Биология нового неассоциативного факультативно литотрофного представителя рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov.

Лавриненко, Ксения Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биология нового неассоциативного факультативно литотрофного представителя рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov.
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биология нового неассоциативного факультативно литотрофного представителя рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov."

На правах рукописи

Лавриненко Ксения Сергеевна

БИОЛОГИЯ НОВОГО НЕАССОЦИАТИВНОГО ФАКУЛЬТАТИВНО ЛИТОТРОФНОГО ПРЕДСТАВИТЕЛЯ РОДА АгояртИит - АгоьртНит ЛюрШит «р. пох.

Специальность 03.02,03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-1 ДЕК 2011

САРАТОВ -2011

005003350

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Грабович Маргарита Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Антонюк Людмила Петровна

Ведущая организация:

кандидат биологических наук Кравченко Ирина Константиновна

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина (г. Пущино)

Защита состоится «14» декабря 2011 года в 13 часов на заседании диссертационно совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиасте 13).

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российскс

Федерации и на сайте ИБФРМ РАН:

http://ibppm.ru/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан « ^ ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета —-—~

доктор биологических наук, профессор В.Е.Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Представители рода Azospirillum относятся к ассоциативным этфиксаторам. Они, как правило, ассоциированы с различными почвами, с корневой стемой диких травянистых растений, кормовых трав, злаков (Игнатов, 1998), за ключением A. largimobile, обитающего в водных биотопах (Dekhil et al., 1997; Sly, ickcbrandt, 1999). Azospirillum могут быть полезны в технологии выращивания льскохозяйственных культур, а также в качестве модельного объекта для изучения социативных отношений между растениями и микроорганизмами.

Преимущественно представители рода Azospirillum имеют органогетеротрофный п метаболизма, хотя известно, что некоторые штаммы A. lipoferum способны к водород зависимому автотрофному росту, что не исключает способности к литотрофии у угих видов этого рода в присутствии Н2, восстановленных соединений серы и др.

На момент написания диссертации род Azospirillum представлен пятнадцатью дами, и данные о видовом составе рода с каждым годом пополняются. Так за 'Следние 5 лет описано 8 новых видов. В последние годы было показано, что 1едставители рода Azospirillum (Del Gallo, 1994) имеют различное географическое юисхождение и способны занимать разнообразные экологические ниши. ,'Шествование Azospirillum в различных климатических поясах, сложных гетерогенных ловиях почвы, смена мест обитания (почва - ризосфера - растение) требуют от ктерий высокой приспособляемости к постоянно меняющимся условиям обитания, бкости метаболизма.

Изучение биоразнообразия представителей рода Azospirillum и изучение южественных метаболических путей, обеспечивающих адаптацию бактерий в равновесных условиях среды, имеет важное значение, так как позволяет понять «чину господствующего положения бактерий в ряде микробных сообществ и их роли в охимических циклах углерода, азота и т.д.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось изучение фенотипических и генетических рактсристик нового представителя рода Azospirillum, определение его ксономической принадлежности и изучение особенностей углеродного и серного ¡таболизма.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Из умеренно термального сероводородного источника выделить чистую культуру нового представителя азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum.

2. Определить филогенетическое и таксономическое положение нового штамма BV-ST.

3. Выявить функциональную роль восстановленных соединений серы в метаболизме и механизм их окисления: определить активность ферментов,

участвующих в процессах превращения соединений серы, проверить нали1 ряда генов, кодирующих ферменты серного метаболизма, и определ! уровень их экспрессии в аэробных и микроаэробных условиях.

4. Установить связь окисления восстановленных соединений серы функционированием ЭТЦ.

5. Выделить и получить высокоочищенный препарат МДГ из исследуем бактерий, изучить структурно-функциональные измене! малатдегидрогеназы у АгозртИит ШорЫ1ит в зависимости от типа питания.

Научная новизна и значимость работы. Используя современные мето, полифазной таксономии, изучено филогенетическое и таксономическое положен нового представителя рода АгоэртИит. Анализ последовательности 16Б рРНК позвол отнести выделенный штамм к А1ркарго1еоЬас1епа, который был охарактеризован I новый вид азотфиксирующих бактерий, АгозртИит - АгоэртШт МоркПит sp.ni ВУ-Б1. Впервые для представителей рода АгохртИит, в частности для А. МорЫЬ зр.поу., в микроаэробных условиях показана способность к литотрофному росту присутствии восстановленных соединений серы. Показано, что в присутств тиосульфата переход от органотрофного роста к литотрофному возможен только микроаэробных условиях культивирования.

В ходе проведенной работы удалось показать структурно-функциональн: изменения малатдегидрогеназы у АгоярМиит МорИИит в зависимости от типа питан] МДГ, полученная из А. МорЫЫт при органотрофном и литотрофном рос представлена как димером, участвующим в работе ЦТК, так и тетрамерс функционирующим в глиоксилатном цикле. При органотрофном росте доминирующ формой является димер, поддерживающий энергетический метаболизм, а п литотрофном - тетрамер, поддерживающий конструктивный метаболизм. Поскольку АгояртЫит МорЫЫт при литотрофном росте снижается доля димерной формы участвующей в энергетическом метаболизме, то можно предположить, что значительн часть энергии поставляется в клетку за счет диссимиляционного процесса окислен восстановленных соединений серы.

Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современн] представления о бисразнообразии бактерий. Изучение множественных метаболическ: путей, обеспечивающих адаптацию бактерий в неравновесных условиях среды, име большое значение, так как позволяет выяснить функциональную роль окислен соединений серы и понять причину господствующего положения бактерий в ря микробных сообществ и их роли в геохимических циклах азота, углерода, серы.

Практическая значимость работы. Результаты исследований расширя1 фундаментальные представления о разнообразии бактерий и о физиолог биохимических механизмах регуляции их метаболизма; позволяют с новых позиц] подойти к изучению их функциональной роли в природных сообществах. Полученные

1боте результаты могут быть использованы в соответствующих разделах учебных >собий по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по исгериологии.

Полученные высокоочищенные препараты малатдегидрогеназы могут быть ¡пользованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением грментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, а также как ферментные эепараты в качестве модельного образца для других методов исследования, рикладные аспекты изучения сероокисляющих азотфиксаторов - Azospirillum iophilum определяются возможностью их использования в районах, обедненных отом, но обогащенных сероводородом, таких как рисовые плантации и т. д.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на международных и >ссийских конференциях:

1. Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009).

2. Международной молодежной школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009).

3. Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011).

4. Международной молодежной школе - конференции «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2011).

Публикации. Материалы диссертации содержатся в 9 печатных работах: экспериментальных статьях и 4 публикациях материалов конференций. бъем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и гтодов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка ¡пользованной литературы и приложения. Работа изложена на 132 страницах, шючает 15 таблиц, 22 рисунка, а также 1 страницу приложения, список литературы из )7 наименований, из них 84 на русском и 123 на английском языке.

Гесто проведения работы. Работа проведена на кафедре биохимии и физиологии 1етки биолого-почвенного факультета ФГБОУВПО Воронежского государственного шверситета при участии студентов, аспирантов. Ряд работ выполнены совместно с б.н. Лысенко A.M. (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН), д.б.н. сиповым Г.А. (академическая группа Академика РАМН Ю.Ф.Исакопа).

Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам и друзьям, отнимавшим участие на разных этапах работы.

Работа была выполнена при финансировании в рамках грантов РФФИ № 05-04-5229а, № 06-04-63105к, № 09 - 04 - 00799а, № 09 - 04 - 10072к.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., проф. -»абович М.Ю. за содействие в работе и помощь при обсуждении результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе полифазного анализа изолят из сульфидного источника отнесен неассоциативному виду рода Azospirillum - A.thiophilum sp.nov.

2. Azospirillum thiophilum sp. nov. в микроаэробных условиях культивирован способен к литотрофному росту в присутствии тиосульфата.

3. A. thiophilum при литотрофном росте окисляет тиосульфат при участии 2-ферментных систем: тиосульфатдегидрогеназы и тиосульфатокисляюще ферментного SOX комплекса.

4. В зависимости от типа питания в клетке A. thiophilum происходят адаптационн структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Объектом исследования служил штамм BV-ST, выделенный микробного сообщества, обнаруженного в умеренно-термальном сульфидном источил «Бесстыжие ванны», расположенном в северных отрогах Главного Кавказского хребта Пятигорска Ставропольского края. Также для ряда сравнительных харакгерист использовались филогенетически близкие бактерии рода Azospirillum: Azospirillum picis DS 19922Azospirillum lipoferum ATCC 29707T, Azospirillum doebereinerae DSM 13131T.

Состав питательных сред. Для выделения и культивирования штамма BV-использовали видоизмененную полужидкую среду PSS следующего состава: (NH^SC^ 1,0 г/л, СаСЬ • 2НгО- 0,03 г/л, MgSOWI^O -1,0 г/л, тиосульфат натрия - 1г/л, сукцинат натр - 1,0 г/л, пептон - 2,0 г/л, дистиллированная вода - 1л, агар - 1,7 г/л с добавлением суспенз: FeS (Caraway, Krieg, 1974). Перед посевом во все питательные среды вносили раств микроэлементов и витаминов - 1,0 х 10'3 (г/л) (Pfennig, 1966). pH среды перед посев! доводили до 7,5 - 7,8. При микроаэробном культивировании соотношение объемов жидкой газовой фаз во флаконах составляло 1:10 и концентрация кислорода в газовой фазе составля 5%.

Изучение (Ьенотнпическнх. хсматаксоиомнческих свойств чистых культ бесцветных серобактерий проводили с помощью стандартных методов, используемых микробиологической практике.

Анализ неорганических соединений серы. Сероводород определяли колориметричеа с использованием диметил-п-фенилендиамина. Раздельное определение S2O32", S4062", S3O6 при их совместном присутствии в среде проводили методом раздельного йодометрическо титрования (Резников и др., 1970). Содержание SO42" определяли хлоранилатным методе (Уильяме, 1982). Элементную серу определяли по методу Морриса (Morris et al., 194 колориметрически на СФ-26.

Метод ацетилен-редукции. Способность бактерий к азотфиксации проверяли ;етиленовым методом (Stewart et al., 1968).

Методы определения растворенного кислорода. Для определения потребления [слорода суспензией клеток использовали полярографический метод при помощи закрытого ектрода Кларка и регистрировали на полярографе «Рекорд-4» (совместное производство (статута биофизики РАН и СКВ, Пущино).

Получение ферментных препаратов. Суспензию клеток, клеточные экстракты эмогенат), супернатант (цитоплазматическую фракцию) получали как описано ранее рабович и др., 1998; Grabovich et al, 1999).

Методы определения активности ферментов. Активность ферментов серного гтаболизма и ферментов ЦТК определяли в супернатанте или гомогенате :ектрофотометрическими методами, как описано ранее (Грабович и др., 1998).

Определение белка. Белок клеточной биомассы определяли методом Лоури (Lowry et 1951).

Очистка и изучение свойств МДГ. Высокоочшценные препараты МДГ получали гласно схеме очистки, включающей следующие стадии: получение экстракта фермента, ¡акционирование сульфатом аммония (40-70 %), гель-фильтрацию на колонке с сефадексом 25 (Pharmacia, Швеция), ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, пь-хроматографию на колонке с сефадексом G-150 (Pharmacia, Швеция). Для определения мо-кулярной массы нативной малатдегидрогеназы использовали гель-хроматографию через фадекс G-150 (Остерман, 1983).

Выделение н очистка хромосомной ДНК. Для экстракции ДНК из чистых культур роокисляющих бактерий использовали модификацию метода (Ausubel et al., 1994) с полнительными этапами быстро чередующихся циклов замораживания и оттаивания (Bej et , 1991).

Полнмеразная цепная реакция (ПНР). Амплификация генов 16S рРНК и nifil (Fe-лок нитрогеназы) была проведена на приборе GeneAmp PCR System 2700 («Applied osystems», США).

Очистка ПНР-продуктов проводилась при помощи ферментов экзонуклеазы I Е. coli Fermentas», Литва) и креветочной щелочной фосфатазы («Promega», США).

Определение чуклеотндной последовательности генов 16S рРНК. nifíi, soxB вводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США) в ответствии с протоколом, предлагаемым фирмой.

Филогенетический анализ. Для нахождения близкородственных организмов клеотидные последовательности генов 16S рРНК и nifli сравнивали с последовательностями вестных штаммов в базе данных NCBI. Последовательности были выровнены с этветствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы CLUSTAL (Thompson et al., 1997). Филогенетические деревья были построены с помощью программы LEECON (Van de Peer, De Wächter, 1994).

Определение Г+Ц в ДНК и ДНК-ДНК гибридизация. Содержание Г+Ц в Д1 определяли по кривым термической денатурации на спектрофотометре «Pye Unicum SP 1800> рассчитывали по формуле Оуэна (Owen, Lapage, 1976), реассоциацию ДНК-ДНК изуча методом оптической реассоциации (De Ley etal., 1970).

Выделение суммарной клеточной фракции РНК. Суммарную клеточную РЬ выделяли методом фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski Р., 1987) с неболыпи! модификациями.

Качественный анализ препаратов РНК проводили путём денатурирующе электрофореза - 4 % ПААГ в присутствии 8М мочевины или же в 1 % агарозном геле добавлением формальдегида при напряжённости электрического поля 7 В/см. Окрашивая гелей осуществляли с помощью бромистого этидия. Визуализацию результатов осущесгвля на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете с длиной волны 254 нм.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием обрати транскриптазы M-MuLV (Fermentas, Литва).

ПНР в реальном времени проводили на приборе ДТ-322 (ДНК-Технология, Россия) использованием интеркалирующего в двухцепочечную ДНК красителя SYBR Green (Invitrogen, США). Первичный анализ сходства полученных нуклеотиди последовательностей генов проводили с помощью программ BLAST, ClustalW2 и TCofl (http://b1ast.ncbi.nlm.nih.goV/Blast.ca.htto://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/.htto://www.ebi.ac.u Tools/msa/clustalw2/V Количественный анализ уровня экспрессии генов проводили при помо1 программы q_PCR (ДНК-Технология). Относительное количество синтезированн] ампликонов рассчитывали по формуле 24Ct.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика нового вида рода Azospirillum

Штамм BV-ST, исследуемый в работе, был выделен из умеренно-термально сероводородного источника «Бесстыжие ванны», расположенного в г. Пятигорс Ставропольского края, характерной особенностью которого была слабая минерализац источников (1,4-1,6 г/см2), температура воды 28 - 35 °С, слабощелочная pH среды (7,1 концентрация S/S2' - 1,5-2 мг/л, концентрация кислорода - 2-2,5 мг/л. Штамм BV-Î обитающий в водных биотопах, не ассоциирован с растениями, хотя большинст представителей рода Azospirillum преимущественно локализованы в ризосфере.

1.1. Фенотипические характеристики штамма BV-ST Морфология. Клетки изолята BV-ST подвижны, спиральной формы, с длин< 3,6-7,0 мкм и шириной 1,1-2,0 мкм. В природных сероводородных биотопах бактер) способны к накоплению серных глобул внутри клеток (рис. 1). На богатых сред; содержащих 3 г/л органических веществ, в клетках, особенно при длительш

культивировании, обильно накапливаются включения липидов в виде гранул поли-/?-щроксибутирата.

ЦЯ НИ

Рис. 1. Морфология штамма ВУ-в7

А - клетки с включениями элементной серы; В - цисты; С - клетки спиралевидной формы на полужидкой среде; Б - полиморфизм клеток: 1 - спириллы, 2 - клетки в начале этапа цистообразования, 3 - сформировавшиеся цисты. Масштаб 10 мкм.

Физиолого-биохимические свойства. Из испытанных органических соединений истерии способны использовать широкий спектр органических веществ в качестве источника углерода (табл.1). Результаты изучения физиолого-биохимических свойств >едставлены в таблице 2.

Таблица!. Использование источников углерода штаммом ВУ-8Т

Органические кислоты: Изобутанол + Глутамат +

Ацетат + Глицерол + Аспартат -

Сукцинат + Пропанол + Серии +

Малат + Сахароспирты: Цистеии -

Фумарат - Маннитол + Цистин -

Оксалат + Сорбитол + Лизин -

Оксалоацетат + Инозит - Триптофан -

Цитрат + Сахара: Алании +*

Изоцитрат + Глюкоза + Гистидин +*

2-оксоглутарат + Галактоза - Фенилаланин -

Лактат + Арабиноза + Метионин -

Формиат + Раффиноза - Аспарагин +

Бензоат - Сахароза - Тирозин +*

Салицилат - Мальтоза + Пролин +

ПВК + Лактоза - Орнитин -

Аконитат - Фруктоза + Лейцин +*

Малонат - Сорбоза + Изолейцин +

Глиоксилат +* Манноза - Глутамин +

Гликолат - Ксилоза - Полимерные соединения:

Спирты: Рамноза - Пептон +

Этанол + Трегалоза - Гидролизат козеина +

Бутанол + Аминокислоты: Дрожжевой экстракт +

Примечание: "+" наличие роста; " -" отсутствие роста; * слабый рост

Таблица 2. Физиолого-биохимические свойства нового изолята BV-ST

Тест BV-ST

Каталазная активность +

Оксидазная активность +

Образование Нгв при росте на тиосульфате -

Образование Н28 при росте на цистеине -

Гидролиз казеина -

Гидролиз крахмала +

Разжижение желатина -

Образование индола -

Ассимиляционная редукция N03" с накоплением N02 +

Анаэробный рост с N0^ -

Кислая реакция на сахара -

Пигменты при росте на ароматических аминокислотах -

Рост с 3 % №С1 +

Накопление в" на среде с сульфидами +

Окраска по Граму -

Анаэробный рост с фумаратом -

Уреаза +

Пределы рН роста 6,2-8,8

Температурные пределы роста, "С 5-42

Фиксация молекулярного азота. Штамм BV-ST способен к росту на среде, содержащей источники азота. Способность штамма к азотфиксации проверя ацетиленовым методом (Stewart et al., 1968). Для этого штамм BV-ST выращивался хангейтах на безазотистой среде, содержащей сукцинат в микроаэробных условиях (2 кислорода в жидкой фазе) до середины экспоненциальной фазы. Редукция ацетиле: составила от 1000 до 2000 нмоль этилена/час (мг белка). Для оценки способное штамма BV-ST к азотфиксации была проведена амплификация гена nifli со следуюгцм праймерами: Fl (5'- TAYGGIAARGGIAARGGIGGIATIGGIAARTC- 3') + nifH-Ъх (: TTGTTGGCIGCRTASAKIGCCATT- 3'). По результатам полимеразной цепной реакц (ПЦР) был получен ПЦР - продукт гена nifli длиной 480 п. н. (рис. 2), что позволя утверждать, что штамм BV-ST способен к азотфиксации.

Рис. 2. Выявление функционального гена nifli у штамма BV-ST

Дорожка 1 - ПЦР с ДНК штамма BV-ST; дорожка 2 - ПЦР с ДНК культуры, 500 Ьр для которой ранее была отмечена

способность к азотфиксации; дорожка 3 -контрольная ПЦР без ДНК - матрицы; дорожка 4 - маркер длины фрагментов ДНК.

Состав жирных кислот. Жирнокислотные профили штамма ВУ-!_ представлены в таблице 3. В жирнокислотном составе клеток доминируют додекаповн (12:0), гексадекановые (16:0) и октадеценовые (18:1) жирные кислоты.

¡следованного штамма спирилл были обнаружены 2 и 3-гидрокси жирные кислоты: кОЗОН, 15:(Нбо20Н, 16:0 ЗОН, 18:1 20Н.

Таблица 3. Состав жирных кислот у штамма ВУ-Б1 н близкородственных видов рода АгоьртИит

Жирные кислоты 1 2 3 4 Жирные кислоты 1 2 3 4

С14:0 сл.к - сл.к 0,68 С18:1ш7с 59,28 37,51 54,43 76,37

С16:1ш9с - - 1,45 - С18:0 0,83 5,32 2,09

С16:1ш9 - - - сл.к С19:0сус 0,93 - сл.к 2,67

С16:1со7с 17,56 2,6 7,8 3,92 С19:0 - - - СЛ.К

C16:l(o7t - - - сл.к С14Ю2-ОН - - - сл.к

С16:1ш5 - - сл.к С14:0 3-ОН 4,5 22,78 6,76 сл.к

С16:0 9,62 5,07 12,06 6,66 С16:0 3-ОН 0,84 - 2,45 -

С 17:0сус. - - - сл.к С18.03-ОН сл.к 2,69 сл.к сл.к

С17:0 - - - сл.к 115 - - - сл.к

С18:2 - - 3,31 С15:0 - - - сл.к

С18:2шб - сл.к С11Ме18:1 сл.к - . -

С18:1ш9 0,77 - 0,59 1,17 C18:l 20Н 4,81 24,03 9,12 1,86

C18:l(ö7t - - - сл.к C19:l 20Н - - 0,95 1,77

К18:2 - - сл.к -

Штамм BV-ST; 2. А. lipoferum АТСС297071; 3. А. doebereinerae DSM 1313Г; Л. А. picis ММЮ TAR-37. (став приведен в % от суммарного количества выявленных жирных кислот. -, не обнаружено; сл.к., едовые количества (менее 0,5 %)

1.2. Филогенетический и генотипический анализ штамма ВУ-8Т

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК жазал, что исследуемый штамм относится к классу А\phaproteobacteria и наиболее [изок к Агозрт11ит <1оеЬегеигегае и Аго$рггШит Про/егит. Уровень сходства ■клеотидных последовательностей гена ВУ-8Т и АгозртИит йоеЪегетегае составил ',7 %, а между ВУ-8Т и АгозртИит Про/егит - 97,4 %. Различия в 3-4 % по 168 рРНК :азывают на межвидовое родство между исследуемыми бактериями. На 1лоюистичсском дереве, построенном на основе анализа гена 168 рРНК, штамм ВУ-БТ ¡разует отдельный кластер с АгоярггШит (¡оеЬегеигегае (рис. 3).

0.02

100 86

Azospírillum zeae (dq682470) Azospírillum oryzae (ab185396) Azospírillum hrgomobik (x90759) Azospírillum melmis (dq022958)

53 -Azospírillum lipoferum (z29619)

^ 90-Azospírillum doebertmerae (aj238567)

~ i_bv-s (eu 678791)

_Axtspirillm pícís (am922283)

_Azospírillum brasiUnse (x79739)

Azospírillum nigosum (am419042)

_Azospírillum canadense (dq393891)

-Azospírillum halopraeferens (x7973i)

-Azospírillum amazonense (Z29616)

-Azospírillum irakense (x79737)

— Pkieospirilhtmfuhvm (d14433)

.-Azorhtobium caulinodans (x67221)

_GlucoMcctobacterdiazotrophlcus (x75618)

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе 16S рДНК

Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью "bootstrap" - анализа. Масшт представляет собой эволюционное расстояние (соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 1 нуклеотидов). В качестве «внешней группы» использована последовательность Rhodospirillum rubrum.

Для представителей рода Azospirillum сравнение генотипических характерист часто осуществляют не только с использованием традиционного анализа первичн структуры генов 16S рРНК, но и на основании филогенетического анали нуклеотидных последовательностей гена rtiflí (Peng et al., 2006; Mehnaz et al., 2007a, Lin et al., 2011). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена ni был проведен между наиболее филогенетически близкими видами рода Azospirillum.

Частичный сиквенс гена nifli штаммов BV-ST, A. doebereinerae DSM 13131т A. picis IMMIB TAR-37 был получен с использованием двух пар праймеров, Fl (

TAYGGIAARGGIAARGGIGGIATIGGIAARTC-3') + nifli-Ът (5- TTGTTGGCIGCRTASAKIGCCATT- 3'), nifll-vam (5' - GCIWTITAYGGIAARGGIGG - 3') + R6 (5' - GCCATCATYTCICCIGA - 3'), СОГЛЭС протоколу Федорова и Марусиной (Fedorov et al., 2008; Marusiña et al., 2001).

ПЦР-продукты были получены для штаммов BV-ST и A. doebereinerae DS 13131Т. Однако, для штамма А. picis IMMIB TAR-3T продукта амплификации с данныл праймерами получить не удалось. Вероятно, праймеры Fl, nifli-Ът, nifH-mñv и R6 имен некоторые несоответсвия в 3' регионе гена ni/H А. picis IMMIB TAR-3T. ПЦР продукт] полученные для штаммов BV-ST и А. doebereinerae DSM 131317, были очищены секвенированы. Нуклеотидные последовательности гена nifH А. lipoferum АТСС 2970 и других известных видов рода были получены из GenBank (NCE http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Согласно анализу нуклеотидных последовательностей reí nifli штамм BV-ST наиболее близок к A. doebereinerae DSM 13131т (96,8 %). Сходст)

нуклеотидных последовательностей данного гена штамма BV-ST с другими редставителями рода Azospirillum составил от 96,7 до 94,5 %.

ДНК-ДНК гибридизация проводилась между штаммами BV-ST, A.doebereinerae ISM 13131т, A. picis IMMIB TAR-3T и A. lipoferum ATCC 29707T. Гомология ДНК ггамма BV-ST с A. doebereinerae DSM 13131T, A. picis IMMIB TAR-37 и A. lipoferum .ТСС 29707х составила 47, 50 и 42 %, соответственно. Эти значения существенно ниже О % - критерия, который считается пороговым для видового уровня (Wayne et al., 1987).

Молярный процент Г+Ц в ДНК для штамма BV-ST составил 67 %, что ^ответствует диапазону значений Г+Ц в ДНК для рода Azospirillum (64-71 mol %) dehnaz et al., 2007a; Mehnaz et al., 2007b; Young et al., 2008 and Lin et al., 2009).

Анализ проведенных фенотипических исследований позволил выявить ряд гличий штамма BV-S7 от типовых штаммов A. doebereinerae и A. lipoferum. олученные данные и данные других авторов статей по Azospirillum отражены в табл. 4.

Таким образом, результаты и анализ полифазного исследования, включающие орфологические, хемотаксономические и филогенетические исследования признаков, изиологических и биохимических различий, позволяют заключить, что штамм BV-ST эедставляет собой новый таксон видового уровня в составе рода Azospirillum, для )торого предлагается название Azospirillum thiophilum sp. nov.

Диагноз вида Azospirillum thiophilum sp. nov. Azospirillum thiophilum sp. nov. -юбодноживущий диазотрофный представитель рода Azospirillum, обитающий в ,(ерешю-термальном сероводородном источнике. Клетки грамотрицательные, едвижные, спиральной формы (3,6x7,0 - 1,1x2,0 мкм). При росте на среде с щьфидами, а также в природных условиях бактерии способны к внутриклеточному 1коплению серных глобул. Колонии вида белого цвета, гладкие, округлые, 0,4 - 0,6 мм диаметре. В микроаэробных условиях способны к миксотрофному росту, утилизируя >ганические субстраты и тиосульфат в качестве доноров электронов для [ергетического метаболизма. При росте на полужидкой безазотистой среде Azospirillum iophilum sp. nov. образует цисты. Температурные пределы развития вида варьируют в гапазоне от 10 °С до 42 °С с оптимумом 37 °С, пределы рН роста 6,2-8,8. A. thiophilum |. nov. использует широкий спектр органических соединений: органических кислот: (етат, сукцинат, малат, оксалат, оксалоацетат, цитрат, изоцитрат, 2-оксоглутарат, жтат, формиат, ПВК; спиртов: этанол, бутанол, изобутанол, глицерол и пропанол; хароспиртов: маннитол, сорбигол; Сахаров: глюкозу, арабинозу, мальтозу, фруктозу, |рбозу; аминокислот: глутамат, серии, аспарагин, изолейцин, глутамин, пролин. эроший рост наблюдается на пептоне, дрожжевом экстракте и гидролезате козеина. В честве источника углерода бактерии не используют следующие органические [слоты: фумарат, бензоат, салицилат, аконитат, малонат и гликолат; сахароспирт юзит; сахара: галактозу, раффнозу, сахарозу, лактозу, ксилозу, рамнозу и трегалозу; [инокислоты: аспартат, цистеин, цистин, лизин, триптофан, фенилаланин, метионин, 1нитин. Исследуемый вид способен к росту на среде с 3 % NaCl, к ассимиляционной

нитратредукции. В жирнокислотном составе клеток доминируют С)6:о, С^ь^с? С18;1„' Содержание Г+Ц в ДНК составило 67 мол. %.

Таблица 4. Сравнительная характеристика А. МорШит ер. поу. ВУ-в7 и _близкородственных видов рода АюзртИит__

Характеристика А. МорЬИит ер. поу. ву-8т А. doebereinerae DSM 13131т А. lipoferum АТСС29707т А. picis IMMI TAR-31

Место выделения Сероводородный источник Ризосфера Miscanthus Ризосфера Miscanthus Придорожньк смолы

Размер, мкм 1,1-2,0x3,6-7,0 1,0-1,5 х2,0-30 1,4-1,7x5,0-30 0,9-1,7x2,0-4,

Способность к росту с 3 % №С1 + - - -

Пределы рН 6,2-8,8 6,0-7,0 5,7-6,8 6,5-9,0

Т„1гг ("С) 37 30 37 37

Использование тиосульфата как донора электронов + - - -

Уреазная активность - + - +

Кислая реакция на сахара - + + +

Гидролиз желатина - - + -

Источники углерода:

глицерол + + + но.

трегалоза - - - но.

цитрат + - + -

О - глюкоза + +* + +

О - ксилоза - но. + и.о.

Б - манноза - - + +

Б - сорбитол + + - +

О - галактоза - +* + +

О - фруктоза + + + -

мальтоза + - - -

лактоза - - - +

Потребность в биотине - - + +

Мол. % Г+Ц 67 70,7 69-70 68,7

Примечание: знак «+» наличие роста, «-» отсутствие роста, «+*» слабый рост, н.о,- ] определяли

2. Роль восстановленных соединений серы в метаболизме АгоярМии ШорЫИчп

Присутствие восстановленных соединений серы в среде культивирован! стимулирует рост АгояртПит ШорЫ1ит в среднем на 20 - 30 % и способству! увеличению срока их жизнеспособности (рис. 4А). Анализ продуктов окислен! тиосульфата в аэробных условиях показал, что штамм ВУ-БТ окисляет тиосульфат ; тетратионата в эквимолярном соотношении (рис. 4 Б.)

24 48

Время, час

[с. 4. Влияние тиосульфата на рост А. ШорЫ1ит ер. поу. штамм ВУ-Б1 (А) и динамику гисления тиосульфата и накопление продуктов его окисления (Б) в культуре А. хорИИит в аэробных условиях роста

1 - урожай клеток на среде с тиосульфатом, 2 - урожай клеток на среде без тиосульфата; Б 1 - в/БзОз2", - Б^Об2". Среда культивирования содержала 1 г/л тиосульфата натрия и 250 мг/л лакгата/ сукцината натрия.

В присутствии органического субстрата и сульфидов в виде №28, БеЗ, Са8 или шисульфида штамм ВУ-8Т накапливает внутри клеток элементную серу.

Преимущество роста штамма ВУ-8Т в микроаэробных условиях культивирования > сравнению с аэробными выражалось в значительном увеличении клеточного урожая ис. 5 А) и скорости окисления тиосульфата (рис. 5 Б). В аэробных условиях роста орость окисления составляла до 93 мг/л З/БгОз^ а в микроаэробных до 250 мг/л 320з2'. Анализ продуктов окисления тиосульфата в микроаэробных условиях показал, о штамм ВУ-8Т окисляет тиосульфат до тетратионата и сульфата (рис. 5 Б).

90 А

70 60 50 40 30 20 10

X ж

О 3,5

19 24 28

Время, час

43 48 51

с. 5. Влияние кислородного режимп на рост A. thiophilum sp. nov. BV-S (A) ii динамику и еле ii и я тиосульфата и накопление продуктов его окисления (Б) в культуре А. ophilum в микроаэробных условиях роста

I - при 5 % содержании кислорода в газовой фазе, 2 - при 20 % содержании кислорода в газовой фазе; Б 1 -

2032', 2 - S/S,Os~, 3 - S/SOj"'. Среда культивирования содержала 1 г/л тиосульфата натрия и 250 мг/л гтата/сукципата натрия при 2 % содержании кислорода в жидкой фазе.

2.1. Механизм окисления восстановленных соединений серы Azospirillu thiophilum в микроаэробных условиях роста

У исследуемого штамма только в микроаэробных условиях культивирования бы. обнаружена активность тиосульфатдегидрогеназы, которая катализирует окислен: тиосульфата до тетратионата. Работа этого фермента сопряжена с функционированш электронтранспортной цепи, а, следовательно, и с синтезом АТФ за счет окислительно фосфорилирования. В микроаэробных условиях роста активное тиосульфатдегидрогеназы составила 135,1нмоль (мин-мг белка). Активное сульфитоксидоредуктазы и АФС-редуктазы не была обнаружена.

Связь окисления соединений серы с функционированием ЭТЦ. Скорое потребления кислорода суспензией клеток, выращенных в аэробных условиях роста, присутствии тиосульфата в среднем составила 2,4 - 8 нмоль/(мин-мг белка), а микроаэробных - 67 - 300 нмоль/(мин-мг белка). Применение ингибиторного анали показало, что процесс окисления тиосульфата А. thiophilum BV-ST DSM 21654х щ культивировании в микроаэробных условиях сопряжен с функционированием ЭТЦ электроны поступают в ЭТЦ на уровне убихинон - цит Ъ участок (рис. 6).

Рис.6. Схема электронтранспортных путей у АговртИит МорНйит ВУ-Б1 п. .гштогетеротрофном росте 0>-(ЗН2- убихиноновый цикл

Окисление тиосульфата оказалось чувствительно к разобщителям дыхания окислительного фосфорилирования - С1ССР. При внесении разобщителя скорое дыхания на тиосульфате увеличивалась в 2,4 раза, что непосредственно указывает сопряженность процесса окисления тиосульфата с функционированием ЭТЦ.

Таким образом, впервые показано, что представитель рода АгоэртИит А. ШоркИит штамм ВУ-Б7 способен к литотрофному росту в присутствии тиосульфата.

Идентификация генов диссимиляционного серного метаболизма у АгоьрЬШит юрШит.

Для обнаружения генов, кодирующих ряд ферментов диссимиляционного числительного серного метаболизма (гОэг, ¿дг, аргАВ и были использованы

- врожденные праймеры, подобранные на основе сравнительного анализа нуклеотидных ~ зследовательностей. Поиск генов зохВ проводился с использованием четырёх _ .¡рожденных праймеров: 432Р, 693Р, 1164В и 1446В.

ПЦР-анализ показал отсутствие генов rD.tr, аргАВ, я/л кодирующих обратную юсимиляторную сульфитредуктазу, диссимиляторную аденозин-5'-

эсфосульфатредуктазу и сульфид: хиноноксидоредуктазу, соответственно. С '.пользованием пары праймеров 693Р -1446В был получен продукт ожидаемой _ личины ~780 п.о., а также небольшое количество неспецифического продукта, от второго в дальнейшем удалось избавиться благодаря оптимизации методики ПЦР ис.7).

Результаты ПЦР в реальном времени. Ранее было установлено, что в шроаэробных условиях по сравнению с аэробными в значительной степени юисходит увеличение скорости окисления восстановленных соединений серы и [тенсивности дыхания на тиосульфате. Поэтому для количественной оценки уровня " спрессии гена .шхВ в микроаэробных и аэробных условиях была проведена ОТ-ПЦР в альном времени. Из рисунка 8 видно, что в микроаэробных условиях по сравнению с робными происходит значительное увеличение продукта гена бохВ.

1 М 2

1000 п о

Рис. 7. Продукты ПЦР с использованием вырожденных

праймеров к гену «>дгВ Комбинации праймеров:

1 - 693Р-1446В,

2 - 693Р-1164В,

М - маркеры длины нуклеотидных последовательностей

А В М 1 2 1 2

Рис. 8. Результаты ОТ-ПЦР для гена захВ с различными вариантами праймеров

М - маркеры длины нуклеотидных последовательностей;

1 - бактерии культивировали в аэробных условиях;

2 - бактерии культивировали в микроаэробных условиях;

А - амплификация с праймерами 693Р-1446В Б - амплификация с праймерами 693Р- 1164В

В результате эксперимента было показано, что в микроаэробных услови) экспрессия гена soxB увеличивается в 6 раз (рис.9).

400

I 300

(а

I 200

о. f 100 о

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 Номер цикла

Рис. 9. Уровень экспрессии гена soxB при культивировании бактерий микроаэробных (синяя кривая) и аэробных условиях (красная кривая).

На графике показана зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла (типична эксперимент) и среднее увеличение уровня экспрессии в микроаэробных условиях (по даннь : шести независимых экспериментов, синий столбец) в процентном отношении к контрад (аэробные условия, красный столбец).

Результаты секвенирования гена sox. Секвенирование участка гена seo (GenBank accession no. JN015012) из A. thiophilum sp. nov. BV-ST позволило оцени : уровень гомологии с аналогичными генами других видов бактерий. Полученн последовательность была использована для сравнительного анализа с использованж пакетов программ Blast, TCoffee и ClustalW2. Установлено, что процент сходства генг soxB из A. thiophilum sp. nov. BV-ST с аналогичными генами других бактерий составля: 66-78 %.

2.2. Механизм окисления восстановленных соединений серы в аэробнь условиях роста у представителей рода Azospirillum

Ранее было установлено, что представители рода Azospirillum: A. picis, lipoferum, A. doebereinerae, A. thiophilum филогенетически близки между собо Поэтому сочли необходимым исследовать особенности серного метаболизма у данн< близкородственной группы видов. Было показано отсутствие у A. thiophilum в аэробнь условиях, а у Azospirillum picis, Azospirillum lipoferum, Azospirillum doebereinerae как аэробных, так и в микроаэробных условиях роста, активности специфических оксид серных соединений, низкий уровень потребления кислорода суспензией клеток присутвии тиосульфата [0,5 - 2,0 нмоль/(мин-мг белка)], а также способности бактер! окислять тиосульфат лишь до тетратионата. Это позволило предположить, что ' исследованных штаммов в данных условиях роста восстановленные соединения cef ._ не могут выполнять роль энергодающих субстратов, а их окисление происходит за сч химического взаимодействия с АФК. Для подтверждения выше сказанного бь

«08» >

/ 1

00* п

эоведен ряд экспериментов по влиянию каталазы на процесс аэробного дыхания в эисутствии органического субстрата (табл. 5).

Таблица 5. Скорость потребления кислорода и образования Н202 при аэробном дыхании суспензией клеток представителей рода АгоъртИит

Бактерии Скорость потребления 02, нмоль/(мин мг белка) Скорость потребления 02 в присутствии каталазы, нмоль/(мии мг белка) Скорость образования Н2СЬ, мкг /(минмг белка)

А. МорЫЫт 120,0 75,0 3,1

А. lipoferum 137,3 82,8 3,7

А. (¡оеЬегетегае 67,0 29,0 2,6

А. ршя 58,9 31,8 1,8

возраст культуры - конец логарифмической фазы роста (48 часов)

Было показано, что в процессе дыхания в суспензии клеток более 40 % от >требленного клетками кислорода восстанавливается лишь до Н202. Скорость ¡разования Н202 определялась с помощью полярографического метода по скорости 1требления кислорода при внесении каталазы в суспензию клеток.

Таким образом, окисление тиосульфата у А. Цро/егит, А. ¿оеЬегетегае, А. /и'си и у МорЫЫт при аэробном культивировании связано с функционированием ЭТЦ лишь свенно, за счет взаимодействия с продуктами неполного восстановления кислорода, йтрализуя сильный окислитель (Н202), и не сопряжено с энергетическим таболизмом.

3. Структурно-функциональная перестройка малатдегидрогеназы у оврМПит МоркИит при смене типа питания

Исследована активность ряда ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла из ктерий рода АгоэртИит МорЬПит штамм ВУ-Б7 при литотрофном и органотрофном пе метаболизма (табл. 6).

Таблица 6. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла

Ферменты Литогрофный рост (микроаэробные условия роста) Органотрофный рост (аэробные условия роста)

Активность ферментов (нмоль/мин*мг)

Малатдсгидрогеназа 130 430

Изоцитратдегидрогеназа 299 522

Сукцинатдегидрогеназа 115 183

Изоцитратлиаза 112 45

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании амма в аэробных условиях активность дегидрогеназ (МДГ, ИДГ и СДГ), тавляющих энергетические эквиваленты (НАДН и ФАДН2) в ЭТЦ, в 1,5 - 3,0 раза

выше по сравнению с культивированием в микроаэробных условиях, где доноре электронов для энергетического метаболизма выступает тиосульфат. Активное ключевого фермента глиоксилатного цикла - изоцитратлиазы при литотрофном рос увеличивается в 2 раза по сравнению с органотрофным, что свидетельствует возрастающей роли глиоксилатного цикла при литотрофном росте Azospirilh thiophilum.

В ходе многостадийной очистки из Azospirillum thiophilum, культивируемг микроаэробно при литогетеротрофном росте, были получены ферментные препара малатдегидрогеназы с удельной активностью 3,27±0,16 Е/мг белка (степень очист 46,7 раз). Из бактерий, выращенных в аэробных условиях при органотрофном рос получена МДГ со значением удельной активности 13,97±0,70 Е/мг белка и степен: очистки 51,74 раз.

Определенную роль в получении высокоочищенного препарата играет rej хроматография на сефадексе G-150. Использование хроматографии на данном ти сефадекса позволило провести эффективное разделение белков по молекулярной ма( и получить высокоочищенные препараты исследуемого фермента.

Электрофоретический анализ очищенных препаратов показал, что полиакриламидном геле при универсальном окрашивании на белки и специфическ проявлении на активность МДГ обнаружены две полосы с величиной относительн электрофоретической подвижности (Rf) 0,21 и 0,44 как в аэробных, так микроаэробных условиях. Для наглядности представлены электрофореграммы М/ полученные после гель-хроматографии на ДЭАЭ - сефарозе (рис. 10).

"1 7.7

i "1

мШ

« ?

Шз

Рис. 10. Электрофореграмма МДГ из АгоъртИшп МорИИит ВУ-в7, культивируемого в аэробных условиях (I), культивируемого в микроаэробных условиях (II)

Проявление высокоочищенного препарата, полученного после гель-хроматографии на ДЭАЭ - сефарозе универсальным красителем на белок (1), специфическое проявление на малатдегидрогеназную активность

тетразолиевым методом (2), Т - тетрамер, О - димер, Р-фронт (бромфеноловый синий)

С помощью гель-фильтрации на сефадексе G-150 была определена молекуляг масса нативной МДГ. В аэробных и в микроаэробных условиях было обнаружено , пика активности, соответствующих массам 66 и 132 кДа. Согласно профилям элю: после G-150 при органотрофном и литогетеротрофном росте присутствуют 2 фо[:

[ДГ: в аэробных условиях доминирующей формой является димер, а в микроаэробных -гграмер.

Электрофоретическое исследование в присутствии додецилсульфата натрия >зволило определить величину молекулярной массы субъединиц малатдегвдрогеназы I изучаемых бактерий Azospirillum thiophilum BV-ST. Было установлено, что МДГ »стоит из изологических субъединиц с молекулярной массой 33 кДа (Rf 0,56).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из умеренно-термального сероводородного источника «Бесстыжие ванны» был аделен штамм BV-ST, способный к фиксации молекулярного азота

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК жазал, что исследуемый штамм относится к классу Alphaproteobacteria.

Результаты полифазного исследования, включающие морфологические, мотаксономические и филогенетические исследования признаков, физиологических и «химических различий, позволяют заключить, что штамм BV-ST представляет собой вый таксон видового уровня в составе рода Azospirillum, для которого было «дложено название Azospirillum thiophilum sp. nov.

Штамм растет как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, однако есть ряд еимуществ при росте в микроаэробных условиях по сравнению с аэробными: [ксация молекулярного азота, значительное увеличение клеточного урожая и скорости исления тиосульфата.

В ходе исследований было показано, что исключительно в микроаэробных повиях культивирования представитель рода Azospirillum - A. thiophilum штамм BV-ST особен к дыханию на тиосульфате - окисление тиосульфата сопряжено с нкционированисм ЭТЦ; тиосульфат окисляется при участии 2-ух ферментных систем: эсульфатдегидрогеназы (тиосульфат окисляется до тетратионата) и эсульфатокисляющего ферментного SOX комплекса (тиосульфат окисляется до 1ьфата). Вьивлена генетическая детерминированность компонента SOX комплекса -наружен ген soxB) и показано, что в микроаэробных условиях культивирования сгерий по сравнению с аэробными экспрессия генов soxB увеличивается более чем в 1аз.

Таким образом, впервые на молекулярном и биохимическом уровнях была ¡сазана способность представителя рода Azospirillum - A. thiophilum BV-ST к готрофиому росту в присутствии тиосульфата.

Ранее при изучении МДГ, одного из ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного ела, у ряда факультативно литотрофных бактерий (Епринцев и др. 2009; Епринцев и , 2011; Арабцева и др., 2008) было показано, что при переходе факультативно готрофных бактерий от органотрофного роста к литотрофному у них образуется юлпительная изоформа малатдегвдрогеназы. При органотрофном росте

функционирует димерная форма МДГ, тогда как при литотрофном - индуцирует дополнительная тетрамерная изоформа. Наличие двух изоферментов, участвующих различных метаболических процессах, предполагает универсальную ро малатдегидрогеназы в адаптации бактерий к меняющимся условиям среды.

В ходе проведенной работы нам удалось показать структурно-функциональн! изменения малатдегидрогеназы у АгояртИит ШорЫЫт в зависимости от типа питан! МДГ, полученная из А. МорИИит при органотрофном и литотрофном росте, в отлич от исследуемых ранее бактерий, была представлена как димером, участвующим работе ЦТК, так и тетрамером, функционирующим в глиоксилатном цикле. Меняло только соотношение этих форм фермента. При органотрофном росте доминирующ формой являлся димер, поддерживающий энергетический метаболизм, а п литотрофном - тетрамер, поддерживающий конструктивный метаболизм. Поскольку АгозртИит МоркИит при литотрофном росте снижается доля димерной формы М/ участвующей в энергетическом метаболизме, то можно предположить, что значителы часть энергии поставляется в клетку за счет диссимиляционного процесса окислен восстановленных соединений серы.

Многие микроорганизмы, обитая в неравновесных условиях, находятся состоянии стресса, их рост лимитируется наличием различных питательных веществ, довольно часто на них действуют несколько факторов. Выделенный новый в АгояртИит МорЫ1ит оказался «заложником» экологических условий сероводородн биотопов и вынужден был адаптироваться. Поэтому в процессе эволюции выживания в изменяющихся условиях среды у бактерий появился лабильный т метаболизма и более совершенные механизмы его регуляции. Эта способно« обусловливает их выживаемость в сероводородных биотопах.

ВЫВОДЫ

1. Из умеренно термального сероводородного источника Ставропольского к] впервые получена чистая культура неассоциативного диазотрофш представителя рода АгоэртПит - факультативно литотрофный штамм ВУ-способный в микроаэробных условиях использовать тиосульфат в качес донора электронов.

2. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательное] гена 168 рРНК, белок-кодирующего гена т/Н, результата анализа ДНК-Д] гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств опи< новый представитель рода Лгозрш'Яит - АгоэртИит ШорЫЫт вр.поу. Б! 216547.

3. Биохимические механизмы окисления тиосульфата у АгояртИит МорЫЫт Е Бт различны. Тиосульфат окисляется при участии 2-ух ферментных сист тиосульфатдегидрогеназы (тиосульфат окисляется до тетратиопата)

тиосульфатокисляющего ферментного SOX комплекса (тиосульфат окисляется до сульфата). Активность тиосульфатдегидрогеназы составила 135,1 нмоль (мин-мг белка). Выявлена генетическая детерминированность компонента SOX комплекса - обнаружен ген soxB и показано, что в микроаэробных условиях культивирования бактерий по сравнению с аэробными экспрессия генов soxB увеличивается более чем в 6 раз.

4. Установлено, что в микроаэробных условиях окисление тиосульфата Aiospirillum thiophilum BV-ST сопряжено с функционированием ЭТЦ. В ходе окисления тиосульфата электроны поступают в ЭТЦ на уровне убихинон - цит Ь участка.

5. С помощью гель-хроматографии на сефадексе G-150 была определена молекулярная масса нативной МДГ. При органотрофном и литотрофном росте было обнаружено два пика активности, соответствующих массам 66 и 132 кДа. Электрофоретическое исследование позволило установить, что МДГ A. thiophilum BV-ST является гомодимером и гомотетрамером и состоит из субъединиц с молекулярной массой 33 кДа (Rf 0,56).

6. Обнаружены структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы у Azospirillum thiophilum в зависимости от типа питания: при органотрофном росте доминирует димерная форма МДГ, а при литотрофном - тетрамерная. Поскольку у Azospirillum thiophilum при литотрофном росте снижается доля димерной формы МДГ, участвующей в энергетическом метаболизме, то можно предположить, что значительная часть энергии поставляется в клетку за счет диссимиляционного процесса окисления восстановленных соединений серы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи

Лавриненко К.С., Гриднева Е.В., Логинова О.О., Сыров В.М., Грабович М.Ю. (бенности электронтранспортной цепи у Azospirillum thiophilum sp.nov. // ■анизация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион, сб науч. от. Воронеж, 2009 . Вып. 11. С. 125-129 .

Лавриненко К.С., Гриднева Е.В., Черноусова Е.Ю., Матросова Ю.С., Сыров В.М., ir Т.Т., Грабович М.Ю. Неассоциированный диазотрофный представитель рода spirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov, выделенный из умеренно-термального ^водородного источника Ставропольского края // Организация и регуляция иолого-биохимических процессов : межрегион, сб науч. работ. Воронеж, 2008. Вып. С. 133-142.

Лавриненко К.С., Черноусова Е.В., Гриднева Е.В., Логинова О.О., Сыров В.М., бович М.Ю. Особенности серного метаболизма и филогенетический анализ матограмм нуклеотвдных последовательностей гена 16S rRNA у Azospirillum vhilum sp. nov. Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. С. 424-432.

4*. Lavrinenko К., Chemousova E., Gridneva E., Dubinina G., Akimov V., Kuever J., г Grabovich M. Azospirillum thiophilum sp. nov., a diazotrophic bacterium isolated from sulfide spring // Int J Syst Evol Microbiol. 2010. V. 60. (12), P. 2832-2837. 5*. Лавриненко K.C., Фролов E.H., Тугукина M.H., Юревич Л.И., Белоусова Е. Грабович М.Ю. Идентификация генов диссимиляционного серного метаболизма первого литотрофного представителя рода Azospirillum - A. thiophilum // Вестник BI Серия Химия, биология. 2011. Т. 2. С. 129 - 132.

Материалы конференций

6. Лавриненко К.С., Гриднева Е.В., Грабович М.Ю., Логинова О.О. Диазотрофн представитель рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov, выделенный умеренно-термального сероводородного источника Ставропольского Края // Симб) Россия 2009: материалы II Всероссийского с международным участием конгре< студентов и аспирантов-биологов, 25-29 мая 2009 г., г. Пермь. Пермь, 2009. С. 41-42.

7. Лавриненко К.С., Черноусова Е.Ю., Грвднева Е.В., Грабович М.Ю. Сероокисляюи представитель рода Azospirillum thiophilum sp. nov., выделенный из умереи термального сероводородного источника Ставропольского края II Биология - наука века: 13-я Междунар. Путинская шк.-конф. молодых ученых, 28 сент.-2 окт. 2009 г.: тез. Пущино, 2009. С. 203.

8. Лавриненко К.С., Фролов E.H., Тутукина М.Н., Юревич Л.И. Идентификация ret диссимиляционного серного метаболизма у первого литотрофного представителя р( Azospirilum - A. thiophilum II Симбиоз Россия 2011: материалы 4-го Всерос. с меяедун участием конгресса студ. и аспирантов-биологов, Воронеж, 23-27 мая 2011 г. Вором 2011 .Т. 1. С.77-78.

9. Фролов E.H., Лавриненко К.С., Данг Т. Т. Первый литотрофный сероокисляюи представитель рода Azospirillum - A. thiophilum И Биология - наука XXI века: 1 Междунар. Путинская школа-конф. молодых ученых, Пухцино, 18-22 апр. 2011 г.: тез. Пущино, 2011.С. 338.

(* - публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лавриненко, Ксения Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бактерии рода Azospirillum как представители азотфиксирующих бактерий

1.2. История открытия Azospirillum

1.3. Характеристика бактерий рода Azospirillum ±

1.3.1. Экология

1.3.2. Таксономическое положение

1.4. Адаптационные механизмы микроорганизмов

1.5. Эколого-иммунологические исследования бактерий рода Azospirillum

1.6. Азотфиксация и нитрогеназный комплекс

1.6.1. Структура нитрогеназного комплекса и молекулярные основы азотфиксации

1.6.2. Влияние кислорода на активность нитрогеназного комплекса

1.7. Применение на практике

1.8. Особенности метаболизма соединений серы у литотрофных прокариот

1.8.1. Механизм адаптации к среде обитания 4 q

1.8.2. Роль соединений серы в метаболизме серобактерий

1.8.2.1. Дыхательная цепь и ферменты серного метаболизма

1.8.2.2. Особенности дыхательных цепей литотрофных прокариот

1.8.3. Ферменты диссимиляционного серного метаболизма

1.8.3.1. Тетратионатформирующие тиосульфат: хиноноксидоредуктазы (тиосульфатдегидрогеназы) ^

1.8.3.2. Sox комплекс (!TOMES) 49 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования и источник выделения

2.2. Методы исследования

2.2.1. Состав питательной среды для культивирования

2.2.2. Микроаэробное культивирование

2.2.3. Методы изучения морфологии и внутриклеточных включений

2.2.4. Получение клеточной суспензии и ферментных экстрактов

2.2.5. Определение общего количества белка

2.2.6. Методы определения продуктов превращения соединений серы

2.2.7. Оценки способности к азотфиксации

2.2.8. Анализ жирнокислотного состава на приборе Шерлок

2.2.9. Методы определения активности ферментов, участвующих в 58 превращении восстановленных соединений серы

2.2.10. Определение активности ферментов цикла трикарбоновых 59 кислот '

2.2.11. Выделение и очистка малатдегидрогеназы

2.2.12. Электрофоретические исследования ^

2.2.12.1. Аналитический электрофорез

2.2.12.2. Определение гомогенности ферментных препаратов

2.2.12.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы

2.2.12.4. Определение молекулярной массы субъединиц 64 малатдегидрогеназы

2.2.13. Определение молекулярной массы нативного фермента 65 малатдегидрогеназы

2.2.14. Полярографический метод определения кислорода

2.2.15. Методы молекулярной биологии 66 2.2.15.1. Выделение и очистка хромосомной ДНК

2.2.15.2. Получение кДНК-копий (реакция обратной транскрипции)

2.2.15.3. Количественная PCR (PCR в реальном времени)

2.2.15.4. Определение нуклеотидной последовательности генов

2.2.15.5. Определение Г+Ц в ДНК

2.2.16. Филогенетический анализ

2.2.17. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеристика нового вида рода Azospirillum

3.1.1. Характеристика местообитания штамма BV-ST

3.1.2. Выделение в чистую культуру штамма ВV-ST

3.1.3. Фенотипические характеристики штамма ВV-ST 73 3.1.3.1. Особенности морфологии штамма 73 . 3.1.3.2. Культуральные признаки 3.1.3.3. Источники углерода 3.1.3.4. Физиолого - биохимические свойства

3.1.3.5. Фиксация молекулярного азота

3.1.3.6. Состав жирных кислот 78 ЗЛА. Филогенетический и генотипический анализ штамма BV-S

3.2. Роль восстановленных соединений серы в метаболизме Azospirillum 86 thiophilum

3.2.1. Окисление соединений серы в аэробных условиях

3.2.2. Влияние кислородного режима культивирования на рост А. 87 thiophilum и динамику окисления тиосульфата

3.2.3. Механизм окисления восстановленных соединений серы 88 Azospirillum thiophilum в микроаэробных условиях роста

3.2.3.1. Связь окисления соединений серы с функционированием 89 электронтранспортной цепи

3.2.4. Идентификация генов диссимиляционного серного 92 метаболизма у АгояртПит ШорЪИит

3.2.4.1. Результаты ПЦР анализа

3.2.4.2. Результаты ПЦР в реальном времени

3.2.4.3. Результаты секвенирования гена бохВ

3.2.5. Механизм окисления восстановленных соединений серы в 96 аэробных условиях роста у представителей рода АгояртПит

3.3. Структурно-функциональная перестройка малатдегидрогеназной 98 системы у АгозртИит ШоркИит при смене типа питания

3.3.1. Определение активности ферментов цикла трикарбоновых 98 кислот и глиоксилатного цикла

3.3.2. Очистка малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий 99 АгозртПит ШоркИит ВУ

3.3.2.1. Электрофоретические исследования ферментных 101 препаратов

3.3.2.2. Определение молекулярной массы нативного фермента 103 малатдегидрогеназы

3.3.2.3. Определение субъединичного строения 104 малатдегидрогеназы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биология нового неассоциативного факультативно литотрофного представителя рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov."

Актуальность проблемы

Представители рода Azospirillum относятся к ассоциированным азотфиксаторам. Они, как правило, ассоциированы с различными почвами, с корневой, системой диких травянистых растений, кормовых трав, злаков (Игнатов, 1998), за исключением A. largimobile, обитающего в водных биотопах (Dekhil et al., 1997; Sly, Stackebrandt, 1999). Azospirillum могут быть полезны в технологии выращивания сельскохозяйственных культур, а также в качестве модельного объекта для изучения ассоциативных отношений между растениями и микроорганизмами.

Преимущественно представители рода Azospirillum имеют органогетеротрофный тип метаболизма, хотя известно, что некоторые штаммы A. lipoferum способны к Н2 - зависимому автотрофному росту, что не исключает способности к литотрофии у других видов этого рода в присутствии Н2, восстановленных соединений серы и др.

На сегодняшний день род Azospirillum представлен пятнадцатью видами, и данные о видовом составе рода с каждым годом пополняются. Так за последние 5 лет описано 8 новых видов. В последние годы было показано, что представители рода Azospirillum (Del Gallo, 1994) имеют различное географическое происхождение и способны занимать разнообразные экологические ниши. Существование Azospirillum в различных климатических поясах, сложных гетерогенных условиях почвы, смена мест обитания (почва - ризосфера - растение) требуют от бактерий высокой приспособляемости к постоянно меняющимся условиям обитания, гибкости метаболизма.

Изучение биоразнообразия представителей рода Azospirillum и изучение множественных метаболических путей, обеспечивающих адаптацию бактерий в неравновесных условиях среды, имеет важное значение, так как позволяет понять причину господствующего положения бактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах углерода, азота и Т.д.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение фенотипических и генетических характеристик нового представителя рода АгохрМИит, определение его таксономической принадлежности и изучение особенностей углеродного и серного метаболизма.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Из умеренно термального сероводородного источника выделить чистую культуру нового представителя азотфиксирующих бактерий рода АгояртИит.

2. Определить филогенетическое и таксономическое положение нового штамма ВУ-8Т.

3. Выявить функциональную роль восстановленных соединений серы в метаболизме и механизм их окисления: определить активность ферментов,, участвующих в процессах превращения соединений серы, проверить наличие ряда генов, кодирующих ферменты серного метаболизма, и определить уровень их экспрессии в аэробных и микроаэробных условиях.

4. Установить связь окисления восстановленных соединений серы с функционированием ЭТЦ.

5. Выделить и получить высокоочищенный ферментный препарат МДГ из исследуемых бактерий, изучить структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы у АгояртИит ШоркИит в зависимости от типа питания.

Научная новизна и значимость работы

Используя современные методы полифазной таксономии, изучено филогенетическое и таксономическое положение нового представителя рода АгоБрМПит. Анализ последовательности 168 рРНК позволил отнести выделенный штамм к А 1ркарго1еоЬаМепа, который был охарактеризован как новый вид азотфиксирующих бактерий, АгоэрМИит - АгоэрМЦит ШоркПит Бр.поу. ВУ-8 . Впервые для представителей рода АгозрЫИит, в частности для А. МоркПит эр. поу., в микроаэробных условиях показана способность к литотрофному росту в присутствии восстановленных соединений серы. Показано, что в присутствии тиосульфата переход от органотрофного роста к литотрофному возможен только в микроаэробных условиях культивирования.

В ходе проведенной работы удалось показать структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы у АгоэртИит ШоркИит в зависимости от типа питания. Поскольку, согласно литературным данным, димер МДГ - это с форма фермента НТК, поддерживающая энергетический метаболизм, а тетрамер - это форма фермента глиоксилатного цикла, поддерживающая конструктивный метаболизм, то можно предположить, что при литотрофном росте АлоБртИит МоркПит снижается роль ЦТК в энергетическом метаболизме, а значительная часть энергии поставляется в клетку за счет диссимиляционного процесса окисления восстановленных соединений серы.

Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биоразнообразии бактерий. Изучение множественных метаболических путей, обеспечивающих адаптацию бактерий в неравновесных условиях среды, имеет большое значение, так как позволяет выяснить функциональную роль окисления соединений серы и понять причину господствующего положения бактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах азота, углерода, серы.

Научно - практическая значимость работы

Результаты исследований расширяют фундаментальные представления о разнообразии бактерий и о физиолого-биохимических механизмах регуляции их метаболизма; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в природных сообществах. Полученные в работе результаты могут быть использованы в соответствующих разделах учебных пособий по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии.

Полученные гомогенные препараты малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, а также как ферментные препараты в качестве модельного образца для других методов исследования. Прикладные аспекты изучения сероокисляющих азотфиксаторов - АгозртИит МоркИит определяются возможностью их использования в районах, обедненных азотом, но обогащенных сероводородом, таких как рисовые плантации и т. д. "

Апробация работы

Основные положения работы доложены на международных и российских конференциях:

2. Международной молодежной школе - конференции «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2009).

4. Международной молодежной школе - конференции «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2011).

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 9 печатных работах: 5 экспериментальных статьях и 4 тезисах.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследований, изложения результатов экспериментов с обсуждением и заключением, основных выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 22 рисунка, а также 1 страницу приложения. Список цитируемой литературы включает 207 источников, из них 84 на русском и 123 на английском языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лавриненко, Ксения Сергеевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из умеренно-термального сероводородного источника «Бесстыжие

Т* ванны» был выделен штамм BV-S , способный к фиксации молекулярного азота.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что исследуемый штамм относится к классу Alphaproteobacteria.

Результаты полифазного исследования, включающие морфологические, хемотаксономические и филогенетические исследования признаков, физиологических и биохимических различий, позволяют

TP заключить, что штамм BV-S представляет собой новый таксон видового уровня в составе рода Azospirillum, для которого было предложено название Azospirillum thiophilum sp. nov.

Штамм растет как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, однако есть ряд преимуществ при росте в микроаэробных условиях по сравнению с аэробными: фиксация молекулярного азота, значительное увеличение клеточного урожая и скорости окисления тиосульфата.

В ходе исследований было показано, что исключительно в микроаэробных условиях культивирования представитель рода Azospirillum — A. thiophilum штамг^ BV-S способен к дыханию на тиосульфате - окисление тиосульфата сопряжено с функционированием ЭТЦ; тиосульфат окисляется при участии 2-ух ферментных систем: тиосульфатдегидрогеназы (тиосульфат окисляется до тетратионата) и тисульфатокисляющего ферментного SOX комплекса (тиосульфат окисляется до сульфата). Выявлена генетическая детерминированность компонента SOX комплекса - обнаружен ген soxB (JN015012) и показано, что в микроаэробных условиях культивирования бактерий по сравнению с аэробными экспрессия генов soxB увеличивается более чем в 6 раз.

Таким образом, впервые на молекулярном и биохимическом уровнях была доказана способность представителя рода АгоэрЫИит - А. ШоркПит ВУ-Б к литотрофному росту в присутствии тиосульфата.

Ранее при изучении МДГ, одного из ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла, у ряда факультативно литотрофных бактерий (Епринцев и др. 2009; Епринцев и др., 2011; Арабцева и др., 2008) было показано, что при переходе факультативно литотрофных бактерий от органотрофного роста к литотрофному у них образуется дополнительная изоформа малатдегидрогеназы. При органотрофном росте функционирует димерная форма МДГ, тогда как при литотрофном - индуцируется дополнительная тетрамерная изоформа. Наличие двух изоферментов, участвующих в различных метаболических процессах, предполагает универсальную роль малатдегидрогеназы в адаптации бактерий к меняющимся условиям среды.

В ходе проведенной работы нам удалось показать структурнофункциональные изменения малатдегидрогеназы у АгояртИит ШоркИ ит в я, „ • < зависимости от типа питания. МДГ, полученная из А. ШорЫ1 ит при

I ' 1 < » '<• I ' ' ! < « . < , ! * , ■ органотрофном и литотрофном росте, в отличие от исследуемых ранее бактерий, была представлена как димером, так и тетрамером. Менялось только соотношение этих форм фермента: при органотрофном росте доминирующей формой МДГ является димер, а при литотрофном -тетрамер. Это еще раз подтверждает, что димерная форма МДГ поддерживает энергетический метаболизм, а тетрамерная форма -конструктивный метаболизм. Выявленная закономерность дает возможность предположить, что у АгояртПит Шоркй ит при литотрофном росте снижается роль МДГ в энергетическом метаболизме, а значительная часть энергии поставляется в клетку за счет диссимиляционного процесса окисления восстановленных соединений серы.

Многие микроорганизмы, обитая в неравновесных условиях, находятся в состоянии стресса, их рост лимитируется наличием различных питательных веществ, но довольно часто на них действуют несколько факторов. Выделенный новый вид Azospirillum thiophilum оказался «заложником» экологических условий сероводородных биотопов и вынужден был адаптироваться. Поэтому в процессе эволюции для выживания в изменяющихся условиях среды у бактерий появился лабильный тип метаболизма и более совершенные механизмы его регуляции. Эта способность обусловливает их выживаемость в сероводородных биотопах.

1. Из умеренно термального сероводородного источника Ставропольского края впервые получена чистая культура неассоциированного диазотрофного представителя рода Azospirillum

Т* факультативно литотрофный штамм ВV-S , способный в микроаэробных условиях использовать тиосульфат в качестве донора электронов.

2. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, белок-кодирующего гена nifli, результата анализа ДНК-ДНК гибридизации и сравнительного исследования фенотипических свойств описан новый представитель рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp.nov. DSM 21654т.

3. Биохимические механизмы окисления тиосульфата у Azospirillum thiophilum BV-S при литотрофном росте различны. Тиосульфат окисляется при участии 2-ух ферментных ' *' систем:. тиосульфатдегидрогеназы (тиосульфат окисляется до тетратионата) и тиосульфатокисляющего ферментного SOX комплекса (тиосульфат окисляется до сульфата). Активность тиосульфатдегидрогеназы составила 135,1 нмоль (мин-мг белка). Выявлена генетическая детерминированнность компонента SOX комплекса - обнаружен ген soxB и показано, что в микроаэробных условиях культивирования бактерий по сравнению с аэробными экспрессия генов soxB увеличивается более чем в 6 раз.

4. Установлено, что в микроаэробных условиях окисление тиосульфата

ТГ

Azospirillum thiophilum BV-S сопряжено с функционированием ЭТЦ. В ходе окисления тиосульфата электроны поступают в ЭТЦ на уровне убихинон - цит b участка.

5. С помощью гель-хроматографии на сефадексе G-150 была определена молекулярная масса нативной МДГ. При органотрофном и литотрофном росте было обнаружено два пика активности, соответствующих массам 66 и 132 кДа. Электрофоретическое исследование позволило установить, что МДГ А. ШоркИит ВУ-8Т является гомодимером и гомотетрамером и состоит из субъединиц с молекулярной массой 33 кДа (Ш^ 0,56).

6. Обнаружены структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы у АгозртИит ШоркПит в зависимости от типа питания: при органотрофном росте доминирует димерная форма МДГ, а при литотрофном - тетрамерная. Поскольку у АгояртПит ШоркИит при литотрофном росте снижается доля димерной формы МДГ, участвующей в энергетическом метаболизме, то можно предположить, что значительная часть энергии поставляется в клетку за счет диссимиляционного процесса окисления восстановленных соединений серы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лавриненко, Ксения Сергеевна, Воронеж

1. Авакумова E.H. Новые данные о взаимоотношении бобовых растений и клубеньковых бактерий. В сб.: Биологический азот и его роль в земледелии / E.H. Авакумова //- М., 1967. - С.77-87.

2. Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов/ В.К. Акименко // М.: Наука, 1989. С. 263 - ISBN 5-02-003959-4.

3. Арабцева М. А. Очистка и регуляторные свойства тетрамерной формы малатдегидрогеназы из бактерий Sphaerotilus natans / М. А. Арабцева, А. Т. Епринцев, М. И. Фалалеева, И. В. Парфенова // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация 2008, № 1 С. 69-73.

4. Аристовская Т.В. Микробиология процессов почвообразования / Т.В. Аристовская // Л.: Нзд-во ЛГУ. 1980. - С. 246.

5. Басилашвили Л. А. Распространение азоспирилл в некоторых почвах Грузии / Л. А. Басилашвили, H.H. Нуцубидзе // Сообщения АН Грузин. ССР. -1984.-Т. 114.-С. 617-620.

6. Белимов A.A. Смешанные культуры азотфиксирующих бактерий и перспективы их использования в земледелии / A.A. Белимов, А.П. Кожемяков // С.-х. биология. 2004. - № 6. - С. 24-26.

7. Берцева Ю.В. Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у Azotobacter vinelandii / Ю.В. Берцева, О.В.Демин, A.B. Богачев // Успехи биологической химии. 2005 - Т.45. - С. 205-234.

8. Берцова Ю.В. Биохимия / Ю.В. Берцова, В.Н. Попов, A.B. Богачев // 2004.- Т.69.- С. 712-718.

9. Бурыгин Г.Л. Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Саратов, 2003. С. 22.

10. Волкогон В.В. Особенности взаимоотношений бактерий рода Azospirillum с растениями картофеля, культивируемыми in vitro / B.B.

11. Волкогон, С.Б. Димова, А.Е. Мамчур // Институт сельскохозяйственной 'микробиологии УААН, Чернигов. С. 19-25.

12. Волкогон В.В. Азотфиксирующие микроорганизмы корневой зоны райграса пастбищного и костреца безостого / В.В. Волкогон, А.Е. Хальчицкий, В.Г. Миняйло//Микробиол. журн. 1991.-Т.53, N6.-С. 3-8.

13. Воробьева Л. И. Пропионовокислые бактерии / JI. И. Воробьева // М.: Изд-во МГУ, 1995.

14. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, JI. Верецкеи // М.: Мир, 1982. - С. 446.

15. Гильманов М.К. Методы очистки и изучения ферментов растений / М.К. Гильманов, О.В. Фурсов, А.П. Францев // Алма-Ата: Наука, 1981. С. 92.

16. Грабович М.Ю. Микробиология / М.Ю. Грабович, H.H. Дульцева, Г.А. Дубинина// 2002. Т. 71. - С. 301-307.

17. Грабович М.Ю. Биоразнообразие бесцветных серобактерий: таксономия, метаболизм и его регуляция: дисс. . доктора биол. Наук / М.Ю. Грабович // Саратов, 2005. - С. 308. - f, (f * * > I I ' 1 *

18. Грабович М.Ю. Микробиология / М.Ю. Грабович, Г.А. Дубинина, В.Ю. Лебедева, В.В. Чурикова // 1998. Т.67. - С. 464-470.

19. Гусев М.В. Микробиология: Уч. для студ. биол. специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева // 4-е изд.: Изд. центр «Академия», 2003. С. 464.

20. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман // М.: Мир, 1970. С. 173.

21. Дорошенко Е.В. Выделение и характеристика азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum из почвы сфагнового болота / Е.В. Дорошенко, Е.С. Булыгина, Е.М. Спиридонова, Т.П. Турова, И.К. Кравченко // Микробиология. Т. 76, №1. - 2007, С. 107-115.

22. Дубинина Г.А. Механизмы адаптации бесцветных серобактерий к среде обитания / Г.А. Дубинина // Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского. -М.: Наука, 2004. С. 126 - 149.

23. Дэвени Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я. Гергей // М.: Мир, 1976.-С. 364.

24. Евстигнеева З.Г. Молекулярные механизмы усвоения азота растениями / B.JI. Кретович, Т.И. Карякина и др. / АН СССР, ин-т биохимии им. А.Н. Баха; Отв. ред. E.H. Мишустин. М.: Наука, 1983. - С. 264.

25. Емцев В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, E.H. Мишустин // М., Дрофа, 2005. С. 445.

26. Епринцев А.Т. Малатдегидрогеназная и аконитазная системы высших растений: физиолого-биохимическая характеристика, регуляция и роль в адаптации к факторам внешней среды . Дис. д-ра биол. наук / А.Т. Епринцев. Воронеж, 1995. - С. 457.

27. Епринцев А.Т. Механизм формирования изоформ малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans Д-507 в различных условиях культивирования / А. Т. Епринцев, М. И. Фалалеева, М. А. Арабцева, и др. // Известия РАН. Серия биологическая. 2011, № 4, С. 1-6.

28. Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот / Е.В. Ермилова // СПб.: Изд-во С. - Петерб. ун-та. 2007: - С. 299. .

29. Ермилова Е.В. Подвижность и поведение микроорганизмов / Е.В. Ермилова, Ж.М. Залуцкая, Т.В. Лапина // Прокариоты. СПб.: Изд-во С. -Петерб. ун-та. 2004. - С. 172.

30. Завалин А. А. Азотное питание и продуктивность сортов яровой дшеницы / А. А. Завалин // М.: Агроконсалт 2003. - С.152.

31. Заварзин Г. А. Алкало-фильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие / Г.А. Заварзин, Т.Н. Жилина, В.В. Кевбрин // Микробиол. 1999. - Т. 68. - № 5. - С. 503-521.

32. Землянухин A.A. Большой практикум по физиологии и биохимии растений: учеб. пособие / A.A. Землянухин, JI.A. Землянухин // Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1996. - С. 188.

33. Крылова Н.Б. Роль микроэлементов в азотфиксации / Н.Б. Крылова // изд-во; АН СССР, сер. биол., №5. 1962. - С. 718.

34. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М.: Высш. шк., 1990. С.352.

35. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледерман // М.: Финансы и статистика, 1989. С. 508.

36. Львов Н.П. 43-е ежегодные Баховские чтения. М.: «Наука», 1987. С. 714.

37. Любимов В.И. Биохимия и фиксация молекулярного азота / В.И. Любимов // М.: Наука. 1969. С. 159.

38. Манорик A.B. Методы получения и очистки бесклеточных азотфиксирующих препаратов из различных азотфиксирующих организмов / -A.B. Манорик, Е.П. Старченков, В.К. Даценко // АН СССР, ин-т физиологии растений. Киев: Наука думка. 1971. - С. 71.

39. Матора Л.Ю. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brazilense / Л.Ю. Матора, С.Ю. Щеголев // Микробиология. 2002. - Т. 71. - С. 211-214.

40. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр // М.: Мир, 1971. - С. 222.

41. Методы общей бактериологии. / Под ред. Герхардта Ф. и др. М.: Мир, 1984.- Т.З. С. 10-46.

42. Мишустин E.H. Биологическая фиксация атмосферного азота / E.H. Мишустин, В.К. Шильникова// М., 1968. С. 32-37.

43. Мишустин E.H. Биологическая фиксация молекулярного азота / E.H. Мишустин, В.Т. Емцев // Микробиология, ВО «Агропромиздат», 1987. М., С.169-192.

44. Мулюкин A.JI. Разнообразие морфотипов покоящихся клеток и условия их образования у Azospirillum brasilense / A.JI. Мулюкин, Н.Е. Сузина, А.Ю. Погорелова, Л.П. Антонюк, В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. -2009.-Т. 78. № 1.-С. 42-52.

45. Новикова Т. А. Генная инженерия растений / Т. А. Новикова // Биология в школе. 2004. - N 3. - С. 13-18

46. Олейников P.P. Физиолого-биохимические особенности клубеньковых бактерий разной азотфиксирующей активности: автореф. дис.канд. биол. наук / P.P. Олейников // М.: ин-т микробиологии АН СССР. - 1971. - С. 25.

47. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул / Л.А. Остерман // М.: Мир, 1983. - С. 297.

48. Парфенова Н.В. Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды, дисс. . канд. биол. Наук / Н.В. Парфенова // Воронеж, 2004. С. 142.

49. Патрицкая В.Ю. Регуляция углеродного и серного метаболизма у нитчатых скользящих серобактерий Beggiatoa и Leucothrix. Дис. канд. биол. наук. Институт микробиологии РАН. М., 2001.

50. Пиневич А. В. Микробиология. Биология прокариотов: учебник в 3 т. Том 2. Спб.: Изд-во С.- Петерб. ун-та, 2007. - С. 331.

51. Пирог Т.П. Защитные функции экзополисахаридов, синтезируемых бактериями Acinetobacter sp. / Т.П. Пирог, Т.А. Гринберг, Ю.Р. Малашенко // Микробиология. 1997. - Т. 66. Вып. 3. - С. 335-340.

52. Проворов H.A., Воробьев Н.И. Эволюционная генетика клубеньковых бактерий: молекулярные и популяционные аспекты / H.A. Проворов, Н.И. Воробьев // Генетика. 2000. - Т.36. - С. 1573-1587.

53. Резников A.A. Методы анализа природных вод / A.A. Резников, Е.П. Муликовская, В.Ю. Соколов //- М.: Госгеолтехиздат, 1970. С. 488.

54. Речкин А.И. Геохимическая роль микроорганизмов / А.И. Речкин, Г.Н. Ладыгина // Нижегородский государственный университет им

55. Н.И.Лобачевского Национальный исследовательский университет Нижний Новгород, 2010. С. 72.

56. Романова А.К. Биохимические методы автотрофии у микроорганизмов / А.К. Романова// М.: Наука, 1980. С. 160.

57. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс// М.: Мир, 1985. С. 358.

58. Тихонович И.А. Интеграция генетических систем растений и микроорганизмов при симбиозе / И.А. Тихонович // Успехи совр. биол. -2005. Т. 125. - № 3. - С. 227-238.

59. Тихонович И. А., Круглов Ю.В. Микробиологические аспекты плодородия почвы и проблемы устойчивого земледелия / И.А. Тихонович, Ю.В. Круглов // Плодородие. 2006. - № 5 (32).

60. Трепачев Е.П. Минеральный и биологический азот в земледелии СССР / Е.П. Трепачев // М.: Наука, 1985. С.27-37.

61. Уильяме У.Д. Определение анионов / У.Д. Уильяме // М.: Химия, 1982.- С. 622.

62. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация / М.М. Умаров // М.: Из-во МГУ, 1986.-С. 136.

63. Федоров М.В. Биологическая фиксация азота атмосферы / М.В.Федоров // Московская с.-х. акад.им. К.А. Тимирязева -2-е изд., перераб. и доп. -М. 1952.- С. 671.

64. Федорова JI.C. Выделение азоспирилл из культурных и дикорастущих злаков Саратовской области / JI.C. Федорова, Л.И. Позднякова, С.В. Каневская // Микробиология. 1985. - Т.54. №4. - С. 684-685

65. Филипьечева Ю.А. Эколого-физиологические и серологическиеIсвойства бактерий рода Azospirillum различных растительно-бактериальных сообществ: дисс. . канд. биол. наук / Ю.А. Филипьечева Саратов, 2011. -С. 142.

66. Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применение препаратов на их основе (методические рекомендации) / А.В. Хотянович // Л., 1991. С. 60.

67. Черников В.А. Агроэкология / В.А. Черников, А.И. Чекерес // М.: Колос, 2000.-322 с.

68. Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков// Воронеж: Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1998. С. 270.

69. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель // Пер. с нем. М.: Мир, 1987.-С. 567.

70. Шольц К.Ф. Ячейка для амперометрического определения кислорода / К.Ф. Шольц, Д.Н. Островский // Методы современной биохимии. М., 1975. -С. 52-58.

71. Appia-Ayme С. Cytochrome complex essential for photosynthetic oxidation of both thiosulfate and sulfide in Rhodovulum sulfidophilum / C. Appia-Ayme, P.J. Little, Y. Matsumoto // J Bacterid. 2001. -Vol. 183. - P. 6107-6118.

72. Assmus B. In situ localization of Azospirillum brasilense ih the rhozosphere of wheat with fluorescently labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes and scanning confocal laser microscopy / B. Assmus, P. Hutzler, G. Kirchhof, R.

73. Amann, J. Lawrence, A. Hartmann // Appl. Environ. Microbiol. 1995. — V. 61. -P. 1013-1019.

74. Ausubel F. Current protocols in Molecular Biology / F. Ausubel, R. Brent, R. Kingston, D. Moore, J. Seidman, J. Smith, K. Strahl // New York: John Wiley and Son, 1994.-P. 534.

75. Baldani J. Recent advances in BNF with non-legume plants / J. Baldani, L. Caruso, V. Baldani, S. Goi, J. Dobereiner // Soil. Biol.Biocem. 1997. - V. 29. -P. 911-922.

76. Barbieri P. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production / P. Barbieri, T. Zanelli, E. Galli, G. Zanetti // FEMS Microbiol. Lett. 1986 - V. 36. -P.2951-2955.

77. Bashan Y. Azospirillum plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) / Y. Bashan, G. Holguin // Can J.Microbiol. -1997.-V. 43.-P. 103-121.

78. Bashan Y. Contribution > of Azospirillum brasilense Cd to growth^ of tomato ' seedlings is not through nitrogen fxation / Y; Bashan, M. Singh, H. Levariony // Can. J. Bot. 1989. - Vol. 67, №8. - P. 2429 - 2434. : ' * '

79. Becking. Fixation of molecular nitrogen by an aerobic vibrio or spirillum / Becking // J. Microbiol. Serol. -1963. Vol. 29. - P. 326.

80. Beijerinck M.W. Uber ein Spirillum, welches freien Stickstoff binden kann / M. W. Beijerinck// Centralbl. Bakt. II. 1925. - Vol. 63. - P. 353-357.

81. Bej A. Polymerase chain reaction-gene probe detection of microorganisms by using filter-concentrated samples / A. Bej, M. Mahbubani, J. Dicesare, R. Atlas //Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V. 57. - P. 3529-3534.

82. Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture / G. Berg // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. - V. 84. - P. 11-18.

83. Boyer M. A quorumquenching approach to identify quorum-sensing-regulated functions in Azospirillum lipoferum / M. Boyer, R. Bally, S. Perrotto, C. Chaintreuil, F. Wisniewski-Dye // Res. Microbiol. 2008. - V. 159. - P. 699-708.

84. Bradford M. A rapid and sensitive method for quantitation of microorganism quantities of protein utilize the principle of protein dye binding / M. Bradford // Anal. Biochem. -1976. Vol. 72. - P. 248-261.

85. Brune D. Sulfur oxidation by phototrophic bacteria / D. Brune // Biochim. Biophys. Act. 1989. - Vol. 975. -P. 189-221.

86. Brusser T. The biological sulfur cycle / T. Brüser, P. N. L. Lens, H. G. Truper // Environmental technologies to treat sulfur pollution / Ed. by Lens, P.N.L., Pol, L.H. London, UK: IWA Publishing. - 2000b. - P. 47-86.

87. Burdman S. Surface characteristics of Azospirillum brasilense in relation to cell aggregation and attachment to plant roots / S. Burdman, Y. Okon, E. Jurkevitch // Crit. Rev. Microbiol. 2000. -V. 26. - P. 91-110.

88. Caraway B. Aerotaxis in Spirillum volutans / B. Caraway, N. Krieg // Can J Microbiol. 1974. - Vol. 20. - P. 1367 - 1377.twi J s

89. Chakraborty B. Evidence for the occurrence of an alternative nitrogenase system in Azospirillum brasilenseh B. Chakraborty, K. Samaddar // FEMS Microbiol. Lett. 1995. Vol. 127. - P. 127-131.

90. Dahl C. Friedrich (Editors) Microbial Sulfur Metabolism / Christiane Dahl, G. Cornelius, C. Friedrich // Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008 - P. 308.

91. Dahl C. Deposition and oxidation of polymeric sulfur in prokaryotes / C. Dahl // Biochemical principles and mechanisms of biosynthesis and biodégradation of polymers / Ed. by Steinbüchel A Wiley-VCH, Weinheim/ - 1999. - P. 27-34.

92. Dahl C. Inorganic sulfur compounds as electron donors in purple sulfur bacteria / C. Dahl // Sulfur metabolism in phototrophic organisms / Ed. by Hell R, Dahl C, Knaff D. B, Leustek T. -. Springer, New York. 2008. - Vol. 27.

93. Davis B. A new high resolution electrophoresis method / B. Davis, L. Ornstein // Society for the study at the New York Academy of medicine. 1959. -P. 112-118.

94. De Lay J. The quantitative measurements of DNA hybridization from renaturation rates / J. De Lay, H. Cottoir, A. Reynearts // Eur. J. Biochem. 1970. -Vol. 12.-P. 133-142.

95. Del Gallo. The rhizosphere and Azospirillum / M. Del Gallo, I. Fendrik // Plant Associations 1994. - P. 57-75.

96. De-Polli H. Serological differentiation of Azospirillum species belonging of different host-plant specificity groups / H. De-Polli, B. Bohlool, J. Dobereiner // Arch. Microbiol. 1980. - V. 126. - P. 217-222.

97. Dobereiner J. Ecological distribution of Spirillum lipoferum Beijerinck / J. Dobereiner, I. Marriel, M. Nery // Can. J. Microbiol. 1976. - Vol. 22. - P. 14641473.

98. Dobereiner J. Selective infection of maize roots by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria / J. Dobereiner, V. Baldani // Can. J. Microbiol. 1979. - Vol. 25. - P. 264-269.

99. Dobereiner J. Ten years Azospirillum II Azospirillum III: Genetics, Physiology, Ecology / Ed. Klingmuller W.// Berlin: Springer, 1983. - EXS48. -P. 9-23.

100. Dobereiner J. The genera Azospirillum and Herbaspirillum/ J. Dobereiner// The Prokaryotes, 2nd ed. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 1990. - P. 22362253.

101. Dobereiner J. Nitrogen-fixing Bacteria in Nonleguminous Crop Plants / J. Dobereiner, F.Pedrosa // Nature. 1987. - V.338. - P. 579-581.

102. Douglas A. Symbiotic Interactions / A. Douglas // Oxford; New York; Toronto: Oxford Univ. Press. 1994. - P. 194.

103. Eckert B. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus / B. Eckert, O. Weber, G. Kirchhof, A. Halbritter, M. Stoffes, A. Hartmann// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001- Vol. 51. -P. 17-26.

104. Falk E.C. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense Magalhäes et.al. 1984 and emendation of the description of the genus Azospirillum / E. Falk, J. Dobereiner, J. Johnson, N. Krieg // Int.J. Syst. Bacteriol. 1985. -V.35.-P. 117-118.

105. Fay P. Microbiol / P. Fay // Rev. 1992. - V. 56. - P. 340-373.

106. Fedorov D. A new system of degenerate-oligonucleotide primers for detection and amplification of nifHD genes / D. Fedorov, E. Ivanova, N. Doronina, Iu. Trotsenko // Mikrobiologia, 77 2008 - V.2. - P. 286-288.

107. Ferguson S. J. Nitrogen cycle enzymology / S.J. Ferguson // Curr. Opin. Chem. Biol.- 1998. V.2.-P. 182-193.

108. Fieldes M. An explanation of the achromatic bands produced by peroxidaseisozymes in Polyacrylamide electrophoresis gels stained for malate dehydrogenase / M. Fieldes // Electrophoresis. 1992. - V. 13, № 1-2. - P. 82 - 86. : ;J\\

109. Friedrich C. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by bacteria: ;< emergence of a common mechanism / C. Friedrich, D. Rother, F. Bardischewsky, A. Quentmeier, J. Fischer //Appl Environ Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 28732882.

110. Grabovich M.Yu. Lithoautotrophic growth of the strain Beggiatoa D-402 and energy conservation in a homogeneous under microoxic conditions / M.Yu. Grabovich, V.Yu. Patritskaya, M.S. Muntyan, G.A. Dubinina // FEMS MicrobXett.-. 2001.-V.204.-P. 341-345.

111. Hartmann A. Comparison of nitrogenase regulation in A. brasilense, A. lipoferum and A. amazonense / A.Hartmann, H. Fu, S. Song, R. Burris // Azospirillum III: Genetics, Physiology and Ecology. Springer-Verlag. Berlin, Germany 1985. - P. 116-126.

112. Hartmann A. Effect of carotenoid overproduction; on oxygen tolerance of nitrogen fixation in Azospirillum brasilense Sp7 / A.Hartmann, T. Hurek. // J. Gen. Microbiol. 1988c. - Vol. 134. - P. 2449-2455.

113. Hartmann A. Influence of amino acids on nitrogen fixation activity and growth of Azospirillum spp. / A.Hartmann, H. Fu, R. Burris // Environ. Microbiol. 1988d. - Vol. 54.-P. 87-93.

114. Hartmann A. Regulation of nitrogenase activity by oxygen in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum / A. Hartmann, R. Burris // J. Bacteriol. -1987. Vol. 169. - P. 944-948.

115. Howarth, R. Unz, E. M. Sevior et al // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - Vol. 49. -P. 1817-1827.

116. Janiczek O. Purification and properties of malate dehydrogenase from Paracoccus denitriflcans / O. Janiczek, J. Kovar, Z. Glatz // Prep. Biochem. 1993. - V.23, № 3. - P. 285-301.

117. Kelly D. P Oxidative metabolism of inorganic sulfur compounds by bacteria / D. Kelly, J. Shergill, W. Lu, A. Wood // Antonie Van Leeuwenhoek. 1997. - P. 95-107.

118. Khammas K. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere / K. Khammas, Ageron, E. Grimond, P. Kaiser // Soil. Res. Microbiol. 1989. - V. 140. - P. 679-693.

119. Kletzin A. Oxidation of sulfur and inorganic sulfur compounds m Acidianus ambivalens II A. Kletzin // Microbial Sulfur Metabolism / Ed. by C. Dahl, C. G. Friedrich. 2008. - Ch.15. - P. 184 - 201.

120. Krieg N. Genus Azospirillum / N. Krieg, J. Dobereiner // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins. Baltimore 1984. - Vol. 1. - P. 94-104.

121. Laemmly U. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 /U. Laemmly//Nature. 1970. - V.77. - №4. - P. 680-683.

122. Lin S. Azospirillum picis sp.nov., isolated from discarded tar / S. Lin, C. Young, H. Hupfer, C. Siering, A. Arun, W. Chen, W. Lai, F. Shen, P. Rekha, A. Yassin // Int J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. - V. 59. - P. 761-765.

123. Lin W. Enhanced mineral uptake by Zea mays and Sorghum bicolor roots inoculated with Azospirillum brasilens / W. Lin, Y. Okon, R. Hardy // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 45. -P. 1773-1779.

124. Lopez de Victoria G. Chemotactic behavior of Azospirillum species to aromatic compounds / Lopez de Victoria, C. Lovell // Appl. Environ. Microbiol. -1993-V. 59.-P. 2951-2955.

125. Ludden P.W. Reversible ADP-ribosylation as a mechanism of enzyme regulation in procaryotes / P.W. Ludden // Mol Cell Biochem. 1994. - V. 138. № 1-2.-P. 123-129.

126. Malik K. A. Chemolithoautotrophic growth of bacteria able to grow under N2-fixing conditions / K. A. Malik, H. G. Schlegel // FEMS Microbiol Lett. -1981.-V.11-P. 63-67.

127. Marmur J. Procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms / J. Marmur // J. Mol. Biol. 1961. - Vol. 3. - P. 208-218.

128. Marusina A. A system of oligonucleotide primers for amplifying nifH genes from various taxonomic groups of prokaryotes / A. Marusina, E. Bulygina, B. Kuznetsov, T. Turova, I. Kravchenko, V. Gal'chenko // Mikrobiologiia. -2001, 70(1),-P. 86-91.

129. Mehnaz S. Asospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere / S. Mehnaz, B. Weselowski, G. Lazarovits // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. -V. 57. - P. 620-624.

130. Mehnaz S. Azospirillum zeae sp., a diazotrophic bacterium isolated from rhizosphere soil of Zea mays / S. Mehnaz, B. Weselowski, G. Lazarovits // Int.J .Syst. Evol. Microbiol. 2007. - V.57. - P. 2805-2809.

131. Mori E. Cloning, nucleotide sequencing, and expression of the Azospirillum brazilense Ion gene: involvement in iron uptake / E. Mori, M. Fulchieri, C. Indorato, R. Fani, M. Bazzicalupo // J.Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 3440 -3446.

132. Morris H. Quantitative determination of elemental sulfur in aromatic hydrocarbons / H. Morris, R. Lacombe, W. Lane // Anal. Chem. 1948. - V. 20. -P. 1037-1039.

133. Mukhopadhyaya P. A soxA gene, encoding a diheme cytochrome c, and a sox locus, essential for sulfur oxidation in a new sulfur lithotrophic bacterium / P. Mukhopadhyaya, C. Deb, C. Lahiri, P. Roy // J Bacterid. 2000. - Vol. 182. - P. 4278-4287. ,

134. Muratova. Oil-oxidizing potential of associative rhizobacteria of the genus Azospirillum/ A. Muratova, O. Turkovskaia, L. Antoniuk, O. Makarov, L. Pozdniakova, I. Ignatov // Mikrobiologia. 2005. - Vol. 74. - P. 248-254.

135. Nair S. Recent developments in the genetics of nitrogen fixation in Azospirillum II Azospirillum II: Genetics, Physiology, Ecology / S. Nair, P. Jara, B. Quiviger, C. Elmerich // Ed. by W. Klingmuller. Basel: Birkhauser, 1983. P. 2938.

136. Nakamura K. Purification and properties of thiosulfate dehydrogenase from Acidithiobacillus thiooxidans JCM7814 / K. Nakamura, M. Nakamura, H. Yoshikawa, Y. Amano // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. - Vol. - 65. P. 102-108.

137. Nesterenko M. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in poly aery lamide gels / M. Nesterenko, M. Tilley, S. Upton//J. Biochem. Biol. 1994. - V. 28. - P. 239-242.

138. Okon Y. Carbon and ammonia metabolism of Spirillum lipoferum / Y. Okon, S. Albercht, R. Burris // J. Bacteriol. 1976. - V. 128. - P. 592-597.

139. Okon Y. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants / Y. Okon, J. Vanderleyden//ASM News. 1997. - V. 63. - P. 366-370.

140. Owen R. The shermal denaturation of partly purified bacterial deoxyribonucleic acid and its taxonomic / R. Owen, S. Lapage // J. Appl. Bacteriol. 1976.-Vol. 41.-P. 335-340.

141. Patriquin D. Light microscopy obersvations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other grasses in Brazil / D. Patriquin, D. Dobereiner// Can. J. Microbiol. 1978 - Vol. 24. - P. 734-742.

142. Patriquin D. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses / D. Patriquin, J. Dobereiner, D. Jain // Can. J. Microb'iol. 1983 - Vol. 29.-P. 900-915. ' < " ? V « *<'£1. A t V » < t 4

143. Peng G. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass / G. Peng, H. Wang, G. Zhang, W. Hou, Y. Liu, E. Wang, Z. Tan // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - V. 56. - P. 1263-1271.

144. Pfennig N. Uber das vitamin B12 bedurfuis phototropher Schwefelbakterien /N. Pfennig, K.D. Lippert // Arch, microbiol. - 1966. - V. 55. - № 1. - P. 245-256.

145. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H.Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - № 1/2. - P. 265-275.

146. Purschke W. The terminal quinol oxidase of the hyperthermophilic archaeon Acidianus ambivalens exhibits a novel subunit structure and gene organization / W.

147. Purschke, C. Schmidt, A. Petersen, G. Schäfer // J Bacteriol 1997. Vol. 179. - P. 1344-1353.

148. Quiviger B. Cloning of a nitrogen fixation (nif) gene cluster of Azospirillum brasilense / B. Quiviger, C. Franche, G. Lutfalla, D. Rice, R. Haselkorn, C. Elmeric/ZBiochimie. 1982. - Vol. 64. - P. 495-502.

149. Rice S. The aconitase of yeast. II crystallisation and general properties of yeast aconitase / S. Rice, N. Pon // J. Biochem. 1975. - V. 77. - № 2. - P. 367372.

150. Robson R. L. Oxygen and hydrogen in biological nitrogen fixation / R. L. Robson, J. R. Postgate // Annu. Rev. Microbiol. 1980. - V. 34/ - 183-207.

151. Rother D. Novel genes of the sox gene cluster, mutagenesis of theflavoprotein SoxF and evidence for ,a general sulfur-oxidising system* ' . ! 'f in Paracoccus pantotrophus GBl7 / D. Rother, H-J. Henrich, A. Quentmeier, F.

152. Bardischewsky, C. Friedrich // J Bacteriol. 2000. - Vol. 183. - P. 4499-4508.

153. Sabehi G. New insights into metabolic properties of marine bacteria encoding proteorhodopsins / G. Sabehi, A. Loy, K. H. Jung et al. // PLoS Biol. -2005.-Vol.3. -P. 1409-1417.

154. Sarba W. Effect of oxygen on formation and structure of Azotobacter vinelandii alginate and its role in protecting nitrogenaze / W. Sarba // Appl.Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 4037 - 4044.

155. Schedel M. Purification of Thiobacillus denitrificans siroheme sulfite reductase and investigation of some molecular and catalytic properties / M. Schedel, H. G. Truper // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - Vol. 568. - P. 454467.

156. Schloter M. Endophytic and surface colonization of wheat roots (Triticum aestivum) by different Azospirillum brazilense strains studied with strain-specific monoclonal antibodies / M. Schloter, A. Hartmann // Symbiosis. 1998. - V. 25. -P. 159- 179.

157. Shah V.K. Isolation of anions-molybdenum cofactor from nitrogenase / V.K. Shah, W.J. Brill // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1977, V. 74, P. 3249-3253.

158. Shen J. Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein II J. Shen, D. R. Dean, W. E. Newton / Biochemistry, 1997, V. 36, P. 4884-4894.

159. Shevchenko A. Mass spectrometric sequncing of protein from silver-stained polyarylamide gels / A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm // Anal. Chem. 1996. -Vol.68. P. 850—858.

160. Shi N.Q. SHAM-sensitive alternative respiration in the xylose-metabolizing yeast Pichia stipitis / N.Q. Shi, J. Cruz, F. Sherman & T. Jeffries // Yeast 19, 2002; 1203-1220.

161. Song S. Purification and properties of the nitrogenase of Azospirillum amazonense / S. Song, A. Hartmann, R. Burns // J. Bacteriol. 1985. - V. 164- P. 1271-1276.

162. Sorbo B.N. Rhodanase / B.N. Sorbo // Methods in Enzymology II. N.Y., ' 1955.-P.334-337.

163. Sorokin D. Oxidation of thiosulfate to tetrathionate by an haloarchaeon isolated from hypersaline habitat/D. Sorokin, T. Tourova, G. Muyzer // Extremophiles. -2005. V. 9. - P. 501-504.

164. Steenhoudt O. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects / O. Steenhoudt, J. Vanderleyden // FEMS Microbiol Rev. 2000. V. 24. - P. 487-506.

165. Stewart W. Acetylene reduction by nitrogen fixing blue-green algae / W. Stewart, G. Fitzerald, R. Burris // Arch Mikrobiol 62. 1968. - P. 336-348.

166. Suzuki I. Sulfite:cytochrome c oxidoreductase of Thiobacilli / I. Suzuki // Methods. Enzymol. 1994. - Vol. 243. - P. 447-454.

167. Teske A. The genera Beggiatoa and Thioploca / A. Teske, D. C. Nelson // The Prokaryotes / Ed. by Dworkin, M., Falkow, E., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H., Stackebrandt, E. 2006. - Vol. 6. - P. 784 - 810.

168. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools / J.D. Thompson et al. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4876-4882.

169. Umali — Garcia M. Association of Azospirillum with grass roots / M. Umali Garcia, D. Hubbel, M. Gaskins, F. Dazzo // Appl. Environ. Microbiol. - 1980. -V. 39.-P. 219-226.

170. Van de Peer Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, R. De Wachter // Comput. Applic. Biosci. 1994.1. V. 10.-P. 569-570.

171. Veeger C.B. Succinate Dehydrogenase / C.B. Veeger, B.W. Devatanin // Meth. enzyme citric acid cycle. 1969. - V. 23. - P. 81-90.

172. Visser J. Purification and characterization of a periplasmic thiosulfate dehydrogenase from the obligately autotrophic Thiobacillus sp. W5. / J. Visser, de Jong GAH, L. Robertson, J. Kuenen // Arch Microbiol. 1997. - 166. - P. 372378.

173. Wayne L. G. International Committee on Systematic Bacteriology. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics / L. Wayne et al. II Int J Syst Bacteriol 37. 1987. - P. 463-464.

174. Wood P. Chemolithotrophy. In Anthony C. (ed.), Bacterial Energy Transduction / P. Wood // Academic Press, London. 1988 UK. - P. 183-230.

175. Xie C. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oryza sativa / C. Xie, A. Yokota // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2005. -V. 55. -P.1435-1438.

176. Yamada K. Constituents of Holothuroidea, Isolation and structure oft r * \ 1 • ' « t , ' r <"* ' /biologically active glycosphingolipids from the sea cucumber Cucumaria echinatai * jt > / i „'¡t •

177. Yamada et al. II Eur. J. Org. Chem. 1998a. - P. 371-378.

178. Yates M.G. The nitrogen and sulphur cycles / M. Yates // University Press, Cambridge, 42. -1988. P. 386-416.

179. Young C. Azospirillum rugosum sp.nov., isolated from oil-contaminated soil / C. Young et.al. II Int.J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V.58. - P.959-963.

180. Zhou Y. Azospirillum palatum sp. nov., isolated from forest soil in Zhejiang province, China / Y. Zhou, W. Wei, X. Wang, L. Xu, R. Lai // J. Gen. Appl. Microbiol. 2009 - V. 55. P.l-7.

181. Zimmer W. An alternative explanation for plant growth promotion by bacteria of the genus Azospirillum / W. Zimmer, K. Roeben, H. Bothe // Planta. -1988.-V. 176.-P. 333-342.

Информация о работе

Лавриненко, Ксения Сергеевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Биология нового неассоциативного факультативно литотрофного представителя рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Биология нового неассоциативного факультативно литотрофного представителя рода Azospirillum - Azospirillum thiophilum sp. nov. - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы