Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности организации и ферментативной регуляции метаболизма сукцината

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности организации и ферментативной регуляции метаболизма сукцината"

?Г5 од

1 Л £ и :

На правах рукописи

Попов Василий Николаевич

ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ И ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА СУКЦИНАТА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1997

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственного университета.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Игамбердиев А.У.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Любимов В.Ю. доктор биологических наук, профессор Пашков А.Н. Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского

Защита состоится 9 июня 1997 года в час. на заседании

Диссертационного Совета Д 063.48.11 при Воронежском государственном университете по адресу; 394693, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан 8 мая 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук,

доцент Ковалева Т.А.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма является одной из важнейших задач современной биологии. Оно 1меет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться с пониманию механизмов функционирования организма как целостной :истемы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем, связанных : повышением устойчивости живых организмов к неблагоприятным факторам. 3 этом направлении проводится немало исследований, но многие аспекты, ;вязанные, например, с регуляцией и сопряжением отдельных процессов, 1зучены недостаточно. Это относится и к метаболизму сукцината, в частности, з период интенсивного функционирования глиоксилатного цикла. Принято считать,- что интенсивно образующийся в этих условиях сукцинат, далее зкисляется в отрезке цикла Кребса до оксалоацетата и последний вступает в люконйогенез. Однако нет да иных о том, сбалансирования ли скорость -лиоксисомальных и югтохондриальных процессов, особенно в период максимальной активности: глиоксилатного цикла, Кроме того известно, что им функционирования глюконеогенетического пути необходимо высокое содержание восстановленных пиридиннуклеотндов и АТФ в клетке, тормозящее работу электронгранспортно!! цепи митохондрий и, соответственно, сукцинатдеищрогеназного комплекса. Таким образом, есть Основания предполагать наличие альтернативных путей окисления сукцината в териод прорастания масличных семян.

Важным представляется решение вопроса о путях электронного транспорта при окислении сукцината в активно дышащих тканях проростков зысших растений. Наличие в растительных митохондриях альтернативной жсидазы определяет возможность либо сопряженного окисления сукцината 1ерез цитохромный путь, либо быстрое несопряженное окисление через шьтернативную оксидазу. Кроме того функционирование митохондрий в условиях высокого соотношения НАДН/НАД"1" и АТФ/АДФ и высокого мембранного потенциала может приводить к генерации восстановленных }юрм кислорода, способных повреждать митохондриальную ДНК. Этот троцесс и наличие защитных механизмов остаются малоисследованными для эастительных митохондрий.

Особый интерес представляет организация метаболизма янтарно; кислоты в микротельцах. Процесс мобилизации запасных жиров дл глюконесгенеза, по-видимому, протекает во всех живых организмах. Однакс для тканей высших животных биохимический механизм данного процесс остается невыясненным. Наличие ферментов |3-окислешш жирных кислот животных пероксисомах позволяет предположить возможность индукци] ферментов глиоксилатного цикла, позволяющих конденсировать две молекул! ацетил-КоА, образующегося при Р-окиелении, в сукцинат.

Для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке необходимо изучение всех метаболических путей, сопряженных с тем ил иным веществом, исследование физических, химических и физиологически свойств отдельных ферментативных систем. В клетках сукцинат образуется 1 утилизируется при работе ферментов, обеспечивающих функционировани центральных метаболических путей: сукцинатдегидротеназы, сукцинил-КоА синтетазы, изоцитратлиазы и дегидрогеназы полуальдегида янтарной кислоть: То есть сукцинат яштяется важным связующим звеном процессов дыхания глюконеогенеза и биосинтеза аминокислот. Множественност

ферментативных реакций, связанных с одним субстратом - сукцинатом, по видимому, может обеспечивать тонкую регуляцию анаболических ] катаболических процессов, поддерживающих внутриклеточный гомеостаз условиях изменения окружающей среды.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучени организации и ферментативной регуляции метаболизма сукцината растительной и животной клетках в условиях его интенсивного образования, также исследование физико-химических, каталитических и регуляторны свойств отдельных ферментных систем, участвующих в этом процессе.

Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности метаболизма сукцината в процессе прорастани семян, отличающихся природой и структурой запасающих органов.

2. Исследовать возможность функционирования альтернативных путе: окисления сукцината в условиях его интенсивного образования.

3. Определить пути электронного транспорта при окислении сукцината митохондриях различных тканей высших растений.

4. Выявить возможность генерации восстановленных форм кислорода в астительных митохондриях и участие альтернативной оксидазы в этом роцессе.

5. Изучить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла в санях высших животных в условиях, вызывающих мобилизацию запасных иров (при голодании).

6. Разработать способы получения высокоочищенных препаратов ерментов, участвующих в метаболизме сухцината из различных источников.

7. Исследовать кинетические, физико-химические и регуляторные зсйства ферментов, метаболизирующих янтарную кислоту.

Научная новизна работы. При изучении метаболизма сукцината оказано, что его интенсификация связана с работой глиоксилатного цикла 1К в растительных, так и в животных тканях. Показано, что интенсивное эразование янтарной кислоты приводит к значительным изменениям етаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так при прорастании :мян злаковых функционирует впервые обнаруженная нами хиоксисомальная сукцинатоксидаза, основной функцией которой является ыстрое, не связанное с запасанием энергии окисление сукцината елосредственно в глиоксисомах, позволяющее снять аденилатный контроль тектронтранспортной цепи митохондрий. В эндосперме клещевины при рорастании в период интенсивной работы глиоксилатного цикла происходит [унтирование цикла Кребса через аминотрансферазные реакции, что озволяет обойти лимитирующие этапы и также способствует интенсивной етаболизации сукцината.

