Особенности физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс при аллоксановом диабете

Фарис Сатар Абуд

Автореферат диссертации по теме "Особенности физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс при аллоксановом диабете"

На правах рукописи

Фарис Сатар Абуд

ОСОБЕННОСТИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ, КИНЕТИЧЕСКИХ И РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ ИЗОФОРМ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

Специальность 03.01.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж-2010

004607103

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Пашков Александр Николаевич

кандидат биологических наук, доцент Башарина Ольга Владимировна

Ведущая организация Всероссийский НИВИ патологии,

фармакологии и терапии РАСХН

Защита состоится 1 июля 20 Юг на заседании диссертационного совета № Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59 в 15 часов.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Диабет - хроническое заболевание, приводящее к нарушениям углеводного, белкового и жирового обменов в результате недостатка гормона инсулина.

Известно, что основным энергетическим субстратом в клетках и тканях организма выступают углеводы. Постоянное поступление глюкозы в качестве источника энергии особенно необходимо для нервной ткани и эритроцитов. При экспериментальном диабете ткани испытывают недостаток в глюкозе. В качестве механизма адаптации к данному процессу выступает глюконеогенез. Он имеет особенно важное значение в печени, которая является главным метаболически активным органом, участвующим в поддержании гомеостаза глюкозы. Соотношение между процессами катаболизма и анаболизма глюкозы в клетках печени находится под контролем целого ряда факторов регуляции, включая концентрацию метаболитов, нуклеотидов, а также воздействие гормонов. В нормальных условиях глюконеогенетические трансформации в печени млекопитающих протекают с относительно низкой скоростью. Интенсификация данного процесса наблюдается при дефиците углеводов, в частности при диабете [Епринцев А.Т. и др., 2005].

Кроме того, при адаптации клеточного метаболизма к изменениям условий среды организм использует стратегию регуляции активности ферментного аппарата клетки. Важная роль в осуществлении адаптивных реакций организма принадлежит малатдегидрогеназной системе [Епринцев А.Т. и др., 2006]. Малатдегидрогеназа (К.Ф.1.1.1.37), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание конструктивного и энергетического обменов. В последнее время малатдегидрогеназа (МДГ) является объектом значительного количества исследований, что обусловлено ее полифункциональностью. Малатдегидрогеназный комплекс обеспечивает функционирование важнейших метаболических процессов, обеспечивающих нормальное функционирование клетки. Особенностью малатдегидрогеназы является участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров, то есть данный фермент относится к биокатализаторам глиоксилатного цикла. Наличие в клетке различных процессов, связанных с функционированием одного фермента малатдегидрогеназы требует сложной многоуровневой регуляции

его активности. К механизмам такой регуляции причисляют пространственно разделенные изоформы, имеющие различные кинетические характеристики и структуру молекул данного фермента. По мнению некоторых исследователей, МДГ может быть представлена в виде димерной или тетрамерной формы, которые участвуют в анаболическом и катаболическом метаболизме. По данным современных исследователей димерная изоформа имеет митохондриальную локализацию и участвует в энергетическом обмене (ЦТК), а тетрамерная МДГ, локализованная в цитоплазме или этиопластах, функционирует в анаболических процессах клетки.

В связи с этим большой интерес представляет изучение действия экспериментального диабета на структурно-функциональные трансформации мапатдегидрогеназы в гепатоцитах крыс. Кроме того, мало известно о их роли в адаптивных реакциях, обеспечивающих переключение метаболизма на утилизацию жирных кислот и их превращение в водорастворимые углеводы.

Таким образом, целесообразно изучить структуру адаптивного ответа клеточной энергетики печени, оценить особенности различных метаболических путей крыс при аллоксановом диабете, а также рассмотреть возможность участия малатдегидрогеназной системы в адаптивной реакции организма лабораторных крыс к экспериментальному диабету.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение особенностей глюконеогенетических трансформаций в печени крыс с индуцированным аплоксановым диабетом; получение гомогенных препаратов изоформ мапатдегидрогеназы из печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом и сравнение их физико-химических, каталитических и регуляторных свойств. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить концентрацию интермедиатов основных метаболических процессов в печени крыс при экспериментальном диабете;

2) определить динамику ключевых ферментов основных метаболических путей в печени крыс при индукции аллоксаном экспериментального диабета;

3) установить возможность индукции малатдегидрогеназной активности в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального диабета и определить наличие множественных молекулярных форм изучаемого энзима;

4) получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты изоформ МДГ из органоидов гепатоцитов крыс;

5) исследовать физико-химические, кинетические и регуляторные свойства цитоплазматической, митохондриальной и пероксисомальной форм МДГ из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета;

6) исследовать особенности регуляции изоформ малатдегидрогеназы интермедиатами основных метаболических путей;

7) установить действие различных ионов и температуры на активность исследуемых форм малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс.

Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о способах трансформации метаболических потоков в животной клетке с помощью изоферментов малатдегидрогеназной системы в условиях экспериментального диабета. Показано появление дополительной пероксисомальной изоформы фермента, обуславливающей функционирование глиоксилатного цикла, как этапа глюконеогенеза. Выделение изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета позволило получить новые данные о физико-химических характеристиках, особенностях структурной организации и регуляции метаболитами. Сравнительный анализ указывает на значительное сходство по большинству характеристик (Л^ четвертичной структуре, рН-оптимуму, сродству к субстрату, активации ионами и др.) пероксисомальной и цитоплазматической форм изучаемого фермента. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы может иметь важное значение в реализации механизмов адаптивных реакций гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы позволяют расширить и углубить наши представления о роли разных изоформ малатдегидрогеназы в животной клетке в механизмах реализации адаптивных реакций к повышенным концентрациям глюкозы. Высокоочищенные изоформы МДГ могут быть использованы для количественного определения малата в клеточном соке клеток. Получение препаратов множественных молекулярных форм исследуемого фермента открывает перспективы его применения в научно-исследовательских изысканиях, связанных с исследованием ферментативной кинетики и моделированием сопряженных ферментных систем при патологиях, а также для биохимических анализов в лабораторной практике.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, спецкурсах по энзимологии, кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на 12 международной Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2008,2009,2010), ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (148 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок, 7 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали самцов беспородных лабораторных крыс (Rattus rattus L.) в возрасте трёх месяцев и массой 180-200г., которые выращивались в виварии при нормальном питании, а затем были инъектированы подкожно 5% аллоксаном (100 мг / кг веса, раствор в 0,9% NaCI). Контрольные животные выращивались при нормальном пищевом режиме; обработка аллоксаном не проводилась.

Контроль за индукцией диабета. Индукция диабета контролировалась изменением концентрации глюкозы в крови. Определение глюкозы производили стандартным глюкозооксидазным методом [Чернышев Г.А., 1998].

Получение материала для исследования. Для получения ткани печени опытных животных предварительно усыпляли хлороформом и проводили декапитацию.

Определение активности ферментов. Активность изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1.) определяли по методу Диксона и Корнберга [Попов В.Н. и др., 1996].

Активность мапатсинтазы (КФ 4.1.3.2.) определяли при 412 нм по формированию комплекса СоА-БН и дитио-биснитробензойной кислоты (метод Хока и Биверса).

Активность малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37.) измеряли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью расходования НАДН.

Для определения активности аконитатгидратазы (КФ 4.2.1.3.) применяли метод, основанный на учёте разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цисаконитатом.

Для определения активности сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1.) пользовались общепринятой методикой [Ерпг^еу А.Т. й. а1., 2010].

Определение активности изоцитратдегидрогеназы, НАДФ+-зависимой (КФ 1.1.1.42) проводили при 340 нм.

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу (КФ 1.1.1.49) определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм [Уе58а1 М. е1 а1., 1996].

Активность ФЕП-карбоксикиназы (КФ 4.1.1.32) определяли спектрофотометрически при 340 нм.

Определение активности пируваткиназы (КФ 2.7.1.40) проводили при 340 нм.

Для измерения активности АсАТ и АлАТ пользовались стандартным набором реактивов. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, превращающего 1мкМ субстрата за 1 минуту при 25°С и оптимальном значении рН.

Определение количества метаболитов. Определение количества интермедиатов проводили энзиматическими методами при 340 нм с использованием СФ 46. При расчёте количества данных метаболитов учитывали то, что для НАДН и НАДФН изменение оптической плотности при 340 нм на 0,207 будет соответствовать ЮОнмоль определяемого вещества [Детлаф Т.А., 1974].

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [Ьо\угу еЧ. а1., 1951].

Выделение и очистка фермента. Для получения высокоочищенного препарата МДГ были использованы специальные схемы очистки, включающие получение гомогената, фракционирование сульфатом аммония,

гель-фильтрацию на сефадексе G-25, хроматографию на ионообменнике ДЭАЭ-целлюлозе.

Аналитический электрофорез. Электрофорез нативного фермента проводили по модифицированной методике Дэвиса [Davis, 1964]. Для универсального окрашивания белков использовали метод проявления нитратом серебра. Специфическую идентификацию фермента выявляли с помощью модифицированного реагента Шиффа [Reeves Н.С., 1972].

Определение молекулярной массы белков. Для определения молекулярной массы МДГ пользовались методом, описанным Лэммли [Laemmly U.K., 1970]. Для определения молекулярной массы изоформ нативной малатдегидрогеназы использовали гель-хроматографию на Тоуоре-arl HW-65 [Остерман Л.А., 1983].

Исследование кинетических характеристик и регуляторной активности изоформ Фермента. Кинетические свойства ферментов изучали на электрофоретических гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса проводили методом Лаинуивера-Берка [Варфоломеев С.Д., 1999].

Статистическая обработка данных. Опыты проводились в трех повторностях. Аналитическое определение для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. В таблицах приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента [Лакин, 1990].

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИНДУКЦИИ АЛЛОКСАНОВОГО ДИАБЕТА

Введение аплоксана подопытному животному способствовало увеличению концентрации глюкозы в крови до 15,8 ммоль/л через 10 дней после инъекции. У контрольных животных концентрация глюкозы составила порядка 5,5 ммоль/л.

Уровень глюкозы в крови, ммоль/л

18т

2 0

Рис. 1 Динамика изменения уровня глюкозы в крови у крыс:

1 - контрольные животные;

Здня бдней Юдней 2-животные с

индуцированным аллоксановым диабетом.

Воздействие аллоксана приводит к разрушению Р-клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе, вследствие чего возникает недостаток инсулина и развивается инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) (рис. 1). Реакция животного организма на действие аллоксана в значительной мере зависит от степени включённости различных метаболических процессов, в частности мобилизации запасного пула энергетически активных веществ. В печени протекают глюконеогенетические процессы, формируются кетоновые тела, а также активные транспортные формы жира, то есть важные энергетические субстраты для органов крыс [Епринцев А.Т. и др., 2008; Лебкова Н.П., 2000].

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПУТЕЙ В ПЕЧЕНИ КРЫС Реакция животного организма на действие аллоксана в значительной мере зависит от степени включённости различных метаболических процессов, в частности мобилизации запасного пула энергетически активных веществ [Епринцев А.Т. и др., 2008; Степанова И.Ю. и др., 2002]. Особую роль с точки зрения решения данной проблемы выполняет печень, так как в ней синтезируются многие органические вещества, используемые другими органами и тканями.

Таблица 1.

Изменение активности некоторых ферментов основных метаболических путей в печени крыс (п=5, р<0,05)

Ферменты Контроль, Контроль, Опыт, Опыт,

Е/г.с.м. Е/мг белка Е/г.с.м. Е/мг белка

мдг 0,27±0,01 0,006±0,003 0,66±0,01 0,022±0,001

АГ 1,48±0,01 0,041±0,002 2,30±0,02 0,077±0,004

сдг 1,31±0,03 0,031±0,002 1,67±0,07 0,055±0,003

идг 0,82±0,03 0,024±0,001 0,86±0,01 0,010±0,001

МС - - 0,45±0,09 0,015±0,001

ИЦЛ - - 0,19±0,06 0,006±0,001

ПК 0,56±0,03 0,013±0,001 0,35±0,01 0,012±0,001

Гл-6-ФДГ 1,03±0,04 0,025±0,001 0,38±0,02 0,013±0,001

ФЕП-КК 0,26±0,01 0,006±0,001 0,57±0,01 0,019±0,001

В печени крыс с аллоксановым диабетом наблюдается индукция маркерных ферментов ГЦ (МС и ИЦЛ), активность которых составляет 0,45 Е/г.с.м. и 0,19 Е/г.с.м. соответственно. В печени контрольных животных активность данных ферментов не обнаружена. Индуцированный диабетом

ускоренный синтез щавелевоуксусной кислоты в свою очередь стимулирует активность других энзимов глюконеогенеза, в частности ФЕП-КК, активность которой в опытной пробе составляет 0,57 Е/г.с.м., а в контрольной 0,26 Е/г.с.м. Роль фосфоенолпируват - карбоксикиназы (ФЕП-КК) заключается в синтезе ФЕП как предшественника глюкозы. Рост активности ФЕП-КК при диабете отражает увеличение скорости синтеза фермента в ответ на недостаток глюкозы (табл.1).

Следует также отметить, что при патологическом состоянии, к которому можно отнести экспериментальный диабет, организм стремится сохранить максимальное количество белков. Об этом свидетельствует относительно постоянный уровень аминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) (табл. 2).

Таблица 2.

Изменение активности АсАТ и АлАТ в печени крыс с диабетом

(п=5, р<0,05)

Ферменты, мккат/л Контроль Опыт

АсАТ 0,79±0,03 0,59±0,03

АлАт 1,00±0,05 1,00±0,05

ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ УГЛЕВОДОВ В ТКАНЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ

Результаты исследований свидетельствуют о том, что аллоксановый диабет вызывает снижение в печени таких гликолитических метаболитов, как ФЕП и лактат, малат. Лактат, образованный в других тканях, током крови доставляется в печень, где выступает в качестве важного исходного материала для процесса глюконеогенеза. Уменьшение количества малата в опытном образце связано с более интенсивной работой МДГ, участвующей в превращении малата в оксалоацетат, который является ещё одним продуктом для реализации глюконеогенеза. Кроме того, малат, являясь промежуточным метаболитом, участвует в протекании одного из путей трансформации жирных кислот в углеводы, предшествующего глюконеогенезу, -глиоксилатного цикла [Попов В.Н. и др., 2000; Марри Р. и др. 1993].

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО НАЛИЧИЯ ТРЁХ ИЗОФОРМ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ

ДИАБЕТОМ

Электрофоретические исследования, проведенные в полиакриламидном геле, показали, что по сравнению с контрольными животными, в гепатоцитах

которых присутствуют две изоформы МДГ2 и МДГ] с ЯГ 0,22 и 0,34 соответственно, у животных с экспериментальным диабетом появляется дополнительная изоформа МДГ3 с коэффициентом электрофоретической подвижности 0,15 (рис. 2).

МДГ3 _. gbdn2

Рис 2. Электрофоретическое разделение изоформ

малатдегидрогеназы из печени крыс:

1 -животное с индуцированным аллоксановым диабетом;

2 - контрольное животное;

Р - фронт красителя бромфенолового

ОЧИСТКА ИЗОФОРМ МДГ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ

ДИАБЕТОМ

Для изучения регуляции метаболических процессов, связанных с различно локализованными формами малатдегидрогеназы, было проведено хроматографическое разделени изоформ МДГ из гепатоцитов контрольных и крыс с экспериментальным диабетом. В результате элюции линейным градиентом КС1 показано, что у контрольных животных малатдегидрогеназная активность обнаруживается в двух фракциях (табл. 4). В печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом появляется

Фракции, м/т

фоакции. мл

Рис 3. Профиль элюции малатдегидрогеназы из печени крыс с ДЕАЭ-

Toyopearl линейным градиентом KCl: I - из печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом; II - из печени контрольных животных.

Таблица 4.

Очистка изоформ МДГ из печени крысы с индуцированным

аллоксановым диабетом (п=3, р<0,05)

Стадия Объём, мл Активность, Е Общий белок, мг Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат 2,4 5,50± 0,17 48,40± 1,45 0,11± 0,01 100 1

Гель- фильтрация на Ст-25 2,0 4,48± 0,134 12,20± 0,37 0,37± 0,01 80,9 3,2

Хроматография на ДЭАЭ-Тоуореаг1 МДГ, 3,4 1,18± 0,04 0,54± 0,02 2,19± 0,07 21,3 19,2

МДГ2 3,7 1,3 8± 0,04 0,78± 0,02 1,77± 0,05 24,9 16,1

МДГз 3,8 2,40± 0,07 0,56± 0,02 4,29± 0,13 43,3 37,6

Гель- фильтрация на Тоуореаг1 Н\У-65 МДГ, 1,5 0,113± 0,003 0,028± 0,001 4,04± 0,12 2,0 36,7

мдг2 2,0 0,150± 0,005 0,044± 0,001 3,41± 0,10 2,7 31,0

МДГз 1,5 0,140± 0,004 0,018± 0,001 7,78± 0,23 2,5 70,7

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГОМОГЕННОСТИ ФЕРМЕНТА Проведённый электрофоретический анализ очищенных препаратов показал, что в полиакриламидном геле, окрашенном нитратом серебра, проявлялись белковые полосы с Ш"= 0,34 , ЯГ = 0,22 и 1?Г=0,15 (рис. 4).

МДГ2

Рис 4. Электрофореграмма МДГ, очищенной из печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом:

Р-фронт красителя бромфенолового

МДГз МДГ,

F

Белковые полосы соответствуют трём пикам элюции с ДЭАЭ-ТоуореаН, для МДГ из гепатоцитов крыс с экспериментальным диабетом, а также полосам при специфическом проявлении данного фермента из гомогената. Полученные данные свидетельствуют о гомогенности выделенных ферментативных препаратов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ СУБЪЕДИНИЦ ФЕРМЕНТОВ МЕТОДОМ ББ-Ка ПААГ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Электрофоретические исследования по субъединичному строению изоформ изучаемого фермента из гепатоцитов голодающих крыс позволили установить величину молекулярной массы субъединиц цитозольной, митохондриальной и пероксисомальной изоформ МДГ, которая составила 40-46 кДа (рис. 5, 6).

Рис 5. 08-1Ча-ПААГ электрофорез изоформ МДГ, очищенных из гепатоцитов крыс в условиях аллоксанового диабета.

Маркерные белки:

1 - целлюлаза (94,6 кДа); 2 - бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа); 3 -яичный альбумин (45,0 кДа); 4 - трипсин (21,5 кДа); 5 - лизоцим (14,4 кДа).

а. Цитозольная форма МДГ;

б. Пероксисомальная изоформа;

в. Митохондриальная изоформа МДГ.

>Мг :

4.8 ■

4,6 1

4,4 "!

0,5

Рис 6. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ методом Ов^а-электрофореза: 1

целлюлаза; 2-бычий сывороточный альбумин; 3-яичный альбумин; 4-карбоангидраза; 5-лизоцим; 6-МДГ. (п=5, р<0,05).

КГ

Значения молекулярной массы различных форм МДГ из гепатоцитов голодающих крыс, определенные гель-фильтрацией через сефадекс 0-200

составили 162±2,5 кДа, 92±3,9 кДа для пероксисомальной и митохондриальной форм фермента соответственно, а также - 170+8,3 кДа -для цитозольной изоформы малатдегидрогеназы (табл. 5).

Таблица 5,

Сравнительная характеристика молекулярной массы и субъединичного строения малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс при голодании

(п=5; р<0,05)

Молекулярная масса, кДа Молекулярная масса субъединиц, кДа Количество субъединиц

Цитоплазматическая 170 42 4

Митохондриальная 92 46 2

Пероксисомальная 162 40 4

КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗОФОРМ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Изучение кинетических параметров изоформ МДГ, выделенных из гепатоцитов крыс при индуцированном диабете важны для понимания их роли в процессах метаболизма.

10 15 1/[S],mM

10 15 1/[s],mm

Рис 7. Определение Км по малату для изоформ МДГ:

1-МДГ,;

II - МДГ2;

III - МДГз.

Установленные величины костанты Михаэлиса по малату (рис. 7) указывают на низкое сродство фермента к этому субстрату. Данные значения составляют 276 мкМ для МДГЬ 866 мкМ для МДГ2 и 123 мкМ для МДГ3. Это обусловлено конформационными изменениями изоформ МДГ при превращении этого субстрата [Пинейру и др., 1991, Uttaro A.D. et al., 1997]. Значение Км по малату варьирует в широких пределах и зависит от выполняемых функций МДГ внутри клетки и от влияния различных факторов на живой организм.

Получены экспериментальные данные, свидетельствующие, что сродство фермента к NAD+ ниже, чем к NADH и составляет, соответственно, Км по NAD+ 185мкМ для МДГ,, 120 мкМ для МДГ2 и 155 мкМ для МДГ3 (рис. 8). Таким образом, выявленная форма МДГз по кинетическим параметрам имеет сходство с известной ранее МДГ2.

1/IS],mM

1/[S],mM

Рис 8. Определение Км по NADH для изоформ МДГ:

1-МДГ,;

II -МДГ2;

III - МДГ3.

В большинстве работ, посвященных изучению каталитического механизма МДГ [Stumvoll М. et. al., 1997], показано, что кинетика реакций подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Полученные

экспериментальные данные также свидетельствуют об аналогичной последовательности присоединения кофермента и субстрата к ферменту.

1/[S],mM

-150 -100 -50

50 100 150 1/[S],MM

-150 -100 -50

50 100 150 1/[S],MM

-150 -100 -50

50 100 150 1/[S], mM

Рис 9. Определение Км no NADH

для изоформ МДГ:

1-МДГ,;

II -МДГ2;

III - МДГ3.

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВОДОРОДА При изучении влияния ионов водорода на активность установлено, что оптимальные значения рН, при которых обнаруживается максимальная скорость восстановления оксалоацетата и окисления малата, находятся в щелочной области (рис. 10). Так, рН-оптимум для реакции восстановления оксалоацетата составляет 9 для МДГь 8,7 для МДГ2 и 8,5 для МДГз. рН-оптимум для окисления малата лежит в ещё более щелочной области. Для МДГ] он составляет 9,8, для МДГ2 - 9,9 и для МДГ3- 9 (табл. 6).

Полученные можно данные объяснить тем, что МДГ катализирует окисление и восстановление субстратов в двух конформационных состояниях, различных по своим параметрам и, возможно, по функциональным аминокислотным остаткам, которые принимают участие в каталитических реакциях [Варфоломеев С.Д., 1999; Iyer S.L. et al., 1983].

0,09" 0,08 0,070.06 -0,050,040.03 0,020,01 ■ 0 ■■

рН

Рис 10. Зависимость скорости реакции от рН среды для изоформ МДГ:

1-МДГ,;

II - МДГ2;

III - МДГз;

Таблица 6.

Кинетические и регуляторные характеристики изоформ МДГ

Свойства МДГ, МДГ2 МДГ3

Км(малат),мкМ 276±8,3 866±18,0 123±3,8

Км (КАБН), мкМ 90±2,7 35±1,1 50±1,5

Км (ЫАОт), мкМ 185±5,6 120±3,8 155±4,7

рН-оптимум (оксалоацетат) 9±0,2 8,7±0,2 8,5±0,2

рН-оптимум (малат) 9,8±0,3 9,9±0,3 9±0,2

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ МАГНИЯ Обнаружено, что ионы двухвалентного металла Mg2+ оказывают активирующий эффект на все изоформы МДГ. Однако оптимальные концентрации этого иона для отдельных изоформ различны. В количестве 3 мМ ионы магния активируют МДГ] и МДГ2 на 50 и 40% соответственно, а МДГз - на 15%. Концентрация в среде ионов М§2+ свыше 3,5 мМ вызывает ингибирующий эффект (рис 11).

3,5 -| 3 -2 2,5-

ш

> 1 -0,5 -0 -

0

2

3

4

5

6

[Мд], мМ/л

Рис 11. Влияние на активность изоформ МДГ:

1 - МДГ,; 2 - МДГ2; 3 - МДГ3.

ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ИЗОФОРМ МДГ ИЗ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС

Полученные нами данные по исследованию термостабильности МДГ из органоидов клеток печени крыс указывают на сходную картину зависимости активности изоферментов малатдегидрогеназы от времени инкубации (1, 5, 10 минут) в диапазоне значений температуры от 5 до 60°С [Пинейру и др., 1991]. Температурный оптимум цитозольной изоформы МДГ при восстановлении оксалоацетата равнялся 35°С, при окислении малата 37°С. Митохондриальная и пероксисомальная изоформы МДГ имеют температурные оптимумы при 35°С и 40°С соответственно для прямой реакции.

На основе полученных данных рассчитаны значения энергии активации (Еакт) для переходного состояния фермент-субстратного комплекса, указывающие, что митохондриальная и пероксисомальная изоформы МДГ существуют в одном конформационном состоянии. Вычисленные значения энергии активации составили 4,2 и 5,1 кДж/ моль. Для цитозольного фермента выявили, что в интервале температур от +5°С до +60°С получается ломаная линия с точкой изгиба при +26°С. Энергия активации до излома составила 6,1 кДж/ моль и после излома - 3,3 кДж/ моль.

СТРОЕНИЕ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АКТИВНОГО ЦЕНТРА МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ С помощью специфичных аминокислотных ингибиторов изучено присутствие серина, аргинина и лизина в активном центре цитоплазматической МДГ из гепатоцитов крыс.

Исследование активного центра цитоплазматической МДГ с помощью фенилметилсульфонилфторида показало, что остатки серина не являются необходимыми для ее каталитической активности. В присутствии этого ингибитора активность данного изофермента МДГ после 60-минутной инкубации падает лишь на 9%. Одновременно была также исследована структура активного центра глиоксисомальной МДГ. Путем инкубации МДГ в присутствии n-хлормеркурибензоата было исследовано участие сульфгидрильных групп цистеина в ее активном центре. В активном центре пероксисомальной МДГ, так же, как и в этой структуре цитоплазматического изофермента, обнаруживается присутствие функционального остатка лизина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В стрессовых условиях перед организмом возникают новые метаболические потребности, для удовлетворения которых необходимы количественные и качественные перестройки ферментных систем клетки. Адаптивные изменения включают перестройку регуляторных механизмов метаболических путей, что ведет либо к изменению изоферментного спектра, либо к изменению каталитических свойств существующих ферментов, при этом активируются пути, которые в норме функционируют незначительно или вовсе отсутствуют. Поэтому главной задачей метаболизма при диабете остается поддержание достаточного уровня глюкозы в тканях организма и, в первую очередь, в мозге, что достигается интенсификацией метаболизма, гибкостью обмена веществ, строгостью регуляции реакций, катализируемых исследуемыми ферментами [Епринцев А.Т. и др, 2007, 2008].

Кроме того, немаловажное значение в адаптивной реакции организма при аллоксановом диабете играет малатдегидрогеназа [Malick A.W. et al., 1977]. Существенный рост активности фермента у животных при индукции аллоксанового диабета, вероятно, связан с процессами мобилизации запасных питательных веществ. После мобилизации запасного гликогена наиболее важным ресурсом клетки остаются запасные жиры. Р-окисление жирных кислот интенсивно протекает как в митохондриях, так и в

пероксисомах гепатоцитов [Lazarow Р.В. et al., 1985; Moor R.E. et al., 1983]. Данный факт позволяет предположить, что максимальная индукция малатдегидрогеназной активности была связана с появлением новой изоформы МДГ, выделенной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-Toyopearl, которая имеет, по-видимому, пероксисомальную локализацию. Получение в электрофоретически гомогенном состоянии пероксисомапьной, цитозольной и митохондриальной изоформ МДГ открыло перспективу исследования их физико-химических и регуляторных характеристик. Анализ полученных данных в этой работе и опубликованных ранее в научной литературе позволяет считать, что димерная изоформа МДГ из митохондрий обеспечивает протекание реакций цикла Кребса, а тетрамерная цитозольная и индуцированная пероксисомальная малатдегидрогеназа катализирует реакции глюконеогенеза и глиоксилатного цикла соответственно. Обсуждение свойств пероксисомальной изоформы МДГ и цитозольной формы исследуемого фермента показывает их значительное сходство (рН оптимум, Км по субстрату и по ферментам, температурный оптимум и др.). Можно предположить, что именно цитозольная изоформа МДГ претерпевает посттрансляционные трансформации и доставляется в пероксисомы гепатоцитов печени крыс, где принимает участие в осуществлении реакций глиоксилатного цикла. Подобный механизм описан для некоторых пероксисомальных белков [Игамбердиев А.У., 1990; Косматых Т.Н., 2002]. Полученные результаты позволили разработать гипотетическую схему участия изоформ малатдегидрогеназы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс при аллоксановом диабете (рис. 12).

Увеличение активности и появление новой изоформы МДГ в печени крыс при диабете подтверждают возможность участия малатдегидрогеназной системы в адаптивной реакции организма при стрессовых условиях и ее полиморфизм. Роль малатдегидрогеназы в адаптации к изменяющимся условиям среды сводится к интенсификации глюконеогенетических и дыхательных процессов, мобилизации запасного пула малата и ускорению внутриклеточного транспорта углеродных соединений.

Рис. 12 Гипотетическая схема участия изоформ малатдегидрогеназы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового диабета. Условные обозначения: ЖК - жирные кислоты, двойная стрелка указывает на индукцию пероксисомальной МДГ. МДП - цитоплазматическая форма малатдегидрогеназы, МДГг - митохондриальная форма малатдегидрогеназы, МДГз -пероксисомальная форма малатдегидрогеназы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что аллоксан является индуктором диабета, повышая концентрацию глюкозы в крови. Введение 150 мг аллоксана на 1 кг массы животного приводит к увеличению концентрации глюкозы в крови в 2-4 раза. Повышенная концентрация глюкозы у экспериментальных животных сохраняется не менее двух месяцев.

2. Установлено, что при экспериментальном диабете наблюдается активация большинства ферментов цикла трикарбоновых кислот в печени крыс, изменение содержания органических кислот, уменьшение активности ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути, а также индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла.

3. Активность малатдегидроненазы, принимающая участие как в глиоксилатном цикле, так и в цикле трикарбоновых кислот, увеличивалась в 2,5 раза в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального диабета. При этом повышение ферментативной активности сопровождалось появлением новой изоформы фермента с Rf 0,15.

4. С помощью четырёхстадийной очистки получены в электрофоретически гомогенном состоянии изоформы малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс в условиях аллоксанового диабета. Удельная активность для цитозольной МДГ составляла 7,78 Е/мг белка (степень очистки 70,7 раза), для митохондриальной МДГ - 4,04 Е/мг белка (36 раз) и для пероксисомальной МДГ - 3,41 Е/мг белка (31 раз).

5. Методами гель-хроматографии на Toyopearl HW-65 и Ds-Na ПААГ-электрофорезом исследовано субъединичное строение изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс. Установлено, что исследуемый фермент имеет димерное (митохондриальная форма) или тетрамерное (цитозольная или пероксисомальная форма) строение. Значения молекулярной массы субъединицы, определенные методом денатурирующего электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, колеблются от 40 до 44 кДа.

6. Анализ кинетических характеристик и физико-химических свойств индуцируемой формы МДГ3 выявил её значительное сходство с МДГ2, имеющей цитоплазматическую локализацию. Отличительной особенностью данной изоформы является ее меньшее сродство к кофакторам NADH и NAD+. Установлено также, что все обнаруженные изоформы МДГ в гепатоцитах крыс регулируют свою активность с помощью аллостерического механизма.

7. Выявлены определенные закономерности влияния концентрации ионов водорода на скорость ферментативных реакций, катализируемых различными изоформами малатдегидрогеназы. Значение рН-оптимума для реакции окисления маната лежит в более щелочной среде (МДГ) - 9,8; МДГ2 - 9,9 и МДГ3 - 9) по сравнению с реакцией восстановления оксалоацетата

8. Установлено, что двухвалентные ионы магния оказывают регуляторное влияние на скорость ферментативной реакции. При этом, выявлено активирующее действие ионов Mg2+ в используемых концентрациях на все изоформы МДГ.

9. Определены значения температурных оптимумов и термостабильности изучаемых изоформ малатдегидрогеназ. Индуцированная в условиях аллоксанового диабета пероксисомальная форма малатдегидрогеназы обладает более термостабильными свойствами.

10. В активном центре пероксисомальной и цитозольной форм малатдегидрогеназы обнаружены остатки следующих аминокислот: лизин, цистеин и гистидин. Предполагается механизм превращения субстрата в активном центре при взаимодействии молекул фермента и кофермента.

(МДГ, - 9, МДГ2 - 8,7 и МДГ3 - 8,5).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

2.

1.

Динамика активности ферментов основных метаболических путей в печени крыс с аллоксановым диабетом / В.Ю.Башмаков, Е.В.Полуэктова, А.Ф.Сатар ... [и др] //Физиология и психофизиология мотиваций. Воронеж. - 2008. - вып. 9. С. 30-33. Идентификация гена МДГ в печени крыс с алооксановым диабетом / В.Ю.Башмаков, А.Ф.Сатар ... [и др] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. -

2008. - С. 41-45.

3.

О возможности использования препарата Бк(31 в терапии сахарного диабета на примера аллоксановой модели заболевания / В.Ю.Башмаков, А.Ф.Сатар ... [и др] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. - 2009. - С. 46-

50.

Кинетические характеристики тетрамерной формы малатдегидрогеназы, полученной с использованием ионообменной хроматографии, из животных и бактерий / А.Ф.

Сатар ... [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. - Т.10, вып.2. - С. 231-236.

Физико-химические свойства малатдегидрогеназной системы микроорганизмов из различных экологических групп при смене типа питания / К.Д. Шихалиева ... А.Ф. Сатар ... [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. - 2010. - С. 190-211.

Работа №4 опубликована в издании, рекомендованном Перечнем ВАК.

Подписано в печать 27.05.10. Формат 60*84 '/|6. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 80 экз. Заказ 738

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-нолиграфичсского цешра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фарис Сатар Абуд

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности биохимических нарушений при аллоксановом диабете.

1.1.1. Понятие об аллоксановом диабете.

1.1.2. Ультраструктурные изменения клеток животных при диабете и голодании

1.1.2.1. Гликоген как основной энергетический субстрат клеток при стрессовых условиях.

1.1.2.2. Функционирование глиоксилатного цикла в тканях животных и человека.

1.1.2.3. Процессы гликолиза и глюконеогенеза в тканях высших животных.

1.2. Роль малатдегидрогеназы в регуляции метаболических процессов.

1.2.1. Общая характеристика малатдегидрогеназной активности.

1.2.2. Участие малатдегидрогеназы в метаболических процессах.

1.2.3. Молекулярная масса и субъединичное строение.

1.2.4. Каталитические свойства малатдегидрогеназы.

1.2.4.1. Общая характеристика каталитического действия.

1.2.4.2. Кинетические параметры.

1.2.5. Влияние концентрации ионов водорода на активность малатдегидрогеназы.

1.2.6. Влияние температуры на активность малатдегидрогеназы.

1.2.7. Влияние интермедиатов и ионов на активность малатдегидрогеназы.

1.2.8. Изоферментный состав малатдегидрогеназы.

1.3. Механизмы адаптации животных к диабету.

1.3.1. Ультраструктурные изменения клеток животных при диабете и голодании.

1.3.2. Гормональная регуляция энергетического метаболизма у высших животных при пищевой депривации.

1.3.3. Биохимические сведения о конверсии жирных кислот в углеводы в клетках высших животных.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объект и методы исследования

2.1.1. Объект исследования

2.1.2. Методы исследования.

2.1.2.1. Контроль за индукцией диабета.

2.1.2.2. Получение материала для исследования.

2.1.2.3. Определение активности ферментов.

2.1.2.4. Определение количества метаболитов.

2.1.2.5. Определение количества белка.

2.1.2.6. Методы хроматографического разделения изоформ малатдегидрогеназы.

2.1.2.7. Электрофоретические исследования.

2.1.2.7.1. Определение гомогенности ферментов.

2.1.2.7.2. Специфическое проявление МДГ.

2.1.2.7.3. Определение молекулярной массы субъединиц фермента методом Ds-Na ПААГ-электрофореза.

2.1.2.8. Определение молекулярной массы нативного фермента.

2.1.2.9. Исследование кинетических характеристик и регуляторной активности изоформ фермента.

2.2.3. Статистическая обработка данных.

2.3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.3.1. Доказательство индукции аллоксанового диабета.

2.3.2. Изменение активности некоторых метаболических путей в печени крыс.

2.3.3. Динамика содержания углеводов в тканях печени крыс с аллоксановым диабетом.

2.3.4. Доказательство наличия трёх изоформ малатдегидрогеназы в печени крыс с аллоксановым диабетом.

2.3.5. Очистка изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс с аллоксановым диабетом.

2.3.6. Электрофоретические исследования.

2.3.6.1. Определение гомогенности фермента.

2.3.6.2. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов методом DS-Na ПААГ-электрофореза.

2.3.7. Определение молекулярной массы малатдегидрогеназы.

2.3.8. Кинетические и регуляторные характеристики изоформ малатдегидрогеназы.

2.3.8.1. Отношение изоформ малатдегидрогеназы к концентрации субстрата.

2.3.8.2. Определение константы Михаэлиса.

2.3.9. Влияние концентрации ионов водорода.

2.3.10. Влияние концентрации ионов магния.

2.4. Влияние температуры на активность МДГ, выделенной из различных органоидов гепатоцитов крыс с аллоксановым диабетом.

2.4.1. Термостабильность изоформ МДГ из гепатоцитов крыс.

2.4.2. Температурный оптимум изоформ МДГ из гепатоцитов крыс.

2.5. Строение и механизм действия активного центра малатдегидрогеназы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс при аллоксановом диабете"

Актуальность проблемы. Диабет - хроническое заболевание, приводящее к нарушениям углеводного, белкового и жирового обменов в результате недостатка гормона инсулина.

Известно, что основным энергетическим субстратом в клетках и тканях организма выступают углеводы. Постоянное поступление глюкозы в качестве источника энергии особенно необходимо для нервной ткани и эритроцитов. При экспериментальном диабете ткани испытывают недостаток в глюкозе. В качестве механизма адаптации к данному процессу выступает глюконеогенез. Он имеет особенно важное значение в печени, которая является главным метаболически активным органом, участвующим в поддержании гомеостаза глюкозы. Соотношение между процессами катаболизма и анаболизма глюкозы в клетках печени находится под контролем целого ряда факторов регуляции, включая концентрацию метаболитов, нуклеотидов, а также воздействие гормонов. В нормальных условиях глюконеогенетические трансформации в печени млекопитающих протекают с относительно низкой скоростью. Интенсификация данного процесса наблюдается при дефиците углеводов, в частности при диабете [19,20].

Кроме того, при адаптации клеточного метаболизма к изменениям условий среды организм использует стратегию регуляции активности ферментного аппарата клетки. Важная роль в осуществлении адаптивных реакций организма принадлежит малатдегидрогеназной системе. Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание конструктивного и энергетического обменов. В последнее время малатдегидрогеназа (МДГ) является объектом значительного количества исследований, что обусловлено ее полифункциональностью. Малатдегидрогеназный комплекс обеспечивает функционирование важнейших метаболических процессов, обеспечивающих нормальное функционирование клетки. Особенностью малатдегидрогеназы является участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров, то есть данный фермент относится к биокатализаторам глиоксилатного цикла. Наличие в клетке различных процессов, связанных с функционированием одного фермента малатдегидрогеназы требует сложной многоуровневой регуляции его активности. К механизмам такой регуляции причисляют пространственно разделенные изоформы, имеющие различные кинетические характеристики и структуру молекул данного фермента. По мнению некоторых исследователей, МДГ может быть представлена в виде димерной или тетрамерной формы, которые участвуют в анаболическом и катаболическом метаболизме. По данным современных исследователей димерная изоформа имеет митохондриальную локализацию и участвует в энергетическом обмене (ЦТК), а тетрамерная МДГ, локализованная в цитоплазме или этиопластах, функционирует в анаболических процессах клетки.

В связи с этим большой интерес представляет изучение действия экспериментального диабета на структурно-функциональные трансформации малатдегидрогеназы в гепатоцитах крыс. Кроме того, мало известно о их роли в адаптивных реакциях, обеспечивающей переключение метаболизма на утилизацию жирных кислот и их превращение в водорастворимые углеводы.

Таким образом, целесообразно изучить структуру адаптивного ответа клеточной энергетики печени, оценить особенности различных метаболических путей крыс при аллоксановом диабете, а также рассмотреть возможность участия малатдегидрогеназной системы в адаптивной реакции организма лабораторных крыс к экспериментальному диабету.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение особенностей глюконеогенетических трансформаций в печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом; получение гомогенных препаратов изоформ малатдегидрогеназы из печени крыс с индуцированным аллоксановым диабетом и сравнение их физико-химических, каталитических и регуляторных свойств. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить концентрацию интермедиатов основных метаболических процессов в печени крыс при экспериментальном диабете;

2) определить динамику ключевых ферментов основных метаболических путей в печени крыс при индукции аллоксаном экспериментального диабета;

3) установить возможность индукции малатдегидрогеназной активности в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального диабета и определить наличие множественных молекулярных форм изучаемого энзима;

4) получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты изоформ МДГ из органоидов гепатоцитов крыс;

5) исследовать физико-химические, кинетические и регуляторные свойства цитоплазматической, митохондриальной и пероксисомальной форм МДГ из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета;

6) исследовать особенности регуляции изоформ малатдегидрогеназы интермедиатами основных метаболических путей;

7) установить действие различных ионов и температуры на активность исследуемых форм малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс.

Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о способах трансформации метаболических потоков в животной клетке с помощью изоферментов малатдегидрогеназной системы в условиях экспериментального диабета. Показано появление дополнительной пероксисомальной изоформы фермента, обуславливающей функционирование глиоксилатного цикла, как этапа глюконеогенеза. Выделение изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета позволило получить новые данные о физико-химических характеристиках, особенностях структурной организации и регуляции метаболитами. Сравнительный анализ указывает на значительное сходство по большинству характеристик (Rf, четвертичной структуре, рН-оптимуму, сродству к субстрату, активации ионами и др.) пероксисомальной и цитоплазматической форм изучаемого фермента. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы может иметь важное значение в реализации механизмов адаптивных реакций гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы позволяют расширить и углубить наши представления о роли разных изоформ малатдегидрогеназы в животной клетке в механизмах реализации адаптивных реакций к повышенным концентрациям глюкозы. Высокоочищенные изоформы МДГ могут быть использованы для количественного определения малата в клеточном соке клеток. Получение препаратов множественных молекулярных форм исследуемого фермента открывает перспективы его применения в научно-исследовательских изысканиях, связанных с исследованием ферментативной кинетики и моделированием сопряженных ферментных систем при патологиях, а также для биохимических анализов в лабораторной практике.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, спецкурсах по энзимологии, кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на 12 международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2008, 2009, 2010), ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (148 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок, 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фарис Сатар Абуд

ВЫВОДЫ

1. Показано, что аллоксан является индуктором диабета, повышая концентрацию глюкозы в крови. Введение 150 мг аллоксана на 1 кг массы животного приводит к увеличению концентрации глюкозы в крови в 2-4 раза. Повышенная концентрация глюкозы у экспериментальных животных сохраняется не менее двух месяцев.

2. Установлено, что при экспериментальном диабете наблюдается активация большинства ферментов цикла трикарбоновых кислот в печени крыс, изменение содержания органических кислот, уменьшение активности ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути, а также индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла.

3. Активность малатдегидроненазы, принимающая участие как в глиоксилатном цикле, так и в цикле трикарбоновых кислот, увеличивалась в 2,5 раза в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального диабета. При этом повышение ферментативной активности сопровождалось появлением новой изоформы фермента с Rf 0,15.

4. С помощью четырёхстадийной очистки получены в электрофоретически гомогенном состоянии изоформы малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс в условиях аллоксанового диабета. Удельная активность для цитозольной МДГ составляла 7,78 Е/мг белка (степень очистки 70,7 раза), для митохондриальной МДГ - 4,04 Е/мг белка (36 раз) и для пероксисомальной МДГ - 3,41 Е/мг белка (31 раз).

5. Методами гель-хроматографии на Toyopearl HW-65 и Ds-Na ПААГ-электрофорезом исследовано субъединичное строение изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс. Установлено, что исследуемый фермент имеет димерное (митохондриальная форма) или тетрамерное (цитозольная или пероксисомальная форма) строение. Значения молекулярной массы субъединицы, определенные методом денатурирующего электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, колеблются от 40 до 44 кДа.

6. Анализ кинетических характеристик и физико-химических свойств индуцируемой формы МДГ3 выявил её значительное сходство с МДГ2, имеющей цитоплазматическую локализацию. Отличительной особенностью данной изоформы является ее меньшее сродство к кофакторам NADH и NAD+. Установлено также, что все обнаруженные изоформы МДГ в гепатоцитах крыс регулируют свою активность с помощью аллостерического механизма.

7. Выявлены определенные закономерности влияния концентрации ионов водорода на скорость ферментативных реакций, катализируемых различными изоформами малатдегидрогеназы. Значение рН-оптимума для реакции окисления малата лежит в более щелочной среде (МДГ1 - 9,8; МДГ2 - 9,9 и МДГ3 - 9) по сравнению с реакцией восстановления оксалоацетата (МДГ, - 9, МДГ2 - 8,7 и МДГз - 8,5).

8. Установлено, что двухвалентные ионы магния оказывают регуляторное влияние на скорость ферментативной реакции. При этом, выявлено активирующее действие ионов Mg2+ в используемых концентрациях на все изоформы МДГ.

9. Определены значения температурных оптимумов и термостабильности изучаемых изоформ малатдегидрогеназ. Индуцированная в условиях аллоксанового диабета пероксисомальная форма малатдегидрогеназы обладает более термостабильными свойствами.

10. В активном центре пероксисомальной и цитозольной форм малатдегидрогеназы обнаружены остатки следующих аминокислот: лизин, цистеин и гистидин. Предполагается механизм превращения субстрата в активном центре при взаимодействии молекул фермента и кофермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В стрессовых условиях перед организмом возникают новые метаболические потребности, для удовлетворения которых необходимы количественные и качественные перестройки ферментных систем клетки. Адаптивные изменения включают трансформацию регуляторных механизмов метаболических путей, что ведет либо к изменению изоферментного спектра, либо к новым каталитическим свойствам существующих ферментов, при этом активируются пути, которые в норме функционируют незначительно или вовсе отсутствуют. Поэтому главной задачей метаболизма при диабете остается поддержание достаточного уровня глюкозы в тканях организма и, в первую очередь, в мозге, что достигается интенсификацией метаболизма, гибкостью обмена веществ, строгостью регуляции реакций, катализируемых исследуемыми ферментами [21, 22, 33].

Кроме того, немаловажное значение в адаптивной реакции организма при аллоксановом диабете играет малатдегидрогеназа [125]. Существенный рост активности фермента у животных при индукции аллоксанового диабета, вероятно, связан с процессами утилизации запасных питательных веществ. После мобилизации запасного гликогена наиболее важным ресурсом клетки остаются запасные жиры. Р-окисление жирных кислот интенсивно протекает как в митохондриях, так и в пероксисомах гепатоцитов [118, 129]. Данный факт позволяет предположить, что максимальная индукция малатдегидрогеназной активности была связана с появлением новой изоформы МДГ, выделенной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-Toyopearl, которая имеет, по-видимому, пероксисомальную локализацию. Получение в электрофорётически гомогенном состоянии пероксисомальной, цитозольной и митохондриальной изоформ МДГ открыло перспективу исследования их физико-химических и регуляторных характеристик. Анализ полученных данных в этой работе и опубликованных ранее в научной литературе позволяет считать, что димерная изоформа МДГ из митохондрий обеспечивает протекание реакций цикла Кребса, а тетрамерная цитозольная и индуцированная пероксисомальная малатдегидрогеназа катализируют реакции глюконеогенеза и глиоксилатного цикла соответственно. Обсуждение свойств пероксисомальной изоформы МДГ и цитозольной формы исследуемого фермента показывает их значительное сходство (рН оптимум, Км по субстрату и по ферментам, температурный оптимум и др.). Можно предположить, что именно цитозольная изоформа МДГ претерпевает посттрансляционные трансформации и доставляется в пероксисомы гепатоцитов печени крыс, где принимает участие в осуществлении реакций глиоксилатного цикла. Подобный механизм описан для некоторых пероксисомальных белков [32, 39]. Полученные результаты позволили разработать гипотетическую схему участия изоформ малатдегидрогеназы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс при аллоксановом диабете (рис. 21).

Увеличение активности и появление новой изоформы МДГ в печени крыс при диабете подтверждают возможность участия малатдегидрогеназной системы в адаптивной реакции организма при стрессовых условиях и ее полиморфизм. Роль малатдегидрогеназы в адаптации к изменяющимся условиям среды сводится к интенсификации глюконеогенетических и дыхательных процессов, мобилизации запасного пула малата и ускорению внутриклеточного транспорта углеродных соединений.

Рис. 21. Гипотетическая схема участия изоформ малатдегидрогеназы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового диабета.

Условные обозначения: ЖК - жирные кислоты, двойная стрелка указывает на индукцию пероксисомальной МДГ. МДГ1 -цитоплазматическая форма малатдегидрогеназы, МДГ2 - митохондриальная форма малатдегидрогеназы, МДГ3 — пероксисомальная форма малатдегидрогеназы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фарис Сатар Абуд, Воронеж

1. Биохимия человека : в 2-х т. / Р. Мари и др. ; перевод с англ. В.В. Борисова, Е.В. Дайниченко ; под ред. Л.М. Гинодмана. — М. : Мир, 1993. Т. 1.-384 с.

2. Блюменфельд Л.А. Единичные циклы прямой ферментативной реакции на примере малатдегидрогеназы / Л.А. Блюменфельд, П.Г. Плешанов // Биофизика. 1986. - Т.30, № 5. - С. 760-763.

3. Быковская К.Н. Особенности синтеза гликогена в кардиомиоцитах при диабете / К.Н. Быковская, Д.А. Мешков // Архив патологии. 1981. - № 1.-С. 36-40.

4. Варфоломеев С.Д. Биокинетика / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. М. : ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

5. Волвенкин С.В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С.В. Волвенкин, В.Н. Попов, А.Т. Епринцев // Биохимия. 1999. - Т.64, №. 9. - С. 1185-1191.

6. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. М. : Мир, 1982. - 446с.

7. Давранов К. Влияние некоторых органических кислот на активность малатдегидрогеназы семян хлопчатника / К. Давранов, М.А. Кученкова, П.Х. Юлдашев // Химия природных соединений. — 1972. — № 2. — С. 75-79.

8. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. М. : Мир, 1970. -173 с.

9. Детлаф Т.А. Методы биологии развития / Т.А. Детлаф. М.: Наука, 1974.-619 с.

10. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. М. : Мир, 1982. - Т.З. С. 809-1118.

11. Догаева JI.H. Ультраструктурные особенности миокарда собак при сахарном диабете / Л.Н. Догаева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1960. - №4. - С.53-55.

12. Дюв К. Де. Путешествие в мир живой клетки / К.Де Дюв. М.: Мир, 1987.-225 с.

13. Епринцев А.Т. Ферментативная регуляция метаболизма ди- и трикарбоновых кислот в растениях / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов. Воронеж: ВГУ, 1999.- 192 с.

14. Епринцев А.Т. Индукция аконитатгидратазы в гепатоцитах голодающих крыс / А.Т. Епринцев, Е.В. Семёнова, В.Н. Попов // Биохимия. 2002. - Т.67, № 7. - С. 956-966.

15. Епринцев А.Т. Очистка и физико-химические свойства малатдегидрогеназы из бактерий p. Beggiatoa I А.Т. Епринцев и др. // Биохимия. 2003. - Т.68, вып.2. - С. 207-211.

16. Епринцев А.Т. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических и катаболических процессов у Beggiatoa leptomitiformis / А.Т. Епринцев и др. // Микробиология. 2004. - Т.73, № 4. - С.437-442.

17. Епринцев А.Т Малатдегидрогеназа термофильных бактерий Vulcanithermns medioatlant / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, Н.В. Парфёнова // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 9. - С. 1345-1349.

18. Епринцев А.Т. Получение и свойства малатдегидрогеназы из мезо- и термофильных бактерий / А.Т. Епринцев и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42, № 3. - С. 274-278.

19. Епринцев А.Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. -Воронеж: Центрально-Черноземное книжное изд-во, 2005. — 224 с.

20. Епринцев А.Т. Физико-химические характеристики малатдегидрогеназы из бактерий Rhodopseudomonas palustris штамм fBpt / А.Т. Епринцев и др. // Биохимия. 2006. - Т.71, вып.6. - С. 856-860.

21. Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации?/ А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко // Москва. ИКЦ «Академкнига». 2007. - 228с.

22. Епринцев А.Т. Распространение глиоксилатного цикла у организмов различных таксономических групп / А.Т. Епринцев, М.Ю. Шевченко, В.Н. Попов // Успехи современной биологии. 2008. - Т. 128, № З.-С. 271.

23. Епринцев А.Т. Регуляция потоков углерода в системе: цикл трикарбоновых кислот глиоксилатный шунт у Rhodopseudomonas palustris в различных условиях роста/ А.Т. Епринцев и др. // Микробиология. -2008. - Т.77, №2.-С. 158-163.

24. Епринцев А.Т. Углеводный метаболизм в печени крыс при пищевой депривации и экспериментальном диабете/ А.Т. Епринцев, М.Ю. Шевченко, В.Н. Попов // Известия РАН, серия биологическая. 2008. -№ 1.-С. 115-118.

25. Епринцев А.Т. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы бактерий Sphaerotilus sp. Штамм Д-507 в зависимости от типа питания / А.Т. Епринцев и др. //Известия РАН, сер. биологическая. 2009. - № 3. - С. 269-275.

26. Епринцев А.Т. Особенности структурной организации и экспрессионной регуляции изоформ малатдегидрогеназы из Rhodobacter sphaeroides Штамма 2г / А.Т. Епринцев и др. // Биохимия. 2009. - Т.74, вып. 7. - С. 977-984.

27. Ермолаева Л.П. Регуляция глюконеогенеза в онтогенезе / Л.П. Ермолаева. М. : Наука, 1987. - 140 с.

28. Глиоксилатный цикл растений / А.А. Землянухин и др.. -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1986. 148 с.

29. Землянухин А.А. Субклеточная локализация изоформ аконитатгидратазы в высших растениях/ А.А. Землянухин и др. // Физиология растений, 1984. Т. 31, вып. 2. - С. 337-343.

30. Землянухин А.А. Глиоксилатный цикл растений / А.А. Землянухин и др. Воронеж: ВГУ, 1986. - 148 с.

31. Иванищев В.В. Ферменты метаболизма малата: характеристика, регуляция активности и биологическая роль / В.В. Иванищев, Б.И. Курганов // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 5. - С. 653-661.

32. Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений/ А.У. Игамбердиев//Воронеж: Изд-во ВГУ, 1990. 148 с.

33. Игамбердиев А.У. Логика организации живых систем / А.У. Игамбердиев // Воронеж: ВГУ, 1995. 152 с.

34. Кац В.А.Ультраструктура эмбриональной липосаркомы человека / В.А. Кац, Г.А. Лавникова, С.А. Синицкая // Архив патологии. 1984. - Т.46, №5.-С. 38-45.

35. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. / Т.Келети. М.: Мир, 1990.-350 с.

36. Клячко О.С. Температура вызывает структурные и функциональные изменения лактатдегидрогеназы из скелетных мышц рыб / О.С.Клячко, Е.С.Полосухина, Н.Д.Озернюк // Биофизика. 1993. - Т.38, № 4. -С. 596-601.

37. Кондрашова М.Н. Формакологическая коррекция гипоксических состояний / М.Н. Кондрашова. М.: Мир, 1989. - 96 с.

38. Косматых Т.Н. Физико-химические и кинетические свойства изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов голодающих крыс: автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.Н. Косматых. Воронеж, 2002. - 24 с.

39. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты / Б.И.Курганов. М.: Мир, 1987.-248 с.

40. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. -352 с.

41. Лебкова Н.П. Особенности липидного обмена в период голодания / Н.П. Лебкова, М.Ф. Бондаренко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1980. - № 5. - С. 614-617.

42. Лебкова Н.П. Трансформация липидов в гликоген в клетках животных и человека / Н.П. Лебкова // Архив патологии. 1981. - № 2. - С. 72-77.

43. Лебкова Н.П. Современные представления о внутриклеточных механизмах обеспечения энергетического гомеостаза в норме и при патологии / Н.П. Лебкова // Вестник РАМН. 2000. - № 9. - С. 6-22.

44. Лебкова Н.П. Внутриклеточное превращение жирных кислот в гликоген у крыс с аллоксановым диабетом по данным электронной авторадиографии / Н.П. Лебкова, О.Е. Колесова, В.Д. Горбунова // Бюлл. Экспер. Биол. и медицины. 1984. - №12. - С. 734-736.

45. Лебкова Н.П. Субклеточная локализация карнитинацетилтрансферазы в клетках разных органов интактных и голодающих крыс/ Н.П. Лебкова // Бюлл. экспер. биол. и медицины. 1983.-№7.- С. 32-35.

46. Лебкова Н.П. Механизмы трансформации жирных кислот при пищевой депривации / Н.П. Лебкова, А.В. Смольянников // Архив патологии. -1983. Т.45, №7. - С. 41-47.

47. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека / У. Мак-Мюррей. М. : Мир, 1981.-257 с.

48. Марри Р. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес. М. : Мир, 1993.-Т.2.-418 с.

49. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр / Пер. с англ. М. : Мир, 1971.-222 с.

50. Ноздрачева А.Д. Общий курс физиологии человека и животных / А.Д. Ноздрачева. М. : Высш. шк., 1991. - Т. 1. - 512 с.

51. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул / Л.А.Остерман. М. : Мир, 1983. - 297 с.

52. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса / Л.Е. Панин. -Новосибирск, 1983. —213 с.

53. Панин Л.Е. Энергетические аспекты адаптации / Л.Е. Панин. М. : Мир, 1987. - 225с.

54. Панченко Л.Ф. Роль пероксисом в патологии клетки / Л.Ф. Панченко, A.M. Герасимов, В.Д. Антоненко. М. : Мир, 1981. - 312 с.

55. Пинейру де Корвалью М.А.А. Малатдегидрогеназа высших растений / М.А.А. Пинейру де Корвалью, А.А. Землянухин, А.Т. Епринцев Воронеж: Изд-во ВГУ, 1991.-216 с.

56. Попов В.Н., Игамбердиев А.У., Волвенкин С.В. Очистка и свойства изоцитратлиазы и малатсинтазы из печени голодающих крыс / В.Н. Попов, А.У. Игамбердиев, С.В. Волвенкин // Биохимия. 1996. - Т.61, Вып. 10. - С. 1898-1903.

57. Попов В.Н. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в различных тканях голодающих крыс / В.Н. Попов и др. // Известия РАН, Серия биологическая 2000. - № 6. - С. 663-667.

58. Попов В.Н. Влияние ингибиторов электронного транспорта на образование активных форм кислорода при окислении сукцината митохондриями гороха / В.Н. Попов, Э.К. Рууге, А.А. Старков // Биохимия. 2003. Т. 68, № 7. - С. 910-916.

59. Попов В.Н. Сравнительный анализ ключевого фермента глиоксилатного цикла, изоцитралиазы, из организмов разных систематических групп / В.Н. Попов и др. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005. - № 6. - С. 317-329.

60. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М. : Мир, 1985. -358 с.

61. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран / В.П. Скулачев -М.: Наука, 1989.-564 с.

62. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая функция дыхательных систем клетки / В.П. Скулачев // Биохимия. -1994. Т. 59, вып. 12. - С. 1910-1912.

63. Степанова И.Ю. Зависимость структуры МДГ от типа метаболизма у пресноводных нитчатых серобактерий рода Beggiatoa / И.Ю. Степанова и др. // Микробиология. 2002. - Т.71, № 4. - С. 445-451.

64. Страйер JI. Биохимия: в 3-х т. / JI. Страйер. М. : Мир, 1985. - Т.2312с.

65. Струмилло С. Сравнение свойств изоферментов малатдегидрогеназы из сердца зайца и кролика / С. Струмило и др. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2006. - Т. 42, № 5. - С. 450-453.

66. Тыщенко В.П. Физиология насекомых / В.П. Тыщенко М.: МГУ, 1986.-283 с.68. 79. Хочачка П. Биохимическая адаптация. / П.Хочачка, Дж.Сомеро. -М. : Мир, 1988.-518 с.

67. Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1998. - 270 с.

68. Aquino-Silva M.R. Isoform expression in the multiple soluble malate dehydrogenase of Hoplias malabaricus (Erythrinidae, Characiform.es} / M.R. Aquino-Silva, M.L.B. Schwantes, A.R. Schwantes // Braz. J. Biol. 2003. - V. 63, № l.-P. 7-15.

69. Atwal O.S. Glycogen accumulation in alveolar type II cells in 3-methylindole-induced pulmonary edema in goats / O.S. Atwal, T.M. Bray // Am. J. Pathol. 1981. - Vol. 105, №3.-P. 255-262.

70. Backman L. Enzime Enzime complexes between aspartate aminotransferase and Malate dehydrogenase from pig heart muscule / L. Backman, G. Johansson // FEBS Lett. - 1976. - Vol. 65, № 1. - p. 180-183.

71. Barrett E.J. Hepatic glucose metabolism and insulin resistance in NIDDM and obesity / E.L. Barrett, Z. Liu // Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 1993. -Vol.7, №4.-P. 875-901.

72. Barrett J. The glyoxylate cycle and the conversion of triglicerides to carbonhydrates in developing eggs of Ascaris lumbricoides / J.Barrett, C.W. Ward, D. Fairbairn // Сотр. Biochem. And Physiol. 1970. - Vol. 35, № 4. - P. 577585.

73. Beale E.G. 6,02 -dibutyryl cycle AMP and glucose regulate the amount of messenger RNA coding for hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTF) / E.G. Beale, E.G. Hartley, J.L. Granner // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257, № 4. - P. 2022-2028.

74. Beeckmans S. Specific association between the glyoxylic-acid-cycle enzymes isocitrate lyase and malate synthase / S. Beeckmans et. al.. // European Journal of Biochemistry. 1994. - V.224, № 1. - P. 197-201.

75. Benziman M. The activation of the NAD-Malic dehydrogenase from Acetobacter xylinum bi monovalent anions / M.Benziman, Y.Karnrely // European Journal Biochemistry. 1968. - Vol. 51, № 1. - P. 134-138.

76. Bjork A. Stabilisation of a tetrameric malate dehydrogenase by introduction of a disulfide bridge at the dimmer-dimer interface / A. Bjork et. al.. // J. Mol. Biol. 2003a. - V. 334, № 4. - P. 811-821.

77. Bjork A. Large improvement in the thermal stability of a tetrameric malate dehydrogenase by single point mutations at the dimer-dimer interface / A. Bjork et. al. // Mol. Biol. 2004. - V.341. - P. 1215-1226.

78. Burchell A. Identification and purification of a liver microsomal glucose6-phosphatase / A. Burchell, B. Burchell // Biochem. J. 1982. - Vol. 205, №3.-P. 567-573.

79. Caravelli A.H. Reduction of hexavalent chromium by Sphaerotilus natans a filamentous micro-organism present in activated sludges / A.H. Caravelli, L. Giannuzzi, N.E. Zaritsky // J Hazard Mater. 2008. - V.156, № 1-3. - P. 214-222.

80. Chan M. Functional characterization of an alternative lactate dehydrogenase-like. malate dehydrogenase in Plasmodium falciparum / M. Chan, Sim T.S. // Parasitol. Res. 2004. - V. 92, № 1. - P. 43-47.

81. Chang H.C. Metal ions stabilize a dimeric molten globule state between the open and closed forms of malic enzyme / H.C. Chang et.al. // Biophys J. -2007. V. 93, № 11. - P. 3977-3988.

82. Chen J. Amide hydrogen exchange shows that malate dehydrogenase is a folded monomer at pH 5 / J.Chen, D.L.Smith // Protein Sci. 2001. - Y.10, N 5. -P. 1079-1083.

83. Cioni M. Comparative biochemistry of glyoxylate cycle / M. Cioni, G. Pinzauti, P. Vanni // Сотр. Biochem. and Physiol. 1981. - Vol. 70, № 1. - P. 126.

84. Cold-active enzymes studied by comparative molecular dynamics simulation / V. Spiwok et.al. // О Mol Model. 2007. - V. 13, № 4. - P. 485497.

85. Courtois-Verniquet F. Lack of aconitase in glyoxysomes and peroxisomes / F. Courtois-Verniquet, R. Douce // Biochem. J. 1993. - № 294. - P. 103-107.

86. Cox B. Organelle and translocatable forms of glyoxysomal malate dehydrogenase. The effect of the N-terminal presequence / Cox B. et.al. // FEBS Journal. 2005. - V. 272, № 3. - P. 643-654.

87. Davis W.L. Cytochemical localization of malate synthase in amphibian fat body adipocytes: possible glyoxylate cycle in a vertebrate / W.L. Davis, R.G.

88. Jones, D.B. Goodman // J. Histochem. Cytochem. 1986. - Vol. 34, № 5. - P. 689-692.

89. Davis W.L. Glyoxylate cycle in the rat liver: effect of vitamin D3-treatment / W.L. Davis, J.L. Matthews, D.B. Goodman // FASEB J. 1989. -Vol. 3.-P. 1651-1655.

90. Davis W.L. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue / W.L. Davis, D.B. Goodman, L.A. Crawford // Biochim Biophys Acta. 1990. - Vol.1051, № 3. - P. 276-278.

91. Davis W.L. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver / W.L. Davis, D.B. Goodman // Source Anatomikal Record. 1992. - Vol. 234, № 4. -P. 461-468.

92. De Duve C. Peroxisomes (microbodies and related particles) / C. De Duve, P. Baudhuim // Physiol. Rev. 1966. - Vol.46, № 2. - P. 323-357.

93. Eprintzev A.T. Succinate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana is regulated by light via phytochrome A / A.T. Eprintzev et. al.. // FEBS Letters. 2010. -C. 199-202.

94. Fukuchi S. Protein surface amino acid compositions distinctively differ between thermophilic and mesophilic bacteria / S. Fukuchi, K. Nishikawa // J. Mol. Biol. 2001. - V. 309, № 4. - P. 835-843.

95. Genda T. Purification and characterization of malate dehydrogenase from Corinebacterium glutamicum / T. Genda, T. Nakamatsu, H. Ozaki // J. of Bioscience and Bioengineering. 2003. - V. 95, № 6. - P. 562-566.

96. Gerhardt B. Microbodies. Peroxisomen pflanzlicher Zeilen. / B. Gerhardt // Cell Biology Monographs. Wien, 1978, vol. 5.

97. Glusker J.P. Aconitase / J.P. Glusker, S.S. Badour, S.R. Waygood // Enzymes. New York-London. 1971. -V. 5. - P. 413-439.

98. Goodman D.B. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: possible stimulation by aldosterone / D.B. Goodman, W.L. Dawis, R.G. Jones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol. 77, № 3. - P. 1521-1525.

99. Holmes R.P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrionic chick liver / R.P. Holmes // Biochim. Biophys. Acta. 1993. - Vol. 1158.- P. 47-51.

100. Iannetta P.P. Identification, cloning and expression analysis of strawberry (Fragaria xananassa) mitochondrial citrate synthase and mitochondrial malate dehydrogenase / P.P. Iannetta et. al. // Physiol. Plant. 2004. - V. 121, № l.-P. 15-26.

101. Iyer S.L. Regulation of glucose 6-phosphatase in hepatic microsomes by thyroid and corticosteroid hormones / S.L. Iyer, A.C. Liu, C.C. Widnell // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - Vol .223, № l.-P. 173-184.

102. Iynedjian P.B. Effect of glucagon, dexamethasone and triiodthyromine on phosphoenolpyruvate carboxikinase (GTP) synthesis and m RNA level in rat liver cells / P.B. Iynedjian, A. Salavert // Europ. J. Biochem. 1984. - Vol. 145, № 3. - P. 489-497.

103. Jaenicke R. Stability and folding of ultrastable proteins: eye lens crystallins and enzymes from thermophiles / R. Jaenicke // FASEB J. -1996b. V. 10, № l.-P. 84-92.

104. Jane A.I. Characterizatin of alanine and malate dehydrogenases from a marine psychrophile strain PA-43 / A.I. Jane et.al. // Extermiphiles. 2001. - V. 5, №3. -P.199-211.

105. Jones J.D. The glyoxylate cycle: does it function in the dormant or active bear? / J.D. Jones, P. Burnett, P. Zollman // Сотр. Biochem. Physiol. B. -1999.-Vol. 124.-P. 177-179.

106. Jones C.T. Is there a gloxylate cycle in the liver of the fetal guinea pig? / C.T. Jones // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. - Vol. 95. - P. 849-856.

107. Kampfer P., Spring S. Genus Intertas Sedis XVI. Sphaerotilus Kiitzing 1833 // Bergie's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. // Eds: Brenner D.Y., Krieg N.R., Garrity G.M. New York: Springer. 2005. - V.2., Part C. - P. 750755.

108. Klinov D. High-resolution atomic force microscopy of duplex and triplex DNA moleculs / D. Klinov // Nanotechnology. 2007. - V. 18, № 22. - P. 225102.

109. Kondrashova M.N. Interaction of transamination and oxidation processes / M.N. Kondrashova // Biochemistry (Mosc) 1991, Vol.56. - P. 388405.

110. Komberg H.L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H.L. Kornberg, H.A. Krebs // Nature. 1957. -Vol.179.-P. 988-991.

111. Kumar S. Close-range electrostatic interactions in proteins / S. Kumar, R. Nussinov // Chembiochem. 2002. - V.3, № 7. - P. 604-617.

112. Labrou N.E. L-Malate dehydrogenase from Pseudomonas stutzeri: purification and characterization / N.E.Labrou, Y.D.Clonis // Arch. Biochem.Biophys. -1997. Vol. 337, № 1. - P. 103-114.

113. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmly // Nature. 1970. - Vol. 77, № 4. - P. 680-683.

114. Lang-Unnasch N. Purification and properties of Plasmodium falciparum malate dehydrogenase / N. Lang-Unnasch // Mol. Biochem. Parasitol. 1992. - V. 50, № l.-P. 17-25.

115. Lazarow P.B. Biogenesis of peroxisomes / P.B. Lazarow, J. Fujiki // Ann. Rev. Cell. Biol. 1985. - Vol. 1. - P. 489-530.

116. Liu F. Bifunctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegans: a developmentally regulated protein of intestine and muscle / F. Liu, J.D. Thatcher, J.M. Barral //Dev. Biol. 1995. - Vol.169. - P. 399-414.

117. Liu F. Induction of glyoxylate cycle expression in Caenorhabditis elegans: a fasting response throughout larval development / F. Liu, J.D. Thatcher, and H.F. Epstein // Biochemistry. 1997. - Vol. 36. - P. 255-260.

118. Lowry O.H. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry et. al. // J. Biologi. 1951. - Vol.193. - P. 265-275.

119. Madern D. Molecular evolution within the L-malate and L-lactate dehydrogenase super-family / D. Madern // Journal of Molecular Evolution.2002. V.54, №6. - P. 0825-0840.

120. Madern D. Molecular adaptation: the malate dehydrogenase from the extreme halophilic bacterium Salinibacter rubber behaves like a non-halophilic protein / D. Madern, G. Zaccai // Biochimie. 2004. - V. 86, № 4-5. - P. 295-303.

121. Malick A.W. Effect of lipids on enzymatic activity of pig heart mitichondrial malate dehydrogenase monomolecular films / A.W. Malick, N.D. Weiner//J. Pharm. Science. 1977.-V. 66, № 10.-P. 1465-1469.

122. Markina V.L. The effect of modification of lactate and malate dehydrogenases on their stability and activity / V.L. Markina, A.N. Eremin, D.I. Metelitsa // Biophis. 1990. - V. 35, № 1. - P. 30-35.

123. Martinez N. Measuring phase shifts and energy dissipation with amplitude modulation atomic force microscopy / N.F.' Martinez, R. Garcia // Nanotechnology. -2006. V.17. - P. 167-172.

124. Matthews B.W. Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding / B.W. Matthews, H. Nicholson, W.J. Becktel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84, № 19. - P. 6663-6667.

125. Moor R.E. The development and application of a radioimmunoassay for rat phosphoenolpyruvate carboxikinase / R.E. Moor et. al. // J. Biol. Chem. -1983. Vol.257, № 21. - P. 12546-12552.

126. Mottram J.C. Purification of particulate malate dehydrogenase and phosphoenolpyruvate carboxykinase from Leishmania mexicana / J.C. Mottram, G.H. Coombs // Biochem. Biophys. Acta. 1985. - V. 827, № 2. - P. 310-319.

127. Murray R. Horpers Biochemistry / R. Murray, D. Granner, P. Mayes. -Lange medical book, 1998. 720 p.

128. Nesterenko M.V. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels / M.V. Nesterenko, M. Tilley, S.J. Upton // J. Biochem. Biol. 1994. - Vol.28. - P. 239242.

129. Nicholson H. Enhanced protein thermostability from designed mutations that interact with aipha-helix dipoles / H. Nicholson, W.J. Becktel, B.W. Matthews //Nature. 1988. - V. 336, № 6200. - P. 651-656.

130. Popov V.N. Induction of glyoxylate cycle enzymes in rat liver upon food starvation / V.N. Popov, A.U. Igamberdiev, C. Schnarrenberger // FEBS Lett. -1996. Vol. 390. - P. 258-260.

131. Popov V.N. Glyoxylate cycle enzymes are present in liver peroxisomes of alloxan-treated rats / V.N. Popov, S.V. Volvenkin, A.T. Eprintsev // FEBS Lett.- 1998.-Vol. 440.-P. 55-58.

132. Qian Т. Formation and characterization of protein patterns on the surfaces with different properties / T. Qian et. al.. // Synthetic Metals. 2004. -V. 147.-P. 247-252

133. Reawen G.M. Role of insulin resistance in human disease / G.M. Reaven //Diabetes.- 1988.-Vol. 37, № 12.-P. 1595-1607.

134. Stumvoll M. Renal glucose production and utilization: new aspects in humans / M. Stumvoll et. al. // Diabetologia. 1997. - Vol.40, № 7. - P. 749-757.

135. Reshef L. The interaction of catecholamines and adrenal corticostroides in the induction of phosphoenolpyruvate carboxikinase in rat liver and adipose tissue / L. Reshef, R.W. Hanson // Biochem. J. 1972. - Vol. 127, № 5.- P. 809-818.

136. Rest M.E. Functions of the membrane associated and cytoplasmic malate dehydrogenase in the citric acid cycle of Escherichia coli / M.E.Rest, C.Frank, D.Molenaar // J. Bacteriol. - 2000. - Vol.182, № 24. - P. 6892-6899.

137. Rubin H. Subcellular localization of glyoxylate cycle enzymes in Ascaris suum larvae / H. Rubin, R.N. Trelease // J. Cell. Biol. 1976. - Vol.70. -P. 374-383.

138. Schnarrenberger C. Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyoxylate cycle of higher plants. A case study of endosymbiotic gene transfer / C. Schnarrenberger, W. Martin // Eur. J. Biochem. FEBS. 2002. - V. 269. - P. 868-883.

139. Song S. Can the glyoxylate pathway contributes to fat-indused hepatic insulin resistance? / S. Song // Med. Hypotheses. 2000. - Vol.54. - P. 739-747.

140. Steffan J.S. Isolation and characterization of the yeast gene encoding the MDH-3 isoenzyme of malate dehydrogenase / J.S. Steffan, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267, №34. - P. 24708-24715.

141. Vessal M. Partial purification and kinetic properties of cytoplasmic malate dehydrogenase from ovine liver Echinococcus granulosus protoscolices /

142. M.Vessal, S.M.Tabei // Comp.Biochem.Physiol. B.Biochem.Mol. Biol. 1996. -Vol.113, №4.-P. 757-763.

143. Uttaro A.D. Characterization of the two malate dehydrogenase from Phytomonas sp. Purification of the glicosomal isoenzyme / A.D.Uttaro, F.R.Opperdoes // Mol. Biochem. Parasitol. 1997. - Vol.89, № 1. - P. 51-59.

144. Yennaco L.J. Charactrerisation of malate dehydrogenase from the hypertermophilic archaeon Pyrobaculum islandicum / L.J. Yennaco, Y. Hu, J.F. Holden // Extermophiles. 2007. - V.l 1, № 5. - P. 741-746.