Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Таксономия и физиология новых нитчатых серобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Таксономия и физиология новых нитчатых серобактерий"

На правах рукописи

ДУЛЬЦЕВА Наталья Михайловна

ТАКСОНОМИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ НОВЫХ НИТЧАТЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ

Специальность 03.00.07 -микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени !саидидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте микробиологии Российской академш

наук

Научный руководитель:доктор биологических наук Г.А. Дубинина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Е.А. Бонч-Осмоловская, кандидат биологических наук E.H. Красильникова

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится " 5 " июня_1996 г.

в IЧ часов на заседании диссертационного совета Д.002.64.01 в Институте микробиологии РАН по адресу: 117811, г.Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан "29" апреля 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Л.Е.Никитин

Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии представляют одну из физиологических групп микроорганизмов, участвующих в окислительных реакциях геохимического цикла серы. Эти организмы являются важными компонентами водных биоценозов пресноводных и морских экосистем и характеризуются обильным развитием в водоемах с активными поступлениями сероводорода. Их массовое развитие сопровождается, как правило, формированием так называемых серных бактериальных матов на поверхности донных отложений или обрастаний на твердых субстратах и подводной растительности.

Изучение этой группы организмов представляет интерес в связи с уникальными свойствами ее представителей - гигантскими размерами меток, своеобразием морфологии, разнообразием типов метаболиза.

Хотя функциональная роль бесцветных серобактерий изучена недостаточно, их участие в окислении токсичных серных соединений, прежде всего и в создании биогеохимического барьера в водоемах на границе НгБ-Ог очевидно. Отсутствие знаний о метаболических возможностях большинства известных видов серобактерий не позволяет, однако, адекватно оценить их вклад в локальные и глобальные циклы серы и углерода и определить функции в различных экосистемах. Проблема охраны окружающей среды от токсичных соединений становится весьма актуальной вследствие возрастающего антропогенного загрязнения. В связи с этим дальнейшее изучение биоразнообразия серобактерий представляет большой научный интерес. Прикладные аспекты их изучения диктуются возможностью использования серобактерий для удаления загрязнения серными соединениями антропогенных систем: промышленных и бытовых сточных вод, воздушной среды производственных помещений и других объектов.

Значительный интерес среди бесцветных серобактерий представляют нитчатые серобактерии рода ТМоЬЪг1х. Интерес к этим микроорганизмам связан с рядом биологических особенностей: наличием сложного жизненного цикла, большим разнообразием ранее описанных "морфологических" видов, способностью к формированию эпифитных обрастаний. Их массовое развитие обнаружено не только в природных экосистемах, но и в очистных сооружениях, где они вызывают так называемое "вспучивание" активного ила и, несомненно, выполняют важную функцию устранения сероводородного загрязнения среды обитания.

Цель работы. Изучение таксономии, физиологии, метаболизма, функциональной роли в водных экосистемах нитчатых серобактерий морфологически сходных с ТЫоЬЬггх .

- г -

Задачи работы :

1. Ввделение чистых культур нитчатых сербактерий рода Thlothrix из пресноводных и морских местообитаний.

2. Изучение морфологических, физиолого-биохимических, ультраструктурных и генотипических особенностей выделенных штаммов.

3. Исследование механизмов окислительных реакций и ферментов, участвующих в метаболизме неорганических соединений серы.

4. Изучение особенностей углеродного метаболизма и его связи с окислением серных соединений.

5. Определение метаболической активности Thlothrix в природных экосистемах на примере бухты Кратерная ( Курильские о-ва, Тихий океан).

Научная новизна и практическая значимость работы.

Из бытовых и промышленных сточных вод выделены три штамма нитчатых бесцветных серобактерий, которые отнесены к новому виду рода Thlothrix - T.arctophíla. Из морских эпифитных обрастаний выделены семь штаммов нитчатых серобактерий, морфологически сходных с Thlothrix. Таксономическое изучение выделенных штаммов позволило обосновать их принадлежность к нитчатым бактериям рода Leucothrlx,ранее не относимых к серобактериям,и описать новый вид - L. thiophlla. Сравнительный анализ 16S- рРНК известных видов родов Thlothrix и Leucothrlx и новых иволятов показал, что штаммы L. thiophlla составляют единую филогенетическую ветвь с единственным видом рода Leucothrlx -L. mucor, эволюционно обособленную от рода Thlothrix. Новый вид Г. arctophlla филогенетически наиболее близок к недавно описанному виду Г. ramosa (Одинцова, Дубинина, 1990) в пределах достаточно обособленной ветви представителей рода Thlothrix. Оба вида входят в состав гамма подгруппы протеобактерий.

У выделенных новых- видов исследован механизм окисления восстановленных соединений серы. С помощью ингибиторного анализа и определения специфических ферментов серного метаболизма показано, что тиосульфат принимает участие в катаболических реакциях по механизму окислительного и субстратного фосфорилирования.

Впервые исследованы ферменты углеродного метаболизма в сравнительном плане при органогетеротрофном и литогетеротрофном росте нитчатых бактерий. Показано одновременное функционирование ЦТК и гли-оксилатного цикла. Отличительной особенностью ферментов ЦТК у новы>

видов является низкая активность дегидрогеназ. Перестройка ферментативной активности при переходе от органо- к литотрофии заключается в резком снижении активности гидратаз в ЦТК и направлении потока восстановительного эквивалента ( НАДН, НАДФНг ) в глиоксилатный цикл на биосинтетические процессы.

Показано массовое развитие эпифитных нитчатых серобактерий, морфологически сходных с ТМоЬЬг1х, на литорали Белого моря и в районе гидротермальных выходов бухты Кратерная в Тихом океане. В эпифитной популяции нитчатых серобактерий могут доминировать как виды рода ТЫоЬЬг1х, так и новые сероокисляющие бактерии рода ЬеисоЫз-г1к. Обнаружены низкие скорости фиксации СОг популяцией морских эпифитных серобактерий в бухте Кратерная, что свидетельствует о гетеротрофном метаболизме и их участии в аэробной деструкции органического вещества. Результаты определения скорости окисления НгЗ и тиосульфата в сообществе эпифитных нитчатых серобактерий показали, что ТМо-ЬЬг1х при литогетеротрофном росте достаточно активно окисляет серные соединения и, выполняя роль барьера, препятствут диффузии сероводорода гидротермального происхождения в водную толщу. Полученные результаты важны для понимания роли нитчатых серобактерий в биогеохимическом цикле серы и углерода, а также для оценки их вклада в процессы окисления токсичных соединений серы и в сохранении благоприятного биологического режима водоемов.

