petroleum reservoir. 2nd International Conference on Applied Microbiology and Molecular Biology in Oil Systems. ISMOS2 Abstract Book, 17-19lh June 2009, Aarhus, Denmark. P. 80.

5. Коршунова A.B.. E.M. Михайлова, H.M. Шестакова, Д.Ш. Соколова, Т.П. Турова, А.Б. Полтараус, Т.Н. Назина. Использование рибосомных и функциональных генов в исследовании микробных сообществ высокотемпературных нефтяных пластов. Актуальные аспекты современной микробиологии: V молодежная школа-конференция с международным участием. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Москва, 26-27 октября 2009 г.: Тезисы. - М.: МАКС Пресс, 2009. С. 86-87.

Автор выражает глубокую признательность научным руководителям д.б.н. Т.Н. Назиной и В.В. Алешину, к.б.н. А.Б. Полтараусу, д.б.н. Т.П. Туровой и к.б.н. Шестаковой за полезные советы и помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор приносит благодарность коллегам и друзьям за содействие и поддержку.

Заказ № 12-Р/08/2014 Подписано в печать 06.08.14 Тираж 50 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", г. Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел. (495)649-83-30 )} www.cfr.ru ; e-mail: :akpark@cfr.ru