Для печени крыс впервые показана индукция при голодании ферментов шоксилатного цикла, позволяющая мобилизовывать жиры и через сукцинат аправлять их на глюконеогенез или поддержание энергетического баланса петки. Впервые установлено, что ключевые ферменты глиоксилатного цикла -зоцитратлиаза и малатсинтаза . локализованы в микротельцах животных саней. Наличие в этих органоидах ферментов (3-окисления жирных кислот озволяет считать их полноценными глиоксисомами. Впервые получен )Могенный препарат изоцитратлиазы из животной ткани, изучены его изико-химические свойства и показана регуляция активности данного ермента сахарофосфатами.

При изучении путей электронного транспорта при окислении сукиината в растительных митохондриях показано, что основной поток электронов в жирозапасающих тканях идет через цианидрезистентную альтернативную оксидазу. Впервые обнаружено, что ингибирование альтернативной оксидазы приводит к значительному увеличению интенсивности генерации перекиси водорода митохондриалыюй электронтранспортной цепью, то есть альтернативная оксидаза может выступать защитным механизмом от образования восстановленных форм кислорода.

Практическая значимость исследования. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов в растительной и животной клетках. Разработанная схема выделения электрофоретически гомогенного препарата изоцитратлиазы может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Найденный метод стабилизации фермента позволяет сохранять его активность в течение длительного времени, что обеспечивает возможность использования препарата изоцитратлиазы для медицинской диагностики и в биохимических исследованиях для количественного определения изоцитрата.

Обнаружение феномена индукции глиоксилатного цикла при голодании в печени высших животных может служить основой для' разработки тест-систем обнаружения нарушений обмена веществ, связанных с мобилизацией запасных жиров. На основе полученных данных о существовании альтернативной глиоксисомальной сукцинатоксидазы, специфичной для растений семейства злаковых, возможна разработка гербицидов, частично ингибирующих основной путь окисления сукцината - сукцинатдегидрогеназу и подавляющих развитие растений, не обладающих альтернативной системой окисления янтарной кислоты.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета. Результаты исследований вошли в курсы лекций по "Биохимии", "Дыханию растений".

Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на IX (Брно, Чехия, 1994 г.) и X (Флоренция, Италия, 1996) Конгрессах Федерации европейских обществ физиологов растений; 2-ом ежегодном симпозиуме Всероссийского общества физиологов растений (Пенза, 1996); 2-

й Международной конференции "Кислород и свободные радикалы в астениях" (Вена, Австрия, 1996); Международном симпозиуме "Физико-омические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 595); Международном совещании "Дыхание растений: физиологические и дологические аспекты" (Сыктывкар, 1995); научной сессии Воронежского зсударственного университета (1996). Работа является победителем XXXII и XXIII Международной научной студенческой конференции Новосибирского ^университета (1994, 1995 гг.) и Лауреатом Премии администрации оронежской области для молодых ученых за 1995 год.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает 6 глав, 190 границ, 32 рисунка, 14 таблиц. В работе использовано 343 литературных сточника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве основных объектов исследования тужили проростки культурных растений: кукурузы (Zea mays L.), сорт оронежская 76, клещевины (Ricinus communis), подсолнечника (Helianthus inuus L.), сорт Передовик, гороха (Pisum sativum L.), сорт Рамонский 77, шеницы (Triticum aestivum), сорт Северодонская, сои (Glycine max L.), сорт мурская 310. Некоторые исследования проводили на других растениях, азвания которых приводятся по ходу изложения экспериментальных данных, тиолированные растения выращивали гидропонным способом в темноте при :мпературе 25°С, зеленые - при 14-ти часовом освещении дневным светом, ыбор вида растения мотивировался различиями в типе основного обмена и :обенностями запасающих органов семян. При работе с животными юхмесячные лабораторные крысы (Rattus rattus L.) выращивались при эрмальном питании и затем помещались в условия пищевой депривации при юбодном доступе к воде на срок до 7 суток. Для получения печени опытных ивотных предварительно усыпляли этиловым эфиром и производили гкапитацию.

Выделение клеточных органе.тл. Выделение субклеточных фракций из эганов растений проводили методами дифференциального ;нтрмф\тирования и изоплотностного ультрацентрифугирования в градиенте ютности сахарозы (Гавриленко и др., 1975; Schiiarrenberger et al., 1971).

Маркерными ферментами для митохондрий яатялись сукцинатдегидрогеназа и фумаратгидрагаза, для глиоксисом - каталаза, для цитозоля алкогольдегидрогеназа.

Определение активности ферментов. Определение активности ферментов проводили при 25°С с помощью спектрофотометрических методов. Активность изоцитратлиазы (ИЦЛ) исследовали по методу Dixon и Kornberg (1959) при 324 нм. Малатсинтазу (MC) и цитратсинтазу (ЦС) определяли при 412 нм по формированию комплекса КоА и дитио-бис-нигробензойной кислоты (ДТНБ) (Hock, Beevers, 1966). Активность малатдегидрогеназы (МДГ) и детвдрогеназы полуальдегида янтарной кислоты (ПЯКДГ) определяли при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, вызываемой образованием или расходованием НАДН. Для изучения активности аконитатгидратазы (АГ) применяли метод, основанный на учете разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис-аконитатом при 240 нм. Продукты реакции, катализируемой ГСО, исследовали с. использованием вспомогательных ферментов. Возможность образования малата и оксалоацетата анализировали при 340 нм, добавляя МДГ (1-2 ФЕ/мл) и соответственно НАД+ (0,6 мМ) или НАДН (0,2 мМ). Возможность образования лактата и пирувата анализировали, добавляя ЛДГ (0,015 ФЕ/мл) и соответственно НАД+ и НАДН. Определение пероксида водорода проводили с использованием пероксидазы и о-дианизидина при 435 нм.

Выделение и очистка ферментов. Для получения высокоочищенных препаратов ферментов после гомогенизации материала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. От низкомолекулярных соединений ферменты отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлкшозе или ДЭАЭ-фрактогеле, и гель-хроматографию на Toyopearl HW-65. Все операции проводили б холодной комнате при 0....4°С.

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов. Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на электрофоретически гомогенных или частично очищенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, констант ингибирования осуществляли с использованием линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов.

Радиоизотопные исследования. Скорость выделения |4ССЪ в ходе (етаболизиа 1,4-14С-сукцината изучали при 25°С влечение 2,5 ч с интервалом тбора проб 0,5 ч. Разделение на фракции аминокислот, органических кислот Сахаров проводили путем ионообменной и бумажной хроматографии Солдагенков, Мазурова, 1971). Радиоактивность проб просчитывали на цинтилляционном счетчике СБС-2 (Россия) в сцинтилляционной жидкости КС-8И (Россия).

Полярографический анализ и определение скорости генерации Н^О^.

1нтенсивность митохондриального дыхания определяли с помощью закрытого ларковского электрода. Субстратом дыхания служил 5 мМ сукцинат. Для нгибирования комплекса I ЭТЦ использовали 2 цМ ротенон, СДГ - 10-20 гМ малонат, комплекса Ш - 2 цМ антимицин или 1 uM миксотиазол, итохромоксидазы - 1-5 мМ KCN или азид натрия, альтернативной оксидазы 0,2-5 мМ SHAM, АТФазы - 2 цМ олигомицин. Измерение интенсивности родукции Н2О2 проводили с помощью флюоресцентного метода на шюориметре MPF-4 (Hitachi).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-4-кратной овторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в рех повторностях. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < ,05 (Лакин, 1990).

ИЗУЧЕНИЕ ГЛИОКСИСОМАЛЬНОЙ СУКЦИНАТОКСИДАЗЫ ИЗ ПРОРОСТКОВ ЗЛАКОВ

Изучение влияния ингибиторов на метаболизм меченого сукцината оказало, что в семенах злаковых растений таких, как кукуруза и, пшеница, роцесс окисления сукцината не чувствителен к ТТФА - ингибитору СДГ. ведение этого ингибитора в среду инкубации приводило к интенсификации роцесса выделения ИС02 (120 % от контроля). В присутствии ТТФА гмечалось также снижение накопления радиоактивной метки в сахарах (на 0%). Фгорацетат незначительно ингибировал выделение 14С02 в первые два аса инкубации. Введение в инкубационную среду этого ингибитора риводило к резкому (почти в 4 раза) увеличению радиоактивности

аминокислот и заметному (на 40 %) снижению радиоактивности фракции органических кислот.

При исследовании метаболизма сукцината в запасающих органах различных растений было показано, что в щитках кукурузы и пшеницы сукцинат метаболизируется не только в митохондриях, но и в глиоксисомах, причем в микротельцах сукцинат превращается непосредственно в малат. Для этого нами проводились исследования метаболизации 2,3-,4С-сукцината в изолированных митохондриях и глиоксисомах, выделенных с помощью изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы из щитков кукурузы. Показано, что в митохондриях сукцинат превращался преимущественно в фумарат. Для глиоксисом установлено, что радиоактивный сукцинат метаболизируется преимущественно в малат (табл.1).

Таблица 1

Включение радиоактивной метки в органические кислоты после инкубации

органелл с 2,3-14С-сукцинатом

Радиоактивность, имп/мин мг белка

сукцинат малат фумарат гликолат цитрат со2

Интактные глиоксисомы 18320 3100 70 • 950 100 80

Разрушенные глиоксисомы 19900 4700 80 800 100 100

Интактные митохондрии 19600 130 4300 300 300 100

В результате последующих исследований нами был обнаружен, частично очищен и охарактеризован фермент, обеспечивающий данный процесс -глиоксисомальная сукцинатоксидаза, катализирующая окисление сукцината в малат с образованием перекиси водорода. Показано, что наиболее эффективным способом солюбшшзации глиоксисомальной сукцинатоксидазы является разрушение глиоксисоматьных мембран 0,05 % раствором дигитонина. Квинакрин - ингибитор флавиновых оксидаз, подавлял процесс глиоксисомадьного окисления сукцината. Прединкубация ферментативного экстракта с 1 мМ ФМН стимулировала на 25-30 % активность ГСО. Этс Позволяет предположить, что изучаемая нами ферментная система является

лавиносодержащей. Активность ГСО коррелирует с интенсивностью ротекания глиоксилатного цикла и достигает максимального значения 0,17 >Е на 1 г сырой массы на 4-й день прорастания семян.

Изучение распространения глиоксисомальной сукцинатоксидазы оказало, что данная ферментная система обнаруживается только в щитках юковых растений, но не выявляется в жирозапасающих органах клещевины и одсолнечника (табл.2).

Таблица 2

Активность ферментов метаболизма янтарной кислоты в жирозапасаюшеи

ткани различных растений

Возраст Активность, Удельная

Орган проростков, Фермент ФЕ/г сырой активность,

дней массы ФЕ/мг белка

Щиток сдг 0.29±0.03 0.048+0.005

кукурузы 4 ПЯК-ДГ 0.21+0.02 0.033+0.004

ГСО 0.19+0.02 0.026+0.003

Щиток СДГ 0.28+0.03 0.038+0.004

пшеницы 5 ПЯК-ДГ 0.26+0.03 0.030+0.003

ГСО 0.10+0.02 0.013+0.002

Эндосперм сдг 0.44+0.04 0.067+0.006

клещевины 5 ПЯК-ДГ 0.49+0.05 0.068+0.008

ГСО 0 0

Семядоли сдг 0.57+0.05 0.106+0.008

одсолнечника 3 ПЯК-ДГ 0.22±0.02 0.043+0.003

ГСО 0 0

Семядоли сдг 0.32+0.02 0.042+0.003

гороха 7 ПЯК-ДГ 0.23+0.02 0.024+0.003

ГСО 0 0

Исследование некоторых каталитических свойств ГСО показало, что рН ггимум реакции состааляег 7,8, константа Михаэлиса (по сукцинату) шняется 18 мМ. Наличие в глиоксисомах жирозапасаюшей ткани семян аков альтернативной системы, окисляющей сукцинат, по-видимому, иволяет осуществлять регуляцию распределения сукцината, интенсивно

образующегося при работе глиоксилатлого цикла. При низких концентрациях субстрата ГСО не насыщается и, так как активность его незначительна, основная часть сукцината транспортируется в митохондрии и окисляется через СДГ. В условиях прорастания мобилизация жирных кислот для глюконеогенеза приводит к резкой интенсификации образования янтарной кислоты.

Митохондриальная сукцинатдегидрогеназа ингибируется при накоплении АТФ и НАДН и не может обеспечивать быстрое окисления сукцината. И в этой ситуации, очевидно, наиболее выгодным является быстрое окисление, не связанное с запасанием энергии, которое осуществляется глиоксисомальной сукцинатоксидазой.

РОЛЬ РЕАКЦИИ ПЕРЕАМИНИРОВАНИЯ В ПРЕВРАЩЕНИИ СУКЦИНАТА В ЭНДОСПЕРМЕ КЛЕЩЕВИНЫ

Для животных тканей, находящихся в стрессовых условиях (в первую очередь в пшокс ических) было показано функционирование цикла Браунштейна. шунтирующего ЦТК через аспартатаминотрансферазную реакцию [Кондрашова, 1991]. Coleman и La\ietes [1981] указывали на наличие редуцированного цикла Кребса для пролиферирующих клеток активно растущих тканей. Вывод этот быт сделан на основании того, что цитрат в таких тканях не окисляется, а сукцинат активно метаболизируется.

Для эндосперма клещевины нами было показано, что превращение сукцината тормозится при ингибированин различных метаболических реакций. Поскольку ТТФА ингибировал как выделение 14С02 (на 60%), так и включение метки в сахара и аминокислоты (на 50 и 30% соответственно), можно предположить, что в эндосперме клещевины метаболизация сукцината непосредственно связана с сукцинат: убихинон редуктазой (рис. 1,2).

На рисунке 1 показано, что интенсивность декарбоксилирования при введении экзогенного 1,4-14С-сукцината значительно повышалась в присутствии фторацетата (более чем в 2 раза) и арсенита (почти в 2 раза). Аминооксиацетат, напротив, снижал интенсивность выделения ,4С02 на 20-

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Время, ч

-»-8мМТТФА; -■- 1 мМ аминооксиацетат; -Аг- контроль; -г- 2 мМ арсенит; 5 мМ фторацетат

Рис.1.Влияние ингибиторов метаболизма на выделение ,4С02 при введении 1,4- "*С-сукцината в эвдосперм клещевины

юо-

3 о о

с 2 80 -

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Время, ч

—А— Контроль 1 мМ ГАМ К -в— 1 мМ глутамат

Рис.2. Влияние метаболитов ГАМК-шунта на выделение "С02 при введении 1,4- "С-сукцината в эндосперм клещевины

30 %. Введение в инкубационную среду глугамата приводило к повышению суммарного декарбоксилировакия за 2,5 часа на 80-90 %, а ГАМК на 25-30 %. Присутствие ингибиторов оказывало существенное влияние на распределение радиоактивной метки между различными органическими соединениями (рис.2). Фторацетат интенсифицировал на 25-30 % включение радиоактивной метки во фракцию Сахаров. Введение АОА приводило к активации образования радиоактивных аминокислот и органических кислот на 30 и 100% соответственно. Включение метки в сахара ингибировалось на 3540 %. Присутствие в среде инкубации арсенита вызывало уменьшение радиоактивности аминокислот.

