Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические особенности адаптации крыс при аллоксановом диабете

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические особенности адаптации крыс при аллоксановом диабете"

На правах рукописи

Гатн Моханнад Абдулраззак Гати

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ КРЫС ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

Специальность 03.01.04 - Биохимия 03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005537922

Воронеж-2013

005537922

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Еприицев Александр Трофимович доктор биологических наук, доцент Вашаиов Геннадий Афанасьевич

Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна

доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, кафедра биофизики и биотехнологии, профессор

Дорохов Евгений Владимирович

кандидат медицинских наук, доцент, Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко, кафедра нормальной физиологии, заведующий

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Орловский государственный

аграрный университет»

Защита состоится 6 декабря 2013 года на заседании диссертационного совета в 14 час. 30 мин. при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд.59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и сайте ФГБОУ ВПО «ВГУ»: www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан «£.» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

^ Грабович М.Ю.

Актуальность проблемы. Адаптация животного организма к аллоксановому экспериментальному диабету представляет сложный многоэтапный процесс, главным звеном которого является трансформация клеточного метаболизма. Индукция ферментов глиоксилатного цикла и цикла трикарбоновых кислот в тканях животных обеспечивает изменение основных путей метаболизма, обусловленных ресинтезом гликогена в печени крыс при патологиях, связанных с условиями пищевой депривации и экспериментального диабета [Епринцев А.Т. и др. 2007, Popov V.N. et al., 1998]. Ранее была установлена индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла в гепатоцитах крыс при аллоксановом диабете [Popov V.N. et al., 1996]. Кроме того, что глюконеогенез выступает как важнейший процесс при адаптивной реакции организма к экстремальным условиям, важную роль играет энергетический обмен, связанный, главным образом, с функционированием цикла Кребса. Следовательно, адаптация клеточного метаболизма обеспечивается соотношением интенсивности катаболизма и анаболизма глюкозы в клетках печени и других органов животного организма. Несмотря на значительное количество исследований об интенсивности ферментативной активности, обуславливающей скорость энергетического и синтетического процессов, остаются невыясненными многие факторы регуляции, такие как концентрация метаболитов, воздействие гормонов и другие [Попов В.Н. и др., 2005].

В литературе широко представлены работы об особенностях клинико-биохимических показателей при сахарном диабете. Данные морфологических исследований немногочисленны и зачастую разноплановы. В последнее время большое внимание исследователей направлено на изучение состояния нейроэндокринных центров и выяснение их участия в регуляции функций панкреатических островков [Жураковская О.Я., 2013, Revsin Y. et al., 2008].

Особый интерес вызывает молекулярный уровень регуляции ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла, связанный с экспрессионной регуляцией ферментов. Ранее было показано наличие двух изоформ аконитатгидратазы, малатдегидрогеназы. Однако исследований по генетической детерминации изоферментного полиморфизма этих и других ферментных систем в животных организмах в условиях экспериментального диабета нами не обнаружено. В связи с этим необходимо проведение анализа функционирования интенсивности экспрессии генов энзимов, участвующих с помощью изоферментов в обеспечении протекания как

энергетического обмена, так и процессов, обуславливающих синтетическую функцию метаболизма.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось комплексное исследование физиолого-биохимических особенностей адаптации крыс при аллоксановом диабете, включающее изучение экспрессионной регуляции ферментов сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, обеспечивающих трансформацию метаболических процессов, и выяснение изменений

гистологического характера во внутренних органах крыс в условиях аллоксанового диабета.

В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Индуцировать с помощью аллоксана экспериментальный диабет у крыс и провести изучение физиолого-биохимических критериев, подтверждающих возникновение данной патологии у экспериментальных животных.

2. Осуществить гистологические исследования печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.

3. Исследовать гистологические изменения клеток поджелудочной железы крыс в условиях экспериментального диабета.

4. Выяснить изменение активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в печени, поджелудочной железе и почках крыс, подвергшихся воздействию экспериментального диабета.

5. Установить субклеточную локализацию сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, активность которых меняется в тканях разных органов крыс при аллоксановом диабете.

6. Определить уровень экспрессии генов малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.

7. Исследовать роль метилирования в регуляции биосинтеза ферментов ЦТК и ГЦ в норме и при аллоксановом диабете.

8. Разработать гипотетическую схему адаптации крыс к экспериментальному диабету на морфо-физиологическом, биохимическом и экспрессионном уровнях.

Научная новизна. Полученные результаты позволяют расширить и углубить имеющиеся представления о способах адаптации животных на физиологическом, биохимическом и экспрессионном уровнях. Установлено, что при экспериментальном диабете, моделируемом с помощью экзогенного аллоксана, в печени и поджелудочной железе крыс наблюдаются изменения морфологических признаков, связанных со значительными отклонениями от контрольных образцов по составу, физическим индексам и размерам.

При экспериментальном диабете наблюдается активация исследуемых ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути в печени, почках и поджелудочной железе крыс, обусловленная увеличением митохондриальных форм малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, что, вероятно, связано с более высокой скоростью работы ЦТК. Показано, что индукция ферментов обусловлена синтезом de novo, так как наблюдается повышение интенсивности транскрипции их генов при адаптации к аллоксановому диабету.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы позволяют разработать комплексный механизм адаптации животных к аллоксановому диабету на физиолого-биохимическом уровне. Результаты анализа экспрессионной регуляции сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени, поджелудочной железе и почках крыс могут служить основой для разработки тестов для идентификации патологических отклонений в организме при экспериментальном диабете.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, физиологии человека и животных, спецкурсах по энзимологии, адаптационным механизмам животных. Кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментальный диабет индуцировал в паренхиме печени животных признаки токсического гепатита в виде нарушения балочной структуры долек, некроза гепатоцитов жировой и белковой дистрофии. Цитотоксическое действие аллоксана и инсулиновая недостаточность приводили к патоморфологическим изменениям в островковой части поджелудочной железы, носящим выраженный деструктивный характер. При этом токсическому воздействию в наибольшей степени подвергались Р-клетки и компоненты микроциркуляторного русла.

2. Аллоксановый диабет индуцирует активность ферментов, осуществляющих функционирование цикла Кребса в печени, почках и поджелудочной железе. Увеличение активности СДГ (маркерного фермента ЦТК) и митохондриальных изоформ МДГ и АГ свидетельствует об интенсификации катаболических процессов, повышающих энергетический потенциал клетки, что необходимо для осуществления адаптивной реакции.

3. Увеличение активности сукцинатдегидрогеназы, аконитатгидратазы и малатдегидрогеназы в условиях аллоксанового диабета осуществляется по механизму синтеза de novo. На это указывают результаты исследования уровней экспрессии генов sdha, mdh jntx и асо.

4. В печени, почках и поджелудочной железе крыс в условиях аллоксанового диабета резко повышается активность цитоплазматических форм АГ и МДГ, а также маркерных ферментов глиоксилатного цикла ИЦЛ и MC. При этом выявлено увеличение уровня транскрипции генов исследуемых ферментов, что свидетельствует об интенсификации их экспрессии в исследованных внутренних органах опытных животных.

5. Предлагается гипотетическая схема действия аллоксанового диабета на функционирование ключевых ферментов ЦТК и ГЦ во внутренних органах крыс. Увеличение количества глюкозы активирует с помощью глюкозо-сигнальных соединений фактор транскрипции ChREBP (углевод-реагирующий элемент связывающий белок), обуславливающий контроль процессов экспрессии исследуемых генов метаболитами глюкозы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на международной юбилейной научно-практической конференции ВЭПИ-ВГЛТА (Воронеж, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Системная организация физиологических функций», посвященной 90-летию со дня основания кафедры физиологии человека и животных Воронежского государственного университета (Воронеж, 2012); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2011, 2012, 2013).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 9 статьях и 3 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (199 источник). Иллюстрационный материал включает 6 таблиц и 28 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. В качестве объектов исследования служили самцы лабораторных крыс (Rattus rattus L.) массой 200-250 гр., выращенные в виварии при стандартном рационе. Индукцию диабета у исследуемых животных вызывали введением внутрибрюшинно 5% раствора аллоксана из расчета 100мг на кг веса животного в 0,9% растворе NaCI. Контрольные животные выращивались при

обычном пищевом режиме, без введения аллоксана.

Получение материала для исследования. Для получения ткани печени, почек и поджелудочной железы опытных животных подвергали краниоцервикальной дислокации под эфирным наркозом.

Определение содержания глюкозы в крови. Определение глюкозы производили стандартным глюкозооксидазным методом с помощью глюкометра "Сателлит плюс" (Россия).

Определение содержания гликогена. Содержание гликогена определяли «прямым» методом [Северин С.Е. и др., 1998]. Количество глюкозы (калибровочный график строится по глюкозе) умножали на коэффициент 0,9.

Определение активности ферментов. Определение активности ферментов проводили при 25°С с помощью спектрофотометрических методов [Пинейру де Корвалью М.А.А. и др., 1991, Епринцев А.Т. и др., 2005, Kornberg H. L. et al., 1957].

Выделение митохондрий из органов крыс. Навеску материала осторожно гомогенизировали в соотношении 1:5 со средой выделения, после чего полученную фракцию митохондрий выделяли дифференциальным центрифугированием.

Определение перекрестного загрязнения фракций. Активность алкогольдегидрогеназы определяли спектрофотометрически при 340 нм [Pathuri I.P. et al., 2011]. Активность лактатдегидрогеназы определяли при помощи оптического теста Варбурга [Yang X. et al., 2010].

Выделение суммарной клеточной популяции РНК. Для выделения суммарной клеточной РНК использовался метод фенол-хлороформной экстракции с использованием в качестве осадителя LiCl [Chomczynski P. et al., 1987].

Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы. Для визуализации и анализа качества выделенной РНК использовался электрофорез в 1% агарозном геле.

Обратная транскрипция. Обратная транскрипция РНК осуществлялась с использованием обратной транскриптазы вируса Moloney лейкоза мышей М-MULVRT (Fermentas, Литва) для синтеза первой цепи кДНК согласно рекомендациям производителя.

Проведение обратнотранскриптазной полимеразной реакции. Полимеразную цепную реакцию генспецифичными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия) на приборе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия), и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия.

Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green. Параметры

амплификации: предварительная денатурация 95 °С - 5 мин., затем цикл: 95 "С - 20 сек., 58 °С - 30 сек., 72 °С - 40 сек., финальная элонгация - 72 °С - 10 мин.

Выделение геномной ДНК из печени крыс. Геномную ДНК выделяли из 0,2 г. печени с помощью коммерческого набора ДНК-сорб 100 (ВГУП НИИ Эпидемиологии, Россия) согласно инструкции производителя.

Метилчувствительная рестрикция. Для рестрикции ДНК клеток печени крыс использовали эндонуклеазу BisI («SibEnzyme Ltd», РФ) согласно рекомендациям производителя.

Методика гистологических исследований. Фиксацию материала осуществляли по методике, предложенной Волковой [Волкова О.В., 1971]. Образцы уплотняли для последующей работы на микротоме. Образцы обезвоживали путем погружения на 24 часа в растворы спиртов разных концентраций [Кисели Д., 1962]. Заливку проводили инкубацией образцов в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56°С. Срезы приготавливали при помощи микротома 4/MedGV (Micros, ФРГ) [Лавдовский М.Д., 1988]

Перед окрашиванием образцы освобождали от парафина, используя систему растворителей: ксилол, спирт. Окраску препарата проводили с применением гематоксилин-эозина по ранее разработанной методике [Лили Р., 1969].

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3-4 кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. На рисунках приводятся данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из трех измерений. Полученные данные обрабатывали с использованием статистических критериев [Лакин Г.Ф., 1990].

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ, СВИДЕТЕЛЬСТВУЮЩИЕ ОБ ИНДУКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО

ДИАБЕТА

Динамика изменения содержания глюкозы и гликогена в крови крыс в норме и при диабете. Введение аллоксана подопытным животным способствовало увеличению концентрации глюкозы в крови до 15,8 ммоль/л через 10 дней после инъекции. Проведение данных анализов в динамике в течение 21 дня позволило выявить определенные закономерности. Максимальное значение этого показателя в крови опытных крыс достигало 17,31 ммоль/л. Высокий уровень содержания глюкозы был характерен в течение двух недель, причем резкое увеличение этого показателя наблюдали, начиная с седьмого дня эксперимента. Одновременно проводились анализы количественного содержания гликогена в печени контрольных и опытных животных. Анализ полученных данных (табл. 1) свидетельствует, что в течение трехнедельного эксперимента концентрация этого важнейшего запасного

полисахарида изменялась в пределах от 2,98 до 3,56 мкЕ/мл в контрольных животных. Динамика изменения гликогена в экспериментальных образцах носила иной характер. Количество этого вещества в течение всего опыта уменьшалось, и на 21 день составило 0,075 мкЕ/мл. Т.е., при экспериментальном диабете происходила мобилизация эндогенных Сахаров, представленных гликогеном.

Таблица 1.

Уровень глюкозы в крови и гликогена в печени у крыс в норме и в условиях

экспериментального диабета (п = 5, р < 0,05)

День Вариант Глюкоза ммоль/л Гликоген мкЕ/мл

0 Контрольная группа животных 4,71 ±0,09 2,98 ±0,12

Животные с диабетом 4,66 ±0,1 3,11 ±0,09

7 Контрольная группа животных 5,84 ±0,12 3,18 ± 0,14

Животные с диабетом 11,92 ±0,13 0,72 ± 0,8

14 Контрольная группа животных 7,68 ±0,11 3,44 ±0,11

Животные с диабетом 15,89 ± 0,14 0,18 ±0,03

21 Контрольная группа животных 7,44 ±0,11 3,56 ±0,15

Животные с диабетом 17,31 ±0,14 0,075 ± 0,004

Изменение массы животных, их печени и почек в норме и при диабете

Анализ полученных данных позволяет выявить определенные тенденции в изменении исследуемых показателей. Так, масса тела в контрольных животных увеличивалась в течение всего эксперимента. Ее колебания составляли от 197 г в первый день до 217 г на 21 день. Следовательно, крысы контрольной группы увеличивали свою массу в течение всего опыта на 11,3%. Противоположная картина обнаружена для данного показателя в экспериментальной группе животных. Динамика изменения массы печени и почек не являлась одинаковой для этих органов. Масса печени, составлявшая 6,49 г в начале опыта у контрольных животных, достигала величины 6,7 г. У экспериментальных животных после введения экзогенного аллоксана масса этого органа уменьшилась с 6,35 г до 4,83 г через 21 день экспозиции, что означало 24%-ное снижение массы печени.

Анализ полученных результатов по изменению массы тела и внутренних органов крыс позволяет предположить, что выявленные эффекты связаны с действием экспериментального диабета.

Индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла

Исследование активности маркерных ферментов глиоксилатного цикла ИЦЛ и МС в печени, почках и поджелудочной железе показало наличие активности этих энзимов только в органах крыс, подвергшихся воздействию аллоксанового диабета.

В печени контрольных крыс активность изоцитратлиазы и малатсинтазы отсутствовала, однако, у крыс с экспериментальным диабетом наблюдалась индукция активности этих ферментов. В поджелудочной железе активность изоцитратлиазы отсутствовала у опытных и контрольных животных. Малатсинтазная активность равнялась нулю в поджелудочной железе контрольных крыс, и обнаруживалась незначительная активность в этом органе экспериментальных животных. Полученные данные четко показывают, что появление активности маркерных ферментов должно сопровождаться индукцией глиоксилатного цикла в печени и почках экспериментальных крыс.

РЕЗУЛЬТАТЫ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПЕЧЕНИ И ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У КРЫС ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ Морфологическая организация и гистологические особенности печени крыс при аллоксановом диабете. Печень животных интактной группы темно-красного цвета, гладкая, эластичной консистенции, с долями правильной формы, заостренными висцеральными краями. В микрогистопрепаратах печени животных дольки полигональной формы, четко структурированы, расположены в центре, хорошо видны ядрышки, величины и число которых сильно варьирует. Цитоплазма гомогенна, с большим содержанием РНК в виде базофильных гранул. На периферии печеночных долек нередко встречались клетки с гигантскими ядрами. В пограничной области дольки хорошо различимы междольковые выводные желчные протоки, которые вместе с разветвлениями воротной вены и печеночной артерии образуют между печеночными дольками триады (рис. 1).

Рис. 1. Фрагмент печеночной дольки животных интактной группы (А) и с аллоксановым диабетом (Б). Окраска гематоксилином-эозином; об. х10.

Анализ данных гистологических исследований образцов печени крыс экспериментальной группы свидетельствовал о том, что применение аллоксана вызывало индукцию сахарного диабета, проявляющегося в изменении морфологических особенностей тканей исследуемого органа. Данные изменения

А)

Б)

характеризовались значительными отклонениями от контрольных образцов по составу и физическим характеристикам, а также и размеру.

В целом, при экспериментальном аллоксановом диабете в паренхиме печени исследуемых животных прослеживались выраженные признаки токсического гепатита в виде нарушения балочной структуры долек, некроза гепатоцитов, жировой и белковой дистрофии, наличия инфильтратов из скоплений гематогенных клеток.

Морфологическая организация и гистологические особенности поджелудочной железы крыс при аллоксановом диабете. Морфологические изменения в ткани поджелудочной железы крыс после введения аллоксана характеризовались наиболее выраженными дегенеративными изменениями в центральных отделах островков Лангерганса (рис. 2). Число и размер островков уменьшены, форма их неправильная. Количество |5-клеток в островках резко снижено, в большинстве из них отмечалась вакуолизация цитоплазмы, уменьшение размеров ядер, конденсация хроматина, в некоторых клетках - кариопикноз. Выявлено наличие лимфоцитарного инфильтрата по периферии части островков, отека междольковой соединительной ткани, полнокровие капилляров; в сосудах прослеживались стазы.

А) Б)

Г.»

♦ ' г***«» ■ ♦ ■ ш

■ . \

. • ' М

Рис. 2. Островковый аппарат поджелудочной железы крысы интактной группы (А) и после введения аллоксана (Б). Окраска гематоксилином-эозином; об.х20.

Таким образом, цитотоксическое воздействие аллоксана и инсулиновая недостаточность вызывали патоморфологические изменения в островковой части поджелудочной железы, носящие выраженный деструктивный характер, причем токсическому воздействию в наибольшей степени подвергались (3-клетки и компоненты микроциркуляторного русла.

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ ЦИКЛА КРЕБСА И ГЛИОКСИЛАТНОГО ПУТИ В ПЕЧЕНИ КРЫС

Результаты исследования показали, что в печени крыс с аллоксановым диабетом наблюдается активация маркерного фермента ЦТК

сукцинатдегидрогеназы, активность которого увеличилась у опытных животных в 1,77 раза (рис. 3). Увеличение активности сукцинатдегидрогеназы в печени крыс свидетельствует об интенсификации функционирования цикла Кребса в условиях аллоксанового диабета, что, по-видимому, необходимо для энергизации клеточного дыхания и усиления поставок энергетических эквивалентов АТФ, НАДН для адаптации клеточного метаболизма в гепатоцитах.

0,06-

5 0.05

ю

3 0,04

Ш

£- 0,03 1 0,02

| 0,01 ■ <

о

Рис. 3. Активность

сукцинатдегидрогеназы в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете. К - контрольные животные, О - животные с аплоксановым диабетом.

Активность цитоплазматической формы МДГ в образцах опытных животных составляет 9.38 Е/мг белка, а в контрольных - 4.36 Е/мг белка. Однако, иная картина наблюдалась при анализе изменения активности митохондриальной формы малатдегидрогеназы. У крыс в условиях аллоксанового диабета обнаружено резкое увеличение скорости функционирования МДГ в 3,96 раза относительно контрольного варианта (рис. 4). Такой характер изменения интенсивности работы разных изозимов малатдегидрогеназной системы свидетельствует об интенсификации митохондриальных процессов, в частности цикла Кребса, обуславливающего эффективность функционирования дыхательного процесса.

12 ■ ю 8 64 • 2 0

Рис. 4. Активность

цитоплазматической (белые столбцы) и митохондриальной (черные столбцы) формы малатдегидрогеназы в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете. К - контрольные животные, О - животные с аплоксановым диабетом.

К О

В наших исследованиях было показано, что активность цитоплазматической АГ в опытных образцах по сравнению с контролем уменьшилась в 3,8 раза. Что касается митохондриальной формы, то здесь наблюдается увеличение активности в 3 раза относительно контрольного варианта (рис. 5). В гепатоцитах доминируют реакции синтетического или конструктивного характера, в частности,

глгоконеогенез, одним из этапов которого является ГЦ. Именно в протекании данного пути принимает участие аконитатгидратаза. 3,5-

Рис. 5. Активность цитоплазматической (белые столбцы) и

митохондриальной (черные столбцы) формы

аконитатгидратазы в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете. К - контрольные животные, О - животные с К О аллоксановым диабетом.

Изменение активности ферментов в клетке может происходить несколькими

путями, либо путем модуляции скорости функционирования имеющихся энзимов,

либо изменением скорости синтеза новых молекул. С целью выяснения роли

экспрессионной регуляции активности ключевых ферментов цикла Кребса, нами

проведено исследование уровня транскрипции генов исследуемых ферментов в

печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.

Изменение активности ферментов ЦТК и ГЦ в почках

Полученные данные свидетельствуют о резком изменении

ферментативной активности маркерного энзима митохондрий в

экспериментальных животных.

2 0,05 с

ю 0,04 £

ш 0,03 ■

5 0,02 ■

о

| 0,01 ■ V-

< о

уровня группе

Рис. 6. Активность

сукцинатдегидрогеназы в

почках крыс в условиях экспериментального диабета. К - контрольные животные, О - животные с аллоксановым диабетом.

К О

Уровень активности сукцинатдегидрогеназы в условиях воздействия аллоксана увеличивался в несколько раз. Так, активность фермента в контрольных животных составляла 0,02 Е/мг белка, а в опытных образцах ее величина возрастала до 0,04 Е/мг белка, то есть прирост составлял более двух раз (рис. 6).

Характер изменения малатдегидрогеназы в почках крыс был более сложным и неоднозначным из-за сложной внутриклеточной локализации. Как видно из приведенных на рисунке 7 результатов, наблюдалась определенная стабильность малатдегидрогеназной активности в митохондриальной фракции по сравнению с цитоплазматической.

А)

Б)

0,35

СО

С 0,3 -|

ч>

? 0,25

а 0,2

5 0,15

0

1 0,1

| 0,05

о

" 0,6 -,

I 0,5

! 0,4 ■ ш

л" 0,3 ■

ё 0,2 -

I 0,1 ■ < 0

Рис. 7. Активность цитоплазматической (белые столбцы) и митохондриальной (серые столбцы) форм малатдегидрогеназы (А) и аконитатгидратазы (Б) в почках крыс. К - контрольные животные, О - животные с аллоксановым диабетом.

В условиях аллоксанового диабета цитоплазматическая фракция характеризуется резким скачком активности аконитатгидратазы в почках крыс. Так, активность АГ, составлявшая 0,1 Е/мг белка в почках контрольных животных, возрастала до 0,45 Е/мг белка у экспериментальных крыс.

Активность ключевых ферментов ЦТК и ГЦ в поджелудочной железе Изменение активности сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в поджелудочной железе опытных и контрольных животных приведено в виде рисунков 8, 9. Уровень активности сукцинатдегидрогеназы в исследуемом органе нормальных крыс составлял 0,4 Е/мг белка. В экспериментальных животных поджелудочная железа имела невысокий уровень активности СДГ равный 0,14 Е/мг белка, то есть экспериментальный диабет подавлял функционирование маркерного фермента.

с

ю 0,4

г

Ш 0,3

л

5 0,2

0

1 0,1

Ь

< 0

Рис. 8. Активность

сукцинатдегидрогеназы в

поджелудочной железе. К - контрольные животные, О - животные с аллоксановым диабетом.

К о

Изменение активности малатдегидрогеназы в разных фракциях клеток поджелудочной железы в контроле и опыте имело определенные тенденции. Уровень активности изучаемого фермента в клетках поджелудочной железы крыс, подвергшихся воздействию аллоксанового диабета, был выше по сравнению с опытными животными.

А) Б)

Рис. 9. Активность цитоплазматической (белые столбцы) и митохондриальной (серьге столбцы) форм малатдегидрогеназы (А) и аконитатгидратазы (Б) в поджелудочной железе. К - контрольные животные, О - животные с аллоксановым диабетом.

Уровень активности аконитатгидратазной ферментной системы определяет направление реакций так называемого аконитазного равновесия. Величина аконитазной активности в поджелудочной железе в опытных вариантах возрастала в 2-2,5 раза и составляла значение 0,25 Е/мг белка для цитоплазматической формы и 2,5 Е/мг белка для митохондриального фермента. Следовательно, повышение интенсивности функционирования аконитатгидратазного ферментного комплекса наблюдается как в цитоплазматической фракции, так и в митохондриальной.

Субклеточная локализация ферментов в печени, почках и поджелудочной

железе крыс, находящихся в условиях экспериментального диабета

Применение дифференциального центрифугирования для разделения клеточных фракций позволило получить органоиды с небольшой степенью перекрестного загрязнения. Использование маркерных ферментов лактатдегидрогеназы для идентификации цитоплазмы и фумаратгидратазы для обнаружения митохондрий показало небольшое загрязнение, составляющее от 3 до 8%. Максимальное количество активности сукцинатдегидрогеназы обнаружено было в митохондриальной фракции всех исследованных органов. Небольшие количества ферментативной активности данной энзимной системы в цитоплазматической фракции являлись следствием разрушения небольшого количества митохондрий и переходом сукцинатдегидрогеназы в цитоплазму.

Внутриклеточное распределение малатдегидрогеназы в органах крыс при аллоксановом диабете имело более сложный характер по сравнению с сукцинатдегидрогеназной активностью. В печени большая часть ферментативной активности обнаруживалась в цитоплазматической фракции (более 70%).

Количество малатдегидрогеназы в митохондриях составляло примерно 30% от общей активности энзима в клетке.

Субклеточная локализация аконитатгидратазной активности связана с митохондриальной и цитоплазматической фракциями клеток исследованных органов. Анализ полученных данных показывает, что значительная часть ферментативной активности сосредоточена в цитоплазматической фракции печени. Здесь ее концентрация достигает более 70%. Обращает внимание, что в этом органе наблюдается сильная индукция аконитазы в митохондриях.

Анализ результатов по изменению активности ключевых ферментов и их субклеточной локализации в печени, почках и поджелудочной железе крыс в условиях аллоксанового диабета свидетельствует об их индукции. Изменение активности таких ферментов, как сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа и аконитатгидратаза связано с приспособлением животного организма к патологическим условиям. Появление в клетке исследованных внутренних органов крыс при экспериментальном диабете дополнительных изоформ связано, по-видимому, с существованием определенного биохимического механизма адаптации к изменениям среды, которая обеспечивает большую выживаемость. В частности, повышение уровня активности МДГ и АГ может обуславливать индукцию глиоксилатного цикла, являющегося важнейшим этапом глюконеогенеза.

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ ЦИКЛА КРЕБСА И

ГЛИОКСИЛАТНОГО ПУТИ В ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

Применение гуанидинтиоционата позволило выделить тотальную РНК практически без следов деградации, об этом свидетельствует более высокое содержание в них 28S рРНК, в сравнении с количеством 18S рРНК.

Проведенный ПЦР-анализ кДНК с полученными ген-специфическими праймерами и последующий электрофорез продуктов реакции в 1% агарозном геле показал наличие одной полосы после гель-электрофореза, что свидетельствует об их специфичности [Епринцев А.Т., и др., 2001].

Результаты исследования ПЦР в реальном времени приведены на рисунке 10, из которого видно, что в печени крыс при пищевой депривации концентрация транскрипта исследуемого гена выше этого показателя у контрольных в 2.3 раза, что составляет 1.26 отн. ед. в контрольном образце и 2.91 отн. ед. - в опытном. При исследовании интенсивности транскрипции гена mdh_cyt цитоплазматической формы МДГ установлено, что в контрольном образце данный показатель равняется

3.01 отн. ед., а в опыте - 5.55 отн. ед., что также свидетельствует об интенсификации экспрессии исследуемого гена.

7 6 к

0) о

X

° 4

К

I зн

О. с

* 2 1 О

1

Рис. 10. Экспрессия генов малатдегидрогеназы в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете. К - контрольные животные, О - животные с аллоксановым диабетом.

Расчетные значения относительной концентрации кДНК гена митохондриальной аконитатгидратазы в разных образцах отличаются между собой. Из показателей, приведенных на рисунке 11 А, видно, что в печени крыс с аллоксановым диабетом содержание транскрипта выше данного показателя у контрольных животных в 2.98 раза.

Это свидетельствует о том, что экспрессия генов малатдегидрогеназы и акконитатгидрагазы при наступлении диабета возрастает, что может быть связано с усилением метаболических процессов, катализируемых данными ферментами.

Методом ПЦР в реальном времени показано, что уровень экспрессии гена хЛа сукцинатдегидрогеназы при индукции диабета также увеличивается на 16% (рис. 11 Б).

А) Б)

3,5 3 ■

2.5

1,6

ш

1.2

0,8

0,4

0

Рис. 11. Экспрессия гена аконитатгидратазы (А) и сукцинатдегидрогеназы (Б) в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете. К — контрольные животные, О - животные с аллоксановым диабетом.

Данные по экспрессии генов СДГ, МДГ, АГ свидетельствуют, что при диабете активация ферментов происходит на уровне транскрипции соответствующих генов. В условиях аллоксанового диабета наблюдается изменение транскрипционной

активности ДНК клеток печени, следовательно, увеличивается скорость экспрессии исследуемых генов.

Роль метилирования в регуляции биосинтеза ферментов ЦТК и ГЦ в норме и при аллоксановом диабете

Одним из механизмов, обеспечивающих регуляцию экспрессии генов, является эпигенетический механизм, связанный с перераспределением метальных группировок в рамках одного гена или целого генома. Основными участками ДНК, подвергающимися изменению статуса метилирования, являются промоторы генов [168].

1 2

Рис. 12. Геномная ДНК клеток печени крыс в норме (1) и ДНК после обработки

метилспецифичной рестриктазой Bis 1 (2).

ДНК, полученную из контрольных и экспериментальных образцов с применением набора ДНК-сорб-100, обрабатывали метилчувствительным ферментом рестрикции В1§1, разрезающей нуклеотидную последовательность геномной ДНК в сайте 5'-ОСНОС-3' только при наличии метилированного цитозина во втором положении. Таким образом, статус метилирования для каждого образца влияет на распределение по размеру рестрикционных фрагментов.

Полученные данные о характере метилирования геномной ДНК клеток печени свидетельствуют, что при развитии диабета у крыс не происходит изменения степени метилирования в исследуемых образцах (рис. 12). Данный факт может свидетельствовать о том, что в регуляции уровня экспрессии генов исследуемых ферментов не принимает участие эпигенетический механизм, обусловленный изменением промоторных областей генов энзимов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование в нашем исследовании экзогенного аллоксана, вводимого подкожно крысам, позволило создать модель экспериментального диабета у животных. Индукция диабета наблюдалась в течение трехнедельного эксперимента. У опытных животных было выявлено изменение массы тела и внутренних органов (печени и почек), характерное для данного заболевания. В печени крыс, находящихся в условиях экспериментального диабета, наблюдалась индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. Ранее было показано, что интенсификация глюконеогенетических процессов при

аллоксановом диабете является обязательным элементом адаптивной реакции [Епринцев А.Т., и др., 2007, Popov V.N., et al., 1998]. Проведенные гистологические исследования тканей печени и поджелудочной железы также свидетельствуют о патологических изменениях у экспериментальных крыс. Так, морфологическое состояние печени крыс контрольной группы животных характеризовалось равномерным распределением относительно одинаковых гепатоцитов на протяжении печеночной дольки, структура гепатоцитов и соотношение исследуемых клеток соответствовали классической гистологической характеристике активно функционирующей печени. Гистологическая характеристика эндокринной части поджелудочной железы соответствовала норме. Наибольшее количество островков выявлялось в желудочно-кишечной части. При аллоксановом диабете в паренхиме печени исследуемых животных наблюдались выраженные признаки токсического гепатита в виде нарушений балочной структуры долек, некроза гепатоцитов жировой и белковой дистрофии, наличия инфильтратов и скоплений гематогенных клеток. Цитоскопическое действие аллокс'ана и инсулиновая недостаточность вызывали патоморфологические изменения в островковой части поджелудочной железы, имеющие выраженный деструктивный характер. При этом токсическому воздействию в наибольшей степени подвергались Р-клетки и компоненты микроциркулярного роста.

В нашей работе значительное внимание было уделено выяснению механизмов адаптивной реакции клеточного метаболизма внутренних органов крыс в условиях экспериментального диабета. В патологических условиях перед организмом возникают новые метаболические потребности, для удовлетворения которых необходимы количественные и качественные перестройки ферментных систем клетки. Трансформация активности ряда ключевых ферментов центральных метаболических путей (цикла Кребса, глиоксилатного цикла и др.) у животных при действии аллоксанового диабета, вероятно, связана с процессами мобилизации запасных питательных веществ. После утилизации запасного гликогена наиболее важным ресурсом клетки остаются запасные жиры, р-окисление жирных кислот интенсивно протекает как в митохондриях, так и в пероксисомах гепатоцитов [Епринцев А.Т., и др., 2005, Епринцев А.Т., и др., 2007].

Анализ полученных результатов свидетельствует, что аллоксановый диабет вызывает увеличение активности энзимов, осуществляющих функционирование цикла трикарбоновых кислот в печени, почках и поджелудочной железе. Обнаруженное увеличение активности маркерного фермента ЦТК сукцинатдегидрогеназы и митохондриальных форм малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы убедительно свидетельствует об интенсификации протекания

катаболических процессов, обуславливающих повышение энергетического потенциала, который необходим для осуществления адаптивной реакции клеточного метаболизма. Использование методов молекулярной биологии позволило установить, что индукция активности СДГ, АГ и МДГ осуществляется благодаря синтезу de novo. Это вытекает из полученных данных, свидетельствующих о резком повышении уровня экспрессии генов sdha, mdh_mtx и асо, кодирующих эти энзимы.

В печени, почках и поджелудочной железе крыс в условиях аллоксанового диабета наблюдалось резкое возрастание активности цитоплазматических форм аконитазы и малатдегидрогеназы. По нашему мнению, это указывает на интенсификацию глюконеогенетических процессов, являющихся

приспособительным механизмом у животных, поддерживающих клеточный гомеостаз. Уровень транскрипции генов исследуемых изоформ ферментов показывает интенсификацию их экспрессии в клетках внутренних органов крыс. Следовательно, можно считать, что увеличение активности цитоплазматической МДГ и АГ при диабете вызвано интенсификацией биосинтеза молекул этих энзимов. В работе были проведены исследования разных уровней регуляции митохондриальных и цитоплазматических ферментов, в частности, рассматривался один из возможных вариантов их регуляции с помощью эпигенетических механизмов, однако, полученные данные показывают, что не было выявлено изменений в общем статусе метилирования геномной ДНК у крыс в условиях аллоксанового диабета.

На основании полученных данных была разработана гипотетическая схема действия аллоксанового диабета на трансформацию метаболических потоков в клетках путем изменения функционирования ключевых ферментов ЦТК и ГЦ (рис. 13). Увеличение концентрации глюкозы передается, по-видимому, с помощью глюкозосигнального соединения в ядро клетки, где активируется фактор транскрипции ChREBP (углевод-реагирующий элемент связывающий белок).

До недавнего времени не был известен характер глюкозо-сигнального соединения, хотя было установлено, что именно метаболиты глюкозы, а не сама гексоза, несут ответственность за глюкозный сигнал [Girard J., 1997]. Недавняя идентификация фактора транскрипции ChREBP [Yamashita H. et al., 2001] показала возможный механизм, благодаря которому глюкоза влияет на транскрипцию генов.

Таким образом, показано, что 'адаптация крыс к условиям аллоксанового диабета осуществляется на нескольких уровнях. Патоморфологические изменения в островковой части поджелудочной железы и нарушение балочной структуры долек гепатоцитов сопряжены с трансформацией основных путей клеточного метаболизма,

обеспечиваемой изменением функционирования ключевых ферментов цикла Кребса и глиоксилатного пути (СДГ, МДГ и АГ).

Рис. 13. Гипотетическая схема действия аллоксанового диабета на трансформацию метаболических потоков в клетках путем изменения функционирования ключевых ферментов ЦТК и ГЦ и морфологические изменения в тканях органов крыс.

ВЫВОДЫ

1. С помощью экзогенного аллоксана (100 мг аллоксана на 1 кг массы животного) была создана модель экспериментального диабета у крыс. Для экспериментальных животных в течение 3-х недель было выявлено увеличение концентрации глюкозы, понижение уровня гликогена, характерные изменения массы тела и внутренних органов, а также индукция маркерных ферментов изоцитратлиазы и малатсинтазы глиоксилатного цикла, являющегося важным этапом глюконеогенеза.

2. Морфологическое состояние печени крыс контрольной группы характеризовалось равномерным распределением относительно одинаковых гепатоцитов на протяжении печеночной дольки, структура гепатоцитов и соотношение исследуемых клеток соответствовали классической гистологической характеристике активно функционирующей печени. Гистологическая характеристика эндокринной части поджелудочной железы соответствовала норме, наибольшее количество островков выявлялось в желудочно-кишечной части.

3. При экспериментальном аллоксановом диабете в паренхиме печени исследуемых животных прослеживались выраженные признаки токсического гепатита в виде нарушения балочной структуры долек, некроза гепатоцитов, жировой и белковой дистрофии, наличия инфильтратов из скоплений гематогенных клеток.

4. Цитотоксическое воздействие аллоксана и инсулиновая недостаточность вызывали патоморфологические изменения в островковой части поджелудочной железы, носящие выраженный деструктивный характер, причем токсическому воздействию в наибольшей степени подвергались Р-клетки и компоненты микроциркуляторного русла.

5. Установлено, что аллоксановый диабет индуцирует активность ферментов, осуществляющих функционирование цикла трикарбоновых кислот в печени, почках и поджелудочной железе. Увеличение активности маркерного фермента ЦТК и митохондриальных форм МДГ и АГ убедительно свидетельствует об интенсификации катаболизма, обуславливающего повышение энергетического потенциала, необходимого для осуществления адаптивной реакции. Показано, что индукция активности СДГ, АГ и МДГ осуществляется по механизму синтеза de novo, о чем свидетельствуют полученные данные об уровнях экспрессии генов sdha, mdhmtx и асо.

6. Выявлено, что в печени, почках и поджелудочной железе крыс в условиях аллоксанового диабета резко увеличивается активность цитоплазматических форм АГ и МДГ, а также маркерных ферментов глиоксилатного цикла - ИЦЛ и МС, что свидетельствует об интенсификации глюконеогенетических процессов, являющихся приспособительным механизмом к поддержанию клеточного гомеостаза. Анализ уровня транскрипции генов исследуемых ферментов свидетельствует о более интенсивной их экспрессии в исследованных внутренних органах опытных животных. Следовательно, увеличение активности МДГ и АГ при диабете обусловлено увеличением интенсивности синтеза молекул исследуемых ферментов.

7. Установленные изменения уровней экспрессии генов митохондриальных и цитоплазматических ферментов свидетельствуют о детерминации

транскрипционных процессов геномными структурами. Известно, что одним из возможных вариантов регуляции является эпигенетический механизм, однако в нашей работе не было выявлено изменений в общем статусе метилирования геномной ДНК крыс в условиях аллоксанового диабета.

8. Разработана гипотетическая схема действия аллоксанового диабета на функционирование ключевых ферментов ЦТК и ГЦ во внутренних органах крыс. Увеличение концентрации глюкозы посредством глюкозо-сигнальных соединений активирует фактор транскрипции СЬЯЕВР, а также инсулин-зависимый фактор 8ЯЕВР-1С, что обуславливает контроль экспрессии исследуемых генов ферментов углеводного и липидного метаболизма.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гати Моханнад Абдулраззак Гати. Трансформация активности антиокислительных ферментов в печени при аллоксановом сахарном диабете / Гати Моханнад Абдулраззак Гати, Е.В. Семенова // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - 2011. - Вып. 13. - С.43-48.

2. Гати Моханнад Абдулраззак Гати. Изменение ферментативной активности дегидрогеназ в печени крыс при аллоксановом диабете / Гати Моханнад Абдулраззак Гати, Е.В. Семенова, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - 2011. - Вып. 13. - С.48-53.

3. Моханнад Абдулраззак Гати. Особенности функционирования антиокислительных ферментов у крыс, больных аллоксановым диабетом, в процессе эксперимента / Моханнад Абдулраззак Гати // Перспективы науки. - 2012. - № 5 (32). - С.361-363.

4. Особенности функционирования аконитатгидратазной ферментной системы в органах крыс в условиях аллоксанового диабета / А.Т. Епринцев [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - № 3. - С.38-44.

5. Индукция дополнительных изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени крыс в условиях аллоксанового диабета / Аль Дайни Саба Хади [и др.] // Вестник Воронежского государственного университета. - 2012. - № 1. - С. 168-176.

6. Гати Моханнад Абдулраззак Гати. Функционирование ферментов глиоксилатного цикла в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета / Гати Моханнад Абдулраззак Гати, Е.В. Семенова, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - 2012. -Вып.14. - С.53-59.

7. Гати Моханнад Абдулраззак Гати. Регуляция активности фруктозо-1,6-бисфосфатазьг у крыс с аллоксановым диабетом / Гати Моханнад Абдулраззак Гати, Е.В. Семенова, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - 2012. - Вып.14. - С.59-63.

8. Гистологические показатели образцов печени и поджелудочной железы крыс в норме и при аллоксановом диабете / Моханнад Гати Абдулраззак [и др.] // Физиология и психофизиология мотиваций. - Воронеж. - 2012. - Вып.11. - С.94-99.

9. Моханнад Абдулраззак Гати. Исследование физиологических и биохимических изменений в свойствах ферментов центральных метаболических путей в печени крыс при экспериментальном диабете / Моханнад Абдулраззак Гати, А.Т. Епринцев // Актуальные проблемы профессионального образования - подходы и перспективы. - 2012. - С.375-376.

10. Моханнад Абдулраззак Гати. Особенности функционирования ферментов при экспериментальном диабете и их роль в процессе глюконеогенеза / Моханнад Абдулраззак Гати // Международная юбилейная научно-практическая конференция ВЭПИ-ВГЛТА. - 2012. - Т.4. - С.286-289.

11. Экспрессия ключевых ферментов цикла Кребса в поджелудочной железе и печени крыс в норме и при аллоксановом диабете / Е.Г. Петрова [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - 2013. - Вып.15. - С. 155-162.

12. Физиолого-биохимические механизмы адаптации крыс к условиям аллоксанового диабета /Гати Моханнад Абдулраззак Гати [и др.] // Фундаментальные исследования. -2013. -№ 11. -С. 1256-1262.

Статьи № 3, № 4, № 5, № 12 опубликованы в печатных изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Подписано в печать 31.10.13. Формат 60^84 '/,„_ Усл. нсч. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1033.

Отпечатано с готовою оригинал-макета в типографии Издательско-гюлшрафического центра Воронежскою государственного университета. 394000, Воронеж, у.ч. Пушкинская, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гати Моханнад Абдулраззак Гати, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

(ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

04201365085

Гати Моханнад Абдулраззак Гать ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ КРЫС ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.04 - Биохимия 03.03.01 - Физиология

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Епринцев А.Т., доктор биологических наук профессор Вашанов Г.А.

ВОРОНЕЖ 2013 г.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ТЕРМИНОВ

АДФ - аденозиндифосфат; АТФ - аденозинтрифосфат;

НАДН (NADH) - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный; НАД+ (NAD4) - никотинамиддинуклеотид окисленный;

сдг - сукцинатдегидрогеназа;

ФАД - флавинадениндинуклеотид;

Е - ферментативная единица;

цтк - цикл трикарбоновых кислот;

ГЦ - глиоксилатный цикл;

этц - электронтранспортная цепь;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ицл - изоцитратлиаза;

мс - малатсинтаза;

кДНК - комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота;

мдг - малатдегидрогеназа;

АГ - аконитатгидратаза;

СД - сахарный диабет;

вмя - вентромедиальное ядро;

Rf - электрофоретическая подвижность.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 6

Глава 1 . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................12

1.1. Физиолого-биохимические аспекты адаптации метаболизма животных к сахарному диабету...............................................12

1.1.1. Биохимия сахарного диабета................................................ 12

1.1.2. Аллоксановый диабет......................................................... 14

1.2. Роль ферментов цикла Кребса и глиоксилатного пути

в трансформации основных метаболических потоков....................16

1.2.1. Метаболизм углеводов........................................................16

1.2.2. Метаболизм липидов..........................................................21

1.2.3. Механизмы адаптации при аллоксановом диабете.....................24

1.2.4. Глюконеогенез в тканях животных........................................25

1.2.4.1. Глиоксилатный цикл в тканях животных...............................26

1.3. Функционирование ключевых ферментных систем

в животной клетке.............................................................. 29

1.3.1. Аконитатгидратаза............................................................29

1.3.2. Малатдегидрогеназа...........................................................33

1.3.3. Сукцинатдегидрогеназа.......................................................38

1.4.Молекулярно-биологические особенности регуляции функционирования ферментов при адаптивной реакции клеточного метаболизма при диабете.......................................................44

1.5. Морфологические исследования изменений тканей и органов

при сахарном диабете............................................................52

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................63

2.1. Объекты и методы исследования..............................................63

2.1.1. Объект исследования....................... ...................................63

2.1.2. Методы исследования....................... ..................................63

2.1.2.1. Получение материала для исследования.................................63

2.1.2.2. Определение содержания глюкозы в крови.............................63

2.1.2.3. Определение содержания гликогена......................................64

2.1.2.4. Определение активности ферментов.....................................64

2.1.2.5. Определение количества белка.............................................66

2.1.2.6. Выделение митохондрий из органов крыс...............................67

2.1.2.7. Определение перекрестного загрязнения фракций.....................67

2.1.2.8. Выделение суммарной клеточной популяции РНК....................67

2.1.2.9. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы..........................................................................68

2.1.2.10. Обратная транскрипция....................................................68

2.1.2.11. Подбор специфических праймеров......................................69

2.1.2.12. Проведение обратнотранскриптазной полимеразной реакции.....69

2.1.2.13. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени........................................................................70

2.1.2.14. Выделение геномной ДНК из печени крыс............................70

2.1.2.15. Метилчувствительная рестрикция.......................................71

2.1.2.16. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот........................................................71

2.1.2.17. Методика гистологических исследований...........................72

2.1.2.18. Статистическая обработка данных.................................... 73

2.3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............75

2.3.1. Физиолого-биохимические критерии, свидетельствующие

об индукции экспериментального диабета..............................75

2.3.1.1. Динамика изменения содержания глюкозы и гликогена

в крови крыс в норме и при диабете.....................................75

2.3.1.2. Изменение массы животных и их внутренних органов

в норме и при диабете......................................................76

2.3.1.3. Индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла...........79

2.3.2. Результаты гистологических исследований печени и поджелудочной железы у крыс при аллоксановом диабете......... 81

2.3.2.1. Морфологическая организация и гистологические особенности

печени крыс при аллоксановом диабете.............................. 81

2.3.2.2. Морфологическая организация и гистологические особенности

поджелудочной железы крыс при аллоксановом диабете......... 85

2.3.3. Активность ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла в разных'органах крыс в норме и при экспериментальном

диабете...........................................................................90

2.3.3.1. Динамика активности ключевых ферментов цикла Кребса

и глиоксилатного пути в печени крыс................................. 90

2.3.3.1.1. Изменение сукцинатдегидрогеназной активности в печени крыс в условиях аллоксанового диабета..............................90

2.3.3.1.2. Активность малатдегидрогеназы в печени контрольных

и опытных крыс............................................................92

2.3.3.1.3. Активность аконитатгидратазы в гепатоцитах опытных

и контрольных крыс.......................................................93

2.3.3.2. Изменение активности ферментов ЦТК и ГЦ в почках..............95

2.3.3.3. Активность ключевых ферментов ЦТК и ГЦ

в поджелудочной железе...................................................97

2.3.3.4. Субклеточная локализация ферментов в печени, почках и поджелудочной железе крыс, находящихся в условиях экспериментального диабета............................................100

2.3.4. Экспрессия генов ключевых ферментов цикла Кребса и глиоксилатного пути в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.......................................................104

2.3.5. Роль метилирования в регуляции биосинтеза ферментов

ЦТК и ГЦ в норме и при аллоксановом диабете........................110

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................114

ВЫВОДЫ.............................................................................119

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.......................122

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Адаптация животного организма к аллоксановому экспериментальному диабету является сложным многоэтапным процессом, главным звеном которого служит трансформация клеточного метаболизма. Индукция ферментов глиоксилатного цикла и цикла трикарбоновых кислот в тканях животных служит для изменения основных путей метаболизма, обусловленных ресинтезом гликогена в печени крыс при патологиях, связанных с условиями пищевой депривации и экспериментального диабета [27, 157, 10]. На нашей кафедре была установлена индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла в гепатоцитах крыс при аллоксановом диабете [158]. Кроме того, что глюконеогенез выступает как важнейший процесс при адаптивной реакции животного организма к экстремальным условиям, важную роль играет энергетический обмен, связанный, главным образом, с функционированием цикла Кребса. Следовательно, адаптивная реакция клеточного метаболизма обеспечивается соотношением интенсивности протекания катаболизма и анаболизма глюкозы в клетках печени и других органов животного организма. Несмотря на значительное количество исследований об интенсивности ферментативной активности, обуславливающей скорость протекания энергетического и синтетического процессов, остаются невыясненными многие факторы регуляции, такие как концентрация метаболитов, воздействие гормонов и другие [50].

В литературе широко представлены работы об особенностях клинико-биохимических показателей при сахарном диабете. Данные морфологических исследований немногочисленны и зачастую разноплановы. В последнее время большое внимание исследователей направлено на изучение состояния нейроэндокринных центров и

выяснение их участия в регуляции функций панкреатических островков [3; 16; 165].

Особый интерес вызывает молекулярный уровень регуляции ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла, связанный с экспрессионной регуляцией ферментов. Ранее было показано наличие двух изоформ аконитатгидратазы, малатдегидрогеназы. Однако, исследований по генетической детерминации изоферментного полиморфизма этих и других ферментных систем в животных организмах в условиях экспериментального диабета нами не обнаружено. В связи с этим необходимо проведение анализа функционирования интенсивности экспрессии генов энзимов, участвующих с помощью изоферментов в обеспечении протекания, как энергетического обмена, так и процессов, обуславливающих синтетическую функцию метаболизма. Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось комплексное исследование физиолого-биохимических особенностей адаптации крыс при аллоксановом диабете, включающее изучение экспрессионной регуляции ферментов сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, обеспечивающих трансформацию катаболических и анаболических процессов. Кроме того, установлены изменения гистологического характера во внутренних органах крыс в условиях аллоксанового диабета.

В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Индуцировать с помощью аллоксана экспериментальный диабет у крыс и провести изучение физиолого-биохимических критериев, подтверждающих возникновение данной патологии у экспериментальных животных.

2. Осуществить гистологические исследования печени у крыс в норме и при аллоксановом диабете.

3. Исследовать гистологические изменения клеток поджелудочной железы у крыс в условиях экспериментального диабета.

4. Выяснить изменение активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в печени, поджелудочной железе и почках крыс, подвергшихся воздействию экспериментального диабета.

5. Установить субклеточную локализацию сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, активность которых меняется в тканях разных органов крыс при аллоксановом диабете.

6. Определить уровень экспрессии генов малатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.

7. Исследовать роль метилирования в регуляции биосинтеза ферментов ЦТК и ГЦ в норме и при аллоксановом диабете.

8. Разработать гипотетическую схему адаптации крыс к экспериментальному диабету на морфо-физиологическом, биохимическом и экспрессионном уровнях.

Научная новизна. Результаты исследований, полученные в данной диссертационной работе, позволяют расширить и углубить имеющиеся представления о способах адаптации животных на физиологическом, биохимическом и экспрессионном уровнях. Установлено, что при экспериментальном диабете, моделируемом с помощью экзогенного аллоксана, в печени и поджелудочной железе крыс, наблюдаются изменения морфологических признаков, связанных со значительными отклонениями от контрольных образцов по составу, физическим индексам и размерам.

При экспериментальном диабете наблюдается активация исследуемых ферментов цикла трикарбоновых кислот и гликолатного пути в печени, почках и поджелудочной железе крыс, обусловленная увеличением

митохондриальных форм малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, что, вероятно, связано с более высокой скоростью работы ЦТК. Показано, что индукция ферментов обусловлена синтезом de novo, так как наблюдается более высокая интенсивность транскрипции их генов при адаптации к аллоксановому диабету.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы позволяют разработать комплексный механизм адаптации животных к аллоксановому диабету на физиолого-биохимическом уровне. Результаты анализа экспрессионной регуляции сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени, поджелудочной железе и почках крыс могут служить основой для разработки тестов для идентификации патологических отклонений в организме при экспериментальном диабете.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, физиологии человека и животных, спецкурсах по энзимологии, адаптационным механизмам животных. Кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту. 1. Экспериментальный диабет индуцировал в паренхиме печени животных признаки токсического гепатита в виде нарушения балочной структуры долек, некроза гепатоцитов жировой и белковой дистрофии. Цитотоксическое действие аллоксана и инсулиновая недостаточность приводили к патоморфологическим изменениям в островковой части поджелудочной железы, носящим выраженный деструктивный характер. При этом токсическому воздействию в наибольшей степени подвергались 0-клетки и компоненты микроциркуляторного русла.

Аллоксановый диабет индуцирует активность ферментов, осуществляющих функционирование цикла Кребса в печени, почках и поджелудочной железе. Увеличение активности СДГ (маркерного фермента ЦТК) и митохондриальных изоформ МДГ и АГ свидетельствует об интенсификации катаболических процессов, повышающих энергетический потенциал клетки, что необходимо для осуществления адаптивной реакции.

Увеличение активности сукцинатдегидрогеназы, аконитатгидратазы и малатдегидрогеназы в условиях аллоксанового диабета осуществляется по механизму синтеза de novo. На это указывают результаты исследования уровней экспрессии генов sdha, mdhjntx и асо.

В печени, почках и поджелудочной железе крыс в условиях аллоксанового диабета резко повышается активность цитоплазматических форм АГ и МДГ, а также маркерных ферментов глиоксилатного цикла ИЦЛ и МС, что указывает на интенсификацию глюконеогенеза. При этом выявлено увеличение уровня транскриции генов исследуемых ферментов, что свидетельствует об интенсификации их экспрессии в исследованных внутренних органах опытных животных.

Предлагается гипотетическая схема действия аллоксанового диабета на функционирование ключевых ферментов ЦТК и ГЦ во внутренних органах крыс. Увеличение количества глюкозы активирует с помощью глюкозо-сигнальных соединений фактор транскрипции ChREBP (углевод-реагирующий элемент связывающий белок), обуславливающий контроль процессов экспрессии исследуемых генов метаболитами глюкозы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на международной юбилейной научно-практической конференции ВЭПИ-ВГЛТА (Воронеж, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Системная организация физиологических функций», посвященной 90-летию со дня основания кафедры физиологии человека и животных Воронежского государственного университета (Воронеж, 2012); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2011, 2012, 2013).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 9 статьях и 3 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (199 источник). Иллюстрационный материал включает 6 таблиц и 28 рисунков.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Физиолого-биохимнческие аспекты адаптации метаболизма животных к сахарному диабету 1.1.1. Биохимия сахарного диабета

Сахарный диабет - это группа эндокринных заболеваний, развивается от относительного или абсолютного недостатка гормона инсулина или нарушения его взаимодействия с клетками организма, в результате развивается гипергликемия - стойкое увеличение содержания глюкозы в крови. Нарушаются все виды обменов веществ: белковый, жировой, углеводный, водно-солевой, минеральный [21]. В настоящее время в мире насчитывается более 150 миллионов больных сахарным диабетом, это 5% населения западных стран и 10 - 15 % развивающихся стран [45]. Глюкоза— основной продукт фотосинтеза, образуется в цикле Кальвина. В организме человека и животных глюкоза является основным и наибо