Результаты исследований расширяют представления о биоразнообразии бесцветных серобактерий, их таксономическом составе и многообразии метаболических возможностей.

Полученные в работе результаты могут быть использованы при составлении определителей бактерий, для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, а также в биотехнологических исследованиях для очистки среды от токсичных соединений серы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на совместном заседании лабораторий нефтяной микробиологии, микробной трансформации минералов и лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН,1995г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 1 тезисы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 11-ти глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 137 страницах машинописного текста, включая 16 таблиц и |8 ри-

сунков. Список литературы содержит 54 отечественных и 11д иностранных наименований работ.

Место проведения работ. Работа проведена в Институте микробиологии РАН ( Заведующий лабораторией - доктор биологических наук В.М. Горленко). Исследование генотипических свойств бактерий проводили совместно с ст. н. сотрудником ИНМИ РАН к.б.н. A.M. Лысенко. Анализ 16S- рРНК выполнен доктором F. Rainey из DSM (Германия). Изучение ультраструктуры клеток проводили совместно с сотрудником ИНМИ РАН H.A. Кострикиной. Активность ферментов серного и углеродного метаболизма изучали совместно с М.Ю. Грабович (ВГУ). Автор приносит им искреннюю благодарность.

Сокращения, используемые в тексте: ЦТК - цикл трикарбоновых кислот, ЭТЦ - электронтранспортная цепь, ЦПМ - цитоплазматическая мембрана, АТФ - аденозинтрифосфорная кислота, РДФК - рибулезо-дифос-фаткарбоксилаза, НАДНг - никотинамиддинуклеотид восстановленный, АФС-редуктаза- аденозинфосфосульфат-редуктаза, ТТФА - теноилтрифлуо-роацетон, СССР - карбонит- цианид- хлорофенилгидразон, ИДГ - изоцит-ратдегидрогеназа, СДГ - сукцинатдегидрогеназа, МДГ - малатдегидроге-наза, NEM - N-этилыалеимид, HQNO - Е-гептил-4-гидрохинолин-Ы-оксид, ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.

Объекты и методы исследования

Работа проводилась с тремя штаммами нитчатых бесцветных серобактерий рода Thiothrix и семью штаммами морских нитчатых серобактерий, четыре из которых отнесены к новому виду рода Leucothrix. Бактерии выделены нами совместно с Г.А. Дубининой. Для сравнительных целей использовали Г. ramosa штамм 2 из коллекции ИНМИ РАН и Leucothrix mucor 2157 из DSM (Германия).

Для выделения пресноводных бактерий рода Thiothrix применяли среду Вильямса и Унза (Williams, Unz, 1985), в которую вносили в качестве источника углерода лактат Na и ацетат Na по 0,1 г/л. Во все среды добавляли микроэлементы и витамины.

Для выделения морских бактерий Leucothrix использовали среду следующего состава, г/л: (NH4)2S04-0,1; CaCl2-2H20-0,2; MgClß-eHgO-5,4; NaCl-20,0. К среде добавляли витамины и микроэлементы, 0,15 M раствор калий-фосфатного буфера срН7,2-7,4-10мли 10% растворы ЫаНСОз- 1 мл, Na2S2Û3-5НгО- 10 мл, лактат Na - 2 мл. Начальное значение pH среды 7,6 - 7,8.

Морфологию бактерий исследовали в фазово-контрастном микроскопе

JU-2 фирмы "Zeiss" и трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100C.

Жизненный цикл штаммов Thiothrlx и Leucathrix изучат путем юследовательного наблюдения в фазово-контрастном микроскопе за культурой, растущей в жидкой среде. Ультратонкую структуру клеток ^следовали на срезах, изготовленных по методу Ритер и Келенбергер (Ryter, Kelenberger, 1958).. в электронном микроскопе JEM- 100С при ускоряющем напряжении 80 кВт.

Физико-химические и биохимические методы анализа. Белок клеток эпределяли методом Брэдфорда с Кумаси синим Q-250 (Bradford,1976), и з отдельных случаях-методом Лоури (Lowry et. al., 1951). Суспензию снеток получали путем центрифугирования культуры при 6000g, 4°С в течение 30 минут. Клеточные экстракты получали разрушением бактериальных клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН- 21 при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2 мин. в ледяной бане, "упернатант получали после центрифугирования клеточных экстрактов 1ри 9000д в течение 30 мин. при 4°С. Скорость потребления кислорода регистрировали на самопишущем полярографе П4-1. Регистрацию подпрограмм производили по общепринятой методике (Шольц, Островский, 1975). концентрацию кислорода в пробе вычисляли по таблице (Франк, 1973). Концентрацию сероводорода в пробах определяли методом иодометричес-хого титрования (Резников и др., 1963) и спектрофотометрически (Мас-iereth et. al.,1978), растворенного кислорода - методом Винклера. Тиосульфат,тетратионат и тритионат при совместном присутствии определяли цианолитическим методом (Kelly et. al., 1969), концентрацию 3042"- хлоранилатным методом (Уильяме, 1982), элементной серы - модифицированным сульфитным методом Морриса (Компанцева, 1985), тетра-гионата - сульфитным методом .

Исследование влияния восстановленных соединений серы на скорость фиксации углекислоты в культурах проводили в опытах с NaH14C03, определяя включение 14С в биомассу в динамике в течение 8-и суток, при этом использовали варианты сред с тиосульфатом и без тиосульфата. Определение общего количества углерода карбонатов и углекислоты (С карб.) проводили прямым титрованием. Интенсивность декарбоксилирова-ния органических кислот в суспензии клеток определяли в среде инкубации следующего состава: 0,05 М калийфосфатный буфер (pH 7,0), различные субстраты (сукцинат, малат) в концентрации 100 мг/л и, соответственно, меченые по карбоксильной группе субстраты с конечной активностью 3"106 имп./(мин.-мл). В стеклянные сосудики вносили 1 мл

- б -

среды инкубации и добавляли 0,2 мл суспензии клеток бактерий (0,3 мг белка). Инкубацию проводили в течении 1 часа. Об активности процесса декарбоксилирования судили по количеству 14 COg, который улавливали моноэтаноламином в специальных сосудиках, а затем измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике СБС - 2. Эту работу проводили совместно с М.Ю.ГраОович (ВГУ).

Методы геносистематики. Определение содержания ГЦ в ДНК проводили совместно с А.М.Лысенко (ИНМИ РАН) по температуре плавления ДНК методом Мармура (Магшиг, 1961). Уровень гомологии ДНК определяли методом мембранных фильтров (Evtushenko et. al., 1989; Maniatue et. al., 1994) и методом оптической реассоциации (De Ley et. al., 1970; Gillis et. al., 1970). Анализ 16S- pPHK проводили совместно с F.Rai-ney (Германия).

Методы определения ферментативной активности.

Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла определяли спектрофотометрически на СФ-26 ( Velger et. al., 1969; Романова, 1980; Bacon et. al., 1978; Землянухин и др., 1986; Miernyk et. al., 1979).

Определение активности ферментов, участвующих в превращении соединений серы.

Активность роданазы определяли по видоизмененной методике Сорбо (Sorbo, 1955) в супернатанте по образованию тиоцианата колориметрическим методом при Л= 460 (Bowen et. al., 1965).

Активность серооксигеназы определяли в супернатанте по скорости образования тиосульфата из серы и сульфита (Suzuki, Silver, 1966; Silver, Lindgren, 1968). Приготовление элементной коллоидной серы осуществляли по методу Сузуки (Suzuki, Silver, 1966). Образовавшийся тиосульфат определяли иодометрическим титрованием.

Активность тиосульфатоксидазы (Rolls, Lindstrom, 1967), суль-фитоксидазы (Петушкова, Ивановский, 1976) определяли в супернатанте спектрофотометрически по восстановлению феррицианида или по скорости восстановления цитохрома с в присутствии окисляемого субстрата. Восстановление феррицианида регистрировали на двухлучевом спектрофотометре при Л =420 нМ, цитохрома с - при Л =550 нм.

АФС-редуктазу определяли в реакционной смеси того же состава, как и для сульфитоксидазы, но с добавлением АШ - 1 мкМ (Peck et. al., 1965).

Активность тиосульфатредуктазы определяли в супернатанте по

¡корости образования сероводорода из тиосульфата в присутствии вос-;тановителя дитиотреитола (Петушкова, Ивановский, 1976; Hashma, .972). Реакцию проводили в сосудах Варбурга без удаления воздуха в течение 10 минут при 37°С (Петушкова, Ивановский, 1976). В качестве шгибитора тиосульфатредуктазы использовали сульфит. Ввделившийся зульфид определяли колориметрическим методом с диметил-л-фениленди-амином.

Активность сероредуктазы определяли по скорости образования се-)оводорода из экзогенной элементной серы. Для опыта использовали отбытую суспензию клеток бактерий из логфазы роста. Опыт проводили в *эробных условиях.

Определение скорости фиксации 14С0г и скорости окисления вос-:тановленных соединений серы популяцией Thiothrix бухты Кратерная доводили в опытах с меченым 353-сульфидом натрия и параллельно с 35S-тиосульфатом натрия. Определяли активность включения метки в элементную серу , накапливаемую внутриклеточно. Аналитическими мето-5ами определяли убыль вносимых субстратов и рассчитывали скорость их окисления. В параллельных пробах определяли скорость фиксации углекислоты с использованием радиоактивного углерода ЫаН14С0з. Инкуба-дао проб с введенным в них NaH14C03 осуществляли в условиях in situ з течение 3 - 8 ч. Радиоактивность меченых продуктов в пробах измеряли с помощью сиинтилляционного счетчика Рак-Бэта (Швеция). Зная содержание исходного белка клеток и количество фиксированной углекислоты, рассчитывали процент фиксации СОг на единицу биомассы Thiothrix.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Выделение и характеристика нитчатых бесцветных серобактерий.

1.1.Выделение нитчатых серобактерий. В качестве материала для выделения бактерий рода Thiothrix использовали обрастания на гальке первичного аэрофильтра очистного сооружения и эпифитные обрастания яа Zostera с литорали Белого моря, в которых преобладали нитчатые Зактерии, морфологически сходные с Thiothrix. Было выделено три штамма бактерий из сточных вод и семь штаммов морских бактерий.Морские штаммы отнесены нами, как показано далее, к роду Leucothrlx.

1.2.Характеристика нитчатых бесцветных серобактерий рода Thiot-

hrix.

Строение и жизненный цикл. Выделенные штаммы Thiothrix характеризуются сходным строением, способами размножения и наличием сложного цикла развития. Физиологические различия штаммов также незначительны. Ниже приводится характеристика штамма 1N.

Многоклеточные неподвижные нити. Толщина клеток варьирует по длине трихома от 0,7 до 2,6 мкм,длина клеток - 3,0 - 5,0 мкм. Клетки грамотрицательные. Длина нитей в поздней стационарной фазе роста культур может достигать сотен микрометров. Нити окружены чехлом толщиной до 100 нм.

Размножение клеток в нитях происходит путем поперечного деления. При этом наружный слой клеточной стенки, общий для всего трихома, не участвует в делении. Размножение нитей происходит двумя способами. Первый - с помощью отшнуровывания гонидий на апикальном конце нитей, реже гонидии освобождаются с обоих концов неприкрепленных нитей. Размеры гонидий: 3-5 мкм длиной, 1,3-2 мкм толщиной. Гонидии способны к медленному передвижению скольжением. Второй способ размножения, характерный для рода Beggiatoa и обнаруженный только у Т. ramosa, состоит в сегментировании всей нити на короткие отрезки -гормогонии. Гормогонии, как правило, состоят из двух-четырех клеток. Гормогонии также способны к предвижению скольжением.

В цитоплазме обнаружены включения полифосфатов, поли-А-оксимас-ляной кислоты и элементной серы.

Штамм 1N характеризуется наличием сложного жизненного цикла. В начале экспоненциальной фазы роста в культуре преобладают неподвижные длинные нити. Способность к образованию розеток выражена слабо. В середине экспоненциальной фазы на 2 - 3 сутки происходит массовое образование гонидий, а также гормогониев. К концу экспоненциальной и началу стационарной фаз в культуре преобладают длинные нити и розетки. Розетки могут быть сформированы из отдельных нитей разной длины, а также гонидий или гормогониев. В основании розеток, а иногда на базальном конце нитей имеется прикрепительный диск. Морфологически штамм 1N незначительно отличается по размерам клетки от Г. ramosa, но имеет более крупные клетки, чем типовой вид Т.nivea и другие изоляты (штаммы Al, A3, I, Q, ТНЗ, ТН1) ( Larkln, 1980; Larkin, Shinabarger, 1983; Williams, Unz, 1985; Одинцова, Дубинина, 1990). Кроме того, отличие от типового вида и вышеуказанных штаммов заключается и в возможности размножения нитей 2-мя способами: не только с помощью гонидий,но и гормогониями.

Физиолого-биохимические и культуральные свойства. Бактерия не растет в отсутствие органических веществ в минеральной среде с тиосульфатом при периодическом культивировании. При росте в среде с органическими веществами накопление серы в клетках происходит в среде с тиосульфатом, сульфидом или элементной серой. Штамм 1N отличается от известных видов пониженным температурным оптимумом - 15°С. Он способен использовать в качестве источника углерода сукцинат, фу-марат, пропионат, лактат, ацетат, малат, пируват, оксалоацетат, мальтозу, мелизитозу, бутанол, источника азота - аммоний, нитраты, нитриты, глутамин, аланин, гидролизат казеина, пептон. В ассиммиля-ционных процессах использует в качестве источника серы сульфид, тиосульфат, элементную серу, цистеин, метионин, сульфит, тетратионат. Облигатный аэроб, не способен использовать в качестве акцепторов электронов сульфаты, тиосульфат, нитраты, фумарат.

Генотипические свойства. У штамма 1N ГЦ в ДНК составляет 55 мол.%. ДНК-ДНК-гибридизация проведена с наиболее близким по свойствам видом Т.ramosa штамм 2, у которого величина ГЦ в ДНК составляет - 51,3 мол.%. Величина гомологии ДНК этих штаммов составляет 17-19%, что позволяет рассматривать штамм 1N как самостоятельный вид рода Thlothrix. Приведен диагноз нового вида T.arctophila .

1.3.Характеристика морских нитчатых серобактерий.

Строение и жизненный цикл. Семь штаммов нитчатых серобактерий морфологически различаются незначительно. Неподвижные нити состоят из клеток цилиндрической формы с четкими поперечными перегородками. Клетки в составе нитей имеют общий наружный слой клеточной стенки. Толщина нитей одинакова по всей длине. Их длина варьирует от нескольких мкм до сотен мкм. Клетки от 0,8 до 2,5 мкм длиной и от 0,5 до 1,0 мкм шириной, грамотрицательные. Чехлы у нитей отсутствуют. Нити имеют прикрепительные диски.

Размножение клеток в нитях происходит поперечным делением, наружный слой клеточной стенки не участвует в делении. При росте на среде с тиосульфатом клетки содержат включения элементной серы.В пределах нити могут встречаться гигантские раздутые клетки, так называемые "бульбы". Другая особенность состоит в образовании узлов в нити,что свойственно Leucothrix.

Выделенные штаммы характеризуются наличием сложного жизненного цикла. Он заключается в способности к образованию гонидий на одном конце, либо по всей длине нити. При формировании гонидий концы raie-

ток сужаются, образуется полная клеточная стенка. Между клетками образуется свободное пространство, но они остаются соединенными слизистыми тяжами. В дальнейшем нить распадается на гонидии, которые вырастают в нити. Гонидии способны к передвижению путем скольжения толчками. Помимо гонидий, расселение нитей может происходить путем разделения нитей на гормогонии - короткие отрезки, состоящие из нескольких клеток и имеющих, как и нить, общую наружную мембрану. Гормогонии не обладают способностью к передвижению скольжением. В зависимости от условий культивирования может преобладать первый или второй способ "размножения" нитей.

Характерной особенностью всех штаммов является способность к образованию розеток.

В зависимости от фазы роста, условий культивирования и штаммо-вых различий в культуре могут преобладать либо длинные нити, либо одиночные клетки - гонидии и очень короткие нити.

Физиолого-биохимические и культуральные свойства. Подобно Т. агсЬорЬИа морские штаммы не растут в минеральной среде с тиосульфатом при периодическом культивировании в отсутствие органических веществ. Накопление серы в клетках происходит в среде, содержащей органические вещества, с тиосульфатом, сульфидом, элементной серой или сульфитом. Выделенные штаммы способны использовать как источник углерода и энергии ограниченное число испытанных субстратов. Из органических кислот рост большинства штаммов поддерживают: ацетат, малат пируват, сукцинат, фумарат, лактат, оксалоацетат, пропионат,о£-кето-глутарат. Из Сахаров отдельные штаммы используют фруктозу, сахарозу рибозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу; из спиртов - бутанол, глицерин, маннит; из аминокислот- аспарагин, глутамат, аланин, аспартат Все штаммы используют дрожжевой экстракт, большинство- пептон, отдельные- крахмал. В качестве источника азота штаммы используют гид-ролизат казеина, пептон, дрожжевой экстракт, мочевину, аммонийный азот, нитраты, аспартат, глутамат, глутамин, валин, аланин, лейцин, метионин, пролин, аспарагин, глицин, фенилаланин. В конструктивном метаболизме в качестве источника серы могут использовать сульфид, сульфит, элементную серу, тиосульфат. Оптимум роста отмечен при температуре 20°С и солености 2,0 - 2,5% НаС1. Границы солености - 0,5 -7% ИаС1. Строгие аэробы, не способны использовать в качестве акцепторов электронов сульфаты, тиосульфат, нитраты, фумарат.

Генотипические свойства. Все штаммы имеют очень незначительные

- 1-1 -

»азличия в содержании ГЦ в ДНК - от 42,3 до 43,1 мол.% (табл.1).Единое родство штаммов подтверждается результатами ДНК-ДНК- гибридиза-сии. Тем не менее, по уровню гомологии ДНК семь штаммов достаточно [адежно подразделяются на два кластера. Штаммы 2, 4, 6 и 7 составля-1Т первый кластер, у которых сходство в полинуклеотидной последова-

Таблица 1

Генотипические свойства новых нитчатых серобактерий

Штамм ГЦ в ДНК Гомология ДНК, %

мол.% реперные штаммы

6WS 4 WS ZWS 1WS SWS

А.

WS 42,8 100 86 60 HO HO

:WS 42,3 89 100 64 HO HO

WS 42,4 62 70 71 HO HO

WS 42,9 45 51 100 HO HO

.WS 42,8 58 61 53 100 HO

SWS 43,1 57 53 60 HO 100

¡WS 43,0 59 42 42 HO HO

T.ramosa 2 51,3*

..mucor 2157 49,8**

DSM

B.

»WS 100

¿WS 78 100

iWS 49 61 100

.WS 56 HO HO 100

Ш HO 62 HO 62 100

¡WS HO 56 HO 86 88

Примечание: А - исследование методом мембранных фильтров,

В - исследование методом оптической реассоциации ДНК, но- не определяли.

* - (Одинцова, Дубинина, 1990),

(Brock, 1981).

тельности ДНК варьирует в пределах 89-61%. В пределах второго кластера эта величина составляет 88 - 61% между штаммами 1, 3 и 5. Однако гомология ДНК штаммов первого и второго кластеров не более 42 -60%. Такие различия при достаточно близком сходстве фенотипических признаков штаммов обеих групп не позволяют на основе имеющихся сведений надежно обосновать их различие на видовом уровне.

Для установления степени родства с представителями других родов бактерий, наиболее близких по особенностям морфологии, наличию сложного цикла развития и некоторым физиологическим свойствам была проведена гибридизация ДНК изучаемых штаммов с Thiothrix ramosa 2 и Le-ucothrix rncor 2157. Степень гомологии ДНК этих штаммов с названными бактерииями оставила соответственно 8-11% и 9-11%.

1.4.Филогенетическое положение T.arctophila и L.thiophila.

Был проведен сравнительный анализ 16S- рРНК выделенных новых нитчатых серобактерий с известными видами Т. ramosa и L. тисог (рис.

1). Согласно полученным данным, штамм 6WS из первого кластера помещен в гамма-подгруппу Proteobacteria в составе единой ветви филогенетического древа вместе с L.rncor, достаточно отдаленной от Thiothrix. Штаммы первого кластера- 2WS, 4WS, 6WS и 7WS выделены в самостоятельный вид рода Leucothrix с видовым названием L. thlophíla sp. nov. Приведен диагноз L. thiophlla. Установление степени родства с L. thiophlla штаммов второго кластера (1WS, 3WS, 5WS) будет определено после анализа 16S- рРНК для этих штаммов. Как видно на рис. 1, новый вид Г. arctophlla наиболее близок к недавно описанному виду Т. ramosa в пределах достаточно обособленной ветви известных видов рода Thiothrix.

2.Роль неорганических серных соединений в метаболизме T.arctophila и L.thiophila.

Окисление тиосульфата. Присутствие тиосульфата в среде увеличивает урожай клеток в 1,5-4 раза. Тиосульфат окисляется бактериями с накоплением в среде тетратионата, элементной серы и сульфата.

Для выяснение роли тиосульфата в метаболизме данных бактерий определяли: 1) продукты его окисления в периодической культуре;

2) ферменты, участвующие в диссимиляционных процессах окисления серных соединений; 3) связь окисления серных соединений с функционированием электронтранспортной цепи с помощью ингибиторного анализа.

Рисунок 1. Дендрограмма филогенетического древа,основанная на внительном анализе 16S- рРНК выделенных новых нитчатых серобакте-с известными видами Т.ramosa и L.rncor.

2.1.Определение активности ферментов серного метаболизма. При чении серного метаболизма мы сосредоточили внимание на выяснении

роли окисления серных соединений в катаболических реакциях, т.е. возможности получения энергии для жизнедеятельности. В таблице 2 суммированы результаты определения активности ферментов, участвующих в превращении серных соединений у исследуемых бактерий при росте в среде с тиосульфатом. Для сравнительных целей приведены также результаты определения ферментативной активности у других сероокисля-ющих бактерий. У обоих видов обнаружены специфические ферменты, связанные с диссимиляционными процессами окисления серных соединений-сульфит-цитохром с-оксидоредуктаза и АФС- редуктаза. Оба фермента участвуют в энергодающих реакциях, связанных с окислением сульфита до сульфата, в первом случае за счет окислительного, во втором-суОс-тратного фосфорилирования. Последнее подтверждено ингибированием на 44-58% окисления сульфита в присутствии арсената - ингибитора субстратного фосфорилирования. Удельная активность перечисленных ферментов была достаточно высокой, близкой к величинам, обнаруженным у се-роокисляющих бактерий, способных к автотрофному росту (табл. 2). Как следует из приводимых результатов, у ТЫоЬЪг1х и ЬеисоЬЬггх активность АФС- редуктазы составляла 400 нмоль/мин/мг белка и 47-147 нмоль/мин/мг белка. Такая высокая активность ферментов свойственна сероокисляющим бактериям, которые получают энергию за счет субстратного фосфорилирования.

У бактерий также обнаружена высокая активность тиосульфат- расщепляющего комплекса и роданазы, не связанных с синтезом АТФ, но их взаимодействие с З^Оз2" приводит к образованию сульфит-иона в клетках, используемого в последующих этапах окисления.

Помимо ферментов, участвующих в реакциях окисления серных соединений, сопряженных с синтезом АТФ, в клетках изучаемых бактерий обнаружены и другие ферменты, участвующие в окислительных, либо восстановительных реакциях, непосредственно не связанных с энергетическими. К ним относятся, кроме упомянутых роданазы и тиосульфат- расщепляющего комплекса,- серооксигеназа, тетратионат- синтаза, тетра-тионатредуктаза ( фермент, участвующий в превращении Б^б""- до ВоОз2-). Тиосульфат-цитохром с оксидоредуктаза обнаружена лишь у £.. 1ЫорМ1а. В целом ферментные системы серного метаболизма у обоих видов сходны.

2.2.Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ. Связь окисления восстановленных серных соединений с ЭТЦ исследовали с использованием ингибиторного анализа процессов ды-

Таблица 2.

Активность ферментов,участвующих в превращении соединений серы при росте серных бактерий

в среде с тиосульфатом

Бактерии нмоль/мин/мг белка

сероок- сиге- наза сульфит-цитохром с-оксидо-редуктаэа АФС- редук- таза тиосульфат-феррициа-нид-оксидо-редуктаза тиосульфат-цитохром с -оксидо-редуктаза рода-наза тиосульфат-расщепляющий комплекс серо- редук- таза

Thiothrix arctophila* 53 9 400 35 0 56 353 0

Thiothrix ramosa* 0 (Одинцова,Дубинина, 1993) 0 19 0 - 75 - -

Thiothrix ramosa** 18-50 (Odiritsova et.al. 1993) - 529 - - 251 - -

Leucothrix thiophila* 4.7 6 46,4-147 54 2-12 25 53-97 0

Thiobaci1 lus ferrooxidans (Tuovinen et al.,1976) - 14,9 - 8,2 - 14,8 - -

Chromatium vinosum (Truper,Peck,1970) - 208 - - - - -

Thiobacillus sp. (Suzuki .Silver.,1966) 66 --- _ _ _

Примечание:!."-" нет данных,2.*При периодическом культивировании,экспоненциальная фаза роста, 3.**При проточном культивировании в хемостатных условиях(автотрофный рост)

хания. Дыхание в отсутствие ингибитора принимали за 100%. Изменение скорости дыхания в суспензии клеток измеряли на фоне эндогенного дыхания при внесении восстановленных серных соединений. Анализ влиянш ингибиторов ЭТЦ показал, что сульфитзависимое потребление Ог у Г. агсЬарЪИа очень чувствительно к НОШ, антимицину А, СССР ( 100% ин-гибирования), в меньшей степени к миксотиазолу, ИЕМ (65 - 45%); у Ь. ЬЫорЬИа- к КСН (95%), антимицину А (83%), СССР (77%), слабее - } НОШ (35%), миксотиазолу (50%). Результаты анализа свидетельствуют с поступлении электронов от сульфита в ЭТЦ, повидимому, на уровне участка флавин- хинон- цитохром с .

С помощью полярографических измерений показано, что у Т.агсЬор-Ы1а и I. ЬЫорЪИа происходило заметное увеличение скорости потребления кислорода при внесении в ячейку сульфита, и лишь в слабой степени - при добавлении тиосульфата, тетратионата, сульфида. В присутствии сульфида, тиосульфата и тетратионата обнаружены низкие скорости потребления кислорода, что не позволяет провести ингибиторньи анализ процессов дыхания на этих субстратах.

3.Особенности углеродного метаболизма Т.агсЪорЫ1а и ЬЛЫорМ-

1а. Исследуемые штаммы Т.агсЬорЫ1а и ЬЛМорЬИа при периодическом культивировании не способны к автотрофному росту на минеральной среде с тиосульфатом. При изучении особенностей углеродного метаболизма исследованных бактерий важно было выяснить вопрос о влиянии тиосульфата на активность фиксации СО2 и на активность ферменто] углеродного метаболизма.

Определение величин фиксации радиоактивной углекислоты проводили в культурах в экспоненциальной фазе роста (одно - двух суточные) . Присутствие в среде тиосульфата не приводило к увеличению скорости фиксации СОг- Эти величины варьировали от 0,4 до 5,1% от углерода белка клеток. Это находится в пределах величин обычной гетеротрофной фиксации углекислоты .

Для изучения возможных путей утилизации органических кислот 5 исследуемых штаммов был использован радиоуглеродный метод определения интенсивности декарбоксилирования используемых органических кислот с применением ингибиторного анализа (табл. 3). Полученные результаты указывают на одновременное функционирование у обоих штаммо] ЦТК и глиоксилатного цикла независимо от присутствия тиосульфата, Изучение удельной активности ферментов ЦТК и глиоксилатного цикл;

Таблица 3

¡тенсивность декарбоксилирования радиоактивного малата (1,4-14С-ма-и) в суспензиях клеток бесцветных серобактерий (имп. /мин./иг белка)

В отсутствие В присутствии 7> инги- В присутствии % инги-

жтерии ингибитора ингибитора бирова- ингибитора бирова-

изоцитратлиазы ния сукцинатде- ния

(итаконат) гидрогеназы

(ТТРА)

~11оЬЬг1х 1,1-104±50 5,9'102«50 95 5,9"102±50 95

-с^рЫ1а

гамм 1№ 1,1'104±50 6,0'102>50 94 6,0"102±50 94

?исоЬЬг1х 5,0"103±50 0,7"103±50 86 0,7'103±50 86

ПорЫ 1а 9,0"103±50 1,9"103±50 79 1,8"103±50 80

гамм б,9-103^50 2,'1'103±50 70 1,2'103±50 83

зимечание: приведены средние значения из трех опытов.

габл. 4) подтверждает приведенный выше вывод. Отличительная осо-шность углеродного метаболизма заключается в низкой активности де-здрогеназ ЦТК при гетеротрофном росте - в 10 раз ниже по сравнению другими гетерстрофами.

Добавление в среду культивирования тиосульфата приводило к прилету биомассы у штаммов ТЪ1оЬЪг1х и ЬеисоЬЬг1х и одновременно к 1ижению активности ферментов ЦТК, но не влияло на изоцитратлиазу -шчевой фермент глиоксилатного цикла (табл. 4). Из приводимых в 1блице результатов очевидно, что при окислении тиосульфата в среде гльтивирования резко ингибируется активность гидратаз у серобакте-ш, в 10 - 30 раз, а активность дегидрогеназ всего в 2 - 7 раза.

Полученные результаты позволяют предположить, что при хемолито->теротрофном росте, при наличии тиосульфатзависимого дыхания сни-ются роль ЦТК в энергетическом метаболизме клеток. Это обусловле-> поступлением дополнительных электронов в ЭТЦ при окислении тио-гльфата и переключением потока восстановительных эквивалентов 1АДН2 и НАДФНг), синтезируемых в ЦТК при участии дегидрогеназ, с юргетического на конструктивный метаболизм, что и объясняет увели-

чение прироста биомассы.

Таблица 4

Сравнительная активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла (нмоль/мин./мг белка) при разных условиях культивирования

Thiothrix Leucothrix Escherichia

Ферменты arctophila thlophlla coll

штамм IN штамм 6WS BKM В-12 -52032"+S2032" -S2032" +S2032" -S2O32" +S2O32"

Аконитатгидратаза 97 2,8 52 12 90 но

Изоцитратдегидрогеназа (НАД)(ИДГ) 22 10 21 4 но но

Изоцитратдегидрог еназа (НАДФ)(ИДГ) 15 4 10 0,2 160 145

2-оксиглутарат-дегидрогеназа но 6 но 13 10 но

Сукцинатдегидро-геназа (СДГ) 25 •13 8 2 420 400

Фумаратгидратаза 48 5 102 22 410 но

Малатдегидро-геназа СМДГ) 23 6 30 4 210 200

Цитратсинтаза но 15 но 3,5 но но

Изоцитратлиаза* 40 30 25 19 130 но

Примечание: но - не определяли,*-ключевой фермент глиоксилатного цикла.Условия культивирования : в присутствии или в отсутствие тиосульфата клетки выращивали в среде с ацета том и лактатом

4. Распространение и активность нитчатых серобактерий в морских эпифитных сообществах Описание объекта исследования - бухты Кратерная.Бухта Кратеры представляет собой кратер 0,7 км2 затопленного древнего вулкана шлир, расположенного на острове Янкича (Курильские острова, Тихий íeaH). Бухта соединяется с морем мелководным проливом. Кальдера /лкана характеризуется проявлениями газогидротермальной активности i берегу и под водой, которые приурочены к кольцевому разлому, про-эдящему по периметру фундамента бухты. Проведенные ранее исследова-ля показали, что в районах выходов газогидротерм, содержащих вос-гановленные соединения серы, активно протекают процессы новообразо-ания органического вещества фотосинтезирующими и хемосинтезирующими якроорганизмами (Tarasov et. al., 1990; Нестеров и др., 1991).

Распространение Thlothríx в бухте Кратерная. Развитие нитча-ж бесцветных серобактерий сосредоточено, в основном, на литорали в энах газогидротерм в зарослях фукусовых водорослей. Здесь, при со-гржании в воде сульфида 0,17-2,17 мг/л и до 12 мг/л S/S2O32" на дубинах от О до 2 м отмечено массовое развитие Thlothríx в качестве вторичных" эпифитов на нитчатых водоролях, обрастающих фукусы. Лишь ^значительные по площади обрастания расположены на отдельных участ-ах литорали. Вокруг газогидротерм, выносящих большие количества /льфида, эти микроорганизмы не развиваются. Thlothríx в виде еди-дчных нитей обнаружен в серно- диатомовом мате на глубине 0,5 м и в пьго- бактериальных матах на глубине больше 2 м.

Оценка скорости окисления восстановленных серных соединений и лксации углекислоты. Скорость окисления соединений серы и фиксации 32 была определена в краткосрочных опытах с использованием радио-зотопов 35S и 14С. Было показано, что в обрастаниях Thlothríx проводит окисление сульфида, со скоростью 2,5 -3,4 мг/г белка в сутки тиосульфата - 30,8 - 34,8 мг S/ S2032~/r белка, что сопоставимо с ;личинами скорости окисления этих соединений Thlothríx в чистых /льтурах при литогетеротрофном росте .

Скорость фиксации СО2 при окислении сульфида составляла не боге 6,5 мкг/г белка в сутки. Эти величины на два-три порядка ниже ш аналогичных значений, определенных ранее для хемоавтотрофной по-/ляции Thlothríx nivea, развивающейся в сероводородном источнике vicGlennon, Makemson, 1988). Соотношение величин окисленный субс-?ат:Сфикс. на 1 - 2 порядка выше в популяции Thlothríx бухты Кра-

терной по сравнению со значениями, известными для хемоавтотрофных сероокисляющих бактерий (Kuenen, Bedeuker, 1982), что также свидетельствует о гетеротрофном метаболизме нитчатых серобактерий в бухте Кратерная.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на углубленные исследования представителей рода Thiothrix в последнее десятилетие,ставшие возможными в результате выделения чистых культур, до сих пор остается много неясного в вопросе о таксономическом составе, метаболизме представителей этой группы и их функциональной роли в природных сообществах.

В задачи настоящей работы входило дальнейшее изучение представителей рода Thiothrix, выделенных из мест их массового развития в различных экологических условиях. К таковым относятся обильные обрастания нитчатых серобактерий, морфологически сходных с Thiothrix, в бытовых и промышленных сточных водах и в эпифитных сообществах на литорали морских побережий. Основное внимание в работе было сосредоточено на изучении таксономического состава, роли восстановленных неорганических соединений серы в катаболических процессах и метаболической активности серобактерий в природной среде.

Из разных местообитаний было выделено 10 штаммов нитчатых серобактерий, морфологически близких Thiothrix ( по способности к формированию розеток, образованию гонидий и ряду других особенностей строения). При изучении морфологии, циклов развития, ультраструктуры, физиолого-1 биохимических и генотипических свойств выделенных штаммов была установлена их таксономическая неоднородность на уровне рода.Три штамма, выделенные из сточных вод, были описаны в качестве нового вида в пределах рода Thiothrix с видовым названием T.arctophila sp. nov. На основании изучения фено- и генотипических свойств с использованием анализа 16S- рРНК семь штаммов морских изолятов отнесены нами к несерным нитчатым скользящим бактериям рода Leucoth-rix, из них штаммы 2WS, 4WS, 6WS, 7WS описаны в качестве второго вида этого рода - L. thlophlla sp. nov. Необходимо отметить, что способность к окислению сульфида и тиосульфата до тетратионата, сульфата и внутриклеточной элементной серы была обнаружена ранее у одного изштаммов Leucothrlx mucor (Brock, 1981). В связи с этим Т.Д. Брок отмечал необходимость проведения дальнейших исследований способности к окислению серных соединений у штаммов L. mucor (Brock, 1989).

На основе анализа 16S- рРНК установлены филогенетические связи sbix видов в пределах гамма- подгруппы протеоОактерий, подтвердив; принадлежность выделенных бактерий к различным родам. Т. arcto-:1а оказался наиболее близок к Г. ramosa в филогенетической ветви (a Thlothrlx. L. thlophila составляет единую ветвь с L. тисог, )люционно достаточно обособленную от видов Thlothrlx.

Таким образом, результаты наших исследований позволили допол-?ь характеристику видового состава родов Thlothrlx и Leucothrlx и лпирить представления о таксономическом составе группы бесцветных юокисляющих бактерий.

В настоящей работе при изучении физиологии новых видов основное мание было уделено роли серных соединений в катаболических реак-IX и их связи с углеродным метаболизмом. Доказана способность но-i видов к литогетеротрофному росту при окислении тиосульфата и п>фита. Кроме ранее установленного для Т. ramosa механизма субст-гного фосфорилирования, у новых видов возможно также получение гргии за счет окислительного фосфорилирования в ЭТЦ с участием зцифических ферментов, участвующих в диссимиляционных окислитель-с процессах.

Отличительная особенность углеродного метаболизма изучаемых стерий состоит в очень низкой активности дегидрогеназ ЦТК, неза-;имо от наличия тиосульфата в среде, и в функционировании, наряду ITK, и глиоксилатного цикла. При окислении тиосульфата в культурах следованных видов происходит увеличение урожая клеток в 1,5 - 4 за. Одновременно в клетках снижается активность ферментов ЦТК вдратаз в 10-30 раз и дегидрогеназ в 2 - 7 раза). Активность эментов глиоксилатного цикла при окислении тиосульфата не уменьша-zh. Результаты позволяют предположить, что при хемолитогетеротроф-и росте при наличии субстратного и окислительного фосфорилирования лжается роль ЦТК в энергетическом метаболизме клеток и происходит эеключение потока восстановительных эквивалентов (НАДНг, НАДФНг) ЦТК в глиоксилатный цикл для целей конструктивного метаболизма, зледнее объясняет биохимический механизм увеличения прироста био-хы при окислении тиосульфата.

При изучении распространения нитчатых серобактерий в морских говиях обнаружено массовое развитие нитчатых розеткообразующих се-5актерий в виде эпифитов на подводной растительности на литорали лого моря и в районе выходов сероводородсодержащих газогидротерм в

бухте Кратерная (на Курильских островах). С использованием радиоактивных изотопов Na235S и Ма-23550з в краткосрочных опытах с эпифитны-ми обрастаниями бухты Кратерная определены достаточно высокие скорости окисления этих соединений. Показано, что при достаточно высокой скорости окисления сульфида и тиосульфата, присутствующих в морской воде, величины скорости фиксации углекислоты в популяции серо-окисляющих бактерий низкие, на уровне гетеротрофной фиксации СОг. Это свидетельствует о гетеротрофном метаболизме и участии сообществе эпифитных сероокисляющих бактерий не в продукции органического вещества, а в деструкционных процессах. Важная экологическая роль эпифитных серобактерий состоит в окислении токсичных соединений серы ъ предотвращении их диффузии из донных выходов в водную толщу. Это позволяет рассматривать выделенные культуры серобактерий как потенциальные объекты для биотехнологических целей при решении задач удаления токсичных соединений серы из окружающей среды.

Результаты исследований расширяют представление о биоразнообразии бесцветных серобактерий- их таксономическом составе, разнообразии метаболических возможностей и функциональной роли в природных сообществах.

выводи

1. Из обрастаний очистных сооружений выделены и охарактеризованы три штамма нитчатых серобактерий, способных к образованию розеток. На основе изучения фено- и генотипических свойств выделенные штаммы отнесены к новому виду Thlothrix arctophlla sp.nov.

" 2. Из сообщества эпифитных сероокисляющих бактерий литорали Белого моря выделено 7 штаммов морских нитчатых серобактерий, морфологически сходных с Thlothrix. Четыре штамма близкородственных организмов с уровнем гомологии 89 - 62 % отнесены к новому виду нитчатых бактерий рода Leucothrlx с видовым названием L. thlophlla sp. nov.

3. На основе анализа 16S- рРНК установлены филогенетические связи новых видов в пределах гамма-подгруппы протеобактерий: Г. arctophlla наиболее близок к Г. ramosa в пределах филогенетической ветви рода Thlothrix. L. thlophlla составляет единую ветвь с L.mucor, обособленную от видов Thlothrix.

4. Показана способность новых видов серобактерий к литогетерот-рофному росту при окислении тиосульфата и сульфита. Вовлечение промежуточного продукта окисления тиосульфата- сульфита в катаболичес-кие реакции происходит с участием механизмов окислительного фосфори-

эования в ЭТЦ и субстратного фосфорилирования.

5. При изучении особенностей углеродного метаболизма двух новых аов нитчатых серобактерий установлено одновременное функционирова-э НТК и глиоксилатного цикла и низкая активность дегидрогеназ ЦТК л органо- и литогетеротрофном росте. Окисление тиосульфата сопро-кдается резким снижением активности гидратаз и перераспределением установительных эквивалентов клеток (НАДНг, НАДФНг), из ЦТК в гли-зилатный цикл для целей конструктивного метаболизма.

6. Массовое развитие морских эпифитных нитчатых бактерий Leuco-rlx thiophlla обнаружено на литорали Белого моря, а также популя-л Thiothrix в районе подводных газогидротерм бухты Кратерная в Ти-vi океане.

Дана количественная оценка скорости процессов окисления восставленных серных соединений и фиксации углекислоты в сообществе элитных обрастаний с доминированием Thiothrix на литорали бухты Кра-эная. Показано, что эти процессы не сопряжены с хемосинтезом орга-теского вещества: участвуя в окислении серных соединений, сообщес-э эпифитных серобактерий развивается за счет деструкции органичес-< веществ.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Нестеров А.И., Горленко В.М., Старынин Д.А., Намсараев Б.Б., ЭининаГ.А., Качалкин В.И., Дульцева Н.М., Тарасов В.Г. Влияние цротермальных поступлений на микробиологические процессы синтеза ганического вещества в бухте Кратерная// Сборник "Мелководные гид-термы и экосистема бухты Кратерная". Часть 1. Функциональная ха-ктеристика. Владивосток, 1991. -С. 130 - 153.

2. Дульцева Н.М., Дубинина Г.A. Thiothrix arctophila sp.nov. -вый вид бесцветных нитчатых серобактерий// Микробиология. 1994. -

63. № 2.- С. 271 - 281.

3. Дульцева Н.М., Дубинина Г.А. Выделение морских нитчатых се-бактерий и описание нового вида Leucothrix thiophila sp. nov.// кробиология.- 1996.- T.65.N°1.-C. 89 - 98.

4. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Дульцева Н.М., Чурикова В.В. обенности углеродного метаболизма при хемолито- и хемоорганогете-трофном росте нитчатых серобактерий Thiothrix arctophila sp. nov. Leucothrix thiophila sp.nov.// Микробиология.- 1996. Т. 65. N°2.-

149 - 153.

5. Дульцева Н.М. Новые виды нитчатых серобактерий, выделенн из антропогенных и морских экосистем// Конференция "Автотрофные ми