Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Таксономия и физиология новых нитчатых серобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Таксономия и физиология новых нитчатых серобактерий"

Р Г Б ОД

На правах рукописи

1 3 МАЙ 1936

ДУЛКЦЕВА Наталья Михайловна

ТАКСОНОМИЯ Й ФИЗИОЛОГИЯ НОВЫХ НИТЧАТЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ

Специальность 03.00.07 -микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте микробиологии Российской академи

наук

Научный руководитель:доктор биологических наук Г.А. Дубинина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Е.А. Бонч-Осмоловская, кандидат биологических наук E.H. Красильникова

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится " 5 " июня 1996 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.002.64.01 в Институте микробиологии РАН по адресу; 117811, г.Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан апреля 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Л.Е.Никитин

Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии представляют одну из физиологических групп микроорганизмов, участвующих в окислительных реакциях геохимического цикла серы. Эти организмы являются важными компонентами водных биоценозов пресноводных и морских экосистем и характеризуются обильным развитием в водоемах с активными поступлениями сероводорода. Их массовое развитие сопровождается, как правило, формированием так называемых серных бактериальных матов на поверхности донных отложений или обрастаний на твердых субстратах и подводной растительности.

Изучение этой группы организмов представляет интерес в связи с уникальными свойствами ее представителей - гигантскими размерами клеток, своеобразием морфологии, разнообразием типов метаболиза.

Хотя функциональная роль бесцветных серобактерий изучена недостаточно, их участие в окислении токсичных серных соединений, прежде всего Нг5, и в создании биогеохимического барьера в водоемах на границе Н20-О2 очевидно. Отсутствие знаний о метаболических возможностях большинства известных видов серобактерий не позволяет, однако, адекватно оценить их вклад в локальные и глобальные циклы серы и углерода и определить функции в различных экосистемах. Проблема охраны окружающей среды от токсичных соединений становится весьма актуальной вследствие возрастающего антропогенного загрязнения. В связи с этим дальнейшее изучение биоразнообразия серобактерий представляет большой научный интерес. Прикладные аспекты их изучения диктуются возможностью использования серобактерий для удаления загрязнения серными соединениями антропогенных систем: промышленных и бытовых сточных вод, воздушной среды производственных помещений и других объектов.

Значительный интерес среди бесцветных серобактерий представляют нитчатые серобактерии рода ТШоЬЪг1к. Интерес к этим микроорганизмам связан с рядом биологических особенностей: наличием сложного жизненного цикла, большим разнообразием ранее описанных "морфологических" видов, способностью к формированию эпифитных обрастаний. Их массовое развитие обнаружено не только в природных экосистемах, но и в очистных сооружениях, где они вызывают так называемое "вспучивание" активного ила и, несомненно, выполняют важную функцию устранения сероводородного загрязнения среды обитания.

Цель работы. Изучение таксономии, физиологии, метаболизма, функциональной роли в водных экосистемах нитчатых серобактерий морфологически сходных с ТЫоЬЬг1х .

Задачи работы :

1. Выделение чистых культур нитчатых сербактерий рода Thlothrl?. из пресноводных и морских местообитаний.

2. Изучение морфологических, физиолого-биохимических, ультраструктурных и генотипических особенностей выделенных штаммов.

3. Исследование механизмов окислительных реакций и ферментов, участвующих в метаболизме неорганических соединений серы.

4. Изучение особенностей углеродного метаболизма и его связи с окислением серных соединений.

5. Определение метаболической активности Thlothrlx в природных экосистемах на примере бухты Кратерная ( Курильские о-ва, Тихий океан).

Научная новизна и практическая значимость работы.

Из бытовых и промышленных сточных вод выделены три штамма нитчатых бесцветных серобактерий, которые отнесены к новому виду родг Thiothrix - Т.arctophíla. Из морских эпифитных обрастаний выделень семь штаммов нитчатых серобактерий, морфологически сходных с Thiothrix. Таксономическое изучение выделенных штаммов позволило обосновать их принадлежность к нитчатым бактериям рода Leucothrix,ранее не относимых к серобактериям,и описать новый вид - L. thiophila. Сравнительный анализ 16S- рРНК известных видов родов Thiothrix и Leucothrix и новых изолятов показал, что штаммы L. thiophila составляю! единую филогенетическую ветвь с единственным видом рода Leucothrix -L. mucor, эволюционно обособленную от рода Thiothrix. Новый вид Т. arctophíla филогенетически наиболее близок к недавно описанному вид} Г. ramosa (Одинцова, Дубинина, 1990) в пределах достаточно обособленной ветви представителей рода Thiothrix. Оба вида входят в состав гамма подгруппы протеобактерий.

У выделенных новых- видов исследован механизм окисления восстановленных соединений серы. С помощью ингибиторного анализа и определения специфических ферментов серного метаболизма показано, что тиосульфат принимает участие в катаболических реакциях по механизм; окислительного и субстратного фосфорилирования.

Впервые исследованы ферменты углеродного метаболизма в сравнительном плане при органогетеротрофном и литогетеротрофном росте нитчатых бактерий. Показано одновременное функционирование ЦТК и г ли-оксилатного цикла. Отличительной особенностью ферментов ЦТК у новы:

видов является низкая активность дегидрогеназ. Перестройка ферментативной активности при переходе от органо- к литотрофии заключается в резком снижении активности гидратаз в ЦТК и направлении потока восстановительного эквивалента ( НАДН, НАДФНг ) в глиоксилатный цикл на биосинтетические процессы.

Показано массовое развитие зпифитных нитчатых серобактерий, морфологически сходных с ТЫоЬЬг1х, на литорали Белого моря и в районе гидротермальных выходов бухты Кратерная в Тихом океане. В эпифитной популяции нитчатых серобактерий могут доминировать как виды рода ТМоЬЬПх, так и новые сероокисляющие бактерии рода ЬеисоЬЪ-г1к. Обнаружены низкие скорости фиксации СОг популяцией морских зпифитных серобактерий в бухте Кратерная, что свидетельствует о гетеротрофном метаболизме и их участии в аэробной деструкции органического вещества. Результаты определения скорости окисления Н20 и тиосульфата в сообществе зпифитных нитчатых серобактерий показали, что ТЫо-ЪЬг1х при литогетеротрофном росте достаточно активно окисляет серные соединения и, выполняя роль барьера, препятствут диффузии сероводорода гидротермального происхождения в водную толщу. Полученные результаты важны для понимания роли нитчатых серобактерий в биогеохимическом цикле серы и углерода, а также для оценки их вклада в процессы окисления токсичных соединений серы и в сохранении благоприятного биологического режима водоемов.

Результаты исследований расширяют представления о биоразнообразии бесцветных серобактерий, их таксономическом составе и многообразии метаболических возможностей.

Полученные в работе результаты могут быть использованы при составлении определителей бактерий, для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, а также в биотехнологических исследованиях для очистки среды от токсичных соединений серы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на совместном заседании лабораторий нефтяной микробиологии, микробной трансформации минералов и лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН,1985г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 1 тезисы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 11-ти глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 1ЧЧ страницах машинописного текста, включая 16 таблиц и 18 ри-

сунков. Список литературы содержит бН отечественных и 116 иностранных наименований работ.

Место проведения работ. Работа проведена в Институте микробиологии РАН ( Заведующий лабораторией - доктор биологических наук В.М. Горленко). Исследование генотипических свойств бактерий проводили совместно с ст. н. сотрудником ИНМИ РАН к. б.н. A.M. Лысенко. Анализ 16S- рРНК выполнен доктором F. Rainey из DSM (Германия). Изучение ультраструктуры клеток проводили совместно с сотрудником ИНМИ РАН H.A. Кострикиной. Активность ферментов серного и углеродного метаболизма изучали совместно с М.Ю. Грабович (ВГУ). Автор приносит им искреннюю благодарность.

Сокращения, используемые в тексте: ЦТК - цикл трикарбоновых кислот. ЭТЦ - электронтранспортная цепь, ЩМ - цитоплазматическая мембрана, АТФ - аденозинтрифосфорная кислота, РДФК - рибулезо-дифос-фаткарбоксилаза, НАДНг - никотинамиддинуклеотид восстановленный, АФС-редуктаза- аденозинфосфосульфат-редуктаза, ТТФА - теноилтрифлуо-роацетон, СССР - карбонил- цианид- хлорофенилгидразон, ИДГ - изоцит-ратдегидрогеназа, СДГ - сукцинатдегидрогеназа, МДГ - малатдегидроге-наза, NEM - N-этилмалеимид, HQNO - 2-гептан-4-гидрохинолин-N-оксид, ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.

Объекты и методы исследования

Работа проводилась с тремя штаммами нитчатых бесцветных серобактерий рода Thiothrix и семью штаммами морских нитчатых серобактерий, четыре из которых отнесены к новому виду рода Leucothrix. Бактерии выделены нами совместно с Г.А. Дубининой. Для сравнительных целей использовали Г. ramosa штамм 2 из коллекции ИНМИ РАН и Leucothrix mucor 2157 из DSM (Германия).

Для выделения пресноводных бактерий рода Thiothrix применяли среду Вильямса и Унза (Williams, Unz, 1985), в которую вносили в качестве источника углерода лактат Na и ацетат Na по 0,1 г/л. Во все среды добавляли микроэлементы и витамины.

Для выделения морских бактерий Leucothrix использовали среду следующего состава, г/л: (NH4)2S04-0,1; CaCl2'2H20-0,2; MgClg'SH^O-5,4; NaCl-20,0. К среде добавляли витамины и микроэлементы, 0,15 М раствор калий-фосфатного буфера с pH 7,2 - 7,4 - 10 мл и 10% растворы ЫаНСОз- 1 мл, Na2S2Ü3'5Н2О- 10 мл, лактат Na - 2 мл. Начальное значение pH среды 7,6 - 7,8.

Морфологию бактерий исследовали в фазово-контрастном микроскопе

-2 фирмы "Zeiss" и трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100C.

Жизненный цикл штаммов Thiothrix и Leucothrlx изучали путем зледовательного наблюдения в фазово-контрастном микроскопе ва яьтурой, растущей в жидкой среде. Ультратонкую структуру клеток следовали на срезах, изготовленных по методу Ритер и Келенбергер /ter, Kelenberger, 1958), в электронном микроскопе JEM- 100С при теряющем напряжении 80 кВт.

Физико-химические и биохимические методы анализа. Белок клеток эеделяли методом Брэдфорда с Кумаси синим 6-250 (Bradford,1976), и отдельных случаях-методом Лоури (Lowry et. al., 1951). Суспензию зток получали путем центрифугирования культуры при 6000g, 4°С в 1ение 30 минут. Клеточные экстракты получали разрушением бактерийных клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН- 2Т при дности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2 мин. в ледяной бане, зернатант получади после центрифугирования клеточных экстрактов г 9000g в течение 30 мин. при 4°С. Скорость потребления кислорода ^истрировали на самопишущем полярографе П4-1. Регистрацию поляро-амм производили по общепринятой методике (Шольц, Островский, 1975). гщентрацию кислорода в пробе вычисляли по таблице (Франк, 1973). ацентрацио сероводорода в пробах определяли методом иодометричес-го титрования (Резников и др., 1963) и спектрофотометрически (Мас-reth et. al.,1978), растворенного кислорода - методом Винклера. эсульфат,тетратионат и тритионат при совместном присутствии опре-аяли цианолитическим методом (Kelly et. al., 1969), концентрацию i2~- хлоранилатнкм методом (Уильяме, 1982), элементной серы - мо-£ицированным сульфитным методом Морриса (Компанцева, 1985), тетра-эната - сульфитным методом .

Исследование влияния восстановленных соединений серы на ско-2ть фиксации углекислоты в культурах проводили в опытах с NaH14C03, ределяя включение 14С в биомассу в динамике в течение 8-и суток, а этом использовали варианты сред с тиосульфатом и без тиосульфата, ределение общего количества углерода карбонатов и углекислоты (С рб.) проводили прямым титрованием. Интенсивность декарбоксилирова-ï органических кислот в суспензии клеток определяли в среде инку-ши следующего состава: 0,05 M калийфосфатный буфер (pH 7,0), раз-чные субстраты (сукцинат, малат) в концентрации 100 мг/л и, соот-гственно, меченые по карбоксильной группе субстраты с конечной ак-вностью 3"10б имп./(мин.■мл). В стеклянные сосудики вносили 1 мл

среды инкубации и добавляли 0,2 ш суспензии клеток бактерий (0,3 мг белка). Инкубацию проводили в течении 1 часа. Об активности процессе декарбоксилирования судили по количеству 14 СОг, который улавливал! моноэтаноламином в специальных сосудиках, а затем измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике СБС - 2. Эту работу проводит совместно с М.Ю.Грабович (ВРУ).

Методы геносистематики. Определение содержания ГЦ в ДНК проводили совместно с А.М.Лысенко (ИНМИ РАН) по температуре плавления ДШ методом Мармура (Marmur, 1961). Уровень гомологии ДНК определяли методом мембранных фильтров (Evtushenko et. al., 1989; Maniatue et. al-, 1994) и методом оптической реассоциации (De Ley et. al., 1970; GillIs et. al., 1970). Анализ 16S- pPHK проводили совместно с F.Rai-ney (Германия).

Методы определения ферментативной активности.

Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла определял! спектрофотометрически на СФ--26 ( Yelger et. al., 1969; Романова, 1980; Bacon et. al., 1978; Землянухин и др., 1986; Miernyk et. al.. 1979).

Определение активности ферментов, участвующих в превращении соединений серы.

Активность роданазы определяли по видоизмененной методике Cop6¡ (Sorbo, 1955) в супернатанте по образованию тиоцианата колориметрическим методом при Я= 460 (Bowen et. al., 1965).

Активность серооксигеназы определяли в супернатанте по скорост) образования тиосульфата из серы и сульфита (Suzuki, Silver, 1966 Silver, Lindgren, 1968). Приготовление элементной коллоидной cepi осуществляли по методу Сузуки (Suzuki, Silver, 1966). Образовавшие) тиосульфат определяли иодометрическим титрованием.

Активность тиосульфатоксидазы (Rolls, Lindstrom, 1967), суль-фитоксидазы (Петушкова, Ивановский, 1976) определяли в супернатант' спектрофотометрически по восстановлению феррициаяида или по скорост: восстановления цитохрома с в присутствии окисляемого субстрата. Вое становление феррицианида регистрировали на двухдучевом спектрофото метре при Л =420 нМ, цитохрома с - при А =550 нм.

АФС-редуктазу определяли в реакционной смеси того же состава как и для сульфитоксидазы, но с добавлением АШ - 1 мкМ (Peck et al., 1965).

Активность тиосульфатредуктазы определяли в супернатанте п

скорости образования сероводорода из тиосульфата в присутствии восстановителя дитиотреитола (Петущкова, Ивановский, 1976; Hashma, 1972). Реакцию проводили в сосудах Варбурга без удаления воздуха в гечение 10 минут при 37°С (Петущкова, Ивановский, 1976). В качестве янгибитора тиосульфатредуктазы использовали сульфит. Выделившийся сульфид определяли колориметрическим методом с диметил-л-фениленди-амином.

Активность сероредуктазы определяли по скорости образования сероводорода из экзогенной элементной серы. Для опыта использовали от-штую суспензию клеток бактерий из логфазы роста. Опыт проводили в аэробных условиях.

Определение скорости фиксации 14€0г и скорости окисления восстановленных соединений серы популяцией Thiothrix бухты Кратерная проводили в опытах с меченым 353-сульфидом натрия и параллельно с 35S-тиосульфатом натрия. Определяли активность включения метки в элементную серу , накапливаемую внутриклеточно. Аналитическими методами определяли убыль вносимых субстратов и рассчитывали скорость их окисления. В параллельных пробах определяли скорость фиксации углекислоты с использованием радиоактивного углерода NaH14C03. Инкубацию проб с введенным в них ЫаН14С0з осуществляли в условиях in situ в течение 3 - 8 ч. Радиоактивность меченых продуктов в пробах измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика Рак-Бэта (Швеция). Зная содержание исходного белка клеток и количество фиксированной углекислоты, рассчитывали процент фиксации СОг на единицу биомассы Thiothrix.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Выделение и характеристика нитчатых бесцветных серобактерий.

1.1.Выделение нитчатых серобактерий. В качестве материала для выделения бактерий рода Thiothrix использовали обрастания на гальке. первичного аэрофильтра очистного сооружения и эпифитные обрастания на Zostera с литорали Белого моря, в которых преобладали нитчатые бактерии, морфологически сходные с Thiothrix. Было выделено три штамма бактерий из сточных вод и семь штаммов морских бактерий.Морские штаммы отнесены нами, как показано далее, к роду Leucothrix.

1.2.Характеристика нитчатых бесцветных серобактерий рода Thiot-

hrix.

Строение и жизненный цикл. Выделенные штаммы Thiothríx характеризуются сходным строением, способами размножения и наличием сложного цикла развития. Физиологические различия штаммов также незначительны. Низке приводится характеристика штамма 1N.

Многоклеточные неподвижные нити. Толщина клеток варьирует по длине трихома от 0,7 до 2,6 мкм,длина клеток - 3,0 - 5,0 мкм.Клетки грамотрицательные. Длина нитей в поздней стационарной фазе роста культур может достигать сотен микрометров. Нити окружены чехлом толщиной до 100 нм.

Размножение клеток в нитях происходит путем поперечного деления. При этом наружный слой клеточной стенки, общий для всего трихома, не участвует в делении. Размножение нитей происходит двумя способами. Первый - с помощью отшнуровывания гонидий на апикальном конце нитей,1 реже гонидии освобождаются с обоих концов неприкрепленных нитей. Размеры гонидий: 3-5 мкм длиной, 1,3-2 мкм толщиной. Гонидии способны к медленному передвижению скольжением. Второй способ размножения, характерный для рода Beggiatoa и обнаруженный только у Т. ramosa, состоит в сегментировании всей нити на короткие отрезки -гормогонии. Гормогонии, как правило, состоят из двух-четырех клеток. Гормогонии также способны к предвижению скольжением.

В цитоплазме обнаружены включения полифосфатов, поли-^-оксимас-ляной кислоты и элементной серы.

Штамм 1N характеризуется наличием сложного жизненного цикла. В начале экспоненциальной фазы роста в культуре преобладают неподвижные длинные нити. Способность к образованию розеток выражена слабо. В середине экспоненциальной фазы на 2 - 3 сутки происходит массовое образование гонидий, а также гормогониев. К концу экспоненциальной и началу стационарной фаз в культуре преобладают длинные нити и розетки. Розетки могут быть сформированы из отдельных нитей разной длины, а также гонидий или гормогониев. В основании розеток, а иногда на базалыгом конце нитей имеется прикрепительный диск. Морфологически штамм 1N незначительно отличается по размерам клетки от Г. ramosa, но имеет более крупные клетки, чем типовой вид Г.nivea и другие изоляты {штаммы Al, A3, I, Q, ТНЗ, ТН1) ( Larkin, 1980; Larkln, Shinabargèr, 1983; Williams, Unz, 1985; Одинцова, Дубинина, 1990). Кроме того, отличие от типового вида и вышеуказанных штаммов заключается и в возможности размножения нитей 2-мя способами: не только с помощью гонидий,но и горыогониями.

Физиологе-биохимические и культусальные свойства. Бактерия не астет в отсутствие органических веществ в минеральной среде с тио-/льфатом при периодическом культивировании. При росте в среде с ор-эническими веществами накопление серы в клетках происходит в среде тиосульфатом, сульфидом или элементной серой. Штамм 1Ы отличается г известных видов пониженным температурным оптимумом - 15°С. Он гасобен использовать в качестве источника углерода сукцинат, фу-арат, пропионат, лакгат, ацетат, малат, пируват, оксалоацетат, эльтозу, мелизитозу, бутанол, источника азота - аммоний, нитраты, атриты, глутамин, аланин, гидролизат казеина, пептон. В ассиммиля-аонных процессах использует в качестве источника серы сульфид, тио-/льфат, элементную серу, цистеин, метионин, сульфит, тетратионат. Элигатный аэроб, не способен использовать в качестве акцепторов яектронов сульфаты, тиосульфат, нитраты, фумарат.

Генотипические свойства. У штамма 1Н ГЦ в ДНК составляет 55 эл.%. ДНК-ДНК-гибридизация проведена с наиболее близким по свойс-вам видом Т.гтоБа штамм 2, у которого величина ГЦ в ДНК составляет 51,3 мол.%. Величина гомологии ДНК этих штаммов составляет 7-19%, что позволяет рассматривать штамм как самостоятельный вид ода ТЫо1Ъг1х. Приведен диагноз нового вида Т.агсЬорМ 1а .

1.3.Характеристика морских нитчатых серобактерий.

Строение и жизненный цикл. Семь штаммов нитчатых серобактерий орфологически различаются незначительно. Неподвижные нити состоят з клеток цилиндрической формы с четкими поперечными перегородками, яетки в составе нитей имеют оОшда наружный слой клеточной стенки, олщина нитей одинакова по всей длине. Их длина варьирует от нес-ольких мкм до сотен мкм. Клетки от 0.8 до 2,5 мкм длиной и от 0,5 о 1,0 мкм шириной, грамотрицательные. Чехлы у нитей отсутствуют, ити имеют прикрепительные диски.

Размножение клеток в нитях происходит поперечным делением, на-ужный слой клеточной стенки не участвует в делении. При росте на реде с тиосульфатом клетки содержат включения элементной серы.В ределах нити могут встречаться гигантские раздутые клетки, так на-ываемые "бульбы". Другая особенность состоит в образовании узлов в ити.что свойственно 1еисоЬЪг1х.

Выделенные штаммы характеризуются наличием сложного жизненного игла. Он заключается в способности к образованию гонидий на одном онце, либо по всей длине нити. При формировании гонидий концы кле-

ток сужаются, образуется полная клеточная стенка. Между клетками ос разуется свободное пространство, но они остаются соединенными слиз! стыми тягами. В дальнейшем нить распадается на гонидии, которые вь растают в нити. Гонидии способны к передвижению путем скольжеш толчками. Помимо гонидии, расселение нитей может происходить пук разделения нитей на гормогонии - короткие отрезки, состоящие из ж 'скольких клеток и имеющих, как и нить, общую наружную мембрану. Го{ могонии не обладают способностью к передвижению скольжением. В зав! симости от условий культивирования может преобладать первый или вгс рой способ "размножения" нитей.

Характерной особенностью всех штаммов является способность образованию розеток.

В зависимости от фазы роста, условий культивирования и штамме вых различий в культуре могут преобладать либо длинные нити, лис одиночные клетки - гонидии и очень короткие нити.

Физиодого-биохимические и культуральные свойства. Подобно 1 агсЬорЪИа морские штаммы не растут в минеральной среде с тиосульфс том при периодическом культивировании в отсутствие органических в« ществ. Накопление серы в клетках происходит в среде, содержащей ор ганические вещества, с тиосульфатом, сульфидом, элементной серой ш сульфитом. Выделенные штаммы способны использовать как источник уг лерода и энергии ограниченное число испытанных субстратов. Из оргс нических кислот рост большинства штаммов поддерживают: ацетат, малг пируват, сукцинат, фумарат, лактат, оксалоацетат, пропионат, «¿-кете глутарат. Из Сахаров отдельные штаммы используют фруктозу, сахарог рибрзу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу; из спиртов - бутанол, гл! церин, маннит; из аминокислот- аспарагин, глутамат, аланин, аспартг Все штаммы используют дрожжевой экстракт, большинство- пептон, оч дельные- крахмал. В качестве источника азота штаммы используют гщ ролизат казеина, пептон, дрожжевой экстракт, мочевину, аммонийнь азот, нитраты, аспартат, глутамат, глутамин, валин, аланин, лейцш метионин, пролин, аспарагин, глицин, фенилаланин. В конструктивна метаболизме в качестве источника серы могут использовать сульфщ сульфит, элементную серу, тиосульфат. Оптимум роста отмечен при тек пературе 20°С и солености 2,0 - 2,5% МаС1. Границы солености - 0,5 7% N301. Строгие аэробы, не способны использовать в качестве акце1 торов электронов сульфаты, тиосульфат, нитраты, фумарат.

Генотипические свойства. Все штаммы имеют очень незначительш

зличия в содержании ГЦ в ДНК - от 42,3 до 43,1 мол.% (табл.1).Бли-ое родство штаммов подтверждается результатами ДНК-ДНК- гибридиза-и. Тем не менее, по уровню гомологии ДНК семь штаммов достаточно цежно подразделяются на два кластера. Штаммы 2, 4, б и 7 составля-первый кластер, у которых сходство в полинуклеотидной последова-

Таблица 1

Генотипичеекие свойства новых нитчатых серобактерий

тамм ГЦ в ДНК мол.% 6WS 4WS Гомология ДНК, % реперные штаммы 2WS 1WS ш

А.

S 42,8 100 86 60 но но

S 42,3 89 100 64 но но

S 42,4 62 70 71 но но.

S 42,9 45 51 100 но но

S 42,8 58 61 53 100 но

S 43,1 57 53 60 но 100

S 43,0 59 42 42 но но

.ramosa 2 51,3* тисог 2157 49,8** DSM

В.

S '100

S 78 100

S 49 61 100

S 56 но но 100

5 но 62 но 62 100

S но 56 но 86 88

Примечание: А - исследование методом мембранных фильтров,

В - исследование методом оптической реассоциации ДНК, но- не определяли, * - (Одинцова, Дубинина, 1990), **- (Brock, 1981).

тельности ДНК варьирует в пределах 89-61%. В пределах второго кластера эта величина составляет 88 - 61% между штаммами 1, 3 и 5. Однако гомология ДНК штаммов первого и второго кластеров не более 42 -60%. Такие различия при достаточно близком сходстве фенотипическш признаков штаммов обеих групп не позволяют на основе имеющихся сведений надежно обосновать их различие на видовом уровне.

Для установления степени родства с представителями других родо! бактерий, наиболее близких по особенностям морфологии, наличию сложного цикла развития и некоторым физиологическим свойствам была проведена гибридизация ДНК изучаемых штаммов с Thiothrix ramosa 2 и Le-ucothrix rncor 2157. Степень гомологии ДНК этих штаммов с названными бактерииями оставила соответственно 8-11% и 9-11%.

1.4.Филогенетическое положение T.arctophila и L.thiophila.

Выл проведен сравнительный анализ 16S- рРНК выделенных новы> нитчатых серобактерий с известными видами Т. ramosa и L. тисог (рис.

1). Согласно полученным данным, штамм 6WS из первого кластера помещен в гамма-подгруппу Proteobacteria в составе единой ветви филогенетического древа вместе с L.тисог, достаточно отдаленной от Thiothrix. Штаммы первого кластера- 2WS, 4WS, 6WS и 7WS выделены в самостоятельный вид рода Leucothrix с видовым названием L. thiophila sp. nov. Приведен диагноз L. thiophila. Установление степени родства с L. thiophila штаммов второго кластера (1WS, 3WS, 5WS) будет определено после анализа 16S- рРНК для этих штаммов. Как видно на рис. lä новый вид Т. arctophíla наиболее близок к недавно описанному вид} Г. ramosa в пределах достаточно обособленной ветви известных видо! рода Thiothrix.

2.Роль неорганических серных соединений в метаболизме T.arctophila и L.thiophila.

Окисление тиосульфата. Присутствие тиосульфата в среде увеличивает урожай клеток в 1,5-4 раза. Тиосульфат окисляется бактериями < накоплением в среде тетратионата, элементной серы и сульфата.

Для выяснение роли тиосульфата в метаболизме данных бактерш определяли: 1) продукты его окисления в периодической культуре;

2) ферменты, участвующие в диссимиляционных процессах окисления серных соединений; 3) связь окисления серных соединений с функционированием электронтранспортной цепи с помощью ингибиторного анализа.

Рисунок 1. Дендрограмма филогенетического древа,основанная на мнительном анализе 16S- рРНК выделенных новых нитчатых серобакте-í с известными видами Т.ramosa и L.rncor.

2.1.Определение активности ферментов серного метаболизма. При чении серного метаболизма мы сосредоточили внимание на выяснении

роли окисления серных соединений в катаболических реакциях, т.е. возможности получения энергии для жизнедеятельности. В таблице 2 суммированы результаты определения активности ферментов, участвующих в превращении серных соединений у исследуемых бактерий при росте в среде с тиосульфатом. Для сравнительных целей приведены также результаты определения ферментативной активности у других сероокисля-ющих бактерий. У обоих видов обнаружены специфические ферменты, связанные с диссимиляционными процессами окисления серных соединений-сульфит-цитохром с-оксидоредуктаза и АФС- редуктаза. Оба фермента участвуют в энергодающих реакциях, связанных с окислением сульфита до сульфата, в первом случае за счет окислительного, во втором-субс-тратного фосфорилирования. Последнее подтверждено ингибированием на 44-58% окисления сульфита в присутствии арсената - ингибитора субстратного фосфорилирования. Удельная активность перечисленных ферментов была достаточно высокой, близкой к величинам, обнаруженным у се-роокисляющих бактерий, способных к автотрофному росту (табл. 2). Как следует из приводимых результатов, у Thiothrix и Leucothrix активность АФС- редуктазы составляла 400 нмоль/'мин/мг белка и 47-147 нмоль/мин/мг белка. Такая высокая активность ферментов свойственна сероокисляющим бактериям, которые получают энергию за счет субстратного фосфорилирования.

У бактерий также обнаружена высокая активность тиосульфат- расщепляющего комплекса и роданазы, не связанных с синтезом АТФ, но их взаимодействие с 2о0з2~ приводит к образованию сульфит-иона в клетках, используемого в последующих этапах окисления.

Помимо ферментов, участвующих в реакциях окисления серных соединений, сопряженных с синтезом АТФ, в клетках изучаемых бактерий обнаружены и другие ферменты, участвующие в окислительных, либо восстановительных реакциях, непосредственно не связанных с энергетическими. К ним относятся, кроме упомянутых роданазы и тиосульфат- расщепляющего комплекса,- серооксигеназа, тетратионат- синтаза, тетра-тионатредуктаза ( фермент, участвующий в превращении S^e^ до S2O32-)- Тиосульфат-цитохром с оксидоредуктаза обнаружена лишь у L. thiophila. В целом ферментные системы серного метаболизма у обоих видов сходны.

2.2.Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ. Связь окисления восстановленных серных соединений с ЭТЦ исследовали с использованием ингибиторного анализа процессов ды-

Таблица 2.

Активность ферментов,участвующих в превращении соединений серы при росте серных бактерий

в среде с тиосульфатом

Бактерии нмоль/мин/мг белка

сероок- сиге- наза сульфит-цитохром с-оксидо-редуктаза АФС- редук- таза тиосульфат-феррициа-нид-оксидо-редуктаза тиосульфат-цитохром С -01ССИД0-редуктаза рода-наза тиосульфат-расщепляющий комплекс серо- редук- таза

Thiothrix arctophila* 53 9 400 35 0 56 353 0

Thiothrix ramosa* 0 (Одинцова,Дубинина, 1993) 0 19 0 - 75 - -

Thiothrix ramosa** 18-50 (Odintsova et.al.1993) - 529 - - 251 - -

Leucothrix thiophila* 4.7 6 46,4-147 54 2-12 25 53-97 0

Thiobacillus ferrooxidans (Tuovinen et al.,1976) - 14,9 - 8,2 - 14,8 - -

Chromtium virtosum (Truper,Peck,1970) - 208 - - - - -

Thiobacillus sp. (Suzuki,Silver,1966) 66---

Примечание:!."-" нет данных,2.*При периодическом культивировании,экспоненциальная фаза роста, 3.**При проточном культивировании в хемостатных условиях(автотрофный рост)

хания. Дыхание в отсутствие ингибитора принимали за 100%. Изменен» скорости дыхания в суспензии клеток измеряли на фоне эндогенного ды хания при внесении восстановленных серных соединений. Анализ влияни: ингибиторов ЭТЦ показал, что сульфитзависимое потребление 0г у Г arctophila очень чувствительно к HQN0, антимицину А, СССР ( 100%. ин гибирования), в меньшей степени к миксотиазолу, NEM (65 - 45%); у L thiophlla- к KCN (95%), антимицину А (83%), СССР (77%), слабее - ] HQN0 (35%), миксотиазолу (50%). Результаты анализа свидетельствуют < поступлении электронов от сульфита в ЭТЦ, повидимому, на уровн< участка флавин- хинон- цитохром с .

С помощью полярографических измерений показано, что у T.arctop hila и L. thiophlla происходило заметное увеличение скорости потреб ления кислорода при внесении в ячейку сульфита, и лишь в слабой степени - при добавлении тиосульфата, тетратионата, сульфида. В присут ствии сульфида, тиосульфата и тетратионата обнаружены низкие скорос ти потребления кислорода, что не позволяет провести ингибиторны анализ процессов дыхания на этих субстратах.

3.Особенности углеродного метаболизма Т.arctophila и L.thlophi

la. Исследуемые штаммы Т.arctophila и L.thiophila при периоди ческом культивировании не способны к автотрофному росту на минераль ной среде с тиосульфатом. При изучении особенностей углеродного ме таболизма исследованных бактерий важно было выяснить вопрос о влия нии тиосульфата на активность фиксации СОг и на активность ферменто: углеродного метаболизма.

Определение величин фиксации радиоактивной углекислоты проводи ли в ' культурах в экспоненциальной фазе роста (одно - двух суточ ные). Присутствие в среде тиосульфата не приводило к увеличению ско рости фиксации СОг- Эти величины варьировали от 0,4 до 5,1% от угле рода белка клеток. Это находится в пределах величин обычной гетеро трофной фиксации углекислоты .

Для изучения возможных путей утилизации органических кислот исследуемых штаммов был использован радиоуглеродный метод определе ния интенсивности декарбоксилирования используемых органических кис лот с применением ингибиторного анализа (табл. 3). Полученные ре зультаты указывают на одновременное функционирование у обоих штаммо ЦТК и глиоксилатного цикла независимо от присутствия тиосульфата Изучение удельной активности ферментов ЦТК и глиоксилатного цикл

Таблица 3

нтенсивность декарбоксилирования радиоактивного малата (1,4-14С-ма-ат) в суспензиях клеток бесцветных серобактерий (имп./мин./мг белка)

В отсутствие В присутствии %■ инги- В присутствии X инги-

актерии ингибитора ингибитора бирова- ингибитора бирова-

изоцитратлиазы ния сукцинатде- ния

(итаконат) гидрогеназы

(ТТРА)

ЫоЬЬг1к 1,1-104±50 5,9-102-50 95 5,9' 102=*50 95

гсЬорЬИа

гамм 1И 1,1-104*50 6,0-102»50 94 6,0"102±50 94

еисоЬЪг!к 5,0-103л50 0,7-103±50 86 0,7'103±50 86

Ь1орЫ1а 9,0-103±50 1,9*103±50 79 1,8-103^50 80

гамм бйБ б,9-103*50 2,1'103±50 70 1,2'103±50 83

римечание: приведены средние значения из трех опытов.

табл. 4) подтверждает приведенный выше вывод. Отличительная осо-енность углеродного метаболизма заключается в низкой активности де-идрогеназ ЦТК при гетеротрофном росте - в 10 раз ниже по сравнению другими гетерстрофами.

Добавление в среду культивирования тиосульфата приводило к при-эсту биомассы у штаммов ТМоЬЪг1х и 1еисоЬЬг1х и одновременно к нижению активности ферментов ЦТК, но не влияло на изоцитратлиазу -лючевой фермент глиоксилатного цикла (табл. 4). Из приводимых в зблице результатов очевидно, что при окислении тиосульфата в среде /льтивирования резко ингибируется активность гидратаз у серобакте-ий, в 10 - 30 раз, а активность дегидрогеназ всего в 2 - 7 раза.

Полученные результаты позволяют предположить, что при хемолито-этеротрофном росте, при наличии тиосульфатзависимого дыхания сни-ается роль ЦТК в энергетическом метаболизме клеток. Это обусловле-э поступлением дополнительных электронов в ЭТЦ при окислении тио-/льфата и переключением потока восстановительных эквивалентов ЩНг и НАДФН2), синтезируемых в ЦТК при участии дегидрогеназ, с аергетического на конструктивный метаболизм, что и объясняет увели-

чение прироста биомассы.

Таблица 4

Сравнительная активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла (нмоль/мин./мг белка) при разных условиях культивирования

Thiothrix Leucothrlx Escherl chl,

Ферменты arctophila thlophila coli

штамм IN штамм 6WS BKM В-12

-S2032~+S2032~ -S2O3z~ +S2032" -S2032- +S2032

Аконитатгидратаза 97 2,8 52 12 90 НО

Изоцитратдегидрогеназа (НАД)(ИДГ) 22 10 21 4 НО НО

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ)(ИДГ) 15 4 10 0,2 160 145

2-оксиглутарат-дегидрогеназа но б НО 13 10 но

Сукцинатдегидро-геназа (СДГ) 25 13 8 2 420 400

Фумаратгидратаза 48 5 102 22 410 но

Малатдегидро-геназа (ВДГ) 23 6 30 4 210 200

Цитратсинтаза НО 15 НО 3,5 НО но

Изоцитратлиаза* 40 30 25 19 130 но

Примечание: но - не определяли,*-ключевой фермент глиоксилатногс цикла.Условия культивирования : в присутствии или в 01 сутствие тиосульфата клетки выращивали в среде с ацетг том и лактатом

4. Распространение и активность нитчатых серобактерий в морских эпифитных сообществах Описание объекта исследования - бухты Кратерная.Бухта Кратер-эя представляет собой кратер 0,7 км2 затопленного древнего вулкана иишир, расположенного на острове Янкича (Курильские острова, Тихий <еан). Бухта соединяется с морем мелководным проливом. Кальдера /лкана характеризуется проявлениями газогидротермальной активности i берегу и под водой, которые приурочены к кольцевому разлому, про-эдящему по периметру фундамента бухты. Проведенные ранее исследова-та показали, что в районах выходов газогидротерм, содержащих вос-сановленные соединения серы, активно протекают процессы новообразо-ания органического вещества фотосинтезирующими и хемосинтезирующими *кроорганизмами (Tarasov et. al., 1990; Нестеров и др., 1991).

Распространение Thlothríx в бухте Кратерная. Развитие нитча-лх бесцветных серобактерий сосредоточено, в основном, на литорали в энах газогидротерм в зарослях фукусовых водорослей. Здесь, при со-гржании в воде сульфида 0,17-2,17 мг/л и до 12 мг/л З/ЗгОз2" на нубинах от 0 до 2 м отмечено массовое развитие Thiothrix в качестве зторичных" эпифитов на нитчатых водоролях, обрастающих фукусы. Лишь ^значительные по площади обрастания расположены на отдельных участ-ах литорали. Вокруг газогидротерм, выносящих большие количества /льфида, эти микроорганизмы не развиваются. Thiothrix в виде еди-1чных нитей обнаружен в серно- диатомовом мате на глубине 0,5 м и в' иьго- бактериальных матах на глубине больше 2 м.

Оценка скорости окисления восстановленных серных соединений и -жсации углекислоты. Скорость окисления соединений серы и фиксации )2 была определена в краткосрочных опытах с использованием радио-зотопов 35S и 14С. Было показано, что в обрастаниях Thiothrix проводит окисление сульфида, со скоростью 2,5 -3,4 мг/г белка в сутки тиосульфата - 30,8 - 34,8 мг S/ 520з2~/г белка, что сопоставимо с ^личинами скорости окисления этих соединений Thiothrix в чистых /льтурах при литогегеротрофном росте .

Скорость фиксации С0г при окислении сульфида составляла не бо-5е 6,5 мкг/г белка в сутки. Эти величины на два-три порядка ниже ш аналогичных значений, определенных ранее для хемоавтотрофной по-дляции Thiothrix nivea, развивающейся в сероводородном источнике AcGlennon, Makemson, 1988). Соотношение величин окисленный субс-эат:Сфикс. на 1 - 2 порядка выше в популяции Thiothrix бухты Кра-

терной по сравнению со значениями, известными для хемоавтотрофных сероокисляющих бактерий (Kuenen, Bedeuker, 1982), что также свидетельствует о гетеротрофном метаболизме нитчатых серобактерий в бухте Кратерная.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на углубленные исследования представителей рода Thiothrix в последнее десятилетие,ставшие возможными в результате выделения чистых культур, до сих пор остается много неясного в вопросе о таксономическом составе, метаболизме представителей этой группы и их функциональной роли в природных сообществах.

В задачи настоящей работы входило дальнейшее изучение представителей рода Thiothrix, выделенных из мест их массового развития в различных экологических условиях. К таковым относятся обильные обрастания нитчатых серобактерий, морфологически сходных с Thiothrix, в бытовых и промышленных сточных водах и в зпифитных сообществах на литорали морских побережий. Основное внимание в работе было сосредоточено на изучении таксономического состава, роли восстановленных неорганических соединений серы в катаболических процессах и метаболической активности серобактерий в природной среде.

Из разных местообитаний было выделено 10 штаммов нитчатых серобактерий, морфологически близких Thiothrix ( по способности к формированию розеток, образованию гонидий и ряду других особенностей строения). При изучении морфологии, циклов развития, ультраструктуры, физиолого- биохимических и генотипических свойств выделенных штаммов была установлена их таксономическая неоднородность на уровне рода.Три штамма, выделенные из сточных вод, были описаны в качестве нового вида в пределах рода Thiothrix с видовым названием T.arcto-phila sp. nov. На основании изучения фено- и генотипических свойств с использованием анализа 16S- рРНК семь штаммов морских изолятов отнесены нами к несерным нитчатым скользящим бактериям рода Leucoth-rlx, из них штаммы 2WS, 4WS, 6WS, 7WS описаны в качестве второго вида этого рода - L. thlophlla sp. nov. Необходимо отметить, что способность к окислению сульфида и тиосульфата до тетратионата, сульфата и внутриклеточной элементной серы была обнаружена ранее у одного из штаммов Leucothrlx тисог (Brock, 1981). В связи с этим Т.Д. Брок отмечал необходимость проведения дальнейших исследований способности к окислению серных соединений у штаммов L. тисог (Brock, 1989).

На основе анализа 16S- рРНК установлены филогенетические связи вых видов в пределах гамма- подгруппы протеобактерий, подтвердив-е принадлежность выделенных бактерий к различным родам, т. arcto-11а оказался наиболее близок к Г. ramosa в филогенетической ветви ца Thlothrlx. L. thiophila составляет единую ветвь с L. тисог, элюционно достаточно обособленную от видов Thlothrlx.

Таким образом, результаты наших исследований позволили допол-гь характеристику видового состава родов Thiothrlx и Leucothrlx и сширить представления о таксономическом составе группы бесцветных роокисляющих бактерий.

В настоящей работе при изучении физиологии новых видов основное имание было уделено роли серных соединений в катаболических реак-ях и их связи с углеродным метаболизмом. Доказана способность но-х видов к литогетеротрофному росту при окислении тиосульфата и льфита. Кроме ранее установленного для Т. ramosa механизма субст-тного фосфорилирования, у новых видов возможно также получение ергии за счет окислительного фосфорилирования в ЗТЦ с участием ецифических ферментов, участвующих в диссимиляционных окислитель-х процессах.

Отличительная особенность углеродного метаболизма изучаемых ктерий состоит в очень низкой активности дегидрогеназ ЦТК, неза-симо от наличия тиосульфата в среде, и в функционировании, наряду ЦТК, и глиоксилатного цикла. При окислении тиосульфата в культурах следованных видов происходит увеличение урожая клеток в 1,5 - 4 за. Одновременно в клетках снижается активность ферментов ЦТК идратаз в 10-30 раз и дегидрогеназ в 2 - 7 раза). Активность рментов глиоксилатного цикла при окислении тиосульфата не уменьша-ся. Результаты позволяют предположить, что при хемолитогетеротроф-м росте при наличии субстратного и окислительного фосфорилирования ижается роль ЦТК в энергетическом метаболизме клеток и происходит реключение потока восстановительных эквивалентов (НАДНг, НАДФНг) ЦТК в глиоисилатнкй цикл для целей конструктивного метаболизма, следнее объясняет биохимический механизм увеличения прироста био-ссы при окислении тиосульфата.

При изучении распространения нитчатых серобактерий в морских ловиях обнаружено массовое развитие нитчатых розеткообразующих се-бактерий в виде эпифитов на подводной растительности на литорали лого моря и в районе выходов сероводородсодержащих газогидротерм в

бухте Кратерная (на Курильских островах). С использованием радиоактивных изотопов Na235S и Na235S03 в краткосрочных опытах с эпифитны-ми обрастаниями бухты Кратерная определены достаточно высокие скорости окисления этих соединений. Показано, что при достаточно высокой скорости окисления сульфида и тиосульфата, присутствующих в морской воде, величины скорости фиксации углекислоты в популяции серо-окисляющих бактерий низкие, на уровне гетеротрофной фиксации СОг Это свидетельствует о гетеротрофном метаболизме и участии сообществ, эпифитных сероокисляющих бактерий не в продукции органического вещества, а в деструкционных процессах. Важная экологическая роль эпифитных серобактерий состоит в окислении токсичных соединений серы i предотвращении их диффузии из донных выходов в водную толшу. Это позволяет рассматривать выделенные культуры серобактерий как потенциальные объекты для биотехнологических целей при решении задач удаления токсичных соединений серы из окружающей среды.

Результаты исследований расширяют представление о биоразнообразии бесцветных серобактерий- их таксономическом составе, разнообразии метаболических возможностей и функциональной роли в природньк сообществах.

ВЫВОДЫ

1. Из обрастаний очистных сооружений выделены и охарактеризованы три штамма нитчатых серобактерий, способных к образованию розеток. На основе изучения фено- и генотипических свойств выделенны< штаммы отнесены к новому виду Thiothrix arctophlla sp.nov.

2. Из сообщества эпифитных сероокисляющих бактерий литорали Белого моря выделено 7 штаммов морских нитчатых серобактерий, морфологически сходных с Thiothrix. Четыре штамма близкородственных организмов с уровнем гомологии 89 - 62 % отнесены к новому виду нитчатая бактерий рода Leucothrlx с видовым названием L. thiophlla sp. nov.

3. На основе анализа 16S- рРНК установлены филогенетически* связи новых видов в пределах гамма-подгруппы протеобактерий: Г. arctophlla наиболее близок к Т. ramosa в пределах филогенетической ветви рода Thiothrix. L. thiophlla составляет единую ветвь с L.mucor обособленную от видов Thiothrix.

4. Показана способность новых видов серобактерий к литогетерот-рофному росту при окислении тиосульфата и сульфита. Вовлечение промежуточного продукта окисления тиосульфата- сульфита в катаболичес-кие реакции происходит с участием механизмов окислительного фосфори-

рования в ЭТД и субстратного фосфорилирования.

5. При изучении особенностей углеродного метаболизма двух новых дов нитчатых серобактерий установлено одновременное функционирова-е НТК и глиоксилатного цикла и низкая активность дегидрогеназ ЦТК и органо- и литогетерогрофном росте. Окисление тиосульфата сопро-вдается резким снижением активности гидратаз и перераспределением сстановительных эквивалентов клеток (НАДНг, НАДФНг), ив ЦТК в гли-силатный цикл для целей конструктивного метаболизма.

6. Массовое развитие морских зпифитных нитчатых бактерий Leuco-rlx thiophila обнаружено на литорали Белого моря, а также популя-и Thiothrix в районе подводных газогидротерм бухты Кратерная в Тим океане.

Дана количественная оценка скорости процессов окисления восставленных серных соединений и фиксации углекислоты в сообществе элитных обрастаний с доминированием Thiothrix на литорали бухты Кра-рная. Показано, что эти процессы не сопряжены с хемосинтезом орга-ческого вещества: участвуя в окислении серных соединений, сообщес-□ зпифитных серобактерий развивается за счет деструкции органичес-х веществ.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Нестеров А.И., Горленко В.М., Старынин Д.А., Намсараев Б.В., бининаГ.А., Качалкин В.И., Дульцева Н.М., Тарасов В.Г. Влияние дротермальных поступлений на микробиологические процессы синтеза ганического вещества в бухте Кратерная// Сборник "Мелководные гид-гермы и экосистема бухты Кратерная". Часть 1. Функциональная ха-ктеристика. Владивосток, 1991. -С. 130 - 153.

2. Дульцева Н.М., Дубинина Г.A. Thiothrix arctophila sp.nov. -вый вид бесцветных нитчатых серобактерий// Микробиология. 1994. -

63. № г.- С. 271 - 281.

3. Дульцева Н.М., Дубинина Г.А. Выделение морских нитчатых се-Зактерий и описание нового вида Leucothrix thiophila sp. nov.// кробиология.- 1996.- T.65.№l.-C. 89 - 98.

4. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Дульцева Н.М., Чурикова В.В. обенности углеродного метаболизма при хемолито- и хемоорганогете-трофном росте нитчатых серобактерий Thiothrix arctophila sp. nov. Leucothrix thiophila sp.nov.// Микробиология.- 1996. Т. 65. №2.149 - 153.

' 5. Дульцева Н.М. Новые виды нитчатых серобактерий, выделена из антропогенных и морских экосистем// Конференция "Автотрофные мь роорганизмы". Москва, 23-25 апреля 1996 г. Тезисы, С. 70,