Биоразнообразие нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных экосистем Северного Кавказа

Черноусова, Елена Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биоразнообразие нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных экосистем Северного Кавказа
ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Биоразнообразие нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных экосистем Северного Кавказа"

На правах рукописи

Черноусова Елена Юрьевна

БИОРАЗНООБРАЗИЕ НИТЧАТЫХ СЕРООКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

СУЛЬФИДНЫХ ЭКОСИСТЕМ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА: ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

03.02.08 - экология 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 КЮН 2011

Воронеж - 2011

4848831

Работа выполнена в Воронежском государственном университете и в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Грабович Маргарита Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Гапонов Сергей Петрович

доктор биологических наук, профессор Наумова Елена Сергеевна

Ведущая организация: Институт микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится «14» июня 2011 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.05 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан «13» мая 2011г.

Ученый секретарь диссертационного сов^алГ"Л кандидат биологических наук, доцент N¿-^«-1 Барабаш Г.И.

Актуальность проблемы.

Важным объектом экологии микроорганизмов являются микробные сообщества, представляющие особый интерес в связи с их значимой функциональной ролью в глобальном цикле превращения элементов в биосфере.

Экологические ниши бесцветных серобактерий располагаются, как правило, в зоне контакта сероводорода и кислорода в водоемах разного типа - пресных, морских, в районах океанических гидротерм и вулканической активности, минеральных сульфидных источниках, а также в антропогенных экосистемах. Их массовое развитие сопровождается формированием мощных обрастаний или плотных бентосных сообществ - серных матов, покрывающих иногда огромные площади поверхности донных отложений. Для подобных сообществ характерно, как правило, доминирование одного - двух представителей нитчатых или одноклеточных серобактерий.

Значительный прогресс в исследованиях состава бесцветных серобактерий, особенно в морских глубоководных местообитаниях, был достигнут за последние десятилетия благодаря применению молекулярно-генетических методов анализа микробных сообществ. Это позволило значительно расширить представления о таксономическом составе и эволюционных позициях представителей этой группы бактерий.

Таксономическая характеристика микробных сообществ с участием нитчатых бесцветных серобактерий может осуществляться непосредственно в природных образцах (ш situ идентификация) на родовом и видовом уровнях на основе анализа филогенетических маркеров, в первую очередь - генов 16S рРНК. Идентификация организмов на видовом и внутривидовом уровнях в большинстве случаев по-прежнему осуществляется на изолированных культурах (ex situ идентификация). Параллельная оценка разнообразия микробного сообщества in situ и ex situ все еще проводится редко из-за проблем, связанных с трудностью культивирования организмов и ограниченностью прямых модекулярно-биологических и генетических методов оценки разнообразия, что не позволяет расшифровать структуру микробного сообщества в целом и оценить его биогеохимическую деятельность.

Настоящая работа посвящена комплексному экологическому и генетико-таксономическому исследованию биоразнообразия нитчатых сероокисляющих бактерий, формирующих мощные обрастания в низкотемпературных и умеренно термальных пресноводных сульфидных экосистемах Северного Кавказа. Необходимость исследования продиктована широким распространением сообществ бесцветных нитчатых серобактерий в пресноводных сульфидных системах, где они характеризуются высокой продуктивностью и являются эффективным биогеохимическим фильтром в превращении соединений углерода, серы и азота. Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было проведение комплексного эколого-генетического (in situ и ex situ) анализа микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий

из умеренно термальных и низкотемпературных сульфидных источников и озер различных географических регионов Северного Кавказа.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав, численность и структуру микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий, обнаруженных в 20042007 гг. в сульфидных источниках и озерах.

2. Оценить генетический полиморфизм доминирующих в составе микробных сообществ организмов на внутривидовом уровне.

3. Выявить закономерности сукцессионных процессов микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в зависимости от экологических условий среды.

4. Выделить чистые культуры бесцветных серобактерий из микробных сообществ и определить их таксономическое положение на основе полифазного анализа с применением филогенетических маркеров.

Научная новизна и значимость работы.

Впервые проведено экологическое и генетико-таксономическое изучение микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в умеренно термальных и низкотемпературных сульфидных экосистемах различных регионов Северного Кавказа.

Комплексный подход (in situ и ex situ) к исследованию сообществ микроорганизмов, включающий наряду с молекулярно-генетическими методами и детальный микробиологический анализ, позволил показать картину таксономического и физиологического разнообразия микробного сообщества типа «ThiothrixSphaerotilus». Хотя массовое развитие представителей родов Thiothrix и Sphaerotilus в составе бактериальных сообществ характерно для антропогенных экосистем, стабильные сообщества этих бактерий в составе формируемых ими серных «тяжей» в природных сульфидных источниках обнаружены впервые.

С помощью амплификации фрагментов генов 16S рРНК из суммарной ДНК природного образца, их клонирования с последующим скринингом библиотеки клонов методами ПЦР, рестрикционного анализа (RFLP) и секвенирования проведен мониторинг биологического разнообразия микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий умеренно термальных сульфидных источников Краснодарского края и впервые выявлены структурные изменения микробного сообщества «ThiothrixSphaerotilus» в зависимости от концентрации сульфида в водах источников.

С помощью метода T-RFLP выявлена зависимость разнообразия видового состава микробных сообществ «Thiothrix» умеренно термального источника Ставропольского края и низкотемпературного озера Кабардино-Балкарии от экологических условий - температуры и уровня трофности водоемов.

Сравнение двух методов молекулярной биологии и генетики для анализа бактериальных сообществ нитчатых серобактерий показало, что метод T-RFLP позволяет выявлять только доминирующие компоненты, тогда как технология молекулярного клонирования обнаруживает и минорные компоненты микробных природных сообществ.

Впервые показано участие представителей родов Sphaerotilus и Azospirillum в качестве компонентов микробных сообществ в природных сульфидных экосистемах. Многочисленные изоляты рода Sphaerotilus традиционно относили к группе органогетеротрофных железобактерий, а известные представители рода Azospirillum -к ризобактериям, живущим на поверхности корневой системы растений и фиксирующим азот воздуха.

На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, белок-кодирующих генов - hspóO и gyrB, результата анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств описаны новые виды семейства Thiotrichaceae - Thiothrix caldifontis sp. nov. и Thioíhrix lacustris sp. nov.

Исследования микробных сообществ в природных сульфидных экосистемах Северо-Кавказского региона позволили существенно расширить знания об экологии и биологии нитчатых сероокисляющих бактерий, в частности, их филогенетическом и фенотипическом разнообразии, физиологии и генотипических характеристиках.

Практическая значимость.

Научные положения диссертационной работы являются необходимой базой для дальнейших исследований филогенетического и фенотипического разнообразия нитчатых сероокисляющих бактерий, населяющих умеренно термальные и низкотемпературные сульфидные пресноводные системы.

Апробированные подходы к анализу микробных сообществ могут быть использованы при микробиологическом мониторинге разнообразных водных экосистем природного и антропогенного происхождения.

Полученная коллекция культур расширяет наши представления о микроорганизмах, задействованных в процессах окисления соединений серы, и может использоваться в биотехнологических исследованиях для очистки водных экосистем от токсичных серных соединений.

Материалы диссертационной работы используются в фундаментальных исследованиях по эволюции и таксономии бактерий, в учебном процессе при чтении лекций по экологии и микробиологии.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на международных и российских конференциях:

1. Международной молодежной школе - конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005).

2. Международной молодежной школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006).

3. 2"dFEMS congress of European microbiologists (Spain, 2006).

4. 2-ой Международный байкальский симпозиум по микробиологии (Иркутск, 2007)

5. 3ndFEMS congress of European microbiologists (Sweden, 2009). Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 11 печатных работах: 6 экспериментальных статей и 5 тезисов. Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 153 страницах, включает 15 таблиц. 23 рисунка, список литературы из 222 наименований, из них 38 на русском и 184 на английском языке. Место проведения работы и благодарности.

Работа была выполнена на кафедре биохимии и физиологии клетки Воронежского государственного университета под руководством д.б.н. Грабович М.Ю. Молекулярно-генетические исследования проводились во время стажировок в рамках грантов РФФИ в лаборатории Всероссийской коллекции микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Скрябина РАН (г. Пущино) под руководством к.б.н. Акимова В.Н. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Лысенко A.M., д.б.н. Осипову Г.А., к.б.н. Кравченко И.К., д.б.н. Сорокину Д.Ю. и аспирантке Белоусовой Е.В. за помощь на отдельных этапах работы. Автор выражает особую благодарность научному руководителю д.б.н. Грабович М.Ю., к.б.н. Акимову В.Н. и д.б.н. Дубининой Г.А. за внимание и помощь в формулировании положений диссертации, полезные советы и поддержку на всех этапах работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Материалом для проведения молекулярно-генетических анализов и выделения культур бесцветных серобактерий служили микробные сообщества, формируемые в виде обрастаний нитчатых сероокисляющих бактерий, обнаруженные в минеральных сероводородных источниках и озерах Северного Кавказа. Образцы микробных сообществ были отобраны в августе 2004, августе 2006 и августе 2007 года. Образцы микробных сообществ для молекулярных исследований сразу после отбора были помещены в 30 % раствор этанола и хранились во льду. Состав питательных сред. Для выделения и культивирования, изучения физиолого-биохимических и культуральных свойств бактерий рода Thiothrix использовали среду Армбрустера (Кузнецов, Дубинина, 1989). Перед посевом в среду вносили набор витаминов и микроэлементов (Pfennig, Lippert, 1966), рН среды перед посевом доводили до 7.5-7.8. В среду выделения перед посевом вносили лактат натрия - 100-

500 мг/л, тиосульфат натрия - 1 г/л. Твердая среда для изоляции колоний имела тот же состав с добавлением агара 15 г/л.

Изучение фенотипическиу, хемотзк-соиомических свойств чистых культур бесцветных серобактерий проводили с помощью стандартных методов, используемых в микробиологической практике.

Анализ неорганических соединений серы. Сероводород определяли колориметрически с использованием диметил-п-фенилендиамина. Раздельное определение S2O32', S4062", S3062" при их совместном присутствии в среде проводили методом раздельного йодометрического титрования (Резников и др., 1970). Содержание S042" определяли хлоранилатным методом (Уильяме, 1982). Элементную серу определяли по методу Морриса (Morris et al, 1948) колориметрически на СФ-26.

Метод аиетилен-редукцин. Способность бактерий к азотфиксации проверяли ацетиленовым методом (Stewart et al., 1968).

Выделение и очистка хромосомной ДНК. Для экстракции ДНК из сообществ и чистых культур бесцветных серобактерий использовали модификацию метода (Ausubel et al., 1994) с дополнительными этапами быстро чередующихся циклов замораживания и оттаивания (Bej et al., 1991).

Полимеразная цепная реакпия ГПЦР). Амплификация генов 16S рРНК, hspóO (60 kDa субъединица шаперонина I типа), gyrB (АТФазный домен ДНК-гнразы) и ntfH (Fe-белок нитрогеназы) была проведена на приборе GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США).

Очистка ИЦР-пиодуктов проводили при помощи ферментов экзонуклеазы I Е. coli («Fermentas», Литва) и креветочной щелочной фосфатазы («Promega», США). В случае клонирования, T-RFLP-анализа и неспецифичной наработки ПЦР-продуктов для очистки ДНК использовали специальный набор реактивов Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System («Promega», США) согласно инструкциям фирмы-изготовителя. Клонирование генов 16S рРНК. АмплиФишюованные фрагменты генов 16S рРНК клонировали в векторе pGEM-T по методике и с использованием набора реактивов pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems («Promega», США).

Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК. hspóO и evrB

проводили на автоматическом сехвенаторе CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США) в соответствии с протоколом, предлагаемым фирмой.

Филогенетический анализ. Для нахождения близкородственных организмов нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК, hspóO и gyrB сравнивали с последовательностями известных штаммов в базе данных NCBI. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы CLUSTAL X (Thompson et al., 1997). Филогенетические деревья были построены с помощью программы TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994). RAPD-ПЦР. Геномные RAPD-фингепринты были получены с использованием праймера М13 по методу (Moissenet et al., 2003). Уровень генетического

сходства/различия штаммов по данным ПЦР-фингерпринтов рассчитывали с использованием коэффициента Нея-JIn (Nei, Li, 1979), реализованного в пакете программы FreeTree 0.9.1.50 (Hampl et al., 2001).

Определение Г+Ц в ДНК и ДНК-ДНК гибридизация. Содержание Г+Ц в ДНК определяли по кривым термической денатурации на спектрофотометре «Руе Unicum SP 1800» и рассчитывали по формуле Оуэна (Owen, Lapage, 1976), реассоциацию ДНК-ДНК изучали методом оптической реассоциации (De Ley et al., 1970). T-RFLP-анализ проводили на секвенаторе CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США). Принадлежность T-RFLP-фрагментов в сообществах к определенной филогенетической группе определяли по длине соответствующих концевых рестрикциошшх фрагментов генов 16S рРНК культур и клонов, обнаруженных в составе этих сообществ. Дополнительную расшифровку T-RFLP-фрагментов осуществляли в базе данных Micalll (Shuy et al., 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В течение нескольких лет нами проводились эколого-генетические исследования биоразнообразия микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в умеренно термальных и низкотемпературных сульфидных источниках и озерах различных географических регионов Северного Кавказа. Характеристика источников и озер, использованных в настоящем исследовании, представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика источников и озер

Источник и озеро Параметры

Т(°С) РН H2S (мг/л)

«Бесстыжие ванны», 2007, Ставропольский край 30 7.8 3.8

«Кабардинский», 2007, Ставропольский край 30-35 7.5 3.77

«Петушок», 2004/2006, Краснодарский край 40 7.5/7.8 2-5/10-14£

«Ручей», 2004/2006, Краснодарский край 40 7.5 10-12

«Яма», 2004, Краснодарский край 40 7.5 1.5-2

Озеро «Провал» 2007, Ставропольский край 33 7.3-7.5 6.43

«Нижнее» озеро, 2007, Кабардино-Балкария 9.3 7.5 3.06

Примечание:

£- содержание сульфида в различные годы колебалось от 2-5 (2004 г.) до 10-14 мг/л (2006 г.), что, вероятно, связано с

концентрированием его в результате уменьшения дебета

свободноистекаклцей минеральной воды из скважины и степенью разбавления подземными водами.

