Влияние водного экстракта оливы европейской (Olea Europaea) на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс в условиях экспериментального диабета

Аль Дайни Саба Хади Бенайед

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние водного экстракта оливы европейской (Olea Europaea) на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс в условиях экспериментального диабета
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние водного экстракта оливы европейской (Olea Europaea) на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс в условиях экспериментального диабета"

На правах рукописи

005049229 ^г*^

Аль Дайни Саба Хади Беиайед

Влияние водного экстракта оливы европейской {Olea Europaea) на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс в условиях экспериментального диабета

Специальность 03.01.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж-2012

005049229

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна

доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии

Шуваева Галина Павловна

кандидат биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет инженерных технологий, доцент кафедры микробиологии и биохимии

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН

Защита состоится «27» декабря 2012 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., д. 1, ауд. 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан «26» ноября 2012 года. Ученый секретарь ,

диссертационного совета ^ Грабович Маргарита Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. При индуцированном аллоксаном экспериментальном диабете в организме включаются многие защитные механизмы. Среди этих способов защиты важную роль играют природные вещества, содержащиеся в экстрактах растений. Считается, что оливковое дерево обладает высокой антиоксидантной активностью, причем это характерно для листьев, плодов и полученного из них масла. Известно, что листья оливкового дерева содержат в своем составе молекулы таких веществ, как олеуропеин, гидрокситирозол, олеуропеина агликон и тирозол (Corona et al., 2006; Manna et al., 2004). Основными фенольными соединениями листьев оливы являются гликозилированные формы олеуропеина и лигстрозида. Наиболее активным компонентом листьев оливы считается экстракт олеуропеина, естественный продукт иридоидной группы. Механизм подавления гипергликемии с помощью олеуропеина до сих пор не изучен (Saenz et al., 1998; Visioli et al., 1998).

Подробные исследования эффективности гидрокситирозола, выделенного из листьев оливкового дерева, в отношении моделирования оксидативного стресса, ассоциированного с сахарным диабетом у экспериментальных животных, отсутствуют. Следовательно, настоящее исследование было проведено для изучения возможных гипогликемических и сахароснижающих эффектов водного экстракта листьев оливы. Изменения метаболизма липидов и липопротеинов на фоне сахарного диабета связаны с трансформацией функционирования глиоксилатного цикла. Ранее на кафедре была установлена возможность индукции ключевых ферментов глюконеогенеза в печени и почках крыс при голодании и экспериментальном диабете (Епринцев и др., 2007). Особый интерес вызывает функционирование изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1), малатсинтазы (КФ 4.1.3.2) и других ключевых ферментов в разных органах крыс при экспериментальном диабете на фоне введения в организм животного водного экстракта оливы европейской (ВЭО). Выяснение механизма изменения активности маркерных и ключевых ферментов глиоксилатного цикла открывает перспективы для разработки модели адаптивной реакции клеточного метаболизма, включающей «ферментативную» оборону, что обеспечивает адаптацию организма к сахарному диабету.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование действия водного экстракта оливы европейской на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс при экспериментальном диабете. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи.

1. Создание экспериментальной модели диабета с использованием инъекций индуктора диабета аллоксана экспериментальным животным.

2. Изучение динамики развития экспериментального диабета при введении крысам перорально водного экстракта оливы.

3.Проведение гистологических исследований печени и поджелудочной железы у контрольных крыс, животных, подвергшихся аллоксановому диабету, и крыс с аллоксановым диабетом, получавших ВЭО.

4. Исследование изменения активности и изоферментного состава ряда ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в различных тканях опытных и контрольных крыс.

5. Изучение субклеточной локализации маркерных ферментов глиоксилатного цикла в печени и почках крыс с экспериментальным диабетом, получавших водный экстракт оливы.

6. Получение электрофоретически гомогенных препаратов изоцитратлиазы и малатсинтазы с помощью многостадийной очистки из опытных животных.

7. Исследование физико-химических и каталитических свойств маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы из почек и печени экспериментальных крыс.

Научная новизна. Показано, что экспериментальный диабет, вызывающий индукцию изоцитратлиазы и малатсинтазы, в гепатоцитах и клетках почек крыс, полностью блокируется введением водного экстракта листьев оливы европейской {Olea Europea). Протекторное действие экстракта оливы проявляется в снятии индукции маркерных ферментов глиоксилатного цикла, в частности, их активность отсутствует в печени и почках. При введении водного экстракта листьев оливы наблюдается уменьшение размера островков по сравнению с панкреатическими островками у крыс с аллоксановым диабетом. Получены гомогенные препараты изоцитратлиазы и малатсинтазы из тканей крыс с аллоксановым диабетом. Показано, что при

экспериментальном диабете происходит образование новых изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, локализованных в пероксисомальной фракции гепатоцитов, при этом их индукция полностью снимается при введении водного экстракта оливы крысам.

Практическая значимость. Результаты диссертационной работы позволяют углубить современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов в клетках животных. Протекторное действие водного экстракта листьев оливы европейской открывает перспективы для использования его как гипогликемического средства при сахарном диабете. Предлагается способ хранения фермента изоцитратлиазы, обеспечивающий его функциональную сохранность в течение длительного времени, что позволяет использовать препарат для биохимических анализов в лабораторной практике.

Материалы работы применяются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении лекций по биохимии, а также в спецкурсах по энзимологии. Кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на IV Международной научно-практической конференции «Наука на рубеже тысячелетия», Барселона -Санта Сусанна, Испания, 2012; на III международной научно-практической конференции «Роль науки в развитии общества», Хургада, Египет, 2011; на международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии», Санкт-Петербург, 2010; на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи; на Х-ой международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы»; ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в одиннадцати публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 256 источников. Иллюстрационный материал включает 23 рисунка, 7 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали самцов беспородных лабораторных крыс (Rattus rattus L.), которые выращивались при нормальном питании. Контрольные животные выращивались при обычном пищевом режиме без введения аллоксана. Для экспериментов использовали животных в возрасте приблизительно пяти месяцев. Их масса к этому времени составляла от 250 до 300 г.

Формирование модели аллоксанового диабета у крыс. Опытным крысам вводили подкожно аллоксан в дозе 200 мг/кг. Контрольным животным производили инъекцию физиологического раствора в том же объеме. Наличие аллоксанового диабета у крыс определяли по уровню изменения концентрации глюкозы в крови. Концентрацию глюкозы определяли ферментативно. Для этого использовали готовый глюкозный реактив, содержащий трис-буфер рН 8,4, смесь ферментов (глюкозооксидаза, пероксидаза), хромоген. Глюкозу определяли в плазме крови. По 3 мл глюкозного реактива смешивали с 0,01 мл плазмы крови, 10 ммоль глюкозой и с водой, затем инкубировали в течение 30 мин. при 37°С в темноте. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 480520 нм пробы (А) и этанола (В) против контрольного раствора. Концентрацию глюкозы рассчитывали по формуле: Глюкоза (ммоль/л) = 10 * А / В. Концентрация глюкозы в крови в норме составляла 6-8 ммоль/л. Через десять дней после инъекции концентрация глюкозы в крови крыс составляла 14-16 ммоль/л. Такое существенное увеличение концентрации глюкозы в крови нами рассматривалось как критерий индукции у опытных животных аллоксанового диабета.

Получение водного экстракта из листьев оливы. Для приготовления горячего водного экстракта 10 граммов растительного порошка смешивали со 100 мл кипящей дистиллированной воды и помещали в термостат на 30

минут при температуре 70°С для получения сухого порошка экстракта. Экстракт имел рН-6,3, что достаточно близко к значению pH крови (El FallaKattan, 1997).

Выделение клеточных органелл. Выделение субклеточных фракций из органов проводили методами дифференциального центрифугирования и изоплотностного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Один грамм органа гомогенизировали в 10 мл среды выделения (pH 7,5), содержащей 50 мМ трис-НС1 0,25 М сахарозы, 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол и 1 мМ ЭДТА. Осадок, содержащий в основном митохондрии и пероксисомы, ресуспедировали в среде выделения. Затем митохондрии и пероксисомы разделяли с помощью изоплотностного центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы. Наличие в исследуемой фракции сахарозного градиента митохондрий и пероксисом определяли по активности маркерных ферментов: сукцинатдегидрогеназы, фумаратгидратазы и каталазы.

Определение активности ферментов. Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически при 25°С.

Изоцитратлиазу (ИЦЛ, КФ. 4.1.3.1) определяли при 324 нм по методу Диксона и Корнберга (Dixon, Kornberg, 1959).

Малатсинтазу (MC, КФ 4.1.3.2) измеряли при 412 нм по формированию комплекса CoA-SH и дитио-бкс-нитробензойной кислоты (ДТНБ). Активность малатдегидрогеназы (МДГ, КФ 1.1.1.37) измеряли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования или расходования НАДН.

Для измерения активности аконитатгидратазы (АГ, КФ 4.2.3.1) применяли метод, основанный на учете разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис-аконитатом при 240 нм.

Для определения активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3,99.1) спектрофотометрировали при длине волны 600 нм по методу Т. Cooper с сотр. (1969). Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли спектрофотометрически при 230 нм (Breidenbach et al., 1968).

Цитратсинтазу (ЦС, КФ 4.1.3.7) определяли при длине волны 412 нм. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль продукта за 1 минуту при 25 °С.

Выделение и очистка Ферментов. Для получения высокоочищенных препаратов ИЦЛ и МС был разработан метод, включающий несколько стадий очистки. После гомогенизации материала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. От низкомолекулярных соединений ферменты отделяли гель-фильтрацией на сефадексе 0-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Тоуореаг1 или ДЭАЭ-целлюлозе, и гельхроматографию на Тоуореаг1Н\У-55 или сефадексе С-150.

Исследование кинетических характеристик-ферментов.

Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на электрофоретически гомогенных или высокоочищенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, констант ингибирования осуществляли с использованием линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов

(Диксон, Уэбб, 1982).

Аналитический электрофорез. Электрофоретическое исследование проводили по методу Дениса и Орнстейна фа™, ОтзШп, 1959). Разделение белкового раствора осуществляли на разделяющем (мелкопористом) геле, который содержал 7,5% полиакриламида. Применение концентрирующего (крупнопористого) геля, содержащего 2% акриламида, обеспечивало концентрацию белка. Разделение исследуемых белков проводили в основной буферной системе, рН 8,9. Электрофоретическое разделение белков проводили на холоду (0,+2°). Для определения гомогенности

очищенной ИЦЛ наносили на одну полосу исследуемый раствор, содержащий 10-15 мкг белка. После электрофореза гелевые пластинки окрашивали универсальным красителем на белки - нитратом серебра или кумасси голубым.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 3-4 кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. В таблицах и на рисунках приводятся данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из трех определений. Для контроля достоверности результатов исследований применяли метод вариационной статистики. Полученные данные об-

рабатывали с использованием статистических критериев. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0,05 (Лакин, 1980). Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации.

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИНДУКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА У КРЫС

Введение аллоксана самцам лабораторных крыс способствовало увеличению концентрации глюкозы в крови до 15,8 ммоль/л, спустя 9 дней после инъекции. У контрольных крыс концентрация глюкозы составила порядка 5,5 ммоль/л (рис. 1). У группы животных с аллоксановым диабетом при введении им перорально водного экстракта оливы европейской наблюдали устойчивое снижение концентрации глюкозы, которое не превышало 6-8 ммоль/л.

Воздействие аллоксана приводит к разрушению р-клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе, вследствие чего возникает недостаток инсулина и развивается инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД).

I I

а норма

■ аллоксан

□ аллоксан + экстракт оливы

Рис. 1. Динамика изменения уровня глюкозы в крови у крыс

Было показано, что уровень глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом, получавшим ежедневно ВЭО, значительно снижался на всем протяжении проведения эксперимента по сравнению с группой крыс с аллоксановым диабетом.

Гистологический анализ образцов печени крыс в норме и при аллоксановом диабете. В контрольных срезах печени состояние центрального сосуда и триады (поддольковые печеночные вены) не изменено. Размеры их находятся в норме, просвет нормальный, хорошо видны макрофаги. При диабете печень отреагировала появлением лимфоидной ткани, сосуды уменьшились, следовательно, их просвет сужался (рис. 2). У группы животных с аллоксановым диабетом, получавшей ВЭО, клетки имели нормальную структуру и мало отличались от гистологических срезов, сделанных с клеток печени контрольных крыс.

В контрольном образце среза поджелудочной железы изменений в строении клеток островков Лангерганса нет. В тканях опытных крыс с индуцированным диабетом, в островках Лангерганса наблюдается патология в их строении. При диабете их количество и размер заметно уменьшается. Были выявлены изменения в размере и форме островковых клеток и умеренная дегрануляция (3-клеток.

1 2 3

Рис. 2. Гистологические срезы образцов печени в районе центральной вены крыс в норме (1), при аллоксановом диабете (2), у крыс с аллоксановым диабетом в присутствии экстракта оливы (3).

Однако, панкреатические островки в группе крыс с аллоксановым диабетом, получавшей водный экстракт оливы, и в контрольной группе имели нормальную структуру с умеренной дегрануляцией и полнокровными кровеносными сосудами. В группе животных с аллоксановым диабетом, получавших ВЭО, были выявлены нормальные панкреатические островки правильной формы аналогичные островкам в контрольной группе крыс.

ИНДУКЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА В ТКАНЯХ КРЫС В УСЛОВИЯХ АЛЛОКСАНОВОГО ДИАБЕТА И ПРИ ВВЕДЕНИИ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА ОЛИВЫ Активность ключевых ферментов центральных метаболических путей в печени и почках крыс. Анализ изменения активности ферментов, обеспечивающих функционирование глиоксилатного цикла, приведен в таблице 1. Контролировалась активность аконитатгидратазы,

Таблица 1.

Активность ключевых ферментов, участвующих в протекании основных _метаболических процессов в печени и почках крыс_

Ферменты Активность ферментов

Печень Почки

Норма Аллоксан Аллоксан + экстракт оливы Норма Аллоксан Аллоксан + экстракт оливы

Цитратсинтаза, Е/г сырой массы 1,983± 0,102 2,850± 0,082 1,953± 0,073 0,896± 0,039 1,231± 0,041 0,905± 0,031

Аконитат-гидратаза, Е/г сырой массы 2,951± 0,059 7,212± 0,037 2,861± 0,031 3,052± 0,012 6,715± 0,101 3,210± 0,120

Малатдегидро-геназа, Е/г сырой массы 38,106 ±1,132 79,211± 2,116 39,201± 1,083 43,314 ±1,410 100,300± 2,514 52,301± 2,000

Сукцинатде-гидрогеназа, Е/г сырой массы 1,218± 0,034 1,728± 0,041 1,251± 0,043 0,911± 0,012 1,342± 0,019 1,264± 0,014

Изоцитрат-лиаза, Е/г сырой массы 0 2,806± 0,073 0 0 0,926± 0,027 0

Малатсинтаза, Е/г сырой массы 0 1,318± 0,026 0 0 0,516± 0,018 0

АсАТ, мк кат/л 1,489± 0,071 1,790± 0,085 1,521± 0,067 1,293± 0,043 0,101± 0,032 1,189± 0,051

АпАТ, мк кат/л 3,519± 0,173 6,958± 0,292 3,601± 0,115 0,319± 0,011 0,474± 0,021 0,309± 0,017

малатдегидрогеназы, цитратсинтазы, сукцинатдегидрогеназы, АлАТа и АсАТа в печени и почках интактных и опытных крыс. У животных одной группы индуцировался экспериментальный диабет, а крысам второй группы вводили перорально дополнительно водный экстракт оливы. Было установлено, что в период эксперимента активность всех ферментов увеличивалась при возникновении аллоксанового диабета. К 5 дню опыта по сравнению с контрольными животными резко возрастала активность ферментов глиоксилатного цикла, составляющая для МДГ и ЦС из печени 79,211 и 2,850 ед. на 1 г сырой массы, а из почек 100,300 и 1,231 ед. на г сырой массы, соответственно (табл. 1). Интересно отметить, что наблюдается индукция маркерных ферментов глиоксилатного пути МС и ИЦЛ, которая полностью отсутствует в печени и почках контрольных животных. Введение крысам перорально водного экстракта оливы европейской полностью снимало индукцию маркерных ферментов и увеличение активности других исследуемых энзимов под влиянием экспериментального диабета. Изменение активности исследуемых ферментов в группе крыс с аллоксановым диабетом, которым вводили перорально водный экстракт оливы, совпадало с тенденциями, характерными для энзимов контрольной группы животных (табл.1).

Экстракт оливы, введенный крысам, оказывал нивелирующее действие на изменение ферментативной активности, обуславливающей протекание катаболических и анаболических процессов.

Индукция Ферментов глиоксилатного цикла в тканях крыс.

Доказательством функционирования глиоксилатного цикла у экспериментальных крыс являются активности ИЦЛ и МС в различных тканях и органах крыс, подвергшихся воздействию аллоксана. В тканях нормальных крыс активности маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы не обнаружены. Интересно отметить, что активность этих ферментов глиоксилатного цикла в печени, почках и других органах крыс с аллоксановым диабетом, получавших водный экстракт оливы, не выявлена. На пятый день эксперимента активность изоцитратлиазы и малатсинтазы была максимальной и составила для гомогената тканей печени 0,10 и 0,060 ед. на 1 мг белка, соответственно (рис.3). Такая же динамика

индукции характерна и для ИЦЛ и МС из почек. Однако, абсолютные значения активности' изучаемых ферментов были ниже.

0^12

Рис. 3. Индукция ключевых ферментов | ои глиоксилатного цикла в условиях

V аллоксанового диабета крыс.

" ом 1 - динамика активности изоцитратлиазы;

I 2 - динамика активности малатсинтазы

£ 0,04 М2

Известно, что как ИЦЛ, так и MC отсутствуют в животных тканях, обнаруживаясь только в микроорганизмах и высших растениях (Beevers, 1979). Однако, во время личиночных стадий онтогенеза и в эмбриогенезе некоторых нематод была показана индукция ферментов глиоксилатного цикла (Khan, McFadden, 1980). Для их личинок было установлено, что изоцитратлиаза и малатсинтаза локализованы в митохондриях и обеспечивают синтез гликогена из жирных кислот (Rubin, Trelease, 1976).

Кроме того, некоторые биохимические и цитохимические исследования показали присутствие ключевых ферментов глиоксилатного цикла в тканях высших животных. Так активность изоцитратлиазы и малатсинтазы обнаруживалась в почечных канальцах Bufo marinus (Goodman et al., 1980), в печени морских свинок (Jones, 1980) и цыплят (Davis et al., 1990).

Очень интересно отметить, что существуют данные об обнаружении активности изоцитратлиазы и малатсинтазы в гепатоцитах человека (Davis et al, 1992).

Изоферментный состав ключевых ферментов глиоксилатного цикла у крыс в различных условиях. Увеличение активности энзимов может быть связано с дополнительным синтезом ферментов и появлением их новых изоформ (рис. 4). У крыс в норме обнаружено два изофермента малатдегидрогеназы и три изоформы, обладающие аконитатгидратазной активностью. Полностью отсутствует активность маркерных ферментов

Рис. 4. Изоферментный состав малатдегидрогеназы (I), аконитатгидратазы (XI) и изоцитратлиазы (III) в гепатоцитах крыс в норме (1), крыс с экспериментальным диабетом (2) и крыс с экспериментальным диабетом, получавших водный экстракт

оливы (3)

глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. В печени крыс в условиях экспериментального диабета происходит индукция маркерных ферментов глиоксилатного пути и перестройка изоферментного состава других ключевых ферментов центральных метаболических путей -малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы. Наблюдается сопряженное с возрастанием активности этих энзимов увеличение количества их изоформ (рис.4). Так, с помощью электрофореза выявлено появление одной изоформы малатдегидрогеназы в печени крыс в условиях аллоксанового диабета. Введение крысам водного экстракта оливы полностью снимает эффект изменения активности исследуемых ферментов в печени и почках. В частности, отсутствует изоцитратлиазная и малатсинтазная активность. Кроме того, у крыс принимающих водный экстракт оливы европейской, не наблюдали индукцию дополнительных изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы под действием аллоксанового диабета. Следовательно, анализ полученных данных свидетельствует о протекторном действии экстракта оливы на функционирование глиоксилатного цикла в печени и почках крыс при введении им аллоксана.

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ МАРКЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ

ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА В ПЕЧЕНИ И ПОЧКАХ КРЫС Картина распределения маркерных ферментов в гепатоцитах крыс с аллоксановым диабетом, которым вводился водный экстракт оливы, приведена на рисунке 5. Данная группа животных не обладала МДГ и ЦС.

Рис. 5. Субклеточная локализация ферментов

глиоксилатного цикла в печени крыс в условиях совместного действия

аллоксана и водного экстракта оливы.

1 - изоцитратлиаза;

2 - малатсинтаза;

3 - цитратсинтаза;

4 — малатдегидрогеназа;

5 - аконитатгидратаза

изоцитратлиазной и малатсинтазной активностями, так как проявилось протекторное действие водного экстракта оливы. Уровень активности других ферментов совпадал со значениями активности энзимов в контрольном варианте. Похожая картина распределения ИЦЛ и МС по субклеточным фракциям наблюдается в тканях почек. Также как и в гепатоцитах максимальная активность ИЦЛ и МС обнаружена во фракции с плотностью градиента 1,25 г/см3 и максимальной активностью каталазы, т.е. во фракции микротелец. Однако, общая активность ключевых ферментов глиоксилатного цикла здесь в среднем в 1,3 - 1,5 раза ниже. При изучении субклеточной локализации остальных ферментов, обеспечивающих функционирование глиоксилатного цикла в гепатоцитах крыс, установлено, что увеличение активности МДГ, ЦС также связано с пероксисомальной фракцией. Активность МДГ и ЦС увеличивалась во фракции митохондрий и в цитозоле в 1,5 раза, тогда как увеличение их активности в пероксисомальной фракции достигает 6 и 7 раз соответственно.

В отличие от пероксисомальной фракции печени в пероксисомальной фракции почек экспериментальных животных не наблюдается существенного увеличения активности.

ОЧИСТКА И СВОЙСТВА МАРКЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПЕЧЕНИ И ПОЧЕК КРЫС ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

Очистка и свойства изоцитратлиазы из печени и почек крыс.

Последовательное применение нескольких стадий очистки позволило получить ферментный препарат ИЦЛ с удельной активностью 10,2 Е на мг белка, что соответствует очистке в 135 раз. Выход фермента составил 16%. Электрофоретические исследования полученных ферментативных препаратов изоцитратлиазы из печени крыс показали наличие лишь одной белковой полосы (при окрашивании на белок кумасси бриллиантовым голубым и амидочерным 10 В) с относительной электрофоретической подвижностью 0,34. Следовательно, полученный нами препарат был электрофоретически гомогенен (рис. 6). Выход активности изоцитратлиазы и общего белка при фракционировании на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (рис.7).

Субъеднннчное строение изоцитратлиазы. Получение в высокоочищенном состоянии фермента позволило исследовать их физико-химические, каталитические и регуляторные свойства. Было показано, что изоцитратлиаза является изологическим тетрамером, при этом молекулярная масса одной субъединицы равняется - 45 КДа.

Каталитические свойства изоцитратлиазы. рН оптимум изоцитратлиазы из печени экспериментальных крыс при определении в 50 мМ трис-НС1-буфере равен 7,5, в 50 мМ калий- фосфатном буфере - 7,4, а в 20 мМ трис-НЕРЕ8 оптимум рН составил 7,5. Как видно из графика, представленного на рисунке 17, наибольшая активность ИЦЛ из печени проявляется в трис-НС1-буфере. После выяснения общего характера зависимости активности ИЦЛ из печени и почек от рН среды были определены рК ионогенных групп данных ферментов, участвующие в катализе лиазной реакции. рК ионогенных групп ИЦЛ из печени, определенные путем построения графиков зависимости от рН,

составляют 7,1 и 7,9. Сходные значения получены и для фермента,

выделенного из почек крыс 7,1; 7,9. Таким образом, значения рК, полученные для ферментов из печени и почек, оказались схожими.

Рис. 6. Фотографии электрофореграмм изоцитратлиазы из печени (Л) и почек ( Б) экспериментальных крыс при окрашивании универсальным красителем на кумасси

Рис. 7. Выход активности изоцитратлиазы и общего белка при фракционировании на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

1 - Выход белка;

2 - Выход активности.

Очистка и свойства малатсингазы. Выделение МС из гепатоцитов крыс проводили по многостадийной схеме (табл.2). Вначале осуществляли фракционирование гомогената сульфатом аммония (0-30% насыщения). При этом большая часть МС выпадает в осадок. Отделение сульфата аммония проводили на колонке с сефадексом в-25. Наиболее активные фракции наносили на колонку с анионообменником ДЭАЭ-Ргак^е1, уравновешенную 10 ммоль/л трис-НС1 буфером, рН 7,4. Элюцию фермента проводили ступенчатым градиентом с шагом в 10 ммоль/л КС1, растворенным в 10 ммоль/л трис-НС1 буфере, рН 7,4. Элюируется МС с носителя при концентрации 70 - 80 ммоль/л КС1.

Таблица 2.

Очистка малатсинтазы из гепатоцитов крыс при экспериментальном диабете

Стадии очистки Активность, Е/мл Белок, мг Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат 11,987± 0,214 197,583± 5,819 0,059± 0,001 100 1

Фракционирование сульфатом аммония 0-30% насыщения 7,412± 0,165 44,929± 1,314 0,167± 0,002 65 2,8

Гель-фильтрация на сефадексе в-25 7,115± 0,112 31,677± 0,648 0,226± 0,006 59 3,8

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-фрактогеле 1,121± 0,039 0,369± 0,074 3,015± 0,112 9Д 51

Гель- хроматография на Тоуореаг! 1Ш-65 0,498± 0,011 0,118± 0,003 4,509± 0,091 4,0 76,5

Каталитические свойства малатсинтазы. В наших исследованиях показано, что МС, выделенная из печени и почек крыс, характеризуется кинетикой Михаэлиса-Ментен. Определение Км проводили по графикам двойных обратных величин. При этом один из субстратов брался в избытке.

Влияние метаболитов на активность малатсинтазы из печени и почек крыс. Малат, который является продуктом данной реакции, ингибирует МС по конкурентному типу. Значение для фермента из печени составило 4 мМ, для МС, выделенной из почек, 3,5 мМ. Кроме того обнаружено, что глюкозо-1-фосфат, фосфоенолпируват ингибируепг данный фермент по неконкурентному типу. К^ по глюкозо-1-фосфату для МС из печени и почек - 2,2 мМ и 2,0 мМ, а по фосфоенолпирувату - 3 мМ и 2,6 мМ, соответственно. Все константы ингибирования определялись по методу Диксона (Диксон, Уэбб, 1982).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании показаны сахароснижающие свойства листьев оливы европейской (Olea Europaea), что подтверждает гипогликемические характеристики этого известного растения. Аллоксан вызывает массивное уменьшение высвобождения инсулина в результате разрушения ß-клеток островков Лангерганса (Terazono et al., 1990). Интересно отметить, что ВЭО оливы европейской (Europaea Olea) в дозе (0,30 г/кг) эффективно предотвращает повышение уровня глюкозы крови. Поскольку аллоксан вызывает диабет, уничтожая ß-клетки, в настоящее время при исследовании оливы (ВЭО) было подтверждено наличие заметного антигипергликемического эффекта. Важно отметить значительное повышение уровня глюкозы крови у крыс с аллоксановым диабетом и снижение уровня глюкозы у крыс с аллоксановым диабетом, получавших ежедневно ВЭО. Наши данные подтверждают, что постоянное применение ВЭО в течение двух недель предотвращает повышение концентрации глюкозы в крови. Результаты настоящего исследования аналогичны данным, полученным в других лабораториях (Kumar, 1990; Nesseem et al., 2009), которые использовали водный экстракт полыни Herba Alba, Ziryphus spina-Christi, широко применяемый в народной медицине и установили значительное снижение уровня глюкозы у животных с сахарным диабетом.

Механизм гипогликемического действия до конца не ясен. Не исключено, что растение способно реверсировать метаболические особенности дефицита инсулина, снижать выброс глюкагона или увеличивать продукцию инсулина, стимулируя непосредственно гликолиз в периферических тканях, увеличивая утилизацию глюкозы из крови, или уменьшая всасывание глюкозы из желудочно-кишечного тракта.

Возможными действующими веществами являются содержащиеся в водном экстракте оливы олеуропеин, гидрокситирозол, олеуропеина агликон и тирозол. Наиболее активным компонентом листьев оливы считается экстракт олеуропеина, естественный продукт иридоидной группы. Биохимический механизм подавления гипергликемии с помощью олеуропеина до сих пор не выяснен (Saenz et al., 1998; Visioli et al., 1998; Corona et al., 2006; Manna et al., 2004).

В течение первой недели в группе животных с аллоксановым диабетом

была выявлена дегрануляция ¡3-клеток, что может быть спровоцировано введением аллоксана и согласуется с более ранними исследованиями (Ьеп§уе1 е1 а1., 2007). Дегрануляция Р-клеток обусловлена, в основном, депонированием гликогена, а наличие гликогена связано с выраженностью и продолжительностью гипергликемии (Ргаепке1 е! а1., 2008).

Для выяснения механизма действия ВЭО на развитие экспериментального диабета у животных важное значение имеют полученные в работе результаты по трансформации функционирования маркерных и ключевых ферментов глиоксилатного цикла.

Экстракт оливы, введенный крысам, нивелировал изменение ферментативной активности, обуславливающей протекание катаболических и анаболических процессов. Наибольшее увеличение ферментативной активности обнаружено для маркерных энзимов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. Причем, изменение профиля активности исследуемых ферментов коррелировало с длительностью экспозиции, наблюдавшейся после введения аллоксана в брюшную вену. Механизм протекторного действия ВЭО неизвестен. Хотя можно предположить влияние компонентов этого экстракта на трансформацию метаболических процессов в печени и почках экспериментальных крыс. По-прежнему считается, что ферменты глиоксилатного цикла могут индуцироваться в животном организме при интенсификации утилизации жиров (Лебкова, 2000; Епринцев и др., 2004). В наших экспериментах был применен такой экстремальный фактор, как сахарный диабет. Ранее было установлено, что в этих условиях организм переключается на метаболизацию запасных жиров и, следовательно, интенсифицируются процессы глюконеогенеза. Нами было показано, что в условиях экспериментального диабета происходит индукция активности ИЦЛ и МС в печени и почках крыс. Данный факт получил подтверждение, т.к. аллоксан индуцировал активность маркерных ферментов глиоксилатного цикла. Однако, в гепатоцитах и клетках почек крыс с аплоксановым диабетом, которым вводили ВЭО оливы европейской, происходило снятие данного эффекта (не обнаружена активность малатсинтазы и изоцитратлиазы).

По нашему мнению, увеличение активности ферментов может быть связано с дополнительным синтезом ферментов и появлением их новых

изоформ. У крыс в норме обнаружено два изофермента малатдегидрогеназы и три изоформы, обладающие аконитатгидратазной активностью.

Внутриклеточное распределение активности ИЦЛ и МС показало, что в пероксисомальной фракции гепатоцитов и клеток почек крыс с аллоксановым диабетом находится значительное количество их активности. Причем установлено увеличение как общей, так и удельной активности. У группы крыс с аллоксановым диабетом при введении ВЭО распределение активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла становилось аналогичным контрольным животным, что подтверждает протекторное действие водного экстракта оливы европейской на развитие биохимических изменений в экстремальных условиях (экспериментальный диабет). Очистка изоцитратлиазы и малатсинтазы подтвердила, что эти ферменты обнаруживаются только у крыс с индуцированным экспериментальным диабетом. Следует отметить, что важнейшее значение для получения гомогенных препаратов фермента сыграла ионообменная хроматография. Анализ данных по ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-фрактогеле позволяет заключить, что в почках и печени индуцируется по одной изоформе изоцитратлиазы и малатсинтазы.

Проведенные исследования позволяют предположить следующий биохимический механизм приспособления крыс к экспериментальному диабету. В данных патологических условиях в организме резко возрастает липолиз в жировой ткани и выход свободных жирных кислот. Периферические ткани интенсивно потребляют их как основной энергетический субстрат. В пероксисомах гепатоцитов и клеток крыс происходит р-окисление жирных кислот с образованием ацетил-КоА, который может метаболизироваться с помощью глиоксилатного цикла, о чем свидетельствует индукция маркерных и ключевых ферментов этого метаболического пути. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что водный экстракт оливы обладает гипогликолитическим действием, проявляющимся в резком снижении концентрации глюкозы в крови крыс при аллоксановом диабете. Протекторное влияние водного экстракта оливы обнаружено для островков поджелудочной железы. Выявлены биохимические аспекты действия ВЭО, проявляющиеся в

изменении функционирования ферментов глиоксилатного цикла у крыс с экспериментальным диабетом.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что повышение концентрации глюкозы в крови, индуцируемое экзогенным аллоксаном, у крыс полностью снимается пероральным введением водного экстракта листьев оливы. При этом наблюдается значительное снижение уровня глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом до нормальных значений.

2. Гистологические исследования показали, что островки Лангерганса у крыс с гипергликемией были сильно изменены (их общий размер увеличен). В группе крыс с аллоксановым диабетом, получавших водный экстракт оливы, были выявлены островки нормальной формы, похожие на островки в контрольной группе. Можно предположить, что водный экстракт оливы способен прямо или косвенно влиять на секрецию инсулина и других гормонов, связанных с метаболизмом глюкозы.

3. Выявлено, что при экспериментальном диабете наблюдается активация большинства ферментов глиоксилатного цикла и цикла трикарбоновых кислот в печени и почках крыс. При этом наблюдается индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. Перорапьное введение экстракта оливы крысам с экспериментальным диабетом снижает уровень активности исследуемых ферментов до нормальных значений.

4. Установлено, что увеличение активности малатдегидрогеназы, аконитатгидратазы и цитратсинтазы связано с появлением дополнительных изоформ. При этом применение водного экстракта оливы блокирует образование новых изоформ ферментов у крыс с экспериментальным диабетом.

5. Субклеточная локализация маркерных ферментов глиоксилатного цикла (изоцитратлиазы и малатсинтазы) в печени и почках крыс с аллоксановым диабетом связана, главным образом, с пероксисомальной фракцией. Использование водного экстракта оливы в качестве сахароснижающего вещества приводит к исчезновению

изоцитратлиазной и мапатсинтазной активности в пероксисомах гепатоцитов и клеток почек.

6. Получение в электрофоретически гомогенном состоянии изоцитратлиазы и малатсинтазы из печени и почек экспериментальных крыс (удельная активность составляла 11,9 Е/мг белка и 10 Е/мг белка для изоцитратлиазы и 4,5 Е/мг белка и 4,0 Е/мг белка для малатсинтазы) позволило исследовать их физико-химические и каталитические характеристики. Показано, что каталитическое действие маркерных ферментов подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен.

7. На гомогенных препаратах изоцитратлиазы из печени и почек крыс с аллоксановым диабетом установлено, что фермент состоит из четырех одинаковых субъединиц с Mr 46 кДа, то есть является гомотетрамером.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аль Дайни Саба X. Зависимость биохимического состава экстракта из листьев Olea Europaea от способа его получения / Аль Дайни Саба X., А.Т. Епринцев, H.A. Карпеченко // «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». Воронежский государственный университет. -Воронеж. - 2010. - С.188-192.

2. Аль Дайни Саба X. Регуляция аконитазной активности в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального аллоксанового диабета / Аль Дайни Саба X., H.A. Карпеченко, В.Ю. Башмаков, А. Саба X. // Материалы международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии». -Санкт-Петербург. - 2010, № 1, секция 2. - С.99-100.

3. Аль Дайни Саба X. Изменение активности некоторых ферментов цикла Кребса в различных органах крыс с аллоксановым диабетом / Аль Дайни Саба X., В.Ю. Башмаков, М.Ю. Сыромятников, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. ВГУ. - 2011. -Выпуск 11. С.134-137.

4. Аль Дайни Саба Хади Бенайед. Оценка влияния водного экстракта листьев оливы на концентрацию глюкозы и показатели липидного профиля в плазме крыс с аллоксановым диабетом / Аль Дайни Саба Хади Бенайед //Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. -Воронеж. - 2011. - С.315-319.

5. Аль Дайни Саба Хади Бенайед. Гиполипидемические эффекты водного экстракта листьев оливы у крыс с аллоксан-индуцированным диабетом / Аль Дайни Саба Хади Бенайед, А.Т. Епринцев // Перспективы науки. - Тамбов. - 2011. - С.287-291 (ВАК).

6. Аль Дайни Саба Хади Бенайед. Анализ влияния витамина С, содержащегося в листьях Olea Europaea, на уровень основного метаболизма и липидный профиль у крыс с аллоксановым диабетом / Аль Дайни Саба Хади Бенайед, А.Т. Епринцев // Перспективы науки. - Тамбов. - 2012. - № 5[32]. - С.358-360.

7. Аль Дайни Саба X. Протекторное действие экстракта из листьев Olea Europaea при индукции экспериментального диабета в гепатоцитах крыс / Аль Дайни Саба X., М.Ю. Сыромятников, А.Т. Епринцев // Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы. Материалы Х-ой международной научно-практической конференции. Воронеж, Изд-во «Научная книга». - 2012. - С.358.

8. Аль Дайни Саба X. Трансформация функционирования ферментных комплексов при аллоксановом диабете / Аль Дайни Саба X. // Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы. Материалы Х-ой международной научно-практической конференции. Воронеж, Изд-во «Научная книга». - 2012. - С.359.

9. Аль Дайни Саба Хади. Индукция дополнительных изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени крыс в условиях аллоксанового диабета / Аль Дайни Саба Хади, М.Ю. Сыромятников, А.Т. Епринцев // Вестник Воронежского госуниверситета. Серия Химия, биология, фармация. - 2012. - С.176-181.

10. Епринцев А.Т. Особенности функционирования аконитатгидратазной ферментной системы в органах крыс в условиях аллоксанового диабета / А.Т. Епринцев, X. Аль Дайни Саба, М.Ю. Сыромятников, М.А. Гати // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - № 3. - С.38-44.

11. Аль Дайни Саба X. Выделение и очистка малатсинтазы из гепатоцитов крыс при экспериментальном диабете / X. Аль Дайни Саба, А.Т. Епринцев //Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. -Воронеж. - ВГУ. - 2012. - С.159-165.

Работы №5, №6, №9 и №10 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Подписано в печать 23,11.12. Формат 60*84 Усл. печ. л. 1,45. Тираж 100 экз. Заказ 1096.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аль Дайни Саба Хади Бенайед

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Использование водного экстракта оливы для лечения сахарного диабета.

1.1.1. Понятие об аллоксановом диабете.

1.1.2. Биохимические аспекты протекторного действия водного экстракта оливы.

1.2. Метаболизм жирных кислот у млекопитающих при экстремальных и патологических состояниях.

1.2.1 .Утилизация запасных липидов при диабете.

1.2.2. Мобилизация плазменных свободных жирных кислот в тканях млекопитающих при диабете.

1.3. Биохимия глюконеогенетических процессов.

1.3.1. Изменение глюконеогенетических реакций при экспериментальном диабете.

1.3.2. Регуляция гормонами глюконеогенеза на ферментативном уровне.

1.3.3. Биохимические особенности метаболизма в пероксисомах.

1.3.4. Микротельна (пероксисомы) и их метаболическая функция.

1.3.5. Морфология и индукция пероксисом.

1.4. Глиоксилатный цикл как промежуточный этап глюконеогенеза.

1.4.1. Биохимические аспекты функционирования глиоксилатного цикла.

1.4.2. Внутриклеточное распространение глиоксилатного цикла.

1.4.3. Экспрессионная регуляция функционирования глиоксилатного цикла.

1.4.4. Глиоксилатный цикл в тканях животных.

1.5. Ключевые и маркерные ферменты глиоксилатного цикла.

1.5.1. Очистка и изучение свойств изоцитратлиазы из различных организмов.

1.5.2. Характеристики малатсинтазы из различных организмов.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Формирование модели аллоксанового диабета у крыс.

2.2.2. Приготовление препаратов поджелудочной железы и печени.

2.2.3. Получение водного экстракта из листьев оливы.

2.2.4. Выделение клеточных органелл.

2.2.5. Определение активности ферментов.

2.2.6. Выделение и очистка ферментов.

2.2.7. Экстракция.

2.2.8. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония.

2.2.9. Гель-фильтрация.

2.2.10. Ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

2.2.11. Гель-хроматография на колонке с сефадексом в-150.

2.2.12. Гель-фильтрация на Тоуореаг11Г\¥-65.

2.2.13. Исследование кинетических характеристик ферментов.

2.2.14. Аналитический электрофорез.

2.2.15. Определение гомогенности ферментов.

2.2.16. Специфическое проявление МДГ.

2.2.17. Определение молекулярной массы.

2.2.18. Определение количества белка.

2.2.19. Статистическая обработка экспериментальных данных.

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.3.1. Доказательство индукции экспериментального диабета у крыс.

2.3.2. Гистологический анализ образцов печени крыс в норме и при аллоксановом диабете.

2.3.3. Индукция и локализация ферментов глиоксилатного цикла в тканях крыс в условиях аллоксанового диабета и при введении водного экстракта оливы.

2.3.3.1. Активность ключевых ферментов центральных метаболических путей в печени и почках крыс.

2.3.3.2. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в тканях крыс.

2.3.3.3. Распределение ключевых ферментов глиоксилатного цикла в разных тканях крыс.

2.3.3.4. Изоферментный состав ключевых ферментов глиоксилатного цикла у крыс в различных условиях.

2.3.3.5. Субклеточная локализация маркерных ферментов глиоксилатного цикла в печени и почках крыс.

2.4. Очистка и свойства маркерных ферментов из печени и почек крыс при аллоксановом диабете.

2.4.1. Очистка изоцитратлиазы из печени и почек крыс.

2.4.2. Субъединичное строение изоцитратлиазы.

2.4.3. Каталитические свойства изоцитратлиазы.

2.5. Очистка и свойства малатсинтазы из печени крыс.

2т5т1т Выделение и~очистка^ малатсинтазы г.г.гг.

2.5.2. Каталитические свойства малатсинтазы.

2.5.3. Влияние метаболитов на активность малатсинтазы из печени и почек крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние водного экстракта оливы европейской (Olea Europaea) на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс в условиях экспериментального диабета"

Подробные исследования эффективности гидрокситирозола, выделенного из листьев оливкового дерева, в отношении моделирования оксидативного стресса, ассоциированного с сахарным диабетом у экспериментальных животных, отсутствуют. Следовательно, настоящее исследование было проведено для изучения возможных гипогликемических и сахароснижающих эффектов водного экстракта листьев оливы. Измененияметаболизма липидовилипопротеинов на фонесахарного диабета связаны с трансформацией функционирования глиоксилатного цикла. Ранее на кафедре была установлена возможность индукции ключевых ферментов глюконеогенеза в печени и почках крыс при голодании и экспериментальном диабете (Епринцев и др., 2007). Особый интерес вызывает функционирование изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1), малатсинтазы (КФ 4.1.3.2) и других ключевых ферментов в разных органах крыс при экспериментальном диабете на фоне введения в организм животного водного экстракта оливы европейской. Выяснение механизма изменения активности маркерных и ключевых ферментов глиоксилатного цикла открывает перспективы для разработки модели адаптивной реакции клеточного метаболизма, включающей «ферментативную» оборону, что обеспечивает адаптацию организма к сахарному диабету.

3. Проведение гистологических исследований печени и поджелудочной железы у контрольных крыс, животных, подвергшихся аллоксановому диабету, и крыс с аллоксановым диабетом, получавших водный экстракт оливы европейской.

Научная новизна. Показано, что экспериментальный диабет, вызывающий индукцию изоцитратлиазы и малатсинтазы, в гепатоцитах и клетках почек крыс, полностью блокируется введением водного экстракта листьев оливы европейской (Olea Europea). Протекторное действие экстракта оливы проявляется в снятии индукции маркерных ферментов глиоксилатного цикла, в частности, их активность отсутствует в печени и почках. При введении водного экстракта листьев оливы наблюдается уменьшение размера островков по сравнению с панкреатическими островками у крыс с аллоксановым диабетом. Получены гомогенные препараты изоцитратлиазы и малатсинтазы из тканей крыс с аллоксановым диабетом. Показано, что при экспериментальном диабете происходит образование новых изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, локализованных в пероксисомальной фракции гепатоцитов, при этом их индукция полностью снимается при введении водного экстракта оливы крысам.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на IV Международной научно-практической конференции «Наука на рубеже тысячелетия», Барселона -Санта Сусанна, Испания, 2012; на III международной научно-практической конференции «Роль науки в развитии общества», Хургада, Египет, 2011; на международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии», Санкт-Петербург, 2010; на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи; на Х-ой международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы»; межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2010-2012 гг.); ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в одиннадцати публикациях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Аль Дайни Саба Хади Бенайед

ВЫВОДЫ

3. Выявлено, что при экспериментальном диабете наблюдается активация большинства ферментов глиоксилатного цикла и цикла трикарбоновых кислот в печени и почках крыс. При этом наблюдается индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. Пероральное введение экстракта оливы крысам с экспериментальным диабетом снижает уровень активности исследуемых ферментов до нормальных значений.

6. Получение в электрофоретически гомогенном состоянии х<> изоцитратлиазы и малатсинтазы из печени и почек экспериментальных крыс (удельная активность составляла 11,9 Е/мг белка и 10 Е/мг белка для изоцитратлиазы и 4,5 Е/мг белка и 4,0 Е/мг белка для малатсинтазы) позволило исследовать их физико-химические и каталитические характеристики. Показано, что каталитическое действие маркерных ферментов подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен.

7. На гомогенных препаратах изоцитратлиазы из печени и почек крыс с аллоксановым диабетом установлено, что фермент состоит из четырех одинаковых субъединиц с Мг 46 к Да, то есть является гомотетрамером.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании показаны сахароснижающие свойства листьев оливы европейской {Olea Europaea), что подтверждает гипогликемические свойства этого известного растения. Аллоксан вызывает массивное уменьшение высвобождения инсулина в результате разрушения (3-клеток островков Лангерганса (Terazono et al., 1990). Интересно отметить, что водный экстракт листьев оливы европейской {Europaea Olea) в дозе (0,30 г/кг) эффективно предотвращает повышение уровня глюкозы крови. Поскольку аллоксан вызывает диабет, уничтожая [3-клетки, в настоящее время при исследовании водного экстракта листьев оливы (ВЭО) было подтверждено наличие заметного антигипергликемического эффекта. Важно отметить значительное повышение уровня глюкозы крови у крыс с аллоксановым диабетом и снижение уровня глюкозы у крыс с аллоксановым диабетом, получавших ежедневно ВЭО. Результаты данного исследования подтверждают, что постоянное применение ВЭО в течение двух недель предотвращает повышение уровня глюкозы в крови. Наши результаты согласуются с данными, полученными другими исследователями (Cardinal et al., 2001), поскольку они подтвердили значительное снижение уровня глюкозы в крови на 21 день у крыс в группе с аллоксановым диабетом, которым ежедневно давали чернику в ходе проведения исследования в Италии. Настоящее исследование свидетельствует в пользу гипогликемического действия Ziryphus spina-Christi - растения, используемого в народной медицине Египта, применение которого приводит к снижению уровня глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом (Nesseem et al., 2009).

Стойкая гипергликемия может объясняться отсутствием продукции инсулина в разрушенных (3-клетках. Значительное увеличение уровня глюкозы в группе животных с аллоксановым диабетом по сравнению с контрольной группой согласуется с результатами, полученными другими авторами (GruBner et al., 1993). Тем не менее, нет подтвержденных исследованиями данных, доказывающих антидиабетические свойства водного экстракта листьев оливы. Результаты настоящего исследования аналогичны данным, полученным в других лабораториях (Kumar, 1990), которые использовали водный экстракт полыни Herba Alba, широко применяемый в народной медицине, в дозе 0,39 г/кг массы тела в течение 2-4 недель, после чего было установлено значительное снижение уровня глюкозы у животных с сахарным диабетом. В ходе их исследования было установлено неизменное снижение уровня глюкозы в крови во время лечения растительным экстрактом полыни. В нашей работе было подтверждено, что водный экстракт листьев оливы в используемой дозе приводит к значительному снижению уровня глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом. Механизм гипогликемического действия до конца не ясен. Не исключено, что растение способно реверсировать метаболические особенности дефицита инсулина, снижать выброс глюкагона или увеличивать продукцию инсулина, стимулируя непосредственно гликолиз в периферических тканях, увеличивая утилизацию глюкозы из крови, или уменьшая всасывание глюкозы из желудочно-кишечного тракта.

Возможными действующими веществами являются содержащиеся в водном экстракте оливы олеуропеин, гидрокситирозол, олеуропеина агликон и тирозол. Основными фенольными соединениями листьев оливы являются гликозилированные формы олеуропеина и лигстрозида. Наиболее активным компонентом листьев оливы считается экстракт олеуропеина, естественный продукт иридоидной группы. Механизм подавления гипергликемии с помощью олеуропеина до сих пор не изучен (Saenz et al., 1998; Visioli et al., 1998; Corona et al., 2006; Manna et al., 2004).

В течение первой недели в группе животных с аллоксановым диабетом была выявлена дегрануляция ß-клеток, что может быть спровоцировано введением аллоксана и согласуется с более ранними исследованиями (Ьеп§уе1 е1 а1., 2007). Дегрануляция (З-клеток обусловлена, в основном, депонированием гликогена, а наличие гликогена связано с выраженностью и продолжительностью гипергликемии (Ргаепке1 е1 а1., 2008).

Панкреатические островки в группе животных с аллоксановым диабетом, получавших ВЭО, были обычной формы с отсутствующей дегрануляцией, означающей, что не все островки или не все (3-клетки подвергаются воздействию с одинаковой скоростью, поскольку небольшая х<> площадь островка оказалась почти неизмененной при гистологическом исследовании. В конечном итоге, островки у крыс с гипергликемией были сильно изменены, их общий размер постепенно увеличивался пропорционально длительности и тяжести гипергликемии. К концу второй недели панкреатические островки животных группы с аллоксановым диабетом подверглись гипертрофии и гиперплазии, причем гипертрофия наблюдалась до последнего этапа. Островки были правильной формы, с гипертрофированными клетками и легкими ядрами, обнаруживались редкие атрофированные островки с плотными, по сравнению с контрольной группой, ядрами. В группе с аллоксановым диабетом, получавшей ВЭО, были выявлены островки нормальной формы, похожие на островки в контрольной группе. В течение последнего этапа панкреатические островки у экспериментальных животных с аллоксановым диабетом претерпевали непрерывную гипертрофию и гиперплазию. При проведении настоящего исследования было продемонстрировано влияние ВЭО на островки поджелудочной железы и коррелируемые изменения уровня глюкозы крови. Существует вероятность того, что ВЭО способен прямо или косвенно влиять на секрецию инсулина. Для выяснения этого необходимо проведение дальнейших исследований для исследования влияния ВЭО на секрецию инсулина и других гормонов, "связанных с метаболизмом глюкозы".

Для выяснения механизма действия ВЭО на развитие экспериментального диабета у животных важное значение имеют полученные результаты по трансформации функционирования маркерных и ключевых ферментов глиоксилатного цикла.

Экстракт оливы, введенный крысам, нивелировал изменение ферментативной активности, обуславливающей протекание катаболических и анаболических процессов. Наибольшее увеличение ферментативной активности обнаружено для маркерных энзимов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. Причем, изменение профиля активности исследуемых ферментов коррелировало с длительностью экспозиции, наблюдавшейся после введения аллоксана в брюшную вену. Механизм протекторного действия ВЭО неизвестен. Хотя можно предположить влияние компонентов этого экстракта на трансформацию метаболических процессов в печени и почках экспериментальных крыс. По-прежнему считается, что ферменты глиоксилатного цикла могут индуцироваться в животном организме при интенсификации утилизации жиров (Лебкова, 2000; Епринцев и др., 2004). В наших экспериментах был применен такой экстремальный фактор, как сахарный диабет. Ранее было установлено, что в этих условиях организм переключается на метаболизацию запасных жиров и, следовательно, интенсифицируются процессы глюконеогенеза. На нашей кафедре было показано, что в условиях экспериментального диабета происходит индукция активности ИЦЛ и малатсинтазы в печени и почках крыс. Данный факт получил подтверждение, т.к. аллоксан индуцировал активность маркерных ферментов глиоксилатного цикла. Однако, в гепатоцитах и клетках почек крыс с аллоксановым диабетом, которым вводили водный экстракт листьев оливы европейской, происходило снятие данного эффекта. У данной группы животных не обнаружена активность малатсинтазы и изоцитратлиазы.

По нашему мнению, увеличение активности ферментов может быть связано с дополнительным синтезом ферментов и появлением их новых изоформ. У крыс в норме обнаружено два изофермента малатдегидрогеназы и три изоформы, обладающие аконитатгидратазной активностью. Полностью отсутствует активность маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. В печени крыс в условиях экспериментального диабета происходит индукция маркерных ферментов глиоксилатного пути и перестройка изоферментного состава других ключевызР ферментов центральных метаболических путей - малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы. Наблюдается сопряженное с увеличением активности этих энзимов увеличение количества их изоформ.

Внутриклеточное распределение активности ИЦЛ и малатсинтазы показало, что в пероксисомальной фракции гепатоцитов и клеток почек крыс с аллоксановым диабетом находится значительное количество их активности. Причем установлено увеличение как общей, так и удельной активности. У группы крыс с аллоксановым диабетом при введении ВЭО распределение активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла становилось аналогичным контрольным животным, что подтверждает протекторное действие водного экстракта оливы европейской на развитие биохимических изменений в экстремальных условиях (экспериментальный диабет). Очистка изоцитратлиазы и малатсинтазы подтвердила, что эти ферменты обнаруживаются и можно выделить только у крыс с индуцированным экспериментальным диабетом. Следует отметить, что важнейшее значение для получения гомогенных препаратов фермента сыграла ионообменная хроматография. Анализ данных по ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-фрактогеле позволяет заключить, что в почках и печени индуцируется по одной изоформе изоцитратлиазы и малатсинтазы. Проведенные исследования позволяют предположить следующий биохимический механизм приспособления крыс к экспериментальному диабету. В данных патологических условиях в организме резко возрастает липолиз в жировой ткани и выход свободных жирных кислот. Периферические ткани интенсивно потребляют их как основной энергетический субстрат. В пероксисомах гепатоцитов и клеток крыс происходит (3-окисление жирных кислот с образованием ацетил-КоА, который может метаболизироваться с помощью глиоксилатного цикла, о чем свидетельствует индукция маркерных и ключевых ферментов этого хо метаболического пути. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что водный экстракт оливы обладает гипогликолитическим действием, проявляющимся в резком снижении концентрации глюкозы в крови крыс при аллоксановом диабете. Протекторное влияние водного экстракта оливы обнаружено для островков поджелудочной железы.

Выявлены биохимические аспекты действия ВЭО, проявляющиеся в изменении функционирования ферментов глиоксилатного цикла у крыс с экспериментальным диабетом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аль Дайни Саба Хади Бенайед, Воронеж

1. Баженов Ю.И., Горбачева Л.Р., Ритов В.Б. Влияние адаптации к холоду на липидный обмен и транспортные функции мембран скелетных мышц // Российский физиол. журнал. 1998. -Т.84, №1. -С. 125-132.

2. Волкова О.В. и Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. М. : Медицина, 1971.

3. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. -М.: Наука, 1982. -312 с.

4. Демченко И.Т. Физиология экстремальных состояний // Успехи физиол. наук. -1994.-Т.25, №2.-С.97-103.

5. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев: Наукова думка, 1973. - 273 с.

6. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. - 252 с.

7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. -М.: Мир, 1982. -Т.З. -С.1118

8. Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У. Активность и изоформы малатдегидрогеназы в высоко и низко масличных сортах кукурузы // Физиология растений. 1995. -Т.42, -ВЫП.5.-С.759-764.

9. Епринцев А.Т. Очистка и некоторые свойства аконитатгидратазы из щитков кукурузы / А.Т. Епринцев, Л.А Землянухин, М.П. Алексюк // Биохимия. 1995. - 80, № 8. - С. 1244-1250.

10. Епринцев А.Т. Индукция аконитатгидратазы в гепатоцитах голодающих крыс А.Т. Епринцев, Е.В. Семенова, В.Н. Попов // Биохимия. -2002. Т.67. - № 7. - С.956-966.

11. Епринцев А.Т. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов // Биохимия. 2004. - Т.69, № 4. - С. 467-472.

12. Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации?/ А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. - 228 с.

13. Епринцев А.Т. Углеводный метаболизм в печени крыс при пищевой депривации и экспериментальном диабете/ А.Т. Епринцев, М.Ю. Шевченко, В.Н. Попов // Известия РАН, серия биологическая. 2008. - № 1.- С. 115118.

14. Епринцев А.Т. Особенности структурной организации и экспрессионной регуляции изоформ малатдегидрогеназы из Rhodobacter sphaeroides Штамма 2г / А.Т. Епринцев и др. // Биохимия. 2009. - Т.74, вып. 7. - С. 977-984.хо

15. Епринцев А.Т. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы бактерий Sphaerotilus sp. Штамм Д-507 в зависимости от типа питания / А.Т. Епринцев и др. //Известия РАН, сер. биологическая. 2009. - № 3. - С. 269-275.

16. Ермолаева Н.П. Регуляция глюконеогенеза в онтогенезе. М.: Наука, 1987. - 168 с.

17. Глиоксилатный цикл растений./ Землянухин A.A., Землянухин JI.A., Епринцев А. Т., Игамбердиев А.У. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1986. -148 с.

18. Землянухин A.A., Игамбердиев А.У. Регуляция активности изоцитратлиазы в растениях конопли // Физиология растений. 1985. - Т.32, -Вып.4. - С.739-746.

19. Землянухин JI.A., Игамбердиев А.У., Землянухин A.A. Очистка и свойства изоцитратлиазы из подсолнечника // Биохимия. -1984. Т.49, -Вып.З. - С.387-393.

20. Землянухин JI.A., Игамбердиев А.У., Преснякова E.H. Выделение и характеристика изоцитратдегидрогеназы из щитка кукурузы // Биохимия. -1986. -Т.51,-Вып.З.-С.442-448.

21. Иванов К.П. Основы энергетики организма. Теоретические и практические аспекты.- СПб.: Наука, 1992. 272 с.

22. Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений. -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1990. 148 с.

23. Игамбердиев А.У., Землянухин A.A. Исследование кинетических свойств и модификаций аминокислотных остатков изоцитратлиазы из щитка кукурузы // Биохимия. 1987. - Т.52, - Вып. 8. - С. 1286-1293.

24. Игамбердиев А.У., Землянухин A.A., Мещерякова И.В. Внеглиоксисомальная форма изоцитратлиазы высших растений // Физиология растений. 1986. -Т. 33, - Вып. 6.-С. 1113-1120.

25. Игамбердиев А.У., Иванов Б.Ф., Родионова Окисление сукцината в глиоксисомах щитка кукурузы // Физиология растений. 1990. -Т.37, - Вып.З. - С.505-510.

26. Калабухов Н.И. Спячка животных. Хорьков: Изд-во Харьковского ун-та, 1975.- 184 с.

27. Климова М.А. Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств / М.А. Климова, А.Т. Епринцев //Учебно-методическое пособие для вузов (практикум). Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 2008. - 34с.

28. Козырева Т.В., Верхогляд JI.A. Адаптация к холоду и структура терморегуляционного ответа при медленном и быстром охлаждении // Российский физиол. журнал. 1997. -№14. - С.135-141.

29. Кондрашева М.Н. Родионова М.А. Реализация глиоксилатного цикла в митохондриях ткани животных // Докл. АН СССР. 1971. - Т. 196, №5. - С. 1225-1227.

30. Коржевский Д. Э. Применение гематоксилина в гистологической технике. Морфология. - 2007. - Т. 132. - №6. - С. 77 - 81.

31. Лакин Г.Ф. Биометрия. М: Высшая школа, 1980. - 293 с.

32. Лебкова Н.П. Изучение субклеточной локализации УДФ-глюкозилтрансферазы в печени голодающих крыс // Цитология. 1985. -Т.27, №2. - С.35-40.

33. Лебкова Н.П. Субклеточная локализация карнитинацилтрансферазы в клетках различных органов интактных и голодающих крыс // Бюлл. экспер. и биол. медицины. 1983. - №7. - С.32-35.

34. Лебкова Н.П. Субстратное обеспечение энергетического гомеостаза при голодании // Бюлл. экспер. и биол. медицины. 1991. - № 11.- С475-479.

35. Лебкова Н.П. Трансформация липидов в гликоген в клетках животных и человека //Архив патологии. 1981. - №2. - С .71-77.

36. Лебкова Н.П., Чижов А.Я. Ультраструктурные и цитохимическиехоизменения в печени крыс при тренировке к гипоксии // Бюлл. экспер. биол. и медицины. 1992. -№6.-С663-666.

37. Лебкова Н.П. Современные представления о внутриклеточных механизмах обеспечения энергетического гомеостаза в норме и при патологии / Н.П. Лебкова // Вестник РАМН. 2000. - № 9. - С. 3-12.

38. Лили Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. -М.: Мир, 1969. С. 102 - 108, 157 - 167.

39. Майланов И.С. Температурная компенсация у гомойотермных животных // Российский физиол. журнал. 1997. - №9. - С. 102-110.

40. Ньюсхолм Э., Старт К. Регуляция метаболизма. М.: Мир, 1977. 247с.

41. Пинейру де Карвалью М.А., Землянухин A.A., Епринцев А.Т. Малатдегидрогеназа высших растений. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1991. -216 с.

42. Родина Е.А., Василевская Л.С. Действие среднецепочечных триглицеридов на секреторную функцию печени // Успехи физиол. наук. -1994. Т.25, №4. - С.38-45.

43. Саркисов Д. С. и Перов Ю.Л. Микроскопическая техника (руководство для врачей и лаборантов).- М.: Медицина, 1996.

44. Скулачев В.П. Понижение внутриклеточной концентрации 02 является специфической функцией дыхательной системы клетки // Биохимия. 1994. - Т.59,№12.-С. 1910-1912.

45. Смирнов К.В. Физиология пищеварения // Успехи физиол. наук. -1994. Т.25, №2.-С.69-75.

46. Спиридонов В.Н., Воробьева М.Ф. Влияние стимуляции и повреждения афферентных нервов на содержание глюкозы и свободных жирных кислот в крови крыс при изменении гликемии // Российский физиол. журнал. 1998. - Т.83, №12. -С.1433-1439. х<>

47. Ткачев А.В., Клярина И.М., Исаев А.И. Влияние гормональной активности щитовидной железы и инсулярного аппарата на уровень глюкозы у человека // Российский физиол. журнал. 1998. - Т.84, №5. - С.521-527.

48. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. -М.:Мир, 1986.-376 с.

49. Шустов Е.Б. Физиология экстремальных состояний. -СПб.: Наука, 1998. 247с.

50. Abeysinghe S.L., Baker Р.J., Rice D.W. Use of chemical modification in the crystallization of isocitrate lyase from E. coli // J. Mol. Biol. 1991. - V.220, №1. -P.13-16.

51. Adamo A.M., Aloise P.A., Pascuini J.M. // Int. J. Dev. Neurosci. -1986. -V.l l.-P. 13-17.

52. Al-Azzawie HF, Alhamdani MS. Hypoglycemic and antioxidant effect of oleuropein in alloxan-diabetic rabbits. Life Sci. 2006;78:1371-7.

53. Baumgart E., Volkl. A., Hashimoto T. Metabolism of peroxisomes // J. Cell Biol. 1989. -V.108.-P.2221-2231.

54. Beale E.G., Hartley J.L., Granner D.K. Dibutyryl cyclic AMP and glucose regulated the a mouth of messenger RNA coding for hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase // J. Biol. Chem. 1982. - V.257. - P.2022-2028.

55. Beeckmans S., Khan A.S., Van Drissche E. Specific association between the glyoxylic acid cycle enzymes isocitrate lyase and malate synthase // Eur. J. Biochem. -1994. V.224, № 1. -P. 197-201.

56. Beevers H. Microbodies in higher plants // Ann. Rev. Plant Physiol. -1979. -V.30. P.159-193. x<>

57. Behari R. Baker A. The carboxylterminus of isocitrate lyase is not essential for import intro glyoxysomes in an in vitro system // J. Biol. Chem. -1993. -V.268, №10. P.7315-7322.

58. Behrends W., Birghan R., Kindl H. Transition from of microbodies overlapping of to sets of marker proteins during the rearrangement of glyoxysomes in to leaf peroxisomes // J. Biol. Chem. -1990. -V.371, №1. -P.85-94.

59. Benevides J.M., Tremblay G.C., Hammen C.S. Determination of isocitrate lyase and malate synthase activities in a marine bivalve mollusk by new method of assay // Сотр. Biochem. Physiol. -1989. -V.94, №4. -P.779-782.

60. Bowden L., Lord J.M. Purification and comparative properties of microsomal and glyoxysomal malate synthase caster bean endosperm // Plant Physiol. -1978. -V.61, №2. P.259-265.

61. Bowger P., De Lucas J.R., Turher G. Regulation of the expression of the isocitrate lyase gene (acu D) of Aspergillus nidulans // Mol. Gen. Genet. -1994. -V.242, №4. -P.484-489.

62. Brown D.F., Olivecrona T. The effect of glucose availa bility and utilization on chilomicron metabolism in the rat // Acta Physiol. Scand. -1989. -V.66. -P.9-18.

63. Bruinenberg P.G., Blaauw ML, Kazemir B. Cloning and sequencing of the malate synthase gene from Hansenula polymorpha // Yeast. -1990. -V.3, №6. -P.245-254.

64. Burchell A. Burchell B. Identification and purification of a liver microsomal glucose-6-phosphatase // Biochem. J. -1982. -V.205, №3. -P.567-573.

65. Butcher R.W., Baird C.E., Sutherland E.W. Effect of lipolitic and antilipolitic substances on adenosine-3.5-monophosphate levels in isolated fat cell // J. Biol. Chem. -1978. V.243.-P.1705-1712.

66. Carlson L.A. Inhibition of the mobilization of free fatty acid from adipose tissue // Ann. N.Y. Acad. Sci. -1985. -V.131. -P.l 19-142.

67. Caterson I.D., Fuller S.G., Randle P.J. Effect of the fatty oxidation inhibitor 2-tetradecylglycidic acid on pyruvate dehydrogenase complex activity in starved and alloxan-diaetic // Biochem J. -1982. -V.208, №1. -P.53-60.

68. Chan M. Sim T.S. Malate synthase from Streptomyces claviligerus NRPL3585: cloning, molecular characterization and its control by acetate // Microbiol. -1998. -V.l 1, №144. -P.3229-3237.

69. Chell R.M., Sundaram T.K. Structural basis of the thermostability of monomeric malate synthase from a thermophylic Bacillus // Bacteriol. -1978. -V.135, №2. -P.334-341.

70. Chiou A, Salta FN, Kalogeropoulos N, Mylona A, Ntalla I, Andrikopoulos NK. Retention and distribution of polyphenols after pan-frying of French fries in oils enriched with olive leaf extract. J Food Sci. 2007;72:S574-84.

71. Chock P.B., Rhee S.G., Stadtman E.R. Interconvertible enzyme cascades in cellular regulatin // Ann. Rev. Biochem. -1980. -V.49. -P.813-843.

72. Claus T.H., Pielkis S. Fructose 2, 6-bisphosphate levels are elevated in livers of genetically obese mice // Biochem. and Biophys. Res. Communs. -1982. -V.109, №3. P.664-668.

73. Colonna W.J., Mc Fadden B.A. Isocitrate lyase from parasitic and free-living nematodes // Arch. Biochem. Biophys. -1975. -V.170, №4. -P.608-619.

74. Cook J.R. Properties of partially purified malate synthase from E. gracilis // J. Protozool. -1970. -V.17, №2 -P.232-235.

75. Cooper T.G., Beevers H. Mitochondria and glyoxysomes from castor bean endosperm // J. Biol. Chem. -1969. -V.244, №13. -P.3507-35^

76. Cortay J.C, Negre D., GalinierA. Regulation of the acetate operon in E. coli: purification and functional characterization of the ICL R repressor // EMBO J. —1991. — V.103.-P.675-679.

77. Courtois-Verniguest F., Douce R. Lack of aconitase in glyoxysomes and peroxisomes // Biochem. J. -1993 -V.294, Pt.l. -P. 103-107.

78. Davis W.J., Goodman D.B.P., Crawford L.A. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue // Biochim. Biophys. Acta. -1990. V.1051.-P.276-278.

79. Davis W.L., Goodman D.B.P. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver // Anat. Rec. -1992. -V.234. -P.461-468.

80. Davis W.L., Jones J.L., Matthews G.R. The identification of glyoxylate cycle enzymes in chick liver the effect of vitamin D3: cytochemistry and biochemistry // Anat. Rec. -1990.-V.227.-P.271-284.

81. Davis W.L., Jones R.G., Farmer E. The glyoxylate cycle in rat epiphysial cartilage: the effect of vitamin D3 on the activity of the enzymes isocitrate lyase and malate synthase // Bone.-1989.-V.10. -P.201-206.

82. Davis W.L., Matthews G.R., Goodman D.B.P. Glyoxylate cycle in rat liver: effect of vitamin D3 treatment // FASEB J. -1988. -V.3. -P.1651-1655.

83. De Duve C Microbodies in the living cell // Sci. Mer. -1983 -V.248, №5. -P.52-62.

84. De Duve C, Baughuin P. Peroxisomes (microbodies and related particles) // Phisiol. Rev. -1966. -V.46(2). -P.323-357.

85. De Lucas J.R., Gregory S., Turner G. Analysis of the regulation of the Aspergillus nidulans acuD gene, encoding isocitrate lyase, by constriction of a hybrid promoter // Mol. Gen. Genet. -1994. -V.243, №6. -P.654-6^

86. Dole V.P. The significance of nonesterified fatty acid in plasma // Arch. Intern. Med. -1988. -V. 101. -P.1005-1008.

87. Dudman N.P.B., De Maine M.M., Bencovic S.J. Fructose 1,6-bisphosphate: Kinetic of hydrolisis catalised by rabbit liver neutral fructose 1,6-bisphosphatase with Mg2+ // J. Biol. Chem. -1978. -V.253, №16. -P.5712-5718.

88. Dunham S.M., Thurston C.F. Control of isocitrate lyase synthesis in Chlorella fusca var. vacuolata // Biochem. J. -1978. -V.176, №2. -P.179-185.

89. Dupont J., Mathias M.M. Biooxidation of linoleic acid via methylmalonil-CoA // Lipids. -1989.-V.4-P.478-483.

90. Durchschlag H., Biederman G., Eggerer H. Large-scale purification and . some properties of malate synthase from Baker's yeast // Eur. J. Biochem. -1981. -V.l 14, №2. -P.255-262.

91. Eising R., Trelease R.N., Ni W.T. Biogenesis of catalase in glyoxysomes and leaf-type peroxisomes of sunflower cotyledons // Arch. Biochem. Biophys. -1990. -V.278. №1.-P.258-264.

92. EI S.N, Karakaya S. Olive tree (Olea europaea) leaves: potential beneficial effects on human health. Nutr Rev. 2009;67:632-8.

93. Eldan M., Mayer A.M., Poljaroff-Mayer A. Difference in subcellular lacalization of isocitrate lyase in lettuce seeds of different ages // Plant and Cell. -1974. -V.l5, №1. -P. 164-173.

94. Elgasma Y., Tabak H.F. Proteins involved in peroxisome biogenesis and functioning // Biochim. Biophys. Acta. -1996. -V.1286, №3. -P.269-283.

95. Faber K.N., Keizer-Gunnik I., Pluim D. The N-terminus of amine oxidase of Hansenula polymorpha contains a peroxisomal targeting // FEBS Lett. -1995. -V.354. №2.-P.l 15-120.

96. Fain J.N. Studies on the role of RNA and protein synthesis in lipolitic action of growth hormone in isolated fat cells // Advan. Enzyme Regul. -1987. -V.5. -P.39-51.xo

97. Felig P., Marliss E., Owen O. Blood glucose and gluconeogenesis in fasting man // Arch. Inter. Med. -1979. -V.123. -P.293-298.

98. Fernandez E., Fernandez M., Moreno F. Transcriptional regulation of the isocitrate lyase encoding gene in S. cerevisiae // FEBS Lett. -1993. -V.333, №3.-P.23 8-242.

99. Fernandez E., Fernandez M., Radicio R. Two structural genes are encoding malate synthase isoenzymes in S. cerevisiae // FEBS Lett. -1993. -V.3, №320. -P.271-275.

100. Fernandez E., Moreno F., Rodicio R. The ICL gene from S. arevisiae // Eur.J. Biochem. -1992. -V.204. №3. -P.983-990.

101. Fleig W.E., Noether-Fleig C, Roeben H. Hormonal regulation of key glucuneogenic enzymes and glucose release in cultured hepatocytes // Arch. Biochem and Biophys. -1984. -V.229, №1. -P.368-378.

102. Fki I, Bouaziz M, Sahnoun Z, Sayadi S. Hypocholesterolemic effects of phenolic-rich extracts of Chemlali olive cultivar in rats fed a cholesterol-rich diet. Bioorg Med Chem. 2005;13:5362-70.

103. Fragopoulou, E.; Nomikos, T.; Karantonis, H C.; Apostolakis, C.; Pliakis, E.; Samiotaki, M.; Panayotou, G.; Antonopoulou, S. Biological activity of acetylated phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 80-89.

104. Fredrickson D.S., Gordon R.S., Cherkes A. Metabolism of albumin-bound carbon-14-labeled unesterified fatty acid in normal human subject // J. Clin. Ivest. -1988. -V.37.-P. 1504-1515.

105. Frevert J., Koller W., Kindl H. Occurrence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds // Hoppe-Seyler's J. Physiol. Chem. -1980. -V.361, №10. -P.1557-1565. x<>

106. Friedman B., Goodman E.H., Wienhouse S. Effect of insulin and fatty acid on gluconeogenesis in the rat // J. Biol Chem. -1987. -V.242. -P.3620-3627.

107. Ganning A.E., BrunkU., Dallner G. //Biochim. Biophys. Acta. -1983. -V.763. -P.72-82.

108. Gemmrich A.R. Isocitrate lyase in germinating spores of the fern

109. Anemia phylitids //Phytochemistry. -1979. -V.18,№6. -P.l 143-1146.2+ 2-j

110. Giachetti E., Vanni P. Effect of Mg and Mn on isocitrate lyase, a non-essentially metalionactivated enzyme. A graphycal approach for the discrimination of the model for activation // Biochem. J. -1991. -V.276, -Pt.l. -P.223-230.

111. Gietl C Glyoxysomal malate dehydrogenase from watermelon is synthesized with an amino-terminal transit peptide // Proceedings of the National Academy of Science of USA.-1990.-V.87, №15. -P.5773-5777.

112. Gietl C Malate dehydrogenase isoenzymes: cellular locations and role in the flow of metabolites between the cytoplasm and cell organelles // Biochim. et Biophys. Acta.-1992. V.l 100, №3. -P.217-234.

113. Gietl C Malate dehydrogenase isoenzymes: cellular locations and role in the flow of metabolites between the cytoplasm and cell organelles // Biochim. et Biophys. Acta. -1992. -V.l 100, № 3. -P.217-234.

114. Glover T.R., Andrews D.W., Rachubinski R.A. S. cerevisiae peroxisomal thiolase is imported as a dimer // Proc. Natl. Acad. Sci. US A.-1994.-V.91, №22. -P. 10541-10545.

115. Goodman D.B.P., Davig W.L., Jones R.G. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: Possible stimulation by aldosterone // Proc. Natli. Acad. Sci.-1980.-V.77, № 3. -P. 1521-1525.

116. Goodman H.M., Knobil E. Some endocrine factor in regulation of fatty acid mobilization during fasting // Amer.J.Physiol.-1981. -V.201.-P.1-3.

117. Goodman P.S. Interaction of human serum albumin with long-chain fatty acid anions // J. Amer. Chem. Soc. -1978. -V.80. -P.3892-3898.

118. Gorin E., Shafrir E. Lipolitic activity in adipose tissue homogenate toward tri- di-and monoglyceride substrate // Biochem. et biophys. Acta. -1984. -V.84. -P.24-34.

119. Gould S.J. Keller G.A., Subramini S. Identification of peroxisomal targeting signals located at the carboxy terminus of tour peroxisomal proteins // J. Cell. Biol. 1990. -V. 107,№3.-P.897-905.

120. Graham I.A., Smith L.M., Brown J.W. The malate synthase gene of cucumber // Plant Mol. Biol. -1989. -V.6, №13. -P.673-684.

121. Graham LA., Baker C.J., Leaver C.J. Analysis of the cucumber malate synthase gene promoter by transient expression and gel retardation assays // Plant J.-1994.-V.6, №6. -P.893-902.

122. Graham LA., Smith L.M., Leaver C.J. Developmental regulation of expression of the malate synthase gene in transgenic plants // Plant Mol.Biol.-1990.-V.4, №15. -P.539-549.

123. Green L.S., Karr D.B., Emerich D.W. Isocitrate dehydrogenase and glyoxylate cycle enzyme activities in Bradyrhizobium japonicum under variosus growth conditions // Arcli.Microbiol.-1998.-V.5, №169. -P.445-451.

124. GruBner R. Nakhleh R. GruBner A., Tomadze G, Diem p, Sutherland D (1993). Alloxan- induced diabetes mellitus in dogs. Horm. Metabol. Res 25: 199-203.

125. Guex N., Menry M., Fluch T. Glyoxysomal malate dehydrogenase and malate synthase from soybean cotyledons (Glycine maxh.): enzyme association antibody production and cDNA cloning // Planta.-1995.-V.2, №19^.369-375.

126. Hamden K., Allouche N, Abdelfattah Elfeki MK. (2009). Hypoglycemic and antioxidant effects of phenolic extracts and purified hydroxytyrosol from olive mill waste in vitro and in rats. Chemico-Biological Interactions 180: 421^432.

127. Hartig A., Simon M.M., Schuster T. Differentially regulated malate synthase genes participate in carbon and nitrogen metabolism of S.cerevisiae // Nucleic Acid Res.-1992.-V.21, №20. P.5677-5686.

128. Hayashi M., DeBellis L., Alpi A. Cytosolic aconitase participates in the glyoxylate cycle in etiolated pumpkin cotyledons // Plant and Cell Physiol.-1995.-V.36, №4.-P.669-680.

129. Hikida M., Atomi M., Fakuda Y. Resence of two transcribed malate synthase genes in n-alkane-utilizing yeast, Candida tropicalis // J. Biochem. -1991.-V.6,№ 110. -P.909-914.

130. Holmes R.P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embryonic chick liver // Biochem.Biophys.Acta.-1993.-V. 1158.-P.47-51.

131. Hoppe A., Theimer F.R. Rapid purification of malate synthase from cotyledons of Brassica napus L. // FEBS Lett-1995, №374.-V.2.-P.225-227.

132. Huang A.M.C Metabolism in the plant peroxisomes // Recent. Adv.Phyrochem.-1982. V.16.-P.85-123.

133. Hunt L., Skvarla J., Fletcher T. Subcellular localization of isocitrate lyase in nongreen tissue culture cells //Plant Physiol.-1978.-V.61, №6. -P. 10101013.

134. Huttner S., Mecbe D., Frochlich F.U. Gene cloning and sequencing and enzyme purification of the malate synthase of Streptomyces arenal // Gene.-1997.-V.2, №188. -P.239-246.

135. Igamberdiev A.U., Klezkowski L. Glyoxylate metabolism during photorespiration: A cytosol connection // Handbook on Photosynthesis (M. Pessarakli, ed.). -1996. -N.Y.: Marcel Dekker Inc. -P.269-279. x<>

136. Ismail I., De Bellis L., Alpi A. Expression of glyoxylate cycle genes in cucumber roots responds to sugar supply and can be activated by shading or defoliation of the shoot // Plant Mol. Biol. -1997. -V.5, №35. -P.633-640.

137. Isseman I., Green S. Peroxisomes //Nature. -1990. -V.347. -P.645-650.

138. Iynedjian P.B., Salaver A. Effect of glucogon, dexametasone and triiodoteranine on phosphoenolpyruvate carboxykinase synthesis and mRNA level in rat liver cells // Eur. J. Biochem. -1984. -V.145, №3. -P.489-497.

139. Janssen B.J. A cDNA clone for isocitrate lyase from tomato // Plant Physiol. -1995. -V.108, №3.-P.1339.

140. Jomain M., Loriette C, Macaire I. Activities enzymatique du foie et du tissu adipeax pendant le jeune total on le jeune proteique et la realimentation equilebree uliterieure //Nutr. and metabolism. -1980. -V.12. -P.245-253.

141. Jones R.G., Davis W.L., Goodman D.B.P. Microperoxisomes in the epitelial cells of the amphibian urinary bladder: an electron microscopic demonstration of catalase and malate synthase // J. Histichem. -1981. -V.29. -P. 1150-1156.

142. Kajiro Y., Ochoa S. The metabolism of propionic acid // Advan. Enzymol. -1984. -V.26. -P.283-290.

143. Kato A., Mayashi M., Mori M. Molecular characterization citrate synthase that is synthesized as a precursor of higher molecular mass in pumpkin // Plant. Mol. Biol. 1995. - V.27, №2. - P.377-390.

144. Keller G.A., Krisans S., Gould S.P. Evolutionary conservation of a microbody targeting signal that targets proteins to peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes // Journal of Cell Biolqgy.-1991.-V.114, №5. -P.893-904.

145. Kerwick A., Pawan G.L. Fat-mobilizing substance /^^letabolism. -1977. -V. 16. -P.787-796.

146. Khan A.S., Van Driessche E., Kanarek L. The purification and physicochemical characterization of maize (Zea mays L.) isocitrate lyase // Arch. Biochem. and Biophys.-1992.-V.297,№l.-P.4-18.

147. Khan A.S., Van Drissche F., Kanarek L. Purification of the glyoxylate cycle enzyme malate synthase from maize (Zea mays L.) and characterization of a proteolytic fragment // Protein Express. Purific. -1993. -V.4. -P.519-528.

148. Khan F.R., McFadden B.A. Coenorhabditis elegans: Decay of isocitrate lyase during larval development//Exper. Parasitol. -1982. -V.54. -P.2519-2527.

149. Khan F.R., McFadden B.A. Embriogenesis and the glyoxylate cycle // FEBS Lett.-1980.-V.l 15, №2. -P.312-314.

150. Khan F.R., Salamuddin M., Siddigi M. The appearance and decline of isocitrate lyase in flax seedlings // J.Biol.Chem. -1979. -V.254, №15. -P.6938-6944.

151. Koller W., Frevert J., Kindl M. Incomplete glyoxysomes appearing at a late stage of maturation of cucumber seeds // Z. Naturforsch. -1979. -Bd.34, Ser.C, №12. -S.1232-1236.

152. Kornberg H.L., Beevers H. The glyoxylate cycle as a stage in the conversion of fat to carbohydrate in castor beans // Biochim. Biophys. Acta. -1957. -V.26. -P.531-537.

153. Kornberg H.L., Krebs H.A. Synthesis of cell constituents from C2-unit by a modified tricarboxylic acid cycle //Nature. -1957. -V.157. -P.981-991.

154. Kornberg M.L. The metabolism of C2 compounds in microorganisms. I. The incorporation of (2-14C) acetate by Pseudomonas grown on ammonium acetate // Biochem.J. -1958. -V.68, №3. -P.535-542.

155. Korner A., Raben M.S. Effect of aminonucleotide and puromicin on insulin and epinephrine control of fatty acid release from adipose tissue // Nature. -1984. -V.203. -P.1287-1289.

156. Lalwani N.D., Alwares K., Reddy M.K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. -V.84. -P.5242-5246.

157. Lamb Y.E., Riezman PL, Becker W.M. Regulation of glyoxysomal enzymes germination of cucumber. Isolated and immunological detection of isocitrate lyase and catalase // Plant. Physiol. -1978. -V.62, №3. -P.754-760.

158. Lardy H.A., Foster D.O., Sharado E. Metabolic and hormonal regulation of phosphopyruvate synthesis // Advan Enzyme Regul. -1984. -V.2. -P.39-47.

159. Lengyel C, Lâszlô V, Tamâs B, Norbert J, Jânos M, Péter B, Erzsébet K, Réka S, Péter P. Nânâsi MT, Kecskeméti V, Papp JG, Andrâs V. (2007). Diabetes mellitus attenuates the repolarization reserve in mammalian heart. Cardiovasc Res 73: 512-520.

160. Liu F., Thatcher J.D., Barrel J.M. Bifunctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegans: a developmentally regulated protein of intestine and muscle //Develop. Biol. 1995. -V.169. -P.399-414.

161. Luers G., Beier K., Hashimoto T.A. // J. Cell Biol. -1990. -V.52. -P. 175-184.

162. Malhorta O.P., Srivastava A.K. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm //Arch. Biochem. and Biophys.-1982.-V.214, №1. -P.164-171.

163. Manna C, Migliardi V, Golino P, Scognamiglio A, Galletti P, Chiariello M, Zappia V. Oleuropein prevents oxidative myocardial injury induced by ischemia and reperfusion. J Nutr Biochem. 2004;15:461-6.

164. Maxwell D.P., Maxwell M.D., Nanssler G. Microbodies and glyoxylate cycle enzymes activities in filamentous fungi // Planta.-1975.-V. 124, N 1. P. 109-123. x<>

165. Mc Laughlin Y.C., Smith S.M. Metabolic regulation of glyoxylate cycle enzyme synthesis in detached cucumber cotyledons and protoplasts // Planta.- 1994. -V.195, № 1. P.22-28.

166. McClard R.W., Atkinson D.E. Effect of fructose-6-phosphate and adenylates in the activities of rabbit liver fructose bisphosphatase and phosphofructokinase // Arch. Biochem. and Biophys. -1979. -V.194, №1. -P.236-243.

167. McCullough W., Shanks A. Properties of genes involved in the control of isocitrate lyase production in Aspergillus nidulans // J. Gen. Microbiol.-1993.-V. 139,-Pt.3.-P. 509-511.

168. McKindly M P., Trelease R.N. Glyoxylate cycle enzymes and catalase in digitonin-fractionated mitochondria in Turbatrix aceti // Protoplasma.-1978.-V.94, №2.-P.249-261.

169. McNew J.A., Goodman J.M. An oligomeric protein is imported into peroxisomes in vivo // J.Cell.Biol.-1994.-V.127, №5.-P. 1245-1257.

170. Meyer J. Afzelius C A. // J. Ultrastr. Mol. Struct. Res. 1989. - V. 102.- P. 87-94.

171. Miernyk T.A., Trelease R.N. Malate synthase from Gossypium hirsutum // Phytochem.-1981 .-V.20, № 12.-P.2657-2663.

172. Mizunuma M., Tashima Y. Effect of Mn on fructose-1,6-bisphosphate inhibition of mouse liver, intestinal and muscle fructose-1,6-bisphosphatase // Arch. Biochem. and Biophys. -1983. -V.226, №1. -P.257-264.

173. Molina I., Pelliur M.T., Badia J. Molecular characterization of E. coli malate synthase G. Differentiation with the malate synthase A isoenzyme // Eur. Biochem. J.-1994.-V.2, №224.-P.541-548.

174. Moreau R.A., Huang L.H.C. Gluconeogenesis from storage wax in the cotyledons of yojoba seedlings // Plant Physiol.-1977.-V.60.-P.329-333.

175. Mori M., Takeda-Yoshikawa Y., Mara-Nishimura T.1. JTSur. Biochem.

176. J. -1991. -V.2,№147.-P.331-336.

177. Mullen R.T., Gifford D.J. Isocitrate lyase from germinated loblolly pine megagametophytes: Enzyme purification and immunocharacterization // Plant Physiol and Biochem. 1995. -V.33, №1. - P.87-95.

178. Nesseem DI, Michel CG, Sleem AA, El-Alfy TS (2009). Formulation and evaluation of antihyperglycemic leaf extracts of Zizyphus spina-christi (L.) Willd. Pharmazie. 64:104-109).

179. Nishimura M., Beevers H. Subcellular distribution gluconeogenetic enzymes in germinating castor bean endosperm // Plant Physiol. 1979. -V.64. -P.31-37.

180. Noor A, Gunasekaran S, Soosaihanickam A. Vijayalakshmi, MA (2008). Antidiabetic activity of Aloevera and histology of organs in alloxan induced diabetic rats. Current Sci. 94:1070-1076).

181. Olsen L.J., Ettiger W.F., Damsz B. Harada J.J. Targeting of glyoxysomal proteins peroxisomes in leaves and roots of a higher plant // Plant Cell. 1993. -V.5, №8. - P.941-952.

182. Ono K., Okinashi M., Jnui M. Purification and characterization isocitrate lyase from ethanol-grown Euglena gracilis // J. Eucariotic Microbiol. -1994. -V.46. №6. P.536-539.

183. Opperdoes F.R., Compartmentalization of carbohydrate metabolism in trypanosomes // Ann. Rev. Microbiol. 1987. - V.41. - P. 127-151.

184. Ordiz I., Herrero P., Radicio R. Glucose-induced inactivation of isocitrate lyase in S. cerevisiae is mediated by an internal decapeptide sequence // FEBS Lett. 1995. -V.367,№3. - P.219-222.

185. Ordiz I., Herrero P., Radicio R. Glucose-induced inactivation of isocitrate lyase in S. cerevisiae is mediated by the cAMP-dependent protein kinase catalytic subunits TpKl and TpK2 // FEBS Lett. 1996. - V.385, №1. - P.43-46.

186. Osumi M., Kazama H., Sato S. Microbody-associated SNA in Candida tropicalis pK233 cells // FEBS Lett. 1978. - V.90, №2. - P.309-312.

187. Osumi T., Tsukamoto T., Hata S. Amino-terminal presequense of the precursor of peroxisomal 3-ketoacyl-CoA tiolase is a cleaveble signal peptide for peroxisomal targeting // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. -V. 181. -P.947-954.

188. Parmeggiani A., Bowman R.H. Regulation of phosphofructokinase activity by citrate in normal and diabetic muscle // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1993. - V. 12. - P. 268-273.

189. Patel T.R., McFadden B.A. Coenorhabditis elegans and Ascaris suum: Fragmentation of isocitrate lyase in crude extracts // Exper. Parasitol. 1978. -V.44. - P.72-81.

190. Pellicer M.T., Fernandez C, Bodia J. Cross-induction of glc and operons of E. coli attributable to pathway intersection. Characterization of the glc promoter // J. Biol. Chem. 1999. -V.3, №274. - P. 1745-1752.

191. Randle P.J., Garland P.B., Halls C.N. The glucose-fatty acid cycle. Its role on insulin sensitivity and the metabolic disturbance of diabetes melitus // Recent. Progr. Hormone Res. 1993. - V.l. - P.785-789.

192. Reddy .T.K. // Biochem. Soc. Trans. 1990. - V.l8. - P.92-94.

193. Reed L.J., Pettit F.H. Phosphorylation and dephosphorylation of pyruvate dehydrogenase // Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation. -1981. P.701-711.

194. Reinscheid D.J., Eirmans B.J., Sahm H. Malate synthase from Corynebacterium glutamicum sequence analysis of the gene and biochemical characterization of the enzyme // Microbiol. 1994. - V.l 1, №140. - P.3099-3108.

195. Reynolds S.J., Smith S.M. Isocitrate lyase gene of cucumber : isolation, characterization and expression in cotyledons following seed germination // Plant Mol. Biol. 1995. - V.27, №3. - P.487-497. x<>

196. Rua J., Soler J., Busto F. The pH dependence and modification by dietylpyrocarbonate of isocitrate lyase from Phycomyces blakesleeanus //Eur. J. Biochem. 1995. - V.232, №2. - P.381-390.

197. Rubin H., Trelease R.N. Subcellular localization of glyoxylate cycle enzymes in Ascaris suum larvae // J. Cell Biol. 1976. -V.70. - P.374-383.

198. Saenz MT, Garcia MD, Ahumada MC, Ruiz V. Cytostatic activity of some compounds from the unsaponifiable fraction obtained from virgin olive oil. Farmaco. 1998;53:448-9.

199. Sanbar S.S., Metenyi B., Forbath N. Effect of infusion octanoate on glucose concentration in plasma and rates of glucose production and utilization in dogs//Metabolism. 1975. - V. 14. - P. 1311-1323.

200. Sandeman R.A., Mynes M.J., Fincham J.R. Molecular organization of the malate synthase genes of Aspergillus nidulans and Neurospora crassa // Mol. Gen. Genet. 1991. - V.3, №228. - P.445-452.

201. Scholer A., Schuller H.J. Structure and regulation of the isocitrate lyase gene ICL I from the yeast S. cerevisiae // Current Genetics. 1993. - V.23, №5-6. -P.375-381.

202. Schutgens R.B.H., Heymans H.S.A., Wanders R.J.A. // Europ. J. Rediatr. V.l44. - P. 430-440.

203. Utilization of free fatty acid // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980. - V.131. -P. 119-122.

204. Scrutton M.C., Utter M.F. The regulation of glycolisis and gluconeogenesis in animal tissue // Ann. Rev. Biochem. 1988. - V.37. - P.249-302.

205. Sexton WJ, Jarow JP (1997). Effect of diabetes mellitus upon the male reproductive function. J Urology 49: 508-515.

206. Shafrir E. Gait S., Khasis S. Partition of fatty acid of 20-24 carbon atoms between serum albumin and lipoproteins // Biochim. et 6u5phys. Acta. -1975. V.98. - P.365-371.

207. Siess E.A., Wicland O.H. Cellular distribution of pyruvate dehydrogenase phosphatase: Activity in normal, hyperinsulized diabetic rats // FEBS Lett. 1976. - V.65, №2. - P. 163-168.

208. Singh V.N., Mac Gregor J.S., Pontremoli S. Inhibition of fructose-1,6-bisphosphatase by exess substrate and its reversal by monovalent cations // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1980. - V.94, №4. - P. 1140-1144.

209. Soling H.D., Willms B., Friedrichs D. Regulation of gluconeogenesis by fatty acid oxidation in isolated perfused livers of non-starved rats // Europ. J. Biochem. 1988. -V.4. - P.364-372.

210. Spitzer J.J., Gold M. The metabolism of free fatty acid in diabetic and fasting doss //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1985. - V.131. - P.235-249.

211. Subramoniam A, Pushpangadan P, Rajasekharan S, Evans DA, Latha PG, Valsaraj R. (1996).

212. Sundaram J., Chell R.M., Wilkinson A.E. Monomelic malate synthase from a thermophylic bacillus. Molecular and kinetic characteristics // Arch. Biochem. and Biophys. 1980. - V.199, №2. - P.515-525.

213. Swinkels B.W., Gould S.J., Subramini S. Targeting efficiencies of various permutations at the consensus C-terminal tripeptide peroxisomal targeting signal // FEBS Lett. 1992. - V.305, №2. - P. 133-136.

214. Szkudelski T. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas / T. Szkudelski // Physiol. Res. 50. 2001. - P. 536546.

215. Tashima Y., Mizunuma H., Hasegawa M. Purification and properties of mouse liver fructose-1,6-bisphsphatase // J. Biochem. 1979. - V.86, №4. - P. 1089-1099.

216. Terazono Y, Uchiyama M, Ide T, Watanabe H, Yonekura H, Yamamoto H, (1990). Expression of reg protein in rat regenerating islets and its co-localization with insulin in the Beta cell secretory granules. £)iabetologia 33: 250-252).

217. Thangada S., Alvares K., Mangino M. // FEBS Lett. 1989. - V.250. -P.205-210.

218. Tolbert N.E. Metabolic pathways in peroxisomes and glyoxysomes // Ann. Rev. Biochem. 1981. - V.50. - P.133-157.

219. Tolbert N.E. Microbodies-peroxisomes and glyoxysomes // Ann. Rev. Plant Physiol. 1971. - V.22. - P.45-74.

220. Trelease R.N. Biogenesis of glyoxysomes // Ann. Rev. Plant Physiol. -1984. V.35. -P.321-347.

221. Tsukamoto T., Shimozawa N., Fujiki Y. Peroxisome assembly factor 1: nonsense mutation in a peroxisome-deficient Chines hamster ovary cell mutant and deletion analysis // Mol. Cell Biol. 1994. -V.14, №8. - P.5458-5465.

222. Van Roermund C.W., Elgersma Y., Singh N. The membrane of peroxisomes in S. cerevisiae is impermeable to NAD(H) and acetyl-CoA under in vitro conditions // EMBO J. 1995. - V.14, №4. - P.3480-3486.

223. Vanni P., Vincenzini M.T., Nerozzi F.M. Studies on isocitrate lyase isolated from Lupinus cotyledons // Can. J. Biochem. -1979. -V28, №14. -P.405-406.

224. Vaughan M., Berger J.E., Steinberg D. Hormone-sensitive lipase and monogliceride lipase activities in adipose tissue // J. Biol. Chem. 1984. - V.239. -P.401-409.

225. Vaughan M., Steinberg D. Effect of hormones on lipolisis and esterification of free fatty acid during incubation of adipose tissue in vitro // J. Lipid Res. 1983. -V4. - P. 193-199. x<>

226. Veenhuis M. Peroxisome biogenesis and function in Hansenula polymorpha // Cell Biochem. Funct. 1992. - V.10. - P.193-199.

227. Veenhuis M., Goodman J.M. Proliferation of microbodies in S. cerevisiae // J. Cell Sci. 1990. - V.96. - P.383-590.

228. Veenhuis M., Harder W., Van Dijken J.P. // Mol. Cell Biol. 1981. -V. 1. -P.949-957.

229. Veneziale C.M., Donofrio J.C., Nishimura H. The concentration of P-enolpyruvate carboxykinase protein in murine tissue in diabetes of chemical and genetic origin // J. Biol. Chem. 1983. - V.258, №23. - P. 14257-14262.

230. Venkatesh S, Reddy GD, Reddy BM, Ramesh M, Appa AV (2003). Antihyperglycemic activity of Caralluma attenuata. Fitoterapia, 74: 274-279.

231. Verniquest F., Gailard J. Neuburger M. R. Rapid inactivation of plant aconitase by hydrogen peroxide // Biochem. J. 1991. - V.276, - Pt.3. - P.643-648.

232. Vincenzini M.T., Nerozzi F., Vincieri F. B. Isolation and properties of isocitrate lyase from Lupinus seeds // Phytochem. -1980. -V.19, №5. -P.769-774.

233. Visioli F, Bellomo G, Galli C. Free radical-scavenging properties of olive oil polyphenols. Biochem Biophys Res Commun. 1998;247:60-4.

234. Visioli F, Poli A, Gall C. Antioxidant and other biological activities of phenols from olives and olive oil. Med Res Rev. 2002;22:65-75.

235. Von Tagow G.B., Westefman B., Wieland O. Supression pyruvate oxidation in liver mitochondria in the presence of long-chain fatty acid // Eur. J. Biochem. 1988. - V.3. - P.512-518.

236. Walter L., Davis W.L., Goodman D.B.P. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver // Anat. Record. 1992. - V.234. - P.461-468.

237. Weber G., Convery H.J., Lea M.A. Feedback inhibition of key glycolitic enzymes in liver; cation of free acid // Science. 1976. - V.154. -P.1357-1360.

238. Wicheanvonagoon S., Arinze I.J. Phosphoenolpyruvate carboxykinase from guinea pig liver mitochondria // Biochem. J. 1984. - V.221, №1. - P. 105111.

239. Wieland O., Suyter M. Glicerokinase. Its isolation and properties // J. Biochem. 1987. - V. 329. - P.320-331.

240. Williamson J.R., Browning E.T., Olson M.S. Interrelation between fatty acid oxidation and the control of gluconeogenesis in perfused rat liver // Adv. Enzyme Regul. 1978. - V.6. - P.67-100.

241. Williamson J.R., Browning E.T., Scholtz R. The inhibition of fat acid stimulation of gluconeogenesis by (+)-decanoylcarnitine in rat perfused liver // Diabetes. -1988. -V.17. -P. 194-208.

242. Wolins N.E., Donaldson R.P. Specific binding of the peroxisomal protein targeting sequence to glyoxysomal membranes // J. Biol. Chem. 1994. -V.269, №2. - P.l 149-1153.

243. Woodcock E., Merrett M.Y. Malate synthase massenger Euglena // Arch. Microbiol. -1980.-V.124, №l.-P.33-38.

244. Yki-Jarvinen H, (1994). Pathogenesis of non-insulin-dependent diabetes mellitus Lancet, 343:91-95.

245. Zaar K., Volkl A., Fahimi H.D. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. -V.897. - P.135-142. x<>

246. Zhang J.Z., Gomez-Pedrozo., Baden C.S. Two classes of isocitrate lyase gene are expressed during late embryogeney and postgermination in Brassica napus L. // Mol. Gen. Genetics. 1993. -V.238, №1-2. - P.174-177.

247. Zhang J.Z., Laudencia-Chingcuanco D.L., Commai L. Isocitrate lyase and malate synthase gene from Brassica napus L. are active in pollen // Plant Physiol. 1994. - V.104, №3. - P.854-857.

248. Zhang X, Jiang L, Geng C,Yoshimura H, Zhong L, (2008). Inhibition of acrylamide genotoxicity in human liver-derived HepG2 cells by the antioxidant hydroxytyrosol, Chem. Biol. Interact. 176: 173-178.

Информация о работе

Аль Дайни Саба Хади Бенайед
кандидата биологических наук
Воронеж, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Влияние водного экстракта оливы европейской (Olea Europaea) на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс в условиях экспериментального диабета - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы