Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоразнообразие бесцветных серобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биоразнообразие бесцветных серобактерий"

На правах рукописи

ГРАБОВИЧ Маргарита Юрьевна

БИОРАЗНООБРАЗИЕ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ: ТАКСОНОМИЯ, МЕТАБОЛИЗМ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2005

Работа выполнена в Воронежском государственном университете и в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Г.А. Дубинина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

М.Б. Вайнштейн

доктор биологических наук Л.М. Герасименко

доктор биологических наук С.А. Коннова

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится 12 мая 2005 года в 13й2 час на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук /г у —""" В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии представляют группу микроорганизмов, участвующих в окислительных реакциях геохимического цикла серы. Представители бесцветных серобактерий широко распространены в водоемах разного типа - пресных, морских, в районах океанических гидротерм и в антропогенных экосистемах. В природе серобактерии занимают уникальные экологические ниши - они существуют в пограничных областях между аэробной и анаэробной зонами, где играют важную роль в окислении токсичных серных соединений органической и неорганической природы, предотвращая их поступление в вышележащие слои воды. Изучение серобактерий активизировалось в последнее десятилетие благодаря проведению широкомасштабных экологических исследований морских экосистем в районах гидротермальной активности, что значительно расширило представления о биологии серобактерий в галофильных сообществах. Установлено, что серобактерии, такие как ßeggiatoa, Thioploca, Thiomargarita, содержащие вакуоли, в которых накапливаются нитраты в высокой концентрации и выполняющие роль терминального акцептора электронов, часто являются инициаторами существенной доли общей морской нитратредукции. В связи с этим бактерии этих родов оказались важным связующим звеном между циклами S, N, С.

Особый интерес представляют маты, в которых доминируют бесцветные серобактерии (Beggiatoa, Thioploca, «Thiodendron»). Бактериальные маты характеризуются высокой продуктивностью, широким распространением в водных экосистемах и являются эффективным биогеохимическим фильтром в превращении и преобразовании соединений углерода, серы и азота.

Таксономический состав группы бесцветных серобактерий слабо изучен из-за трудности выделения и поддержания чистых культур. Большинство так называемых «морфологических видов», известных по наблюдениям за природными популяциями, не удалось выделить в чистую культуру. Применение современных методов молекулярной биологии показало, что представители бесцветных серобактерий относятся к различным таксономическим и филогенетическим группам. Филогенетическое положение для ряда некультивируемых представителей серобактерий до сих пор не определено, хотя для некоторых серобактерий из природных популяций был проведен филогенетический анализ с применением флюоресцентной in situ гибридизации 16S рРНК (FISH) и анализа гена 16S рРНК.

Несмотря на пристальное внимание к этим микроорганизмам и их геохимической деятельности, количественных данных, отражающих роль бесцветных серобактерий в круговороте веществ в природе, недостаточно. Необходимо изучение метаболизма новых изолятов для понимания их функциональной роли в микробиальных сообществах. В настоящее время существует ограниченное количество данных по метаболическому разнообразию бесцветных серобактерий. У подавляющего большинства серобактерий не

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург

Ш^РК

известны пути метаболизма углерода и серы, не изучены механизмы регуляции метаболических путей в быстро меняющихся градиентных условиях. Поскольку бесцветные серобактерии обитают в неравновесных условиях среды, то выявление факторов внешней среды, оказывающих на них воздействие, является абсолютно необходимым и будет способствовать выявлению «уязвимых» мест в метаболизме клетки, а также позволит понять стратегию их биохимической адаптации к условиям внешней среды.

Большинство бесцветных серобактерий являются микроаэрофилами, чем и объясняется специфика их экониши и трудности с выделением чистых культур. Однако практически отсутствуют сведения о механизмах регуляции клеточного обмена веществ у бесцветных серобактерий при смене кислородного режима среды, также не изучены реакции стресс-лимитирующей антиоксидантной системы бактерий на процессы образования активных форм кислорода (АФК).

Таким образом, анализ имеющихся сведений о бесцветных серобактериях ясно показывает, что наши знания об их разнообразии и филогении, а также о метаболизме и адаптационных механизмах его регуляции далеки от их понимания.

Состояние вопроса. Среди микроорганизмов, участвующих в окислении неорганических соединений серы, особую группу составляют так называемые бесцветные серобактерии. Они включают представителей разных физиологических, таксономических и филогенетических групп. Единственным общим признаком, объединяющим их, является способность откладывать внутри клеток элементную серу.

Многие бесцветные серобактерии с давнего времени привлекают внимание исследователей благодаря массовому развитию в природе в определенных условиях, где они доминируют в отдельных сообществах, особенностям физиологии, гигантским размерам, своеобразной морфологии клеток. Достаточно вспомнить, что именно с изучением бесцветных серобактерий Beggiatoa и ТкШкггх в конце XIX века связано создание С.Н..Виноградским концепции хемолитоавтотрофии. Однако роль соединений серы в метаболизме бесцветных серобактерий до конца не ясна. Высказывается две точки зрения: восстановленные соединения серы могут выполнять роль доноров электронов для энергетического метаболизма, а также они могут участвовать в детоксикации АФК.

Изучение таксономии, филогении представителей этой группы затруднено из-за сложности их культивирования, хотя существенный вклад в изучение филогении некультивируемых на сегодня серобактерий позволили внести современные молекулярно-биологические и молекулярно-экологические методы при исследовании природных сообществ. На основании морфологических признаков бесцветные серобактерии традиционно подразделяют на две группы — одноклеточные и нитчатые. Из известных по морфологическим описаниям более чем 60 видов в настоящее время удалось выделить чистые культуры всего лишь несколько видов нитчатых и одноклеточных серобактерий. Детальное физиологическое исследование выделенных штаммов показало, что представители этой группы существенно различаются по типу энергетического и

конструктивного метаболизма и по роли серных соединений в их жизнедеятельности.

На основании имеющихся данных предполагается возможность следующих путей использования неорганических соединений серы бесцветными серобактериями в процессах, не связанных с ассимиляцией в конструктивном обмене.

' 1. Использование восстановленных форм серы в качестве доноров электронов либо для фиксации углекислоты у хемолитоавтотрофов, либо для ассимиляции органических веществ при хемолитогетеротрофном росте. В физиологическом плане известные виды серобактерий изучены слабо. Такие бактерии, как Ahromatium, Thiovulum, Thioploca и Thiomargarita, не получены в чистых культурах. Однако исследования, проведенные с природными популяциями показали способность этих организмов к литотрофному росту (Wirsen, Jannasch, 1978; Maier, 1984; Fossing, Gallardo et al., 1995, Grey et al., 1999; Head et al., 2000; Schulz et al., 1999). Удалось показать, что пресноводные бактерии рода Thiothrix (Larkin, Shinabarger, 1983; Hagen, Nelson, 1996; Kohno, Inomata, 1990; Одинцова, Дубинина, 1993; Odintsova et al., 1993) и морские штаммы Beggiatoa способны осуществлять наряду с органогетеротрофным, также литогетеротрофный, миксотрофный и хемоавтотрофный метаболизм (Nelson, Jannasch, 1983; Nelson et al., 1986; Nelson, 1989; Hagen, Nelson, 1997). Особенности метаболизма пресноводных представителей Beggiatoa изучены слабо. Для них не показана способность к литотрофному росту, хотя высказывается предположение о их способности к миксотрофному росту (Strohl, Schmidt, 1984; Hagen, Nelson, 1997).

Выявлена важная роль бесцветных серобактерий как хемолитоавтотрофных первичных продуцентов в сообществах гидротерм (Nelson et al., 1986; Hagen, Nelson, 1995). В последнее время проблеме изучения функциональной роли бесцветных серобактерий в водных экосистемах уделяется значительное внимание. Было показано участие нитчатых серобактерий родов Thiothrix и Beggiatoa в продукции органического вещества за счет хемосинтеза в морских водоемах (Sweerts et al. 1990). В районах проявления гидротермальной активности в океане установлено участие представителей рода Thiothrix во взаимодействиях с высшими звеньями трофической цепи, в частности, с креветками (Пименов и др., 1992; Gebruc et al., 1993). а также Beggiatoa - в продукции органического вещества в районах гидротермальной активности за счет хемосинтеза (Nelson et al., 1986; Nelson et al., 1989: Gundersen et al, 1992; Laitan et al., 1994; McHatton et al., 1996; Chung, Strom, 1997).

Метаболизм таких одноклеточных серобактерий, как Macromonas, Thiovulum, Achromatium, Thiospira, Thiobacterium остается малоизученным.

2. Использование соединений серы для детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода. Для всех выделенных к настоящему времени пресноводных штаммов Beggiatoa, включая типовой штамм В alba, а также одноклеточных серобактерий - Macromonas bipunctata, Thiospira spp. не удалось показать способность к использованию серных соединений в энергетическом

метаболизме. В то же время для ряда представителей Thiothrix и Beggiatoa, а также Macromonas bipunctata, Thiospira spp. предполагается перекисный механизм окисления соединений серы (Burton, Morita, 1964; Nelson, Castenholtz, 1981; Одинцова, Дубинина, 1993; Чеканова, Дубинина, 1990): сероводород используется бактериями для удаления токсичного продукта метаболизма - пероксида водорода и супероксидного аниона, что сопровождается накоплением элементной серы в клетках. В связи с этим необходимы дополнительные исследования функциональной роли соединений серы.

Способность к автотрофному росту для многочисленных пресноводных штаммов Beggiatoa до сих пор не удалось доказать, несмотря на предпринимаемые исследователями попытки (Nelson et al 1982; Hagen, Nelson, 1997). 3. Наряду с окислением восстановленных соединений серы, у Beggiatoa обнаружен обратный процесс — редукция внутриклеточной серы до HiS. Имеются данные об использовании серобактериями соединений серы в качестве акцепторов электронов при анаэробном дыхании (Nelson, Castenholz, 1981; Fossing et al., 1995; McHatton et al., 1996; Otte et al., 1999). Для некоторых серобактерий, содержащих вакуоль, в которой аккумулируются нитраты, показана способность к анаэробному дыханию и использованию последних в качестве терминального акцептора электронов.

Таким образом, можно заключить, что большинство серобактерий, в частности Beggiatoa, Thiothrix, Thioploca, Thiomargarita, Thiovulum, Achromatium, обладают высокой физиологической приспособленностью к условиям среды и могут изменять характер метаболизма в зависимости от условий среды обитания. Знание ответных биохимических реакций бесцветных серобактерий на воздействие стрессорных факторов, возникающих в условиях их экотопов и способствующих функционированию или переживанию в гетерогенных условиях среды, позволит выявить механизмы устойчивости бесцветных серобактерий к существованию в неравновесных природных системах. Изучение множественных метаболических путей, обеспечивающих адаптацию серобактерий в неравновесных условиях среды, имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования организма, как целостной системы и благодаря этому создает условия для понимания господствующего положения серобактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах серы, углерода, азота.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы явилась оценка биоразнообразия пресноводных представителей бесцветных серобактерий в отношении таксономического состава, метаболизма и путей его регуляции.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав и филогенетическое положение представителей пресноводных бесцветных серобактерий.

2. Выявить функциональную роль восстановленных соединений серы и

механизмы их окисления в метаболизме различных представителей серобактерий.

3. Исследовать серный, углеродный метаболизм и биохимические механизмы их регуляции у различных представителей серобактерий.

4. Выявить специфические причины микроаэрофилии у различных физиологических групп бесцветных серобактерий (миксотрофных, литоавтотрофных и облигатно гетеротрофных представителей).

5. Определить роль кислорода в регуляции метаболизма аэротолерантных спирохет - основного компонента бактериальных серных матов «Thiodendron».

Научная новизна и значимость работы

Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биоразнообразии бесцветных серобактерий. Показано, что группа пресноводных бесцветных серобактерий гетерогенна по составу. Анализ последовательностей гена 16S рРНК позволил отнести все изученные пресноводные серобактерии к альфа-, бета-, гамма - классам филума Proteobacteria. Изучен таксономический состав и филогенетическое положение серных спирилл, а также пресноводных штаммов Beggiatoa, Macromonas. Согласно опубликованным ранее данным (Schleifer et al, 1991; Ding and Yokota, 2002; Cleenwerck et al., 2003) и полученным нами результатам на основе изучения штаммов серных спирилл была проведена реклассификация некоторых видов рода Aquaspirillum Мы предлагаем оставить в составе рода Aquaspirillum вид А bipunctata sp. nov. вместе с типовым и единственным видом A. serpens, который, согласно филогенетическому анализу, группируется с A bipunctata

Бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер, включающий виды [Aquaspirillum] voronezhense, [.Aquaspirillum] kuznetsovii, [.Aquaspirillum] giesbergeri, [Aquaspirillum] sinuosum, [Aquaspirillum] anulus предложено классифицировать как представителей нового рода Giesbergeria gen.nov. -Giesbergeria voronezhense sp. nov. (типовой вид), Giesbergeria kuznetsovii sp. nov., Giesbergeria giesbergeri comb, nov., Giesbergeria sinuosa comb, nov., Giesbergeria anula comb, nov., соответственно: бактерии филогенетического спектра видов [Aquaspirillum] metamorphum, [Aquaspirillum] psychrophillum - как Simplispira metamorpha comb.nov. (типовой вид) и Simplispira psychrophilla comb.nov., соответственно; бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер подвидов [Aquaspirillum] itersonii: [Aquaspirillum] itersonii subsp. itersonii, [Aquaspirillum] itersonii subsp. niponicum - как Denitrospira itersonii comb, nov.: Denitrospira itersonii subsp. itersonii comb, nov., Denitrospira itersonii subsp. niponicum comb, nov., соответственно.

Расширены границы рода Spirillum, который ранее включал единственный вид - S volutans4, в его состав включены серные спириллы, отнесенные к двум новым видам рода Spirillum: Spirillum winogradskii comb. nov. и Spirillum kriegii sp. nov.

Было установлено, что штаммы серных спирилл, способные накапливать S0 внутриклеточно в присутствии сульфида, согласно полифазному анализу относятся

к разным таксонам Betaproteobacteria (роды Aquaspirillum, G icshergeria, Simplispira, Comamonas и Spirillum) и Alphaproteobacteria (Denitrospira). Полученные нами данные не оставляют оснований для сохранения этих бактерий в составе рода Thiospira.

На базе уникальной коллекции бесцветных серобактерий, которая представлена бактериями, выделенными нами (23 штамма) и любезно предоставленными коллегами из коллекпи уникальных микроорганизмов ИНМИ РАН, DSMZ (10 штаммов), CIP (1 штамм) было показано, что бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются по функциональной роли и механизму окисления восстановленных соединений серы: литотрофные серобактерии используют восстановленные соединения серы в качестве энергетического субстрата, а облигатные органотрофы используют соединения серы для снятия токсического эффекта, оказываемого продуктами неполного восстановления кислорода на их метаболизм. Было выявлено, что у гетеротрофных бесцветных серобактерий в ответ на образование АФК возникает консолидированный адаптивный ответ, включающий увеличение активности антиоксидантных ферментов, метаболитной антиокислительной активности (МАОА), индукцию анаплеротических последовательностей, а также синтез экзополисахаридов (ЭПС).

Выявлено, что у факультативно литотрофных бесцветных серобактерий регуляция метаболизма может инициироваться различными факторами внешней среды (кислородом, органическими соединениями, неорганическими донорами электронов). При этом может меняться метаболическая активность, а также тип питания. Впервые показано, что регуляция и переключение метаболических функций у некоторых факультативных литогетеротрофных серобактерий может осуществляться за счет структурно-функциональной перестройки малатдегидрогеназной системы, перераспределения потока восстановительных эквивалентов и изменения состава электронтранспортной цепи (ЭТЦ).

Расширены представления о причинах микроаэрофилии и аэротолерантности бактерий. Установлено, что приуроченность к росту в микроаэробных условиях может быть обусловлена чувствительностью ферментов углеродного и серного диссимиляционного окислительного метаболизма к концентрации кислорода, АФК, а также потребностью факультативно литогетеротрофных серобактерий в дополнительных донорах электронов по причине низкой активности дегидрогеназ, поставляющих восстановительные эквиваленты в ЭТЦ.

Аэротолерантность спирохет из симбиотической ассоциации «.Thiodendron», осуществляющих анаэробный тип метаболизма, обусловлена наличием альтернативных ферментных систем, позволяющих им извлекать энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы. Практическая значимость

Результаты исследований расширяют фундаментальные знания о разнообразии бесцветных серобактерий и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их метаболизма; позволяют с новых позиций подойти к изучению их

функциональной роли в природных сообществах, в продукционных и деструкционных процессах и вкладе в круговорот углерода и серы в природе.

Создана уникальная коллекция новых бесцветных серобактерий, некоторые из которых можно использовать для очистки водных экосистем от токсичных соединений серы.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1 Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды», Томск, 1995.

2. Международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000.

3. Научной конференции «Водные экосистемы и организмы», Москва, МГУ им.

М.В. Ломоносова, 2001.

4. Iя FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003.

5. Ill съезде биофизиков России, Воронеж, 2004.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, описание объектов и методов исследований, изложение экспериментов с обсуждением и заключением, общее заключение), основных выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 307 страницах, содержит 74 таблицы и 62 рисунка, а также 30 страниц приложения. Список цитируемой литературы включает 366 работ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 работы: статей 35, тезисов и докладов на конференциях и симпозиумах 8. Место проведения работы

В основном работа проведена на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета и в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН при участии д.б.н. Дубининой Г.А., а также при участии студентов, аспирантов. Филогенетические, генотипические и хемотаксономические исследования проводились в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН совместно с к.б.н. Гавриш Е.Ю., в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН совместно с к.б.н. Лысенко A.M., к.б.н. Черных H.A. и к.б.н. Туровой Т.П. и совместно с д.б.н. Осиповым Г.А. (Академическая группа Академика РАМН Исакова Ю.Ф.). Исследования состава цитохромов серобактерий проводилось в Институте физико-химической биологии им Белозерского совместно с к.б.н. Мунтян М.С. Совместно с группой биохимиков ВГУ под руководством д.б.н., проф. Епринцева А.Т. была проведена комплексная работа по изучению функционально-структурных свойств

мдг.

Исследования, представленные в данной работе были финансированы грантами Госкомвуза России (94-10.7-117, 96-0-10.0-64), грантами Российского фонда фундаментальных исследований (94-04-11956; 96-04-48518; 96-04-64100к; 99-04-48686; 99-04-63022к; 00-04-63043к; 01-04-63022к; 02-04-49185; 02-04-63078к; 03-04-63040к; 04-04-63081к).

Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим участие на разных этапах работы.

Автор выражает глубокую признательность научному консультанту д.б.н. проф. Дубининой Г.А. за содействие в работе и помощь при обсуждении результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В филогенетическом отношении пресноводные бесцветные серобактерии гетерогенны по составу и относятся к альфа-, бета-, гамма - классам филума Proteobacteria.

2. На основе молекулярно-генетических исследований проведена ревизия представителей рода Aquaspirillum, к которому ранее было отнесено большинство штаммов серных спирилл.

3. Бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются

по функциональной роли восстановленных соединений серы в их метаболизме.

4. Представители бесцветных серобактерий обладают широким спектром биохимических адаптационных механизмов, позволяющих им выживать и доминировать в нестабильных условиях кислородного режима в природных средах.

5. Микроаэрофилия бесцветных серобактерий обусловлена влиянием активных форм кислорода на различные стороны их конструктивного и энергетического метаболизма.

6. Аэротолерантность анаэробных спирохет обусловлена наличием альтернативных ферментных систем, позволяющих им извлекать энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

В качестве объектов исследования были использованы новые изоляты бесцветных серобактерий, которые нам удалось выделить в чистую культуру: Macromonas bipunctata (штаммы Д-405, 406,407,408), 17 штаммов серных спирилл (Д-405, 407 - 412, 415, 416, 419, 420, 422 - 425, 427, 430), два штамма спирохет из симбиотической ассоциации «Thiodendron» (Р, БМ), а также культуры из коллекций DSMZ: Beggiatoa alba DSM 1416, Leucothrix mucor DSM 2157, Aquaspirillwn serpens DSM 68, [A.] sinuosum DSM 11556, [A ] giesbergeri DSM 9157, [A.] anulus CIP 107877, [A.] metamorphum DSM 1837, [A ] itersonii subsp. nipponicum DSM 11590, коллекции уникальных микроорганизмов Института микробиологии РАН: 6 штаммов бактерий рода Leucothrix (штаммы WS 1 - 6 ) и Thiothrix arctophila штамм IN, Beggiatoa leptomitiformis (штаммы Д-401, Д-402).

Для культивирования серобактерий использовали оригинальные рецепты состава питательных сред: В. leptomitiformis и B.alba (Кузнецов, Дубинина, 1989), Leucothrix sp. и L. thiophila (Дульцева, Дубинина, 1996), L. тисог, согласно каталогу DSMZ, T.arctophila (Williams, Unz,1985), M. bipunctata, серные спириллы и Е. coli - применяли видоизмененную PSS-среду (Кузнецов, Дубинина, 1989), спирохеты из серных матов «Thiodendron» (Дубинина и др., 1993а), Rhodococcus erytropolis (Милехина и др., 3991), Vulcanithermus medioatlanticus (Miroshnichenko et al., 2002). Перед посевом во все питательные среды для разных бактерий вносили раствор микроэлементов и витаминов - 1,0 х Ю"3 (г/л) (Pfennig, Lippert, 1966). В ряде опытов культивирование вышеуказанных бактерий осуществляли как в присутствие тиосульфата (1 г/л), так и в его отсутствие.

Техника создания микроаэробных условий. Во всех опытах соотношение объемов жидкой и газовой фаз составляло 1:10 для предотвращения заметного снижения Ог в газовой и жидкой фазе по мере его потребления бактериями. Культивирование осуществляли в герметически закрытых флаконах. Газовую фазу с различным содержанием кислорода создавали следующим образом: для Beggiatoa - бутыли сначала заполняли доверху свежепрокипяченой стерильной средой и затем вытесняли определенный объем жидкости аргоном и, дополнительно, необходимым объемом воздуха в определенных соотношениях; для серных спирилл - флаконы со свежепрокипяченной средой сначала вакуумировали, затем продували аргоном (данную процедуру выполняли три раза), а затем вводили необходимый объем воздуха в определенных соотношениях; для спирохет -флаконы с жидкой средой продували азотом в течение трех минут, а затем вводили воздух в заполненные азотом флаконы с содержанием 1,4 % кислорода в газе, что соответствовало 0,4 - 0,5 мг 02 в 1 л жидкости.

Изучение фенотипических, хемотаксономических, генотипических и филогенетических свойств чистых культур бесцветных серобактерий проводили с помощью стандартных методов, используемых в микробиологической практике.

Получение ферментных препаратов Суспензию клеток, клеточные экстракты (гомогенат), супернатант (цитоплазматическую фракцию) и мембранные препараты клеток Beggiatoa и Leucothrix получали как описано ранее (Грабович и др., 1998; Grabovich et al, 1999).

Методы определения активности ферментов. Активность ферментов серного метаболизма и ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) определяли в супернатанте или гомогенате спектрофотометрическими методами, как описано ранее (Грабович и др., 1998). Активность ключевых ферментов цикла Кальвина и карбоангидразы определяли в супернатанте по соответствующим методикам (Патрицкая и др., 2001). Активность ферментов гликолиза, глюконеогенеза, антиоксидантной защиты клеток, активность ферментов, участвующих в превращении пирувата в процессе брожения у спирохет, осуществляли согласно общепринятым методам подробно описанными в диссертации (Грабович, 2005).

Физико-химические методы анализа Определение интенсивности ассимиляции NaHC03 в растворе и интенсивности процесса декарбоксилирования органических кислот проводили радиоизотопным методом по соответствующим методикам (Патрицкая и др., 2001 ; Грабович и др., 1993).

Анализ неорганических соединений серы. Сероводород определяли

колориметрически с использованием диметил-р-фенилендиамина. В случае, когда продукты окисления тиосульфата не определяли, то его количество определяли методом иодометрического титрования. Раздельное определение S2O32", S4062", S3Oe2" при их совместном присутствии в среде проводили цианолитическим методом (Roy, Trudinger, 1970) или методом раздельного иодометрического титрования (Резников и др. 1970). Содержание S042" определяли хлоранилатным методом (Уильяме. 1982). Элементную серу определяли по методу Морриса (Morris et al. 1948).

Определение белка. Белок клеточной биомассы определяли методом Лоури (Lowry et al, 1951). Содержание аминокислот в культуральной среде после удаления клеток ультрафильтрацией определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951), и параллельно с нингидрином (Moore, Stein, 1954) с использованием БСА (бычий сывороточный альбумин) в качестве стандарта. Содержание углерода белка при автотрофном росте рассчитывали, исходя из того, что углерод составляет ~ 54 % от белка клеток (Jukes et al. 1975; Doolittle, 1981), углерод белка от всего углерода клеток составляет ~ 43-44 %, согласно данным по фракционированию углерода клеток в чистых культурах различных микроорганизмов и в частности, Beggiatoa MS-81-6 (Cuhel et al. 1981; Konopka, Schnur 1980; Nelson, Holger 1983).

Спектры поглощения цитохромов снимали на спектрофотометре SLM Aminco DW-2000 при комнатной темепратуре. Стандартное расхождение значении между повторностями не превышало 5 %. Для определения ковалентно связанных гемов цитохромов проводили электрофорез в полиакриламидном геле. SDS-Page готовили в соответствии с методом Лэммли (Laemirtmli U.K., 1970); гель фиксировали как описано у Thomas (Thomas etal., 1976).

Методы определения растворенного кислорода. Для определения потребления кислорода суспензией клеток использовали полярографический метод. Скорость потребления кислорода в суспензии клеток регистрировали на самопишущем полярографе ПУ-1.

Очистка и изучение свойств малатдегидрогеназы (МДГ). Высокоочищенные препараты МДГ получали согласно схеме очистки, включающей следующие стадии: получение экстракта фермента, гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25 (Pharmacia, Швеция), ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гель-хроматографию на колонке с сефадексом G-200 (Pharmacia, Швеция). Для определения молекулярной массы нативной .малатдегидрогеназы использовали гель-фильтрацию через сефадекс G-200 (Остерман, 1973). Метод определения концентрации внутриклеточной АТФ. Концентрацию внутриклеточной АТФ проводили биолюминесцентным методом на люминометре ЛБ - ЗПА, «Климби» (Россия), используя люциферин - люциферазный реактив, изготавливаемый в Лаборатории химической кинетики МГУ (Угарова и др., 1987). Определение продуктов брожения. Этанол и ацетат определяли методом газоадсорбционной хроматографии Chrom-5 (Чехия) с пламенно-ионизационным детектором. Летучие органические вещества определяли на Chromosorb 101, размер колонки: длина-1.5 м, диаметр-Змм. Режимы хроматографа были следущие: газ-носитель - аргон, расход 40 мл/мин, температура испарителя 200 °С, детектора 230 °С, объем пробы 5 мкл (Кевбрин, 1993). Формиат определяли

спекрофотометрически при длине волны 515 нм (Lang, Lang, 1972). Пируват определяли спекрофотометрически при длине волны 505 нм. (Прохорова, 1982). Концентрацию глюкозы определяли в реакции с фенолом спектрофотометрически при длине волны 488 нм (Герхард, 1984).

Перманентные газы определяли на хроматографе ЛХМ-80 с каторометром. Газ-носитель - аргон, расход 40 мл/мин, ток накала нити 30 мА, температура колонок комнатная.

Определение Н202. Пероксид водорода определяли в суспензии клеток двумя методами: 1) расчётным - по скорости потребления кислорода до и после внесения каталазы в инкубационную смесь: кислород в эгом случае определяли полярографическим методом на полярографе LP-7 (ЧССР); 2) хемилюминесцентным - на хемилюминометре медицинском ХАЛМ 1Ц-01 и люминометре ЛБ ~ ЗПА, «Климби» (Россия) в присутствии люминола (Hodson, Fridovich, 1973; Аль-Хадиди и др. 1985). Определение Н202 в клетках бактерий цитохимическим методом осуществляли с использованием в качестве субстрата окисления диаминобензидина (ДАБ) (Graham, Karnovsky, 1966). Определение метаболитной антиокислительной активности осуществляли по регистрации скорости окисления восстановленной формы 2,6 дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) кислородом, растворенным в реакционной среде (Семенов, Ярош, 1985).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-4 кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0,05 (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Таксономический состав и филогенетическое положение бесцветных серобактерий

Благодаря разработанным ранее методам культивирования нами была получена уникальная коллекция бесцветных серобактерий, выделенных из пресноводных и морских местобитаний, отсутствующая в других международных лабораториях: получен ряд штаммов одноклеточных серобактерий - 17 штаммов серных спирилл, один из известных видов Macromonas (М bipunctata), аэротолерантных сероокисляющих спирохет. Наличие коллекции чистых культур бесцветных серобактерий позволило всесторине изучить эту группу микроорганизмов цикла серы.

1.1. Филогенетическое положение штаммов серных спирилл

В начале прошлого века с использованием морфологического подхода было описано несколько видов серных спирилл, отнесенных к роду Thiospira. В последующие годы штаммы бесцветных серных спирилл были получены лишь в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии РАН и на кафедре физиологии и биохимии ВГУ. Изучение фено- и генотипических свойств серных спирилл позволило провести их ревизию и поместить в пределах рода Aquaspirillum и Spirillum. Однако исследование

филогении и таксономии с использованием современных молекулярно-биологических методов не было применено к этим микроорганизмам.

Необходимо отметить, что применение в последние годы современных методов молекулярно-генетических исследований к представителям рода Aquaspirillum показало филогенетическую гетерогенность этого рода. В связи с неопределенным таксономическим статусом представителей рода Aquaspirillum таксономическое положение аэробных серных спирилл также оставалось не выясненным. В связи с этим одна из задач работы состояла в исследовании филогенетического положения и таксономической принадлежности описанных ранее аэробных и микроаэрофильных серных спирилл.

Методы молекулярно-генетического анализа были применены к восьми коллекционным штаммам аэробных серных спирилл, отнесенных ранее на основании лишь фенотипических и некоторых генотипических свойств к роду Aquaspirillum.

Как свидетельствуют полученные результаты (рис. 1), большинство штаммов спирилл принадлежит к бета-классу протеобактерий, за исключением штамма Д-425, описанного ранее как [Aquaspirillum] elegans (Грабович и др., 1990). Последний образует обособленный кластер с двумя подвидами [Aquaspirillum] itersonii альфапротеобактерий (99,2 и 99,9 % сходства 16S рДНК) Уровень гибридизации ДНК штамма Д-425 со штаммом [Aquaspirillum] itersonii subsp. nipponicum DSM 11590 составил 99 %, что позволяет классифицировать его как новый штамм [Aquaspirillum ] itersonii subsp. nipponicum. В пределах бетапротеобактерий все изученные штаммы были отнесены к двум семействам: Comamonadaceae и Neisseriaceae. Штамм Д-411, описанный ранее как A bipunctata (Дубинина и др., 1993), группируется вместе с типовым видом рода - A. serpens, образуя обособленную ветвь в семействе Neisseriaceae (99,5 % сходства 16S рДНК), а на основании полифазного анализа является самостоятельным видом рода Aquaspirillum.

Другие 6 штаммов спирилл относятся к семейству Comamonadaceae. Штаммы Д-408 и Д-415, описанный ранее как A. denitrificans (Дубинина и др., 1989), имеют высокий процент сходства 16S рДНК с ранее валидно описанными видами рода Comamonas: С. aquatica (99,4 %) и С. denitrificans (99,6 %).

Штамм Д-416 образует устойчивый кластер с [Aquaspirillum] metamorphum и [Aquaspirillum] psychrophilum (99,8 % сходства 16S рДНК) Уровень гибридизации ДНК штамма Д-416 со штаммом [Aquaspirillum] metamorphum DSMZ18377 составил 95 %, что позволяет классифицировать его как новый штамм вида [Aquaspirillum] metamorphum.

Штаммы новых видов Д-412, описанные ранее как [Aquaspirillum] kuznetsovii (Грабович, 1984), штаммы Д-419, Д-420, описанные ранее как [Aquaspirillum] vorortezhense (Грабович и др., 1987), формируют стабильный кластер с [Aquaspirillum] anulus, [Aquaspirillum] giesbergeri, [.Aquaspirillum] sinuosum (98,8-99 % сходства 16S рДНК).

от

ia

100 ¿¡usptrilhmamlis IAM 14ЗДТ(АВ074527) "Y

8f Aquaspirilliwnsp. 412 (AY7809Q7) . ^ КОДрсврглУ/дог swuxwt LMj 4393 (АГО78754) I -и AqMsprWungesbergrt 1AM149494 (АЮ74522) f WAquiBpmliumsp. 419 (AY7809Q5) I

. ' AquaymUumsp. 420 (AY780906) ^

li-Aadmarixaienxsiixp. одаиеАТОС 19860T(AP078759)

;1 ОарЬтЫаегпЛюк&сеп NA10B4AB064317) AacbmnKdjlum BS&»1T(Y18616) Aqumpuilhjn psychnpMwn LMj 5408т (АГО78755) 100 [ АтщжпОтШаягрЫтDSM1837T (Y18618)

}

4

1(X>

loo

-Ecoh

Г —Щ Aquaspirilbmep. 416 (AY7809M) ' AquasfirilliMnsn 4(T7

100-Hyterwnethgracue ATCC 19fijf (АГО78753)

P-Ottawa thaaacbe K.1 l'(AJ537466)

U0g--Rhxhferazferriredcem T118r (AF43»«)

Qrwbaoter daicaim LM3432ST (AF078756) Ddfla ааЛкопт ACM489T (ATO7S774) - frtxfymcns dentoifictrts AS-PI (D14320)

V-Сптжпопсп testmerori ATOC119%T (Ml 1224)

П-Commons какова KCIC 12005T(AF275377)

•i ... ЩСотжтпкdertrificaK415 Ч 4У-1 Comxvnas cfeninfiarcl23T (AF233877) ol 1—лйптшге 23310 (AI251577)

1 94,--Carawnastem&mlMj 12534AJ430342)

, 9 i P— Contanonaskersteru LMG34754AM3C047)

| ^G»«»ntMirc4ii«£»LMj2J70T(AM3Q344)

I | ComrwntaaquaticaWi

! L Comrwmsaquaica'B2

T-ТЫЬпа dslwdyeca ACM3522т (X65590)

I_Щ90,-^apiMmJhsi^mseM>)lTA^3S359

Я7П— Aqiasptnllienauctrcphicwi IAM 1W2 (AB074524)

loo.-Du&nilazoodoeoides 1AM126704D142561

«7- Aquaspirillum crcticwn IAM 14963Т(АВД74523)

,-FomMbriocitnac DSM6150T(Y176Q2X

94 100-Neisseria gjnorrltxaeATOZmTA' (AF146369)

■~L| I--UngeUa fangae ATOC23330T (MZ2517)

H ---Lartbacter hongkcngznsis HKU1 (AF389Q85)

18! 1-Anaspinlhmdstxr IAM 14943T(AB074526)

П I-Afuaspviilitttpuridccrcf^intn 1AM 149&4T (AB076000)

1. 100 r AquaspirUUtmsp.4\\ (AY90402^

U aias/mllum serpens IAM 13Wr(AB074518) -

ptepmlhmpofymyrphun 1ГО 13©1T(AB00W81)

99 П-(УЮ\(Я)

8б[ IS-fbxaifmllimfflm ATCC 15798T(M59065)

AnsarillMltooterunVaMB 1I861T fZ296!9)

RhtDabiimlegmnaxrwnbv исиеШЗ\2501 (U89830) Rhocbsanllumphaonancitn Е-11 (E8Q777) ¡ШщЛШп rnbrun ATOC 11 TO7 (D8077X) Rh/dosptra truepen ATOC 700224T (X99671) - Roseaspma meSosciina BN280 (АЮ00989) }^/kjuaspinU>mpeK^mmsisp.peregnnum IPO 149Z21 (AB000479)

1 AquxfxrillumpeKg-uimsiisp. trie/pen 1Ю 13617T(AB000480) I 100—Aquaspwtllum uenom aispi ilersom 1ГО15648T (АВООИ77)

Aquaspirillum itertOfti sitofL npporicum 425 т__1

a

¿quaspmlhm aersonii afcp nppomam IAM 14945 (AB074520) j

Рис. 1. Положение представителей серных спирилл на филогенетическом дереве филума Proteobacteria. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap"- анализа (значищими признаются значения более 95). 1,2,3 - филогенетически обособленные кластеры, включающие штаммы серных спирилл и претендующие на статус нового рода

Таким образом, филогенетические исследования позволили выявить три филогенетически обособленных кластера (рис.1), представители которых имеют менее 95 % сходства 168 рРНК с ближайшими филогенетическими соседями, что позволяет характеризовать родство между ними на межродовом уровне. Обособленность трех филогенетических кластеров подтверждается и результатами сравнительного фенотипического, хемотаксономического и генотипического анализа филогенетически близких им родов (табл.1).

Таблица 1. Основные дифференцирующие признаки новых (Simplispira gen. nov., Giesbergeria gen. nov.) и близкородственных им родов

Различительные признаки родов и .2 I .в I» 1 IS 1 « ts 8 и

1 1 ■s Е

3 ч •с а

Морфология клетки п С с п п п,с

Биполярный политрих i + + J нд +

Хемолитотрофный рост с Нг ± - - - г - -

Восстановление нитратов + - + + ±

Денитрификация ± - + + ±

Источники углерода,

используемые для роста: 15-фруктоза ГНглюкоза + -н + - нд + + + ±

глицерол

Преобладающие жирные кислоты (4): 16:0 + + + + + +

16:1 + + + + + +

18:1 + ± - + + +

Г+Ц в ДНК, мол. % 62-66 63-65 56,5 - 60 64-65 66 59,7 - 68,7

Источник выделения ПЧ, ПВ,К ПВ,СВ ПВ, СВ АИ СВ ПЧ, ПВ, СВ,К

Примечание■ П - палочки; С - спириллы; ПЧ - почва; ПВ - пресная вода; СВ - сточные воды,

АИ - активный ил; К - клинические изоляты; * - способен только S psychrophila:; **- использует только G. kuznetsovir, нет жгутиков; 2-монополярный монотрих.; (1) - цитировано по Willems et al., 1990; Willems et al., 1992, (2) - Khan, Hiraishi, 2002, (3) Mechichi et al., 2003; (4) - Sakane, Yokota, 1994.

Сходство генов 16S рРНК представителей трех обособленных кластеров с аналогичным геном типового вида рода Aquaspirillum составляет 74- 87 %. Эти данные свидетельствуют о том, что исследуемые штаммы серных спирилл удалены от бактерий, образующих обособленный кластер с типовым видом рода Aquaspirillum - A. serpens, и не могут быть рассмотрены как его представители. На основании проведенных исследований три филогенетических кластера выделены нами в три новых рода - Simplispira gen. nov., Giesbergeria gen. nov. и Denitrospira gen. nov.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК выделенных микроаэрофильных штаммов Д-427 и Д-430 показал, что они

относятся к семейству Spirilliaceae бетапротеобактерий и имеют высокий уровень сходства последовательностей гена 16S рРНК как между собой (98,4 %), так и с видом Spirillum volvtans (97,4 - 97,8 %), с которыми они образуют единый кластер на филогенетическом древе (рис. 2). Для установления родства между штаммами была проведена ДНК - ДНК гибридизация, которая выявила, что штамм Д-427 имеет 12 % уровня гомологии со S. volutam и 28 % со штаммом Д - 430. Это указывают на видовую обособленность штаммов Д - 427 и Д - 430 в пределах рода Spirillum и позволяют отнести штаммы Д - 427 и Д - 430 к новым видам рода Spirillum, названных нами штамм Д-430 -S kriegii sp.nov., а штамм Д-427 - S. winogradskii sp. nov.

0.05

6

I—/

D427 DSM 12756, AY 845251 D430 AY845252

Spirillum volutans АТСС 19554х, M34131

- Thiobacillus aquaesulis ATCC 43788T, U58019 > Thiobacillus thioparus ATCC 8158т, M79426

■ Azoarcus indigent VB32T, LI 5531

— Rhodocyclus purpureus DSM 168т, M34132

A quaspirillum gracile ATCC 196241,

AF078753

— Thiomonasperomelabolis ATCC 23370т, M79421 ■ Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375т, X07714

Рис. 2. Положение представителей серных спирилл штамм Д-427, Д-430 на филогенетическом дереве класса Ве1арго(еоЬас1епа семейства ЗрпШасеае. Масштаб - 5 % дивергенции.

Таким образом, серные спириллы, отнесенные ранее на основании морфотипа к роду 1Ыо$р1га оказались представителями разных таксонов в пределах альфа- и бетапротеобактерий. Полученные нами данные не оставляют оснований для сохранения этих бактерий в составе рода П¡охр:га. 1.2. Филогенетическое положение бактерий рода Масготопаь

Бактерии Масготопаз Ырипсгага ранее нами были выделены в чистую культуру и валидно описаны, но их филогенетическое положение не было известно.

Филогенетический анализ показал, что Масготопая Ырипс1а1а групируется с кластерами Ве1арго1еоЬа^ег1а рода Hydrogenophaga, Сотатопая, Acidovorax, Уапогогах и Rhodoferax (рис. 3). Последовательность 168 рДНК Масготопая Ырипс1ага рода УКМ 1366т имеет уровень сходства 92,8-96,2 % с последовательностью 168 рДНК типовых штаммов каждого из родов

Нуйго%епорУю%а, Сотатопаь, Асгйо'оогах, УаНоуогах и ЯИос1о/егах.. Наиболее высокое сходство последовательностей 168 рДНК Масготопаз Ырипама обнаружено с видами рода Hydrogenophaga - 95,9-96,2 %. Масготопаэ Ырипсгма группируется с кластером Hydrogenophaga, но близко не связан ни с одним из видов этого кластера (рис. 3). Обособленность родов Hydrogenophaga и Масготопаз подтверждают и результаты сравнительного фенотипического анализа.

2j5 0/о I— Hydro graopbaga flava

__I-Hydrogenophaga pKudoflivt

I-Hydrogenophaga paHeronji

I-Hyiliomiwplup tacnioapiralis

-Macromonu bipunctata

-Common** teaUMtarooi

-Comarncnas acidovorant

-Сопшюю tcrrigena

- Acidovorax avecac subsp avenac

-Acidovorax konjaci

-Acidmom шщжиш

-Acidovora* deUfieldii

-Acidovonu &cil»

r———— Variovorax paradoxus

-Khodoferax fermentans

. ..... ldeooella dechlonuans

-Rabtonia eutropha

Рис. 3. Филогевегическое дерево, сконструированное на основе 16S рДНК, показывает положение Macromonas bipunctata Д-405 и его ближайших родственников внутри Betaproteobacteria. Масштаб - 2.5 % дивергенции.

1.3. Филогенетическое положение штаммов Д-401 и Д-402 пресноводных Beggiatoa

Филогенетический анализ показал, что исследуемые штаммы Д-402 и Д-401 входят в состав кластера Beggiatoa Gammaproteobacteria (рис. 4). Изоляты группируются вместе с другими пресноводными Beggiatoa, имеют значения сходства нуклеотидных последовательностей межвидового уровня со штаммами В alba (98,3 %), а также с двумя штаммами пресноводных Beggiatoa (89,5-91,4 %), которые пока не имеют статуса валидно описанного вида. Для установления родства между исследуемыми штаммами и В alba была проведена ДНК-ДНК гибридизация. Штаммы Д-402 и Д-401 составили одну генотипическуто группу с уровнем гомологии ДНК-ДНК 99 %. При этом, по уровню сходства ДНК, эти

штаммы были равно удалены от референтного штамма В. alba B15LD DSM 1416 (28-33 % сходства ДНК).

1Ш ,

- Thiom ¡crospira киепепи

----Thiom icrosa crunogena

- Thiomicrospn a chilensis - Thiom icrospira peiophila

В athym odiolus therm ophilus symbwnt

— Cralyptogena magnifica sym biont ¡ esteomya chordata sym biont

■ Leucotrix mucor Thiothrix disciformis Thiothrix aefluvn

-— Thiothrix nivea

- 7 hiothrix ramosa

Solemya occidentahs symbiont

Solemya veium symbiont

A nodontia phdlipiana symbioní Thyasxra ftexuosa symbiont

Riftia pachypula symbiont

- Codakia orbicularts symbiont

---Lucinoma aequizonata symbiont

Lucina floridana symbioní

Solemya reidi symbioní 100 ,--Haforhodospira halochloris

(1

— И aforhodospira halophila Thiothrix eikelboomi

А с hromaíiu m oxahferum

-!- Therm ochromatium tepidum

A ¡lochromatium vinosum ¡nanidrilus leukoderm alus symbiont

i i

5 9"

пГ

bJ

Laxus sp symbioní

--Beggiatoa sp MS-81-6

- Beggiatoa sp MS-81-lc И

65— Beggiatoa sp OH-75-2a 100 p— Beggiatoa alba В I 5LD JOtt Beggiatoa alba В l 8LD

j¡_00 Beggiatoa sp. 402 щ

1 В eggiatoa sp. 401

----Beggiatoa sp AA5A

— Beggiatoa sp 1401-13

100i— Beggiatoa ьр Limfjord L9~ 100 f ~ i— Beggiatoa sp Dandast A9

Щ 6$_

Ü

E coli

- Beggiatoa sp Limfjord LIO

--Thiopíoca ingrica

--Thiomargarita nabtensii

— В eggiatoa sp 'Moníerey Canyon' Beggiatoa sp 'Bay Concepción'

— Beggiatoa sp Limfjord L6 Beggiatoa sp Limfjord D4

— Beggiatoa sp Limfjord L22

— Halothxobacillus hvdrotherm ahs

l o o ,- Acidtthiobacil/us ferrooxidans

1— А с id ¡thiobac illus thiooxidans

Рис. 4. Положение представителей пресноводных Beggiatoa - В. leptomitiformis штамм Д-402 и Д-405 на филогенетическом дереве. \ - Thioploca, Thiomargarita, широкие морские Beggiatoa; II - морские Beggiatoa; III - пресноводные Beggiatoa. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов.

Полученные результаты указывают на видовую обособленность штаммов Д -401 и Д - 402 от В. alba, и позволяют отнести их к новому виду. Штаммы Д-401 и Д-402 морфологически сходны с некультивируемым морфотипом Beggiatoa leptomitiformis и имеют с ним сходный диаметр клеток - 1-2,5 мкм. Мы предлагаем поместить исследуемые штаммы (Д-401 и Д-402) в пределах вида Beggiatoa leptomitiformis и считать переописанный вид, как неотип морфотипа Beggiatoa leptom itiform is.

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что пресноводные представители бесцветных серобактерий являются филогенетически гетерогенной группой и представлены альфа-, бета- и гаммапротеобактериями.

2. Углеродный и серный метаболизм бесцветных серобактерий и пути его регуляции

Несмотря на то, что бесцветные серобактерии являются филогенетически гетерогенной группой и относятся к различным классам (от А 1рИа - до Тс.р$'йопргогеоЬас1епа) филума Рго(еоЪаШпа, Зриоскаега, обладают одним общим свойством - они способны вовлекать в метаболические процессы восстановленные соединения серы и откладывать элементную серу внутри клеток в их присутствии. Однако до сих пор нет ясности в одном из основных вопросов, который возникал на протяжении всей истории изучения бесцветных серобактерий - это вопрос о роли восстановленных неорганических соединений серы в обмене одноклеточных и нитчатых серобактерий. Из многочисленных изолятов нитчатых и одноклеточных серобактерий только для нескольких морских штаммов получены строгие доказательства использования неорганических соединений серы в качестве доноров электронов при автотрофном или миксо- и литогетеротрофном росте.

Как известно, развитие бесцветных серобактерий в природе приурочено к сероводородным биотопам, которые характеризуются широким спектром самых разнообразных физико-химических параметров среды, таких как нестабильность и резкая смена окислительно-восстановительных условий, лимитирующие и токсичные концентрации неорганических (Н28, О2) и органических субстратов и т.д. Однако до сих пор существует ограниченное количество данных, объясняющих механизмы адаптации, регуляции метаболизма серобактерий в нестабильных условиях среды.

В связи с этим одна из задач наших исследований состояла в изучении метаболизма и его регуляции у бесцветных серобактерий.

Имеющийся у нас "задел" по метаболизму исследуемых серобактерий позволил изначально распределить их на две группы: литотрофные и гетеротрофные серобактерии, что в дальнейшем было оправдано и подтверждено экспериментально.

2.1. Литотрофные бесцветные серобактерии

2.1.1. Серобактерии рода Beggiatoa. Роль восстановленных соединений серы при миксотрофном росте в метаболизме В. ¡ерШтН/огтЬ Д-402.

Использованные в работе бактерии Beggiatoa 1ерШтШ/пгт1$ Д-402 представляют удобную модель для изучения целого ряда вопросов, связанных с изучением метаболизма и путей его регуляции. Надо сказать, что из всех выделенных пресноводных штаммов Beggiatoa - а их около 70 штаммов в коллекциях различных зарубежных и отечественных лабораторий лишь у одного штамма (Д-402) удалось выявить способность к авто- и миксотрофии. Многочисленные изоляты пресноводных штаммов Beggiatoa относятся к гетеротрофам, способным окислять восстановленные соединения серы с накоплением элементной серы.

Способность Beggiatoa 1ер1от Ш/огт и использовать восстановленные соединения в качестве доноров электронов для энергетического метаболизма было показано с использованием полярографических, хемолиминесцентных и биохимических методов

Показано, что окисление тиосульфата Beggiatoa \eptomitiformis Д-402 сопровождается накоплением сульфата в среде и элементной серы внутриклеточно в соотношении 1:1. В качестве промежуточного продукта в экспоненциальной фазе роста появляется тетратаонат, который практически исчезает в стационарной фазе. При росте на среде с тетратионатом, помимо серы и сульфатов, дополнительно накапливаются тритионаты.

Впервые было показано, что пресноводные бактерии Beggiatoa 1ер1отШ/огт1$ Д-402 обладают конститутивными ферментами серного метаболизма (табл. 2).

Таблица 2. Активность ферментов, участвующих в превращении соединений серы у В. 1ер1отШ/огт'к Д-402 при миксо- и органотрофном росте_

Удельная активность,

Ферменты нмоль/(мин'мг белка)

+ 820,2

Сульфитферрицианидоксидоредуктаза 400 252

Тиосульфатферрицианидоксидоредуктаза 100 48

Тетратионатметаболизирующий комплекс 32* нд

АФС - редуктаза 0,0 0,0

Серооксигеназа 33 нд

Роданаза 41 17

Тиосульфатрасщепляющий комплекс 60 17

Сероредуктаза 0,3 на

Примечание: нд - нет данных; *- культивирование с тетратионатом (2-ой пассаж).

Полярографические исследования серозависимого потребления Ог в суспензии клеток с использованием специфических ингибиторов Н(ЗЖ) (2-н-гептил-4-гидроксихинолин-Ы-оксид), миксотиазола, анитимицина А, ротенона и KCN показали, что окисление серных соединений сопряжено с работой ЭТЦ. Сброс электронов от сульфита, сульфида, серы и тетратионата происходит в ЭТЦ на уровне флавин - хинон - цитохром Ь - участка, а от тиосульфата на уровне цитохром Ь - цитохром с. Об отсутствии терминальной оксидазы а-типа свидетельствует отсутствие влияния КСИ на сульфитзависимое потребление кислорода.

Исследования по влиянию экзогенных доноров электронов на скорость синтеза АТФ показали, что при добавлении ацетата, сульфита или тиосульфата к суспензии клеток В. 1ерЮтШ/огт1з Д-402 наблюдалось увеличение концентрации АТФ в 1,5 -1,9 раза, по сравнению с эндогенным уровнем (табл. 3). Одновременное присутствие в инкубационной смеси ацетата и тиосульфата приводило к снижению скорости образования АТФ по сравнению с образованием АТФ в присутствии только ацетата или же только тиосульфата. Все это свидетельствует о конкуренции между восстановительными эквивалентами, поступающими от разных энергетических субстрататов (ацетат и тиосульфат), за переносчики электронов в

ЭТЦ, что в конечном итоге приводит к дисбалансу в функционировании ЭТЦ и снижению скорости синтеза АТФ. Снятие одного из субстратов существенно увеличивает образование АТФ. В случае использования в качестве ингибитора ротенона (ингибитор I комплекса ЭТЦ) наблюдали снижение ацетатзависимого синтеза АТФ на 77- 80 %, но в то же время отмечали увеличение тиосульфатзависимого синтеза АТФ в 1,8 раз. Последнее объясняется тем, что электроны от тиосульфата поступают в ЭТЦ на III комплекс, минуя участок, блокированный ротеноном.

Таблица 3. Влияние ацетата и восстановленных соединений серы на скорость _синтеза АТФ в суспензии клеток В. 1ер1отШ/огтЬ Д - 402 _

Варианты № опыта [АТФ] в% Варианты № опыта [АТФ] в%

суспензия клеток 1 1,7 100 + апетат+ S2O32" 1 1,9 112

+ s2o3*- 1 2,5 147 + 8гОзг+ ротенон 1 4,4 259

+ SO32* 1 3,2 188 суспензия клеток 2 9,8 100

+ ацетат 1 2,6 153 + S2032" 2 14,6 149

+ ацетат+ДССД 1 1,0 59 + S2OJ2"+ ДССД 2 9,8 100

+ ацегат+ротенон 1 0,6 35 + scy- 2 15,9 162

+ вОз^+ДССД 2 13,4 137

Примечание- клеточная биомасса получена при культивировали на среде с тиосульфатом, экспозиция с субстратами (ацетат, ЯСЬ2", 82Оз2") - 1 мин . с ингибиторами - 10 мин.; измерение АТФ проводили после предварительной экспозиции суспензии клеток, [АТФ]-нмоль АТФ/(мин • мг белка); ДССД (М,]^-дициклогексилкарбодиимид) - ингибитор АТФ-азы.

Таким образом, нам удалось впервые показать, что пресноводный штамм В. 1ер1от'й'фгт1в Д-402 способен использовать энергию окисления восстановленных соединений серы в энергетическом метаболизме.

Изучение влияния восстановленных соединений серы на конструктивный и энергетический метаболизм В. 1ер1отШ/огт1$ Д-402 позволило выявить следующие закономерности. В присутствии серных соединений в ростовой среде в клетках В. 1ер1отШ/огт1в Д-402 активность дегидрогеназ ЦТК снижается в 2-5 раза по сравнению с органотрофным ростом, происходит индукция глиоксилатного цикла (ГЦ), а также увеличение на порядок активности диссимиляционных ферментов, участвующих в окислении соединений серы. Это связано с перераспределением потока восстановительных эквивалентов: снижается роль ЦТК в энергетическом метаболизме, так как восстановительные эквиваленты (НАДН) расходуются преимущественно на биосинтетические цели, но возрастает роль в биоэнергетике клетки восстановленных соединений серы, которые и обеспечивают основной поток восстановительных эквивалентов в ЭТЦ. В присутствии восстановленных соединений серы возрастает доля участия ГЦ в конструктивном метаболизме.

Углеродный метаболизм В. 1ер1отМ/огтк Д-402 и его регуляция. В связи с тем, что МДГ участвует в работе обоих циклов (ЦТК и ГЦ), было важно узнать, как МДГ регулирует направленность процессов в обоих циклах. Это было обусловлено тем обстоятельством, что МДГ в клетках эукариот (животные и растения) представлена в виде двух изоферментов - димера и тетрамера, которые

различаются по структуре, функциям, локализации и разобщены пространственно. Димерная форма МДГ локализована в митохондриях и участвует в энергетических реакциях ЦТК, тогда как тетрамер - в пероксисомах или в цитоплазме и участвует активно в процессах конструктивного метаболизма. Микроорганизмам несвойственны изомеры МДГ; у гетеротрофных бактерий МДГ присутствует в форме димера. В то же время тетрамерная форма найдена у анаэробных фототрофов, где она в основном обеспечивает реакции конструктивного метаболизма. МДГ была выделена из клеток Beggiatoa, выращенных при различных режимах культивирования - миксотрофные и органотрофные условия роста. Путем многостадийной очистки был получен ферментный препарат в виде электрофоретически гомогенного белка.

Было показано присутствие в клетках Beggiatoa двух структурных изомеров -ди- и теграмера. Димер обнаружен при органотрофном росте, а при миксотрофном росте - димер и тетрамер. Анализ кинетических свойств и ингибиторный анализ показали, что димер и тетрамер различаются функционально и участвуют в разных метаболических процессах, аналогично тому, как это происходит у эукариот (табл. 4).

Таблица 4. Физико-химические и кинетические характеристики изоформ

МДГ из Вев&аШ 1ерЮтМ/огтЬ Д-402

Характеристики Изоформы фермента

димер тетрамер

Удельная активность, мкмоль /(мин-мг белка) 24,49±0,7 20,43±0,6

Степень очистки 131 123

Молекулярная масса, кДа 84±1,5 165±3,0

Молекулярная масса субъединиц, кДа 40±2,0 40±2,0

Км, мкМ оксалоацетат 56±0,2 20±0,1

НАДН 48±0,2 17±0,1

малат 320±12,0 670±31,1

НАД 120±5,9 530±20,1

рН-оптимум оксалоацетат 7,4±0,1 8,8±0,2

малат 9,7±0,1 10,2±0,2

Опыты по влиянию ингибиторов (ротенона и итаконата - ингибитора ) изоцитратлиазы, ключевого фермента глиоксилатного цикла) на соотношение изоформ МДГ, показали, что культивирование бактерий Beggiatoa 1ер^тШ/огтк в присутствии ротенона способствовало функционированию только тетрамерной формы фермента, при этом скорость окисления в/БгОз2' составляла 25 - 35 мг/л. В присутствии итаконата - была обнаружена только димерная форма МДГ и не было отмечено окисление тиосульфата. Интересным оказалась динамика перехода димера в тетрамер по ходу роста культур при лимитации тиосульфатом и достаточном содержании органического субстрата (рис. 6).

Рис. 6. Дииамика соотношения димерной и тетрамерной форм МДГ из В. 1ер(от1И/огтЬ Д-402 в условиях миксотрофного роста. По оси ординат указан процент димерной и тетрамерной форм МДГ от общей малатдегидрогеназной активности. Кривая показывает скорость окисления тиосульфата.

По мере потребления тиосульфата и снижения его концентрации в среде увеличивалось относительное содержание димера и соответственно роль ЦТК в энергетическом метаболизме. Было установлено, что по исчерпании неорганического донора электронов бактерии переходят к гетеротрофному росту. Однако, при внесении дополнительных порций тиосульфата происходит очень быстрая перестройка структуры МДГ, и уже через 2 часа после внесения тиосульфата активность тетрамера доходила до 100 % исходной величены независимо от того, на какой стадии роста вносили тиосульфат. Эта способность к быстрой адаптации к смене условий ростовой среды имеет очень большое значение для серобактерий как обитателей экологических ниш с неравновесными и быстро меняющимися условиями среды. Схема (рис.7), построенная на основе проведенных исследований, демонстрирует как происходит регуляция метаболизма в разных условиях роста. Она показывает, что регуляция осуществляется с помощью переключения активности ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла, потока восстановительных эквивалентов и метаболитов на конструктивные или биосинтетические цели.

Регуляторная роль кислорода в метаболизме В. ¡ерХотШ/огт'к Д-402. Данные литературы свидетельствуют о том, что в природных экосистемах Beggiaíoa проявляют себя как градиентные организмы и существуют в микроаэробных условиях при низких концентрациях кислорода.

В пределах испытанных концентраций 02 (9,0 - 0,12 мг/л) при миксотрофном росте обнаружено, что максимальный урожай клеток был отмечен в вариантах сред с минимальной испытанной концентрацией 02; величина урожая клеток оказалась в 2 раза выше, чем при росте в аэробных условиях. Подобная закономерность проявляется как при органо-, так и миксотрофном росте.

Энергетические субстраты (доноры электронов)

С> - стимулирование

- ингибирование

Рис.7. Схема участия малатдегидрогеназной системы в регуляции и переключении основных метаболических путей у серобактерий В. 1ер/отШ/огтк Д-402 в разных условиях роста

Анализ продуктов окисления тиосульфата показывает, что в зависимости от степени аэрации среды существенно изменяется соотношение продуктов окисления тиосульфата. Если при свободном доступе Ог соогношение 8°: в/ЭС^2" составляет 1:1, то при содержании 0,12 мг 02/л среды - 1:4. Тетратионат в микроаэробных условиях роста не накапливается. Основным конечным продуктом в этих условиях является сульфат, т.е. происходит более полное окисление энергетического субстрата. Удельная активность ферментов сульфитоксидоредуктазы и тиосульфатоксидоредуктазы в клетках, выросших при концентрации кислорода в среде 0,1 мг/л, возрастает в 3 и в 2,4 раза соответственно по сравнению с аэробным ростом.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при снижении концентрации кислорода в ростовой среде возрастает роль восстановленных соединений серы и уменьшается роль органических соединений в энергетическом метаболизме.

Автотрофный рост пресноводного штамма Beggiatoa. Автотрофный рост нитчатых серобактерий был обнаружен только в микроаэробных условиях, при концентрации Ог не более 0,5 мг/л, что соответствует 10-15 тМ.

Максимальный урожай клеток при автотрофном росте наблюдается при минимальной испытанной концентрации 02 в среде, равной 0,12 мг 02/л и составил 15,3 мг белка/л. Тиосульфат практически полностью окисляется до сульфатов, а сера составляет не более 1 % от состава конечных продуктов. С использованием радиоизотопного метода определена высокая скорость фиксации меченого углерода бикарбоната - 112-139 нмоль/(мин-мг белка), сопоставимая с величинами, известными для других хемолитоавтотрофов (табл. 5).

Таблица 5. Сравнительная характеристика показателей автотрофного роста для

В. 1ер1отШ/огтк Д-402 при миксот рофном и автотрофном микроаэробном росте

АКТИВНОСТЬ, НМОЛЬ/(МИН'МГ белка) Миксотрофный рост Литоавтотрофный рост

РБФК* 0,0 53 -136

Фосфорибулокиназа 0,0 1870 - 2138

Карбоан гидраза * * 5,6 23,8

Интенсивность фиксации С02 7,0 - 14,0 112 -139

С/ С02 от С-белка, % 1,0-2,0 92

Примечание: *- активность определяли двумя способами- радиоизотопным и спектрофотометрическим; **- активность в у е. Вильбурга и Андерсена

С использованием бикарбоната с радиоизотопом углерода (|4С) было показано, что прирост углерода белка у штамма Д-402 осуществляется практически полностью за счет углерода бикарбоната - 91-92 % клеточного углерода, что свидетельствует об автотрофии пресноводного штамма Beggiatoa 1ер1отШ/огт1з Д-402.

Высокая активность ключевых ферментов автотрофной фиксации С02 в цикле Кальвина - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (РБФК) и фосфорибулокиназы была определена только в клетках, выросших в автотрофных условиях (табл. 5). При миксотрофном росте в микроаэробной среде нам не удалось обнаружить активность данных ферментов. Это вероятно, свидетельствует о том, что регуляция РБФК определяется двумя факторами: низкой концентрацией 02 и наличием органических доноров электронов. Максимальный молярный урожай (Умах) штамма Д-402 составил 12,8 мг сухого веса/ммоль тиосульфата, что сопоставимо с таковыми значениями для литоавтотрофных бактерий. При содержании 02 в среде около 0,5 мг/л величина Умах резко снижалась до 3,4 мг сухого веса/ммоль тиосульфата. Удельная скорость окисления тиосульфата в клеточной суспензии при автотрофном росте почти на порядок выше по сравнению с миксотрофным ростом в аэробных условиях и составляла 110-180 нмоль/(мин-мг белка) и 20-25 нмоль/(мин-мг белка), соответственно. При автотрофном росте

активность сульфитоксидоредуктазы и тиосульфатоксидоредуктазы повышалась в 5 - 10 раз по сравнению с литогетеротрофным ростом и в 17 - 4 раза, соответственно, по сравнению с миксотрофным ростом.

Таким образом, нам впервые удалось показать, что в зависимости от условий среды исследуемые бактерии способны изменять тип метаболизма и осуществлять автотрофный рост.

Структура электронтранспортных цепей в мембранах при различных типах питания и режимах аэрации культуры. На разностных спектрах мембранных частиц В. ¡ерШтШ/огтг'л, культивируемых в аэробных и микроаэробных условиях при миксотрофном, органотрофном и автотрофном росте, обнаруживаются цитохромы с и А. Во всех исследованных нами случаях наблюдается присутствие в клетках растворимого цитохрома с с Мг 12 ЫЭа и двух мембранных цитохромов с с Мг 23 и 26 Ша. Цитохром а3 появляется только при органотрофном росте, что свидетельствует о функционировании в мембранах В. 1ер1от'^огтк оксидазы аа3-типа, условия индукции которой у этой бактерии в литературе ранее не описывались.

На разностных СО-спектрах было выявлено, что часть мембраносвязанных цитохромов Ь связывает монооксид углерода. Последнее свидетельствует о том, что в дыхательной цепи, по-видимому, функционирует оксидаза сЬЬ}-типа. Это подтверждается данными, полученными Мунтян М.С., которая показала, что первичная последовательность ДНК-продуктов гена главной субъединицы фермента - ссоИ составляет значительную гомологию (69 %) с субъединицей ссоМ оксидаз сЬЬгтипа других протеобактерий (Мунтян и др., 2005).

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что значительные изменения в цитохромном составе В. 1ер1отШ^гт1в Д-402 наблюдаются при переходе от литотрофного к органотрофному культивированию. При этом в мембранах клеток В. 1ер1отШ/огт1$ начинает синтезироваться цитохром аа3. Нами показано, что кроме цитохрома аа3 в мембранах В. 1ерютШ/огт'15 функционирует вторая терминальная оксидаза сЬЬз-типа. Известно, что последняя обладает на порядок более высоким сродством к 02, чем оксидаза аагтипа, и ее индукция у микроорганизмов обычно вызывается низким содержанием Ог в окружающей среде. Наши исследования показывают, что синтез оксидазы сйЛ^-типа у В. 1ер(отШ/огт1х также усиливается при переходе к микроаэробным условиям роста.

Из полученных результатов можно заключить, что В. IерЮтШ/огтЬ Д-402 имеет лабильный тип метаболизма, что и обуславливает его высокую конкурентноспособность в сероводородных биотопах.

2.1.2. Серобактерии рода ЬеисоШг1х. Другая исследуемая группа бесцветных серобактерий включала 3 вида скользящих нитчатых бактерий рода ЬеисоЛггх: Ь тисог, Ь. гЫорКйа и ЬеиШИпх эр. До недавнего времени бактерии рода ЬеишИгЫ не были включены в группу бесцветных серобактерий. Был известен всего один вид этого рода - Ь. тисог, для которого было отмечено спорадическое накопление элементной серы внутри клеток. Нами было показано, что эпифитный штамм этого

вида способен к литотрофному росту, но при определенных условиях. Для двух других новых видов, выделенных Дульцевой Н.М (Дульцева, 1996), также была показана способность использовать серные соединения в энергетическом метаболизме. Способность бактерий рода ЬеисоЖгЬ: к литотрофному росту была доказана в соответствии со схемой, использованной для Beggiatoa: исследована динамика и продукты окисления тиосульфата, показана связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ, с синтезом АТФ, изучена активность ферментов, участвующих в превращении соединений серы.

У исследованных бактерий были отмечены различия в активности ферментов серного метаболизма: бактерии Ь. МорИИа и L тисог при окислении сульфита способны получать АТФ, как за счет субстратного, так и за счет окислительного фосфорилирования, а ЬеисоЛгЬс ер. только за счет окислительного фосфорилирования (не обнаружена активность АФС-редуктазы).

Сравнение активности ферментов углеродного метаболизма показало существенные различия в активности ферментных систем ЦТК и глиоксилатного цикла у разных видов Ь. МюрИИа, ЬеисоМгйс Бр. и Ь. тисог (табл. 6).

Таблица 6. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла (нмоль/(мин-мг белка)) в клетках L. тисог DSM 2157, L. thiophila 6WS, _Leucothrix sp. и E. coli BKM В - 12 при органотрофном росте_

Ферменты L. thiophila 6WS Leucothrix sp. 5WS E.coli BKM В12 L. mucor DSM 2157

Аконитатгидратаза 52,0 74,0 90,0 105,0

Фумаратгидратаза 102,0 95,0 410,0 180,0

Изоцшратдегидрогеназа (НАД) 21,0 28,0 нд нд

Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ) 10,0 35,0 160,0 68,0

Сукцинатдегидрогеназа 8,0 20,0 420,0 н/о

Малатдегидрогеназа (НАД) 30,0 160,0 210,0 72,0

Малатсинтаза 6,2 1,2 нд нд

Изоцитратлиаза 25,0 8,0 130,0 6,0

У L. thiophila и Leucothrix sp. показана чрезвычайно низкая активность дегидрогеназ, которая на порядок ниже по сравнению с типовым видом L. тисог, обладающим высоким гетеротрофным потенциалом, и типичными гетеротрофными бактериями Е. coli. В определенной степени низкая активность дегидрогеназ и ферментов ЦТК в целом предопределяет их (L. thiophila и Leucothrix sp.) практически облигатную зависимость от неорганических доноров электронов - серных соединений. Эти организмы очень слабо растут органотрофно, нуждаясь в пополнении пула восстановителей и электронов для ЭТЦ. Надо заметить, что у L thiophila и Leucothrix sp., которые в широком диапозоне концентраций органических веществ не могут их использовать в достаточной для роста степени, ферменты серного метаболизма коститутивные. Pix активность

зависит в большой степени от дополнительного источника энергии в виде восстановленных соединений серы.

У /- тисог - индукция ферментов серного метаболизма, а также способность к окислению соединений серы происходит только при лимитации роста органическим веществом (рис. 8).

А —о—1 Б А —о— 1 -»-2 Б

время, часы время, часы

Рис 8. Динамика потребления триптона и окисления тиосульфата (2 г/л) в культуре L. тисог DSM 2157: а). 270 мг триптона/л; б). 50 мг триптона/л.

Условные обозначения, шкала А (мг/л): 1 - тиосульфат; шкала Б (мг/л)' 2 - триптон.

Подобное двухфазное окисление субстратов известно для некоторых миксотрофных организмов. У Ь. тисог к началу окисления тиосульфата, концентрация триптона в ростовой среде снижается до 100-170 мг/л (рис. 8 а). При исходной концентрации органического субстрата 50-100 мг/л триптона способность к окислению соединений серы появляется сразу, тиосульфат убывает одновременно с уменьшением в среде органического вещества (рис. 8 б).

Переход от литотрофного типа питания к органотрофному сопровождается изменением состава ЭТЦ. При росте Ь тисог на среде с низким содержанием триптона, в присутствии тиосульфата в мембранных фракциях, в отличие от органотрофного роста, нам не удалось обнаружить мембранносвязанных цитохромов с.

При сравнительном анализе ферментативной активности в ЦТК и в глиоксилатном цикле при различном типе питания у бактерий рода ЬеисоЛпх обнаружены закономерности, характерные для Beggiatoa, т.е. при миксотрофном росте происходит снижение роли ЦТК и увеличение активности ферментов глиоксилатного цикла при переходе от органотрофии к миксотрофии. Кроме того, в последнее время удалось обнаружить появление тетрамерной формы МДГ у Ь тисог при миксотрофном росте, так же, как и у Beggiatoa Д-402 (Парфенова и др., 2004).

Таким образом, адаптация к изменению условий роста обеспечивается у ЬеисоМгос, как и у Beggiatoa структурной и функциональной перестройкой ключевого фермента углеродного метаболизма - МДГ и последующими изменениями в активности ферментных систем и перераспределением потоков восстановительных эквивалентов, а также изменением состава ЭТЦ.

Принципиально сходные с В. 1ер1отШ/огт1з и бактериями рода Ьеисо^гЬс механизмы регуляции метаболизма при смене условий роста обнаружены и у других нитчатых серобактерий ТИюЖгис агс1орЫ1а.

2.2. Гетеротрофные бесцветные серобактерия

2-2.1. Способность гетеротрофных серобактерий к окислению соединений серы и их

влияние на рост бактерий. Для гетеротрофных представителей бесцветных серобактерий роль восстановленных соединений серы в их метаболизме не была выяснена. Высказывались предположения о перекисном окислении восстановленных соединений серы, а также о возможности миксотрофии.

Гетеротрофные серобактерии: В. alba DSM 1416, В. leptomitiformis Д-401, Macromanas bipunctata (4 штамма) и серные спириллы (17 штаммов) не способны к автотрофному росту на минеральных средах. Об отсутствии у некоторых гетеротрофных серобактерий потенциальной способности к автотрофии свидетельствуют отрицательные результаты молекулярно-генетического исследования на наличие гена РБФК (Спиридонова и др., 2004). В присутствии органического субстрата и сульфидов в виде Na2S, FeS, CaS все исследованные I серобактерии накапливают внутри клеток элементную серу (рис. 9).

-в'." V,

а

v^T, <

■ 1Г*

Рис.9. Aquaspirillum bipunctata (а), Macromonas bipunctata (б), Spirillum winogradskii (в) с включением серы. Шкала = 5 мкм.

1

Присутствие восстановленных соединений серы в среде культивирования стимулирует рост всех исследованных гетеротрофных серобактерий в среднем на 20-40 % и способствует увеличению срока их жизнеспособности. Количество окисленного тиосульфата не превышает 40-70 мг/л S/S2032" у разных штаммов « серобактерий. Окисление тиосульфата у всех представителей группы гетеротрофных серобактерий сопровождается эквимолярным накоплением тетратионата. У исследованных серобактерий не была обнаружена активность ферментов окислительного (диссимиляционного) серного метаболизма. Последнее позволяет предположить, что у гетеротрофных серобактерий восстановленные соединения серы не участвуют в энергетических процессах, связанных с синтезом АТФ путем окислительного и субстратного фосфорилирования.

Однако было показано, что при добавлении ацетата или соединений серы (сульфита и тиосульфата) скорость синтеза АТР у В. leptomitiformis Д — 401 по

сравнению с эндогенным дыханием увеличивается в 2,1 и 1,4 раза, соответственно (табл. 7).

Таблица 7. Влияние ацетата и восстановленных соединений серы на скорость ___синтеза АТФ в суспензии клеток В. ¡ерготИ'^огт'к Д - 401

Варианты № опыта [АТР] в% Варианты № опыта [АТР] в%

суспензия клеток 1 4,2 100 + ацетат + каталаза 1 21,9 521

+ SO3"2 1 6,0 143 + ацетат+ ротенон 1 1,7 40

+ S2O3-2 1 5,9 140 + S203_2+ ротенон 1 2,7 64

+ ацетат 1 9,0 214 суспензия клеток 2 5,8 100

+ ацетат+ДССД 1 4,1 98 + каталаза 2 12,7 219

+ ацетат+ S2O3"2 1 23,6 562 + каталаза + S2O3"2 2 12,1 209

+ каталаза 1 8,4 200

Примечания, как для табл. 3.

При одновременном внесении ацетата и тиосульфата наблюдалось увеличение синтеза АТР в 2,6 раза по сравнению с ацетатзависимым и в 4 раза по сравнению с эндогенным дыханием в присутствии тиосульфата. Отсутствие ингибирования скорости синтеза АТФ при одновременном присутствии ацетата и тиосульфата, как это имеет место у литотрофных серобактерий при миксотрофном росте (табл. 3), косвенно свидетельствует об отсутствии конкуренции между субстратами в ЭТЦ за переносчики электронов. Добавление ротенона, блокирующего поступление восстановительных эквивалентов от органических соединений на I комплекс ЭТЦ, к суспензии клеток В. leptomitiformis Д - 401 приводило практически к полному ингибированию ацетатзависимого синтеза АТФ в присутствии тиосульфата, тогда как у факультативно литотрофных бактерий В leptomitiformis Д - 402 в аналогичной серии опытов скорость синтеза АТФ возрастала за счет использования неорганических восстановленных соединений серы в качестве доноров электронов, поступающих на Ш комплекс в ЭТЦ (табл. 3).

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что штамм В. leptomitiformis Д - 401 не способен использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов при миксотрофных и литотрофных условиях роста.

Другой важный вопрос, который мы рассмотрели - это причина увеличения скорости синтеза АТФ у В. leptomitiformis Д - 401 в присутствии сульфита и тиосульфата при отсутствии литотрофного роста. Показано, что при добавлении каталазы скорость синтеза АТР при ацетатзависимом дыхании увеличивается в 2,4 раза. Установлено также, что у штамма Д - 401 скорость синтеза АТР после прединкубации суспензии клеток с каталазой или с каталазой + тиосульфат фактически равны - 12,7 и 12,1 нмоль/(мин мг белка), соответственно (табл. 9). Отсутствие стимулирующего действия тиосульфата на сингез АТФ при его внесении в инкубационную среду в присутствии каталазы позволяет предположить участие тиосульфата в химической детоксикации Н202, что способствует более эффективной утилизации эндогенных субстратов, и как следствие - увеличению скорости синтеза АТФ.

Для доказательства способности гетеротрофных бесцветных серобактерий накапливать Н202 внутри клеток нами было изучено три аспекта: скорость образования Н2СЪ; связь его синтеза с функционированием ЭТЦ; локализация пероксида водорода.

2.2.2. Окислительный стресс и механизм антиоксидантной зашиты. Скорость образования Н202, концентрация и локализация. Связь образования Н2О2 с функционированием ЭТЦ. С помощью полярографического метода было показано, что в процессе дыхания в суспензии клеток Macromonas bipunctata, Beggiatoa leptomitiformis Д-401 ,B. alba DSM 1416 и серных спирилл более 40-50 % от потребленного клетками кислорода восстанавливается лишь до Н202 (табл.8).

Введение в реакционную смесь М. bipunctata, В. leptomitiformis Д-401 азида натрия в концентраций 1-Ю"4 М Na№ - ингибитора терминального участка ЭТЦ или антимицина А - ингибитора участка цит. Ь - цит. с электронтранспортной цепи ингибирует образование Н202 на 30-50 %. Характер влияния ингибиторов ЭТЦ указывает на связь образования Н202 с функционированием электронтранспортной цепи. Последнее подтверждается и данными, полученными Чекановой, которая показала, что образование Н202 у В leptomitiformis Д-401 происходит в ЭТЦ в I комплексе (Чеканова, 1991).

Скорость образования Н202 в суспензии клеток у В. leptomitiformis Д-401, В. alba DSM 1416 составляет 3 - 4 мкг/(мин-мг белка), у М. bipunctata Д-405 - 1,6-1,8 мкг/(мин-мг белка), а у 5. winogradskii Д-427 - 1,2 мкг/(мин-мг белка) (табл. 8). В стационарной фазе роста в клетках серобактерий может накапливаться до 10 мкг Н202 на мг белка.

Определение Н202 в среде культивирования серобактерий после удаления клеток путем центрифугирования показало, что в культуральную жидкость выделяется незначительная ее часть - не более 1 - 10 % от образовавшегося пероксида водорода или, как в случае со S. winogradskii Д-427, не удается зарегистрировать накопления Н202

Таблица 8. Скорость потребления кислорода и образования Н202 при

Бактерии Скорость потребления Ог, НМОЛЬ/(МИН'МГ белка) Скорость потребления 02 в присутствии каталазы, нмоль/ (мин-мг белка) Скорость образования Н2О2, мкг / (мин-мг белка)

В. leptomitiformis Д-401* 137,3 82,8 3,7

В alba DSM 1416** 67,0 29,0 2,6

S winogradskii Д-427 45,7 27,4 1,2

M bipunctata Д-405* 58,9 31,8 1,8

Примечание: * - в присутствии 1 г/л лактата; ** - в присутствии 1 г/л сукцината

Полученные данные согласуются с результатами цитохимических исследований клеток В 1ерютШ^згт15, М Ырипс1а1а и S.winogradskii.

Приготовление срезов клеток серобактерий с применением диаминобензидина (ДАБ) в качестве субстрата окисления пероксидом водорода показало, что в основном Н202 локализуется в периплазме, а также в инвагинатах цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и в меньшей степени - снаружи клеточной стенки (рис. 10).

ДАВ

Рис.10. Электронные микрофотографии

ультратонких срезов клеток В. 1ер/отШ/огта после проведения цитохимической окраски на выявление

н2о2.

а — фрагменты клеток В 1ер1отп1/огт!я. окрашенных ДАБ, для обнаружения Н2О2. Окисленный ДАБ располагается в инвагинатах цитоплазматической мембраны и в клеточной стенке, б — фрагменты контрольного варианта клетки В ¡ерМтШ/огти предварительно обработаны для удаления Н202 и 02' последующей окраской ДАБ Окисленный продукт в инвагинатах ЦПМ отсутствует И — инвагинаты ЦПМ. Шкала — 0,25 мкм _

Механизм окисления соединений серы у гетеротрофных серобактерий.

Гетеротрофные серобактерии, как было показано выше, не способны использовать энергию окисления соединений серы в энергетическом метаболизме, но при этом отмечается значительная скорость их окисления. Было отмечено, что органогетеротрофный рост сопровождается накоплением внутриклеточно пероксида водорода в высоких концентрациях. Полученные результаты позволяют предположить, что окисление соединений серы происходит при участии АФК. Анализ окисления тиосульфата в суспензии клеток в присутствии аминотриазола в концентрации ингибирующей активность каталазы показал увеличение окисления тиосульфата в среднем на 30 %, что свидетельствует о прямой зависимости между его окислением и накоплением Нг02.

Это подтверждают и варианты контрольных опытов, если клетки бактерий до внесения соединений серы обработать каталазой, то окисление тиосульфата не наблюдается. Результаты этих контрольных вариантов опытов объясняют наблюдения по накоплению элементной серы внутри прогретых клеток, при погружении в растворы сульфидов (ИагБ, Сав). Продуктом окисления сульфида является элементная сера, накапливаемая внутри клеток, тиосульфата -тетратионат, как это имеет место при химическом окислении сульфида и тиосульфата пероксидом водорода.

Таким образом, в результате проведенных исследований у гетеротрофных серобактерий была установлена непосредственная связь окисления соединений серы с образованием пероксида водорода. Физиологический смысл процесса -детоксикация токсичного продукта метаболизма пероксида водорода. Ферментативные системы защиты клеток от токсичных форм кислорода. Для выяснения сравнительной эффективности различных систем ферментативной защиты клеток серобактерий от токсичных форм кислорода в клетках была проанализирована активность ферментов, участвующих в детоксикации Н202 и

02*: активность каталазы, пероксидазы, СОД (супероксиддисмутаза) и активность ферментов редокс - системы глутатиона (табл. 9).

Таблица 9. Активность ферментов, участвующих в удалении Н2Р2 и О/

Микроорганизмы* 1я Редокс система

Цитохром - с пероксидаза, МКММ0ЛЬ/(МНН'М1 белка) £ х S я S , s Я S 8 sEg" Пероксидаза, нмоль/(мин*мг бел» глутатиона, НМОЛЬ/(МИН'МГ белка)

£ г 5 " «о § и 1 ч i й 1 J s К г Глутатион пероксидаза S я О т еб ё <ъ

Микроаэробные серные спириллы S. -winogradskii Д-427: А 0,0 9,6 0,4 0,5 215,0 71,0

Б 0,0 9,6 0,3 0,1 50,7 16,3

Аэробные серные спириллы: Д-4П 0,0 5,0 1,0 0,1 110 26,5

Д-419 Д-416 Д-415 Д-422 Д-412 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,5 3.0 7.4 4.1 6.5 10,0 1,0 6,0 1,0 2,0 0,4 0,8 0,4 0,1 0,3 нд нд нд нд нд нд нд нд нд нд

М. bipunctata Д-405 0,0 6,5 2,0 0,2 85,5 32,0

В. leptomitiformis Д-402 0,0 5,5 0,0 0,1 56,5 27,5

V. medioatlanticus DSM 14978 1,9 9,5 9,1 10,0 нд нд

Е. coli ВКМ В-12 н.о 4,5 8,0 3,3 нд яд

Примечание- * - бактерии культивировали в аэробных условиях роста, за исключением 5 мто&аскки Д-427, где А - аэробные; Б - микроаэробные условия роста, в качестве контроля использовали термофильные микроорганизмы Уи1сапИИегтш тесИоайапИсю, у которых высокая активность цитохром-с-пероксидазы (Подкопаева и др., 2003; ОоосШе\у а1., 1988).

У разных представителей серобактерий в детоксикации пероксида водорода доминирующую роль играют разные ферменты: у Масготопаз и аэробных серных спирилл - катал аза и редокс-система глутатиона, тогда как у микроаэрофильных спирилл 5. \vmoff-adskii и у 5. 1ерШтШ/огт1з - преимущественно редокс-система глутатиона. Активность каталазы у большинства серобактерий низкая или отсутствует, поэтому представлялось интересным определить активность цитохром-с-пероксидазы, разрушающей Н202 и локализованной преимущественно в периплазме (до 90 %) (ОоосШе-«' й а!., 1988). В клетках всех исследованных серобактерий этот фермент не был обнаружен. Активность СОД, участвующая в детоксикации 02* и приводящая к синтезу Н202, у всех исследованных серобактерий была высокой и была сопоставима с таковой у аэробных гетеротрофов.

Таким образом, можно заключить, что у гетеротрофных серобактерий основной причиной окислительного стресса клеток является пространственная разобщенность активных систем антиоксидантной защиты, преимущественно локализованных в цитоплазме, и Н202, накапливающегося в периплазме, а также

диспропорция в процессах синтеза и детоксикации Н2О2: высокая скорость образования Н202 в процессе дыхания и высокая активность СОД, генерирующая Н202, но низкая активность ферментов, участвующих в детоксикации Н202. Внутриклеточное накопление пероксида водорода приводит к сильному токсическому воздействию, которое выражается в лизисе клеток из культур, начиная с экспоненциальной фазы роста, и к нестабильности культур. Неферментативные способы защиты от токсичных форм кислорода. Поскольку ферментативные способы защиты клеток серобактерий от АФК оказались малоэффективными, то вероятнее всего серобактерии вынуждены использовать неферментативные способы защиты от токсичных форм кислорода. Влияние тиосульфата. Как было показано выше, добавление тиосульфата в среду культивирования способствует оптимизации ростовых процессов серобактерий. Стабилизация культуры серобактерий в аэробных условиях в присутствии тиосульфата, в первую очередь, связана с удалением пероксида водорода в результате химического взаимодействия последнего с тиосульфатом.

Результаты проведенных исследований влияния тиосульфата на клеточный метаболизм свидетельствуют о его полифункциональной роли у серобактерий. Положительное действие серных соединений выражается помимо оптимизации ростовых процессов, в оптимизации процессов конструктивного метаболизма, вследствие увеличения активности ферментов (активность ферментов, приводящих к синтезу аминокислот, в среднем возрастает в 1,3-1,5 раз), и как следствие -стабилизации культуры серобактерий в аэробных условиях. Это находит подтверждение и в результатах полученных при определении метаболитной антиокислительной активности (МАОА), отражающей способность клеток противостоять окислительному стрессу за счет увеличения биосинтетических процессов, направленных на синтез соединений содержащих БН - группы, в частности белков, аминокислот, способных связывать АФК.

Образование экзополисахаридов. Также было показано, что серобактерии способны преодолевать окислительный стресс за счет синтеза экзополисахаридов (ЭПС)

(рис.11).

Рис. 11. Поперечный срез клеток Spirillum winogradskii, круженных слизью.

Клетки из аэробной культуры. Окраска рутением красным. Электронный микроскоп, шкала 5 мкм.

Как известно, наличие слизистых образований вокруг клеток способствует снижению скорости диффузии кислорода к клетке, и как следствие наблюдается

стабилизация роста (Garcia-Pichel. 1989; Jeirgensen, Revsbech, 1983; Sabra et al, 2000).

Было показано, что скорость образования Н202 в клетках микроаэрофильных серобактерий (S. winogradskii, В. leptomitiformis) находится в прямой зависимости от кислородного режима культивирования: в микроаэробных условиях скорость накопления Н202 снижается в 7 раз, что сопровождается трехкратным увеличением клеточной биомассы из-за оптимизации ростовых процессов. Была определена активность некоторых ферментов глюконеогенеза в аэробных и микроаэробных условиях. Оказалось, что активность ферментов, направленных на синтез ЭПС, участвующих в глюконеогенезе, в 1,5 раз выше в аэробных условиях по сравнению с микроаэробными, что свидетельствует о способности микроаэрофильных серобактерий предотвращать стрессовое воздействие кислорода за счет синтеза слизистого матрикса ЭПС.

Полученные результаты по изучению системы защиты клеток от токсичных форм кислорода позволяют заключить, что у гетеротрофных серобактерий преобладают неферментатавные реакции удаления активных форм кислорода. Серобактерии для преодоления окислительного стресса, вызываемого избытком Н2О2, используют две основные стратегии: во-первых, их местообитание, как правило, приурочено к сероводородным биотопам, где Н2О2 химически взаимодействует с H2S, а во-вторых, уменьшение скорости диффузии 02 внутрь клетки достигается за счет синтеза ЭПС, и в результате снижается скорость синтеза и концентрация Н202.

2.2.3. Особенности функционирования ЦТК. В качестве источника углерода при культивировании гетеротрофные серобактерии способны использовать ограниченный круг мономерных органических соединений, в частности карбоновые кислоты (Грабович, 1984). Превращение последних, как правило, осуществляется через ЦТК, который участвует как в энергетическом, так и в конструктивном метаболизме, поставляя для них интермедиа™.

Активность ферментов ЦТК у M. bipunctata Д-405, В. leptomitiformis Д-401 и аэробных серных спирилл, в стандартных условиях определения, оказалась сравнимой с активностью соответствующих ферментов типичных гетеротрофных бактерий, за исключением аконитатгидратазы (АГ) и фумаратгидратазы (ФГ), активность которых на порядок и более ниже по сравнению с Е. coli. Активность гидратаз у аэробных серных спирилл в различных сериях опытов варьировала в широком диапазоне (от 0 до 300 нмоль/(мин-мг белка)) (табл. 10).

У других гетеротрофных серобактерий наряду с низкой активность гидратаз отмечена также низкая активность цитратсинтазы (ЦС) (5. winogradskii Д-427, В alba DSM 1416), МДГ (S. winogradskii Д-427), изоцитратдегидрогеназы (ИДГ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) {В. alba DSM 1416).

Таким образом, общей особенностью окислительного метаболизма гетеротрофных серобактерий является низкая активность некоторых ферментов ЦТК. К ним относятся прежде всего АГ и ФГ, в активном центре которых содержится [4Fe - 4S]2" кластер, чувствительный к АФК, что предполагает уязвимость ЦТК к воздействию АФК на уровне гидратаз, что в итоге будет

приводить к инактивации ферментов и вызывть дисбаланс в работе ЦТК.

Из полученных результатов можно заключить, что метаболическая активность серобактерий при окислительном стрессе во многом будет зависеть от присутствия в среде восстановителей, необходимых для удаления АФК.

Таблица 10 Активность ферментов ЦТК у гетеротрофных серобактерий

Бактерии Удельная активность ферментов, нмоль/(мин-мг белка)

цс АГ* идг (НАДФ) сдг ФГ* МДГ (НАД)

В. leptomitiformh Д-401 64 0-5 160 80 10 350

В alba DSM 1416 28 10 30 22 15 565

М bipunctata Д-405 460 40 200 440 40 170

Микроаэрофильные спириллы: S winogracUkü Д-427 18 35 118 78 20 18

Аэробные спириллы: штамм Д-411 120 0-100 210 350 0-230 340

штамм Д-412 100 0-300 160 150 0-82 430

штамм Д-415 130 0-100 140 400 0-270 340

штамм Д-416 150 0-200 240 300 0-360 300

штамм Д-419 100 0-147 131 153 0-98 320

штамм Д-425 нд 0-187 425 244 0-94 340

штамм Д-408 нд 0-205 нд нд 0-161 нд

Е coli ВКМ В-12 130 160 160 340 220 210

Примечание. * - Активность гидратаз у аэробных серных спирилл в различных сериях опытов варьировала в широком диапазоне (от 0 до 300 нмоль/(мин мг белка)).

2.3. Роль кислорода в регуляции метаболизма аэротолерантных спирохет -основного компонента бактериальных серных матов «Шос/епе/гоп»

Особый интерес представляют анаэробные гетеротрофы аэротолерантные к кислороду. У них в отличие от аэробных гетеротрофов существуют адаптационные механизмы, позволяющие не только избегать негативного влияния кислорода, но и извлекать пользу, а именно получать энергетическую выгоду от его вовлечения в метаболические процессы. Наиболее выражен этот тип стратегии адаптации к кислороду у аэротолерантных сероокисляющих спирохет, выделенных из серных матов «ТЫос1епс1гопу>, где спирохеты доминируют

Ранее нами было показано, что серные маты «ТЫойеп&оп» в действительности представляют тесную ассоциацию свободноживущих спирохет и сульфидогенов, где анаэробные спирохеты являются основным структурным и функциональным компонентом. При росте спирохет в сообществе «ТЫос1епс1гопг> в клетках происходит накопление элементной серы (Дубинина и др., 1993а). Маты формируются в микроаэробных условиях, где спирохеты приобретают нитевидную форму и образуют слизистый матрикс (Дубинина и др.. 1993а; 19936). Метаболизм глюкозы в зависимости от кислородного режима роста. В клетках исследованных нами спирохет штаммов Р и БМ цитохромы не обнаружены,

независимо от кислородного режима их культивирования. Это свидетельствует об отсутствии электротранспортной цепи и запасании энергии в клетках спирохет с участием окислительного фосфорилирования. У аэротолерантных спирохет, как и у других представителей этого рода, обнаружена активность основных ферментов гликолитического катаболизма глюкозы, осуществляемого по пути Эмбдена-Мейергофа (табл. 11).

Таблица 11. Влияние условий культивирования на активность ферментов, участвующих в метаболизме глюкозы у различных штаммов спирохет, нмоль/(мин'мг белка)_________

Ферменты Штаммы

Р БМ

А Б Б/А, в % А Б Б/А, в %

Гексокиназа 64 64 100 33 33 100

Пируваткиназа 13 13 100 33 33 100

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 0 0 0 0

Глюкозо-6-фосфатизомераза 48 48 100 82 82 100

Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза 48 48 100 10 10 100

Фосфатацетилтрансфераза 1064 605 57 2545 2195 86

Ацетаткиназа 160 305 191 57 155 272

Алкогольдегидрогеназа 50 15 30 136 40 29

Лактатдегидрогеназа нд нд 126 70 56

НАДН-оксидаза 12 65 542 10 53 530

НАДН-пероксидаза 27 59 219 17 80 267

Гидрогеназа 46 18 39 нд нд

Фосфоглюкомутаза 30 100 333 30 180 600

Примечание: А - анаэробный рост; Б - микроаэробный рост.

При анаэробном росте спирохеты метаболизируют глюкозу по пути близкому для других анаэробных представителей этого рода. В составе конечных продуктов преобладают более восстановленные соединения - этанол, формиат, Н3 с накоплением центрального метаболита гликолиза - пирувата (рис. 12).

Рис. 12. Влияние условий культивирования на продукты брожения глюкозы у спирохет штамм Р.

Условные обозначения: А - анаэробные условия роста; Б - микроаэробные условия роста.

При наличии 02 в среде в 3-5 раз увеличивался выход более окисленных продуктов - ацетата и С02 с очень незначительным накоплением формиата, этанола, иногда Н2 (рис. 12).

Анализ состава и соотношения конечных продуктов, а также ферментативной активности клеток показывает, что в зависимости от кислородного режима роста - в анаэробных и микроаэробных условиях разложение глюкозы аэротолерантными спирохетами, выделенными из серных матов «ТЫос1епс1гоп», происходит с участием различных биохимических реакций (рис.13).

Образование НАД для реакций гликолиза в анаэробных условиях роста обеспечивается двумя восстановительными реакциями на конечных этапах образования этанола - при участии ацетальдегиддегидрогеназы и алкогльдегидрогеназы, а также при участии лактатдегидрогеназы. В присутствии 02 рециклизация НАД для гликолиза происходит при окислении НАДН кислородом с участием двух ферментов - НАДН - оксидазы и НАДН -пероксидазы. Активизация еще одного фермента, ацетаткиназы, катализирующей образование АТФ и ацетата на конечном этапе, способствует увеличению энергетического выхода катаболизма глюкозы. В пользу последнего говорит тот факт, что при микроаэробном росте удельная скорость синтеза АТФ в клеточной суспензии в два раза выше, чем в клетках, выращенных анаэробно.

Таким образом, на лицо преимущество микроаэробного культивирования перед анаэробным. Преимущества аэробного пути использования глюкозы обусловлены тремя основными факторами: функционированием укороченного пути катаболизма пирувата, с полным его использованием; дополнительным синтезом НАД для реакций гликолиза; активизацией основных ферментативных реакций и, следовательно, - увеличением скорости процессов. В конечном итоге это приводит к увеличению эффективности использования субстрата и к увеличению урожая клеток.

К «издержкам» аэробного метаболизма спирохет следует отнести избыточное накопление Н202 в токсических концентрациях - до 4,9 мкг/(мин-мг белка).

Особенности аэробного метаболизма аэротолерантных спирохет, а именно накопление в клетках Н202 в токсических концентрациях, несмотря на ее ферментативное разрушение с участием НАДН - пероксидазы, позволяют обосновать необходимость введения в состав питательных сред восстанавливающих агентов (сульфида, тиосульфата), способных удалять Н202. Эти причины объясняют и приуроченность массового развития спирохет в естественных условиях к водоемам с активным поступлением сероводорода в придонную воду. Стрессовое воздействие 02 на спирохеты в результате накопления Н202 предотвращается также с участием другого механизма - за счет синтеза слизистого матрикса ЭПС, участвующего в формировании слизистой структуры серных матов «1Ыо<1епс1гот>.

ГЛЮКОЗА

; |

2АТФ _J ' 2АТФ

H2O2 + HjS—»- S + 2H3O

2НАД v

2НАДН ^

НА НАДН

•г Hj» НАД

АЦЕТИЛ-РО,

VX> С5ч

АТФ <У АТФ

АК I АК

Рис.13. Схема превращения глюкозы у аэротолеранткыж спирохет штаммов Р н БМ из снмбнотнческой ассоциации ТкМепЛгоп при анаэробном (1) и макроаэробном (2) росте

-активность фермента была определена

> определена активность ряда ферментов

* активность фермента не определяли О - ® кружок помещены конечные продукты;

АК - ацетаткяназа; ФАТ - фосфатацетилтрансфераза, АДГ - алкогольдегкдрогеназа •Для спирохет показано, что ацегальдегиддегидрогеназа ацетил- СоА-, а не ацетатзависимая (НезреН Сапа1-Раго1а, 1970).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что группа пресноводных бесцветных серобактерий гетерогенна по составу. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК позволил отнесены все изученные серобактерии к альфа-, бета-, гамма - классам филума Proteobacferia. На основе филогенетических исследований проведена реклассификация видов рода Aquaspirillum.

Установлено, что штаммы серных спирилл, способные накапливать S0 внутриклеточно в присутствии сульфида, согласно полифазному анализу,

относятся к разным таксонам Betaproteobacteria (роды Aquaspirillum, Giesbergeria, Simplispira, Comamonas и Spirillum) и Alphaproteobacteria (Demtrospira). Таким образом, серные спириллы, отнесенные ранее на основании морфотипа к роду Thiospira оказались представителями разных таксонов в пределах альфа и бета -протеобактерии. Полученные нами данные не оставляют оснований для сохранения этих бактерий в составе рода Thiospira.

Показана функциональная роль восстановленных соединений серы у бесцветных серобактерий, позволившая разделить их на две физиологические группы: первая объединяет литотрофные бесцветные серобактерии у которых восстановленные соединения серы выполняют роль доноров электронов в энергетическом метаболизме; вторая группа объединяет облигатных гетеротрофов, у которых серные соединения выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода.

Для бесцветных серобактерий характерно развитие в специфических экологических нишах — в неравновесных условиях в микрозоне градиента H2S/O2. Для выживания в быстро меняющихся условиях среды бактерии должны обладать лабильным типом метаболизма и совершенными механизмами его регуляции. Нам удалось показать некоторые механизмы, лежащие в основе переключения метаболических путей при смене условий роста.

При исследовании серного и углеродного метаболизма представителей пресноводных Beggiatoa впервые на примере штамма В. leptomitiformis Д-402 показана их способность к органотрофному, а также к авто-, лито- и миксотрофному росту. Установлено, что основными факторами, определяющими тип метаболизма в присутствии восстановленных соединений серы, являются концентрация кислорода и наличие органических веществ.

Переход от органотрофного роста к миксотрофному у В. leptomitiformis Д 402 сопровождается существенной перестройкой метаболизма за счет изменения ферментативной активности основных метаболических путей - цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла, что приводит к перераспределению их роли в анаболических и катаболических процессах.

Регуляция и переключение метаболических функций у пресноводного штамма В. leptomitiformis Д-402 осуществляется за счет структурно-функциональной перестройки малатдегидрогеназной системы, ключевого фермента углеродного метаболизма: в условиях литотрофного роста функционирование глиоксилатного цикла обеспечивает тетрамерная форма фермента, участвующая в процессах конструктивного метаболизма, а переход к органотрофии сопровождается появлением димерной формы, которая участвует в энергетическом метаболизме, обеспечивая функционирование ЦТК.

Пресноводный штамм В leptomitiformis Д-402 способен также переходить от миксотрофного роста к литотрофному. В этом случае переход определяется степенью загруженности I комплекса ЭТЦ восстановительными эквивалентами, поступающими от органических веществ.

У В leptomitiformis Д-402 автотрофный рост при окислении тиосульфата возможен только в строго микроаэробных условиях в отсутствии органического субстрата. Следует отметить, что концентрация кислорода влияет на активность РБФК, а также на состав цитохромов ЭТЦ (в микроаэробных условиях происходит индукция синтеза терминальной оксидазы ebb ¡-тута, вместо оксидазы аа^-типа) и активность ферментов окислительного (диссимиляционного) метаболизма серы.

Другая исследуемая группа серобактерий - бактерии рода Leucothrix, которые до недавнего времени не были включены в группу бесцветных серобактерий. Нами было показано, что бактерии рода Leucothrix способны использовать серные соединения в энергетическом метаболизме и при этом накапливают элементную серу внутри клеток.

Сравнительное изучение метаболизма трех видов этого рода привело к следующим выводам: 1. У L. thiophila и Leucothrix sp. была показана чрезвычайно низкая активность дегидрогеназ ЦТК, которая на порядок ниже по сравнению с типовым видом L. тисог и типичными гетеротрофными бактериями Е. coli. В определенной степени низкая активность дегидрогеназ и ферментов ЦТК в целом предопределяет их (L thiophila и Leucothrix sp.) практически облигатную зависимость от неорганических доноров электронов - серных соединений. 2. У L. mueor - индукция ферментов серного метаболизма происходит только в присутствии восстановленных соединений серы при лимитации роста органическим веществом в отличие от других видов (L. thiophila и Leucothrix sp.), которые в широком диапозоне концентраций органических веществ не могут их использовать в достаточной для роста степени. 3. Переход от литотрофного типа питания к органотрофному сопровождается изменением состава ЭТЦ: при литотрофном росте у L тисог DSM 2157 в составе ЭТЦ функционируют только цитохромы а и b типов, а при органотрофном - а, Ь, с. 4. При сравнительном анализе ферментативной активности в ЦТК и в глиоксилатном цикле при различном типе питания обнаружены закономерности, характерные для Beggiatoa, т.е. при миксотрофном росте происходит снижение роли ЦТК и увеличение активности ферментов глиоксилатного цикла при переходе от органотрофии к миксотрофии. Кроме того, в последнее время удалось обнаружить появление тетрамерной формы МДГ у L. тисог при миксотрофном росте, так же, как и у Beggiatoa штамм Д-402 (Епринцев и др., 2004).

Принципиально сходные с В leptomitiformis и бактериями рода Leucothrix механизмы регуляции метаболизма при смене условий роста обнаружены и у других нитчатых серобактерий Thiothrix arctophila. Это позволяет сделать вывод об универсальном, или по крайней мере, широко распространенном проявлении подобного характера регуляции и адаптационных изменениях в метаболизме у бактерий с вариабельным типом метаболизма: адаптация к изменению условий роста обеспечивается структурной и функциональной перестройкой ключевого фермента углеродного метаболизма - МДГ и последующими изменениями в активности ферментных систем и перераспределением потоков восстановительных эквивалентов.

Другая группа бесцветных серобактерий - гетеротрофные одноклеточные и нитчатые серобактерии, в отличие от представителей сероокисляющих литотрофов не способны использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов в энергетическом метаболизме. Они отличаются от литотрофов по функциональной роли соединений серы, а также по механизму и конечным продуктам их окисления: сульфид окисляется только до элементной серы, а тиосульфат - до тетратионата. Эти окислительные процессы не связаны с запасанием энергии в виде АТФ и их окисление осуществляется по перекисному механизму. У гетеротрофных серобактерий внутриклеточное накопление Н2О2, вызвано высокой скоростью синтеза пероксида водорода в ЭТЦ, диспропорцией в активности ферментов, участвующих в синтезе Н202 и его детоксикации, а также пространственной разобщенностью локализации Н202 и ряда ферментных систем, участвующих в его удалении.

У бесцветных серобактерий органические соединения метаболизируются преимущественно через ЦТК, который у них на уровне гидратаз, содержащих [4Ре-48]2+ кластеры, уязвим к действию АФК. Сбои в работе ЦТК могут индуцировать генерацию активных форм кислорода в электронтранспортной цепи. Таким образом, можно заключить, что метаболическая активность серобактерий при окислительном стрессе во многом будет зависеть от присутствия в среде восстановителей, необходимых для удаления АФК и повышающих антиокислительную активность.

Другой важный вопрос, который мы постарались рассмотреть, это причины обуславливающие микроаэрофилию и аэротолерантность бесцветных серобактерий. Микроаэрофилия лито- и гетеротрофных серобактерий, также как их способность к окислению соединений серы, обусловлены различными физиологическими причинами. Если у большинства литотрофов она диктуется потребностью в одновременном присутствии доноров и акцепторов электронов (Б2- и 02") и достигается путем физиологической адаптации бактерий к специфическим условиям среды для обеспечения ростовых субстратов, то у гетеротрофных серобактерий микроаэрофилия является вынужденной мерой, или стратегией, позволяющей избежать окислительный стресс, который они испытывают в аэрируемых слоях воды в отсутствие внешних детоксикантов.

Особый интерес представляют анаэробные гетеротрофы аэротолерантные к кислороду. У них в отличие от аэробных гетеротрофов существуют адаптационные механизмы, позволяющие не только избегать негативное влияние кислорода, но и извлекать пользу, а именно получать энергетическую выгоду от его вовлечения в метаболические процессы. Наиболее выражен этот тип стратегии адаптации к кислороду у аэротолерантных сероокисляющих спирохет, выделенных из серных матов «ТЫос1епс1гогг>>, где спирохеты доминируют.

Оказалось, что при микроаэробном культивировании спирохеты используют альтернативный путь метаболизма глюкозы по укороченному пути с образованием более окисленных конечных продуктов. В аэробных условиях наблюдается двухкратное увеличение эффективности использования глюкозы и урожая клеток.

Вовлечение кислорода в метаболические процессы осуществляются с участием НАДН-оксидазы. Последняя выполняет в клетках спирохет двоякую функцию: она катализирует реакцию окисления НАДН кислородом с образованием НАД который необходим для пополнения его пула в клетке для функционирования гликолиза, и участвует в удалении избыточных концентраций 02 в клетках, и, как следствие, это приводит к синтезу Н2С>2. Преодоление окислительного стресса, вызываемого избытком Н2О2, достигается совокупным действием двух основных факторов: во-первых, Н2СЬ не оказывает токсическое действие на клетки спирохет в присутствии восстановленных соединений серы в среде в результате их химического взаимодействия, а во-вторых, уменьшение скорости диффузии 02 внутрь клетки достигается за счет синтеза ЭПС, и в результате снижается скорость синтеза и концентрация Н2О2.

ВЫВОДЫ

1. В филогенетическом отношении пресноводные бесцветные серобактерии гетерогенны и принадлежат к альфа-, бета- и гамма- классам филума Proteobacteria. «

2. Ревизия таксономического состава серных спирилл показала, что они являются представителями различных родов филума Proteodacteria: Aquaspirillum, Giesbergeria gen. nov., Comamonas, Simpüspira gen. nov., Denitrospira gen. nov., ^ Spirillum.

3. На основе филогенетических исследований проведена реклассификация видов рода Aquaspirillum. Из описанных ранее серных спирилл вид A. bipunctata sp. nov. оставлен вместе с типовым и единственным видом A serpens в составе рода Aquaspirillum. Виды f.Aquaspirillum] metamorphum, [Aquaspirillum] psychrophilum объединены в составе нового рода Simplhpira gen. nov., как виды S. metamorpha comb, nov.1, S. psychrophila comb, nov.; вид [.Aquaspirillum] itersonii включен в состав нового рода Denitrospira gen. nov., как вид D itersonii comb. nov.T; серные спириллы [.Aquaspirillum] voronezhense, а также [Aquaspirillum] anulus, [Aquaspirillum] giesbergeri и [.Aquaspirillum] sinuosum включены в состав нового рода Giesbergeria gen. nov., как виды G voronezhense sp. nov., G. anula comb, nov., G giesbergeri comb, nov., G. sinuosa comb. nov.

4 Показана функциональная роль восстановленных соединений серы у бесцветных серобактерий, позволившая разделить их на две физиологические группы: первая объединяет литотрофные бесцветные серобактерии, у которых восстановленные * соединения серы выполняют роль доноров электронов в энергетическом метаболизме; вторая группа объединяет облигатных гетеротрофов, у которых серные соединения выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода.

5. Регуляция метаболизма у факультативно литотрофных бесцветных серобактерий может инициироваться различными факторами внешней среды (кислородом, органическими соединениями, неорганическими донорами электронов). На биохимическом уровне она проявляется в структурно-функщкшальных изменениях

основного рал'ляторпого фермента углеродного метаболизма - малатдегидрогеназы, качественно: о и количественного состава цитохромов электронтранспортной цепи, активности ферментов окислительного метаболизма серы и углерода (цикл Кальвина, ЦГК и глиоксилатный цикл).

6. Микроаэрофилия различных физиологических групп бесцветных серобактерий обусловлена влиянием активных форм кислорода на различные стороны их конструктивного и энергетического метаболизма: у литоавтотрофов микроаэрофилия обусловлена в первую очередь чувствительностью рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы и в меньшей степени ферментов диссимиляционного серного окислительного метаболизма; у облигатных гетеротрофов - высокой чувствительностью ферментов, содержащих SH-группы и [4Fe-4S]2+ кластеры.

7. Аэротолерантность анаэробных спирохет из симбиотической ассоциации «Thiodendron», обусловлена наличием у них ряда адаптационных механизмов, позволяющих не только избегать негативное влияние кислорода, но и получать энергетическую выгоду от его вовлечения в метаболические процессы за счет использования укороченного пути метаболизма глюкозы, образования более окисленных продуктов по сравнению с анаэробным ростом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Экспериментальные статьи

1 Дубинина Г.А., Грабович М.Ю. Выделение чистых культур Thiospira и изучение их серного метаболизма// Микробиология. - 1983. - Т. 53, № 1. - С. 5-12.

2. Дубинина Г.А., Грабович М.Ю. Выделение, культивирование и характеристика Macromonas bipunctata // Микробиология. -1984. - Т. 53, № 5. - С. 748-755.

3. Грабович М.Ю., Чурикова В.В., Черных H.A., Кононыхина И.О., Поправко И.П. Выделение и характеристика штаммов нового вида Aquaspirillum voronezhense sp.nov. // Микробиология. - 1987. - Т. 56, № 4. - С. 665-672.

4. Грабович М.Ю., Чурикова В.В., Дубинина Г.А., Поправко И.П. Изучение активности ферментов,взаимодействующих с продуктами неполного восстановления кислорода, у бесцветных серобактерий // Микробиология. -1988 -Т. 57, № 6. - С. 929-934.

5. Дубинина Г.А., Чурикова В.В., Грабович М.Ю., Черных H.A., Райхинштейн М.В.,Петухова Н.Е. Выделение и характеристика Aquaspirillum denitrificans sp. nov. // Микробиология. - 1989. - Т. 58, № 6. - С. 1014-1020.

6. Грабович М.Ю., Чурикова В.В.,Черных H.A., Лещева Н.В., Пушкина О.Э., Шипилова Л.И., Пантелеева Е.Е. Выделениеи описание нового вида Aquaspirillum elegans sp.nov. // Микробиология. - 1990. - Т. 59, № 2. - С. 307-313.

7 Дубинина Г.А., Грабович М.Ю., Чурикова В.В , Пашков А.Н., Чеканова Ю А, Лещева Н.В Образование перекиси водорода Beggiatoa leptomitiformis II Микробиология. - 1990. - Т. 59, № 3. - С. 425-431.

8. Намсараев Б.Б., Дубинина Г.А., Бонч-Осмоловская Е.А., Старынин Д.А., Горленко В.М., Грабович М.Ю., Качалкин В.И. Участие бактерий круговорота углерода, серы и железа в деструкции органического вещества в бентосных сообществах бухты Кратерная // Сб. «Мелководные гидротермы и экосистема бухты Кратерной Функциональные характеристики» / Владивосток: - 1991. Часть 1,- С. 154-170

9. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Чурикова В.В., Глушков А.Ф., Чуриков С.Н. Особенности углеродного метаболизма у бесцветных серобактерий Macromonas bipunctata // Микробиология. - 1993. - Т. 62, № 3. - С. 421-429.

10. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Чурикова В.В. , Чуриков С.Н., Коровина Т.И., Глушков А.Ф. Изучение углеродного метаболизма у Beggiatoa leptomitiformis при хемоорганогетеротрофном росте // Микробиология. - 1993. - Т. 62, № 3. - С. 430436.

11. Дубинина Г.А., Лещева Н.В., Грабович М.Ю Выделение и таксономическое изучение бесцветных серобактерий рода «Tbiodendron» // Микробиология. - 1993. -Т. 62, № 4.-С. 717-732.

12. Дубинина Г.А., Грабович М.Ю., Лещева Н.В. Распространение и метаболическая активность бактериальных серных матов «Thiodendron» в соленых водоемах различного типа // Микробиология. - 1993. - Т. 62, № 4. - С. 740-750.

13. Дубинина Г.А., Грабович М.Ю., Чурикова В.В., Лысенко A.M., Черных H.A. Пересмотр таксономического положения бесцветных серных спирилл рода Thiospira и описание нового вида Aquaspirillum bipunctata comb. nov. // Микробиология. - 1993.-Т. 62, № 6. - С.1101-1112.

14 Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Чурикова В.В., Чуриков С.Н., Коровина Т.И. Пути синтеза и утилизации включений оксалатов в клетках бесцветных серобактерий Macromonas bipunctata // Микробиология. - 1995. - Т. 64, № 5. -С. 630-637.

15. Грабович М.Ю., Епринцев А.Т., Чурикова В.В., Степанова И.Ю., Кудрявцева H.A. Роль малатдегидрогеназой системы в адаптации Spirillum sp. штамм Д-427 к сероводородным биотопам // Материалы международного симпозиума - Физико-химические основы функционирования белков и их компонентов / Воронеж- ВГУ. -1995.-С.36-38.

16. Грабович МЮ.. Дубинина Г.А., Дульцева М.Н., Чурикова В.В. Особенности углеродного метаболизма при хемолито- и хемоорганогетеротрофном росте нитчатых серобактерий Thiothrix arctophila и Leucothrix thiophila // Микробиология. - 1996. - Т. 65, №.2. - С.149-154.

17. Грабович М.Ю., Чурикова В.В. Исследование механизмов адаптации бесцветных серобактерий к изменениям окружающей среды // Труды III международной конференции из серии «Нелинейный мир» /Воронеж. ВГУ. -1997. - С.110-114.

18. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Лебедева В.Ю., Чурикова В.В. Миксотрофный и литогетеротрофный рост пресноводного штамма скользящих нитчатых серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 // Микробиология. -1998. - Т.67, № 4. - С.464-470.

19. Грабович М.Ю., Чурикова В.В., Мунтян М.С., Лебедева В.Ю., Дубинина Г.А., Попова И.В., Беляев М.А. Механизмы адаптации типовою штамма Leucothrix mucor DSM 2157 к условиям роста // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. тр. - Воронеж, 1998. - № 1. - С. 57-62.

20. Grabovich M.Yu., Muntyan M.S., Lebedeva V.Yu., Ustiyan V.S., Dubinina G.A.. Lithoheterotrophic growth and electron transfer chain components of the filamentous gliding bacterium Leucothrix mucor DSM 2157 during oxidation of sulfur compounds // FEMS Microbiology Letters. - 1999. - V. 178. - P. 155-161.

21. Грабович М.Ю., Патрицкая В.Ю., Дубинина I.A., Чурикова B.B. Литоавтотрофный рост пресноводных нитчатых серобактерий Beggiatoa

22 Подкопаева Д.А., Родионова Е.Ю.. Грабович М.Ю., Дубинина ГА. Изучение влияния кислородного режима на особенности функционирования углеродного метаболизма Spirillum winogradskii / Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. тр. - Воронеж, 2000. - № 2. - С. 96-102.

23. Патрицкая В.Ю., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Мунтян М.С.Литоавтотрофрый рост пресноводного штамма бесцветных серобактерий Beggiatoa "leptomitiformis " Д-402 // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 2. - С.182-188.

24. Grabovich M.Yu., Patritskaya V.Yu., Muntyan M.S., Dubinina G.A.. Lithoautotrophic growth of the freshwater strain Beggiatoa D-402 and energy conservation culture under microoxic conditions // FEMS Microbiology Letters. - 2001. - V. 204. - P.341-345.

25. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Анализ таксономического положения нового представителя бесцветных серных спирилл рода Spirillum -Spirillum sp. штамм Д - 430 // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. тр. - Воронеж, 2001. - № 3. - С. 83-88.

26. Грабович М.Ю., Дульцева Н.М., Дубинина Г.А. Сравнительная характеристика углеродного и серного метаболизма у представителей двух кластеров бактерий рода Leucothrix // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 3. - С. 301-307.

27. Степанова И.Ю., Епринцев А.Т., Фалалеева М.И., Парфенова Н.В., Грабович М.Ю., Патрицкая В.Ю., Дубинина Г.А. Зависимость структуры малатдегидрогеназы от типа метаболизма у пресноводных нитчатых бесцветных серобактерий рода Beggiatoa //Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 4. - С. 445-451.

28. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Влияние условий культивирования на синтез АТФ у бесцветных серобактерий // Вестник ВГУ. Серия Химия, биология. - 2002. - Т.1, № 1. - С. 74-79.

29. Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Климова М.А., Саркисова Т.М. Особенности спирохет Perfilievia russia и вибрионов Dethiosulfovibrio russensis из симбиотической ассоциации «Thiodendron» // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. тр. - Воронеж, 2002. - № 4. - С. 4451.

30. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Окислительный стресс у микроаэрофильных бактерий Spirillum -winogradskii и системы антиоксидантной защиты клеток // Микробиология. - 2003. - Т. 72, № 5. - С. 600-608.

31. Подкопаева Д.А., Божко О.Ю., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Изучение влияния окислительного стресса на системы антиоксидантной защиты клеток сероокисляющих бактерий // Организация и регуляция физиолого-биохимических

, процессов : межрегион, сб. науч. тр. - Воронеж, 2003. - № 5. - С. 122-128.

32. Епринцев А.Т., Фалалеева М.И., Грабович М.Ю., Парфенова Н.В., Каширская H.H., Дубинина Г.А. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических и катаболических процессов у бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 // Микробиология. - 2004. - Т. 73, № 4. - С. 437-442.

33. Дубинина Г.А., Грабович М.Ю., Чернышева Ю.Ю. Роль кислорода в регуляции метаболизма аэротолерантных спирохет - основного компонента бактериальных серных матов «Thiodendron» //Микробиология. - 2004. - Т. 73, № 6. - С. 725-733.

34 Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Функциональная роль неорганических восстановленных соединений серы в метаболизме микроаэрофильных бактерий Spirillum -winogradskii // Микробиология. - 2005. -Т. 74, № 1.-С. 17-25.

2005-4 45461

35. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Влияние неорганических восстановленных соединений серы на метаболизм микроаэрофильных бактерий Spirillum winogradskii // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. тр. - Воронеж, 2004. - № 6. - С. 121-127.

Тезисы конференций

36. Дубинина Г.А., Грабович М.Ю., Чурикова В.В., Епринцев А.Т. Биореактор -эффективный способ удаления сероводорода из воздуха //Тезисы Межд. конф. «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды»,- 1995.-Томск. - Т.З. - С. 349-350.

37. Патрицкая В.Ю., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А., Мунтян М.С. Регуляторные механизмы литотрофного роста у представителей скользящих нитчатых серобактерий родов Beggiatoa и Leucothrix // Тезисы Межд. науч. конф. «Автспрофные микроорганизмы». - 2000. - М. - С. 142-143.

38. Степанова И.Ю., Фалалеева М.И., Грабович М.Ю., Епринцев А.Т. Регуляторные свойства малатдегидрогеназы из бесцветных серобактерий рода Beggiatoa // Тезисы Межд. науч. конф. «Автотрофные микроорганизмы». - 2000. —М. - С. 172-

39. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. Влияние кислорода на метаболизм микроаэрофильных серных спирилл // Тезисы конференции «Водные экосистемы и организмы».- Москва: МГУ, 2001. - С.88.

40. Grabovich M. Yu., Dubinina, G.A.., Patritskaya V. Yu., Muntyan M. S. Regulation of carbon and sulfur metabolism in filamentous freshwater bacterium Beggiatoa leptomitiformis D-402 // Abstracts 1st FEMS Congress of European Microbiologists, 29.06-3.07.2003, Ljubljana, Slovenia. - P. 331-332.

41. Dubinina, G.A.., Grabovich M. Yu. The role of oxygen in metabolism regulation of aerotolerant spirochetes forming sulfur mats of «Thiodendron» // Abstracts 1st FEMS Congress of European Microbiologists, 29.06-3 07.2003, Ljubljana, Slovenia. - P. 325.

42. Podkopaeva D.A., Grabovich M. Yu., Dubinina, G.A..Oxydation stress and antioxidant protection in heterotrophic colorless sulfur bacteria // Abstracts 1st FEMS Congress of European Microbiologists, 29.06-3.07. 2003, Ljubljana, Slovenia. - P. 314.

43. Епринцев A.T., Грабович М.Ю., Фалалеева М.И., Парфенова Н.В., Лавриненко К.С. Роль структурных изменений малатдегидрогеназы в трансформации метаболизма бактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 // Сборник тезисов докладов «III съезд биофизиков России», 24-29 июня 2004г., Воронеж. - С. 29-30.

Заказ №/?3 отЯ!03 2005г Тираж4ÛÛ экз Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

173.

s

»

* Ï $ '

2 2 АПР 2005

а

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Грабович, Маргарита Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. НИТЧАТЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ

1.1 .Таксономическая характеристика нитчатых бесцветных серобактерий

1.1.1 .Характеристика рода Beggiatoa

1.1.1.1. Метаболизм соединений углерода, серы, азота

1.1.1.2. Экология

1.1.1.3. Филогенетическое положение

1.1.2. Характеристика рода ТЫорЬса

1.1.2.1. Таксономический состав

1.1.2.2. Метаболизм

1.1.2.3. Экология

1.1.2.4. Филогенетическое положение

1.1.3. Характеристика рода ТМоЖгЬс

1.1.3.1. Метаболизм соединений углерода и серы

1.1.3.2. Экология

1.1.3.3. Таксономический состав и филогенетическое положение

1.1.4. Характеристика рода ЬеиШкг'гх

1.1.4.1. Филогененетическое положение

1.1.4.2. Экология

ГЛАВА 2. ОДНОКЛЕТОЧНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ

СЕРОБАКТЕРИИ

2.1. Краткая характеристика одноклеточных бесцветных серобактерий

2.1.1. Характеристика рода АсИготаНит

2.1.1.1. Метаболизм

2.1.1.2. Филогенетическое положение

2.1.2. Характеристика рода ТЫотаг^агйа

2.1.3. Характеристика рода ТЫоЪаЫег'шт

2.1.4. Характеристика рода ТЫоуиШт

2.1.5. Характеристика рода Масготопах

2.1.6. Характеристика рода Т1ио$р1га

2.1.7. Характеристика рода «ТЫос1епс1гот> ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты исследования

3.2. Состав питательных сред для культивирования бактерий

3.3. Разработка техники микроаэробного культивирования

3.4. Методы изучения морфологии, ультрастуктуры и внутриклеточных включений

3.5. Получение клеточной суспензии, ферментных препаратов и мембранных фракций бактериальных клеток

3.6. Методы определения активности ферментов

3.6.1. Ферменты углеродного метаболизма

3.6.2. Определение активности ферментов, участвующих в превращениях восстановленных соединений серы

3.6.3. Определение активности ферментов, участвующих в синтезе детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода

3.7. Очистка и изучение свойств МДГ

3.8. Физико-химические методы анализа

3.8.1. Радиоуглеродный метод

3.8.2. Методы определения растворенного кислорода

3.8.3. Определение хинонов

3.8.4. Анализ жирнокислотного состава

3.8.5 Анализ неорганических соединений серы

3.8.6. Метод определения концентрации внутриклеточной АТФ

3.8.7. Определение продуктов брожения

3.8.8. Определение Н

3.8.9. Определение метаболитной антиокислительной активности 109 3.9. Методы молекулярной биологии 109 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ

ГЛАВА 4. ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ БЕСЦВЕТНЫХ

М СЕРОБАКТЕРИЙ

4.1. Филогенетическое положение штаммов серных спирилл

4.1.1. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК

4.1.2. Генотипические свойства

4.1.3. Состав жирных кислот и хинонов

4.2. Таксономическое положение некоторых бактерий рода Aquaspirillum и Spirillum

4.3. Филогенетическое положение штаммов Д-401 и Д-402 пресноводных Beggicitoci

4.3.1. Генотипические свойства

4.3.2. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК

4.4. Филогенетическое положение бактерий рода Macromonas

II УГЛЕРОДНЫЙ И СЕРНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ

ГЛАВА 5. ЛИТОТРОФНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ 142 5.1. Пресноводные нитчатые серобактерии Beggiatoa leptomitiformis Д-402 142 5.1.1. Механизм окисления восстановленных соединений серы

5.1.1.1. Окисление соединений серы и влияние на клеточный урожай

5.1.1.2. Активность ферментов серного метаболизма

5.1.1.3 .Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ

5.1.1.4. Связь окисления соединений серы с синтезом АТФ

5.1.2. Углеродный метаболизм и пути его регуляции

5.1.2.1. Углеродного метаболизма при органотрофном и миксотрофном росте

5.1.2.2. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических и катаболических процессов

5.1.3. Регуляторная роль кислорода в метаболизме В. leptomitiformis

М штамм Д

5.1.3.1. Влияние концентрации кислорода в среде культивирования на урожай клеток и активность ферментов углеродного и серного метаболизма при миксотрофном росте

5.1.3.2. Условия литоавтотрофного роста В. leptomitiformis Д

5.1.3.3. Автотрофная фиксация С02 и активность ключевых ферментов цикла Кальвина

5.1.4. Структура электронтранспортных цепей в мембранах при различных типах питания и режимах аэрации культуры 170 5.2. Серобактерии рода Leucothrix 175 5.2.1 .Механизм окисления соединений серы и углерода у Leucothrix thiophila и Leucothrix sp

5.2.1.1. Окисление соединений серы и влияние на клеточный урожай

5.2.1.2. Изучение активности ферментов, участвующих в превращении соединений серы

5.2.1.3. Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ

5.2.1.4. Связь окисления соединений серы с синтезом АТФ

5.2.1.5. Изучение особенностей углеродного метаболизма 182 5.2.2. Изучение физиолого-биохимических процессов, связанных с окислением соединений серы Leucothrix mucor DSM

5.2.2.1. Использование восстановленных серных соединений в энергетическом метаболизме L. mucor

5.2.2.2. Изучение активности ферментов серного метаболизма в клетках L. тисог

5.2.2.3. Взаимосвязь ферментативного окисления восстановленных серных соединений, состава ЭТЦ, окислительного и субстратного фосфорилирования

5.2.2.4. Связь окисления восстановленных соединений серы с синтезом

М 5.2.2.5. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла в клетках

L. тисог

5.2.2.6. Состав цитохромного участка ЭТЦ

5.3. Окислительный метаболизм соединений серы и углерода у серобактерий Thiothr'ix arctophila IN

5.3.1. Окислительный метаболизм соединений серы

5.3.2. Метаболизм соединений углерода

ГЛАВА 6. ГЕТЕРОТРОФНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ

6.1. Окисление восстановленных соединений серы

6.1.1. Способность гетеротрофных серобактерий к окислению соединений серы и их влияние на рост бактерий

6.1.2. Влияние восстановленных соединений серы на синтез АТР у гетеротрофных серобактерий

6.2. Окислительный стресс и механизм антиоксидантной защиты

6.2.1. Скорость образования Н2О2, концентрация и локализация

6.2.2. Особенности роста гетеротрофных серобактерий в условиях окислительного стресса

6.2.3. Системы защиты клеток от кислорода

6.2.3.1. Ферментативные системы защиты клеток от кислорода

6.2.3.2. Неферментативные способы защиты от токсичных форм кислорода

6.2.4. Механизм окисления соединений серы у гетеротрофных серобактерий

6.2.5. Регуляция углеродного метаболизма

6.2.5.1. Особенности функционирования ЦТК

6.2.5.2.Потребность в анаплеротической последовательности

ГЛАВА 7. РОЛЬ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА АЭРОТОЛЕРАНТНЫХ СПИРОХЕТ - ОСНОВНОГО КОМПОНЕНТА БАКТЕРИАЛЬНЫХ СЕРНЫХ МАТОВ

THIODENDRON» 250 ^ 7.1. Влияние кислорода на рост и эффективность использования глюкозы

7.2. Образование Н2О2 и окисление соединений серы

7.3. Ферментативные системы защиты клеток от кислорода 259 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 264 ВЫВОДЫ 275 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 277 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - аконитатгидратаза

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДАБ - диаминобензидин ДССД - N, N-дициклогексилкарбодиимид ДТТ- дитиотреитол ДХФИФ - 2,6-дихлорофенолиндофенол ИДГ- изоцитратдегидрогеназа МДГ - малатдегидрогеназа НАДНникотинамидадениндинуклеотид (восстановленная форма) НАДФН - никотинамид-адениндинуклеотидфосфат (восстановленная форма) ПХМБ - парахлормеркурийбензоат ПВК - пировиноградная кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция РБФК - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза СДГ- сукцинатдегидрогеназа

СОД - супероксиддисмутаза

ФГ- фумаратгидратаза

ФЕП - фосфоенолпировиноградная кислота

ФМС - феназинметасульфат ФХФ - дихлорфенолиндофенол ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ЩУК - щавелевоксусная кислота (оксалоацетат)

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПС - экзополисахариды ЭТЦ - электронтранспортная цепь Со А - кофермент А СССР - карбонилцианид-м- хлорофенилгидразон DMSO - диметилсульфоксид HQNO - 2-н-гептил-4-гидроксихинолин -N-оксид MOPS - З-(Ы-Морфолино) пропансульфоновая кислота NEM - N-этилмалеимид PMSF - фенилметансульфонилфторид TTFA - теноилтрифторацетон

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биоразнообразие бесцветных серобактерий"

Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии представляют группу микроорганизмов, участвующих в окислительных реакциях геохимического цикла серы. Представители бесцветных серобактерий широко распространены в водоемах разного типа - пресных, морских, в районах океанических гидротерм и в антропогенных экосистемах. В природе серобактерии занимают уникальные экологические ниши - они существуют в пограничных областях между аэробной и анаэробной зонами, где играют важную роль в окислении токсичных серных соединений органической и неорганической природы, предотвращая их поступление в вышележащие слои воды. Участвуя в окислении сульфида, они способствуют рециклизации процесса превращения соединений серы в водоемах, что имеет большое значение для анаэробной минерализации в пресных водоемах.

Изучение серобактерий активизировалось в последнее десятилетие благодаря проведению широкомасштабных экологических исследований морских экосистем в районах гидротермальной активности, что значительно расширило представления о биологии серобактерий в галофильных сообществах. Установлено, что серобактерии, такие как Beggiatoa, ТЫор1оса, ТЫотащаг'Иа, содержащие вакуоли, в которых накапливаются нитраты в высокой концентрации, и выполняющие роль терминального акцептора электронов, часто являются инициаторами существенной доли общей морской нитратредукции. В связи с этим бактерии этих родов оказались важным связующим звеном между циклами серы, азота и углерода.

Особый интерес представляют маты, в которых доминируют бесцветные серобактерии (Beggiatoa, ТИюрЬса, «Ткюс1епс1гоп»). Бактериальные маты характеризуются высокой продуктивностью, широким распространением в водных экосистемах и являются эффективным биогеохимическим фильтром в превращении и преобразовании соединений углерода, серы и азота.

Таксономический состав группы бесцветных серобактерий слабо изучен из-за трудности выделения и поддержания чистых культур. Большинство так называемых «морфологических видов», известных по наблюдениям за природными популяциями, не удалось выделить в чистую культуру. Применение современных методов молекулярной биологии показало, что представители бесцветных серобактерий относятся к различным таксономическим и филогенетическим группам. Филогенетическое положение для ряда представителей серобактерий до сих пор не определено из-за отсутствия чистых культур, хотя для некоторых серобактерий из природных популяций был проведен филогенетический анализ с применением флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) и анализа последовательности 16S рРНК.

Несмотря на пристальное внимание к этим микроорганизмам и их геохимической деятельности, количественных данных, отражающих роль № бесцветных серобактерий в круговороте веществ в природе, недостаточно.

Необходимо изучение метаболизма новых изолятов для понимания их функциональной роли в микробиальных сообществах. В настоящее время существует ограниченное количество доступных данных по метаболическому разнообразию бесцветных серобактерий. У подавляющего большинства серобактерий не известны пути метаболизма углерода и серы, не изучены механизхмы регуляции метаболических путей в быстро меняющихся градиентных условиях.

Поскольку бесцветные серобактерии обитают в неравновесных условиях среды, то выявление факторов внешней среды, оказывающих воздействие на их ферментативные функции, является абсолютно необходимым и будет спосооствовать выявлению «уязвимых» мест в метаоолизме клетки, а также позволит понять стратегию их биохимической адаптации к условиям внешней среды.

Большинство бесцветных серобактерий являются микроаэрофилами, чем и объясняется специфика их экониши и трудности с выделением чистых культур. Однако практически отсутствуют сведения о механизмах регуляции клеточного обмена веществ у бесцветных серобактерий при смене кислородного режима среды, также не изучены реакции стресс-лимитирующей антиоксидантной системы бактерий на процессы образования активных форм кислорода (АФК).

Надо отметить, что в целом группа бесцветных серобактерий остается весьма мало изученной.

Состояние вопроса. Среди микроорганизмов, участвующих в окислении неорганических соединений серы, особую группу составляют так называемые бесцветные серобактерии. Они включают представителей разных физиологических, таксономических и филогенетических групп. Единственным общим признаком, объединяющим«их, является способность откладывать внутри клеток элементную серу.

Многие бесцветные серобактерии с давнего времени привлекают внимание исследователей благодаря? массовому развитию- в природе в определенных условиях, где они доминируют в отдельных сообществах, особенностям физиологии, гигантским размерам, своеобразной морфологии клеток. Достаточно вспомнить, что именно с изучением; бесцветных серобактерий! Ве^аЮа и ТМоШгис в конце XIX века связано создание С.Н. Виноградским концепции; хемолитоавтотрофии. Однако роль соединений серы в метаболизме бесцветных серобактерий до конца; не ясна. Высказывается две точки зрения: восстановленные соединения серы могут выполнять роль доноров электронов для энергетического метаболизма, а также они могут участвовать в детоксикации-АФК.

Изучение таксономии, филогении! представителей этой группы затруднено из-за сложности их культивирования; хотя существенный? вклад в изучение филогении' некультивируемых на сегодня серобактерий" позволили внести; современные молекулярно-биологические и молекулярно-экологические методы при исследовании природных сообществ. На основании морфологических признаков бесцветные серобактерии традиционно подразделяют на две группы — одноклеточные и нитчатые. Из известных по морфологическим описаниям; более чем 60 видов в настоящее время; удалось выделить чистые культуры всего лишь несколько видов нитчатых и одноклеточных серобактерий. Детальное физиологическое исследование выделенных штаммов показало, что представители! этой группы % существенно различаются« по типу энергетического) и конструктивного метаболизма и по роли; серных соединений в их жизнедеятельности.

На основании имеющихся данных предполагается возможность следующих путей использования неорганических соединений серы бесцветными серобактериями в процессах, не связанных с ассимиляцией в конструктивном обмене.

1. Использование восстановленных форм серы в качестве доноров электронов либо для фиксации углекислоты у хемолитоавтотрофов, либо для ассимиляции органических веществ при хемолитогетеротрофном росте. В физиологическом плане известные виды серобактерий изучены слабо. Такие бактерии, как Ahromatium, Thiovulum, Thioploca и Thiomargarita, не получены в чистых культурах. Однако исследования, проведенные с природными 14 популяциями, показали способность этих организмов к литотрофному росту [112;

121; 170; 226; 315; 346; 364]. Удалось показать, что пресноводные бактерии рода ThiothrLx [37; 150; 192; 214; 268] и морские штаммы Beggiatoa способны осуществлять наряду с органогетеротрофным, также литогетеротрофный, миксотрофный и хемоавтотрофный метаболизм [151; 255; 256; 260]. Особенности метаболизма пресноводных представителей Beggiatoa изучены слабо. Для них не показана способность к литотрофному росту, хотя высказывается предположение о их способности к миксотрофному росту [ 151; 314].

Выявлена важная роль бесцветных серобактерий как хемолитоавтотрофных первичных продуцентов в сообществах гидротерм [150; 262]. В последнее время проблеме изучения функциональной роли бесцветных серобактерий в водных ^ экосистемах уделяется значительное внимание. Было показано участие нитчатых серобактерий родов ThiothrLx и Beggiatoa в продукции органического вещества за счет хемосинтеза в морских водоемах [119]. В районах проявления гидротермальной активности в океане установлено участие представителей рода Thiothrix во взаимодействиях с высшими звеньями трофической цепи, в частности, с креветками [62; 142], а также Beggiatoa - в продукции органического вещества в районах гидротермальной активности за счет хемосинтеза [106; 162; 212; 236; 254; 256].

Метаболизм таких одноклеточных серобактерий, как Macromonas, Thiovulum, Achromatium, Thiospira, Thiobacterium остается малоизученным. к }

2. Использование соединений серы для детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода. Для всех выделенных к настоящему времени пресноводных штаммов Beggiatoa, включая типовой штамм В. а1Ьа, а также одноклеточных серобактерий - \iacromonas Ырипс(Ша, ТЫохр'гга5рр. не удалось показать способность к использованию серных соединений в энергетическом метаболизме. В то же время для ряда представителей ТИШИг'их и В姧шЮа, а также для Мае го то паз Ырипс(а(а, Т1гю$р1га Брр. предполагается перекисный механизм окисления соединений серы [14; 15; 34; 37; 66; 95; 259; 263]: сероводород используется бактериями для удаления токсичного продукта метаболизма -пероксида водорода и супероксидного аниона, что сопровождается накоплением элементной серы в клетках. В связи с этим необходимы дополнительные исследования функциональной роли соединений серы.

Способность к автотрофному росту для многочисленных пресноводных штаммов Ве%£1(Иоа до сих пор не удалось доказать, несмотря на предпринимаемые исследователями попытки [151; 263].

3. Наряду с окислением восстановленных соединений серы, у Ве^'шШа обнаружен обратный процесс — редукция внутриклеточной серы до Н^.

Имеются данные об использовании серобактериями соединений серы в качестве акцепторов электронов при анаэробном дыхании [112; 162; 259; 263; 265]. Для некоторых серобактерий, содержащих вакуоль, в которой аккумулируются нитраты, показана способность к анаэрооному дыханию и использованию последних в качестве терминального акцептора электронов.

Таким образом, можно заключить, что большинство серобактерий, в частности Beggiatoa, ТИШкгЬс, ТИшрЬса, ТЫотаг^агЫа, ТИюуиШт, АсНготаНит обладают высокой физиологической приспособленностью к условиям среды и могут изменять характер метаболизма в зависимости от условий среды обитания. Знание ответных биохимических реакций бесцветных серобактерий на воздействие стрессорных факторов, возникающих в условиях их экотопов и способствующих функционированию или переживанию в гетерогенных условиях среды, позволит выявить механизмы устойчивости бесцветных серобактерий к существованию в К неравновесных природных системах. Изучение множественных метаоолических путей, обеспечивающих адаптацию серобактерий в неравновесных условиях среды, имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования микроорганизма, как целостной системы и благодаря этому создает условия для понимания господствующего положения серобактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах серы, углерода, азота.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы явилась оценка биоразнообразия пресноводных представителей бесцветных серобактерий в отношении таксономического состава, метаболизма и путей его регуляции.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав и филогенетическое положение представителей пресноводных бесцветных серобактерий.

2. Выявить функциональную роль восстановленных соединений серы и механизмы их окисления в метаболизме различных представителей серобактерий.

3. Исследовать серный, углеродный метаболизм и биохимические механизмы их регуляции у различных представителей серобактерий.

4. Выявить специфические причины микроаэрофилии у различных физиологических групп бесцветных серобактерий (миксотрофных, литоавтотрофных и облигатно гетеротрофных представителей).

5. Определить роль кислорода в регуляции метаболизма аэротолерантных спирохет - основного компонента бактериальных серных матов «ТМос1епс1гопу>.

Научная новизна и значимость работы

Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биоразнообразии бесцветных серобактерий. Показано, что группа пресноводных бесцветных серобактерий гетерогенна по составу. Анализ последовательности 16Б рРНК позволил отнести все изученные пресноводные серобактерии к альфа-, бета-, гамма - классам филума

Proteobacteria. Изучен таксономический состав и филогенетическое положение серных спирилл, а также пресноводных штаммов Beggiatoa, Macromonas. Согласно опубликованным ранее данным [76; 125; 334] и полученнььм нами результатам на основе изучения штаммов серных спирилл была проведена реклассификация некоторых видов рода Aquaspirillum. Мы предлагаем оставить в составе рода Aquaspirillum вид A. bipunctata sp. nov. вместе с типовым и единственным видом A. serpens, который, согласно филогенетическому анализу, группируется с A. bipunctata.

Бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер, включающий виды [Aquaspirillum] voronezhense, [Aquaspirillum] kuznetsovii, [Aquaspirillum] giesbergeri, [Aquaspirillum] sinuosum, [Aquaspirillum] anulus, предложено классифицировать как представителей нового рода Giesbergeria gen.nov. - Giesbergeria voronezhense sp. nov. (типовой вид), Giesbergeria kuznetsovii sp. nov., Giesbergeria giesbergeri comb, nov., Giesbergeria sinuosa comb, nov., Giesbergeria anula comb, nov., соответственно; бактерии филогенетического спектра видов [Aquaspirillum] metamorphum, [Aquaspirillum] psychrophillum - как Simplispira metamorpha comb.nov. (типовой вид) и Simplispira psychrophilla comb.nov., соответственно; бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер подвидов [Aquaspirillum] itersonii: [Aquaspirillum] itersonii subsp. itersonii, [Aquaspirillum] itersonii subsp. niponicum - как Denitrospira itersonii comb, nov.: Denitrospira itersonii subsp. itersonii comb, nov., Denitrospira itersonii subsp. niponicum comb, nov., соответственно.

Расширены границы рода Spirillum, который ранее включал единственный вид - S. volutans; в его состав включены серные спириллы, отнесенные к двум новым видам рода Spirillum: Spirillum winograclskii sp. nov. и Spirillum kriegii sp. nov.

Было установлено, что штаммы серных спирилл, способные накапливать S° внутриклеточно в присутствии сульфида, согласно полифазному анализу относятся к разным таксонам Betaproteobacteria (роды Aquaspirillum, Giesbergeria, Simplispira, Comamonas и Spirillum) и Alphaproteobacteria (Denitrospira).

Полученные нами данные не оставляют оснований для сохранения этих бактерий в составе рода ТЫоьрка.

На базе уникальной коллекции бесцветных серобактерий, которая представлена бактериями, выделенными нами (19 штаммов) и любезно предоставленными коллегами из коллекци уникальных микроорганизмов ИНМИ РАН (Россия), ЭБМг (Германия), С1Р (Франция) (18 штаммов) было показано, что бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются по функциональной роли и механизму окисления восстановленных соединений серы: литотрофные серобактерии используют восстановленные соединения серы в качестве энергетического субстрата, а облигатные органотрофы используют соединения серы для снятия токсического эффекта, оказываемого продуктами неполного восстановления кислорода на их метаболизм. Было выявлено, что у гетеротрофных бесцветных серобактерий в ответ на образование АФК возникает консолидированный адаптивный ответ, включающий увеличение активности антиоксидантных ферментов, метаболитной антиокислительной активности, индукцию анаплеротических последовательностей, а также синтез экзополисахаридов (ЭПС).

Выявлено, что у факультативно литотрофных бесцветных серобактерий регуляция метаболизма может инициироваться различными факторами внешней среды (кислородом, органическими соединениями, неорганическими донорами электронов). При этом может меняться метаболическая активность, а также тип питания. Впервые показано, что регуляция и переключение метаболических функций у некоторых факультативных литогетеротрофных серобактерий может осуществляться за счет структурно-функциональной перестройки малатдегидрогеназной системы, перераспределения потока восстановительных эквивалентов и изменения состава электронтранспортной цепи (ЭТЦ).

Расширены представления о причинах микроаэрофилии и аэротолерантности бактерий. Установлено, что приуроченность к росту в микроаэробных условиях может быть обусловлена чувствительностью ферментов углеродного и серного диссимиляционного окислительного метаболизма к концентрации кислорода, АФК, а также потребностью факультативно литогетеротрофных серобактерий в дополнительных донорах электронов по причине низкой активности дегидрогеназ, поставляющих восстановительные эквиваленты в ЭТЦ.

Аэротолерантность спирохет из симбиотической ассоциации «Thiodendron», осуществляющих анаэробный тип метаболизма, обусловлена наличием альтернативных ферментных систем, позволяющих им извлекать энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы. Практическая значимость

Результаты исследований расширяют фундаментальные знания о разнообразии бесцветных серобактерий и о физиолого-биохимических механизмах IА регуляции их метаболизма; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в природных сообществах, в продукционных и деструкционных процессах и вкладе в круговорот углерода и серы в природе.

Создана уникальная коллекция новых бесцветных серобактерий, некоторые из которых можно использовать для очистки водных экосистем от токсичных соединений серы.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1. Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды», Томск, 1995.

2. Международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», Москва, МГУ, 2000.

3. Научной конференции «Водные экосистемы и организмы», Москва, МГУ,2001.

4. 1st FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003.

5. Ill съезде биофизиков России, Воронеж, 2004.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, описание объектов и методов исследований, изложение ^ экспериментов с обсуждением и заключением, общее заключение), основных

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Грабович, Маргарита Юрьевна

Выводы

1. В филогенетическом отношении пресноводные бесцветные серобактерии гетерогенны и принадлежат к альфа-, бета- и гамма- классам филума Proteobacteria.

2. Ревизия таксономического состава серных спирилл показала, что они являются представителями различных родов филума Proteodacteria: Aquaspirillum, Giesbergeria gen. nov., Comamonas, Simplispira gen. nov., Denitrospira gen. nov., Spirillum.

3. На основе филогенетических исследований проведена реклассификация видов рода Aquaspirillum. Из описанных ранее серных спирилл вид A. bipunctata sp. nov. оставлен вместе с типовым и единственным видом A. serpens в составе рода Aquaspirillum. Виды [Aquaspirillum] metamorphum, [Aquaspirillum] psychrophilum объединены - в составе нового рода Simplispira gen. nov., как виды S. metamorpha comb. nov.T, S. psychrophila comb, nov.; вид [,Aquaspirillum] itersonii включен в состав нового рода Denitrospira gen. nov., как вид D. itersonii comb. nov.T; серные спириллы [Aquaspirillum] voronezhense, а также [Aquaspirillum] anulus, [Aquaspirillum] giesbergeri и [Aquaspirillum] sinuosum включены в состав нового рода Giesbergeria gen. nov., как виды G. voronezhense sp. nov., G. anula comb, nov., G. giesbergeri comb, nov., G. sinuosa comb. nov.

4. Показана функциональная роль восстановленных соединений серы у бесцветных серобактерий, позволившая разделить их на две физиологические группы: первая объединяет литотрофные бесцветные серобактерии, у которых восстановленные соединения серы выполняют роль доноров электронов в энергетическом метаболизме; вторая группа объединяет облигатных гетеротрофов, у которых серные соединения выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода.

5. Регуляция метаболизма у факультативно литотрофных бесцветных серобактерий может инициироваться различными факторами внешней среды (кислородом, органическими соединениями, неорганическими донорами электронов). На биохимическом уровне она проявляется в структурно-функциональных изменениях основного регуляторного фермента углеродного метаболизма — малатдегидрогеназы, качественного и количественного состава цитохромов электронтранспортной цепи, активности ферментов окислительного метаболизма серы и углерода (цикл Кальвина, ЦТК и глиоксилатный цикл).

6. Микроаэрофилия различных физиологических групп бесцветных серобактерий обусловлена влиянием активных форм кислорода на различные стороны их конструктивного и энергетического метаболизма: у литоавтотрофов микроаэрофилия обусловлена в первую очередь чувствительностью рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы и в меньшей степени ферментов диссимиляционного серного окислительного метаболизма; у облигатных гетеротрофов - высокой чувствительностью ферментов, содержащих 8Н-группы и [4Ре-48]2+ кластеры.

7. Аэротолерантность анаэробных спирохет из симбиотической ассоциации «ТЫо(1епс1гопу>, обусловлена наличием у них ряда адаптационных механизмов, позволяющих не только избегать негативное влияние кислорода, но и получать энергетическую выгоду от его вовлечения в метаболические процессы за счет использования укороченного пути метаболизма глюкозы, образования более окисленных продуктов по сравнению с анаэробным ростом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что группа пресноводных бесцветных серобактерий гетерогенна по составу. Анализ последовательности 16S рРНК позволил отнесены все изученные серобактерии к альфа-, бета-, гамма- классам филума Proteobacteria.

Было установлено, что штаммы серных спирилл, способные накапливать S° внутриклеточно в присутствии сульфида, согласно полифазному анализу относятся к разным таксонам Betaproteobacteria (роды Aquaspirillum, Giesbergeria, Simplispira, Comamonas и Spirillum) и Alphaproteobacteria (Denitrospira). Несмотря на это, род Thiospira рекомендуем оставить из соображения, что возможно в будущем вновь выделенные штаммы серных спирилл будут отнесены к этому роду.

Согласно полученным результатам, которые согласуются с ранее высказанными предположениями [76; 125; 335] о том, что род Aquaspirillum подлежит ревизии, нами была проведена реклассификация некоторых видов рода Aquaspirillum. Мы предлагаем оставить в составе рода Aquaspirillum штаммы А. serpens и A. bipunctata sp. nov., который согласно филогенетическому анализу, группируется с A. serpens.

Значительным изменениям подверглось семейство Comamonadaceae, которое пополнилось тремя новыми родами: Macromonas, Giesbergeria и Simplispira. Представители двух последних родов ранее относили к роду Aquaspirillum. Бактерии филогенетического спектра видов [Aquaspirillum] itersonii предложено классифицировать как представителей нового рода Denitrospira itersonii comb, nov.

Расширены границы рода Spirillum, который ранее включал единственный вид - S. volutans; в его состав включены серные спириллы, отнесенные к двум новым видам рода Spirillum'. Spirillum winogradskii sp. nov. и Spirillum kriegii sp. nov.

Расширены филогенетические границы пресноводных Beggiatoa '. их состав пополнился новым видом Beggiatoa leptomitiformis.

Для бесцветных серобактерий характерно развитие в специфических экологических нишах - в микрозоне градиента Н28/02. Обитая в неравновесных условиях, бесцветные серобактерии постоянно находятся или в состоянии окислительного стресса, или их рост лимитируется наличием различных питательных веществ, а чаще они испытывают воздействие нескольких факторов. Поэтому для выживания в быстро меняющихся условиях среды бактерии должны обладать лабильным типом метаболизма и совершенными механизмами его регуляции. Для большинства литотрофных бесцветных серобактерий, способных использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов, показано большое разнообразие типов энергетического и конструктивного метаболизма. Такая приспособленность обеспечивает бесцветным серобактериям преимущество перед облигатными литоавтотрофами и гетеротрофами, так как они способны использовать более широкий спектр субстратов, что обусловливает их выживаемость и доминирование в сероводородных биотопах. Нам удалось показать некоторые механизмы, лежащие в основе переключения метаболических путей при смене условий роста.

При исследовании серного и углеродного метаболизма представителей пресноводных Ве^акю впервые на примере штамма В. 1ерк)тШ/огт1я Д - 402 показана их способность к органотрофному, а также к авто-, лито- и миксотрофному росту. Установлено, что основными факторами, определяющими тип метаболизма в присутствии восстановленных соединений серы, являются концентрация кислорода и наличие органических веществ.

Переход от органотрофного роста к миксотрофному у штамма Д - 402 сопровождается существенной перестройкой углеродного метаболизма за счет изменения ферментативной активности основных метаболических путей - цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла, что приводит к перераспределению их роли в анаболических и катаболических процессах. В присутствии неорганических доноров электронов - восстановленных соединений серы снижается роль ЦТК в энергетическом метаболизме, но возрастает роль в конструктивном метаболизме глиоксилатного цикла, который и поставляет интермедиаты для биосинтетических целей.

Регуляция и переключение метаболических функций у пресноводного штамма В. 1ер1отШ/огт1з Д - 402 осуществляется за счет структурно-функциональной перестройки малатдегидрогеназной системы, ключевого фермента углеродного метаболизхма: в условиях литотрофного роста функционирование глиоксилатного цикла обеспечивает тетрамерная форма фермента, участвующая в процессах конструктивного метаболизма, а переход к органотрофии сопровождается появлением димерной формы, которая участвует в энергетическом метаболизме, обеспечивая функционирование ЦТК (рис. 28).

Недавно подобный механизм регуляции доли вклада ЦТК и глиоксилатного цикла в процессы конструктивного и энергетического метаболизма при переходе бактерий от органотрофного роста к миксотрофному был показан и для другого вида серобактерий - ЬеисоОигис тисог [41].

Можно предположить, что такой механизм, принимающий участие в гомеостазе адаптивных реакций в условиях доступности энергетических субстратов разной природы, является довольно распространенным среди серобактерий.

Большое значение для адаптации бактерий к изменению условий среды имеет также скорость перехода от органотрофного к миксотрофному росту, которая зависит от концентрации лимитирующих литотрофный рост запасов тиосульфата. При недостатке тиосульфата увеличивается соотношение димера к тетрамеру МДГ, что находит свое отражение в увеличении вклада органического субстратов в энергетический метаболизм. При дополнительном внесении тиосульфата в среду бактерии быстро, в течение 1-2 часов, снова переходят от органотрофного к миксотрофному росту.

Пресноводный штамм В. 1ерктгШ/огт/.? Д-402 способен также переходить от миксотрофного роста к литотрофному. В этом случае переход определяется степенью загруженности I комплекса ЭТЦ восстановительными эквивалентами, поступающими от органических веществ. В конечном счете этот переход зависит от уменьшения соотношения концентрации органических веществ к неорганическим восстановленным соединениям серы в среде культивирования серобактерии.

У В. 1еркшШ/огт'1х Д-402 автотрофный рост при окислении тиосульфата возможен только в строго микроаэробных условиях в диапазоне концентраций кислорода, не превышающих 3-16 мкМ при условии отсутствия органического субстрата. Увеличение содержания 02 в среде выше 20 мкМ приводило к прекращению роста бактерий вследствие подавления карбоксилазной функции РБФК.

Следует отметить, что концентрация кислорода влияет не только на активность РБФК, но также и на состав цитохромов ЭТЦ и активность ферментов окислительного (диссимиляционного) метаболизма серы. Нами впервые было показано, что только при органотрофном росте В. ¡еркшШ/огт'м в аэробных условиях функционирует оксидаза яа^-типа, а в микроаэробных условиях при литотрофном росте у В. 1ерЮтШ/огт1з Д-402 происходит индукция синтеза другой терминальной оксидазы сЬЬутипа. Последняя обладает на порядок более высоким сродством к 02, чем оксидаза аа3-типа, и ее индукция у микроорганизмов обычно вызывается низким содержанием 02 в окружающей среде.

У В. крЮтШ/огт'м Д-402 ферменты, принимающие участие в превращении восстановленных соединений серы, являются конститутивными, поскольку их активность определяется как при органотрофном так и при литотрофном росте. Активность этих ферментов при наличии соединений серы увеличивается в несколько раз по сравнению с органотрофным ростом, а также в микроаэробных условиях роста по сравнению с аэробными.

Другая исследуемая группа бесцветных серобактерий включала 3 вида скользящих нитчатых бактерий рода ЬгисойжЬс. тисог, I,. гЬюрЫЬ и Ьеисо1ИгЬс Бр. До недавнего времени они не были включены в группу бесцветных серобактерий. Был известен всего один вид этого рода - I. тисог. Нами бы по показано, что эпифитный штамм этого вида способен к литотрофному росту, а два других новых вида, выделенные Дульцевой Н.М., тоже способны использовать серные соединения в энергетическом метаболизме. Представители этой группы, как и Ве^'шЮщ характеризуются большим разнообразием метаболических возможностей. Интересно отметить, что ¿. тисог - известный "полифаг", как его назвал Брок [92], использует большой спектр органических веществ от углеводородов до белков и углеводов и др. мономеров. Высокий гетеротрофный потенциал позволяет ему расти в самых разных экосистемах в виде обрастаний. Он широко распространен в морских местообитаниях, районах гидротермальной активности, стоячих водах, марикультурах. Два других вида выделенны из обрастаний на подвижной растительности сублиторали Белого моря - из высокопродуктивных зон с нестабильным H2S - 02 режимом. Полученные результаты позволяют заключить, что виды в разной степени зависимы от концентрации органического вещества и различаются заметно по метаболизму (активности ферментов). Сравнительное изучение углеродного метаболизма привело к следующим выводам:

Сравнение показало существенные различия в активности ферментных систем ЦТК и глиоксилатнош цикла у разных видов L. thiophila и Leucothrix sp. (в пределах кластеров), но не штаммов. Также была показана чрезвычайно низкая активность дегидрогеназ, которая на порядок ниже по сравнению с типовым видом L. тисог, обладающим высоким гетеротрофным потенциалом, и типичными гетеротрофными бактериями Е. coli. В определенной степени низкая активность дегидрогеназ и ферментов UTK в целом предопределяет их (L. thiophila и Leucothrix sp.) практически облигатную зависимость от неорганических доноров электронов - серных соединений. Эти организмы очень слабо растут органотрофно, нуждаясь в пополнении пула восстановителей и электронов для ЭТЦ.

У L. тисог - индукция ферментов серного метаболизма происходит только при лимитации роста органическим веществом в отличие от других видов (L. thiophila и Leucothrix sp.), которые в широком диапозоне концентраций органических веществ не могут их использовать в достаточной для роста степени. Они зависят в большой степени от дополнительного источника энергии в виде восстановленных соединений серы. Переход от литотрофного типа питания к органотрофному сопровождается изменением состава ЭТЦ. При росте L. тисог на среде с низким содержанием триптона, в присутствии тиосульфата в мембранных фракциях, в отличие от органотрофного роста, нам не удалось обнаружить мембранносвязанных цитохромов с. Эти данные позволяют предположить, что при литотрофном росте у L. тисог DSM 2157 в составе ЭТЦ функционируют только цитохромы а и b типов.

При сравнительном анализе ферментативной активности в ЦТК и в глиоксилатном

Т цикле при различном типе питания выявлены закономерности, обнаруженные у

Ве^'шЮа, т.е. при миксотрофном росте происходит снижение роли ЦТК и увеличение активности ферментов глиоксилатного цикла при переходе ог органотрофии к миксотрофии. Кроме того, в последнее время удалось обнаружить появление тетрамерной формы МДГ у ¿. тисог при миксотрофном росте, так же, как и у Beggiatoa штамм Д-402 [41].

Таким образом, адаптация к изменению ростовых условий обеспечивается у Ьеисо1/гг1х, как и у Beggiatoa структурной и функциональной перестройкой ключевого фермента углеродного метаболизма - МДГ и последующими шменениями в активности ферментных систем и перераспределением потоков восстановительных Л: эквивалентов. Принципиально сходные с В. крЮтШ/оптя и бактериями рода

ЬеисойггЬс механизмы регуляции метаболизма при смене условий роста обнаружены и у других нитчатых серобактерий ТЫо1кгЪс агсЮркИа. Это позволяет сделать вывод об универсальном, или по крайней мере, широко распространенном проявлении подобного характера регуляции и адаптационных изменении в метаболизме у бактерий с вариабельным типом метаболизма

Другая фуппа бесцветных серобактерий - гетеротрофные одноклеточные и нитчатые серобактерии, в отличие от представителей сероокисляющих литотрофов не способны использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов в энергетическом метаболизме. Они отличаются от литотрофов по функциональной роли соединений серы, а также по механизму и конечным ** продуктам их окисления: сульфид окисляется только до элементной серы, а тиосульфат - до тетратионата. С использованием ингибиторного анализа было показано, что эти окислительные процессы не связаны с запасанием энергии в виде АТФ, а добавление органического субстрата стимулирует процесс окисления серных соединений.

Надо заметить, что среди облигатно гетеротрофных бактерий, способных окислять тиосульфат до тетратионата, известна целая группа грамотрицательных облигатных гетеротрофов [341; 342; 343; 344; 345], которые, в отличие от гетеротрофных бесцветных серобактерий, обладают потенциальной способностью использования дополнительной энергии в результате окисления ряда серных соединений при лимитации среды питательными субстратами органической t природы [59; 60; 235; 271]. Окисление тиосульфата у этой группы бактерий по сравнению с гетеротрофными серобактериями характеризуется более высокой скоростью, которая в присутствии ацетата снижается.

Об отсутствии потенциальной способности к автотрофии у исследованных нами гетеротрофных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д- 401, В. alba DSM 1416, Macromonas bipunctata Д-405, Spirillum kriegii, S. winogradskii, свидетельствуют и отрицательные результаты молекулярно-генетических исследований на наличие гена РБФК [58]. Нельзя, однако, исключать возможность обнаружения новых видов, обладающих способностью к лито- и автотрофии в составе известных родов гетеротрофных серобактерий.

Одноклеточные и нитчатые гетеротрофные серобактерии характеризуются способностью к использованию ограниченного числа мономерных органических соединений (органических кислот, спиртов, некоторых аминокислот, реже -Сахаров), которые преимущественно метаболизируются через ЦТК.

У бесцветных серобактерий ЦТК на уровне гидратаз уязвим к действию АФК. Сбои в работе ЦТК могут индуцировать генерацию активных форм кислорода в электронтранспортной цепи: снижается скорость потребления кислорода и как следствие - возрастает степень восстановленности начального участка ЭТЦ (флавинов, убихинона и негемовых железопротеинов); в результате увеличиваются концентрации «паразитарных» реакций одноэлектронного восстановления, а следовательно увеличивается скорость образования супероксидного аниона и продуктов его превращения.

Таким образом, можно заключить, что метаболическая активность серобактерий при окислительном стрессе во многом будет зависеть от присутствия в среде восстановителей, необходимых для удаления АФК и повышающих антиокислительную активность, а также будет зависеть от эффективной работы анаплеротических путей превращения интермедиатов ЦТК, обеспечивающих бесперебойную работу энергетических и биосинтетических систем (рис.59).

Изучение метаболизма облигатно гетеротрофных серобактерий позволило выяснить ряд причин, объясняющих стимулирующее влияние восстановленных Г"' соединений серы на рост гетеротрофных бесцветных серобактерий.

Так, показано, что для гетеротрофных серобактерий характерно внутриклеточное накопление Н2О2, вызванное высокой скоростью синтеза пероксида водорода в ЭТЦ, диспропорцией в активности ферментов, участвующих в синтезе Нг02 (СОД) и его детоксикации с участием каталазы, а также пространственной разобщенностью локализации Н2О2 (периплазма) и ряда ферментных систем, участвующих в его удалении (цитоплазма). Поэтому в присутствии НгЗ происходит удаление токсических соединений Н202 и Ог при их взаимодействии с накаплением Б0 в периплазме.

Положительное влияние восстановленных соединений серы, связанное с удалением АФК, проявляется и в снятии их ингибирующего действия на гидратазы (фумаратгидратаза и аконитатгидратаза), что приводит к увеличению активности ферментов, вследствие удаления АФК при их взаимодействии с сульфидом. Известно, что способность супероксидного аниона инактивировать гидратазы (аконитатгидратазу, фумаратгидратазу) основана на том, что многие упомянутые выше гидратазы содержат [4Ре-48]2+ кластеры, которые в присутствии АФК окисляются до нестабильного [4Ре-48]3+ состояния и спонтанно превращаются в [ЗРе-48]+, теряя одни из атомов Ие из каталитического центра. Вследствии этого, фермент инактивируется, метаболический путь, который он обеспечивает, становиться невозможным или процесс резко тормозится.

Помимо этого, у серобактерий активность АГ чувствительна к дефициту Бе (II). Присутствие в среде НгБ стабилизирует двухвалентное железо, которое в этих условиях преимущественно содержится в форме РеБ.

Положительное влияние восстановленных соединений серы отражается при оценке ростовых характеристик - максимального клеточного урожая и эффективности использования ростового субстрата. Первое обусловлено предотвращением прямого литического действия Н202 и кислородных радикалов на клеточные структуры, а также стабилизацией некоторых ферментативных реакций и метаболических процессов, а второе - снижением затрат на ассимиляционные процессы, не связанные с ростом. К такому процессу относится чрезвычайно энергоемкий процесс синтеза экзополисахаридов (ЭПС), как способ защиты от действия избыточного кислорода.

Для гетеротрофных серобактерий также показано, что восстановленные соединения серы способны регулировать пул внутриклеточных метаболитов, содержащих БН-группу, обладающих кислородсвязывающей метаболитной активностью. Такой адаптационный механизм на уровне метаболитов позволяет серобактериям частично нейтрализовать АФК.

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что облигатно гетеротрофные серобактерии способны противостоять действию АФК, благодаря адаптационным механизмам клетки.

В результате проведенных исследований нами было показано, что при внешнем физиологическом сходстве гетеротрофных серобактерий с литотрофами в потребности для роста восстановленных форм серы и накоплении в клетках Б", последние выполняют принципиально различную функциональную роль в метаболизме у этих двух групп серобактерий.

Другой важный вопрос, который мы постарались рассмотреть, это причины обуславливающие микроаэрофилию и аэротолерантность бесцветных серобактерий. Микроаэрофилия лито- и гетеротрофных серобактерий, также как их способность к окислению соединений серы, обусловлены различными физиологическими причинами. Если у большинства литотрофов она диктуется потребностью в одновременном присутствии доноров и акцепторов электронов (Б2" и СЬ) и достигается путем физиологической адаптации бактерий к специфическим условиям среды для обеспечения ростовых субстратов, то у гетеротрофных серобактерий микроаэрофилия является вынужденной мерой, или стратегией, позволяющей избежать окислительный стресс, который они испытывают в аэрируемых слоях воды в отсутствие внешних детоксикантов.

Особый интерес представляют анаэробные гетеротрофы аэротолерантные к кислороду. У них в отличие от аэробных гетеротрофов существуют адаптационные механизмы, позволяющие не только избегать негативное влияние кислорода, но и извлекать пользу, а именно получать энергетическую выгоду от его вовлечения в метаболические процессы, подобно тому, как поступили микроорганизмы, осуществив эволюционный скачок при переходе от анаэробного к аэробному типу метаболизма.

Наиболее выражен этот тип стратегии адаптации к кислороду у аэротолерантных сероокисляющих спирохет, выделенных из серных матов «ТИ'юс1епс1гопу>, где спирохеты доминируют.

Оптимальными для роста и окисления Н2Б являются микроаэробные условия с содержанием не более 8-25 мкМ 02 в 1л среды при условии наличия восстановленных соединении серы [13; 112]. Оказалось, что при микроаэробном культивировании спирохеты используют альтернативный путь метаболизма глюкозы (рис.62). Катаболические реакции превращения пирувата, продукта гликолиза, осуществляются по укороченному пути с образованием более окисленных конечных продуктов, главным образом, ацетата и С02, в отличие от метаболитов строго анаэробного разложения глюкозы - этанола, формиата, Н2 и пирувата (рис. 62). В аэробных условиях наблюдается двухкратное увеличение эффективности использования глюкозы и клеточного урожая.

Вовлечение кислорода в метаболические процессы осуществляются с участием НАДН-оксидазы. Последняя выполняет в клетках спирохет двоякую функцию. Во-первых, она катализирует реакцию окисления НАДН кислородом с образованием НАД, который необходим для пополнения его пула в клетке для функционирования гликолиза. Вторая, защитная функция этого фермента состоит в удалении избыточных концентраций 02 в клетках, неизбежно возникающих в условиях нестабильности кислородного режима роста, и, как следствие, приводит к синтезу Н202. В клетках спирохет с участием НАДН-оксидазы и СОД Н202 образуется с очень высокой скоростью.

Частично разрушение пероксида водорода в клетках осуществляется с участием другого фермента, НАДН-пероксидазы. Однако полного разрушения Н202 не происходит в клетках, что приводит к очень быстрому лизису клеточных структур, в течение нескольких минут экспозции на воздухе. Преодоление окислительного стресса, вызываемого избытком Н202, достигается совокупным действием двух основных факторов. Во-первых, Н202 не оказывает токсическое действие на клетки спирохет в присутствии восстановленных соединений серы в среде в результате их химического взаимодействия. Процесс неферментативного удаления Н202 в присутствии Н25 сопровождается образованием и накоплением внутриклеточной элементной серы. Именно процесс удаления Н2О2 определяет облигатный характер зависимости роста спирохет в микробных условиях от наличия в среде восстановленных серных соединений. Надо отметить, что аэротолерантные спирохеты в природе в условиях мата «ТЫойеп&оп» приспособились получать дополнительную порцию Н28 за счет создания синтрофной ассоциации с сероредуцирующими бактериями родов ОеэифоЬа^ег и ОеМоБифтЪгю [13; 61]. Оба компонента такой системы получают взаимную выгоду: сероредукторы -используют продукты метаболизма глюкозы - ацетат и пируват, спирохеты -дополнительное постоянное снабжение сероводородом в микроаэробной среде.

Другой приспособительный механизм, широко распространенный у микроаэрофильных серобактерий, аэротолерантные спирохеты используют для уменьшения скорости диффузии 02 внутрь клетки и, как следствие, внутриклеточно снижается скорость синтеза и концентрация Н202. Этот эффект достигается за счет синтеза ЭПС. Хотя для синтеза ЭПС затрачивается дополнительная энергия и расходуются питательные субстраты, эффективность использования глюкозы в аэробных по сравнению с анаэробными условиями в два раза выше.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Грабович, Маргарита Юрьевна, Воронеж

1. Бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются по функциональной роли восстановленных соединений серы в их метаболизме. исследований проведена ревизия представителей рода Aquaspirillum, к которому ранее были отнесены все

2. Представители бесцветных серобактерий обладают широким спектром и биохимических адаптационных механизмов, позволяющих им выживать средах. доминировать в нестабильных условиях кислородного режима в природных

3. Микроаэрофилия бесцветных серобактерий обусловлена влиянием активных форм кислорода на различные стороны их конструктивного и энергетического метаболизма.

4. Аэротолерантность альтернативных анаэробных ферментных спирохет систем, обусловлена им наличием извлекать позволяющих энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы. 4Х