1. In situ анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных пресноводных экосистем Северного Кавказа

In situ анализ биоразнообразия микробных сообществ из сульфидных биотопов различных регионов Северного Кавказа проводили по схеме, представленной на рис. 1.

11рнролный образец (Микробное сообщество)

Суммарный препарат ДНК

ПЦР

Суммарная фракция генов I6S рРНК

Клонирование

Отдельные тени гены 16S рРНК

Рестрикция

T-RFLP анализ

Интерпретация T-RFLP-фрагментов в базах данных

Рис. 1. Схема проведения т л/ги анализа микробных сообществ нитчатых серобактерий Северного Кавказа.

Секвенирование н определение филогенетического положения

1.1. Оценка разнообразия микробных сообществ сульфидных источников Краснодарского края методом клонирования генов 16S рРНК

Для генетнко-таксономической характеристики микробных сообществ сульфидных источников Псекупского месторождения минеральных вод Краснодарского края из суммарной ДНК были получены клоновые библиотеки. Скрининг клоновой библиотеки ПЦР-продуктов генов 16S рРНК из бактериальных сообществ различных источников показал доминирование двух групп клонов. Первая группа близка к Thiothrix unzii (от 66 до 100 % от общего числа), а вторая к Sphaerotilus natans (от 26 до 45 %). Минорные компоненты (от 5 до 8 %) представлены филотипами из филогенетических групп Proteobacteria, Chlorobi, Cyanobacteria, Clostridia и Bacteroidetes (табл. 2).

Одновременное присутствие представителей родов Thiothrix и Sphaerotilus в составе микробных сообществ «Thiothrix-Sphaerotilus» характерно главным образом для активированных илов очистных сооружений, поверхностных пресных вод, сильно загрязненных стоками сельскохозяйственного производства. Нами впервые было показано участие представителей этих групп нитчатых бактерий в качестве основных структурообразующих сероокисляющих компонентов в составе микробных сообществ «Thiothrix-Sphaerotilus» в природных сульфидных источниках. Следует упомянуть, что многочисленные изоляты рода Sphaerotilus известны как компоненты

природных железосодержащих экосистем (болот, железистых ручьев и т.д.) и традиционно рассматривались в группе органогетеротрофных железобактерий.

Таблица 2. Филотипы, обнаруженные в клоповых библиотеках микробных сообществ источников Северного Кавказа.

Филотип Число клонов Ближайший таксон (% по 16Э рРНК сходства) Филум или класс

источник «Петушок» (2004)

СК1 1 Аас}атмоЬас1ег кус1го^епо(огтап.ч (95 %) Clostridia

СК2 1 СМогоЫит 1Шсо!а (97 %) Chlorobi

СКЗ 1 Ро!апЬас1сг с1окс1опет1$ (95 %) Bacteroidetes

СК4 1 СуапоЬас1епа (93 %) Cyanobacteria

СК5 1 ЛкойоЪааег сарзи/ашя (97.6 %) Alphaproteobacteria

СК6 1 ВиМоЫегш (ипкогит (100 %) Betaproteobacteria

СК7 1 АИосИготаИит \inosum (97 %) Gammaproteobacteria

СК8 25 5'ркаегоШш Шат (99.8 %) Betaproteobacteria

СК9 63 ШоШх ими (99 %) Gammaproteobacteria

источник «Яма» (2004)

СК8 9 ЗрИаегоШш пшат (99.8 %) Betaproteobacteria

СК9 10 ТЫоЛга ипш (99 %) Gammaproteobacteria

СК2 1 СМогоЫит 1Ысо1а (97 %) Chlorobi

источник «Ручей» (2004)

СК9 19 ТЪШЬпх итп (99 %) Gammaproteobacteria

СК10 1 некультивируемая Оаттарго1еоЬас1епа (99 %) Gammaproteobacteria

источник «Петушок» (2006)

СК9 19 ТИЫНпх ити (99 %) Gammaproteobacteria

СК11 1 некультивируема ВеШрШеоЬааепа (99 %) Betaproteobacteria

источник «Ручей» (2006)

СК9 | 20 ТЫоЛгис ипги (99 %) Gammaproteobacteria

1.2. Определение видового состава микробных сообществ методом Т-МЪР

Мы применили метод Т-ЮТЛ* для анализа видового состава бактериальных сообществ из трех сульфидных пресноводных экосистем Северного Кавказа. Микробное сообщество «Петушок» из умеренно термального источника Краснодарского края, изученное нами с помощью технологии молекулярного клонирования генов 16в рРНК, было выбрано в качестве модельного объекта. Это позволило оценить в сравнительном аспекте возможности применения метода Т-И^ЬР для определения структуры, численности и таксономического состава изучаемого сообщества, не оставив без внимания ряд технических и методических проблем метода.

1.2.1. Т-ШЪР анализ модельного микробного сообщества

Для проведения Т-НРЬР анализа фрагментов генов 16Э рРНК из ДНК модельного образца - сообщество «Петушок» - были выбраны эндонуклеазы с четырех нуклеотидным сайтом рестрикции.

Т. unzii

188 п.н,

S. nutans

1198 D.K.

И л.я. [ЗОЗп.и. 349 i.e. Ц/-,---*-г

100 90 SO 70 60 50 40 30 20 10 О

Sph.nat

Th.uru.

Sph.iwt. (198)

Th. UIB. (188)

Sph.nat, (210]

Th.uru. (72)

Клоновая библиотека Hha 1

Hae III

Рис. 2. T-RFLP-электрофореграмма рестриктов генов 16S pPHK бактерий из сообщества «Петушок», полученная с помощью эндонуклеазы Hha I (А), и их относительная частота встречаемости в исследуемых биотопах (Б).

Примечание: А - ось х - длины фрагментов, выраженные в количестве пар нуклеотидов; ось у -относительная интенсивность флуоресценции. Фрагменты длиной 89. 203 и 349 п.н с относительной высотой пика поглощения ниже предела достоверности (2 %) являлись ложными и были исключены из анализа. Б - ось у - относительная частота встречаемости бактериальных групп, выраженная в процентах (%). В скобках отмечены длины T-RFLP-фрагментов, выраженные в количестве пар нуклеотидов (п.н ). Hha 1 и Нае III - эндонуклеазы рестрикции, используемые в T-RFLP анализе. Mk - минорный компонент; Sph.nat. - Sphaerotilus natans., Th.unz. - Thiothrix unzii

В образце микробного сообщества из источника «Петушок» были обнаружены два основных фрагмента, длины которых соответствовали культурам/клонам Sphaerotilus natans и Thiothrix unzii (рис. 2А) (раздел 1.1). Относительное количество Sphaerotilus natans и Thiothrix unzii составило 31 и 69 % (Hha Г), и 28 и 72 % (Нае III), соответственно (рис. 2Б). Доминирование в сообществе организмов Sphaerotilus natans и Thiothrix unzii в количестве 26 и 66 % было выявлено ранее с помощью технологии молекулярного клонирования. Семь минорных компонентов, представленных в клоновой библиотеке исследуемого сообщества Краснодарского края в количестве примерно 1 % каждый, обнаружить с помощью T-RFLP анализа не удалось.

1.2.2. T-RFLP анализ микробных сообществ сероводородных биотопов Ставропольского края и Кабардино-Балкарии

Для проведения T-RFLP анализа генов 16S рРНК из ДНК микробных сообществ были выбраны рестриктазы Hha I и Нае III. В образце микробного сообщества из умеренно термального источника «Кабардинский» были обнаружены три основных фрагмента, длины которых соответствовали видам Т. caldifontis sp. nov.. Chlorobium sp. и некультивируемым Betaproteobacteria, а их относительное

количество составило 68, 18 и 14 % (Hha Г) и 73, 16 и 11 % (Нае III), соответственно. В образце T-RFLP ампликонов сообщества из низкотемпературного озера «Нижнее» были обнаружены только фрагменты, длины которых соответствовали культуре Т. lacustris sp. nov. (табл. 3).

Таблица 3. Структура сообществ, выявленная методом T-RFLP

Примечание:

* - фрагменты с относительной высотой пика поглощения ниже предела достоверности (2 %) (ложные)

исключаются из анализа.

Сообщество T-RFLP -фрагменты (п.н.) Филогенетическая группа

Hha I Нае III

«Кабардинский», 173 266 Thiothrix caldifontis

Ставропольский край 90 249 Chlorobium sp.

206 199 Betaproteobacteria

83* 91* -

120* -

«Нижнее» озеро, 173 229 Thiothrix lacustris

Кабардино-Балкария 68* 220* -

110* 430* -

252* -

350* -

При определении видовой принадлежности полученных Т-КРЬР фрагментов из ДНК анализируемых микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий мы выявили ряд преимуществ и недостатков метода Т-КРЬР. Метод Т-КРЬР является быстрым и удобным методом мониторинга структурообразующих компонентов природных сообществ нитчатых серобактерий. Сложности в определении видовой принадлежности связаны, прежде всего, с информационной ограниченностью существующих в настоящее время баз данных. Другой причиной является тот факт, что разные организмы могут образовывать Т-Щ^Р фрагменты одинаковой длины, поэтому необходимо проводить несколько серий рестрикции с использованием нескольких эндонуклеаз.

1.3. Влияние экологических условий среды обитания на видовой состав микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий

1.3.1. Влияние концентрации сульфида

В течение ряда лет с помощью молекулярно-генетических методов нами проводился мониторинг микробных сообществ в умеренно термальных сульфидных источниках Краснодарского края Северного Кавказа. Анализ клоновых библиотек ПЦР-продуктов генов 168 рРНК из бактериальных сообществ показал доминирование филотипов ТЫоЛги ер. и 5'рИаегоШш эр. в одних сообществах и доминирование только филотипа ТЫоЛпх ер. в других. Подобное изменение доминирующих компонентов в сообществах, по-видимому, было связано с изменением экологических условий среды. С увеличением концентрации сульфида в

воде источников с 1.5 до 14 мг/л происходила смена доминирующих форм нитчатых сероокисляющих бактерий (рис. 3). Высокое содержание сульфида в источниках исключает массовое развитие БрИавгоШиБ в составе сообщества «ТЫоЖт-БркаегоШш» и создает условия для доминирования ТЫоЛгих.

S/S^MT/ji)

■ филотип ШшЬпх sp.

■ фЯЛОТЯЯ \р1<легиИи\ тр. чшмртыс фя.шткмм

tSI9

аI-а чг

Рис. 3. Влияние концентрации сульфида на распределение доминирующих филотипов Шо1Иг1х эр. и 5/7/7яего/;7ги ер. в бактериальных сообществах из термальных сульфидных источников. Примечание: А - источник «Петушок»; Б - источник «Яма»; В - источник «Ручей».

1.3.2. Влияние температуры и уровня трофности водоемов

С использованием метода Т-КРЬР было показано - от экологических факторов среды зависит разнообразие видового состава микробных сообществ «ШоЛпх» Ставропольского края и Кабардино-Балкарии. С возрастанием температуры и уровня трофности водоемов происходило смещение бактериального разнообразия в сторону увеличения видовой представительности бактериальных организмов в сообществах (табл. 4).

Таблица 4. Влияние экологических факторов на разнообразие микробных сообществ.

Место T-RFLP фрагменты* T(°C) H2S Тип водоема

«Нижнее» озеро Thiothrix lacustris 9.3 3.06 Олиготрофный

«Кабардинский» Thiothrix caldifontis (68 %) Chlorobinm sp. (18 %) Betaproteobacteria (14 %) 30-35 3.77 Мезотрофный

¥ - T-RFLP фрагменты получены с помощью эндонуклеазы Hha I.

2. Ex situ анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий пресноводных сульфидных систем Северного Кавказа

Для анализа генетического полиморфизма и идентификации чистых культур были использованы штаммы, выделенные из исследуемых микробных сообществ

Северного Кавказа. Ex situ анализ сообществ проводили по схеме, представленной на рис. 4.

Природный образец (Микробное сообщество)

ДНК чистой культуры

Идентификация выделенных культур /■ Ген I6S рРНК, бслок-кодирующис гены у H.sp60 и GyrB'

/ \

Оценка внутривидового генетического полиморфизма выделенных культур

ДНК-типирование: j RAPD-ПЦР I

Рис. 4. Схема проведения ех situ анализа микробных сообществ

Примечание: ¥ - белок-кодирующие гены были использованы для

филогенетического анализа выделенных из микробных сообществ культур

Thiothrix (раздел 3).

| ДНК-ДНК I гибридизация f

Секвенирование и определение филогенетического положения

2.1. Анализ внутривидового генетического полиморфизма нитчатых сероокисляющих бактерий

Представители рода Т/иоМгЬс. Семь чистых культур нитчатых серобактерий (Т4. Т19. 01. 02, К2. Р. ВЬ) были отнесены на основании своеобразной морфологии и сложного цикла развития к роду ТИю1кг1х.

Штаммы Пю1кг1х эр. Т4 и ТИ'югкпх эр. Т19 (источник «Петушок») имели 99 % сходства нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК с типовым штаммом ТЫо1кг1х ипги. До настоящего времени был известен только один случай обнаружения природных изолятов Т. игаИ в сульфидных источниках США (В1^топ е/ а!.. 2003). Наши исследования расширяют географию этого вида в природных пресноводных сульфидных экосистемах.

Следует отметить, что 16Б рРНК клоны, представляющие в библиотеках сообществ «Петушок», «Ручей» и «Яма» филотип ТЫоЛт ер., также имели 99 % сходства по 168 рРНК с типовым штаммом ИгШИг'а ипги. Однако между клонами и двумя выделенными штаммами ТЫо1кпх эр., а также между самими штаммами, имелись 1-3 нуклеотидные замены на фрагментах генов 16Б рРНК длиной примерно 500 нуклеотидов. Наблюдаемая вариабельность нуклеотидных позиций свидетельствовала о генетическом полиморфизме по гену 16Б рРНК организмов вида ТЫоЛг'а ипги как в составе одного сообщества, так и в составе микробиологических сообществ из различных источников.

Другие изоляты Г/г/о/йга в дальнейшем были описаны и узаконены нами в качестве новых видов Т. са1сИ/опИ$ эр. поу.: штаммы С1, 02 (источник «Петушок»), Р (озеро «Провал»), К.2 (источник «Кабардинский») и Т. ¡асиз^'и эр. поу. штамм ВЬ

(«Нижнее» озеро). Детальная характеристика штаммов, представляющих неизвестные ранее виды рода ТЫоЖгЬс, приведена в разделе 3.

В результате проведения ЛАРБ-ПЦР для всех штаммов Т. са1сИ/опШ были получены профили, которые различались числом и размером ПНР-фрагментов, что указывало на внутривидовой генетический полиморфизм организмов Т. саЬИ/опйя в микробных сообществах различных сульфидных источников и озер Северного Кавказа (рис. 5). Уровень генетического различия, рассчитанный с помощью коэффициента Нея и Ли (Кек и, 1979), между штаммами Т. сЫсИ/опИэ составил не более 25 %.

Рис. 5. Электрофоретический анализ RAPD-ПЦР продуктов, полученных из ДНК штаммов Т. caldifontis (А) и S. nutans (Б). Примечание: А: дорожка 1 - К2; 2-Gl:3 - Р; 4 - G2; 5 - маркер длины фрагментов ДНК. В: Дорожки: 1, D-501; 2, D-502; 3, D-503; 4, D-504; 5, D-505; 6. D-506; 7, D-507; 8, BV-1; 9, BV-2; 10. маркер длины фрагментов ДНК.

Представители рода Sphaerotilus. Высокий уровень сходства по 16S рРНК между выделенными культурами Sphaerotilus и типовым штаммом вида S. natans (99.8 % сходства) позволил отнести их к данному виду. В отличие от известных штаммов рода Sphaerotilus, новые штаммы из микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий Северного Кавказа оказались способны к использованию восстановленных соединений серы в энергетическом метаболизме (Гриднева и др., 2009).

Как видно из приведенных RAPD-профилей (рис. 5), ряд штаммов Sphaerotilus на основе этих результатов не отличались друг от друга. Выявленные в составе сообщества из источника «Петушок» штаммы D-501, D-502, D-503, D-504, D-505, D-506 и D-507 имели идентичные профили. Аналогичная картина наблюдалась для штаммов BV-1 и BV-2 из микробного сообщества источника «Бесстыжие ванны». При этом ПЦР-фингепринты штаммов Sphaerotilus из разных источников несколько отличались друг от друга, указывая на генетический полиморфизм вида S. natans в сульфидных источниках. Уровень генетического различия между штаммами S. natans, рассчитанный с помощью коэффициента Нея и Ли, составил 26 %. 2.2. Идентификация одноклеточных сероокисляющих бактерий

Среди одноклеточных изолятов сероокисляющих бактерий были генетически идентифицированы представители видов Pseudomonas stützen (100 % сходства по 16S рРНК) и Aquaspirillum serpens (98 % сходства по 16S рРНК). Штамм BV-S оказался близок филогенетически к роду ассоциативных азотфиксирующих микроорганизмов

1234 М 1 2 3 4 5 6 78 9М

AzospiriUum и имел 97.7 % сходства генов 16S рРНК с видом A. doebereinerae. Штамм BV-S является первым, полученным в чистой культуре сероокисляющим представителем рода AzospiriUum - A, thiophilum sp. nov. (Лавриненко и др., 2009), приспособленным к существованию в составе микробного сообщества в сероводородных биотопах.

Разнообразие таксономических групп, обнаруженное in situ и ex situ в микробных сообществах нитчатых серобактерий сульфидных экосистем Северного Кавказа, представлено на рис. 6.

Thiothrixs р. Т1У Thiolhrix sp. Т4 филотип ска

rhtolhm-hhz« ajt Th'mthrix Iискs/ris BLT

Thtothnx /'ritctosivorans Q Thiolhrix caldifnnlis GlT Thiolhrix nivea JP2T

■lllochromaiium reimkae JA 136T филотип CK7 Allocliromafiiim vitiosiim DSM 180T

1— Alio

филотип CK1Q

' Hcfrt'.itrtiBK|)yeMast gamma protoobacterium clonc V/M10(11 — Pseudomonas aeruginosa DSM 5007 ]T 100 , Pseudomonas sp. BV-cl

I Pseudomonas sUiKm CCUG 112567

100 -Aqitaspirilbtm serpens IAM 1 ,i')44T

AquaspiriUunt sp. Spli

10O

Ш.-ЮТИП CK 5 - Rhu Jabach-r

филотин С Кб Burkholderia Jrtiigoriiin 1.МП 16225T г Sphacrotiius, sp. BV-1

-Г Sfhaerolilus sp. 501/филоТИ1Ц CK8

1 Sphaerolilus пalaiu DSM 6575 Ahcvchphilus demtnficans К 601У Aadovorat caeni R-246081

1cкультивируемая beta protcobactcrmm clone OI'I'B 1У1 филотин CKíl

íe культи виру с мая be la proleobactcnum clone OPPR048

: ар su latus А ТС С II166

I- AzospiriUum doebereinerae 6.'fT

-^ji- AzospiriUum picis IMMIB TAR-3T

AzospiriUum sp. BV-S

__I t)D -- филотип CK 1

I Acidaminobacier Itydrogeiw/ormaiis gii -Closiridiuin herbivorous 54408

- филОТКП CK 4 -{"von obuciегш т ip OS 1

100

i— филотин CK 2 ' CMorobtum it nuco la DSM 245 Ciilorobiuiii vibrioforme DSM 260T — Chlorobium ¡uleo 1чni DSM 27 З1

- филотип CK 3

- Po ¡art bade г dokdonensis DSW-5T

Halegenlibacier salegens DSM 5424T

КЮ

GHhsia linmaea R-8282T Gill/sie hknuvivida 1C154

Рис. 6. Филогенетическое дерево, сконструированное на основе анализа генов 16S рРНК, показывает положение клонов и культур, полученных из микробных сообществ различных регионов Северного Кавказа, в составе домена Bacteria. Масштаб соответствует двум нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. В качестве внешней группы использована последовательность Rubrobacter xylanophiíus DSM 9941т.

3. Характеристика новых таксонов бесцветных нитчатых серобактерий

В настоящей работе приведены сравнительные исследования и описания пяти новых штаммов рода ТЫоЛгЬс, выделенных из микробных сообществ нитчатых

сероокисляющих бактерий, на основании принципов полифазной таксономии, включающей изучение комплекса молекулярно-генетических, хемотаксономических и фенотипических характеристик.

Для первичной оценки генетического полиморфизма новых штаммов ТкШЬлх был использован метод 11АР1)-ПЦР (рис. 7).

Рис. 7. Электрофорез продуктов КАРВ-ПЦР геномной ДНК штаммов ТЫоЛпх, полученных с использованием праймера М13. Примечание: различия ПЦР-фингерпринтов между штаммами 011, 02, К2 и Р сводились к минорным ПЦР-фрагментам, тогда как по характеру ПЦР-фингерпринтов эта группа штаммов существенно отличалась от штамма ВЬТ. Генетический полиморфизм штаммов й1т, 02, К2 и Р мы рассматривали в разделе 2.1, в этом разделе мы приводим профиль только типового штамма 01т. Дорожка: 1, ВЬТ; 2, 01т; 3, маркер длины фрагментов ДНК.

Штамм ВЬ' имел сравнительно низкое значение генетического сходства (около 20 %) с другими новыми штаммами ТЪШИгЬс. Напротив, высокий уровень сходства (выше 75 %) был обнаружен между штаммами С1т, 02, Р1 и К2 (раздел 2.1). 3.1. Морфологические и физиолого-биохимические свойства

Новые штаммы ТкюЛш обладали сходными морфологическими признаками. Трихомы изолятов состояли из цепочек клеток и имели четко выраженный слизистый чехол полисахаридной природы (рис. 8). Морфологические и физиологические характеристики новых штаммов ТЫоЛт представлены в таблице 5. У штаммов доминируют С16:|Ш7, С|6:0, С18:1Ш7 жирные КИСЛОТЫ. З-Гидрокси жирные КИСЛОТЫ С¡0:0 3-ОН и 1Яо-С|5;оЗ-ОН обнаружены только у штамма С1т.

Рис. 8. Микрофотографии штаммов BL1 and G1T. Примечание: а, с - штамм BL1; b, d - штамм G1T: а - розетки с серными глобулами; b - спирально изогнутые нити; с - полисахаридный чехол вокруг клеток; d - булавовидные короткие нити с утолщением на одном конце; а - масштаб 10 мкм; Ь, d - масштаб 20 мкм; с - масштаб 1

Таблица 5. Сравнительные характеристики близкородственными представителями рода Thiothrix

изолятов BL и G1

Характеристика 1 2 3 4

Размеры клеток, мкм 0-9-2-3 х 0-9-2-2 х 0-8-2-0х 1-0-1-7*

4-4-6-3 3-2-6-5 4-3-6-7 49-10-0

Оптимум рН 7-0 8-0 7-6 7-6-8-0

Температурный оптимум (°С) 24 25 20-24 25-27

Содержание ГЦ пар в ДНК. 51-4 52 53-4 51-5

мол.%

Источники углерода: +

малат -

фумарат + + -

оксалат + - - +

оксалоацетат + + - +

цитрат + -

изо-цитрат + - +

2-оксоглутарат + - - -

формиат - - - +

аконита! + - - -

малоиат + - -

сахароза - - - +

мальтоза - - -

Э-фруктоза - - -

Э-ксилоза - - +

Ь-рамноза - - - +

глутамат + - - -

аспартат + + - -

цистеин + - -

цистин + - -

аспарагин + - -

лейцин - + -

изо-лейцин - + - -

Активность каталазы - +

Ассимиляция N2 + -

Примечание:

1, ВЬТ; 2, О С1Т, 02, Р и К2 обладают общими фенотипическими свойствами, поэтому в таблице приведены

данные только для штамма 01т); 3, ТЬШЬга эр. СТЗ (использованы данные из статьи а а!., 2003); 4, Т. /гисШШгапз I (=АТСС 49749) (использованы данные из статьи Ноч'аЛЬ е( а!.. 1999).

3.2. Филогенетический и генотипический анализ

Обнаруженная высокая степень сходства RAPD-профилей и общность фенотипических свойств у штаммов G1T, G2, Р и К2 подразумевает близкое родство этих организмов. На основании этих данных было сделано предположение, что штаммы G1T, G2, Р и К2 являются членами одного вида. Далее штаммы G1T и BLT были исследованы более детально с целью уточнения их таксономического положения. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммов G1T и BLT с гомологичными последовательностями ближайших микроорганизмов, проведенный с помощью программы BLAST в банке данных GenBank, подтвердил предположение о филогенетическом родстве изучаемых штаммов с представителями рода Thiothrix. Наибольшее сходство последовательностей генов 16S рРНК изучаемые изоляты BLT и G1T имели с двумя штаммами вида Т. fructosivorans, штаммом I и штаммом QT, и с нитчатым бактериальным штаммом СТЗ (рис. 9). Штаммы BLT и G1T имели 98.8 % сходства генов 16S рРНК между собой (табл. 6). В результате недавней таксономической ревизии обширного числа бактериальных таксонов было показано, что бактериальные

виды при значениях сходства 16Б рРНК 98.7-99 % имеют уровень ДНК-ДНК гомологии ниже 70 % - значения, рекомендованного для выделения бактериального вида (^аскеЬгапЛ, 2006).

97 г Thiolhrix fmclosivorans QT (L79962)

6S[L

68 100

Thiolhrix fmclosivorans I (L79963)

- Thiolhrix sp. CT3 (AF148516)

- Thiolhrix cMifontis sp. nov. G1T (EU642573)

- Thiolhrix tacustris sp. nov. Bt.T(EL'642572) -Thiolhrix ntvea JP2T (L40993)

--Thiothrix unzii A1T (L79961)

-ThiolhrixJlexitis EJ2M-BT (AB042545)

'-----Thiolhrix defluvii Ben 57T (AF127020)

- Thiolhrix elkclhaamii AP3T (L79965)

— Thiolhrix disciform!* В3-!т (AB042532)

Дерево построено с использованием алгоритма neighbor-joining (в качестве внешней группы использована последовательность Achromatium oxaliferum L425431). Цифрами показана достоверность

ветвления на основании bootstrap-анализа (значащими признаются последовательности больше 50). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее двум заменам на каждые 100 нуклеотидов.

Рис. 9. Филогенетическое положение штаммов ВЬТ и О1 в составе рода ТЫоЛпх на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов 16Э рРНК.

Согласно этому критерию, обнаруженный нами уровень сходства последовательностей гена 168 рРНК между штаммами и ближайшими

представителями рода ТЫоЛпх соответствует межвидовому. В тоже время род ТЫоЛга является филогенетически гетерогенным и для представителей рода межвидовые значения сходства по гену 16Б рРНК находятся в пределе 97.2-88.2 %.

Таблица 6. Уровни сходства (%) штаммов ВЬТ и в!7 и близкородственных представителей рода ТЫоЛпх.

Штаммы Номера GenBank 1 2 3 4 5

16S рРНК ген

1. G1T EU642573 100

2. BLT EU642572 98.8 100

3. Thiolhrix sp. CT3 AF148516 99.0 99.1 100

4. Thiolhrix Jructosivorans I L79963 98.7 98.8 99.2 100

5. Thiolhrix Jructosivorans QT L79962 98.9 98.8 99.4 99.4 100

hsp60

!.G1T FJ161077 100

2. BLT FJ161076 88.4 100

3. Thiolhrix sp. CT3 F J167403 85.5 89.8 100

4. Thiolhrix Jructosivorans i FJ799359 91.9 91.4 96.2 100

5. Thiothrix Jructosivorans QT DQ212065 91.5 91.2 96.0 99.8 100

gyrB

l.GJT FJ032200 100

2. BLT FJ032199 83.1 100

3. Thiothrix sp. CT3 FJ032202 84.5 84.5 100

4. Thiolhrix jructosivorans I FJ032201 85.4 89.2 83.6 100

В отличие от анализа гена 16S рРНК, анализ белок-кодирующих генов показывает более высокую разрешающую способность при рассмотрении родства между организмами на межвидовом и внутривидовом уровнях (Kwok et al., 1999; Yamamoto etal, 1999).

Штаммы BLT и G1T имели сравнительно низкий уровень сходства нуклеотидных последовательностей генов hsp60 и gyrB со штаммами вида Thiothrix fructosivorans и Thiothrix sp. СТЗ (табл. 6).

Уровень сходства между штаммами BLT и G1T составил 88.4 % по гену hsp60 и 83.1 % по гену gyrB. В ряде таксонов микроорганизмов, включая род Thiothrix, подобные величины сходства генов hsp60 и gyrB соответствуют межвидовому уровню (Kupfer et al., 2006; Kwok et al., 1999).

Штаммы BLT и G1T имели низкий уровень ДНК-ДНК сходства с Т. fructosivorans I (=АТСС 49749) - 51 и 53 %, соответственно. Уровень ДНК-ДНК гомологии между штаммами BLT и G1T не превышал 35 %.

Согласно вышеприведенным результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, белок-кодирующих генов - hsp 60 и gyrB, результатам анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств в сочетании с хемотаксономическим анализом состава жирных кислот, штаммы G1T и BLT отличаются на видовом уровне между собой и от ранее известных видов рода Thiothrix. Это позволило обосновать описание двух новых видов в пределах рода Thiothrix - Thiothrix lacustris sp. nov. штамм BLT и Thiothrix caldifontis sp. nov. штамм G1T (Chernousova et al., 2009).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В течение нескольких лет нами проводились эколого-генетические исследования микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий из умеренно термальных и низкотемпературных сульфидных источников и озер различных географических регионов Северного Кавказа (Россия). Сочетание подходов in situ и ex situ позволило оценить не только таксономический состав, численность и структуру сообществ, но и внутривидовой генетический полиморфизм доминирующих видов.

In situ анализ микробных сообществ, проведенный методами молекулярного клонирования и T-RFLP генов 16S рРНК, выявил пятнадцать филотипов. В составе микробных сообществ умеренно термальных сульфидных источников «Петушок», «Ручей» и «Яма» Краснодарского края доминировали представители родов Thiothrix и Sphaerotilus. По уровню сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК представители Thiothrix были наиболее близки к Thiothrix unzii (около 99 %), а организмы Sphaerotilus имели 99.8 % сходства с типовым штаммом Sphaerotilus natans.

В составе микробных сообществ умеренно термального источника «Кабардинский» Ставропольского края и низкотемпературного озера «Нижнее» (Кабардино-Балкария) доминировали T-FRLP-фрагменты генов 16S рРНК, которые

соответствовали видам Thiothrix caldifontis sp. nov. и Thiothrix lacustris sp. nov. Минорные компоненты анализируемых микробных сообществ из различных сульфидных систем Северного Кавказа были представлены микроорганизмами следующих филогенетических групп: Rhodobacteraceae (Alphaproteobacteria), Burkholderiaceae (Betaproteobacteria), и Chromatiaceae (Gammaproteobacteria), Chlorobiaceae (Chlorobi), Clostridiaceae (Clostridia), Flavobacteriaceae (Bacteroidetes) и филума Cyanobacteria. Большинство представителей вышеперечисленных таксономических групп ранее обнаруживались в обогащенных сульфидом экосистемах других географических регионов.

По результатам сравнительного анализа модельного микробного сообщества методами клонирования и T-RFLP можно сделать вывод о том, что метод T-RFLP позволяет выявлять только доминирующие компоненты сообществ, тогда как минорные компоненты, выявленные с помощью технологии молекулярного клонирования, не обнаруживаются среди терминально меченных T-RFLP-фрагментов. Метод T-RFLP, несмотря на возможные неточности, связанные с неоднозначностью интерпретации результатов, является быстрым и удобным для мониторинга доминирующих филотипов в составе микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий. Однако в случае анализа сложных и ранее не исследованных микробных сообществ необходимо параллельно с T-RFLP анализом проводить анализ этого сообщества методами традиционной микробиологии и клонирования.

Одновременное присутствие представителей родов Thiothrix и Sphaerotilus в составе микробных сообществ характерно главным образом для активированных илов очистных сооружений, поверхностных пресных вод, сильно загрязненных стоками сельскохозяйственного производства. Нами впервые показано совместное участие представителей этих групп нитчатых бактерий в качестве основных структуробразуюгцих компонентов микробных сообществ в природных сульфидных источниках.

Установлены экологические условия, определяющие разнообразие видового состава и сукцессионные процессы в сообществах нитчатых сероокисляющих бактерий. Мониторинг биоразнообразия микробных сообществ умеренно термальных сульфидных источников «Петушок», «Ручей» и «Яма» Краснодарского края впервые позволил выявить структурные изменения сообщества «Thiothrix-Sphaerotilus» в зависимости от концентрации сульфида в водной среде. Была выявлена зависимость биоразнообразия микробных сообществ в различные временные периоды от концентрации сероводорода. В 2004 г. при концентрации сульфида менее 5 мг/л в водной среде бактериальные сообщества отличались большим разнообразием и были представлены доминирующими организмами Thiothrix и Sphaerotilus. В 2006 г. при значительном увеличении концентрации сероводорода (до 14 мг/мл) в сообществах доминировал только Thiothrix, в то время как Sphaerotilus не был обнаружен. По-видимому, доминирование организмов Thiothrix и Sphaerotilus в одних сообществах

и доминирование только Thiothrix в других обусловлено неспособностью представителей Sphaerotilus к росту при высоких концентрациях сульфида.

Основными факторами, регулирующими состав микробных сообществ «Thiothrix» источника «Кабардинский» Ставропольского края и «Нижнего» озера Кабардино-Балкарии, являлись температура и уровень трофности водоемов. С возрастанием температуры и уровня трофности водоемов происходило смещение бактериального разнообразия в сторону увеличения видовой представительности бактериальных организмов. По-видимому, низкие значения температур и концентрация органических веществ определяют разнообразие организмов, обнаруживаемых в составе микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий.

Ex situ анализ микробных сообществ на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и RAPD-фингерпринтов выявил внутривидовой генетический полиморфизм доминирующих организмов Thiothrix unzii, Thiothrix caldifontis и Sphaerotilus natans в составе сообществ из различных сульфидных экосистем. У организмов Thiothrix unzii выявлены 1-3 нуклеотидные замены на фрагментах генов 16S рРНК длиной примерно 500 нуклеотидов. Профили RAPD-ПЦР для всех штаммов Т. caldifontis и S. natans различались числом и размером ПЦР-фрагментов. Уровень генетического различия, рассчитанный с помощью коэффициента Нея-Ли, между штаммами Т. caldifontis и S. natans составил 25 и 26 %, соответственно.

Физиолого-биохимический анализ ряда чистых культур, выделенных из исследованных микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий (Гриднева и др., 2009; Лавриненко и др.,2009), позволил показать их участие в трансформации восстановленных соединений серы: этот процесс была способна осуществлять как уже известная специализированная группа бесцветных серобактерий рода Thiothrix, так и ранее не отмеченные организмы родов Sphaerotilus и Azospirillum. Способность изолированных культур нитчатых и одноклеточных бактерий к окислению восстановленных соединений серы, а также их присутствие в качестве постоянного компонента микробных сообществ сульфидных источников, свидетельствует об их участии в преобразовании серных соединений в данной экосистеме.

Согласно результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, белок-кодирующих генов - hsp 60 и gyrB, результатам анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств в сочетании с хемотаксономическим анализом состава жирных кислот, выделенные культуры нитчатых сероокисляющих бактерий описаны в качестве двух новых видов семейства Thiotrichaceae - Thiothrix caldifontis sp. nov. и Thiothrix lacustris sp. nov. (Chernousova et al., 2009).

ВЫВОДЫ

1. В природных сульфидных источниках Северо-Кавказского региона впервые выявлен новый тип микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий -«Thiothrix-Sphaerotilus». Впервые в сероводородных биотопах было обнаружено массовое развитие представителей Sphaerotilus natans, способных участвовать в окислении восстановленных соединений серы.

2. In situ анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных биотопов Северного Кавказа, проведенный с использованием методов молекулярного клонирования и T-RFLP генов 16S рРНК, позволил выявить пятнадцать бактериальных филотипов. Доминирующие структурообразующие бактерии были представлены нитчатыми бактериями родов Thiothrix и Sphaerotilus, а минорные компоненты - микроорганизмами следующих филумов: Proteobacteria, Chlorobi, Cyanobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes.

3. Определена специфичность видового состава структурообразующих организмов микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в различных биотопах: организмы, близкие к Thiothrix unzii и Sphaerotilus natans (умеренно термальный источник «Ручей» и «Петушок»), Т. caldifontis sp. nov. (умеренно термальный источник «Кабардинский») и Т. Jacustris sp. nov. (низкотемпературное озеро «Нижнее»).

4. Установлено, что метод T-RFLP позволяет выявлять и оценивать разнообразие только доминирующих компонентов сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий.

5. Ex situ анализ на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и RAPD-фингерпринтов позволил выявить внутривидовой генетический полиморфизм видов Т. unzii, Т. caldifontis sp. nov. и S. natans в составе сообществ.

6. Установлены экологические факторы, определяющие разнообразие микробных сообществ сульфидных источников - концентрация H2S, температура, уровень трофности водоемов. Мониторинг разнообразия микробных сообществ умеренно термальных сульфидных источников позволил выявить сукцессионные процессы -структурные изменения видового состава микробных сообществ в зависимости от концентрации сульфида в водной среде: содержание сульфида более 5 мг/л в источниках исключает массовое развитие Sphaerotilus в составе сообщества «Thiothrix-Sphaerotilus» и создает условия для доминирования Thiothrix.

7. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, белок-кодирующих генов - hsp 60 и gyrB, результата анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств описаны новые представители семейства Thiotrichaceae - Thiothrix caldifontis sp. nov. и Thiothrix lacustris sp. nov.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Черноусова Е.Ю. Филогенетический in situ/ex situ анализ микробного сообщества серного мата из термального сульфидного источника Северного Кавказа / Е.Ю.

Черноусова, В.Н. Акимов, Е.В. Гриднева, Г.А. Дубинина, М.Ю. Грабович // Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 2,- С. 255-260.

2. Chernousova E.Yu. Thiothrix caldifontis sp. nov. and Thiothrix lacustris sp. nov., novel gammaproteobacteria isolated from sulfide springs / E.Yu. Chernousova, E.V. Gridneva, M.Yu. Grabovich, G.A. Dubinina, V.N. Akimov, S. Rossett and J. Kuever // Int J Syst Evol Microbiol - 2009. -V. 59. - P. 3128-3135.

3. Гридиева Е.В. Экофизиология представителей рода Sphaerotilus - обитателей термальных сульфидных источников Северного Кавказа / Е.В. Гриднева, М.Ю. Грабович, Г.А. Дубинина, Е.Ю. Черноусова и В.Н. Акимов // Микробиология - 2009. -Т. 78, № 1. - С. 89-97.

4. Chernousova E.Yu. Biodiversity and monitoring of colorless filamentous bacteria in sulfide aquatic systems of North Caucasus region / E.Yu. Chernousova, V.N. Akimov, E.V. Gridneva, G.A. Dubinina and E.Yu. Grabovich // Микробиология - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 682-687.

5. Lavrinenko К. Azospirillum thiophilum sp. nov., a novel diazotrophic bacterium isolated from a sulfide spring / K. Lavrinenko, E. Chernousova, E. Gridneva, G. Dubinina, V. Akimov, J. Kuever, A. Lysenko and M. Grabovich II Int J Syst Evol Microbiol - 2010. - V. 60 - P. 28322837.

6. Gridneva E. Taxonomic investigation of representatives of the genus Sphaerotilus: descriptions of Sphaerotilus montanus sp. nov., Sphaerotilus hippei sp. nov., Sphaerotilus natans subsp. natans subsp. nov. and Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans subsp. nov., and an emended description of the genus Sphaerotilus / E. Gridneva, E. Chernousova, G. Dubinina, V. Akimov, J. Kuever, E. Detkova and M. Grabovich // Int J Syst Evol Microbiol -2011.-V. 61.-p. 916-925.

7. Черноусова Е.Ю. Молекулярная идентификация in situ нитчатых матообразующих бактерий / Е.Ю. Черноусова, М.Ю. Грабович // Материалы II международной молодежной школы - конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва (1-3 ноября). - 2006. - С. 64.

8. Черноусова Е.Ю. Молекулярно-экологическое исследования микробных сообществ бесцветных серобактерий / Е.Ю. Черноусова, Е.В. Гриднева, М.Ю. Грабович, В.Н. Акимов // Материалы 10-ой международной молодежной конференции «Биология -наука XXI века». - Пущино (17-21 апреля). - 2006. - С. 219.

9. Chernousova E.Y. Community composition of colorless sulfur bacterial mats from the mineral sulfide springs of the North Caucasus / E.Y. Chernousova, V.N. Akimov, G.A. Dubinina and M.Y. Grabovich // 2ndFEMS congress of European microbiologists. - Madrid (4-8 июля). -

2006. - P. 157.

10. Черноусова Е.Ю. Эколого-таксономическая характеристика матов бесцветных серобактерий из термальных сульфидных источников Северного Кавказа / Е.Ю. Черноусова, В.Н. Акимов, Е.В. Гриднева, М.Ю. Грабович, Г.А. Дубинина // Материалы 2-го Байкальского Симпозиума с международным участием. - Иркутск (10-15 сентября). -

2007. - С. 245.

11. Chernousova E.Y. Characterization of the Thiothrix mats in the thermal and low temperature freshwater sulfide systems / E.Y. Chernousova, V.N. Akimov, E.V. Gridneva, M.Y, Grabovich and G.A. Dubinina // 3n<iFEMS congress of European microbiologists. - Gothenburg (28 июня -2 июля).-2009.-P. 154.

Статьи № 1 - 6 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 12.05.2011. Усл. печ. л. 1,4 Тираж 100 экз. Заказ №1258 Отпечатано в типографии Воронежский ЦНТИ - филиал ФГУ «РЭА» Минэнерго России 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 30

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черноусова, Елена Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БЕСЦВЕТНЫЕ НИТЧАТЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ

1.1. Экология бесцветных серобактерий

1.2. Таксономическое разнообразие бесцветных серобактерий

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ТНЮТНШХ

2.1. Биологические особенности организмов рода ТкШкНх

2.2. Таксономия

2.3. Экология

ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В 26 МИКРОБНОЙ ЭКОЛОГИИ

3.1. Принципы молекулярной экологии

3.2. Молекулярные маркеры, используемые в современной таксономии 28 и филогении бактерий

3.2.1. Анализ генов 168 рРНК

3.2.2. Анализ белок-кодирующих генов ОугВ и ШрбО

3.3. Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клонирование - 33 основные инструменты молекулярно-экологических исследований

3.4. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК

3.5. Метод Т-Б^ЬР

3.6. Методы ДНК-типирования

3.7. ДНК-ДНК гибридизация

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биоразнообразие нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных экосистем Северного Кавказа"

Актуальность проблемы. г

Важным, объектом экологии микроорганизмов являютсяг микробные сообщества, представляющие особый интерес в связи, с их значимой функциональной ролью в глобальном цикле превращения элементов в биосфере.

Экологические ниши бесцветных серобактерий располагаются, как правило, в зоне контакта сероводорода и кислорода в водоемах разного типа - пресных, морских, в районах океанических гидротерм и вулканической активности, минеральных сульфидных источниках, а также в антропогенных экосистемах [10; 11; 12; 24; 55; 56; 78; 79; 81; 83; 87; 97; 123; 168; 174; 183; 193; 201]. Их массовое развитие сопровождается формированием мощных обрастаний или плотных бентосных сообществ - серных матов, покрывающих иногда огромные площади поверхности донных отложений. Для подобных сообществ характерно, как правило, доминирование одного -двух представителей нитчатых или одноклеточных серобактерий.

Значительный прогресс в исследованиях состава бесцветных серобактерий, особенно, в морских глубоководных местообитаниях, был достигнут за последние десятилетия благодаря* применению молекулярно-генетических методов анализа микробных сообществ. Это позволило значительно расширить представления о таксономическом составе и эволюционных позициях представителей этой группы бактерий [30; 32; 40; 41; 57; 71; 81; 88; 105; 122; 195].

Таксономическая характеристика микробных сообществ с участием нитчатых сероокисляющих бактерий, может осуществляться непосредственно в природных образцах (in situ идентификация) на родовом и видовом уровнях на основе анализа филогенетических маркеров, в первую очередь - генов 16S рРНК [10; 12; 31; 52; 81; 87; 133; 141; 209; 216]. Идентификация организмов на видовом и- внутривидовом уровнях в большинстве случаев по-прежнему осуществляется на изолированных культурах (ех situ идентификация) [4; 30; 45; 67; 88; 112; 126; 132; 190; 193]. Параллельная оценка разнообразия микробного сообщества in situ и ex situ все еще проводится редко из-за проблем, связанных с трудностью культивирования организмов и ограниченностью прямых молекулярно-биологических и генетических методов оценки разнообразия, что не позволяет расшифровать структуру микробного сообщества в целом и оценить его биогеохимическую деятельность.

Настоящая работа посвящена комплексному экологическому и генетико-таксономическому исследованию биоразнообразия нитчатых сероокисляющих бактерий, формирующих мощные обрастания в низкотемпературных и умеренно термальных пресноводных сульфидных экосистемах Северного Кавказа. Необходимость исследования продиктована широким распространением сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в пресноводных сульфидных системах, где они характеризуются высокой продуктивностью и являются эффективным биогеохимическим фильтром в превращении соединений углерода, серы и азота.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было проведение комплексного эколого-генетического (in situ и ex situ) анализа микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий из умеренно термальных и низкотемпературных сульфидных источников и озер различных географических регионов Северного Кавказа.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав, численность и структуру микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий, обнаруженных в 2004-2007 гг. в сульфидных источниках и озерах.

4. Выделить чистые культуры бесцветных серобактерий, из микробных сообществ и определить их таксономическое положение на основе полифазного анализа с применением филогенетических маркеров.

Научная новизна и значимость работы.

Впервые проведено экологическое и генетико-таксономическое изучение микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в термальных и низкотемпературных сульфидных экосистемах различных регионов Северного Кавказа.

Комплексный подход (in situ и ex situ) к исследованию сообществ микроорганизмов, включающий наряду с молекулярно-генетическими методами и детальный микробиологический анализ, позволил показать картину таксономического и физиологического разнообразия микробного сообщества; типа, «Thiothrix-Sphaerotilus» [191]. Хотя массовое развитие представителей родов ТкШкпх и БрНаегоШт в составе бактериальных сообществ характерно для антропогенных экосистем, стабильные сообщества этих бактерий в составе формируемых ими серных «тяжей» в природных сульфидных источниках обнаружены впервые.

С помощью амплификации фрагментов генов 16Б рРНК из суммарной ДНК природного образца, их клонирования с последующим скринингом библиотеки клонов методами ПЦР, рестрикционного анализа (ЯРЬР) и секвенирования проведен мониторинг биологического разнообразия микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий умеренно термальных сульфидных источников Краснодарского края- и впервые выявлены структурные изменения микробного сообщества «ТкШкпх-БрНаегоШиБ» в зависимости от концентрации сульфида в водах источников.

С помощью метода Т-Ш^ЬР выявлена зависимость разнообразия видового состава- микробных сообществ «ТИШкпх» умеренно термального источника Ставропольского края и низкотемпературного озера Кабардино-Балкарии от экологических условий — температуры, и уровня трофности водоемов.

Сравнение двух методов молекулярной биологии и генетики для анализа бактериальных сообществ нитчатых серобактерий показало, что метод Т-ЫРЪР позволяет выявлять только доминирующие компоненты, тогда как технология' молекулярного клонирования обнаруживает и минорные компоненты микробных природных сообществ.

Впервые показано участие представителей родов БрНаегоШиз и АгоБртИит в качестве компонентов микробных сообществ в природных сульфидных экосистемах. Многочисленные изоляты рода БркаегоШиБ традиционно относили к группе органогетеротрофных железобактерий, а известные представители рода АгояртИит — к ризобактериям, живущим на поверхности корневой системы растений и фиксирующим азот воздуха.

На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК, белок-кодирующих генов - НзрбО и

УгВ, результата анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств описаны новые виды семейства ТЫоМскасеае - ТкШкпх саШг/оМгя эр. поу. и ТкШкпх \acustris эр. поу. [17].

Исследования микробных сообществ в природных сульфидных экосистемах Северо-Кавказского региона позволили существенно расширить знания об экологии и биологии бесцветных нитчатых серобактерий, в частности, их филогенетическом и фенотипическом разнообразии, физиологии и генотипических характеристиках.

Практическая значимость.

Научные положения диссертационной работы являются необходимой базой для дальнейших исследований филогенетического и фенотипического разнообразия бесцветных серобактерий, населяющих умеренно термальные и низкотемпературные сульфидные пресноводные системы.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на международных и российских конференциях:

1. Международной молодежной школе - конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005).

2. Международной молодежной школе - конференции «Биология наука XXI века» (Пущино, 2006).

3. 2ndFEMS congress of European microbiologists (Spain, 2006).

4. 2-ой Международный байкальский симпозиум по микробиологии

Иркутск, 2007)

5. 3ndFEMS congress of European microbiologists (Sweden, 2009). Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 11 печатных работах: 6 экспериментальных статей и 5 тезисов. Статьи, опубликованные по теме диссертации, состоят в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 153 страницах, включает 15 таблиц, 23 рисунка, список литературы из 222 наименований, из них 38 на русском и 184 на английском языке.

Заключение Диссертация по теме "Экология (по отраслям)", Черноусова, Елена Юрьевна

выводы

1. В природных сульфидных источниках Северо-Кавказского региона впервые выявлен новый тип микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий - «Thiothrix-Sphaerotilus». Впервые в сероводородных биотопах было обнаружено массовое развитие представителей Sphaerotilus natans, способных участвовать в окислении восстановленных соединений серы.

2. In situ анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных биотопов Северного Кавказа, проведенный с использованием методов молекулярного клонирования и T-RFLP генов 16S рРНК, позволил выявить пятнадцать бактериальных филотипов. Доминирующие структурообразующие бактерии были 4 представлены нитчатыми бактериями родов Thiothrix и Sphaerotilus, а минорные компоненты -микроорганизмами следующих филумов: Proteobacteria, Chlorobi, Cyanobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes.

3. Определена специфичность видового состава структурообразующих организмов микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в различных биотопах: организмы, близкие к Thiothrix unzii и Sphaerotilus natans (умеренно термальный источник «Ручей» и «Петушок»), Т caldifontis sp. nov. (умеренно термальный источник «Кабардинский») и Т. lacustris sp. nov. (низкотемпературное озеро «Нижнее»).

4. Установлено, что метод T-RFLP позволяет выявлять и оценивать разнообразие только доминирующих компонентов сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий

6. Установлены экологические факторы, определяющие разнообразие микробных сообществ сульфидных источников - концентрация H2S, температура, уровень трофности водоемов. Мониторинг разнообразия микробных сообществ умеренно термальных сульфидных источников позволил выявить сукцессионные процессы - структурные изменения видового состава микробных сообществ в зависимости от концентрации сульфида в водной среде: содержание сульфида более 5 мг/л в источниках исключает массовое развитие БрИавгоШт в составе сообщества «ТкШкНх—ЗркаегоШиз» и создает условия для доминирования ТкШкНх.

7. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК, белок-кодирующих генов - кхр 60 и гВ, результата анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств описаны новые представители семейства ТкШНскасеае - ТИШкпх са1сИ/опИз эр. поу. и ТкШкпх \acustris эр. поу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В течение нескольких лет, нами проводились эколого-генетические исследования микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий из умеренно термальных и низкотемпературных сульфидных источников и озер различных географических регионов Северного Кавказа (Россия).

Сочетание подходов in situ и ex situ позволило оценить не только таксономический состав, численность и структуру сообществ, но и внутривидовой генетический полиморфизм доминирующих видов.

Анализ микробных сообществ проводили по обобщающей схеме, представленной на рис. 23.

In situ анализ микробных сообществ, проведенный методами молекулярного клонирования и T-RFLP генов 16S рРНК, выявил пятнадцать филотипов. В составе микробных сообществ умеренно термальных сульфидных источников «Петушок», «Ручей» и «Яма» Краснодарского края доминировали представители родов Thiothrix и Sphaerotilus. По- уровню сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК представители Thiothrix были наиболее близки к Thiothrix unzii (около 99 %), а организмы Sphaerotilus имели 99.8 % сходства с типовым штаммом Sphaerotilus natans,

В составе микробных сообществ умеренно термального источника «Кабардинский» Ставропольского края и низкотемпературного озера «Нижнее» (Кабардино-Балкария) доминировали T-RFLP-фрагменты генов 16S рРНК, которые соответствовали видам Thiothrix caldifontis sp. nov. и Thiothrix lacustris sp. nov.

Минорные компоненты анализируемых микробных сообществ из различных сульфидных систем Северного Кавказа были представлены микроорганизмами следующих филогенетических групп: Rhodobacteraceae (Alphaproteobacteria), Burkholderiaceae {Betaproteobacteria), и Chromatiaceae (Gammaproteobacteria), Chlorobiaceae (Chlorobi), Clostridiaceae (Clostridia),

ПауоЬаМепасеае (Вас1его'к1е1е$) и филума СуапоЪас1епа. Существенно, что большинство представителей вышеперечисленных таксономических групп ранее обнаруживались в обогащенных сульфидом экосистемах других географических регионов. с

К» м!и аиалщ

11рнро |ш.ш обра (си (Микробное сообщество)

1п $Ни аиалмт

ДНК чистой кулыуры

V-- \

Суммарный препарат ДНК

ПЦР I

Суммарная фракция |«нов 168 рРНК ен 168 рРНК.Л ДНК-бс/юк-ко.-ифуюншсМиширонаннс: ^ I сны ) ^КАГО-ПЦР^

Отдельные гены гены 16$ рРНК

Клонирование

Рестрикция

Т-ЯРЬР

Секвенированис и определение филогенетического положения

Интерпретация Т-ЯН.Р-фрагментон в базах данных

Рис. 23. Схема комплексного эколого-генетического анализа микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий Северного Кавказа.

Следовательно, можно предположить, что эти организмы являются специфическими обитателями подобных экосистем и могут играть существенную роль в протекающих в них процессах.

По результатам сравнительного анализа модельного - микробного сообщества методами клонирования и T-RFLP можно сделать вывод о том,* что метод T-RFLP позволяет выявлять только доминирующие компоненты сообществ, тогда как минорные компоненты, выявленные с помощью технологии молекулярного клонирования, не обнаруживаются среди терминально меченных фрагментов. Метод T-RFLP, несмотря на возможные неточности, связанные с неоднозначностью интерпретации результатов, является быстрым и удобным для мониторинга доминирующих филотипов в составе микробных сообществ. Однако в случае анализа сложных и ранее не исследованных микробных сообществ необходимо параллельно с T-RFLP анализом проводить анализ этого сообщества методами традиционной микробиологии и клонирования.

Одновременное присутствие представителей родов Thiothrix и Sphaerotilus в составе микробных сообществ характерно главным образом для активированных илов очистных сооружений, поверхностных пресных вод, сильно загрязненных стоками сельскохозяйственного производства. Нами впервые показано совместное участие представителей этих групп нитчатых бактерий в качестве основных структуробразующих компонентов микробных сообществ в природных сульфидных источниках.

Установлены экологические условия, определяющие разнообразие видового состава и сукцессионные процессы в сообществах нитчатых сероокисляющих бактерий. Мониторинг биоразнообразия микробных сообществ умеренно термальных сульфидных источников «Петушок», «Ручей» и «Яма» Краснодарского края впервые позволил выявить структурные изменения сообщества «Thiothrix-Sphaerotilus» в- зависимости от концентрации сульфида в водной среде. Была выявлена зависимость биоразнообразия микробных сообществ в различные временные периоды от концентрации сероводорода. В 2004 г. при концентрации сульфида менее 5 мг/л в водной среде бактериальные сообщества отличались большим разнообразием и были представлены доминирующими организмами Thiothrix и Sphaerotilus. В 2006 г. при, значительном увеличении концентрации сероводорода (до 14 мг/мл) в сообществах доминировал только Thiothrix, в то время как Sphaerotilus не был обнаружен. По-видимому, доминирование организмов Thiothrix и Sphaerotilus в одних сообществах и доминирование только Thiothrix в других обусловлено неспособностью представителей Sphaerotilus к росту при высоких концентрациях сульфида.

У организмов Thiothrix unzii выявлены 1-3 нуклеотидные замены на фрагментах генов 16S рРНК длиной примерно 500 нуклеотидов. Профили RAPD-ПЦР для всех штаммов Т. caldifontis и S. natans различались числом и размером ГЩР-фрагментов. Уровень генетического различия, рассчитанный с помощью коэффициента Нея и Ли,- между штаммами Т. caldifontis и S. natans составил 25 и 26 %, соответственно.

Физиолого-биохимический анализ ряда чистых культур, выделенных из исследованных микробных сообществ [188; 191; 204], позволил показать их участие в трансформации восстановленных соединений серы: этот процесс была способна осуществлять как уже известная специализированная группа бесцветных серобактерий рода Thiothrix, так и ранее не отмеченные организмы родов Sphaerotilus и Azospirillum. Способность изолированных культур нитчатых и одноклеточных бактерий к окислению восстановленных соединений серы, а также их присутствие в качестве постоянного компонента микробных сообществ сульфидных источников, свидетельствует об их участии в преобразовании серных соединений в данной экосистеме.

Согласно результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, белок-кодирующих генов - hsp 60 и gyrB, результатам анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств в сочетании с хемотаксономическим анализом состава жирных кислот, выделенные культуры нитчатых сероокисляющих бактерий валидно описаны в качестве двух новых видов семейства Thiotrichaceae - Thiothrix caldifontis sp. nov. и Thiothrix lacustris sp. nov. [17].

Ill

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черноусова, Елена Юрьевна, Воронеж

1. Albrecht S. L. Nitrogen fixation by corn Azospirillum associations in a temperate climate / S. L. Albrecht, Y. Okon, L. Lonnquist, R. H. Burris // Crop. Sci. - 1981. -V. 21. - P. 301-306.

2. Alexandrov A. Streamline Method to Analyze 16S rRNA Gene Clone Libraries / A. Alexandrov, D. Kaushik, S. M. Pascal // Bio. Techniques. -2001.-V. 30.-P. 938-944.

3. Armbruster E. H. Improved technique for isolation and identification of Sphaerotilus / E. H. Armbruster // Appl. Microbiol. 1969. - V. 17. - P. 320-321.

4. Ausubel F. H. Current protocols in Molecular Biology / F. H. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl. New York: John Wiley and Son, 1994. - P. 534.

5. Bashan Y. Azospirillum plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) / Y. Bashan, G. Holguin // Can. J. Microbiol. - 1997.-V. 43.-P. 103-121.

6. Bej A. K. Polymerase chain reaction-gene probe detection of microorganisms by using filter-concentrated samples / A. K. Bej, M. H. Mahbubani, J. L. Dicesare, R. M. Atlas // Appl. Environ. Microbiol. -1991.-V. 57.-P. 3529-3534.

7. Blackwood K. S. / Evaluation of recA sequences for identification of Mycobacterium species // K. S. Blackwood, C. He, J. Gunton // Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 2846-2852.

8. Bland Y. A. Observations on the biology of Thiothrix / Y. A. Bland, Y. T. Staley // Arch. Microbiol. 1978. - V. 117. - P. 79-87.

9. Brigmon R. L. Biofouling of Groundwater Systems by Thiothrix spp. / R. L. Brigmon, H. W. Martin, H. C. Aldrich // Curr. Microbio. 1997. - V. 35. -P. 169-174.

10. Brigmon R. L. Biogeochemical ecology of Thiothrix spp. in underwater limestone caves / R. L. Brigmon, H. W. Martin, T. L. Morris, G. Bitton, and S. G.Zam// Geomicrobiol. 1994.-V. 12.-P. 141-159.

11. Brigmon R. L. Identification of Thiothrix unzii in two distinct ecosystems / R. L. Brigmon, M. Furlong, W. B. Whitman // Lett. Appl. Microbiol. -2003.-V. 36.-P. 88-91.

12. Brigmon R. L. Symbiotic Relationship of Thiothrix spp. with an Echinoderm / R. L. Brigmon, C. De Ridder // Appl. Environ. Microbiol. -1998. V. 64. - P. 3490-3495.

13. Burgmann H. New molecular screening tools for analysis of free-livin diazotrophs in soil / H. Burgmann, F. Widmer, W. Von Sigler and J. Zeyer // Appl. Envir. Microb. 2004. - V. 70. - P. 240-247.

14. Cannon G. C. Cytochromes in Beggiatoa alba / G. C. Cannon // Curr. Microbiol. 1979. - V. 2. - P. 263-266.

15. Cataldi M. S. Aislamiento de Beggiatoa alba en cultivo ouro / M. S. Cataldi // Rev. Inst. Bacteriol. Dep. Nacion. Hig. 1940. - V. 9. - P. 393423.

16. Chun J. EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences / J. Chun, J. H. Lee, Y. Jung, M. Kim, S. Kim, B. K. Kim and Y. W. Lim // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2007. V. 57. - P. 2259-2261.

17. Collins R. E. REPK: an analytical web server to select restriction endonucleases for terminal restriction fragment length polymorphism analysis / R. E. Collins, G. Rocap // Nucleic Acids Res. 2007. - V. 35. - P. 58-62.

18. Coskuner G. In situ characterization of nitrifiers in an activated sludge plant: detection of Nitrobacter spp. / G. Coskuner, T. P. Curtis // J. Appl. Microb. 2002. - V. 93. - P. 431-437.

19. Culman S.W. T-REX: Software for the processing and analysis of T-RFLP data / S.W. Culman, R. Bukowski, H.G. Gauch, H. Cadillo-Quiroz, D. H. Buckley // BMC Bioinformatics. 2009. - V. 10. - P. 171.

20. Dando P. R. Microbiology of shallow hydrothermal sites off Palaeochori Bay, Milos (Hellenic Volcanic Arc) / P. R. Dando et al. // Cah. Biol. Mar.- 1998.-V. 39.-P. 369-372.

21. De Ley J. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates / J. De Ley, H. Cattoir and A. Reynaerts // Eur. Biochem.- 1970.-V. 12.-P. 133-142.

22. Di Marsio W. D. First results a screening of filamentous organisms present in Buenos Aires's activated sludge plants / W. D. Di Marsio // Water. Sei. Technol. 2002. - V. 46. - P. 119-122.

23. Dondero N. C. Sphaerotilus, its nature and economic significance / N. C. Dondero // Adv. Appl. Microbiol. 1961. - V. 3. - P. 77-107.

24. Dubinina G. A. Genus Macromonas Utermohl and Koppe in Koppe 1924 / G. A. Dubinina, F. Rainey, J. G. Kuenen // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd ed. 2005. - V. 2. Part C. - P. 721-724.

25. Dworkin. M. The Prokaryotes / M. Dworkin, S. Falkow. New York: Spinger, 2005. - V. 2. - P. 985-1027.

26. Fossing H. Concentration and transport of nitrate by the mat forming sulfur bacterium Thioploca / H. Fossing, V. A. Gallardo, B. B. Jorgensen, M. Hiittel, L. P. Nielsen, H. Schulz // Nature. - 1995. - V. 374. - P. 713 -715.

27. Frias-Lopez J. Bacterial community associated with black band disease in corals / J. Frias-Lopez, J. Klaus, G. Bonheyo and B. Fouke // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 5955-5962.

28. Friedrich C. G. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by bacteria: emergence of a common mechanism? / C. G. Friedrich, D. Rother, F. Bardischewsky, A. Quentmeier, J. Fischer // Appl. Environ. Microbiol. -2001. V. 67. - P. 2873-2882.

29. Fukui M. Physiology, phylogenetic relationships, and ecology of filamentous sufate-reducing bacteria (genus Desulfonema) / M. Fukui, A. Teske, B. Abmus, G. Muyzer and F. Widde // Arch. Microbiol. 1999. - V. 172.-P. 193-203.

30. Gallardo V. A. Large benthic microbial communities in sulphide biota under Peru-Chile subsurface counter current / V. A. Gallardo // Nature. -1977.-V. 286:-P. 331-332.

31. Garrity G. M. Prokaryotes Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / M. Winters, A. W. Kuo, D. B. Searles // Taxonomic Outline of the Prokaryotes Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. — New York: Springer—Verlag. 2000. - V. 1 - P. 1-3.

32. Garrity G. M. Family Thiotrichaceae fam.nov. / G. M. Garrity, Y. A. Bell, T. Liburn // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. 2005. -V. 2. Part B.-P. 131-179.

33. Gaval G. Impact of the repetition of oxygen deficiencies on the filamentous bacteria proliferation in activated sludge / G. Gaval, J. J. Parnelle // Water. Res. 2003. - V. 37. - P. 1991-2000.

34. Hatano K. Taxonomic studies on Streptomyces violaceoruber group and related species based on gyrB sequences IFO / K. Hatano, T. Nishii // Res. Commun. 1994. - V. 20. - P. 83-91,

35. Hiroaki K. Differentiation of phylogenetically related slowly growing Mycobacteria by their gyrB sequences / K. Hiroaki, E. Takayuki and H. Shigeaki // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 301-308.

36. Huang L. Molecular phylogenetic diversity of bacteria associated with the leachate of a closed municipal' solid waste landfill / L. Huang, S. Zhu, H. Zhou, L. Qu // FEMS Microb. Lett. 2005. - V. 242. - P. 297-303.

37. Huettel M. Vertical migration in the sediment-dwelling sulfur bacteria Thioploca spp. in overcoming diffusion limitations / M. Huettel, S. Forsret, S. Kloser and H. Fossing // Appl. Anviron. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 1863-1872.

38. Hugenholtz P. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity / B. M. Goebel, N. R. Pace // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 4765-4774.

39. Jannasch H. W. Massive natural occurrence of unusually large bacteria (Beggiatoa sp.) as a hydrothermal deep-sea vent site / H.W. Jannasch, D. C. Nelson, C. O. Wirsen // Nature. 1989. - V. 342. - P. 834-836.

40. Jannasch H. W. Recent progress in the microbology of hydrothermal vents / H. W. Jannasch, D. C. Nelson // Current perspectives in microbial ecology / American society for microbiology. Washington D. C., 1984. - P. 170176.

41. Janssen P. H. Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA genes / P. H Janssen // Appl. Envir. Microb. 2006. -V. 72.-P. 1719-1728.

42. Jenkins D. In: Manual on the causes and control of activated sludge bulking and foaming / D. Jenkins, M. Richard, G. T. Daigger. Lafayette, CA: Ridgeline Press, 1984. - P. 28.

43. Jian W. New approach to phylogenetic analysis of the genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences / W. Jian, L. Zhu and X. Dong // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 16331638.

44. Jorgensen B. B. Colorless sulfur bacteria, Beggiatoa spp. and Thiovulum spp. in oxygen and hydrogen sulfide microgradients / B. B. Jorgensen, N. P. Revsbech // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 45. - P. 1261-1270.

45. Jorgensen B. B. Ecology of the bacteria of the sulphur cycle with special reference to anoxic-oxic interface environments / B. B. Jorgensen, J. R. Postgate // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1982. - V. 298. - P. 543-561.

46. Jorgensen B. B. Genus Thioploca Lauterborn 1907 / B. B. Jorgensen, A. Teske, A. Ahmad // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2004. -V. 2. - P. 48-54.

47. Jorgensen B. B. Thioploca spp.: filamentous sulfur bacteria with nitrate vacuoles / B. B. Jorgensen, V. Gallardo // FEMS Microbiology Ecology. -1999.-V. 28.-P. 301-313.

48. Joshi M. M. Interaction of Beggiatoa and ice plant: detoxification of hydrogen sulfide in the rice rhizosphere / M. M. Joshi, J. P. Hollis // Science. 1977.-V. 195.- 179-180.

49. Junier P. TRiFLe: a program for in silico T-RFLP analysis with user-defined sequences sets / P. Junier, T. Junier and K. P. Witzel // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - V. 74. - P. 6452-6456.

50. Kasai H. Intrageneric relationship among Micromonospora species deduced from gyrB based phylogeny and DNA relatedness / H. Kasai, T. Tamura and S. Harayama // Int. J. Syst. Bacteriol. - 2000. - V. 50. - P. 127-134.

51. Kitts C. L. Terminal restriction fragment patterns: a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics / C. L. Kitts // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V. 80. - P. 365-380.

52. Kojima H. Morphological and phylogenetic characterization of freshwater Thioploca species from Lake Biwa. Japan, and Lake Constance, Germany / H. Kojima, A. Teske, M. Fukui // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. -P. 390-398.

53. Kuenen J. G. Genus Thiospira Visloukh 1914 / J. G. Kuenen, G. A. Dubinina // Ibid. 2000, Part B. - P. 178-179.

54. Kupfer M. Genetic relationships of Aeromonas strains inferred from 16S rRNA, gyrB and rpoB gene sequences / M. Kupfer, P. Kuhnert, B. M. Korczak, R. Peduzzi // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - V. 56. - P. 2743-2751.

55. Kvist T. Archaeal diversity in Icelandic hot springs / T. Kvist, B. K. Ahring and P. Westermann // FEMS Microbiol. Ecol. 2007. - V. 59. - P. 71-80.

56. Lackey J. B. Taxonomy and ecology of the sulfur bacteria / J. B. Lackey, E. W. Lackey, G. B. Morgan // Eng. Prog. Univ. Florida. Coll. of Eng. Bull. 1965.-V. 199.-P. 1-23.

57. Lane D. G. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematic / E. Stackebrandt, M. Goodfellow. Chichester: Wiley, 1991. - P. 115-175.

58. Larkin J. M. Beggiatoa in microbial mats at hydrocarbon vents in the Gulf of Mexico and Warra Mineral Springs, Florida / J. M. Larkin, P. Aharon, M. C. Henk // Geo-Mar. Lett. 1994. - V. 14. - P. 97-103.

59. Larkin J. M. Beggiatoa, Thiothrix and Thioploca / J. M. Larkin, W. R. Strohl // Ann. Rev. Microbiol. 1983. - V. 37. - P. 341-367.

60. Larkin J. M. Characterization of Thiothrix nivea / J. M. Larkin, D. L. Shinabarger// Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. - V. 33. - P. 841-846.

61. Larkin J. M. Filamentous sulfide-oxidizing bacteria at hydrocarbon seeps of the Gulf of Mexico / J. M. Larkin, M. C. Henk. // Microsc. Res. Tech. -1996. Y.33. — P. 23-31.

62. Larkin J. M. Mechanism of attachment of swarm cells of Thiothrix nivea / J. M. Larkin, R. Nelson // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 5877-5879.

63. Lee S. A survey of filamentous organisms at the Deer Island treatment plant / S. Lee, S. Basu, C. W. Tyler, P. A. Pitt // Environ. Technol. 2003. -V. 24.-P. 855-865.

64. Liu W. N. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA / W. N. Liu, T. L. Marsh, H. Cheng, L. J. Forney // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 4516-4522.

65. Lueders T. Archaeal Population Dynamics during Sequential Reduction Processes in Rice Field Soil / T. Lueders, M. Friedrich // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 2732-2742.

66. Luna G. M. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments / G. M. Luna, A. Dell'Anno and R. Danovaro // Environ. Microb. 2006. - V. 8. - P. 308-320.

67. Macalady L. Dominant Microbial Populations in Limestone-Corroding Stream Biofilms, Frasassi Cave System, Italy / L. Macalady, E. H. Lyon, B. Koffman, L. K. Albertson, K. Meyer // Appl. Environ. Microbiol. 2006. -V. 72.-P. 5596-5609.

68. Maier S. Description of Thioploca ingrica sp. nov., nom. rev. / S. Maier // Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. - V. 34. - P. 344-345.

69. Mannisto M. K. Bacterial communities in Arctic fields of Finnish Lapland are stable but highly pH-dependent / M. K. Mannisto, M. Tiirola and M. M. Haggblom // FEMS Microbiol. Ecol. 2007. - V. 59. - P. 452-465.

70. Marsch T. L. Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism analysis program, a web-based research tool for microbial community analysis / T. L. Marsch, P. Saxman, J. Cole, J. Tiedje // Appl. Environ. Microbiol. -2000. V. 66.-P. 3616-3620.

71. Martinez-Romero E. Dinitrogen-fixing Prokaryotes / M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K. H. Schleifer, E. Stackebrandt // The Prokaryotes, 3rd edn. New York: Springer-Verlagl, 2006. - V. 2. Part 1. - P. 793-817.

72. McHatton S. C. High nitrate concentrations in vacuolate, autotrophic marine Beggiatoa spp // S. C. McHatton, J. P. Barry, H. W. Jannasch, D. C. Nelson // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 954-958.

73. Medlin L. The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions / H. J. Elwood, S. Sticke, M. L. Sogin // Gene. -1988.-V. 71.-P. 491-499.

74. Miller D. N. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples / D. N. Miller, J. E. Bryant, E. L. Madsen, W. C. Ghiorse // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -V. 65.-P. 4715-4724.

75. Moissenet D. DNA Fingerprinting of Ralstonia paucula by infrequent-restriction-site PCR and randomly amplified polymorphic DNA analysis / D. Moissenet, V. Hoang, Y. Benzerara and G. Arlet // J. Clin. Microbiol. -2003. V. 41. - P. - 5747-5749.

76. Moissl C. Natural Communities of Novel Archaea and Bacteria with a String-of-Pearls-Like Morphology: Molecular Analysis of the Bacterial Partners / C. Moissl, C. Rudolph, and R. Huber // Appl. Environ. Microbiol. -2002.-V. 3.-P. 933-937.

77. Morris H. E. Quantitative determination of elemental sulfur in aromatic hydrocarbons / H. E. Morris, R. F. Lacombe, W. H. Lane // Anal. Chem. -1948.-V. 20.-P. 1037-1039.

78. Moss J. Stability and change in estuarine biofilm bacterial community diversity / J. Moss, A. Nocker, J. Lepo and R. Snyder // Appl. Environ. Microbiol. 2006. -V. 72. - P. 5679-5688.

79. Mulder E.G. Investigation on th q Sphaerotilus-Leptothrix group/ E. G. Mulder W. L. van Veen / Ant. Leeuvenhoek // J. Microbiol. Serol. 1963. - V. 29. - P. 121-153.

80. Mussmann M. Phylogeny and distribution of nitrate-storing Beggiatoa spp. in coastal marine sediments / M. Mussman, H. N. Shulz, B. Strotmann, T. Kjaer, L. P. Nielsen, R. A. Rossello-Mora, R. I. Amann, B.

81. B. Jorgensen // Environ. Microbiol. 2003. - V. 5. - P. 523-533.

82. Nei M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases / M. Nei & W. H. Li // Proc. Natl. Acad. Sei. U S . 1979. - V. 76. - P. 5269-5273.

83. Nelson D. C. Characterization of large, autotrophic Beggiatoa spp. abundant at hydrothermal vents of the Guaymas Basin (Gulf of California, USA) / D. C. Nelson, C. O. Wirsen, H. W. Jannasch // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V. 55. - P. 2909-2917.

84. Nelson D. C. Light responses of Beggiatoa / D. C. Nelson, R. W. Castenholz // Arch. Microbiol. 1982. -V. 737. - P. 146-155.

85. Nelson D. C. The Genus Beggiatoa/D. C. Nelson // The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications. -N.Y., 1992.-Vol. 4. -P. 3171-3180.

86. Nelson D. C. Use of reduced sulfur compounds by Beggiatoa sp. / D.

87. C. Nelson, R. W. Castenholz // J. Bacteriol. 1981. - V. 747. -P. 140-154.

88. Nelson D. C. Growth pattern and yield of a chemoautotrophic Beggiatoa sp. in oxygen-sulfide microgradients / D. C. Nelson, B. B. Jorgensen, N. P. Revsbech // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. -P. 225-233.

89. Nielsen P. H. Studies on the in situ physiology of Thiothrix spp. present in activated sludge / P. H. Nielsen, M. A. de Muro and J. L. Nielsen // Environ. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 389-398.

90. Nishino M. Dense mats of Thioploca, gliding filamentous sulfur-oxidizing bacteria in Lake Biva, central Japan / M. Nishino, M. Fukui, T. Nakajima // Water. Res. 1998. - V. 32. - P. 953-957.

91. Nogales B. Bacterial diversity, composition and dynamics in and around recreational coastal areas / B. Nogales, M. M. Aguiló-Ferretjans, C. Martín-Cardona, J. Lalucat, R. Bosch // Environ. Microb. 2007. - V. 9 -P. 1913-1929.

92. Nogales B. Marine microbial communities are exposed to a number of habitat disturbances including exposure to pollution / B. Nogales, M. Aguiló-Ferretjans, C. Martín-Cardona, J. Lalucat and R. Bosch // Environ. Microbiol. 2007. - V. 9. - P. 1913-1929.

93. Odintsova E.V. Chemolithoautotrophic growth of Thiothrix ramosa / E. V. Odintsova, A. P. Wood, D. P. Kelly // Arch. Microbiol. 1993. - V. 160.-P. 152-157.

94. Olive D. M. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms / D. M. Olive, P. Bean // J. Clin. Microbiol. 1999.-V. 25.-P. 1661-1669.

95. Owen R. J. The thermal denaturation of partly purified bacterial deoxyribonucleic acid and its taxonomic applications / R. J. Owen, S. P. Lapage // J. Appl. Bacteriol. 1976. - V. 41. - P. 335-340.

96. Pace N. R. New perspective on the natural microbial world: molecular microbial ecology / N. R. Pace // ASM News. 1996. - V. 62. -P. 463-^70.

97. Pellegrin V. Morphological and Biochemical Properties of a Sphaerotilus sp. isolated From Paper Mill Slimes/ V. Pellegrin, S. Juretshko //Appl. Environ. Microbiol.- 1999.-V. 65.-P. 156-162.

98. Polz M. F. Phylogenetic analysis of a highly specific association between ectosymbiotic, sulfur-oxidizing bacteria and a marine nematode / M. F. Polz, D. L. Distel, B. Zarda, R. Amann, H. Felbeck, J. A. Ott and C.

99. M. Cavanaugh // Appl. Envoron. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 44614467.

100. Polz M. F. Trophic ecology of the massive aggregations of the hydrothermal vent shrimp Rimicaris exoculata / M. F. Polz, J. J. Robinson, C. M. Cavanaugh, C. L. Van Dover // Limnol. Oceanorg. 1998. - V. 43. -P. 1631-1638.

101. Pouwels D. DNA techniques provide reliable, reproducible, and indisputable characterization of microorganisms used in food fermentations and other application / D. Pouwels, G. Simons // Foodtecgnology. 2001. -V. 57. - P. 82-86.

102. Reysenbach A. Novel Bacterial and Archaeal lineages from an In Situ growth chamber deployed at a Mid-Atlantic Ridge Hydrothermal vent / A. Reysenbach K. Longnecker, J. Kirshtein // Appl. Environ. Microbiol. -2000. V. 9. - P. 3798-3806.

103. Robertson L. A. Genus II Thiovulum Hinze 1913 / L. A. Robertson, et. al. // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. 2005. - V. 2.Part B. - P. 1189-1191.

104. Robertson L. A. The colorless sulfur bacteria / L. A. Robertson, J. G. Kuenen// Prokaryotes. 3nd ed. New York: Spinger, 2006. - V. 2. - P. 9851011.

105. Rossello-Mora R. The species concept for prokaryotes / R. Rossello-Mora, R. Amann // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - V. 25. - P. 39-67.

106. Roy A. B. The biochemistry of inorganic compounds of sulphur / A. B. Roy, P. A. Trudinger. Cambridge, 1970. - P. 73-75.

107. Safade T. L. Tackling the slime problem in a paper-mill / T. L. Safade // Paper Technol. Ind. 1988. - P. 280-285.

108. Savelkoul P. H. Amplified-fragment length polymorphism analysis: the state of an art / P. H. Savelkoul, H. J. Aarts, J. de Haas, L. Dijkshoorn // J Clin Microbiol. 1999.-V. 37.-P. 3083-3091.

109. Schulz H. N. Big bacteria / H. N. Schulz, B. B. Jorgensen // Ann. Rev. Microbiol.-2001.-V. 55.-P. 105-137.

110. Schulz H. N. Community structure of filamentous, sheath-building sulfur Bacteria, Thioploca spp., off the coast of chile / H. N. Schulz, B. B. Jorgensen, H. A. Fossing, N. B. Ramsing // Appl. Environ. Microbiol. -1996. V. 62. - P. 1855-1862.

111. Schulz H. N. Dense population of a giant sulfur bacterium in Namibian shelf sediments / H. N. Schulz, T. Brinkhoff, T. G. Ferdelman, M.

112. Hernandez Marine, A. Teske // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - V. 49. - P. 1325-1326.

113. Schwartz E. Bacterial community structure correlates with decomposition parameters along a Hawaiian precipitation gradient / E. Schwartz, K. Adair, E. Schuur // Soil Biology & Biochemistry. 2007. - V. 39.-P. 2164-2167.

114. Siering P. L. Phylogeny of the Sphaerotilus-Leptothrix group inferred from morphological comparison, genomic fingerprinting and 16S ribosomal DNA sequence analyses / P. L. Siering, W. C. Ghiorse // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. - V. 46. - P. 173-182.

115. Skerman V. B. D. Approved Lists of Bacterial Names / V. B. D. Skerman, V. McGowan and P. H. A. Sneath // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. -V. 30.-P. 225-420.

116. Skerman V. B. Intracellular deposition of sulfur by Sphaerotilus natans / V. B. Skerman, D. G. Dementjeva and B. J. Carey // J. Bacteriol. -1957.-V. 73.-P. 504-512.

117. Smalla K. Bacterial diversity of soils assessed by DGGE, T-RFLP and SSCP fingerprints of PCR-amplified 16S rRNA gene fragments: Do thedifferent methods provide similar results?/ K. Smalla et al. // J. Microb. Methods. 2007. - V. 69. - P. 470-479.

118. Snaidr J. Phylogenetic analysis and In Situ identification of Bacteria in activated sludge / J. Snaidr, R. Amann, I. Huber, W. Ludwig and K. H. Schleifer // Appl. Envir. Microb. 1997. - V. 63. - P. 2884-2896.

119. Spear J. R. Hydrogen and bioenergetics in the Yellowstone geothermal ecosystem / J. R. Spear, J. J. Walker, T. M. McCollom and N. R. Pace // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. - V. 102. - P. 2555-2560.

120. Stackebrandt E. Handbook of new bacterial systematics / E. Stackebrandt, W. Liesack. London: Academic Press.: Nucleic acids and Classification, 1994.-P. 152-194.

121. Stackebrandt E. Report of the ad hoc committee for the reevaluation of the species definition in bacteriology / W. Frederiksen, G. M. Garrity, P. A. Grimont // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - V. 52. - P. 1043-1047.

122. Stackebrandt E. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology / E. Stackebrandt, B. M. Goebel //Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - V. 44. - P. 846-849.

123. Stackebrandt E. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards / E. Stackebrandt, J. Ebers // Microbiol. Today. 2006. - V. 33. -P. 152-155.

124. Stewart W. D. P. Acetylene reduction by nitrogen fixing blue-green algae / W. D. P. Stewart, G. P. Fitzerald and R. H. Burris // Arch. Microbiol. 1968. - V. 62. - P. 336-348.

125. Stokes, J. L. Studies on the filamentous sheathed iron bacterium Sphaerotilus natans / J. L. Stokes // J. Bacteriol. 1954. - V. 67. - P. 278291.

126. Strohl W. R. Heterotrophic carbon metabolism by Beggiatoa alba / W. R. Strohl, G. C. Cannon, J. M. Shively, H. Gude, L. A. Hook, C. M. Lane and J. M. Larkin//J. Bacteriol. 1981. -V. 148. - P. 572-583.

127. Takeda M. Purification and properties of an enzyme capable of degrading the sheath of Sphaerotilus natans / M. Takeda, K. Iohara, S. Shinmaru, I. Suzuki, J. Koizumi // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 4998-5004.

128. Takeda M. Structure of the polysaccharide isolated from the sheath of Sphaerotilus natans / M. Takeda, T. Nakamori, M. Hatta // Int. J. Biol. Macromol. 2003. - V.33. - P. 245-250.

129. Teske A. Phylogeny of Thioploca and related filamentous sulfide-oxidizing bacteria / A. Teske, N. B. Ramsing, J. Kuever, H. Fossing // Syst. Appl. Microbiol.- 1995.-V. 18. P. 517-526.

130. Tourova T. P. Phylogenetic study of haloanaerobic bacteria by 16S rRNA sequences analysis / E. S. Boulygina, T. N. Zhilina, G. A. Zavarzin // System. Appl. Microbiol. 1995. -V. 18. - P. 189-195.

131. Unz R. F. Genus Thiothrix Winogradskii 1882 / R. F. Unz , I. M. Head // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. 2005. - V. 2.PartC.-P.131-142.

132. Van de Peer Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, R. De Wachter // Comput. Appl. Biosci. — 1994.-V. 10.-P. 569-570.

133. Vandamme P. Poliphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics / P. Vandamme,B. Pot, M. Gillins // Microbiol. Rev. 1996. -V. 60.-P. 407-438.

134. Vaneechoutte M. DNA fingerprinting techniques for microorganisms / M. Vaneechoutte // Mol. Biothechnol. 1996. - V. 6. - P. 115-142.

135. Ventura, R. Zink // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 75177522.

136. Versalovic J. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteriaband application to fingerprinting of bacterial genomes / J. Versalovic, T.

137. Koeuth and J. R. Lupski // Nucleic. Acids. Res. 1991. - V. 19. - P. 68236831.

138. Versalovic J. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction / J. Versalovic, M. Schneider, J. R. Lupski // Meth. Cell. Mol. Biol. 1994. - V. - P. 25-40.

139. Vos P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans // Nucleic. Acids. Res. 1995. - V. 23. - P. 4407-4414.

140. Wanner Y. Identification of filamentous microorganisms from activated sludge - a compromise between wishes, needs and possibilities / Y. Wanner, P. Gray // Water. Res. - 1989. - V. 23. - P. 889-891.

141. Wayne L. G. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematic / L. G. Wayne et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. - V. 37. - P. 463-464.

142. Wenying J. New approach to phylogenetic analysis of the genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences / Wenying J. , L. Zhu and X. Dong // Int. J. Syst. Evol. Microb. 2001. - V. 51. - P. 16331638.

143. Widmer F. Analysis of nifH gene pool complexity in soil and litter at a douglas fir forest site in the Oregon Cascade Mountain Range / F. Widmer,

144. B. TV Shaffer, L. A. Porteous and R. J. Seidler // Appl. Envir. Microb. -1999; V. 65. - P. 374-380.

145. Williams T. M. Filamentous sulfur bacteria of activated sludge: characterization of Thiothrix, Beggiatoa and Eikelboom type 02IN strains / T. M. Williams. R. F. Unz // Appl. Environ. Microbiol. 1985. -V. 49; - P. 887-898.

146. Wilson I. G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification / I. G. Wilson // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 3741-3751.

147. Yamamoto S. Phylogenetic structure of the genus Acinetobacter * based on gyrB sequences: comparison with the grouping by DNA — DNA hybridization / S. Yamamoto, J. M. Bouvet and S. Harayama // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - V. 49. - P. 87-95.

148. Yoon J. H. Polaribacter dokdonensis sp. nov., isolated from seawater / J. H. Yoon, S. J. Kang and Т. K. Oh // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. -V.56.-P. 1251-1255.

149. Zhou J. DNA Recovery from soils of diverse composition / J. Zhou, M. A. Bruns and J. M. Tiedje // Appl. Environ. Microbiol. 1996. -V. 62. -P. 316-322.

150. Zhu X. Y. 16S rRNA-Based Analysis of Microbiota from the Cecum of Broiler Chickens / X. Y. Zhu, T. Zhong, Y. Pandya, and R. D. Joerger // Appl. Microbiol. 2002. -V. 1. P. 124-137.

151. Zopfi J. Ecology of Thioploca spp.: nitrate and sulfur storage in relation to chemical microgradients and influence of Thioploca spp. on the sedimentary nitrogen cycle / J. Zopfi et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2001. V. 67. - P. 5530-5537.

152. Агре H. С. Систематика термофильных актиномицетов / H. С. Агре. Пущино: Изд-во ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1986. - С. 132.

153. Блохина И. Н. Систематика бактерий (с основами геноситсематики) / И. Н. Блохина, А. С. Антонов. — Ниж. Новгород: Изд-во НГУ, 1992.-С. 152

154. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии / Ф. Герхардт и др. -М: Мир, 1984. Т. 3. - С. 10-46.

155. Грабович М. Ю. Биоразнообразие бесцветных серобактерий: таксономия, метаболизм и его регуляция // Автореф. дис. . док. биол. наук. Саратов, 2005. С. 45.

156. Гриднева Е. В. Экофизиология представителей рода Sphaerotilus- обитателей термальных сульфидных источников Северного Кавказа / Е. В. Гриднева, М. Ю. Грабович, Г. А. Дубинина, Е. Ю. Черноусова и, В. Н. Акимов // Микробиология 2009. - Т. 78. - С. 76-83.

157. Дубинина Г. А. Бесцветные серобактерии. Хемосинтез. К 100 -летию открытия С.Н. Виноградским / Г. А. Дубинина. М: Наука, 1989.-С. 75-100.

158. Дубинина Г. А. Выделение и таксономическое изучение бесцветных серобактерий рода Thiodendron / Г. А. Дубинина, Н. В. Лещева, М. Ю. Грабович // Микробиология. — 1993. Т. 62. - С. 717— 732.

159. Дулов Л. Е. Микробиологические процессы на гидротермальном поле Лост Сити, Срединно-Атлантический хребет / Л. Е. Дулов, А. Ю. Леин, Г. А. Дубинина, Н. В. Пименов // Микробиология 2005. - Т. 74. -С. 111-118.

160. Дульцева Н. М. Thiothrix arctophila sp. nov. / H. M. Дульцева и Г. А. Дубинина // Микробиология. 1994. - Т. 63. - С. 275-281.

161. Жимулев И. Ф. Общая и молекулярная генетики/ И. Ф. Жимулев.- Новосибирск: Изд-во СГУ, 2003. С. 479.

162. Задорина Е. В. Оценка разнообразия диазотрофов в торфяной почве методом клонирования гена nifH / Е. В. Задорина, Н. В. Слободова; Е. С. Булыгина, Т. В. Колганова, И. К. Кравченко, Б. Б. Кузнецов // Микробиология. 2009. - Т. 78. - С. 252-260.

163. Земская Т. И. Экофизиологическая характеристика матообразующей бактерии Thioploca в донных осадках залива Фролиха, Северный Байкал / Т.И. Земская и др. // Микробиология. -2001.-Т. 70.-С. 391-397.

164. Иванова В. В. Сульфидные воды Кавказа и Предкавказья. Распространение сульфидных вод./ В. В. Иванова // Труды научно-исследовательского Института курортологии и физиотерапии. 1977. -С. 125.

165. Иванов П. JI. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства / П. Л. Иванов// Суд. Мед. Эксп. 1999. - №4. -С. 35-41.

166. Каравайко Г. И. Литотрофные микроорганизмы окислительных циклов серы и железа / Г. И. Каравайко, Г. А. Дубинина, Т. Ф. Кондратьева // Микробиология. 2006. - Т. 75. - С. 593-629.

167. Колганова Т. В. Подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов 16S рРНК архей / Т. В. Колганова, Б. Б. Кузнецов, Т. П. Турова // Микробиология. 2002. - Т. 71.-С. 283-286.

168. Кузнецов С. И. Методы изучения водных микроорганизмов/ С. И. Кузнецов, Г. А. Дубинина. М.: Наука, 1989. - С. 286.

169. Лавриненко К. С. Особенности серного метаболизма и филогенетический анализ хроматограмм нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA у Azospirillum thiophilum sp. nov. / К. С. Лавриненко, Е. В. Черноусова, Е. В. Гриднева, О. О. Логинова, В.

170. М. Сыров, М. Ю. Грабович // The sorbtion and chromatographic processes. 2009. - Т. 9. - С. 424-432.

171. Лейбо А. И: Исследование влияния концентрации водорода на структуру сообщества гидрогенотрофных метаногенов методом Т-RFLP-анализа ампликонов генов 16S рРНК / А. И. Лейбо, А. И. Нетрусов, Р. Конрад // Микробиология. 2006. - Т. 75. - С. 786-791.

172. Лопухов Л. В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л. В. Лопухов, М. В. Эйдельштейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2000. -Т. 2.-С. 92-104.

173. Наградова Н. К. Внутриклеточная , регуляция формирования нативной пространственной структуры белков / Н. К. Наградова // Соровский образовательный журнал. 1996. - № 7. — С. 10-18.

174. Назина Т. Н. Микробиологические исследования высокотемпературных нефтяных пластов залежи Кондиан в связи с испытанием биотехнологии повышения нефтеизвлечения / Т. Н. Назина и др. // Микробиология. 2007. - Т. 76. - С. 329-339.

175. Намсараев Б. Б. Бактериальный синтез и деструкция органического вещества в микробиальных матах озера Байкал / Б. Б. Намсараев и др. // Микробиология. 1994. - Т. 63. - С. 344-351.

176. Одинцова Е. В. Новая бесцветная нитчатая серобактерия Thiothrix ramosa sp. nov. / E. В. Одинцова, Г. А. Дубинина // Микробиология. 1991. - Т. 59. - С. 437-445.

177. Одинцова Е, В. Роль восстановленных серных соединений в метаболизме Thiothrix ramose / Е. В. Одинцова, Г. А. Дубинина // Микробиология. 1993. - Т. 62. - С. 213-222.

178. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы / Л. И. Патрушев. М.: Наука, 2004. - С. 68-85.

179. Турова Т. П. Мультикопийность рибосомных оперонов прокариот и ее влияние на проведение филогенетического анализа / Т. П. Турова // Микробиология. 2003. - Т. 72. - С. 437-452.

180. Турова Т. П. Экология микроорганизмов / А. И. Нетрусов. М.: Академия, 2004. - С. 246-257.

181. Уильяме У. Д. Определение анионов / У. Д. Уильяме. М. : Химия, 1982.-С. 622.

182. Федоров Д. Н. Новая система вырожденных олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации nifHD генов / Д. Н. Федоров, Е. Г. Иванова, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко // Микробиология. -2008.-Т. 77.-С. 1-3.

183. Хоулт JI. Систематика прокариот / JI. Хоулт. М: Мир, 1997. -Т. 1.- С. 128-130.

184. Шагинян И. А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекции. / И. А. Шагинян // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003. - Т. 2. - С. 82-95.

Информация о работе

Черноусова, Елена Юрьевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2011
ВАК 03.02.08

Диссертация

Биоразнообразие нитчатых сероокисляющих бактерий сульфидных экосистем Северного Кавказа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы