Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Таксономия и новые аспекты экофизиологии и метаболизма бактерий рода Sphaerotilus

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Таксономия и новые аспекты экофизиологии и метаболизма бактерий рода Sphaerotilus"

1 си

005003573

Белоусова Елена Васильевна

ТАКСОНОМИЯ И НОВЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОФИЗИОЛОГИИ И МЕТАБОЛИЗМА БАКТЕРИЙ РОДА БРПЛЕКОТНиЗ

03.02.03 - микробиология

2 4 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов -2011

005003573

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Грабович Маргарита Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кацы Елена Ильинична,

кандидат биологических наук Хомякова Мария Александровна

Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение

Биологический факультет Московского

государственного университета имени М. В. Ломоносова

Защита состоится «14» декабря 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан »

Ученый секретарь диссертационного совета //,—-—~

доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина

Актуальность проблемы.

К роду Sphaerotilus, входящему в состав класса Betaproteobacteria (Kämpfer, 2005), относятся нитчатые органогетеротрофные аэробные бактерии. Они распространенны в основном в проточных системах, сточных водах, активных илах и являются космополитами (Eikelboom, 1975; Mulder, 1964; Stokes, 1954). Обильный рост Sphaerotilus является причиной технологических проблем, таких как засорение труб и вспучивание активного ила в очистных сооружениях. (Dondero, 1961; 1975; Richard et al., 1985). Довольно хороший рост представителей рода Sphaerotilus при низких концентрациях кислорода (Dias et al., 1968) и их способность утилизировать широкий спектр органических источников углерода способствует их доминированию в таких местообитаниях, как активный ил очистных сооружений и позволяет использовать их для очистки сточных вод от органических загрязнителей (Stokes, 1954; Richardetal., 1985).

В таксономическом и физиологическом отношениях многочисленные изоляты Sphaerotilus, выделенные из различных географических регионов и разных экосистем, исследованы достаточно детально и представляют группу штаммов, объединенных в единственный вид Sphaerotilus natans (Kämpfer, Spring, 2005).

Новые биотопы, в которых ранее не были обнаружены представители рода Sphaerotilus, такие как природные сероводородные источники Северного Кавказа, характеризуются уникальным набором условий окружающей среды (наличие органического субстрата, умеренно высокие температуры, постоянный приток сероводорода), что способствует развитию обрастаний нитчатых микроорганизмов (Черноусова и др., 2008). Возможно, поиск новых видов рода Sphaerotilus с новыми свойствами может увенчаться успехом при исследовании таких местообитаний. В последнее время накопилось много данных, свидетельствующих о фенотипической и филогенетической гетерогенности многочисленных штаммов Sphaerotilus natans, а, следовательно, назрел вопрос о таксономической ревизии рода Sphaerotilus.

Настоящее исследование представляет собой полифазный анализ и таксономическую ревизию нитчатых бактерий рода Sphaerotilus, ранее объединенных в единственный вид - S. natans, а также новых представителей этого рода и исследование особенностей их серного метаболизма.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было проведение комплексного таксономического и физиолого-биохимического анализа группы штаммов, ранее объединенных в единственный вид рода Sphaerotilus - S. natans, а также новых представителей этого рода и исследование особенностей их серного метаболизма.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав нитчатых структурообразующих компонентов микробных сообществ природных умеренно-термальных сероводородных источников Северного Кавказа.

2. Выделить чистые культуры нитчатых сероокисляющих бактерий из микробных сообществ и определить их таксономическое положение на основе полифазного анализа с применением нескольких филогенетических маркеров.

3. Оценить и проверить на биохимическом и генетическом уровнях способность представителей рода ЪрЪаегоШш, обитающих в сероводородных источниках, к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы.

4. Определить функциональную роль восстановленных соединений серы в метаболизме представителей рода ЗрИаегоШиз.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Представители рода БркаегоШш наряду с представителями рода ШоЛга являются доминирующим структурообразующим компонентом микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в природных умеренно-термальных сульфидных источниках Северо-Кавказского региона.

2. Выделение новых представителей рода БрЬаегоМш, изучение их и уже известных штаммов с применением нескольких филогенетических маркеров наряду с традиционными методами полифазного анализа позволяет описать новые виды и подвиды рода БрИаегоШиз.

3. Представители рода БрИаегоШш - ЗрИаегоШт пМапэ виЬвр. зиЩЬогаю виЬзр. поу. способны к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы.

4. Род БрЬаегоШт представлен двумя физиологическими группами, которые различаются по функциональной роли восстановленных соединений серы в их метаболизме.

Научная новизна и значимость работы.

В работе показано широкое распростанение представителей рода ЗЪраегоШж в природных сероводородных источниках Северного Кавказа, из которых выделено в чистую культуру 9 штаммов. Проведена таксономическая ревизия новых и известных штаммов рода ЗрИаегоМия, который ранее был представлен единственным видом - 5. паХат. Описаны 2 новых вида: БрИаегоШш топшпи.ч ер. поу. и БрИаегоШш Ырре1 ер. поу., а в рамках вида 5. пшат описано 2 подвида - БрЬаегоШж пактз 5иЬзр. пагапз виЬзр. поу. и зриаегошш шага виЬзр. ¡ифинуогат БиЬвр. поу. Расширены представления о типах метаболизма данных бактерий. Показано, что штаммы подвида £ пШат БиЬвр. ¡и^погаю виЬзр. поу. способны как к органогетеротрофному, так и к литогетеротрофному росту, при котором восстановленные соединения серы являются донором электронов для энергетического метаболизма. Способность к литотрофии у

штаммов S. natans subsp. sulfidivorans подтверждена на биохимическом и генетическом уровнях. В присутствии сероводорода, как и типичные представители физиологической группы бесцветных серобактерий, представители S. natans subsp. sulfidivorans subsp. nov. накапливают внутриклеточно включения элементной серы. Для подавляющего числа штаммов S. natans subsp. sulfidivorans subsp. nov. в присутствии тиосульфата переход к литотрофному росту определяется кислородным режимом культивирования - литотрофный рост индуцируется в микроаэробных условиях. Среди исследованных представителей рода Sphaerotilus выявлены две физиологические группы с двумя разными механизмами окисления восстановленных соединений серы: облигатные органогетеротрофы (представители S. montanus, S. hippie и S. natans subsp. natans) и факультативные литотрофы (S. natans subsp. sulfidivorans). У представителей первой и второй группы при органогетеротрофном росте восстановленные соединения серы выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода; у представителей второй группы - S. natans subsp. sulfidivorans в микроаэробных условиях роста соединения серы выполняют роль доноров электронов в энергетическом метаболизме.

Практическая значимость.

Результаты исследований расширяют фундаментальные знания о разнообразии мест обитания представителей рода Sphaerotilus и физиолого-биохимических механизмах регуляции их метаболизма; позволяют оценить их функциональную роль в природных сообществах, вклад в круговорот углерода и серы в природе.

Учитывая эколого-физиологические особенности новых штаммов, их можно использовать для очистки водных экосистем не только от органических веществ, но и от токсичных соединений серы.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на международных и российских конференциях:

1. Международной молодежной школе - конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006).

2. 2-ом Международном байкальском симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007).

3. Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009).

4. 3"dFEMS congress of European microbiologists (Sweden, 2009).

5. Международной молодежной школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011).

Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 10 печатных работах: 5 экспериментальных статьях и 5 тезисах. Статьи, опубликованные по теме диссертации, состоят в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 153 страницах, включает 17 таблиц, 30 рисунков, список литературы из 204 наименований, из них 20 на русском и 184 на английском языке.

Место проведения работы и благодарности.

Работа была выполнена на кафедре биохимии и физиологии клетки Воронежского государственного университета под руководством д.б.н. Грабович М.Ю.

Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Черноусовой Е.Ю., к.б.н. Акимову В.Н., к.б.н. Тутукиной М.Н., к.б.н. Детковой Е. Н., д.б.н. Осипову Г.А., за помощь на отдельных этапах работы.

Работа была выполнена при финансировании в рамках грантов РФФИ № 05-04-48229а, № 06-04-63105к, 09-04-00799а, 09-04-10072к, 10-04-100179к, ФЦП № 14.740.11.0730

Автор выражает особую благодарность д.б.н. Грабович М.Ю. и д.б.н. Дубининой Г.А. за помощь в формулировании положений диссертации, полезные советы и поддержку на всех этапах работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали штаммы, выделенные из микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий из умеренно термальных сульфидных источников «Петушок» (г. Горячий Ключ Краснодарского края) и «Бесстыжие ванны» (г. Пятигорск Ставропольского края), штамм HS выделен из низкотемпературного железистого ручья, расположенного в районе разгрузки глубинных подземных вод Псекупского месторождения минеральных вод в Краснодарском крае, г. Горячий Ключ. Для сравнительного анализа использовали штаммы из коллекции DSMZ Sphaerotilus natans DSM 6575т, "S. natans" DSM 565, "S. natans" DSM 566.

Состав питательных сред. Для выделения, культивирования, изучения физиолого-биохимических и культуральных свойств использовали среду Армбрустера (Armbruster,

1969). Перед посевом в среду вносили набор витаминов и микроэлементов (Pfennig, Lippert, 1966), pH среды перед посевом доводили до 7.5-7.8. В среду выделения перед посевом вносили лактат натрия - 100-500 мг/л, тиосульфат натрия - 1 г/л. При микроаэробном культивировании соотношение объемов жидкой и газовой фаз во флаконах составляло 1:10 и концентрация кислорода в газовой фазе составляла 5 %. Изучение фенотипических, хемотаксономических свойств чистых культур бесцветных серобактерий проводили с помощью стандартных методов, используемых в микробиологической практике.

Получение ферментных препаратов. Суспензию клеток, клеточные экстракты (гомогенат), супернатант (цитоплазматическую фракцию) получали как описано ранее (Грабович и др., 1998; Grabovich et al, 1999). Белок в клеточных экстрактах определяли методом Лоури (Protein measurement with Folin phenol reagent, 1951). Методы определения активности ферментов. Активность ферментов серного метаболизма определяли в супернатанте разрушенных клеток из двухсуточной культуры в середине фазы экспоненциального роста. Измерение активности проводили спектрофотометрическими методами, как описано ранее (Грабович и др., 1998). Методы определения растворенного кислорода. Для определения потребления кислорода суспензией клеток использовали полярографический метод. Скорость потребления кислорода в суспензии клеток регистрировали на полярографе Рекорд 4 (совместное производство Института биофизики РАН и СКБ, Пущино). Регистрацию полярограмм производили по общепринятой методике (Шольц, 1975). Анализ неорганических соединений серы. Сероводород определяли колориметрически с использованием диметил-п-фенилендиамина. Раздельное определение S3062" при их совместном присутствии в среде проводили методом раздельного йодометрического титрования (Резников и др., 1970). Содержание S042" определяли хлоранилатным методом (Уильяме, 1982). Элементную серу определяли по методу Морриса (Morris et al., 1948) ксиоримефически на СФ-56.

Выделение и очистка хромосомной ДНК. Для экстракции ДНК из сообществ и чистых культур бесцветных серобактерий использовали модификацию метода (Ausubel et al., 1994) с дополнительными этапами быстро чередующихся циклов замораживания и оттаивания (Bej et al., 1991).

Полимеразная цепная реакция (ППР). Амплификация генов 16S рРНК, hspóO, gyrB, aprBA, soxB, sqr была проведена на приборе GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США). Очистку ПЦР-продуктов проводили при помощи ферментов экзонуклеазы I Е. coli («Fermentas», Литва) и креветочной щелочной фосфатазы («Promega», США).

Клонирование генов 16S рРНК. Амплифицированные фрагменты генов 16S рРНК клонировали в векторе pGEM-T по методике и с использованием набора реактивов pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems («Promega», США).

RAPD-ПЦР. Геномные RAPD-фингерпринты были получены с использованием праймера М13 по методу (Moissenet et al., 2003). Уровень генетического сходства/различия штаммов по данным ПЦР-фингерпринтов рассчитывали с использованием коэффициента Нея-Ли (Nei, Li, 1979), реализованного в пакете программы FreeTree 0.9.1.50 (Hampl et al., 2001).

Определение нуклеотидной последовательности генов проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США) в соответствии с протоколом, предлагаемым фирмой.

Филогенетический анализ. Для нахождения близкородственных организмов нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с последовательностями известных штаммов в базе данных NCBI. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы CLUSTAL X (Thompson et al., 1994). Филогенетические деревья были построены с помощью программы TREECON (Van de Peer, De Wächter, 1994). Расчет относительных частот использования кодонов и проведение анализа соответствия осуществляли с помощью пакета программ Codon W íhttp://codonw.sourceforge.netA. Содержание ГЦ пар в ДНК генов soxB рассчитывали при помощи программы jPhydit (http://plaza.snu.ac.kr/~ichun/iphvditA.

Выделение суммарной клеточной фракции РНК. Суммарную фракцию клеточной РНК выделяли как описано ранее (Favre-Bonte S., 1999).

Получение кДНК-копий. Реакцию обратной транскрипции проводили в соответствии с протоколом фирмы изготовителя ("Fermentas").

Количественная ПЦР ЩЦР в реальном времени). ПЦР проводили на приборе ДТ-322 (ДНК-Технология, Россия) с использованием интеркалирующего в двухцепочечную ДНК красителя SYBR Green I (Invitrogen, США). Относительное количество синтезированных ампликонов рассчитывали по формуле 2ла. Первичный анализ сходства полученных нуклеотидных последовательностей генов проводили с помощью программ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/

Tools/msa/clustalw2/) и TCoffee (http://tcoffee.crg.cat/).

Определение Г+Ц в ДНК и ДНК-ДНК гибридизация. Содержание Г+Ц в ДНК определяли по кривым термической денатурации на спектрофотометре «Pye Unicum SP 1800» и рассчитывали по формуле Оуэна (Owen, Lapage, 1976), реассоциацию ДНК-ДНК изучали методом оптической реассоциации (De Ley et al., 1970).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-4 кратных повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0.05 (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Таксономическая ревизия рода Sphaerotilus

1.1. Филогенетический анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий

Филогенетический анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий из термального сульфидного источника «Петушок» впервые показал участие представителей рода Sphaerotilus в качестве одного из основных компонентов микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в природных сульфидных источниках (Черноусова, 2008). Скрининг клоновой библиотеки ПЦР-продуктов генов 16S рРНК из бактериального мата "Петушок" показал доминирование Thiothrix sp.

(66.3 %) и ЗрИаегоШиз Бр. (26.3 %). Нами впервые показано участие представителей этих групп нитчатых бактерий в качестве основных структурообразующих компонентов в составе микробных сообществ «тогЬпх-ЗрЬаегоШш» в природных сульфидных источниках.

Соотношение представителей родов ТЫоЛгтх и 5рЬаегоШив в составе обрастаний сероводородных источников в значительной степепи определялось концентрацией Н23 в водах источников, что подтверждается анализом клоновых библиотек гена 16Б рРНК. (рис. 1).

А Б Рис. 1. Состав

бактериального сообщества в источнике «Петушок», определенный с помощью клоновых технологий А - 2004г., 2-4мг/л НгЭ; Б -2006г., 10 мг/л НгЗ. 1 - филотип "ТИШкгЬс ер.", 2 - филотип "ЗрИаегоШиз эр", 3 — минорные филотипы.

/

У

st

Sy- 261--

JÉ

"Ъ

-z___

В г^ЗШ

12 3 13

1.2. Фенотипические характеристики

Морфология клеток соответствует характеристике, данной для рода (Kämpfer, Spring, 2005) (рис. 2).

Рис. 2. Морфология штаммов Sphaerotilus

А - штамм Д-501т; Б - штамм Д-507. Фазово-контрастный микроскоп.

Шкала 10 мкм. 1 — чехлы без клеток, 2 — гонидии Все штаммы имели дыхательный тип метаболизма и не были способны к росту с фумаратом или нитратом в качестве терминального акцептора электронов в анаэробных условиях. Изученные штаммы характеризуются отсутствием гидролитических ферментов, разлагающих сложные органические субстраты -крахмал, желатин, казеин. Все штаммы обладают каталазной и оксидазной активностью. Образуют сероводород при росте на цистеине. Не удалось обнаружить образование индола и денитрификации. Все штаммы, за исключением штамма DSM 566т, были способны восстанавливать нитраты до нитритов. Штамм DSM 566т не способен осуществлять ассимиляционную нитратредукцию. Не образуют пигменты

при росте на ароматических аминокислотах. Не растут с 3 % К'аС1. Не образуют кислоты при росте на сахарах. Штаммы Д-501т, Д-502, Д-504, Д-505 и Д-507 были способны к литогетеротрофному росту с тиосульфатом или сульфидом в качестве донора электронов для энергетического метаболизма. Отличительные признаки исследованных штаммов приведены в таблице 1.

Таблица 1. Отличительные признаки типовых штаммов рода ЗрИоегоШиэ

Признак S. natans DSM 6575т 5. montanus sp. nov. HST (DSM 21226V S. hippei sp. nov. DSM 566T

Размеры клеток, цм 1.2-2.0 Х2.0-6.0 0.8-1.4 хЗ.З-6.0 0.7-1.5 X2.0-6.2

Оптимум рН 6-5-7-5 7.5 7.0

Температурный оптимум (°С) 25 26-27 26-27

Содержание ГЦ в ДНК, мол. % 70.8 67.8 69.0

Источники углерода^:

ацетат - - +

аконитат + + -

аланин + +

арабиноза - + +

аспарагин + - -

аспартат + + -

бензоат - + -

бутанол - + +

цитрат - + +

фумарат +* + -

галактоза + - -

глиоксилат - + +

гистидин - - +

изобутанол - - +

лактоза - + -

маннитол - + -

манноза - + +

орнитин + + -

оксалат +* + -

фенилаланин + + -

пропанол - + +

сорбитол + + -

сорбоза - + +

триптофан + + -

тирозин + - -

нефтепродукты + - -

£ Сукцинат, лактат, пируват, малат, оксалоацетат, 2-оксоглуторат, малонат, глюкоза, сахароза, мальтоза, фруктоза, глицерин, этанол, глутамат, пролин, пептон, дрожжевой экстракт и гидролизат казеина используются всеми штаммами в качестве единственного источника углерода и энергии. Формиат, гликолат, салицилат, изоцитрат, раффиноза, цистеин, цистин, лизин, серин и метионин - не используются. Соли аммония, нитраты, аспартат, глутамат, цистеин, пептон, дрожжевой экстракт и гидролизат казеина используются в качестве единственного источника азота всеми штаммами, метионин — не используется.

"■свойства штаммов HSth DSM 565 были почти идентичными, в таблице приводятся данные только для штамма HST;

1.3. Генотипические и филогенетические свойства

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, /мрбО и gyrB штаммов Д-501т и Д-380 показал их значительное сходство с типовым штаммом S. natans DSM 6575т. Штаммы Д-501т и Д-507 оказались идентичными на основании анализа данных филогенетических маркеров.

Уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК между штаммами Д-501т, Д-380 и представительными штаммами S. natans (АТСС 15291 и группа штаммов, выделенных из илов бумажной промышленности) лежал в диапазоне от 99.7 до 99.9 %. Это позволяет сделать вывод о том, что штаммы Д-501т, Д-507 и Д-380 являются членами одного вида S. natans в составе рода Sphaerotilus. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК, hsp6Q и gyrB, полученные для штаммов HST, DSM 565 и DSM 566т, продемонстрировали низкий уровень сходства по сравнению с типовым штаммом S. natans DSM 6575т. Штаммы HST и DSM 565 оказались идентичными на основании анализа данных филогенетических маркеров. Уровень сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, /крбО и gyrB между штаммами DSM 566т и HST составил 98.6, 91.6 и 91.7 %, соответственно. Наличие столь значимых филогенетических различий между штаммами DSM 566т, HST и типовым штаммом S.natans DSM 6575т позволяет классифицировать штаммы DSM 566Т и HST как представителей новых видов рода Sphaerotilus.

ДНК-ДНК гомология штаммов Д-380, Д-501т, Д-504, Д-507 и S. natans DSM 6575т составила от 80 до 98 %, что говорит о достоверной принадлежности данных штаммов к виду S. natans. Уровень ДНК-ДНК гомологии между штаммами HST и DSM 566т составил 44 %, а между данными штаммами и типовым штаммом S. natans DSM 6575т-48 % и 52 %, соответственно.

На основании фенотипических, хемотаксономических и филогенетических характеристик, штаммы HST и DSM 565 представляют новый вид в составе рода Sphaerotilus, для которого мы предлагаем видовое название Sphaerotilus montanus sp. nov. Типовой штамм данного вида штамм HST.

Проведенный полифазный анализ для штамма DSM 566т свидетельствует о видовой обособленности данного организма и дает основание рассматривать его в качестве нового вида рода Sphaerotilus - Sphaerotilus hippei sp. nov.

Результаты ДНК-ДНК гибридизации, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, hsp60 и gyrB и фенотипические данные, полученные для изолятов, выделенных из сульфидных источников: Д-501т, Д-502, Д-504, Д-505 и Д-507, свидетельствуют о близком родстве данных штаммов и типового штамма S. natans DSM 6575т. Однако штаммы, выделенные из сульфидных источников, значительно отличаются от ранее известных штаммов S. natans их способностью к литотрофному росту с восстановленными соединениями серы и способностью обильно развиваться в термальных сульфидных источниках, а также отдельными фенотипическими характеристиками. В связи с этим, штаммы Д-501т, Д-

502, Д-504, Д-505 и Д-507 представляется возможным выделить в отдельную таксономическую единицу подвидового уровня - Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans subsp. nov. с типовым штаммом Д-501т. Ко второму подвиду -Sphaerotilus natans subsp. natans subsp. nov. предлагается отнести штаммы с органотрофным типом метаболизма (DSM 6575т, Д-380, BV-1, BV-2) с типовым штаммом DSM 6575т. Филогенетическое дерево, отражающее положение новых видов и подвидов рода Sphaerotilus представлено на рисунке 3.

0.05

I-

Н

99

Spkaeroüha ncäcinsi&Mp.natansI£M6575t(£ü64i51l) Sp/uurohlus natans «Alf. sulfidivorans &S01T(FJ871Q54) . fyhatrolilus ndais nfcfp. eilfidworcns Д-507 (FJ371DS3) .S^ww&ius miens nlxp. neUns Д-381 (GU5917S3) SphxrMm nalem ATCC 15291(NBRC13543) • ф!иетой1и51!2(шмГ4(АГО72914) 100 L ¿taercfilasiMians IF5(fi072915)

-_ Sphatrcfflus «atans IF14 (AF072917)

Siimrääusndms IFP(AF072P16) ■—SphutroOiu Mppn DSM5M'(GtJ591795) —I 100 t RnharnSiu пМш ПЯМ «Я (Г,1»117№ I SphaeroOus таНаш HS* (EUÜ6OO0

_UptolhnxdiscqihoTa SS-1' (L33973)

Lsptothm moMiiFeox-l'COTOn) Itftcthix Adoim CCMЮ71 (X97070) Мш'ш gtfalfiBiie A31 (D16214) UtoMlla decNoratans CCUG 30977" (X72724) Aquincctalaliaricarboms L10I(DQ6564a?) АраШггшт alKSpMum B4' (AF035D50) Aqubacitrium с отгггшш ES1 (AF033354;

^иШтшпртчт К1 (AF035Q52) ймвйв^йгвОютлизЕемиаз'даооэбгз)

Ittsmria dtitosaritc&ida 30011 (№006831) fttoMssaxtoopMaDSMWI'iABCMitJ?) Pauabacttrtcxmivomm 2C20" (AY515390)

/ki&vcraxfadlis СОТО 21131 (AFD78765) RhoibferaxfinMntans FM'(D16211) Qmmrarailtmim D6MT099'(AJ420326)

_Irapitpote tyalina [AM 14190' (AB092®1)

. Brachjmmas jirititficam AS-PI' (D1432D)

Рис. 3. Филогенетическое дерево, сконструированное на основе 16S рДНК

Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью "bootstrap" - анализа. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов). В качестве «внешней группы» использована последовательность Alcaligenes faecalis subsp. faecalis ATCC

Диагнозы новых видов и подвидов приведены в тексте диссертации (Gridneva et al„ 2011).

2. Серный метаболизм представителей рода Sphaerotilus.

В связи со способностью штаммов S. natans subsp. sulfidivorans (Д- 501т, Д- 502, Д- 504, Д- 505 и Д- 507) окислять восстановленные соединения серы, основное внимание при изучении данных организмов было сфокусировано на выяснении роли восстановленных соединений серы в их метаболизме.

2.1. Влияние кислородного режима культивирования и восстановленных соединений серы на рост штаммов ЗркаегоХИиъ.

Ни один из штаммов 5. пагапи зиЬэр. $и!/1сИуогапз не был способен к окислению тиосульфата в среде в отсутствие используемого органического субстрата, независимо от содержания кислорода в диапазоне концентраций от 1 до 20 % в газовой фазе. Окисление тиосульфата в культуральной среде происходило только при одновременном внесении лактата (или других органических субстратов - ацетата, сукцината). При сравнительном изучении процесса окисления тиосульфата и состава конечных продуктов была выявлена физиологическая неоднородность штаммов.

Лишь у одного из штаммов, Д-507, скорость окисления тиосульфата не зависела от концентрации кислорода в среде; в микроаэробных условиях окисление тиосульфата сопровождалось накоплением в среде сульфатов, а в аэробных условиях помимо сульфата, в незначительной степени происходило образование тетратионата. У всех других штаммов (Д-501т, Д-502, Д-504, Д-505) при аэробном росте скорость окисления тиосульфата была в 2.5 - 3 раза ниже, и в качестве единственного конечного продукта накапливался только тетратионат. Однако, в микроаэробных условиях скорость окисления тиосульфата заметно увеличивалась, а окисление тиосульфата сопровождалось образованием сульфата в эквимолярных соотношениях.

Результаты опытов по влиянию различных концентраций кислорода на рост штамма Д-501т показывают четкую зависимость клеточного урожая от кислородного режима культивирования. В пределах испытанных концентраций от 5 до 20 % кислорода в газовой фазе для штамма Д-501т обнаружена обратная зависимость между приростом клеточной биомассы и исходным содержанием 02 в среде (рис. 4).

Рис. 4. Влияние содержания кислорода в газовой фазе на урожай S. nutans subsp. suljidivorans н 1 Д-501 т при гетеротрофном росте

0 2 1 - 5% кислорода; 2 - 10% кислорода; в з 3 - 20% кислорода.

Длительность опыта 24 часа

Окисление серных соединений в культуре Д-507 сопровождалось заметным увеличением урожая клеток в 2 раза (рис.5А). Наличие в среде культивирования штаммов Д-501т, Д-502, Д-504, Д-505 восстановленных соединений серы способствовало значительной стабилизации культуры и увеличению урожая клеток в 1,2 раза (рис. 5Б).

время, час время, час

Рис. 5. Влияние тиосульфата на рост штаммов S. natans subsp. suljidivorans

А - штамм Д - 507, Б - штамм Д - 501т, 1 - урожай клеток на среде без тиосульфата, 2 -урожай клеток на среде с тиосульфатом.

2.2. Выявление ферментативных путей окисления восстановленных

соединений серы при литотрофном росте новых штаммов Sphaerotilus.

Активность ферментов серного метаболизма. У штаммов S. natans subsp. sulfldivorans была определена активность ключевых ферментов окислительного серного метаболизма (табл. 2).

Таблица 2. Зависимость активности ферментов серного метаболизма от содержания кислорода в среде у штаммов S. natans subsp. sulfldivorans (нмоль/(мин-мг белка))

Штамм Концентрация кислорода в газовой фазе, %

20 5

Роданаза Сульфит-феррицианид-оксидоредуктаза АФС-редуктаза Сульфит-феррицианид-оксидоредуктаза АФС -редуктаза

Д-507 75 929 - 1611 1150-2762 2554 2915

Д-5011 70-100 но но 518 1104

Штамм Д-507 окисляет тиосульфат до сульфата независимо от концентрации кислорода, а штамм Д-501т в аэробных условиях окисляет тиосульфат до тетратионата, а накопление сульфата в качестве конечного продукта происходило лишь в микроаэробных условиях, но - активность не обнаружена

Связь окисления восстановленных соединений серы штаммом Д-507 с функционированием ЭТЦ. Интенсивность дыхания на сульфите в суспензии клеток в среднем составляла 180 нмоль/(мин-мг белка), интенсивность дыхания на тиосульфате - 60 нмоль/(мин-мг белка). Ингибиторный эффект миксотиазола (23 %), HQNO (80 %) и антимицина А (25-63 %) показывает, что электроны от сульфита поступают в ЭТЦ на уровне убихинон - цитохром b участка. При внесении разобщителей дыхания - ССР и СССР скорость дыхания на тиосульфате и сульфите увеличивалась в 2.5 раза. Последнее непосредственно указывает на сопряженность процесса окисления этих соединений с функционированием ЭТЦ, а, следовательно, на

способность штамма Д-507 использовать их в качестве энергетического субстрата в процессе дыхания.

Молекулярная детекция генов ферментов диссимиляционного серного метаболизма. В результате ОТ-ПЦР анализа, проведенного для штаммов Д-501т и Д-507 были выявлены гены soxB, кодирующего гидролазу SoxB из тиосульфатокисляющего комплекса Sox, аргВА, кодирующих диссимиляторную аденозин-5'-фосфосульфатредуктазу и sqr, кодирующего сульфид-хинон оксидоредуктазу. Для обнаружения данных генов были использованы вырожденные праймеры, подобранные на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей (Meyer, 2007; Meyer, Kuever, 2007b; Bronstein et al., 2000; Chan et al., 2009). Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей участков генов sохВ, аргАВ и sqr с ближайшими в базе данных NCBI показало, что эти последовательности имеют высокую степень сходства с аналогичными генами других бактерий (77-96 %). Таким образом, не вызывает сомнений, что полученные продукты ОТ-ПЦР являются фрагментами генов soxB, аргВА и sqr.

Как было показано выше, основным фактором, определяющим тип метаболизма у Д-501т в присутствии восстановленных соединений серы, является концентрация кислорода. Поэтому для количественной оценки уровня экспрессии генов soxB и аргА в микроаэробных и аэробных условиях была проведена ОТ-ПЦР в реальном времени. Для экспериментов были использованы три независимых выделения РНК, при этом с каждой кДНК проводилось по два эксперимента, с двумя концентрациями кДНК в ПЦР-пробе - 2 и 4 мкл. В результате было показано, что в микроаэробных условиях экспрессия гена soxS усиливалась в 7.23±1.27 раз, экспрессия гена дрл4 усиливалась в 3.78 ±0.64 раза (рис. 6).

■soxB

3 130

Э

z

723'

Рис. 6. Уровень экспрессии генов бохВ и аргА при культивировании в

микроаэробных (красная кривая) и аэробных условиях (зеленая кривая)

* На графиках показана зависимость флуоресценции канала БАМ от номера цикла (типичный эксперимент) и среднее увеличение уровня экспрессии в микроаэробных условиях (по данным шести независимых экспериментов) в процентном отношении к контролю (аэробные условия)

о

J=L

■....... ................I ■ I I i .............

2 4 6 8 10 12 14 16 IS 20 22 24 26 2S 30 32 34 36 38 40 Номер щткла

4 6 8 10 12 U 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Номер цикла

2.3. Функциональная роль и механизм окисления тиосульфата при органогетеротрофном росте представителей рода ЗрИаегоШих

В аэробных условиях роста в клетках большинства штаммов представителей рода БрЪаешииь не была обнаружена активность ферментов окислительного серного метаболизма, но наблюдалось увеличение клеточного урожая в культурах всех штаммов, а окисление тиосульфата осуществлялось до тетратионата.

При органогетеротрофном росте окисление тиосульфата с образованием тетратионата могло быть результатом его взаимодействия с Н2О2, образуемой при окислении органических веществ (Подкопаева, 2003; 2005).

Добавление к суспензии клеток штамма Д-501т каталазы или пирувата, разрушающих Н202 предотвращало процесс окисления на 80-100 %, а внесение в реакционную смесь глюкозы - ускоряло. При одновременном добавлении к суспензии клеток каталазы и глюкозы, окисления тиосульфата не происходило из-за ферментативного разрушения Н202. На рис. 7 приведены результаты опытов с клеточной суспензией, свидетельствующие о перекисном механизме его окисления.

Рис. 7. Окисление тиосульфата суспензией клеток штамма Д-501т, выросших в органогетеротрофных условиях

Плотность суспензии 0,5 мг белка /мл. К суспензии добавлено: 1 - без добавок; 2 - глюкоза (0,5 мг/мл); 3 - каталаза (10 мкг/мл с активностью 7000 Е/мг белка) + глюкоза (0,5 мг/мл); 4 - глюкоза (0,5 мг/мл) + ПВК (0,2 мг/мл).

0 2 5 10

время, мин

Для штамма Д-507, который как в аэробных, так и в микроаэробных условиях способен к литотрофному росту, напротив, добавление глюкозы влекло за собой снижение скорости окисления тиосульфата в два раза.

Стимулирующее влияние тиосульфата на ростовые процессы бактерий при аэробном культивировании обусловлено удалением токсического воздействия Н202. Было отмечено, что органогетеротрофный рост сопровождается накоплением внутриклеточно пероксида водорода. Скорость образования Н202 изолятами была определена полярографическим методом и определялась по скорости потребления кислорода при внесении каталазы в суспензию клеток 5. па1ат БиЬэр. виЩ<И\огап$ (Д-501т, Д-502, Д-504 и Д-505). Она составила 6.4 мкг/(мин-мг белка) при дыхании на сукцинате и 2.0 мкг/(мин-мг белка) - на ацетате.

80 -60 40 1 20

Результаты этих опытов доказывают, что существует прямая зависимость между окислением тиосульфата и накоплением пероксида водорода в суспензии клеток и обратная зависимость процесса от активности каталазы.

Органогетеротрофный рост штаммов S. иагдам subsp. sulfidivorans в аэробных условиях в отсутствие тиосульфата сопровождался лизисом клеток, начиная с ранней фазы экспоненциального роста (рис. 8). По-видимому, в последнем случае он был обусловлен накоплением Н202 в токсических концентрациях в клетках как следствие низкой активности ферментативных систем антиоксидантной защиты, прежде всего, каталазы. Ранее было показано, что клетки S.natans, действительно, обладают низкой каталазной активностью (Kampfer, Spring, 2005).

Рис. 8. Влияние тиосульфата на рост и лизис клеток в культуре штамма Д-501т при аэробном росте

А - в среде без тиосульфата; Б - в среде с тиосульфатом; 1 - белок целых клеток; 2 - белок лизированных клеток. Длительность опыта 24 часа.

2.4. Гипотеза сценария эволюции гена soxB у представителей группы Leptothrix-Sphaerotilus

Результаты филогенетического анализа последовательностей генов soxB для штамма Sphaerotilus 507 коррелируют с его кластеризацией, получаемой в результате проведения анализа последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. По результатам проведенного нами анализа частот использования кодонов генов soxB, наиболее близким к штамму Д-507 оказался штамм Leptothrix cholodnii SP-6. Частоты использования кодонов генов soxB у этих двух штаммов были практически идентичными. Нуклеотидные составы ДНК отдельного гена soxB и ДНК генома штамма Д-507 характеризовались близкими значениями и составляли 67.1 и 69.2 мол. % Г+Ц, соответственно. Аналогично, у штамма Leptothrix cholodnii SP-6 молярные проценты гуанина и цитозина в ДНК гена soxB и ДНК генома были близкими, 66,8 и 69.6 мол. % Г+Ц, соответственно. Отличия в процентах Г+Ц пар в ДНК генов soxB и ДНК геномов у исследованных штаммов не превышала 3 %, следовательно, гены soxB у штаммов Д-507 и Leptothrix cholodnii SP-6 не являются «чужеродными» в составе их геномов. При этом нуклеотидные составы ДНК генов soxB у штаммов Д-507 и Leptothrix cholodnii SP-6 практически равны.

Результаты проведенного нами исследования позволяют расширить гипотезу появления генов soxB в геноме сероокисляющих прокариот (Meyer, Kuever, 2007а),

предложив схему эволюции генов soxB у сероокисляющих представителей рода Sphaerotilus - Sphaerotilus natans subsp. suljldivorans. Сходство последовательностей генов soxB, их практически идентичные ГЦ-состав и частоты использования кодонов у Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans Д-507 и Leptothrix cholodnii SP-6 позволяет предположить наличие у этих организмов общей предковой формы. Мы не рассматриваем возможность обмена серными генами между этими двумя видами, а также заимствования гена soxB у других современных видов посредством горизонтального переноса, поскольку проведенные выше результаты исследований Г+Ц составов ДНК позволяют утверждать, что анализируемые гены soxB не являются «чужеродными» для геномов видов S. natans subsp. sulfidivorans Д-507 и Leptothrix cholodnii SP-6.

Вероятно, предковая бактерия обладала способностью к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы. Об этом свидетельствуют следующие факты: во-первых, окисление восстановленных соединений серы штаммами Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans сопряжено с энергетическим метаболизмом, последнее подтверждено на биохимическом и генетическом уровнях; во-вторых, в геноме Leptothrix cholodnii SP-6 обнаружен ген soxB (геномный проект «Leptothrix cholodnii SP-6» (www.ncbi.nml.gov/bioprogect/20039'). Следует заметить, что способность к окислению серных соединений Leptothrix cholodnii SP-6 экспериментально не доказана. Возможно это объясняется отсутствием в геноме этой бактерии других генов серного метаболизма - aprBA, sqr, rdsr (www.ncbi.nml.gov/bioprogect/20039') или не подобраны условия для литотрофного роста, или в геноме содержится только один из четырех генов мультиферментного комплекса Sox. Вопрос о функциональной значимости и экспрессионной активности гена soxB в геноме Leptothrix cholodnii SP-6 остается открытым. Данные по способности к окислению серных соединений и наличию генов диссимиляционного серного метаболизма у других представителей рода Leptothrix (L. mobilis, L. discpphora, L. lopholea, L. cholodnii LMG7171) отсутствуют, и исследования в этом направлении не проводились.

У представителей S. montanus, S. hippei и S. natans spp. natans нами не был обнаружен ген soxB. Вероятно в процессе эволюции, гены серного метаболизма, и в частности ген soxB, были утеряны у некоторых штаммов Sphaerotilus. Очевидно, утрата гена soxB связана с адаптацией бактерий к обитанию в железистых экосистемах. Такого рода потеря могла быть результатом эволюционного отбора оптимальной физиологической формы существования. В результате литотрофная группа Sphaerotilus - Leptothrix разделилась на две физиологические линии литотрофные и органотрофные бактерии. Ниже представлена гипотетическая схема эволюции генов soxB у представителей Sphaerotilus-Leptothrix группы (рис. 9).

Рис. 9. Гипотетическая схема сценария эволюции генов soxB у представителей Sphaerotilus - Leptothrix группы.

1 - данные (Meyer, Kuever, 2007а)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представители рода 8рЪаегоН1ш ранее были известны как типичные гетеротрофные бактерии, способные использовать широкий спектр органических веществ. Высокий гетеротрофный потенциал позволяет им расти в самых разных биотопах в виде обрастаний: они широко распространены в активном иле, природных железистых источниках и богатых органическим веществом индустриальных водах. Результаты, полученные в нашей работе, расширяют представления об экофизиологии исследуемых бактерий. Впервые представители рода БрЪаегоШш были обнаружены в составе доминирующих структурообразующих компонентов микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в природных умеренно-термальных сульфидных источниках Северо-Кавказского региона. Согласно данным скрининга клоновой библиотеки ПЦР-продуктов генов 168 рРНК филотип ЗраегойЫ в данных

сообществах может составлять до 30 %. Содержание сероводорода в исследуемых местообитаниях варьировало от 2 до 11 мг Б2" в 1 л в зависимости от подтока подземных вод и дебета источника. При такой концентрации сероводорода и проточных условиях в источниках создавались микроаэробные условия - содержание кислорода составляло 0.1 - 0.5 мг л"1. Новые изоляты оказались факультативными литотрофами, способными использовать восстановленные соединения серы в качестве донора электронов для энергетического метаболизма. У подавляющего большинства литотрофных штаммов способность к литотрофии индуцировалась только в микроаэробных условиях.

В связи с получением штаммов с новыми свойствами и имеющимися проблемами в систематике ЗрЬаегоШт была проведена таксономическая ревизия данного рода. В работе обоснованы новые подходы к филогенетическому исследованию представителей рода йрИаегоШш: наряду с анализом гена 16Б рРНК предлагается использовать для идентификации несколько дополнительных филогенетических маркеров - анализ гена /глр 60, кодирующего 60 ГОа шаперонин I типа, и яугВ, кодирующего АТФазный домен ДНК-гиразы. Филогенетический анализ белок-кодирующих генов подтвердил интерпретацию данных по 16Б рРНК и результаты фенотипических и генотипических исследований.

Проведенный полифазный анализ, включающий исследование фенотипических, генотипических и филогенетических свойств, позволил расширить границы рода БрИаегоНЫ. Род БрЪаегоШт до настоящего времени содержал только один вид. В данной работе проведена таксономическая ревизия уже известных и новых штаммов БркаегоШиз: описаны 2 новых вида - БрЬаегогИш тоЫапиэ ер. поу. и БрИавгоШиз Мрр& бр. поу., в рамках вида 5. пШапя описано 2 подвида - 5. пШат виЬэр. пМапз эиБвр. поу. и 5. па1апя виЬзр. эифсНуогапя виЬэр. поу. Выделение подвида БрИаегоШш па1ат БиЬвр. ¡и^сНуогат виЬвр. поу. основано на способности штаммов данного подвида доминировать в биотопах, представленных природными сульфидными источниками, и использовать неорганические восстановленные соединения серы в качестве энергетического субстрата.

Впервые выяснена функциональная роль восстановленных неорганических соединений серы в метаболизме представителей рода БрЬаегоШш, что позволило разделить их на две физиологические группы: облигатные органогетеротрофы (5'ркаегоНШ тетания, БрИавгоШия Ырре^ ЗрИаегоШиз па1ат виЬвр. пашпз) и факультативные литогетеротрофы (БрИаегоШт па1ат БиЬэр. яи^иНуогат). У представителей первой и второй группы при органогетеротрофном росте серные соединения выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода; у представителей второй группы -БркаегоШш па(апз киЬэр. яиЩсНуогат в микроаэробных условиях роста соединения

серы могут выполнять роль доноров электронов в энергетическом метаболизме. На основании проведенных исследований особенностей серного метаболизма, можно предложить следующую схему превращения восстановленных соединений серы у Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans (рис. 10).

Рис.10. Схема превращения восстановленных соединений серы у представителей подвида Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans

1 - сульфид-хинон оксидоредуктаза;

2 - роданаза;

3 - тиосульфатрасщепляющий Sox комплекс;

4 - сульфитферрицианидоксидоредуктаза;

5 - АФС-редуктаза;

6 - АТФ-сульфурилаза или аденилилсульфат: фосфат аденилилтрансфераза;

7 - неферментативный путь при участии H2Oi. * - штамм Д-507 осуществляет литогетеротрофный рост вне зависимости от степени аэрации среды. Сплошные стрелки - обнаружена активность фермента или детектированы гены данных ферментов; пунктирные стрелки - нет данных.

Сходство последовательностей генов soxB, их практически идентичные ГЦ-состав и частоты использования кодонов у Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans 507 и Leptothrix cholodnii SP-6 позволяет предположить наличие у этих организмов общей предковой формы. Вероятно, предковая бактерия обладала способностью к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы. В процессе дальнейшей эволюции, гены серного метаболизма, и в частности ген soxB, были утеряны у некоторых штаммов Sphaerotilus. В результате литотрофная группа Sphaerotilus-Leptothrix разделилась на две физиологические линии - литотрофные и органотрофные бактерий. Очевидно, утрата гена soxB связана с адаптацией бактерий к обитанию в железистых экосистемах.

Для большинства факультативно литотрофных бактерий показано большое разнообразие типов энергетического и конструктивного метаболизма. Такая приспособленность обеспечивает им преимущество перед облигатными литоавтотрофами и гетеротрофами, так как они способны использовать более широкий спектр субстратов, что обусловливает их выживаемость и доминирование в сероводородных биотопах. Наличие вариабельного метаболизма и механизмов адаптации к нестабильным условиям существования обеспечивает расширение ареала распространения рода Sphaerotilus в новых природных местообитаниях и имеет

органотрофныи рост

S,0",

S40;'

SjOJ" - SO4"

SO;

SO;

АФС

.ттогетератрафнмн рост *

мчкроачробпые условия

определяющее значение в доминировании в бактериальных сообществах сульфидных источников.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что представители рода БрЪаегоШиз наряду с представителями рода ШоЛпх являются доминирующим структурообразующим компонентом микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в природных умеренно-термальных сульфидных источниках Северо-Кавказского региона.

2. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК, белок-кодирующих генов - /мр 60 и &'гВ, результата анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств проведена таксономическая ревизия уже известных и вновь выделенных штаммов единственного вида рода БрИаггоПЧив - 5. пШаю: описаны 2 новых вида - БрИаегоИЫ тоМапиз Бр. поу. и ЗркаегоШш Ырре1 ер. поу., 2 подвида - БрЬаегоШш па1ат 5иЬэр. па1ат зиЬвр. поу. и ЪрЬаеШйш па1апв виЬБр. аифсНуогапз зиЬвр. поу., исправлено и дополнено описание рода БрЬаегоШив.

3. Впервые показана способность представителей рода БрЬаегоШт - БрЬаегоШт псйат зиЬвр. ыфкЦуогсш БиЬвр. поу к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы. Способность к литотрофии индуцируется у большинства штаммов в микроаэробных условиях.

4. Способность к литотрофии у 5'рИаегоШиз пШаж виЬзр. зиЩйЬгогат подтверждена на биохимическом и генетическом уровнях: процесс окисления тиосульфата до сульфатов сопряжен с функционированием электронтранспортной цепи; обнаружены функциональные гены ферментов серного метаболизма, такие как аргВА, яохВ и sqr, кодирующие АФС-редуктазу, тиосульфатрасщепляющий комплекс и сульфид-хинон оксидоредуктазу; показана экспрессия генов аргВА и £<?хВ; обнаружена активность АФС-редуктазы и сульфитоксидоредуктазы.

5. Установлена функциональная роль восстановленных соединений серы у представителей рода БрИаеШИт, позволившая разделить их на две физиологические группы: облигатные органогетеротрофы (БрЪаеговЫя тоЫапих, 8рЬаегой1ив Ырре1, ЗрЬаегойЫ паШпя эиЬэр. пШат) и факультативные литогетеротрофы (БркаегоШих пМапя эгЛэр. ви1А<И\<огапз). У представителей первой и второй группы при органогетеротрофном росте восстановленные соединения серы выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода; у представителей второй группы - 5рЬаегои1ш пШат виЪвр. зиф/Змогапя в

микроаэробных условиях роста соединения серы выполняют роль доноров электронов в энергетическом метаболизме.

6. Предложен сценарий эволюции генов soxB у представителей Sphaerotilus-Leptothrix группы. Предковая бактерия группы Sphaerotilus - Leptothrix обладала способностью к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы, но в процессе дальнейшей эволюции, гены серного метаболизма, и в частности ген soxB, были утеряны у некоторых штаммов Sphaerotilus. В результате литотрофная группа Sphaerotilus - Leptothrix разделилась на две физиологические линии - литотрофные и органотрофные бактерии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Черноусова Е. Ю., В. Н. Акимов, Е. В. Грнднева (Белоусова), Г. А. Дубинина, М. Ю. Грабович. Филогенетический in situ/ex situ анализ микробного сообщества серного мата из термального сульфидного источника Северного Кавказа // Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 2 - С. 255-260.

2. Chernousova Е., Gridneva (Belousova) Е. , Grabovich М., Dubinina G., Akimov V., Rossetti S., Kuever J. Thiothrix caldifontis sp. nov. and Thiothrix lacustris sp. nov., novel gammaproteobacteria isolated from sulfide springs // Int J Syst Evol Microbiol -2009.-V. 59.-P. 3128-3135.

3. Грнднева (Белоусова) E. В., Грабович M. Ю.,. Дубинина Г. А, Черноусова Е. Ю., Акимов В. Н.. Экофизиология представителей рода Sphaerotilus - обитателей термальных сульфидных источников Северного Кавказа // Микробиология - 2009. -Т. 78, №1.-С. 89-97.

4. Chernousova Е. Yu., V. N. Akimov, Е. V. Gridneva (Belousova), G. A. Dubinina, M. Yu. Grabovich. Biodiversity and monitoring of colorless filamentous bacteria in sulfide aquatic systems of North Caucasus region // Микробиология - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 682-687.

5. Gridneva (Belousova) E., Chernousova E., Dubinina G., Akimov V., Kuever J., Detkova E., Grabovich M. Taxonomic investigation of representatives of the genus Sphaerotilus: descriptions of Sphaerotilus montanus sp. nov., Sphaerotilus hippei sp. nov., Sphaerotilus natans subsp. natans subsp. nov. and Sphaerotilus natans subsp. suljidivorans subsp. nov., and an emended description of the genus Sphaerotilus // Int J Syst Evol Microbiol - 2011. - V. 61. - P. 916-925

6. Гриднева (Белоусова) Е. В., М.Ю.Грабович, Е.Ю.Черноусова, В.Н.Акимов, А.М.Лысенко. Обнаружение способности к литотрофному росту с тиосульфатом у органотрофной бактерии рода Sphaerotilus и описание нового вида Sphaerotilus gallus sp.nov. // Материалы II международной молодежной школы - конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва (1-3 ноября). -2006.-С. 56-57.

7. Черноусова Е. Ю., Гриднева (Белоусова) Е. В., Акимов В. Н., Грабович М. Ю., Дубинина Г. А. Эколого-таксономическая характеристика матов бесцветных серобактерий из термальных сульфидных источников Северного Кавказа // Материалы 2-го Байкальского Симпозиума с международным участием. - Иркутск (10-15 сентября). - 2007. - С. 245.

8. Гриднева (Белоусова) Е. В., Черноусова Е. Ю., Грабович М. Ю. Дубинина Г. А., Акимов В. Н. Новый подвид Shaerotilus natans subsp. sulfidivorans, выделенный из термального сульфидного источника Северного Кавказа // Материалы II Всероссийского международным участием конгресса студентов и аспираитов-биологов «Симбиоз Россия». - Пермь (25 - 29 мая). - 2009. - С. 16 - 17.

9. Chernousova Е. Y., Akimov V. N., Gridneva (Belousova) Е. V., Grabovich М. Y., Dubinina G. A. Characterization of the Thiothrix mats in the thermal and low temperature freshwater sulfide systems // 3ndFEMS congress of European microbiologists. - Gothenburg (28 июня - 2 июля). - 2009. - P. 154.

10. Белоусова (Гриднева) E. В., Тутукина М. Н. Метаболитная и экспрессионная регуляция диссимиляционного серного метаболизма бактерий Sphaerotilus natans ssp. sulfidivorans Н Материалы 15-ой международной молодежной конференции «Биология - наука XXI века». - Пущино (18-22 апреля). - 2011. - С. 349.

Статьи № 1 - 5 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 10.11.11. Формат 60*84 '/ц. Усл. псч.л. 1.4. Тираж 110 экз. Заказ 1395.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфпчсского центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоусова, Елена Васильевна, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

04201252504 На пРавахрукописи

БЕЛОУСОВА Елена Васильевна

ТАКСОНОМИЯ И НОВЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОФИЗИОЛОГИИ И МЕТАБОЛИЗМА БАКТЕРИЙ РОДА БРНАЕКОТИШ

03.02.03 - микробиология

I

^ Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент М. Ю. Грабович

Воронеж - 2011 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ SPHAEROTIL US -LEPTOTHRIX 13

1.1.1. Филогения и таксономия 14 1.1.1.1. Проблемы таксономии представителей группы Sphaerotilus- 16 Leptothrix

1.1.2. Фенотипические признаки представителей группы Sphaerotilus- 19 Leptothrix

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА SPHAEROTIL US 22

1.2.1. Экология 22

1.2.2. Морфология и физиология 23

1.2.3. Таксономия 24

1.2.4. Механизм окисления железа бактериями 28

1.3. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ДИССИМИЛЯЦИОННЫЙ СЕРНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ЛИТОТРОФНЫХ ПРОКАРИОТ 31

1.3.1. Окисление сульфида 32

1.3.2. Окисление тиосульфата 33

1.3.2.1. Процесс деградации тиосульфата через политионат 33

1.3.2.2. Мультиферментный комплекс Sox 34 1.3.2.2.3. Распространение генов soxB среди фото- и хемотрофных сероокисляющих бактерий 37

1.3.3. Окисление сульфита 3 8 1.3.3.1 Прямой путь окисления сульфита 39 1.3.3.2. Непрямой путь окисления сульфита через АФС 42

1.3.4. Окисление элементной серы 45

1.3.5. Гипотеза сценария эволюции гена бохВ 47 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 50

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 52

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 52

2.1. Объекты исследования 52

2.2. Состав питательных сред 52

2.3. Микроаэробное культивирование 53

2.4. Методы изучения морфологии и внутриклеточных включений 54

2.5. Получение клеточной суспензии и ферментных препаратов 55

2.6. Методы определения активности ферментов ( 55

2.7. Физико-химические методы анализа 54

2.7.1. Полярографический метод определения Ог 54

2.7.2. Определение хинонов 57

2.7.3. Анализ жирнокислотного состава

2.7.4. Анализ неорганических соединений серы

2.8. Методы молекулярной биологии

2.8.1. Выделение и очистка хромосомной ДНК

2.8.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.8.3. Очистка ПЦР-продуктов

2.8.4. Клонирование генов 16Б рРНК

57

58 58

58

59

60 61

2.8.5. Полимеразная цепная реакция с праймерами к повторяющимся последовательностям (КАРБ-ПЦР) 63

2.8.6. Определение нуклеотидной последовательности генов

2.8.7. Филогенетический анализ

64 64

2.8.8. Выделение суммарной клеточной фракции РНК

2.8.9. Получение кДНК-копий (реакция обратной транскрипции)

2.8.10. Количественная ПЦР (ПЦР в реальном времени)

2.8.11. Определение Г+Ц в ДНК и ДНК-ДНК гибридизация 2.9. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Таксономическая ревизия рода Зркаегойїт

3.1.1. Распространение и физико-химические условия развития представителей рода БрНаегоШиз в природных источниках СевероКавказского региона

3.1.2. Филогенетический анализ микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий

3.1.3. Выделение в чистую культуру штаммов БрИаегоШт Бр.

3.1.4. Морфологические и культуральные характеристики новых штаммов БркаегойЫз Бр.

3.1.5. Пределы температуры и рН новых изолятов рода БркаегойЫз.

3.1.6. Физиолого-биохимические свойства представителей рода БрИаегойІиБ.

3.1.7. Состав жирных кислот клеток штаммов БркаегоШиз Бр.

3.1.8. Анализ внутривидового генетического полиморфизма представителей рода БрИаегоШш, выделенных из микробных сообществ сероводородных биотопов

3.1.9. Генотипические и филогенетические свойства штаммов ЗрЬаегоШт эр.

65

66 67 67

69 69

69

72

75

76 78

80 84

85

3.2. Серный метаболизм представителей рода БркаегоШш

3.2.1. Влияние кислородного режима культивирования и восстановленных соединений серы на рост штаммов БркаегоШт

3.2.1.1. Влияние кислородного режима культивирования на скорость и продукты окисления тиосульфата

3.2.1.2. Влияние концентрации кислорода в среде культивирования на урожай клеток

3.2.1.3. Влияние окисления соединений серы на клеточный урожай

3.2.4. Выявление ферментативных путей окисления восстановленных соединений серы при литотофном росте новых штаммов БрНаегоШиБ

3.2.4.1. Активность ферментов серного метаболизма

3.2.4.2. Связь окисления восстановленных соединений серы штаммом Д-507 с функционированием ЭТЦ

3.2.4.3. Условия миксотрофного и литогетеротрофного роста

3.2.4.4. Молекулярная детекция генов ферментов диссимиляционного серного метаболизма

3.2.4.4.1. Идентификация генов диссимиляционного серного метаболизма

3.2.4.4.2. Экспрессия генов бохВ и аргА

3.2.5. Функциональная роль и механизм окисления тиосульфата при органогетеротрофном росте представителей рода БрИаегоШш

3.2.6. Гипотеза сценария эволюции гена бохВ у представителей группы ЬерШкпх- БркаегоШт

97

97

97

100 101

102 102

104

105

107

107 111

112

114

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 123

выводы

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ источников ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК — активные формы кислорода

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленная форма)

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленная форма)

ОТ-ПЦР — обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

ПААГ — полиакриламидный гель

ПВК - пировиноградная кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦТК — цикл трикарбоновых кислот

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)

ССР - карбонилцианидфенилгидразон

СССР - карбонилцианид- м- хлорофенилгидразон

DEPC — диэтилпирокарбонат (ДЭПК)

HQNO - 2-н-гептил-4-гидроксихинолин -N-оксид

IPTG — Изопропил-бета—¿>-тиогалактозид

LB — (lysogeny broth) — лизогенный бульон, комплексная питательная среда для культивирования бактерий

RAPD - (Randomly amplified polymorphic DNA) - метод, основанный на амплификации ДНК с произвольными праймерами

SOC - (Super Optimal Broth for catabolite repression) — жидкая питательная среда для выращивания бактериальных клеток SDS - додецилсульфат натрия ТЕ - трис/ЕДТА буфер

Tris — (гидроксиметил)трисаминометан (Трис)

X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-£>-галактопиранозид

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

К роду Sphaerotilus, входящему в состав, класса Betaproteobacteria (Kämpfer, 2005), относятся? нитчатые органогетеротрофные аэробные бактерии. Они распространенны е основном в проточных системах, сточных водах, активных илах и являются космополитами (Eikelboom, 1975; Muldèr, 1964; Stokes, 1954). Обильный рост Sphaerotilus является причиной технологических проблем, таких как засорение труб и вспучивание активного ила в очистных сооружениях (Doridero, 1961; Dondero, 1975; Richard et al., 1985). Довольно хороший рост представителей рода Sphaerotilus при низких концентрациях кислорода (Dias et: al., 1968) и их способность утилизировать широкий спектр органических" источников? углерода способствует их доминированию^ в таких местообитаниях как активный ил' очистных , сооружений и позволяет использовать их для очистки: сточных вод от оранических загрязнителей (Richard et al., 1985; Stokes, 195.4).

В таксономическом и физиологическом отношениях многочисленные изоляты Sphaerotilus, выделенные из различных географических регионов, и разных экосистем;;исследованы достаточно детально и представляют группу штаммов,, объединенных в единственный' вид Sphaerotilus natans (Kâmpfér, Spring, 2005);

Новые биотопы; в которых ранее не были обнаружены представители рода Sphaerotilus, такие как природные сероводородные^ источник» Северного Кавказа, характеризуются уникальным набором? условий окружающей среды (наличие органического субстрата, умеренно высокие температуры, постоянны» приток сероводорода), что способствуют развитию; обрастаний нитчатых микроорганизмов. Возможно, поиск новых видов рода Sphaerotilus с новыми свойствами может увенчаться успехом при исследовании таких местообитаний. В последнее время накопилось много данных, свидетельствующих о фенотипической и филогенетической гетерогенности многочисленных штаммов Sphaerotilus natans, а, следовательно, назрел вопрос отаксономической ревизии* рода Sphaerotilus.

Настоящее исследование представляет собой полифазный анализ и таксономическую ревизию нитчатых бактерий рода БркаегоШиБ ранее объединенных в единственный вид - Я. паШпБ, а также новых представителей этого рода и исследование особенностей их серного метаболизма.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было проведение комплексного таксономического и физиолого-биохимического анализа группы штаммов, ранее объединенных в единственный вид рода БркаегоШиБ - 5". пШат, а также новых представителей этого рода и исследование особенностей их серного метаболизма.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав нитчатых структурообразующих компонентов микробных сообществ природных умеренно-термальных сероводородных источников Северного Кавказа.

2. Выделить чистые культуры нитчатых сероокисляющих бактерий из микробных сообществ и определить их таксономическое положение на основе полифазного анализа с применением нескольких филогенетических маркеров.

3. Оценить и проверить на биохимическом и генетическом уровнях способность представителей рода БрИаегоШш, обитающих в сероводородных источниках, к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы.

4. Определить функциональную роль восстановленных соединений серы в метаболизме представителей рода БрИавгоШт.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Представители рода БрИавгоШиБ наряду с представителями рода ТМоШпх являются доминирующим структурообразующим компонентом микробных сообществ нитчатых сероокисляющих бактерий в природных умеренно-термальных сульфидных источниках Северо-Кавказского региона.

2. Выделение новых представителей рода БркаегоШш, изучение их и уже известных штаммов с применением нескольких филогенетических

маркеров наряду с традиционными методами полифазного анализа позволяет описать новые виды и подвиды рода ЗркаегоШиз.

3. Представители рода ЗркаегоШт - ЗркаегоШш пМат эиЬзр. би^снуогапб эиЬзр. поу. способны к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы.

4. Род БркаегоШш представлен двумя физиологическими группами, которые различаются по функциональной роли восстановленных соединений серы в их метаболизме.

Научная новизна и значимость работы.

В работе показано широкое распростанение представителей рода БкраегоШиБ в природных сероводородных источниках Северного Кавказа, из которых выделено в чистую культуру 7 штаммов. Проведена таксономическая ревизия новых и известных штаммов рода БркаегоШш, который ранее был представлен единственным видом - 5". пШат. Описаны 2 новых вида -ЗркаегоШт тоЫстт эр. поу. и ЭркаегоШт Ырре1 эр. поу., а в рамках вида 5. пШапБ описано 2 подвида - БрНаегоШт пШат БиЬзр. пШат эиЬзр. поу. и вркаегоШиБ пШат БиЬБр. БиЩсИчогат БиЬзр. поу. Расширены представления о типах метаболизма данных бактерий. Показано, что штаммы подвида 5". пШат БиЬэр. Би1/гсЦуогапБ эиБэр. поу. способны как к органогетеротрофному, так и к литогетеротрофному росту, при котором восстановленные соединения серы являются донором электронов для энергетического метаболизма. Способность к литотрофии у штаммов 5". пШат зиЬэр. БифсЦуогат подтверждена на биохимическом и генетическом уровнях. В присутствии сероводорода, как и типичные представители физиологической группы бесцветных серобактерий, представители 5". пШат БиЬБр. эЫАсИчогат БиЬБр: поу. накапливают ( внутриклеточно включения элементной серы. Для подавляющего числа

1 штаммов 5". пШат БиЬзр. йи^сНуогат эиЬзр. поу. в присутствии тиосульфата

переход к литотрофному росту определяется кислородным режимом культивирования - литотрофный рост индуцируется в микроаэробных условиях. Среди исследованных представителей рода БркаегоШиБ выявлены две физиологические группы с двумя разными механизмами окисления восстановленных соединений серы: облигатные органогетеротрофы

(представители S. montanus, S. hippie и S. natans subsp. natans) и факультативные литотрофы (S. natans subsp. sulfidivorans). У представителей первой и второй группы при органогетеротрофном росте восстановленные соединения серы выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода; у представителей второй группы — S. natans subsp. sulfidivorans в микроаэробных условиях роста соединения серы выполняют роль доноров электронов в энергетическом метаболизме.

Практическая значимость.

Результаты исследований расширяют фундаментальные знания о разнообразии мест обитания представителей рода Sphaerotilus и физиолого-биохимических механизмах регуляции их метаболизма; позволяют оценить их функциональную роль в природных сообществах, вклад в круговорот углерода и серы в природе.

Учитывая эколого-физиологические особенности новых штаммов, их можно использовать для очистки водных экосистем не только от органических веществ, но и от токсичных соединений серы.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на международных и российских конференциях:

1. Международной молодежной школе - конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006).

2. 2-ом Международном байкальском симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007).

3. Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009).

4. 3ndFEMS congress of European microbiologists (Sweden, 2009).

5. Международной молодежной школе - конференции «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2011).

Публикации.

Материалы диссертации содержатся в 10 печатных работах: 5 экспериментальных статьях и 5 тезисах. Статьи, опубликованные по теме диссертации, состоят в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 153 страницах, включает 17 таблиц, 30 рисунков, список литературы из 204 наименований, из них 20 на русском и 184 на английском языке.

Место проведения работы и благодарности.

Работа была выполнена на кафедре биохимии и физиологии клетки Воронежского государственного университета под руководством д.б.н. Грабович М.Ю.

Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Черноусовой Е. Ю., к.б.н. Акимову В. Н., к.б.н. Тутукиной М. Н., к.б.н. Детковой E.H., д.б.н. Осипову Г. А., за помощь на отдельных этапах работы.

Работа была выполнена при финансировании в рамках грантов РФФИ № 05-04—48229а, № 06-04-63105к, 09-04-00799а, 09-04-10072к, 10-04-100179k, ФЦП № 14.740.11.0730

Автор выражает особую благодарность д.б.н. Грабович М. Ю. и д.б.н. Дубининой Г. А. за помощь в формулировании положений диссертации, полезные советы и поддержку на всех этапах работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ SPHAEROTILUS -LEPTOTHRIX

Представители родов Sphaerotilus и Leptothrix являются одними из первых бактерий, описания которых были опубликованы. Эти ранние публикации были связаны с наблюдениями охристых отложений хорошо видимых невооруженным глазом в стоячих и медленнотекущих водах (Cohn, 1875; Lackey, Wattie, 1940; Linde, 1913; Kützing, 1833; Stokes, 1954; Zikes 1915). Микроскопические наблюдения этих агрегаций привели к открытию нитчатых микроорганизмов, которые способны к накоплению железа или железо-марганцевых оксидов в слизистом матриксе.

Дальнейшие исследования группы Sphaerotilus - Leptothrix были связаны с их потенциальной экономической значимостью. Обильное разрастание этих микроорганизмов в индустриальных водах вело к технологическим проблемам, таким как засорение систем водоснабжения или вспучиванию активного ила (Dondero, 1975). Недавно было показано участие бактерий Leptothrix в коррозии стали (Olesen et al., 2000; Rao et al., 2000). С другой стороны, потенциальная польза этих микроорганизмов заключается в очистке сточных вод от тяжелых металлов и органических веществ, что неоднократно обсуждалось разными авторами (Nelson et al., 1999; Solisio et al., 2000).

Оба рода, Leptothrix и Sphaerotilus, всегда рассматривались как близкородственные в связи со сходством некоторых характерных морфологических признаков (Mulder, van Veen, 1963). Позднее, их родство подтвердилось филогенетическими и фенотипическими данными. Характерными чертами, которые отделяют данную группу от других филогенетически близких родов, являются способность формировать трубчатый чехол и накапливать в нем значительные количества оксидов железа и марганца.

; ■:■■.'-■■'.;.■'..• ,■:■■. - •'■•■'.• ■ -'и:-:,

1;1.1.,Филогения и таксономия

Члены родовБрНаегоШт. и; ЬерШкгЪс входят в филогенетический кластер класса .р-Рго1еоЬа&епа. Уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК представительных штаммов группы 8рИаегоМ1ш-/.,ерШИпх колеблется между 96,3 и 99,8 % (РеПейпп е1 а1., 1999); Представители таксонов АциаЬаМег'шт, ШеопеИа, ЛтлЬпумах, ЯозеМе^, Агокуйготопаз и РеЬтопая являются , филогенетически оч