Интенсификация декарбоксилирования и активация включения метки в аланин (табл.3) под действием фторацетата объясняется декарбок-силированием маната или оксалоацетата с последующим аминированием пирувата при торможении ЦТК на уровне превращения цитрата аконитазой. При использовании арсенита, ингибирующего 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс и пируватдегидрогеназный комплекс, увеличивается радиоактивность

Таблица 3

Радиоактивность аминокислот при введении 2,3-14С-сукцииата

в высечки эндосперма клещевины

Аминокислота Контроль Фторацетат ТТФА Арсенит АОА

лизин 440+30 1690+100 490+30 200+10 300+20

глутамин и асларагин 1370+110 3570+200 1320+80 4040+220 1020+80

серин 320+20 1080+80 410+30 960+100 260+20

глицин 1020+70 2040+170 890+50 2870+120 680+40

глутамат и аспартат 3140+210 5620+290 2340+150 6830+380 980+60

треонин 660±40| 2180+140 420+40 1630+100 490+30

аланин 890+50 7670+520 970+70 3650+210 420+30

ГАМК 6500+320 4630+310 4300+240 5400+340 2100+150

метионин 3320+180 1800+100 2100+160 1520+90 2360+140

валин 2660+170 1770+90 2080+150 1840+140 1970+100|

лейцин 4180+210 4050+240 3160+250 3430+280 2140+110

гутамата, аспартата, аспарагина, глугамина (табл.3).

Введение в инкубационную среду глутамата повышает скорость ыделения 14С02- Это может быть объяснено тем, что ЦТК шунтируется ;акцией переаминирования: оксалоаиетата и глутамата в 2-оксоглутарат и шартат. При применении арсенита повышение интенсивности гкарбоксилирования сопровождается ростом радиоактивности фракции ахаров, что может достигаться за счет более интенсивного функционирования икарбоновой части цикла Кребса от сукцината до оксачоацетата. Усиление нтенсивности выделения 14СОг при инкубации с ГАМК позволяет редположить вероятность циклизации ускоренного метаболизма сукцината с спользованием реакции: оксалоацетат + ГАМК —»- полуальдегид янтарной ислоты + аспартат.

Таким образом, можно предположить, что в жирозапасающей ткани роростков клещевины в период интенсивной работы глиоксилатного цикла ункционирует путь от оксалоацетата к 2-оксоглутарату, связанный с работой минотрансфераз и необходимый для поддержания более интенсивной работы икла Кребса, который лимитируется участком от изоцитрата до сукцината.

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ ЭЛЕКТРОНТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ ПРИ ОКИСЛЕНИИ СУКЦИНАТА

Полярографическое исследование интенсивности дыхания на сукцинате тя митохондрий из различных растений показало, что в фотосинтезирующих <анях она значительно ниже, чем в этиолированных тканях проростков сои и эроха. Так, для митохондрий из семядолей сои интенсивность поглощения ислорода составляла 20 дМ/мин.мг белка, а для митохондрий из листьев шината всего 5 цМ/мин.мг белка (рис.3). Для фотосинтезирующих тканей астений показана возможность цианиднечувствительного дыхания на смеси MPD + аскорбат. Этот процесс ингибировался ингибиторами комплекса Ш -ятимицином и миксотаазолом, ингибитором альтернативной оксидазы имцилгидроксаматом и разобщителями (DNP и FCCP) (рис.3). То есть ожно предположить, что имел место обратный перенос электронов с итохрома с через комплекс Ш ЭТЦ на убихинон и далее на кислород через тьтернативную оксидазу.

дитохрома с через комплекс Ш ЭТЦ на убихннон и далее на кислород через альтернативную оксидазу.

В условиях интенсивного протекания процессов мобилизации запасных питательных веществ при прорастании возможно уменьшение концентрации АДФ и ингибирования цитохромного пути. Увеличение трансмембранного потенциала и восстановленности цитохромов приводит к интенсификации образования супероксидрадикала, который позднее может дисмутировать до перекиси водорода и далее превращаться в чрезвычайно агрессивный окислитель гидроксилрадикал. В наших исследованиях было показано, что дыхание в митохондриях из семядолей сои и гороха было чувствительно к салицилгидроксамату - ингибитору альтернативной оксидазы, который подавлял дыхание на 70-80 %, и практически нечувствительно к ингибиторам цитохромоксидазы 5 мМ азиду и 5 мМ цианиду (рис.3).

Нами было обнаружено, что растительные митохондрии в обычных условиях генерируют перекись водорода со скоростью 0,04-0,1 нмоль/мин.мг белка. Добаатение 2 ц.М антимицина ускоряло этот процесс до 0,17 нмоль/мин.мг белка, а в присутствии 1 мМ SHAM скорость образования Н2О2 равнялась 2,4 нмоль/мин.мг белка. При изучении процесса генерации перекиси водорода в митохондриях из печени крыс было показано, что антимицин А является индуктором генерации пероксида водорода, увеличивая скорость его образования с 0,19 до 0,40 нмоль/мин.мг белка (рис.4). SHAM в данной системе выступал как антиоксидант, вызывая ингибирование скорости образования Н2О2Д0 0,1 нмоль/мин.мг белка, что еще раз подтверждает, что действие салицилгидроксамата в растительных митохондриях связано не с химическим образованием перекиси водорода, а с нарушением работы электронтранспортной цепи митохондрий.

При исследовании влияния степени ингибирования альтернативной оксидазы на скорость генерации перекиси водорода было выяснено, что ингибирование цианид-резистентного пути вызывает экспоненциальный рост интенсивности продукции Н2О2. Так при базовой скорости генерации Н2О2 0,1 нмоль/мин.мг белка добавление сукцината и ротенона увеличивало ее до 0,24 нмоль/мин.мг белка, внесение в инкубационную среду 0,1 мМ SHAM увеличивало скорость генерации Н2О2 до 0,55 нмоль/мин.мг белка, 0,4 мМ

Мтх + 5 rriM сукцинат

| 0.2 mM TMPD

0 2 4 6 8 Время, мин

Рис.3.Изучение интенсивности дыхания митохондрий из листьев шпината (А) и семядолей сои (Б) при

Рис.4.Влияние ингибиторов ЭТЦ на скорость генерации Н202митохондриями из печени крыс (А) и семядолей сои (Б): мтх - митохондрии, анти - 2 (Д.М антимицин, SHAM - 1 mM салицилгидроксамат. Цифрами указана сорость генерации Нг02 (пмоль/ мин мт белка).

SHAM - до 1,66 нмоль/мин.мг белка, а 1,8 мМ SHAM - до 25 нмоль/мин.мг белка (табл.4).

Таблица 4.

Образование перекиси водорода при различной степени ингибироваиия альтернативной оксидазы

Вариант Контроль + 2 цМ антимицин + 5 мМ KCN

мтх 0,1 0,1 0

+ 5 мМ сукшшат 0,24 0,25 0

+0,1 мМ SHAM 0.55 0.55 0

+0,2 мМ SHAM 0.90 1.00 0

+0,4 мМ SHAM 1.66 2.5 0.10

+0,8 мМ SHAM 3.16 3.2 0.10

+ 1,8 мМ SHAM 25.0 - 0.25

Антимицин в концентрации 2 рМ ускорял процесс образования пероксида водорода, а 5 мМ КСК выступал как сильный антиоксидант, практически полностью блокируя генерацию перекиси водорода. Эти данные свидетельствуют о том, что альтернативная оксидаза, путь индуцируемый окислительным стрессом и участвующий в поддержании компонентов электронтранспортной цепи в относительно окисленном состоянии может являться механизмом защиты от интенсивного образования восстановленных форм кислорода.

ИНДУКЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ

Изучение активности ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс показато отсутствие ферментативной активности изоцитратлиазы и малатсшгтазы (табл.5). На 3-й день пишевой депривации нами наблюдалась индукция этих ферментов, а на 5-й день голодания активность изоцитратлиазы и малагсинтазы была максимальной и составляла для гомогената ткани печени 0,06 и 0,03 ФЕ/мг белка, соответственно. К пятому дню пищевой депривации происходило возрастание как общей, так и удельной активности

Таблица 5

Индукция ферментов глиоксилатного цикла при голодании.

Удельная активность ферментов, ФЕ/мг белка.

Изоцитратлиаза Малатсинтаза Малатде-гидрогеназа Цитрат-синтаза Аконитат-гидратаза

контроль 0 0 0.060±0.003 0.056+0.002 0.093+0.003

5 дней олодания 0.061+0.005 о.озо±о.ооз 0.120+0.005 0.101+0.003 0.095+0.003

алатдегидрогеназы и цитратсинтазы. Для МДГ было показано появление овой изоформы с 1И 0,46. Активность аконитатгидратазы заметно не з менялась.

С использованием изоплотносгного центрифугирования в градиенте тотности сахарозы было установлено, что изоцлтратлиаза и малатсинтаза экализованы во фракции микротелец. Учитывая наличие в этих органеллах ерментов (3-окисления (Ьагаго\у, 1982), микротельца печени крыс можно гитать полноценными глиоксисомами.

Для изучения каталитических и регуляторных свойств изоцитратлиазы из ечени голодающих крыс нами была проведена очистка фермента, результаты эторой приведены в таблице 6. Применение фракционирования (ИЩ^С^, онообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации на оуореаг1 HW-65 позволило получить препарат с удельной активностью 9,0 ФЕ а 1 мг белка, что соответствует ЮО-кратной очистке, и 8,2% выходом ермента. Активность высокоочищенной изоцитратлиазы при хранении репарата фермента при 4°С снижалась за первые двое суток на 15 %, а в альнейшем примерно на 20-30 % каждые сутки. При разработке условий /штельного хранения полученного ферментативного препарата было ;тановлено, что оптимальными для изоцитратлиазы яатяются следующие зловия: среда, содержащая 0,1 М грис-НС1 буфер (рН 7,5), 3 мМ МйС]^, 3 М дитиотрейтол, 25 % глицерин, и температура -15°С. При таких условиях в :чение 5 дней сохранялось 90 % исходной активности, 20 дней - 65 %.

Таблица 6

Очистка изоцитратлиазы из печени крыс

Стадия Удельная активность, ФЕ Общий белок, мт Удельная активность, ФЕ/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат 24.8 276.0 0.09 100 1

Фракционирование сульфатом аммония (50-70 % насыщения) 15.1 72.0 0.21 60.8 2.3

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 5.7 2.2 2.60 23.1 28.9

Гель-фильтрация на Toyopearl HW-65 2.0 0.3 9.04 8.2 Ю0.5

При определении молекулярной массы изоцитратлиазы с помощью гель-фильтрации на Toyopearl HW-65 установлено, что ее значение составляет 145 кДа. Изучение каталитических свойств изоцитратлиазы показало, что фермент подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, и что значение Км по изоцитрату составило 70 цМ. рН оптимум изоцитратлиазы из печени крыс при определении в трис-HCl буфере равен 7,4 (рис.5). Исследование влияния интермедиатов клеточного метаболизма на активность изоцитратлиазы позволило обнаружить, что глкжозо-1 -фосфат и глюкозо-6-фосфат ингибируют данный фермент по конкурентному типу. Рассчитанные по методу Диксона [1982] значения констант ингибирования составили для глюкозо-1-фосфата 1,1 мМ, для глюкозо-6-фосфата 1,9 мМ (рис.6). 0,1 мМ ADP вызывал активацию фермента на 65-70 %. Инкубация с ATP, NAD и NADH не оказывала существенного влияния на активность изоцитратлиазы.

Малатсинтаза из печени голодающих крыс была очищена с помощью преципитации (NH4)2S04 и гель-фильтрации на сефадексе G-25 в 5,2 раза с выходом 45 То. Малатсинтаза из печени крыс также характеризуется кинетикой

6.5 6.8 7.1 7.4 7.7 8.0 РН

Рис.5.Влияние рН на активность изоцитратлиазы (1) и мадатсинтазы (2) из печени голодающих крыс.

1/^, ФЕ"'МЛ. 0.6 г

1 ФЕ'1 • мл. 0.6 г

Рис.6.Определение констант ингибирования изоцитратлиазы глюкозо-1-фосфатом (А) и глюкозо-6-фосфатом (Б): 1 - 4 мМ изоцитрат, 2-2 мМ изоцитрат.

Малатсинтаза из печени голодающих крыс была очищена с помощью преципитации (ХН^ЙС^ и гель-фильтрации на сефадексе С-25 в 5,2 раза с выходом 45 %. Малатсинтаза из печени крыс также характеризуется кинетикой Михаэлиса-Ментен с Км (по ацетил-КоА) 0,2 мМ и Км (по глиоксилату) = 3,0 мМ, рН оптимум составил 7.6 (рис.5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Янтарная кислота яатяется одним из важнейших интермедиатов клеточного метаболизма. В клетках сукцинат образуется и утилизируется при работе ряда ферментов, обеспечивающих функционирование центральных метаболических путей. Множественность ферментативных реакций, связанных с одним субстратом - сукцинатом, позволяет осуществлять тонкую регуляцию различных метаболических процессов, обеспечивающих внутриклеточный гомеостаз при изменении условий окружающей среды.

При изучении метаболизма сукиината нами было показано, что его интенсификация связана с работой глиоксилатного цикла как в растительных, так и в животных тканях (рис. 7). Интенсивное образование янтарной кислоты приводит к значительным изменениям метаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так при прорастании семян злаковых функционирует впервые обнаруженная нами глиоксисомальная сукцинатоксидаза, основной функцией которой является быстрое, не связанное с запасанием энергии окисление сукцината непосредственно в глиоксисомах, позволяющее снять аденилатный контроль электротранспортной цепи митохондрий. В эндосперме клещевины при прорастании в период интенсивной работы глиоксилатного цикла происходит шунтирование цикла Кребса через аминотрансферазные реакции, что позволяет обойти лимитирующие этапы и также способствует интенсивной метаболизации сукцината. Установлено, что окисление сукцината в тканях проростков преимущественно сопряжено с работой альтернативной оксидазы, что, по-видимому, позволяет регулировать редокс-статус митохондрий и предупреждать избыточное образование восстановленных форм кислорода. Для печени крыс впервые показана индукция ферментов глиоксилатного цикла, позволяющая мобилизовывать жиры и через сукцинат направлять их на глюконеогенез или поддержание энергетического баланса клетки.

'.Схема метаболизма янтарной кислоты в условиях интенсивного ционирования глиоксилатного цикла: 1 - митохондрия, {утренняя митохондриальная мембрана, 3 - глиоксисома.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что интенсивное образование янтарной кислоты в тлиоксилатном цикле приводит к значительным изменениям метаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так, установлено, что в жирозапасаклцих органах злаковых растений существует система глиоксисомального окисления сукцината, осуществляющая окисление янтарной кислоты до малата с образованием перекиси водорода.

2. Выявлено, что глиоксисомальная сукцинатоксидаза является флавинсодержащим ферментом, максимальная активность которого обнаруживается на четвертый день прорастания семян злаковых растений. Изучение каталитических свойств данного фермента показало, что он обладает значительно меньшим сродством к субстрату, чем митохондриальная сукцинатдегидрогеназа.

3. Для эндосперма клещевины обнаружено, что при прорастании в период интенсивной работы глиоксилатного цикла важную роль в метаболизме сукцината играют реакции переаминирования. Предложена модель участия ГАМК-шунта в шунтировании цикла Кребса при ускоренном метаболизме янтарной кислоты.

4. Для митохондрий из семядолей сои и гороха выявлено, что генерация перекиси водорода усиливается при добавлении экзогенного сукцината. Ингибирование альтернативной оксидазы салицилгидроксамовой кислотой приводило к значительному увеличению скорости генерации перекиси водорода растительными митохондриями. Сделано заключение о том, что одной из функций альтернативной оксидазы является защита митоховдриалыюй ЭТЦ от избыточной генерации восстановленных форм кислорода.

5. Показано, что при окислении сукцината растительными митохондриями антимицин А, ингибирующий элекгронтранспортную цепь митохондрий за счет блокирования работы Q-цикла, увеличивал интенсивность индуцируемой SHAM продукции Н2О2. Цианид практически полностью подавлял этот процесс.

6. Выявлено, что мобилизация жирных кислот может быть связана с работой глиоксилатного цикла как в растительной, так и в животной клетках.

Токазано, что пероксисомы из печени голодающих крыс содержат ключевые ферменты глиоксилатного цикла, то есть являются глиоксисомами.

7. Впервые установлено, что в печени крыс при голодании происходит щдукция ферментов глиоксилатного цикла: изоцитратлиазы, малатсинтазы, (итратсинтазы и малатдегидротеназы. Изоцитратлиаза и малатсинтаза юявляются в печени на 3 день пищевой депривации, а для (алатдегидрогеназы на 5 день голодания обнаруживается новая изоформа с Rf 1,46.

8. Впервые получена в гомогенном состоянии изоцитратлиаза из сивотных тканей. Изоцитратлиаза из печени крыс имела удельную активность '.04 ФЕ/мг белка, ее выход при очистке составил 8,2%, а степень очистки авнялась 100.5. Показано, что животная и растительная ИЦЛ имеют сходные шзико-химические и каталитические свойства.

9. Обнаружена возможность регуляции работы глиоксилатного цикла [нтермедиатами глюконеогенеза. Установлено, что АДФ является активатором,

глюкозо-1-фосфат и глкжозо-6-фосфат являются конкурентными [нгибиторами изоцитратлиазы из печени крыс.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Игамбердиев А.У., Попов В.Н., Фалатеева М.И. Особенности [етаболизма сукцината в жирозапасающей ткани прорастающих семян злаков / Физиология растений. 1995. Т. 42, N1, С. 100-105.

2. Igamberdiev A.U., Popov V.N., Falaleeva M.I. Alternative system of iccinate oxidation in glyoxysomes of higher plants. // FEBS Letters. 1995. V. 367, 87-290.

3. Игамбердиев А.У., Попов B.H. Роль реакций переаминирования в етаболизме сукцината в эндосперме проростков клещевины // Физиология астений // 1996. Т. 43. Вып.4. 548-553.

4. Popov V.N., Igamberdiev A.U., Schnarrenberger С., Volvenkin S.V. iduction of the Glyoxylate Cycle Enzymes in Rat Liver upon Food Starvation // EBS Lett. 1996. V. 390, p. 258-260.

5. Попов B.H., Игамбердиев А.У., Волвенкин C.B. Очистка и свойства зоцитратлиазы и малатсинтазы из печени голодающих крыс // Биохимия. Э96. Т. 61. Вып. 10, С. 1902-1907.

6. Igamberdiev A.U.,Popov V.N.,Falaleeva M.I. Glyoxysomal pathway o: succinate oxidation in scutella of cereal seedlings // Biologia Plantarum. 1994. V.3f (Suppl.). S178 (Abstr.ll 07).

7. Игамбердиев А.У., Попов B.H. Очистка и некоторые киинетическм характеристики глиоксисомального сукцинатоксидазного комплекса из щитко] злаков // Материалы международного симпозиума "Физико-химически основы функционирования белков и их комплексов, Воронеж, 1995, С.63-65.

8. Попов В.Н Альтернативная система окисления сукцината i глиоксисомах высших растений // Материалы 32 Международной научно: студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс' Новосибирск, 1994, С. 28.

9. Попов В.Н., Игамбердиев А.У. Окисление янтарной , кислоты эндосперме проростков клещевины // Тезисы Международного совещани "Дыхание растений: физиологические и экологические аспекты", Сыктывкар 1995, С. 105-107 . ..

.10. Popov V.N., Igamberdiev A.U. Utilization of succinate in castor bea . endosperm // Physical and Chemical Basis of Plant Physiology. Annual Symposiun 5-8 February,: 1996, Penza. Abstracts. Pushchino: Pushchino.Research Centre, 199<

11. Pinheiro M.A.A., Popov V.V., Eprintsev A.T:, Igamberdiev A:U.T1 tricarboxylic acid cycle transformation in conditions of intensive gluconeogenesis i castor bean endosperm// Plant Physiol, and Biochem. 1996. Special issue, P. 118,

12. Popov V.N., Igamberdiev A.U. The role of redused oxygen species i succinate oxidation in glyoxysomes of higher plants // Book of Abstracts of 2r International conference "Oxygen, free radicals and environmental stress in plants Vienna/Austria, 1996, P. 65.

p.34,

Заказ f&C отОб 05. 1997 г. Tup. fOO экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ.