Строение активного центра, физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы у представителей различных экологических групп бактерий

Парфенова, Ирина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Строение активного центра, физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы у представителей различных экологических групп бактерий
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Строение активного центра, физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы у представителей различных экологических групп бактерий"

На правах рукописи

005003962

Парфенова Ирина Владимировна

СТРОЕНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И

РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП

БАКТЕРИЙ

Специальность 03.01.04 - биохимия

- 8 ДЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Воронеж -2011

005003962

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Попов Василий Николаевич

доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна

кандидат биологических наук Семенова Елена Васильевна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

оо

Защита состоится «с<3» декабря 2011 года в /5 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан ««?/» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор 2 Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Малатдегидрогеназный комплекс можно с уверенностью отнести к одной из систем, обеспечивающих жизнедеятельность многих организмов. НАД+-зависимая оксидоредуктазная малатдегидрогеназа (МДГ) (К.Ф. 1.1.1.37) имеет универсальное распространение в клетках всех живых организмов - архей, эубактерий, грибов, растений и животных ^¡е^, 1992; Епринцев, Игамбердиев, 1995; Мшгай ег а1., 1998; Волвенкин и др., 1999; Мтапк а1., 2002; 1аппеПа ^ а1., 2004) и катализирует взаимопревращение малата в оксалоацетат, используя НАД' или НАДН в качестве кофермента.

Обычно МДГ представлена в клетках различных организмов в виде множественных молекулярных форм, число которых изменяется в зависимости от групповой принадлежности живых существ, их образа жизни и сложности метаболизма. Помимо участия в процессах клеточного дыхания, в цикле трикарбоновых кислот и глиоксилатном цикле, малатдегидрогеназа способна играть важную роль в адаптации эукариот к различным стрессовым воздействиям.

Важное место в понимании механизма каталитического действия ферментов занимает исследование структуры активного центра белка. Для каждого фермента характерна определенная конформация активного центра, обеспечивающего специфическое взаимодействие с молекулами субстратов и осуществляющего каталитический акт. Причем для эффективного образования фермент-субстратного комплекса большое значение имеет не только геометрическое соответствие (комплементарность) молекул фермента и субстрата, но и образование водородных связей, электростатические и гидрофобные взаимодействия между атомами активного центра фермента и молекулами субстрата.

Структура активного центра изоферментов МДГ из различных источников может отличаться по типу аминокислотных остатков,

образующих микроокружение (дополнительные аминокислоты) и каркас (вспомогательные аминокислоты) данного участка белковой молекулы. В то же время структура активного центра МДГ обладает высокой степенью консервативности ^еГГап, МсАН81ег-Непп, 1991; Ве11 ^ а1., 2001; ЬеЬшпс^ег й а1., 2004).

Малатдегидрогеназа играет важную роль в компенсации различных метаболических стрессов, возникающих в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. В литературе встречается много данных о влиянии высоких концентраций соли, высоких и низких температур, недостатка воды, связей, определяющих компактность упаковки белковой молекулы, на состояние малатдегидрогеназной системы (Мтапк с! а1., 2002; Ыгша е1 а1., 2004; Ма(1егп, 2асса1, 2004). Структурные перестройки молекулы МДГ являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к факторам различной природы (Е1зепЬе^, 1995; Е1соск, МсСашшоп, 1998).

В связи с этим исследование аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы, а также комплексное изучение свойств фермента из бактериальных объектов различной экологической природы представляет особый интерес.

Необходимость исследования продиктована широким распространением бактерий в природе, их способностью адаптироваться к разнообразным условиям существования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование физико-химических, кинетических и регуляторных характеристик малатдегидрогеназы бактериального происхозвдения, определение функциональных групп аминокислотных остатков, которые могут принимать участие в катализируемой малатдегидрогеназой ферментативной реакции, изучение строения активного центра МДГ из бактерий различных экологических групп.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий;

2. Изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из бактерий Шюс1оуи1ит з1еррете А-20з;

3. Исследовать на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические, каталитические и регуляторные характеристики МДГ из ЮхойоуиЫт х1еррете А-20$\

4. Изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ из бактерий рода Ююс1оуи1ит\

5. Определелить с помощью метода химической модификации аминокислотный состав активного центра малатдегидрогеназы из бактерий Шюс1о\'и1ит Шеррете А-20з и БркаегоШиь пМат Д-507;

6. Выявить функциональные группы аминокислотных остатков, участвующие в ферментативной реакции, катализируемой МДГ;

7. Произвести расчет количества идентифицированных аминокислотных остатков в активных центрах МДГ из исследуемых бактериальных объектов.

Научная новизна. Впервые проведено изучение аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из бактериальных объектов различных экологических групп (БрИаегоШш пШат Д-507 и ШюЖл'икип $(еррете А-20з). Получение гомогенных препаратов МДГ из исследуемых микроорганизмов позволило изучить кинетические и регуляторные свойства фермента. Выявлена важная структурная особенность димерной формы малатдегидрогеназы из галофильных бактерий ШподохчЛит .Шррете штамм А-20з - большая по сравнению с МДГ из других объектов молекулярная масса субъединиц (48 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента, необходимую для его функционирования в экстремальных условиях.

Практическая значимость. Практическая значимость настоящей работы состоит в расширении и углублении знаний о структуре активных центров малатдегидрогеназы, о роли МДГ в механизмах адаптации бактерий к факторам внешней среды. Полученные гомогенные препараты малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, термодинамических параметров реакций, катализируемых МДГ.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, микробиологии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 11-ой и 14-ой международных Путинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2007, 2010), международной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), четвертом Всероссийском международном конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз, Россия» (Воронеж, 2011), межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2008, 2009, 2010, 2011), ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2010).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 14 публикациях - 10 статьях и 4 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,

экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (203 источника). Иллюстрационный материал включает 39 рисунков и 4 таблицы.

Благодарность. Автор выражает особую благодарность д.б.н. Грабович М.Ю., асс. Белоусовой Е.В., а также к.б.н. Компанцевой Е.И. за предоставленные культуры бактерий для исследований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов исследования служили фототрофные галоалкалофильные пурпурные несерные бактерии -Мос1оуи1ит steppen.se А-20з, выделенные из мелководных степных содовых озер Центральной Азии, а также представители бесцветных нитчатых серобактерий - БрИавгоШих паШпз штамм Д-507, матообразующие бактерии, выделенные из умеренно термального сульфидного источника Краснодарского края (г. Горячий Ключ).

Определение активности фермента. Активность малатдегидрогеназы определяли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, которая определяется скоростью образования или расходования НАДН. За единицу активности (Е) принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 минуту при 25°С.

Определение количества белка. Измерение общего количества белка, содержащегося в пробах, проводили, используя метод Лоури (Ьоиту й а1., 1951).

Выделение и очистка малатдегидрогеназы. Очистку осуществляли по схеме, включающей получение экстракта фермента, гель-фильтрацию на колонке с сефадексом С-25, ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гель-хроматографию на колонке с сефадексом С-200.

Электрофоретические_исследования. При проведении

аналитического электрофореза использовали метод Дэвиса и Орнстейна (Davis, Ornstein, 1959). Проявление на белок проводили по методике с нитратом серебра (Nesterenko et al., 1994; Shevchenko et al., 1996). Специфическое проявление МДГ осуществляли тетразолиевым методом (Гааль и др., 1982; Fieldes, 1992).

Исследование кинетических параметров. Кинетические и регуляторные свойства МДГ изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, расчет термодинамических параметров осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Диксон, Уэбб, 1982).

Идентификация аминокислотных остатков. Для определения функциональных групп аминокислотных остатков, которые могут принимать участие в катализируемой малатдегидрогеназой ферментативной реакции, очищенный ферментный препарат инкубировали при 25°С с растворами п-хлормеркурибензоата, 2,3-бутандиона, пиридоксаль-5-фосфата (в 50 мМ трис-НС1-буфере, pH 8,5), диэтилпирокарбоната (в 100 мМ натрий-фосфатном бефере, pH 8,4). Перед анализом ДЭПК разбавляли этанолом, концентрация спирта в реакционной смеси не превышала 1,5 %. Реакцию начинали внесением модификаторов различной концентрации (ДЭПК, п-ХМБ, 2,3-бутандиона, пиридоксаль-5-фосфата) в среду инкубации. Через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали аликвоты и определяли активность фермента при 340 нм на СФ-26.

Для изучения защитного действия субстрата (оксалоацетата) при инактивации фермента МДГ выдерживали с 2 мМ оксалоацетатом в течение 5 мин при 25°С перед добавлением модификаторов. Для расчета количества

остатков гистидина, цистеина, аргинина и лизина, модифицированных специфическими ингибиторами, спектрофотометрически определяли

временные кривые остаточной ферментативной активности, константы скоростей инактивации фермента и порядок реакции.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 8-10 биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента (Ллойд, Ледерман, 1989, Лакин, 1990, Чернышев, Стариков, 1998).

ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ МДГ ИЗ БАКТЕРИЙ

ШЮООПЛиМ&ГЕРРЕЖЕ А-208, БРНАЕКОШиБНАТАШ Д-507

Для изучения строения активного центра, физико-химических, кинетических и регуляторных свойств МДГ из исследуемых бактерий были проведены очистки ферментных препаратов. Результаты типичной очистки приведены в таблице 1.

Использование многостадийной очистки позволило получить ферментный препарат малатдегидрогеназы из бактерий Шюс!ош1ит 81ерреп$е штамм А-20Б, культивируемых в фотоорганотрофных условиях, с удельной активностью 3,775±0,113 Е/мг белка (степень очистки 92 раза) и препарат МДГ из БркаеШ'йт пШап-ч, выращенных хемоорганотрофно, с удельной активностью 4,580±0,137 Е/мг белка и степенью очистки 55 раз.

Проведенный электрофоретический анализ очищенного препарата МДГ из ЯАос/оум/мот $1ерреп$е показал, что в полиакриламидном геле при универсальном окрашивании на белки и специфическом проявлении обнаруживалась одна полоса с ЯГ = 0,53 (рис.1).

Электрофоретические исследования очищенного препарата из ЕрЬаегоШт пШапБ штамм Д-570 также свидетельствуют о гомогенности полученных образцов фермента. Значение ЯГ составило 0,5.

Таблица 1.

Очистка МДГ из Якос1о\>и1ит $1еррете штамм А-20з, (п = 3, р < 0,05)

Стадии очистки Общий объем, мл Общая активность, Е Белок, мг Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход, %

Гомогенат 6,5 13,91± 0,41 338,4± 9,44 0,041±0,001 1,0 100

Супернатант 5 9,73± 0,26 215,7* 6,47 0,045±0,001 1,1 70

Гель-фильтрация через сефадекс в-25 6 8,17± 0,24 78,0± 2,31 0,105±0,003 2,5 58

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 6 6,42± 0,19 5,13± 0,15 1,25 Ш,037 30,5 46

Гель-хроматография на сефадексе в-200 1 2,78± 0,08 0,74± 0,02 3,775±0,113 92,0 20

Рис. ]. Электрофореграмма МДГ из Я?10с10У1<1ит э1еррете штамм А-20з:

а - специфическое проявление; б - окрашивание нитратом серебра; И - фронт красителя бромфенолового синего.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И СУБЪЕДИНИЧНОГО СТРОЕНИЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

С помощью гель-хроматографии на сефадексе С-200 была определена молекулярная масса нативного фермента из Rhodovulum $1еррете. Элюция МДГ осуществлялась в виде одного пика. Значение молекулярной массы фермента из исследуемых бактерий составило 102±2,4 кДа. Электрофоретическое исследование белка в присутствии додецилсульфата натрия (рис. 2) позволило определить величину молекулярной массы одной субъединицы, которая составила 48±1,9 кДа. Ранее для МДГ из ЗркаегоШш пШат было установлено значение молекулярной массы нативного фермента (71±1,4 кДа) и размер субъединиц (35±1,7 кДа) (Арабцева, 2009).

Рис. 2. Бв-Иа-электрофорез МДГ из И1юс1оуи1шп ьгеррете штамм А-20$:

11-фосфорилаза Ь\

,2-БСА;

~3-овальбумин;

7 4-карбоангидраза;

„5-ингибитор трипсина;

6-лизоцим;

6 7-исследуемый фермент (МДГ).

Сравнение результатов гель-хроматографии и Бв-Ма-электрофореза показывает, что МДГ из Мос1оуи1ит $1еррете и Зркаегоп1т пШаю в условиях фотоорганотрофного и органотрофного роста, соответственно, представлена димером.

КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МДГ ИЗ ЯНООО УНЕ UMSTEPPEN.SE /\-20S

На гомогенных препаратах фермента исследованы кинетические и регуляторные свойства МДГ (табл.2).

Показано более высокое сродство фермента к оксалоацетату и более низкое - к малату, что согласуется с данными других авторов (Wiseman et al., 1991; Wynne et al., 1997, Струмило и др., 2006). Сравнение величин Км по коферментам показало, что сродство МДГ из исследуемых бактерий к НАДН выше, чем к НАД\ Установлено, что оптимальные значения рН находились в щелочном диапазоне.

Таблица 2.

Кинетические и регуляторные характеристики МДГ из Rhodovulum steppense

Свойства Rhodovulum steppense A-20s

Км (OA), мкМ 40,6 ±1,2

Км (НАДН), мкМ 71,5±2,1

Км (малат), мкМ 200,4±6,8

Км (НАД+), мкМ 125,7 ±3,4

рН-оптимум (OA) 8,2

рН-оптимум (малат) 10,0

Исследование кинетических характеристик малатдегидрогеназы из бактерий Rhodovulum steppense выявило ингибирование фермента высокими концентрациями оксалоацетата, что согласуется с данными большинства других исследователей (Mahmoud et al., 1995; Kuijk, Stams, 1996; Wise et al., 1997). Величина константы субстратного ингибирования (оксалоацетат) для МДГ из Rhodovulum steppense, культивируемых фотоорганотрофно, составила 2,9±0,08 мМ.

При изучении влияния ионов двухвалентных металлов на активность МДГ установлено, что ионы марганца (Мп2+) и кальция (Са2+) в пределах концентраций 4-40 мМ ингибируют малатдегидрогеназу из бактерий Rhodovulum steppense по бесконкурентному типу. При этом ионы кальция в концентрациях до 4 мМ активировали фермент. Ионы бария (Ва2+) являются

конкурентными ингибиторами МДГ из исследуемых бактерий. Ионы магния (N^2+) в концентрациях 2-40 мМ активируют фермент из ЮкхЛоуикпп steppen.se по конкурентному типу.

При исследовании влияния ряда субстратов ЦТК на активность МДГ из галофильных бактерий К1юс1оуц1ит steppen.se было установлено, что цитрат является конкурентным ингибитором фермента в концентрациях 0,005-0,5 мМ. Сукцинат и изоцитрат в концентрациях 0,005-5 мМ не влияли на активность МДГ из КЬодоуиЫт ¡¡еррете.

Температурный оптимум для малатдегидрогеназы из КЬос1оуи1ит steppen.se при восстановлении оксалоацетата составил 50°С, а при окислении малата - 40°С. На основе полученных данных были построены графики Аррениуса для реакций восстановления оксалоацетата и окисления малата, а также рассчитаны значения энергии активации (Еакт) для переходного состояния фермент-субстратного комплекса, которые составили 4,1 и 3,7 кДж/моль в случаях прямой и обратной реакций, соответственно.

При изучении термостабильности малатдегидрогеназы из галоалкалофильных бактерий было показано, что фермент из Шос1охи1шп steppen.se стабилен в интервале температур от 0 до 40°С, а при 60°С наблюдается резкое снижение активности.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ АКТИВНОГО ЦЕНТРА МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

В формировании активного центра фермента принимают участие отдельные аминокислотные остатки, содержащие разнообразные по реакционной способности функциональные группы (гистидина, аргинина, триптофана и др.).

При изучении аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из галоалкалофильных бактерий Шюс!оуи1ит я(еррепзе и

бесцветных нитчатых серобактерий Sphaerotilus natans применяли реакции химической модификации функциональных групп белка.

Для выяснения функциональной роли гистидиновых остатков использовали модификацию под действием диэтилпирокарбоната (ДЭПК), остатков цистеина (SH-группы) - модификацию и-хлормеркурибензоатом («-ХМБ). Для идентификации остатков аргинина в активном центре малатдегидрогеназы из бактериальных объектов использовали химическую модификацию 2,3-бутандионом, для определения остатков лизина фермент инкубировали в присутствии различных концентраций пиридоксаль-5-фосфата.

Анализ полученных данных позволил установить зависимость скорости инактивации фермента от концентрации модификатора и времени инкубации (рис. 3).

Рис. 3. Модификация МДГ диэтилпирокарбонатом из Rhodovulum steppense штамм A-20S. Представлены

временные кривые

остаточной ферментативной 1 активности.

Концентрации ДЕПК: -*2 1 -0,005 мМ; 2-0,01 мМ; ll 3-0,1 мМ; 4-0,15 мМ; 5 5-0,3 мМ; 6-0,5 мМ

15 мин

Известно, что субстраты могут защищать фермент при химической модификации (Sheflyan et al., 1999; Faridmoayer, Seaman, 2005). В результате проведенного исследования установлено, что оксалоацетат оказывает выраженный защитный эффект при инкубации МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans с используемыми модификаторами (рис. 4).

Использование метода химической модификации специфическими ингибиторами (ДЭПК, л-ХМБ, 2,3-бутандион) позволило определить порядок реакции и произвести расчет количества модифицированных остатков гистидина, цистеина и аргинина в активном центре МДГ из Шюс/оуик/т з(еррсп.че и Бркаего^т па1ат.

Рис. 4. Защитное действие оксалоацетата при модификации МДГ из исследуемых объектов диэтилпирокарбонатом:

1 - инкубация в присутствии 2 мМ оксалоацетата;

2 - инкубация без оксалоацетата.

Инкубация МДГ из Юю(1оуи1ит steppen.se и 5ркаегоп1т пШат в присутствии различных концентраций пиридоксаль-5-фосфата (1-12 мМ) не вызывала инактивацию фермента, что указывает на отсутствие остатков лизина в активном центре фермента из изучаемых бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получение препаратов МДГ в электрофоретически гомогенном состоянии позволило исследовать её физико-химические и регуляторные свойства, аминокислотный состав активного центра, выявить роль аминокислотных остатков в каталитическом механизме действия малатдегидрогеназы из бактерий различных экологических групп.

Использование бактерий родов Шос1(тйит и 5'рИаешИш, культивируемых фотоорганотрофно и хемоорганотрофно, а также применение различных методов (гель-хроматография, нативный электрофорез, Бз-Ыа-электрофорез) дало возможность установить, что в этих условиях функционирует димерная форма малатдегидрогеназы. При этом

показано, что МДГ из галофильных бактерий представляет собой димер, характеризующийся большей (по сравнению с МДГ из других объектов) молекулярной массой субъединиц (48 кДа), что, по-видимому, может обеспечивать адаптацию данных микроорганизмов к существованию в условиях содержания в среде высоких концентраций соли. Сходные данные об особенностях структурной организации молекулы МДГ были получены для малатдегидрогеназы из бактерий Vulcanithermus medioatlanticus, существующих в условиях экстремально высоких температур, а также для фермента из фототрофных пурпурных бактерий Rhodopseudomonas palustris с величиной субъединиц 45 кДа (Епринцев и др., 2008; Епринцев и др., 2005).

При изучении кинетических и регуляторных характеристик МДГ из галоалкалофильных бактерий Rhodovuhm steppense не выявлено значительных отличий от ферментов из бактерий других экологических групп. Полученные результаты свидетельствуют о высоком сродстве МДГ к оксалоацетату и более низком - к малату, что согласуется с данными других авторов (Wynne et al„ 1997, Струмило и др., 2006). Сравнение величин Км по коферментам показало, что сродство МДГ из исследуемых бактерий к НАДН выше, чем к НАД4. Известно, что реакции окисления малата и восстановления оксалоацетата МДГ протекают согласно упорядоченному механизму, когда сначала с ферментом связывается кофермент и лишь потом субстрат. Полученные экспериментальные данные, вероятно, также свидетельствуют об аналогичной последовательности присоединения кофермента и субстрата к ферменту (Пинейру де Корвалью и др., 1991).

Для изучения аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из галоалкалофильных бактерий Rhodovulum steppense и бесцветных нитчатых серобактерий Sphaerotilus natans применяли реакции химической модификации функциональных групп белка.

Модификация диэтилпирокарбонатом позволила выявить наличие в активном центре МДГ из изучаемых бактерий гистидиновых остатков,

которые играют важную роль в транспорте протонов между субстратом и коферментом.

Известно, что SH-группы присутствуют в белках эукариот, имеющих митохондриальную локализацию, и не встречаются в активном центре цитоплазматических и глиоксисомальных изоферментов, что свидетельствует о различном генетическом происхождении этих двух групп молекулярных форм малатдегидрогеназной системы (Пинейру де Корвалыо и др., 1991). Выявление остатков цистеина в активном центре МДГ из бактерий Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans позволило сделать вывод, что данный фермент по своей значимости приближается к митохондриальным белкам, участвующим в энергетическом обмене эукариот.

Для идентификации остатков аргинина в активном центре малатдегидрогеназы из изучаемых бактериальных объектов использовали химическую модификацию 2,3-бутандионом, для выяснения функциональной роли остатков лизина - модификацию под действием пиридоксаль-5-фосфата. Отсутствие инактивации МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans при разных концентрациях пиридоксаль-5-фосфата (1-12 мМ) позволило установить, что лизин не вовлечен в каталитический механизм действия фермента.

аргининовых остатков в каталитическом акте, осуществляемом малатдегидрогеназой (Fann et al., 1998; Meiss et al., 2001; Ding et al., 2002; Жеребцов и др., 2003). Так, субстрат МДГ оксалоацетат, вероятно, вызывает конформационные изменения в молекуле фермента, связывая имидазольные группы гистидиновых остатков, что предотвращает его быструю инактивацию диэтилпирокарбонатом.

Применение метода химической модификации специфическими ингибиторами (ДЭПК, л-ХМБ, 2,3-бутандион) позволило произвести расчет количества модифицированных остатков гистидина, цистеина и аргинина, что дает представление о структуре активного центра малатдегидрогеназы из изучаемых объектов. Установлен сходный состав активного центра МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans и показано наличие в нем одного остатка аргинина и цистеина и двух остатков гистидина.

На основании полученных результатов можно предложить следующее строение активного центра малатдегидрогеназы из изученных бактерий Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans и функциональную роль аминокислотных остатков.

кольца кофермента. В то же время протон пространственно сближенного с субстратом имидазола гистидина переносится на отрицательно заряженный кислород, чем и завершается восстановление карбонильной группы и превращение оксалоацетата в малат. БН-группы цистеина могут непосредственно участвовать в каталитическом акте, т.е. в образовании и распаде фермент-субстратного комплекса или осуществлять связь фермент-кофактор.

ВЫВОДЫ

1. С помощью многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты малатдегидрогеназы из бактерий разных экологических групп. Установлено, что значения удельной активности исследуемого фермента зависят от источника выделения. При фотоорганотрофном культивировании пурпурных бактерий Ююс1ох<и1ит з1еррете штамм А-20я удельная активность составляет 3,775±0,113 Е/мг белка (степень очистки 92 раза). Препарат МДГ из БрИаегоШиз паШпь в условиях хемоорганотрофного роста имеет величину удельной активности 4,580±0,137 Е/мг белка, степень очистки - 55.

2. Малатдегидрогеназа из исследуемых микроорганизмов имеет сложную четвертичную структуру. Выявлено, что МДГ из Шюс1о\>и1ит я/ерре/ке в условиях фотоорганотрофного роста и БркаегоШш пШапя при хемоорганотрофном культивировании представлена димером.

3. Установлено, что МДГ из галофильных бактерий представляет собой димер, характеризующийся большей (по сравнению с МДГ из других объектов) молекулярной массой субъединиц, значение которой было определено методом Оз-№-электрофореза и составило 48 кДа. Молекулярная масса нативного фермента, определённая гель-хроматографией на сефадсксе С-200, составляет 102 кДа.

4. Выявлено разное сродство фермента к субстратам. Значения Км для МДГ из Икос1оуи!шп ьгеррете свидетельствуют о высоком сродстве фермента к оксалоацетату и более низком - к малату.

5. Показано, что ионы Мп2+ и Са2+ в концентрациях 4-40 мМ ингибируют малатдегидрогеназу из бактерий Шос1оуи1ит $1еррете по бесконкурентному типу, при этом ионы кальция в концентрациях до 4 мМ активировали фермент. Ионы Ва2+ оказывают ингибирующее действие на фермент по конкурентному типу. Ионы Mg2+ в концентрациях 4-40 мМ активируют МДГ из И1юс1оуи1ит steppen.se по конкурентному типу.

6. Определены значения температурного оптимума полученных препаратов фермента. Величина этого показателя для малатдегидрогеназы из ШойошЫт $1еррете при восстановлении оксалоацетата составила 50°С, а при окислении маната - 40°С.

7. С помощью метода химической модификации с использованием специфических ингибиторов исследован аминокислотный состав и рассчитано количество аминокислотных остатков в активных центрах МДГ из бактерий Шойо\и1ит steppen.se и БрЬаегоШш паШт. Установлено присутствие двух аминокислотных остатков гистидина, одного остатка цистеина и аргинина. Наличие остатков лизина в активном центре МДГ из изучаемых бактерий не выявлено.

8. Использование оксалоацетата в качестве защитного субстрата позволило установить функциональную роль аминокислотных остатков в каталитическом механизме действия малатдегидрогеназы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Арабцева М.А. Исследование морфологических структур димерной формы малатдегидрогеназы из серных бактерий БркагегоШт ер. / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.В. Гречкина // Труды молодых ученых ВГУ. - Воронеж. - 2007. - Вып. 1-2. - С. 69-71.

2. Арабцева М.А. Физико-химические и кинетические свойства димерной формы малатдегидрогеназы из Sphaerolilus natans штамм Д-507 / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова // Материалы 11-ой международной молодежной конференции «Биология - наука 21-го века»: Пущино (29 октября - 2 ноября). - 2007. - С. 128

3. Арабцева М.А. Применение ионообменной хроматографии для разделения изоформ малатдегидрогеназы из Sphaerolilus natans штамм Д-507, культивируемых в условиях миксотрофного роста / М.А. Арабцева, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, И.В. Парфенова // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж. - 2008. - Т.8. - Вып.2. - С.277-280.

4. Арабцева М.А. Очистка и регуляторные свойства тетрамерной формы малатдегидрогеназы из бактерий Sphaerotilus natans / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Вестник ВГУ, Серия Химия. Биология. Фармация. - Воронеж. - 2008. - №1. — С.69-73.

5. Арабцева М.А. Регуяторные свойства малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans штамм Д-507 / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, М.В. Гурбик // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж: межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти A.A. Землянухина. 2008. - Вып. 10. - С. 37-40.

6. Арабцева М.А. Влияние типов питания на трансформацию субъединичного строения малатдегидрогеназной системы из бактерий Sphaerotilus sp./ М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): материалы международной конференции -Саранск (15-18 мая). -2008. - С.206-207.

7. Арабцева М.А. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы бактерий Sphaerotilus sp. штамм Д-507 при различных типах питания / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И.

Фалалеева, А.Т. Епринцев // Известия РАН: Серия биологическая. - 2009. - С.283-289.

8. Парфенова И.В. Сравнительный анализ спектров поглощения димерной и тетрамерной форм МДГ из бактерий рода Sphaerotilus / И.В. Парфенова, М.А. Арабцева, М.И. Фалалеева, И.А. Лавриненко, Нгуен Тхи Чук Лоан, И.Ю. Кудрявцева, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти A.A. Землянухина. -Воронеж, 2009. -Вып. 11. -С. 163-167.

9. Парфенова И.В. Генетическая детерминация изоформ МДГ из Sphaerotilus natans штамм Д-507 в разных условиях роста / И.В. Парфенова, Д.Н. Федорин // Материалы 14-ой международной молодежной конференции «Биология - наука 21-го века»: Пущино -2010.-С. 168-169.

Ю.Сатар А.Ф. Кинетические характеристики тетрамерной формы малатдегидрогеназы, полученной с использованием ионообменной хроматографии, из животных и бактерий / А.Ф. Сатар, И.В. Парфенова, Е.В. Мальцева, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж. - 2010 - Т.10. - Вып.2. - С.231-235.

П.Шихалиева К.Д. Физико-химические свойства малатдегидрогеназной системы микроорганизмов из различных экологических групп при смене типа питания / К.Д. Шихалиева, И.В. Парфенова, Е.В. Шульгина, Т.Л. Ву, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Фарис Сатар Абуд // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти A.A. Землянухина. -Воронеж, 2010. - Вып. 12 - С. 46-50.

12.Парфенова И.В. Исследование структурной организации и свойств малатдегидрогеназы из солеустойчивых бактерий Rhodovulum steppense штамм A-20s / И.В. Парфенова, Е.В. Шульгина // Материалы IV

Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов биологов «Симбиоз, Россия», - Воронеж (23-27 мая). - 2011. С. 30-32.

13.Парфенова И.В. Очистка и каталитические свойства малатдегидрогеназы из Rhodovulum sleppense штамм A-20s / И.В. Парфенова, Е.В. Шульгина, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Е.И. Компанцева // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти A.A. Землянухина. -Воронеж, 2011. - Вып. 13 - С. 128-131.

14. Епринцев А.Т. Механизм формирования изоформ малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans Д-507 в различных условиях культивирования / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, М.А. Арабцева, И.А. Лавриненко, И.В. Парфенова, М.В. Гречкина, Ф.С. Абуд // Известия РАН: Серия биологическая. - 2011. -№4 - С.397-402.

Работы № 3, 7, 10, 14 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК.

Подписано в печать 18.11.11. Формат 60*84 Усл. печ. л. 1.4. Тираж 100 экз. Заказ 1424.

Отпечатано с готового оригннал-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Парфенова, Ирина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика фототрофных бактерий.

1.1.1. Типы метаболизма пурпурных бактерий.

1.1.2. Морфофизиологические особенности фототрофных пурпурных бактерий.

1.1.2.1. Морфологические характеристики.

1.1.2.2. Экофизиология фототрофных пурпурных бактерий.

1.1.3. Систематическое положение и морфофизиологические особенности бактерий Якосіоуиіит зїеррете.

1.1.4. Распространение и структура алкалофильного и галоалкалофильного микробных сообществ.

1.2. Характеристика бактерий рода ЗркаегоШиБ.

1.2.1. Морфологические особенности.

1.2.2. Характеристика Зркаегоіїїт пШат.

1.3. Общая характеристика малатдегидрогеназы.

1.3.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ.

1.3.2. Общая характеристика каталитического действия.

1.3.3. Молекулярная масса малатдегидрогеназы.

1.3.4. Влияние концентрации ионов водорода на активность МДГ.

1.3.5. Влияние интермедиатов и ионов.

1.3.6. Влияние температуры на активность МДГ.

1.3.6.1. Термостабильность.

1.3.6.2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции.

1.4. Структура малатдегидрогеназы.

1.4.1. Уровни организации молекулы МДГ.

1.4.2. Структура и функции активного центра МДГ.

1.4.3. Основные методы изучения структуры и аминокислотного состава активных центров.

1.5. Особенности малатдегидрогеназы, выделенной из организмов, живущих в экстремальных условиях.

1.5.1. Характеристика малатдегидрогеназы из галофильных бактерий.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Цель и задачи исследования.

2.2. Объекты и методы исследования.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Методы исследования.

2.2.2.1.Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов.

2.2.2.2. Определение активности ферментов.

2.2.2.3. Определение количества белка.

2.2.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы.

2.2.2.5. Электрофоретические исследования.

2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез.

2.2.2.5.2.Определение гомогенности ферментных препаратов.

2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы.

2.2.2.5.4. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ.

2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента.

2.2.2.7. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов.

2.2.2.8. Идентификация аминокислотных остатков.

2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных.

2.3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.3.1. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий Шойоуиіит яґеррете А-20з, БркаегоШт пШат Д

2.3.1.1 .Очистка малатдегидрогеназы.

2.3.1.2.Определение гомогенности ферментных препаратов.

2.3.1.3.Определение молекулярной массы и субъединичного строения малатдегидрогеназы.

2.3.2. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ.

2.3.2.1. Влияние концентрации ионов водорода.

2.3.2.2. Определение константы Михаэлиса.

2.3.2.3. Определение константы субстратного ингибирования.

2.3.2.4. Влияние ионов двухвалентных металлов и интермедиатов на активность МДГ.

2.3.2.5. Влияние температуры.

2.3.2.5.1. Температурный оптимум.

2.3.2.5.2. Термостабильность МДГ.

2.3.3. Идентификация аминокислотных остатков активного центра малатдегидрогеназы.

2.3.3.1. Модификация МДГ диэтилпирокарбонатом.

2.3.3.1.1. Защитное действие оксалоацетата.

2.3.3.1.2 Расчет количества аминокислотных остатков гистидина в активном центре МДГ.

2.3.3.2. Модификация МДГ гс-хлормеркурибензоатом.

2.3.3.2.1. Защитное действие оксалоацетата.

2.3.3.2.2. Расчет количества аминокислотных остатков цистеина в активном центре МДГ.

2.3.3.3. Модификация МДГ 2,3-бутандионом.

2.3.3.3.1. Защитное действие оксалоацетата.

2.3.3.3.2. Расчет количества аминокислотных остатков аргинина в активном центре МДГ.

2.3.3.4. Модификация МДГ пиридоксаль-5-фосфатом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Строение активного центра, физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы у представителей различных экологических групп бактерий"

Актуальность проблемы. Малатдегидрогеназный комплекс можно с уверенностью отнести к одной из систем, обеспечивающих жизнедеятельность многих организмов. НАД+-зависимая оксидоредуктазная малатдегидрогеназа (МДГ) (К.Ф. 1.1.1.37) имеет универсальное распространение в клетках всех живых организмов - архей, эубактерий, грибов, растений и животных (С1е1:1, 1992; Епринцев, Игамбердиев, 1995; Мшгай е1 а1., 1998; Волвенкин и др., 1999; Мтапк е1 а1., 2002; 1аппейа е1 а1., 2004) и катализирует взаимопревращение малата в оксалоацетат, используя НАД+ или НАДН в качестве кофермента.

Структура активного центра изоферментов МДГ из различных г источников может отличаться по типу аминокислотных остатков, образующих микроокружение (дополнительные аминокислоты) и каркас (вспомогательные аминокислоты) данного участка белковой молекулы. В то же время структура активного центра МДГ обладает высокой степенью консервативности (Steffan, МсА^ег-Непп, 1991; Ве11 е1 а1., 2001; Ье1иипс^ег ег а1., 2004).

Малатдегидрогеназа играет важную роль в компенсации различных метаболических стрессов, возникающих в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. В литературе встречается много данных о влиянии высоких концентраций соли, высоких и низких температур, недостатка воды, связей, определяющих компактность упаковки белковой молекулы, на состояние малатдегидрогеназной системы (Мтапк е1 а1., 2002; 1гнша е1 а1., 2004; Маёегп, гасса1, 2004). Структурные перестройки молекулы МДГ являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к факторам различной природы (Е1зепЬе^, 1995; Е1соск, МсСашшоп, 1998).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование физико-химических, кинетических и регуляторных характеристик малатдегидрогеназы бактериального происхождения, определение функциональных групп аминокислотных остатков, которые могут принимать участие в катализируемой малатдегидрогеназой ферментативной реакции, изучение строения активного центра МДГ из бактерий различных экологических групп.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

2. Изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из бактерий К1юс1оуи1ит 51еррете А-20з;

3. Исследовать на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические, каталитические и регуляторные характеристики МДГ из Ккос1оуи1ит з1еррете А-20б;

4. Изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ из бактерий рода Кко^\>и1ит\

5. Определелить с помощью метода химической модификации аминокислотный состав активного центра малатдегидрогеназы из бактерий КкойоуиЫт я1еррете А-20б и БрНаегоШт пМат Д-507;

Научная новизна. Впервые проведено изучение аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из бактериальных объектов различных экологических групп (БрИаегоШш пМат Д-507 и Ккос1оуи1ит 81еррете А-20б). Получение гомогенных препаратов МДГ из исследуемых микроорганизмов позволило изучить кинетические и регуляторные свойства фермента. Выявлена важная структурная особенность димерной формы малатдегидрогеназы из галофильных бактерий Кко<Ломи1ит 81еррете штамм А-20з - большая по сравнению с МДГ из других объектов молекулярная масса субъединиц (48 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента, необходимую для его функционирования в экстремальных условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 11-ой и 14-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2007, 2010), международной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), четвертом Всероссийском международном конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз, Россия» (Воронеж, 2011), межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2008, 2009, 2010, 2011), ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2010).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (203 источника). Иллюстрационный материал включает 39 рисунков и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Парфенова, Ирина Владимировна

выводы

1. С помощью многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты малатдегидрогеназы из бактерий разных экологических групп. Установлено, что значения удельной активности исследуемого фермента зависят от источника выделения. При фотоорганотрофном культивировании пурпурных бактерий Якос1оуи1ит 81еррете штамм А-20з удельная активность составляет 3,775±0,113 Е/мг белка (степень очистки 92 раза). Препарат МДГ из БрИаегоШш пМат в условиях органотрофного роста имеет величину удельной активности 4,580±0,137 Е/мг белка, степень очистки - 55.

2. Малатдегидрогеназа из исследуемых микроорганизмов имеет сложную четвертичную структуру. Выявлено, что МДГ из Я1юс1оуи1ит steppense в условиях фотоорганотрофного роста и ЗрИаегоШш пМапя при хемоорганотрофном культивировании представлена димером.

3. Установлено, что МДГ из галофильных бактерий представляет собой димер, характеризующийся большей (по сравнению с МДГ из других объектов) молекулярной массой субъединиц, значение которой было определено методом ОБ-Ма-электрофореза и составило 48 кДа. Молекулярная масса нативного фермента, определённая гель-хроматографией на сефадексе 0-200, составляет 102 кДа.

4. Выявлено разное сродство фермента к субстратам. Значения Км для МДГ из ЯкойоуиЫт згеррете свидетельствуют о высоком сродстве фермента к оксалоацетату и более низком - к малату.

5. Показано, что ионы Мп и Са в концентрациях 4-40 мМ ингибируют малатдегидрогеназу из бактерий ЮюйошЫт я1еррете по бесконкурентному типу, при этом ионы кальция в концентрациях до 4 мМ

9-4активировали фермент. Ионы Ва оказывают ингибирующее действие на

МДГ по конкурентному типу. Ионы Mg в концентрациях 4-40 мМ активируют малатдегидрогеназу из Якосіоміїит хїеррете по неконкурентному типу.

6. Определены значения температурного оптимума полученных препаратов фермента. Величина этого показателя для малатдегидрогеназы из Якосіоуиіит яіеррете при восстановлении оксалоацетата составила 50°С, а при окислении малата - 40°С.

7. С помощью метода химической модификации с использованием специфических ингибиторов исследован аминокислотный состав и рассчитано количество аминокислотных остатков в активных центрах МДГ из бактерий Якосіоуиіит яґеррете и Бркаегоіїїш na.ta.ns. Установлено присутствие двух аминокислотных остатков гистидина, одного остатка цистеина и аргинина. Наличие остатков лизина в активном центре МДГ из изучаемых бактерий не выявлено.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование бактерий родов Rhodovulum и Sphaerotilus, культивируемых фотоорганотрофно и хемоорганотрофно, а также применение различных методов (гель-хроматография, нативный электрофорез, Ds-Na-электрофорез) дало возможность установить, что в этих условиях функционирует димерная форма малатдегидрогеназы. При этом показано, что МДГ из галофильных бактерий представляет собой димер, характеризующийся большей по сравнению с МДГ из других объектов молекулярной массой субъединиц (48 кДа), что, по-видимому, может обеспечивать адаптацию данных микроорганизмов к существованию в условиях содержания в среде высоких концентраций соли. Сходные данные об особенностях структурной организации молекулы МДГ были получены для малатдегидрогеназы из бактерий Vulcanithermus medioatlanticus, существующих в условиях экстремально высоких температур, а также для фермента из фототрофных пурпурных бактерий Rhodopseudomonas palustris с величиной субъединиц 45 кДа (Епринцев и др., 2008; Епринцев и др., 2005).

При изучении кинетических и регуляторных характеристик МДГ из галоалкалофильных бактерий Rhodovulum steppense не выявлено значительных отличий от ферментов из бактерий других экологических групп. Полученные результаты свидетельствуют о высоком сродстве МДГ к оксалоацетату и более низком - к малату, что согласуется с данными других авторов (Wynne et al., 1997, Струмило и др., 2006). Сравнение величин Км по коферментам показало, что сродство МДГ из исследуемых бактерий к НАДН выше, чем к НАД+. Известно, что реакции окисления малата и восстановления оксалоацетата МДГ протекают согласно упорядоченному механизму, когда сначала с ферментом связывается кофермент и лишь потом субстрат. Полученные экспериментальные данные, вероятно, также свидетельствуют об аналогичной последовательности присоединения кофермента и субстрата к ферменту (Пинейру де Корвалью и др., 1991).

При изучении аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из галоалкалофильных бактерий Якос1оуи1ит я1еррете и бесцветных нитчатых серобактерий БркаегоШш пШат применяли реакции химической модификации функциональных групп белка.

Модификация диэтилпирокарбонатом позволила выявить наличие в активном центре МДГ из изучаемых бактерий гистидиновых остатков, которые играют важную роль в транспорте протонов между субстратом и коферментом.

Наличие остатков цистеина в активном центре МДГ было выявлено при помощи модификации сульфгидрильных групп п-хлормеркурибензоатом. Влияние модификации этих групп на активность малатдегидрогеназы может быть связано с конформационными изменениями четвертичной структуры молекул фермента. Известно, что БН-группы присутствуют в белках эукариот, имеющих митохондриальную локализацию, и не встречаются в активном центре цитоплазматических и глиоксисомальных изоферментов, что свидетельствует о различном генетическом происхождении этих двух групп молекулярных форм малатдегидрогеназной системы (Пинейру де Корвалью и др., 1991). Выявление остатков цистеина в активном центре МДГ из бактерий Якос1оуи1ит steppense и БркаегоШт пМат позволило сделать вывод, что данный фермент по своей значимости приближается к митохондриальным белкам, участвующим в энергетическом обмене эукариот.

По литературным данным известно, что субстраты могут защищать фермент при химической модификации (Sheflyan et al., 1999; Faridmoayer, Seaman, 2005). Защитное действие оксалоацетата при химической модификации ДЭПК, и-хлормеркурибензоатом, 2,3-бутандионом дает возможность предполагать важную роль гистидиновых, цистеиновых и аргининовых остатков в каталитическом акте, осуществляемом малатдегидрогеназой (Fann et al., 1998; Meiss et al., 2001; Ding et al., 2002; Жеребцов и др., 2003). Так, субстрат МДГ оксалоацетат, вероятно, вызывает конформационные изменения в молекуле фермента, связывая имидазольные группы гистидиновых остатков, что предотвращает его быструю инактивацию диэтилпирокарбонатом.

Применение метода химической модификации специфическими ингибиторами (ДЭПК, я-ХМБ, 2,3-бутандион), позволило произвести расчет количества модифицированных остатков гистидина, цистеина и аргинина, что дает представление о структуре активного центра малатдегидрогеназы из изучаемых объектов. Установлен сходный состав активного центра МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans и показано наличие в нем одного остатка аргинина и цистеина и двух остатков гистидина.

На основании полученных результатов предлагается гипотетическая модель строения активного центра малатдегидрогеназы из изученных бактерий Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans (рис. 39).

Связывание оксалоацетата в активном центре малатдегидрогеназы определяется в первую очередь электростатическим взаимодействием между карбоксилатной группой субстрата, гуанидогруппой остатка аргинина и имидазольной группой гистидина. Другие функциональные группы фермента, участвующие в связывании оксалоацетата, одновременно выполняют и собственно каталитическую функцию. При связывании субстрата в активном центре образуются ионные пары между карбоксилат-анионом субстрата, гуанидогруппой аргинина и имидазольной группой гистидина. Взаимодействие протонированной имидазольной группы остатка гистидина с С=0 группировкой субстрата усиливает поляризацию последней, а образующийся дефицит электронов у углерода кетогруппы компенсируется переносом гидрид-иона Н~ от сближенного с субстратом никотинамидного кольца кофермента. В то же время протон пространственно сближенного с субстратом имидазола гистидина переносится на отрицательно заряженный кислород, чем и завершается восстановление карбонильной группы и превращение оксалоацетата в малат. БН-группы цистеина могут непосредственно участвовать в каталитическом акте, т.е. в образовании и распаде фермент-субстратного комплекса или осуществлять связь фермент-кофактор.

His о" с=о фрагмент НАДН сн2 I н X

His

N—Н 0=С Н nh с=о о nh2 о n+h2 sh

Cys

Arg — nh— с -ne 2

Рис. 39. Гипотетическая модель строения активного центра малатдегидрогеназы из бактерий Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans. His - гистидин, Arg - аргинин, Cys - цистеин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парфенова, Ирина Владимировна, Воронеж

1. Арабцева М.А. Структурная организация изоформ малатдегидрогеназы и их функциональная роль в адаптивной реакции бактерий Sphaerotilus natans: автореф. дис. . канд. биол. наук / М.А. Арабцева. — Воронеж, 2009. 24 с.

2. Березин И.В. Структура и функции активных центров ферментов / И.В. Березин, К. Мартинек. — М. : Наука, 1974. — 238 с.

3. Блюменфельд JI.A. Единичные циклы прямой ферментативной реакции на примере МДГ/ J1.A. Блюменфельд, П.Г. Плешанов // Биофизика. — 1986. — Т. 30, № 5. — С. 760-763.

4. Варфоломеев С.Д. Биокинетика: Практический курс / С.Д. Варфоломеев, К. Г. Гуревич. — М.: Фаир-Пресс, 1999. — 720 с.

5. Волвенкин C.B. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / C.B. Волвенкин, В.Н. Попов, А.Т. Епринцев // Биохимия. — 1999. — Т. 64, вып. 9. —С. 1185-1191.

6. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, JI. Верецкеи. — М. : Мир, 1982. — 446 с.

7. Гнатенко Д.В. Тирозил-тРНК-синтетаза из печени быка. Изучение функциональной роли остатков гистидина / Д.В. Гнатенко, А.И. Корнелюк, Г.Х. Мацука // Биоорганическая химия. — 1991(а). —Т.17, № 8. —С. 253-257.

8. Гнатенко Д.В. Химическая модификация остатков лизина тирозил-тРНК-синтетазы из печени быка с помощью пиридоксаль-5'-фосфата / Д.В. Гнатенко, А.И. Корнелюк, О.И. Лаврик // Биохимия. — 1991(6). — Т.56, № 11. —С. 1984-1990.

9. Гнатенко Д.В. Изучение функциональной роли остатков лизина тирозил-тРНК-синтетазы из печени быка методом химической модификации о-фталевым альдегидом / Д.В. Гнатенко, А.И. Корнелюк, Г.Х. Манука // Декады АН УССР. — 1991 (в). № 5. С. 140-143.

10. Горленко В.М. Ectothiorhodosinus mongolicum gen. nov., sp. nov. новая пурпурная серная бактерия из содового озера Монголии / В.М. Горленко, И.А. Брянцева, Е.Е. Пантелеева и др. // Микробиология. —2004 (а). — Т. 73, № 1. —С. 80-88.

11. Горленко В.М. История изучения биоразнообразия фотосинтезирующих бактерий / В.М. Горленко // Микробиология. — 2004 (б). — Т. 73, № 5. — С. 633-643.

12. Горячева Е.В. Рентгеноструктурный анализ белков / Е.В. Горячева // Биология. — 2009. № 4. — С. 662.

13. Гриднева Е.В. Экофизиология литотрофных сероокисляющих представителей рода Sphaerotilus обитателей сульфидных источников северного Кавказа / Е.В. Гриднева, М.Ю. Грабович, Г.А. Дубинина и др. // Микробиология. — 2009. — Т. 78, № 1. — С. 89-97.

14. Гусев М.В. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. — 4-е изд., стер. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 464 с.

15. Даниленко А.Н. Термодинамические свойства лактатдегидрогеназы из мышц рыб Misgurnus fossilis, адаптированных к разным температурам среды / А.Н. Даниленко, A.B. Персиков, Е.С. Полосухина и др. // Биофизика. — 1998. — Т.43, № 1. — С. 26-30.

16. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. — М.: Мир, 1970.- 173 с.

17. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. — М.: Мир, 1982. — Т. 3. -216 с.

18. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Элиот. — М.: Мир, 1991.-544 с.

19. Дэвени Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я. Гергей. — М.: Мир, 1976. —364 с.

20. Дюга Г. Биоорганическая химия / Г. Дюга, К. Пенни. — М.: Мир, 1983. — 512с.

21. Епринцев А.Т. Активность и изоформы малатдегидрогеназы в высоко- и низкомасличных линиях кукурузы / А.Т. Епринцев, А.У. Игамбердиев // Физиология растений. — 1995. — Т. 42, № 5. — С. 760-767.

22. Епринцев А.Т. Ферментативная регуляция метаболизма ди- и трикарбоновых кислот в растениях / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов. — Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та. — 1999. — 192 с.

23. Епринцев А.Т. Выделение, очистка и свойства малатдегидрогеназы из серобактерий Beggiatoa 1ер^тШ/огт1$ / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, И.Ю.Степанова и др. // Известия РАН. Сер. биологическая. — 2003. — № 3. —С. 301-305.

24. Епринцев А.Т. Малатдегидрогеназа термофильных бактерий УЫсапИНегтш тесИоайапИсш / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, Н.В. Парфенова // Биохимия. — 2005. — Т. 70, № 9. — С. 1245-1250.

25. Епринцев А.Т. Получение и свойства малатдегидрогеназы из мезо- и термофильных бактерий / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, М.А.

26. Климова, H.B. Парфенова // Прикладная биохимия и микробиология. — 2006. — Т. 42, № 3. — С. 274-278.

27. Епринцев А.Т. Особенности структурной организации и экспрессионной регуляции изоформ малатдегидрогеназы из Rhodobacter sphaeroides штамм 2R / А.Т. Епринцев, М.А. Климова, К.Д. Шихалиева и др. // Биохомия. — 2009. — Т. 74, № 7. — С. 977-984.

28. Жеребцов H.A. Биохимия : учеб. пособие / H.A. Жеребцов, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов. — Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 2002. 696 с.

29. Жеребцов H.A. Идентификация каталитически активных групп инулиназы Bacillus polymyxa 722 / H.A. Жеребцов, И.Н. Абрамова, С.А. Шеламова, Т.Н. Попова // Прикладная биохимия и микробиология. — 2003. — Т. 39, № 6. — С. 619-624.

30. Заварзин Г.А. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие / Г.А. Заварзин, Т.Н. Жилина, В.В. Кевбрин // Микробиология. — 1999. — Т. 68, № 5. — С. 579-599.

31. Землянухин A.A. Большой практикум по физиологии и биохимии растений / A.A. Землянухин, JI.A. Землянухин // — Воронеж: ВГУ, 1996. — 188 с.

32. Игамбердиев А.У. Исследование кинетических свойств и модификаций аминокислотных остатков изоцитратлиазы из щитка кукурузы / А.У. Игамбердиев, A.A. Землянухин // Биохимия. — 1987. — Т. 52, № 8. — С. 1286-1293.

33. Климова М.А. Участие малатдегидрогеназы в метаболической адаптации к типу питания у бактерий разных систематических групп: автореф. дис. . канд. биол. наук / М.А. Климова. — Воронеж, 2006. 24 с.

34. Клячко О.С. Кинетические различия лактатдегидрогеназы из мышц рыб при температурной адаптации / О.С. Клячко, Е.С. Полосухина, A.B. Персиков, Н.Д. Озернюк // Биофизика. — 1995. — Т. 40. — С. 513-518.

35. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами: дис. . д-ра биол. наук / Т. А. Ковалева. — Воронеж, 1998. — 421с.

36. Компанцева Е.И. Фототрофное сообщество соленого щелочного озера Хилганта (юго-восточное Забайкалье) / Е.И. Компанцева, Д.Ю. Сорокин, В.М. Горленко, Б.Б. Намсараев // Микробилогия. — 2005. —Т. 74, № 3. — С. 410-419.

37. Компанцева Е.И. Влияние pH на сообщества аноксифотобактерий в содовых озерах юго-восточного Забайкалья / Е.И. Компанцева // Микробиология. — 2007 (а). — Т. 76, № 6. — С. 872-878.

38. Компанцева Е.И. Структура фототрофных сообществ в содовых озерах юго-восточного Забайкалья / Е.И. Компанцева, И.А. Брянцева, A.B. Комова, Б.Б. Намсараев // Микробилогия. — 2007 (б). — Т. 76, № 2. — С. 243-252.

39. Компанцева Е.И. Несерные пурпурные бактерии в слабо- и среднеминералированных содовых озерах южного Забайкалья и северовосточной Монголии / Е.И. Компанцева, A.B. Комова, В.И. Краузова и др. // Микробиология. — 2009. — Т. 78, № 5. — С. 281-288.

40. Корнеева О.С. Карбоангидразы: препаративное получение, структура и механизм действия на олиго- и полисахариды: дис. . д-ра биол. наук / О.С. Корнеева. — Воронеж, 2001. 311 с.

41. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности / Ф. Коэн. — М. : Мир, 1986.- 144 с.

42. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты / Б.И. Курганов. — М., 1987. -248 с.

43. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. — М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

44. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледерман. — М.: Финансы и статистика, 1989. — 508 с.

45. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр. — М. : Мир, 1971. — 222 с.

46. Мехв А.Т. Простагландин Н синтаза, химическая модификация диэтилпирокарбонатом остатков гистидина в различных формах фермента / А.Т. Мехв, К.А. Мирошников, Н.Д. Игумнова, С.Д. Варфоломеев // Биохимия. —1993. — Т.58, № 10. — С. 1573-1578.

47. Наградова Н.К. Белок-белковые взаимодействия в функционировании НАД-зависимых дегидрогеназ / Н.К. Наградова. — М. : Наука, 1990. — 56 с.

48. Одинцева Е.Р. Роль остатков цистеина в стабильности формиатдегидрогеназы / Е.Р. Одинцева, A.C. Попова, A.M. Рожкова, В.И. Тишков // Вестник московского университета. Серия Химия. — 2002. — Т. 43. №6. — С. 356-359.

49. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул / Л.А. Остерман. — М.: Мир, 1983. — 297 с.

50. Парфенова Н.В. Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды : автореф. дис. . канд. биол. наук / Н.В. Парфенова. Воронеж, 2004. - 24 с.

51. Пинейру де Корвалью М.А.А. Малатдегидрогеназа высших растений / М.А.А. Пинейру де Корвалью, A.A. Землянухин, А.Т. Епринцев. — Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та. — 1991. — 216 с.

52. Попов В.Н. Индукция пероксисомальной изоформы малатдегидрогеназы в печени крыс при пищевой депривации / В.Н. Попов, С.В. Волвенкин, Т.А. Косматых и др. // Биохимия. — 2001. — Т.66, № 5. — С.617-623.

53. Попов Е.М. Структурно-функциональная организация белков / Е.М. Попов. — М. : Наука, 1992. — 358 с.

54. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков / В.М. Степанов. — 3-е изд. — М. : Изд-во Моск. ун-та : Наука, 2005. — 336 с.

55. Степанова И.Ю. Некоторые кинетические характеристики малатдегидрогеназы из Beggiatoa alba / И.Ю. Степанова // Труды молодых ученых. — Воронеж, 2000. — Вып. 2. — С. 130-140.

56. Степанова И.Ю. Физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы из серобактерий рода Beggiatoa : автореф. дис. . канд. биол. наук / И.Ю. Степанова. — Воронеж, 2002. 24 с.

57. Струмило С. Сравнение свойств изоферментов малатдегидрогеназы из сердца зайца и кролика / С. Струмилло, А. Овсенюк, А. Радечка, А. Тилицки // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. — 2006. — Т. 42, № 5. — С. 450-453.

58. Сухарева Б.С. Глутаматдекарбоксилаза: структура и каталитические свойства / Б.С. Сухарева, E.J1. Дарий, P.P. Христофоров // Успехи биологической химии. — 2001. — Т. 41. — С. 131-162.

59. Хочачка П. Стратегия биохимической адаптации / П. Хочачка, Дж. Сомеро. — М. : Мир. — 1977. 398 с.

60. Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков. — Воронеж: ВГУ, 1998. 270 с.

61. Шихалиева К.Д. Малатдегидрогеназная ферментная система бактерий Rhodobacter sphaeroides: очистка, физико-химические свойства, метаболитная и экспрессионная регуляция : автореф. дис. . канд. биол. наук / К.Д. Шихалиева. — Воронеж, 2011. 24 с.

62. Якубке Х.-Д. Аминокислоты, пептиды, белки / Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт.1. М. :Мир, 1985. —456 с.

63. Alldread R.M. Catalitic-rate improvement of a thermostable malate dehydrogenase by a subtle alteration in cofactor binding / R. M. Alldread, D.M. Halsall, A.R. Clarke et.al. // Biochem. J. — 1995. — Vol. 305, No. 2. — P. 539-548.

64. Arnold F.H. How enzymes adapt: lessons from directed evolution / F.H. Arnold, P.L. Wintrode, K. Miyazaki, A. Gershenson // Trends Biochem. Sci. -2001. — Vol. 26. — P. 100-106.

65. Artymiuk P.J. Principles of biochemistry / P.J. Artymiuk, D.E.P. Grace, S.J. Oatley // Nature. — 1979. — Vol. 280, No. 3. — P. 563-568.

66. Beatty J.T. Generation of succinyl-coenzyme A in photosynthetic bacteria / J.T. Beatty, H. Gest // Arch. Microbiol. — 1981. — Vol. 129, No. 5. — P. 335-340.

67. Bell J.K. Structural analyses of a malate dehydrogenase with a variable active site / J.K. Bell, H.P. Yennawar, S.K. Wright, et al. // J. Biol. Chem. — 2001.

68. Vol. 276, No. 33. —P. 31156-31162.

69. Bjork A. Electrostatic interactions across the dimer-dimer interface contribute to the pH-dependent stability of a tetrameric malate dehydrogenase / A. Bjork, D. Mantzilas, R. Sirevag, V. G. Eijsink // FEBS Lett. — 2003. — Vol. 553, No. 3. —P. 423-426.

70. Chen J. Amide hydrogen exchange shows that malate dehydrogenase is a folded monomer at pH 5 / J. Chen, D.L. Smith // Protein Sei. — 2001. — Vol. 10, No. 5. —P. 1079-1083.

71. Clarke A.R. Site-directed mutagenesis reveals role of mobile arginine residue in lactate dehydrogenase catalysis / A.R. Clarke, D.B. Wigley, W.N. Chia, et al. // Nature. — 1986. — Vol. 324. — P. 699-702.

72. Clarke A.R. The role of an aspartate-histidine pair in active site of lactate dehydrogenase / A.R. Clarke, H.M. Wilks, J.J. Holbrook // Protein Eng. — 1987. — Vol. 1, No. 3. — P. 137-142.

73. Davis B.J. A new high resolution electrophoresis method / B.J. Davis, L. Ornstein // Society for the study at the New York Academy of medicine. — 1959. —P. 112-118.

74. Ding S. Identification of histidine residues at the active site of Megalobatrachus japonicus alkaline phosphatase by chemical modification / S. Ding, Y. Li, L. Zhu // Biochim Biophys Acta. — 2002. — Vol. 1594, No. 1. —P. 100-108.

75. Domenech C. An improved purification method for cytosolic malate dehydrogenase from several sources / C. Domenech, J.J. Abante, F.X. Bozal, et al.//Prep. Biochem.— 1988. —Vol. 18, No. 1. —P. 17-35.

76. Dordal A. Factors affecting L-malate activation of mitochondrial malate dehydrogenase from chicken liver / A. Dordal, A. Mazo, J.L. Gelpi et. al. // Biochem. Int. — 1990, —Vol. 20, No. 1. —P. 177-182.

77. Drmota T. Isolation and characterisation of cytosolic malate dehydrogenase from Trichomonas vaginalis / T. Drmota, J. Tachezy, J. Kulda // Folia Parasitol. (Praha). — 1997. — Vol. 44, No. 2. — P. 103-108.

78. Eisenberg H. Life in unusual environments: progress in understanding the structure and function of enzymes from extreme halophilic bacteria / H. Eisenberg // Arch. Biochem. Biophys. — 1995. — Vol. 318, No. 1. — P. 1-5.

79. Elcock A.H. Electrostatic contributions to the stability of halophilic proteins / A.H. Elcock, J.A. McCammon // J. Mol. Biol. — 1998. — Vol. 208, No.4. — P. 731-748.

80. Fann M. Identification of two essential arginine residues in UhpT, the sugar phosphate antiporter of Escherichia coli / M. Fann, A.H. Davies, A. Varadhachary et al. // J Membr Biol. — 1998. — Vol. 164, No. 2. — P. 187195.

81. Faridmoayer A. Binding residues and catalytic domain of soluble Saccharomyces cerevisiae processing alpha-glucosidase I / A. Faridmoayer, C.H. Seaman // Glycobiology. — 2005. — Vol. 15, No. 12. —P. 1341-1348.

82. Favorova O.O. Evidence for essential histidine residues in tryptophanyl-tRNA synthetase / O.O. Favorova, I.A. Madoyan, L.L. Kisselev // Eur. J. Biochem. —1978. —Vol. 86, No. 1.—P. 193-202.

83. Fieldes M.A. An explanation of the achromatic bands produced by peroxidase isozymes in polyacrylamide electrophoresis gels stained for malate dehydrogenase / M.A. Fieldes // Electrophoresis. — 1992. — Vol. 13, No. 12. P. 82-86.

84. Chang G.G. Modification of essential arginine residues of pigeon liver malic enzyme / G.G. Chang, T.M. Huang // Biochim Biophys Acta. — 1981. Vol. 660, No. 2. —P. 341-347.

85. Gietl C. Malate dehydrogenase isoenzymes: cellular locations and role in the flow of metabolites between the cytoplasm and cell organelles / C. Gietl // Biochim. Biophys. Acta. — 1992. — Vol. 1100, No. 3. — P. 217-234.

86. Gilmiiarova F.N. Structure-activity features of malate dehydrogenase from human myocardium in atherosclerosis / F.N. Gilmiiarova, V.M. Radomskaia, L.N. Vinogradova et al. // Vopr. Med. Khim. — 1993. — Vol. 39, No. 5. — P. 17-18.

87. Golding G.B. The structural basis of molecular adaptation / G.B. Golding, A.M. Dean // Mol. Biol. Evol. — 1998.— Vol. 15. —P. 355-369.

88. Gos T. Postmortem activity of lactate and malate dehydrogenase in human liver in relation to time after death / T. Gos, S. Raszeja // Int. J. Legal. Med. — 1993. Vol. 106, No. 1. —P. 25-29.

89. Goward C.R. A single amino acid mutation enhances the thermal stability of Escherichia coli malate dehydrogenase / C.R. Goward, J. Miller, D.J. Nicholls, et al. // Eur. J. Biochem. — 1994. — Vol. 224, No. 1. — P. 249-255.

90. Goward C.R. Malate dehydrogenase: a model for structure, evolution, and catalysis / C.R. Goward, D.J. Nicholls // Protein Sci. — 1994. — Vol. 3. — P. 1883-1888.

91. Grant W.D. Alkaline environments / W.D. Grant, B.E. Jones // Encyclopedia of Microbiology. — 2000. — Vol. 1. — P. 126-133.

92. Gregory E.M. Chemical modification of bovine heart mitochondrial malatedehydrogenase. Selective modification of cysteine and histidine / E.M. Gregory // Journal Biochemistry. — 1975. — Vol. 250, No. 14. — P. 299-305.

93. Hall M.D. Crystal structure of a ternary complex of Escherichia coli malate dehydrogenase citrate and NAD at 1.9 A resolution / M.D. Hall, L.J. Banaszak//J. Mol. Biol. — 1993. — Vol. 232, No. 1, —P. 213-222.

94. Hecht K. Catalytic properties of thermophilic lactate dehydrogenase and halophilic malate dehydrogenase at high temperature and low water activity / K. Hecht, A. Wrba, R. Jaenicke // Eur. J. Biochem. — 1989. — Vol. 183, No. 1. —P. 69-74.

95. Heising S. Phototrophic oxidation of ferrous iron by a Rhodornicrobiurn vannielii strain / S. Heising, B. Schink // Microbiology. — 1998. — Vol. 144.1. P. 2263-2269.

96. Hennecke H. Modification of phenylalanyl-tRNA synthetase from Escherichia coli by histidine-specific reagents. Effects on structure and function / H. Hennecke, A. Bock // Eur. J. Biochem. 1974. — Vol. 50, No. 1.1. P. 157-166.

97. Hippel P.H. In structure and stability of biological macromolecules / P.H. Hippel, S.N. Timasheff, G. D. Fasman // Marcel Dekker, New York. — 1969. —Vol.2. —P. 417-574.

98. Holbrook J.J. Ionic properties of an essential histidine residue in pig heart lactate dehydrogenase / J.J. Holbrook, V.A. Ingram // Biochem J. — 1973. — Vol. 131, No. 4.— 729-738.

99. Hones J. Chemical modification of the essential arginine in malate dehydrogenase / J. Hones, P. Pfleiderer // Biolog. Chem. Hoppe-Seyler. — 1985. — Vol. 366. — P. 1109-1112.

100. Honka E. Properties and primary structure of the L-malate dehydrogenase from the extremely thermophilic archaebacterium Methanothermus fervidus / E. Honka, S. Fabry, T. Niermann et. al. // Eur. J. Biochem. — 1990. — Vol. 188, No. 3. —P. 623-632.

101. Horikoshi K. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology / K. Horikoshi // Microbiology and molecular biology. — 1999. — Vol. 63, No. 4. — P. 735-750.

102. Hoshino T. A study of serum mitochondrial enzymes (mCK, mAST, mMDH) in rotavirus and adenovirus gastroenteritis in pediatric patients / T. Hoshino,

103. N. Hosokawa, M. Yanai et al. // Rinsho. Byori. — 2001. — Vol. 49, No. 11. — P. 1157-1161.

104. Hrdy I. Purification and partial characterization of cytosolic malate dehydrogenase from Tritrichomonas foetus / I. Hrdy // Folia Parasitol. (Praha). — 1993, — Vol. 40, No. 3. — P. 181-185.

105. Hugues-van Kregten H.C. Slime flora of New Zealand paper mills / H.C. Hugues-van Kregten // Appita. J. — 1998. — No. 41. — P. 470-474.

106. Hunter G.R. Tetrameric and dimeric malate dehydrogenase isoenzymes in Trypanosoma cruzi epimastigotes / G.R. Hunter, U. Hellman, J.J. Cazzulo, C. Nowicki // Mol. Biochem. Parasitol. — 2000. — Vol. 105, No. 2. — P. 203214.

107. Jaenicke R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions / R. Jaenicke // Eur J. Biochem. — 1991. — Vol. 202. — P. 715-728.

108. Jaenicke R. What ultrastable globular proteins teach us about protein stabilization / R. Jaenicke // Biochemistry. — 1998. — Vol. 63, No. 3. — P. 312-321.

109. Janiczek O. Purification and properties of malate dehydrogenase from Paracoccus denitrificans / O. Janiczek, J. Kovar, Z. Glatz // Prep. Biochem.1993. — Vol. 23, No. 3. — P. 285-301.

110. Jones B.E. Microbiol diversity of soda lakes / B.E. Jones, W.D. Grant, A.W. Duckworth, G.G. Owenson // Extremophiles. — 1998. — Vol. 2. — P. 191— 200.

111. Jurgensen S.R. Active subunits in hybrid-modified malate dehydrogenase / S.R. Jurgensen, J.H. Harrison // J. Biol Chem. — 1982. — Vol. 257, No. 1. — P. 569-574.

112. Kalinowski A. Maize pollen enzymes after two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis in the presence or absence of sodium dodecyl sulfate / A. Kalinowski, M. Radlowski, S. Bartkowiak // Electrophoresis. — 2002. — Vol. 23, No. 1, —P. 138-143.

113. Kompantseva E.I. Phylogenetic relationships among budding purple bacteria of the genus Rhodopseudomonas / E.I. Kompantseva, E.E. Panteleeva, A.M. Lysenko et al. // Microbiology. — 1996. — Vol. 65, No. 3. — P. 344-351.

114. Kopetzki E. Purification procedure and N-terminal amino-acid sequence of yeast malate dehydrogenase isoenzymes / E. Kopetzki, K.D. Entian, F. Lottspeich, D. Mecke // Biochem. Biophys. Acta. — 1987. — Vol. 912, No. 3. — P. 398-403.

115. Kuijk B.L. Purification and characterization of malate dehydrogenase from the syntrophic propionate-oxidizing bacterium strain MPOB / B.L. Kuijk, A.J. Stams // FEMS Microbiol. Lett. — 1996. — Vol. 144, No. 2-3. — P. 141-144.

116. Kushner D.J. What is the "true" internal environment of halophilic and other bacteria / D.J. Kushner // Can J. Microbiol. — 1988. — Vol. 34. — P. 482486.

117. Labrou N.E. Dye-affinity labeling of bovine heart mitochondrial malate dehydrogenase and study of the NADH-binding site / N.E. Labrou, E. Eliopoulos, Y.D. Clonis // Biochem. J. — 1996. — Vol. 315, No. 2. — P. 687693.

118. Labrou N.E. L-Malate dehydrogenase from Pseudomonas stutzeri\ purification and characterization / N.E. Labrou, Y.D. Clonis // Arch. Biochem. Biophys. — 1997. —Vol. 337, No. 1. —P. 103-114.

119. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmly // Nature. — 1970. — Vol. 77, No. 4. — P.680-683.

120. Langelandsvik A.S. Properties and primary structure of a thermostable L-malate dehydrogenase from Archaeoglobus fulgidus / A. S. Langelandsvik, I.H. Steen, N.K. Birkeland, T. Lien // Arch. Microbiol. — 1997. — Vol. 168, No. 1. —P.59-67.

121. Lanyi J. K. Salt-dependent properties of proteins from extremely halophilic bacteria // Bacteriological Reviews. — 1974. — Vol. 38, No. 3. — P. 272290.

122. Lee H.J. Identification of amino acid residues important for the phosphomannose isomerase activity of PslB in Pseudomonas aeruginosa PAOl / H.J. Lee, H.Y. Chang, N. Venkatesan, H.L. Peng // FEBS Lett. — 2008. — Vol. 582, No. 23-24. — P. 3479-3483.

123. Lee S. A survey of filamentous organisms at the Deer Island treatment plant / S. Lee, S. Basu, C.W. Tyler, P.A. Pitt // Environ. Technol. — 2003. — Vol. 24.—P. 855-865.

124. Lehnindger A.L. Principles of biochemistry / A.L. Lehnindger, D.L. Nelson, M.M. Cox. — WH Freeman&Co, 4th Ed., — 2004. — 1119 p.

125. Liu K. Sphaerotilus natans isolated from activated sludge and its production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) / K. Liu, H. Chua, W.H. Lo et al. // Appl Biochem Biotechnol. — 2002. P. — 1061-1073.

126. Lowry O.H. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry, H.J. Rosebrough, A.H. Papp et al.// J. Biologi. — 1951. — Vol. 193. — P. 265-275.

127. Ludwig W.O. Bacterial phylogeny based on comparative sequence analysis / W.O. Ludwig, O. Strunk, S. Klugbauer et al. // Electrophoresis. — 1998. — No. 19. —P. 554-568.

128. Lunina O.N. Anoxygenie phototrophic bacterial community of Lake Shira (Khakassia) / O.N. Lunina, I.A. Briantseva, V.N. Akimov et al. // Microbiology. — 2007. — Vol. 76. — P. 533-544.

129. Machado M.F. Malate dehydrogenase (MDH; EC 1.1.1.37) isozymes in tissues and callus cultures of Cereus peruvianus (Cactaceae) / M.F. Machado,

130. A.J. Prioli, C.A. Mangolin // Biochem. Genet. — 1993. — Vol. 31, No. 3^1. — P.167-172.

131. Madern D. Stabilisation of halophilic malate dehydrogenase from Haloarcula marismortui by divalent cations / D. Madern, G. Zaccai // Eur. J. Biochem. — 1997. —Vol. 249. —P. 607-611.

132. Madern D. Halophilic adaptation of enzymes / D. Madern, C. Ebel, G. Zaccai // Extremophiles. — 2000. Vol. 2. — P. 91-98.

133. Madern D. Molecular adaptation: the malate dehydrogenase from the extreme halophilic bacterium Salinibacter ruber behaves like a non-halophilic protein / D. Madern, G. Zaccai // Biochimie. — 2004. — Vol. 86, No. 4-5. — P. 295303.

134. Mahmoud Y.A. Purification and characterization of malate dehydrogenase from Cryptococcus neoformans / Y.A. Mahmoud, S.M. Souod, W.G. Niehaus // Arch. Biochem. Biophys. — 1995. — Vol. 322, No. 1. — P. 69-75.

135. Markina V.L. The effect of modification of lactate and malate dehydrogenases on their stability and activity / V.L. Markina, A.N. Eremin, D.I. Metelitsa // Biophis. — 1990. —Vol. 35, No. 1. —P. 30-35.

136. Maloney A. P. Mitochondrial malate dehydrogenase from the thermophilic, filamentous fungus Talaromyces emersonii / A. P. Maloney, S. M. Callan, P. G. Murray, M. G. Tuohy // Eur. J. Biochem. — 2004. — 271. — P. 3115-3126.

137. Meiss G. Identification of functionally relevant histidine residues in the apoptotic nuclease CAD / G. Meiss, S.R. Scholz, C. Korn et al. // Nucleic Acids Res. — 2001. — Vol. 29, No. 19. — P. 3901-3909.

138. Mevarech M. Malate dehydrogenase isolated from extremely halophilic bacteria of Dead Sea / M. Mevarech, H. Eisenberg, E. Neumann // Biochemistry. — 1977. Vol. — 16.—P. 3781-3785.

139. Mevarech M. Halophilic enzymes: proteins with a grain of salt / M. Mevarech, F. Frolow, L.M. Gloss // Biophys Chem. — 2000. — Vol. 86, No. 2-3.-P. 155-164.

140. Mikulasova D. Purification and characterization of malate dehydrogenase from Streptomyces aureofaciens / D. Mikulasova, M. Kollarova, D. Mikulasova et al. // FEMS Microbiol. Lett. — 1998. — Vol. 159, No. 2. — P. 299-305.

141. Minarik P. Malate dehydrogenases-structure and function / P. Minarik, N. Tomaskova, M. Kollarova, M. Antalik // Gen. Physiol. Biophys. —2002. — Vol. 21, No. 3. — P.257-265.

142. Miyazaki K. Directed evolution study of temperature adaptation in a psychrophilic enzyme / K. Miyazaki, P.L. Wintrode, R.A. Grayling et al. // J. Mol. Biol. — 2000. — Vol. 297. — P. 1015-1026.

143. Molenaar D. Functions of the membrane-associated and cytoplasmic malate dehydrogenases in the citric acid cycle of Corynebacterium glutamicum / D. Molenaar, M.E. Rest, A. Drysch, R. Yiicel // J. Bacteriol. — 2000. — Vol. 182, —P. 6884-6891.

144. Mottram J.C. Purification of particulate malate dehydrogenase and phosphoenolpyruvate carboxykinase from Leishmania mexicana / J.C. Mottram, G.H. Coombs // Biochem. Biophys. Acta. — 1985. — Vol. 827, No. 2. —P. 310-319.

145. Muhlrad A. The adenosine triphosphatase activity of the meromyosins / A. Muhlrad, G. Hegyi, G. Toth // Biochim Biophys Acta. — 1967. — Vol. 132. — P. 138-144.

146. Mulder E.G. The sheathed bacteria / E. G. Mulder, M. H. Deinema // The prokaryotes. — 1992. — P. 2612-2624.

147. Musata N. A single-cell view on the ecophysiology of anaerobic phototrophic bacteria / N. Musata, H. Halma, B. Winterhollerb et al. // PNAS. — 2008. — Vol. 105, No. 46. —P. 17861-17866.

148. Musrati R.A. Malate dehydrogenase: distribution, function and properties / R.A. Musrati, M. Kollarova, N. Mernik, D. Mikulasova // Gen. Physiol. Biophys. — 1998.—Vol. 17, No. 3. — P.193-210.

149. Nesterenko M.V. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in poly aery lamide gels / M.V. Nesterenko, M. Tilley, S.J. Upton // J. Biochem. Biol. — 1994. — Vol. 28. — P. 239-242.

150. Pellegrin V. Morphological and biochemical properties of Sphaerotilus sp. isolated from paper mill slimes. / V. Pellegrin, S. Juretschko, M. Wagner, G. Cottenceau//Appl. Microbiol. — 1999. — No. 1. — P. 156-162.

151. Pfenning N.D. Uber das vitamin Bi2 bedurfuis phototropher Schwefelbakterien / N.D. Pfenning, K.D. Lippert / Arch. Microbiol. — 1966.1. Vol. 55. —P. 245-259.

152. Piera-Velazquez S. Increased stability of malate dehydrogenase from Halobacterium salinarum at low salt concentration in reverse micelles / S. Piera-Velazquez, F. Marhuenda-Egea, E. Cadenas // Extremophiles. — 2002.1. Vol. 5. —P. 407^12.

153. Raffin J.P. Yeast phenylalanyl-tRNA synthetase. Properties of the histidyl residues / J.P. Raffin, P. Remy // Biochim. et biophys. acta. — 1978. — Vol. 520, No. 1. —P. 164-174.

154. Sanyal S. C. The folding of dimeric cytiplasmic malate dehydrogenase / S.C. Sanyal, D. Bhattacharyya, C. Das Gupta // Eur. J. Biochem. — 2002. — Vol. 269. —P. 3856-3866.

155. Sheikh S. Active site mapping studies of malate dehydrogenase: identification of essential amino acid residues by o-phthalaldehyde / S. Sheikh, S.S. Katiyar //Biochem. Int. — 1992. — Vol. 27, No. 3. — P. 517-524.

156. Shevchenko A. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels / A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann // Anal. Chem. — 1996. — Vol. 68. — P. 850-858.

157. Siering P. L. Phylogeny of the Sphaerotilus-Leptothrix group inferred from morphological comparison, genomic fingerprinting, and 16S ribosomal DNAsequence analyses / P.L. Siering, W.C. Ghiorse // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1996.—No. 46. —P. 173-182.

158. Steffan J.S. Structural and functional effects of mutations altering the subunit interface of mitochondrial malate dehydrogenase / J.S. Steffan, L. McAlister-Henn // Arch. Biochem. Biophys. — 1991. — Vol. 287, No. 2. — P. 276-282.

159. Steffan J.S. Isolation and characterization of the yeast gene encoding the MDH-3 isoenzyme of malate dehydrogenase / J.S. Steffan, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. — 1992. — Vol. 267, No. 34. — P. 24708-24715.

160. Suparna C.S. The folding of dimeric cytoplasmic malate dehydrogenase / C.S. Suparna, B. Debasish, D.G. Chanchal // Europen Journal of Biochemistry. — 2002. — Vol.269, No. 15. — P. 3856-3866.

161. Takeda M. Purifcation and properties of an enzyme capable of degrading the sheath of Sphaerotilus natans / M. Takeda, K. Iohara, S. Shinmaru et al. // Appl. Environ. Microbiol. — 2000. — No. 66. — P. 4998-5004.

162. Takeda M. Structure of the polysaccharide isolated from the sheath of Sphaerotilus natans / M. Takeda, T. Nakamori, M. Hatta et al. // Int J Biol Macromol. — 2003. — Vol. 33, No. 4-5. — P. 245-250.

163. Tayeh M.A. Malate dehydrogenases in phototrophic purple bacteria. Thermal stability, amino acid composition and immunological properties / M.A. Tayeh, M.T. Madigan // Biochem. J. — 1988. — Vol. 252, No. 2. — P. 595-600.

164. Teixido F. Cytoplasmic malate dehydrogenase from Phycomyces blakesleeanus: kinetics and mechanim / F. Teixido, De D. Arriaga, F. Busto, J. Soler // Can. J. Biochem. Cell. Biol. — 1985. — Vol. 63, No. 10. — P. 1097-1105.

165. Tiago I. Bacterial diversity in a non-saline alkaline environment: heterotrophic aerobic populations / I. Tiago, A.P. Chung, A. Verissimo // Appl. Envivon. Micribiol. — 2004. — Vol. 70. — P. 7378-7387.

166. Tindall B.J. Prokaryotic diversity in the Antarctic: the tip of the iceberg / B.J. Tindall // Microbiol. Ecol. — 2004. — Vol. 47. — P. 271-283.

167. Tripathi A.K. AN a-proteobacterisl type malate dehydrogenase may complement LDH function in Plasmodium falciparum / A.K. Tripathi, P.V. Desai, A. Pradhan et al. // European Journal of Biochemistry. — 2004. — Vol. 271, No. 17. — P.3488-3502.

168. Uttaro A.D. Characterisation of the two malate dehydrogenase from Phytomonas sp. Purification of the glicosomal isoenzyme / A.D. Uttaro, F.R. Opperdoes // Mol Biochem Parasitol. — 1997. — Vol. 89, No. 1. — P. 51-59.

169. Wiegel J. Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles / J. Wiegel // Extremophiles. — 1998. — Vol. 2. — P. 257-267.

170. Wigley D.B. Structure of a ternary complex of an allosteric lactate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus at 2.5 A resolution / D.B. Wigley, S.J. Gamblin, J.P. Turkenburg, et al. // J. Mol. Biol. — 1992. — Vol. 223, — P. 317-335.

171. Wise D.J. Purification and kinetic characterization of Haemophilus influenzae malate dehydrogenase / D.J. Wise, C.D. Anderson, B.M. Anderson // Arch. Biochem. Biophys. — 1997, —Vol. 344, No. 1. —P. 176-183.

172. Wiseman M.S. Rat liver mitochondrial malate dehydrogenase: purification, kinetic properties, and role in ethanol metabolism / M.S. Wiseman, D. McKay, K.E. Crow, M.J. Hardman // Arch. Biochem. Biophys. — 1991. — Vol. 290, No. 3. — P. 191-196.

173. Yoon H. Kinetic studies of Haemophilus influenzae malate dehydrogenase / H. Yoon, B.M. Anderson // Biochem. Biophys. Acta. — 1988. — Vol. 955, No. 1. —P.10-18.

174. Yoon J.H. Halobacillus locisalis sp. nov., a halophilic bacterium isolated from a marine solar saltern of the Yellow Sea in Korea / J.H. Yoon, K.H. Kang, T.K. Oh, Y.H. Park// Extremophiles. — 2004. — Vol. 8, No.l. — P. 23-28.

175. Zaccai G. Stabilization of halophilic malate dehydrogenase / G. Zaccai, F. Cendrin, Y. Haik // J. Mol. Biol. — 1989. — Vol. 208, No.3. — P. 491-500.

176. Zarivi O. Biochemical, electroforetic and immunohistochemical aspects of malate dehydrogenase in truffles {Ascornycotina) / O. Zarivi, P. Cesare, P. Aimola et al. // FEMS Microbiol. Lett. — 2000. — Vol. 185, No. 2. — P. 213219.

177. Zavarzin G.A. Anaerobic chemotrophic alkaliphiles / G.A. Zavarzin, T.N. Zhilina // Journey to diverse microbial worlds. Ed. J. Seckbach Kluwer Academic Publishers, Netherlands. — 2000. — P. 191-208.

Информация о работе

Парфенова, Ирина Владимировна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Строение активного центра, физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы у представителей различных экологических групп бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы