Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Коррекция гипоксических состояний путем поддержания функций митохондрий
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Коррекция гипоксических состояний путем поддержания функций митохондрий"
(\ч
^ V ПРаВаХ РУКОПИСИ
Маевский Евгений Ильич
КОРРЕКЦИЯ ГИПОКСИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ПУТЕМ ПОДДЕРЖАНИЯ ФУНКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ
(03.00.04 - биохимия)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Москва, 1998
Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной
биофизики РАН
Научный консультант доктор биологических наук, профессор М.Н.Кондрашова
Официальные оппоненты -член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук,
профессор Л.Д. Лукьянова доктор биологических наук О.И. Писаренко доктор медицинских наук, профессор Р.Т. Тогузов ,
Ведущая организация -
Гематологический научный центр РАМН
Защита состоится « В ОПрСАЯ 1998 года в ^час. на заседании диссертационного совета Д 053.22.02 в Российском "Университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 8, Медицинский факультет.
С диссертационной работой можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского Университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.
Автореферат разослан « Марта. 1998 года.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор
В.Э.Торбек
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Проблема коррекции гипоксических состояний, поиск а создание противогилоксических средств имеют непреходящее значение для биологии и медицины [Э.Ван Лир, К.Стикней, 1967;: М.Н.Кондрашова, 1979-1997; Г.А.Рябов, 1988; Л.Д.Лукьянова, 1989-1997; М.И.Биленко, 1989,1997; К.П.Иванов, 1993]. В последние годы появились свидетельства того, что у аэробных организмов полноценное восстановление в постгипоксический и постишемический периоды зависит не столько от сохранности уровня АТР, депо субстратов, трансмембранных градиентов ионов, активации гликолиза, или накопления недоокисленных метаболитов и продуктов перекисного окисления липидов, сколько от сохранности функций митохондрий (MX) [V.Regitz et al., 1984; P.W.Hochachka, M.Guppy, 1987; D.P.Jones, 1995]. Анализ литературного материала и наш собственный опыт дают основание полагать, что эффективная защита от кислородного голодания должна быть основана на эволюционно закрепленных физиологических и биохимических механизмах. На уровне MX это могли бы быть реакции анаэробного образования сукцината (АОС), развитые у факультативных и облигатных анаэробов [П.Хочачка, Дж.Сомеро, 1977, 1983]. Однако до настоящего времени АОС практически не используется для повышения устойчивости к кислородному голоданию не столько из-за не изученности всего разнообразия путей и регуляции АОС, сколько в ввиду существенных различий в оценке энергетической эффективности процесса АОС [A.FIuharty, D.Sanady, 1963; H.Hoberman, L.Prosky, 1967; M.Wilson, J.Cascarano, 1970; H.Taegthmeyer, 1978; G.Gronov, J.Cohen, 1984; О.И.Писаренко, 1984,1986; R.Wiesner et al., 1988; V.Grivennikova et al., 1993]. На уровне целостного организма обеспечение сохранности функций MX при кислородном голодании достигается также мобилизацией компенсаторных механизмов доставки кислорода, их искусственной активацией и созданием кислородпереносящих препаратов [Е.А.Коваленко, 1976,' К.П.Иванов, 1993; B.C. Ярочкин, В.В.Кочемасов, 1997].
В соответствии с изложенным цель настоящего исследования заключалась в выяснении возможных путей и механизмов редокс-зависимой энергопродукции в митоходриях, роли образования и окисления сукцината в условиях кислородного голодания, для обоснования подходов и средств защиты от гипоксии и ишемии путем поддержания функций митохондрий.
Поставленная цель достигалась решением следующих задач:
Исследованием метаболических превращений в митохондриях тканей животных в условиях анаэробиоза и гипоксии для разработки подходов, способствующих поддержанию редокс-зависимой энергопродукции в митохондриях и клетках при кислородном голодании.
Выявлением характерных отклонений и различий в реакциях дыхательной цепи митохондрий при гипоксии и ишемии.
Разработкой методов коррекции метаболического ацидоза при гипоксии, основанных на изучении участия митохондрий в поддержании кислотно-основного состояния в тканях.
Оценкой эффективности эмульсии перфторорганических соединений как противоишемического средства на уровне целого организма путем анализа функционального состояния митохондрий.
Научная новизна
Экспериментально показано, что в анаэробных условиях в МХ тканей животных из многих теоретически возможных реакций АОС реализуются три основные пути (в порядке увеличения интенсивности): восстановительное обращения цикла Кребса; дисмугация а-кетоглутарата до глутамата и сукцината; и одновременное восстановительное обращение цикла Кребса и окисление а-кетоглутарата.
Обнаружена энергетическая регуляция АОС в МХ, подобная явлению дыхательного контроля в реакциях окислительного фосфорилирования: стимуляция в присутствии акцепторов макроэргического фосфата и торможение при наличии альтернативного источника АТР.
Впервые установлено, что исследованные пути АОС имеют разную энергетическую эффективность. Наиболее мощным является одновременное восстановительное обращение цикла Кребса и окисление а-кетоглутарата; тогда как дисмутация а-кетоглутарата в МХ печени энергетически мало эффективна.
Выявлено неизвестное ранее спонтанное поочередное включение путей АОС, связанное с изменением энергетического состояния МХ и сопровождающееся падением энергетической эффективности АОС.
Предложена гипотеза, согласно которой АОС выполняет несколько функций: образование богатых энергией соединений, обеспечение оттока восстановительных эквивалентов из цитозоля через редокс челноки, поддержание функционирования ферментных систем цикла Кребса и дыхательной цепи при ограничении доступа кислорода, накопление сукцината, используемого при последующей реоксигенации для восстановления энергетического статуса МХ и торможения реакций перекисного окисления.
Обращено внимание на роль окислительного фосфорилирования в поддержании рН при АТФ-азных нагрузках. Впервые экспериментально показано, что при АТФ-азных нагрузках in vitro и in vivo величина развивающегося ацидоза может быть уменьшена путем увеличения доли окислительного фосфорилирования в энергообеспечении за счет использования экзогенных митохондриальных субстратов. На объектах разного уровня организации показано, что сукцинат эффективнее уменьшает ацидоз, чем другие субстраты, окисляющиеся в МХ.
С использованием метода меченых атомов (радиоактивного изотопа 14С и стабильного изотопа 13С) впервые показано, что в условиях организма экзогенный сукцинат способен проникать в ткани и окисляться до С02.
Впервые показано, что по изменению скоростей и степени сопряжения фосфорилирующего дыхания МХ можно отличить постгипоксические сдвиги от постишемических, развивающихся на уровне ткани: после острой гипоксии повышаются скорости дыхания и фосфорилирования без явного разобщения окислительного фосфорилирования, тогда как для ишемии характерно разобщение окислительного фосфорилирования и падение скоростей фосфорилирующего дыхания. Установлено, что постгипоксическая активация и ишемическое падение скоростей фосфорилирующего дыхания отражают воздействие возрастающих концентраций свободных жирных кислот и ионов кальция, приводящих к набуханию МХ и к активации окисления сукцината после острой гипоксии, тогда как после ишемии наблюдается щавелевоук-сусное торможение окисления сукцината.
Впервые обнаружена биологическая активность у химически инертных перфторорганических соединений (ПФОС), проявляющаяся на уровне изолированных МХ в ускорении переноса восстановительных эквивалентов на ротенон-чувствительном участке дыхательной цепи.
На основании анализа реакций МХ печени и параметров энергетического обмена в ткани почки показана противоишемическая эффективность субмикронной эмульсии ПФОС на уровне целого организма.
Практическая значимость
Представленные в работе материалы могут служить теоретическим и экспериментальным обоснованием для практического использования:
- субстратов - источников сукцината для поддержания энергетического обмена в тканях при кислородном голодании - гипоксии и ишемии;
- экзогенного сукцината в качестве противогипоксического и противо-ацидотического средства, в частности, в условиях рабочей гипоксии, обусловленной повышенным потреблением кислорода при физической нагрузке;
- субмикронных эмульсий перфторорганических соединений в качестве противоишемического средства.
В эксперименте на животных и при обследовании спортсменов показана возможность коррекции кислотно-основной системы крови с помощью субстратов энергетического обмена. Наиболее эффективным противоацидотиче-ским субстратом оказался сукцинат аммония. Эти результаты использованы при создании пищевых добавок «Янтавит» и «Донор Эл» .
Показана эффективность использования МХ как тест-системы для отбора компонентов эмульсии перфторорганических соединений.
Разработан оригинальный способ получения эмульсий перфторорганических соединений
Апробация материалов работы
Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах по биохимии митохондрий в Одессе (1976 г), Гданьске, ПНР (1977), Эльбингероде, ГДР (1981), Пущино (1989), Болонье, Италия (1991);
на Всесоюзных симпозиумах по биохимии митохондрий в 1971, 1973 г.; Всесоюзном Биохимическом съезде в 1979 г.; 1-ом Всесоюзном Биофизическом съезде в 1982 г.; Всесоюзном симпозиуме по кардиоплегии в 1982 г.; на Всесоюзных и Всероссийских конференциях по перфторуглеродным газопере-носящим средам в 1980 г., 1982 г., 1984 г., 1987 г., 1989 г., 1993 г. и по гипоксии в 1989 г., 1996 г. и 1997 г.; на Съезде биохимического общества РАН в 1997 году. В настоящую работу частично включены материалы, кандидатских диссертаций Е.В.Гришиной (1997), Н.Н.Брустовецкого (1988), И.Б.Гузара (1984), А.С.Розенфельда (1983), В.Б.Борзова (1979), выполненных под руководство Е.И.Маевского.
По материалам работы опубликовано 10 авторских свидетельств и патентов на изобретения, 2 коллективные монографии, более 46 статей и 25 тезисов. Оформлены и зарегистрированы Временная Фармакопейная статья на препарат на основе эмульсий перфторорганических соединений Перфторан (1984 г., 1986 г.,1989 г.). Совместно с М.Н.Кондрашовой и сотрудниками ИТЭБ РАН, ПФК «Внедрение», ООО «Вектор-2М» и АО «Диод» созданы пищевые добавки «Янтавит» (1996 г) и «Донор Эл» (1997 г).
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка литературы, всего JSО страниц машинописного текста.
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Анаэробное образование сукцината в митохондриях тканей животных. Общеизвестно, что в анаэробных условиях активированный гликолиз обеспечивает ресинтез АТФ в реакциях субстратного фосфорилирования, завершающихся накоплением лактата [А.Ленинджер, 1985; К.П.Иванов, 1992]. Менее известен и мало учитывается другой процесс, протекающий в MX тканей животных в условиях высокой восстановленности пиридиннуклеоти-дов (ПН), в частности при гипоксии и аноксии - анаэробное образование сукцината (АОС) за счет окислительно-восстановительных превращений интер-медиатов углеводного обмена и аминоксилот [M.S.Olson, R.W.Von Korff. 1967; М.Wilson, J.Cascarano, 1970; М.Н.Кондрашова, Н.Р.Чаговец, 1972; М.Н.Кондрашова и др., 1973; П.Хочачка, Дж. Сомеро,1977; H.Taegthmeyer, 1978; G.Gronov, J.Cohen, 1984; О.И.Писаренко, 1984-1986; R.Wiesner et al„ 1988; Grivennikova et al., 1993]. Согласно карте метаболических путей любые превращения, обеспечивающие образование одной молекулы сукцината в анаэробных условиях должны сопровождаться образованием одной молекулы богатого энергией соединения. В связи с этим появились попытки стимуляции АОС в MX для поддержания энергетического состояния тканей при кислородном голодании. Однако представленные в литературе оценки энергетической эффективности этого процесса оказались весьма противоречивыми вплоть до полного отрицания какой-либо энергетической эффективности АОС в тканях животных [C.Hohl et al.,1987]. Причем разные исследователи отдавали предпочтение разным путям АОС в трудно сопоставимых условиях. 6
2.1.1.Пути и регуляция анаэробного образования сукцината в митохондриях печени, коркового слоя почек и сердца.
Ранее возможные пути образования сукцината при увеличении степени восстановленное™ ПН схематически описывались М.Н.Кондрашовой (19691973), H.Taegthmeyer (1984) и П.Хочачкой и Дж.Сомера (1977, 1988). Экспериментально различные пути АОС в MX и ткани сердца исследованы D.G.Penney, J.Cascarano (1970), O.I Pisarenko et al.(1983), О.И.Писаренко и др.(1984-1986), И.М.Студневой (1989), Y.Choong et al.(1988).
Интенсивность и энергетическую эффективность возможных путей АОС в MX печени, коркового слоя почек и сердца крыс, а также в печени морской свинки мы измеряли методом Н'-ЯМР-спектроскопии [O.I.Pisarenko et al. 1986] и энзиматически [Bergmeyer, 1978 ]. Этот фрагмент работы выполнен совместно с Е.В.Гришиной [1997]. В экспериментах использовано 220 белых крыс-самцов линии "Wistar" весом 180-25 Ог и 15 морских свинок весом 300-3 50г.
Промерив практически все возможные пути и источники АОС в MX, мы пришли к выводу, что наиболее значимыми по интенсивности являются следующие.
1) Восстановительное обращение цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) от оксалоацетата (ОАА), малата или фумарата до сукцината При этом окисление флавопротеидов дыхатель- NAD* NADH2 ной цепи обеспечивает поддер- ^^ АцН4«—
жание NADH-флавин-оксидо- \ 7 FPOHj FAD+
OAAi—4МАПАТ —\ ФУМАРАГ-—СУКЦИНАТ
редуктазнои реакции, сопряженной с фосфорилированием АТР и генерацией Д цН+ на внутренней мембране MX [D.R.Sanadi, A.L.Fluharty.,1963; H.D.Hoberman, L.Prosky, 1967; M.A.Wilson, J.Cascarano, 1970; V.G.Grivennikova et al., 1993].
Непосредственно с восстановительным обращением ЦТК связано образование сукцината из субстратов, превращающихся в ОАА, в том числе хорошо известное из аспартата (АСП): АСП + а-КГ —> ОАА + Глутамат в аспарта-таминотрансферазной реакции, а также в митохондриях печени морской свинки из фосфоенолпирувата (ФЕП) в фосфоешлпируват-карбоксикиназной реакции : ФЕП + СО2+ TDP —> ОАА + ГТР, в анаэробных условиях показанной ранее только у микроорганизмов и двустворчатых моллюсков [П.Хочачка, Дж.Сомеро, 1977, 1988].
2) Обычные окислительные реакции ЦТК, осуществляемые за счет использования окисленного NAD, который образуются при восстановительном обращении ЦТК [О.И.Писаренко и др., 1986; D.G.Penney, J.Cascarano, 1970]. При этом источниками богатых энергией соединений могут быть окислительное фосфорилирование (1), поддерживаемое протоком восстановтиель
ОА-
Сукцинат-л/fiH
■-КГ ных эквивалентов между пиридиннук-леотидами (ПН) и флавопротеидами (ФП) в процессе восстановительного обращения ЦГК и субстратное фосфо-рилирование (2) на уровне сукцинил-"Сукцинат КоА при окислении а-кетоглутарата.
3).Анаэробная дисмутация а-КГ по Кребсу и Козну в присутствии аммония, при которой одна молекула а-КГ вовлекается в восстановительное ами-нирование с образованием глутамата и одновременным окислением ПН, кото-
мн:
а-КГ-
Т"
NADPH
>ч
NADP*
лутамат
ос-КГ-
NAD _^
NADH
ÄpH<— АТР GTP
—> ICYKUHHÄTI
GDP+P,
СО,
рые затем используются для окисления другой молекулы а-КГ до сук-цината в а-кетоглута-ратдегидрогеназной реакции, обеспечивающей прохождение субстратного фосфорилирова-ния.
До настоящего времени в исследованиях АОС этот путь не учитывался. Наше внимание к нему привлекли данные Ю.Г.Каминского [1973] и Е.Б.Окон [1977] о ротенон-нечувствительном окислении восстановленных ПН (ПНН). Продолжив эти исследования вместе с М.Н.Кондрашовой и Д.Б.Борзовым [1979], мы выяснили, что при остановке дыхательной цепи ротеноном, анти-мицином А или цианидом может происходить значительное окисление восстановленных ПН, если в среде присутствуют одновременно сукцинат, а-кетоглутарат и аммоний (рис. 1, кривая 1).
Змм KCN (Сукц.) t
5мм
ЗОмкм ДНФ
5мкм ротенон
а-КГ 5мм
мапонат 5мм
Рис.1. Редокс превращения ПН (1) при закрытой дыхательной цепи и роте-нон-нечувствительное окисление а-кетоглутарата (2) в MX печени крысы. Изменение порядка добавления сукцината и цианида не изменяет ход редокс реакций. Инкубационная среда: 250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 10 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ КН2Р04, (MX - 2-3 мг на мл); 126°С.
Сопоставляя эти данные по окислению Г1НН с феноменом ротенон-нечувствительного окисления а-КГ (рис.1, кривая 2), мы предположили, что оба эти явления свидетельствуют об анаэробной дисмутации а-КГ.
Н-ЯМР-спектромегрический анализ подтвердил предположение о том, что в описанных условиях из а-КГ в присутствии аммония могут образовываться одновременно сукцинат и глутамат
Соотношение скоростей различных путей АОС определяли по динамике 'Н-ЯМР-спектров для субстратов и продуктов реакций. 'Н-ЯМР-спектры регистрировал М.С.Окон на ЯМР-спектрометре 400 МГц, фирмы Bruker (ФРГ). В этих экспериментах MX выделяли и инкубировали в среде без сахарозы, заменяя ее на 0,15 М KCl.
Как показано на рис.2, скорости различных путей АОС неодинаковы. Самым мощным источником образования сукцината в MX печени является сопряжение двух потоков восстановительного обращения ЦТК и окисления а-КГ, особенно когда исходными субстратами служат а-КГ с АСП или а-КГ с малатом. В этих случаях а-КГ равномерно утилизируется практически до полного исчерпания. Следующий по активности путь АОС - дисмутация а-КГ по Krebs H.A. и Cohen P.P.[1939] до сукцината и глутамата. Восстановительное обращение ЦТК (от ОАА, малата или фумарата до сукцината) в наших экспериментах происходило в 4-6 раз медленнее, чем анаэробное образование сукцината из пары субстратов а-КГ с АСП и в 2-3 раза медленнее анаэробной дисмутации а-КГ.
Рис.2. Сравнение АОС в МХ печени крысы (А) и морской свинки (Б) из: а-КГ с аспартатом; а-КГ п присутствии аммония; малата; ФЕП. Каждая точка на кривой - среднее из 4-10 экспериментов. Спектры Н-ЯМР записывали после 50 накоплений. Начальные концентрации добавленных субстратов по 5 мМ; ЫН4С! 2,5 мМ; антимицнна А 0,4 мкг на мг белка МХ; концентрация МХ 12-20 мг белка на мл, г 26Т.
В МХ сердца и почки крысы скорости восстановительного обращения цикла Кребса и анаэробной дисмутации а-КГ практически одинаковы. В МХ сердца все скорости АОС выше, чем в МХ печени и почек.
В МХ печени морской свинки, имеющих в отличие от МХ печени крысы активную фосфоенолпируваткарбоксикиназу [Н.Ьагс1у, ИчогсНу, 1963; D.Saggerson,1975; Е.И.Маевский, М.Н.Кондрашова, 1978], мы обнаружили, что скорость АОС из ФЕП в присутствии 10 мМ КНС03 превышала скорости других путей АОС (рис.2 Б). Ранее в МХ тканей животных АОС из ФЕП никто не описывал.
Скорости превращения в сукцинат добавленных по отдельности фумара-та, а-КГ во всех видах исследованных МХ не превышали 8 им в мин на мг белка. Практически не образуется сукцинат из глутамина, глутамата, алани-на, аспартата, изоцитрата и пирувата.
Зависимость АОС от энергетического состояния МХ была обнаружена для всех исследованных путей АОС (рис. 3). В высокоэнергетическом состоянии, создаваемом исходно высоким отношением АТФ/АДФ (3/1) или внесением в среду альтернативного источника АТФ (фосфокреатина с креа-
Рис.З. Влияние энергетического состояния на АОС из различных субстратов в МХ печени. Добавки: субстратов, как на рис.2; 1 мМ АТР, ЗмМ АОР, 0,3 ед. Креатин-киназы (КК), 15 мМ фосфокреатина (РКг), 5 мкм С1ССР. Время регистрации 'Н-ЯМР спектров 2,5 мин.
тинкиназой) АОС было заторможено. В низкоэнергетическом состоянии при малой величине отношения АТР/АОР (1/3) скорости АОС были максимальными. При разобщении окислительного фосфорилирования скорость АОС из а-КГ с аспартатом и в ходе анаэробной дисмутации а-КГ возрастала, но резко снижалась при восстановительном обращении ЦТК. Последнее, может быть, связано с падением трансмембранного потенциала, необходимого для транспорта малата в МХ, и/или с тесным сопряжением процесса восстановительного обращения ЦТК с реакциями окислительного фосфорилирования.
Таким образом реакции АОС зависят от энергетического состояния МХ и подобно всем системам образования богатых энергией соединений в клетках находятся под энергетическим контролем.
'я4
^ 40
ш хо
"зо
5 20
•В
&
£10
о
о
£
А
сЖГ+АСП оС-КГ+ГЩ,С1 Малат
Энергетическая эффективность различных путей АОС определялась при моделировании in vitro гипоксических и аноксических состояний. При гипоксии согласно исследованиям, выполненным в лаборатории B.Chance [R.Sholz et al., 1969] ПН восстановлены полностью, а флавины и терминальный участок дыхательной цепи еще окислены, тогда как при аноксии восстановлены и ПН, и флавины. Соответственно состояние гипоксии моделировали добавлением ротенона, блокирующего окисление ПН в дыхательной цепи, а состояние аноксии - добавлением антимицина А.
Как показано на рис.4, после остановки дыхательной цепи ротеноном восстановление трансмембранного потенциала в MX обеспечивается в полной мере при окислении добавленного сукцината, и частично субстратами источниками АОС.
Рис.4. Изменение концентрации липофиль-ного катиона тетрафе-нилфосфония (ТФФ), измеренное с помощью ТФФ-чувстви-тельного электрода в суспензии МХ печени под влиянием ротенона и экзогенных субстратов (сукцината и источников АОС). Условия инкубации, как на рис.1. Добавки: субстратов по 5 мМ, 5 мкМ ротенона. Концентрация мх 4 мг Падение Аф белка на мл.
сукцинат
«-КГ+АСП
МАЛ+пир «-Iff+NHjCl
рЭМ
ч Г
MX +Субстрат
По способности поддерживать А\|/ на мембране МХ источники АОС распределись следующим образом: самый мощный источник пара а-КГ-АСП, затем малат и, наконец, дисмутация а-КГ. Подобная закономерность в сохранении А\\1 наблюдалась при АОС в присутствии антимицина А. При использовании а-КГ в сочетании с АСП величина падения Д\[/ не превышала 40,0 тУ, тогда как в присутствии а-КГ с аммонием или р-оксибутирата (|3-ОМ), не превращающимся в сукцинат, Ау снижался на 58,5 тУ и 60 тУ соответственно. Падение А*)/ при АОС из маната не превышало 45,7 шУ.
По изменению уровня АТР и величине отношения АТР/АБР (табл. 1) также видно, что наиболее энергетически продуктивными источниками являются пути, запускаемые а-КГ с АСП и а-КГ с малатом. Анаэробная дисмутация а-КГ энергетически не эффективна.
Таблица 1.
Состояние фонда адениловых нуклеотидов* в МХ печени крысы в анаэробных условиях в присутствии 400 мкм добавленного А1)Р
Адениловые время СУБСТРАТЫ **(п = 5)
нуклеотиды анаэро- а-КГ а-КГ + а-КГ + МАЛАТ а-КГ +
биоза ГЩ4С1 АСП МАЛАТ
АТР 1 мин 53,0 53,0 58,0 72,0 58,0
±20,7 ± 18,0 ± 17,0 ±22,0 ±23,0
(мкм) 10 мин 9,3 12,9 34,8 #) 17,9 19,0 #)
±2,1 ±3,1 ±7,6 ±5,7 ±2,8
АТР+АБР 1 мин 349,0 380,0 435,0 401,0 522,0
+ АМР ±40,0 ±34,0 ±67,0 ±70,0 ± 106,0
(мкм) 10 мин 198,0 198,0 241,0 194,0 207,0
± 16,6 ±22,0 ±26,0 ± 16,8 ±68,0
1 мин 0,32 0,37 0,33 0,52 0,31
АТР/АИР ±0,06 ±0,08 ±0,06 ±0,10 ±0,04
10 мин, 0,13 0,19 0,40 #) 0,29 0,43 #)
±0,02 ±0,05 ±0,09 ±0,07 ±0,12
*Энзиматическое определение. **Начальные концентрации субстратов - 5 мМ, ИНдС! - 2,5 мМ, антимицина А - 0,3-0,4 мкг на мг белка митохондрий. #) р < 0,05 при сравнении с соответствующей величиной при минимальном анаэробном образовании сукцината из а- КГ.
Регистрация энергетического состояния МХ с помощью 3|Р-ЯМР-спектрометра (эксперименты выполнены совместно с В.П. Кутышенко) в процессе анаэробной инкубации МХ показала, что активация АОС при использовании экзогенных субстратов (а-КГ с АСП или а-КГ с манатом) в такой же мере препятствует деградации адениловых нуклеотидов и накоплению неорганического фосфата в суспензии МХ с остановленной дыхательной цепью, как и полное одновременное торможение олигомицин-чувствительной АТФ-азы и аденилаттранслоказы. Иные композиции субстратов - источников АОС оказались менее эффективными.
Таким образом, вопреки теоретическим расчетам, показано, что различные пути АОС имеют разную энергетическую мощность и эффективность.
Спонтанное переключение (смена) путей АОС в МХ было обнаружено в результате поэтапного балансового расчета утилизации субстратов и накопления продуктов АОС. Так, при использовании пары субстратов а-КГ-АСП в первые 3 минуты, пока сохранен пул адениловых нуклеотидов, основная масса сукцината (от 83% до 100%) образуется за счет восстановительного обращения ЦТК. В последующие 1,5 минуты от 20% до 50% сукцината образуется за счет окисления а-КГ, сопряженного с восстановительным обращением ЦТК. В следующие 3-6 минут одновременно идут примерно с равной скоростью обращение ЦТК, сопряженное с ним окисление а-КГ и анаэроб-
ная дисмутация а-КГ. Далее, при падении пула адениловых нуклеотидов вклад восстановительного обращения ЦТК минимален, но резко возрастает доля анаэробной дисмутации а-КГ так, что в MX сердца и печени этот путь становится основным источником сукцината. Поскольку энергетическая эффективность разных путей АОС различна, как было обнаружено нами, постольку в результате такого чередования путей АОС энергетическая эффективность процесса со временем падает. Если подобная смена путей АОС имеет место не только на выделенных MX, но и на уровне органов и тканей, то это позволяет понять многие из противоречий в результатах различных исследователей, по-разному оценивавших энергетическую эффективность и интенсивность АОС.
2.2. Влияние субстратов - источников сукцината на энергетическое состояние изолированных клеток
В связи с тем, что спонтанное чередование путей АОС ставит под сомнение энергетическую эффективность процесса АОС на уровне клеток, нами были поставлены эксперименты по определению энергетического состояния целых клеток - кардиомиоцитов крысы и культивируемых клеток почки свиньи в условиях антимицинового блока дыхательной цепи MX при инкубации с различными субстратами - источниками сукцината. Суспензия кардиомиоцитов содержала 85-90 % жизнеспособных клеток [Н.Н.Брустовецкий, Е.Е.Маевский, Е.В.Гришина, 1990]. Суспензионный штамм клеток почки эмбриона свиньи С-ПС, выращенный в лаборатории Э.И.Лежнева, содержал более 95% жизнеспособных клеток. Энергетическое состояние клеток оценивали по параметрам дыхания, изменению концентрации АТР, отношений ATP/ADP и АТР/АМР и величины энергетического заряда (Э.З.) в процессе кратковременной аэробной и анаэробной инкубации (по 3 мин. при 26°С) концентрированной суспензии клеток (5-10 мг белка в мл). В качестве потенциальных источников сукцината использовали аспартат с а-кетоглутаратом, малат, а-кетоглутарат с NH4C1, а также глутамат (в соответствии с данными, полученными на сердце О.И.Писаренко [1986]).
При закрытой антимицином А дыхательной цепи в присутствии субстратов - источников АОС отношения ATP/ADP и АТР/АМР в среднем были в 1,5 раза выше, чем в контрольной группе, в ситуациях, исключающих образование сукцината (отсутствие экзогенных субстратов, добавка избытка сукцината, или глутамина, который при кратковременной анаэробной инкубации не превращается в сукцинат). Однако существенной зависимости энергетического состояния от вида источника сукцината мы не обнаружили.
Существенно, что вклад источников АОС в энергетику клеток был более заметен в тех экспериментах, когда в среде присутствовала глюкоза. В связи с этим можно предположить, что в клетке при кислородном голодании АОС не только поддерживает воспроизводство богатых энергией соединений в MX, но и выполняет роль акцептора восстановительных эквивалентов, обес-
печивающего работу цитозоль-митохондриальных шунтов, поддерживающих гликолитическую оксидоредукцию и уменьшающих образование лактата.
Следует отметить также, что в процессе АОС идет ряд ферментативных реакций в ЦТК и в дыхательной цепи, несмотря на отсутствии терминального акцептора восстановительных эквивалентов. Такой проток в ферментативных реакциях может быть важным фактором морфо-функциональной стабилизации MX [В.П.Скулачс:, 1962; Лузиков, 1980]. Наконец, накопление сукцина-та в период анаэробиоза может играть значительную роль при последующей реоксигенации, когда сукцинат может быстро окисляться, обеспечивать уменьшение постгипоксического энергетического дефицита и поддерживать высокую степень восстановленности дыхательных переносчиков, что способствует торможению перекисного окисления липидов [V.Regitz et al., 1984; М.В.Биленко,1989; D.P.Jonson,1995]. Мы обнаружили также, что окисление сукцината в паре с накапливающимся при гипоксии лактатом [Н.Ким, Е.Маевский и др, 1996] тормозит гликолиз, и, как будет показано далее, увеличивает вклад окислительного фосфорилирования в энергообеспечение, уменьшая постгипоксический ацидоз.
Полученные данные позволяют сделать вывод о целесообразности использования экзогенных источников АОС для улучшения энергетического статуса клеток и обеспечения функциональной сохранности MX. Заметим, что при аноксии не следует использовать экзогенный сукцинат, который может тормозить АОС. Напротив при гипоксии целесообразно использовать как «анаэробные» источники сукцината, так и сам сукцинат, который легче окисляется при гипоксии, благодаря сохранению окисленности терминальной части дыхательной цепи..
2.3. Окисление экзогенного сукцината в тканях
Среди экспериментаторов бытует представление о том, что экзогенный сукцинат не проникает через неповрежденные клеточные мембраны [О.Walte, 1979], и поэтому не может подвергаться метаболическим превращениям в тканях. Действительно, в наших экспериментах не наблюдалось прироста скорости дыхания после добавления 5 мМ сукцината к неповрежденным клеткам тимуса, кардиомиоцитам или культивируемыми клетками почки свиньи, тогда как дыхание поврежденных при выделении кардиомио-цитов сукцинат стимулировал более чем в 10 раз. При рециркуляторной нор-мотермической перфузии изолированной почки собаки внесение в перфузат 1 мМ сукцината повышало скорость дыхания в несколько раз в тех случаях, когда в процессе перфузии происходило повреждение клеточных мембран. На основании этих данных мы сделали вывод о том, что тест стимуляции дыхания сукцинатом вполне пригоден для оценки повреждения клеточной мембраны, но едва ли может свидетельствовать о метаболизме сукцината в неповрежденных клетках.
В последующих экспериментах проникающая способность сукцината оценивалась по появлению изотопной метки в тканях и в выдыхаемой углекислоте после введения животным через рот радиоактивного 2-3-14С-14
сукцината или после приема человеком сукцината, обогащенного стабильным изотопом 13С. Как показано в таблице 2, у крыс в покое уже через 10 минут в выдыхаемой углекислоте обнаруживается до 3,5% метки от введенной дозы, а через 30 минут до 16%, тогда как 49% метки обнаруживается в тканях (животные получали сукцинат аммония с примесью меченого сукцината, суммарная доза 15 мг на кг массы тела).
Таблица 2
Содержание С14 в выдыхаемом воздухе у крыс в покое и после плавания при
Условия эксперимента Количество (тыс. имп.) радиоактивного углерода, поглощенного щелочью из выдыхаемого воздуха
~......-Время Группы с 1 по 10 мин с 11 по 20 мин с 21 по 30 мин Всего за 30 мин % от дозы
1 гр. Покой (п=7) 110,0 ± 7,4 100 ±5,3 301 ±9,6 508±52,3 15,6
2 гр. Покой и плавание (п=10) 324 + 31,5 р < 0,01 (покой) 340 + 33,2 р < 0,01 (покой) 1806 ±171 р < 0,01 (плавание) 2470+234 P < 0,01 70,6 р <0,01
При плавании с грузом 6% от массы тела в выдыхаемом воздухе появлялось в 5-6 раз больше радиоактивного углерода, чем в условиях покоя. Соответственно, после плавания во всех исследованных тканях (печени, скелетных мышцах, почках, сердце, плазме крови) в 1,5-2 раза снижалось содержание радиоактивной метки по сравнению с уровнем покоя.
Приведенные данные дают основание полагать, что экзогенный сукцинат проникает из желудочно-кишечного тракта животных в кровь и в ткани, где окисляется до С02, который выводится с выдыхаемым воздухом. Ускорение окисления экзогенного сукцината при физической нагрузке напоминает ускорение метаболизма глюкозы [Н.Н.Яковлев, 1974].
С помощью масс-спектрометрического анализа, выполненного д.б.н. A.M. Зякуном (ИБФМ РАН), было установлено, что после приема добровольцем обогащенного стабильным изотопом ,3С сукцината изотоп 13С в составе выдыхаемой углекислоты появляется быстрее и в большем объеме, чем в случае приема обогащенной изотопом 13С глюкозы.
Таким образом, нами получены доказательства того, что экзогенный сукцинат легко окисляется у животных и человека, что дает основания использовать экзогенный сукцинат в качестве метаболически активной пищевой добавки, а в будущем - в составе средств метаболитной терапии.
2.4. Купирование ацидоза сукцннатом при рабочей гипоксии.
Согласно развиваемым М.Н.Кондрашовой [1976-1996] представлениям на функциональное состояние организма можно воздействовать путем регуляции функций МХ, в частности с помощью экзогенного сукцината. Об эффективности экзогенного сукцината на уровне целостного организма мы судили по влиянию сукцината на поддержание кислотно-основного состояния
(КОС) крови при развитии ацидоза, связанного с рабочей гипоксией, когда имеются основания полагать, что сукцинат окисляется лучше, чем иные, в частности N АО-зависимые субстраты.
2.4.1. Источник ацидоза - недостаточный вклад окислительного фосфорилирования в обеспечение АТФ-азных нагрузок.
Гипотеза о возможности уменьшения метаболического ацидоза за счет увеличения вклада окислительного фосфорилирования при рабочей гипоксии основана на том, что источником Н+ при любой нагрузке являются АТФ-азные реакции: АТР"4-»АОР"3.+ РГ2 + Н+ |ХГо\тепз1ет,1993]. При этом развитие ацидоза зависит от того, в какой мере АТФ-азные реакции обеспечиваются субстратным фосфорилированием в реакциях гликолиза, поскольку, в отличие от ресинтеза АТР в МХ, которые потребляют в стехиометрических количествах все продукты АТФ-азной реакции - АБР, И, Н+, гликолитиче-ская оксидоредукция оставляет в цитозоле до 2 г-иона Н+ на каждый моль глюкозы, даже в тех случаях, когда глюкоза затем окисляется до С02 и НгО [■\У.Оеуеге,1977] (см. схему).
СЛакт^£> Глюкоза Согласно сеуегз причиной
ацидоза является некомпенси-руемый окислительным фосфорилированием распад АТР, а не накопление таких недо-окисленных продуктов, как лактат. Следовательно, увеличение вклада гликолитической оксидоредукции в энергообеспечение, например, при гипоксии, должно сопровождаться развитием ацидоза, а при увеличении вклада окислительного фосфорилирования - уменьшением ацидоза. Эти представления в период начала наших исследований не встретили понимания и не были проверены экспериментально [Ь.н.0р1е1980, 0.11.\УШае,1980; А.Яооз, \V.Boron, 1980].
На основании представленной схемы мы предложили способ выявления вклада МХ в поддержание рН по разности между скоростями образования Н+ на фоне стационарной АТФ-азной нагрузки в присутствии и отсутствии потребления кислорода. На гомогенате сердца для увеличения вклада МХ в энергообеспечение использовали субстраты, окисляющиеся непосредственно в МХ, минуя гликолиз. Для увеличения вклада гликолиза добавляли избыток глюкозы или разобщитель окислительного фосфорилирования. Величину АТФ-азной нагрузки задавали добавлением экзогенных «АТФ-аз»: гексоки-назы с глюкозой или фактора Б; Н+-АТФазы МХ (выделенного Г.Е.Бронниковым). Эксперимент выполнен совместно с А.С.Розенфельдом.
Оказалось, что при фиксированной АТФ-азной нагрузке избыток глюкозы даже на фоне окисления сукцината, приводит почти к двукратному увеличение образования Н+: с 25 до 40-50 нг-ат Н+ в мин на мг белка. Подобным же образом возрастает образования Н+ при замедлении дыхания в результате
V
^Лактат СО^ Н20
щавелевоуксусного торможения СДГ или при блокаде дыхательной цепи ингибиторами, или при разобщении окислительного фосфорилирования. При сопряженном с фосфорилированием дыхании большей скорости дыхания соответствует меньший ацидоз (рис. 5).
Гексокиназа глюкоза
Гомогенат сердца крысы
Рис.5. Скорости закисления среды на фоне заданной АТФ-азной нагрузки при окислении разных субстратов гомогенатом сердца крысы. Инкубационная среда, как на рис.1, но удален трис-HCl и концентрация К2НР04 снижена до 1 мМ. Добавлены 1 мМ ЭГТА и 3 мМ АТР. Добавки: субстратов по 5 мМ., гексоки-назы 0,1 ед.
- р-окснбутнрат
акетоглутарат
малат + пнруват сукцинат
f укцинат+глутамат
сукщшат + глутамат сукщшат
малат + пируват
кетоглутарат
Р-окснбутнрат
На гомогенате сердца крысы было установлено, что из всех использованных субстратов наиболее эффективным противоацидотическим средством при фиксированной АТФ-азной нагрузке оказалась смесь сукцината с глута-матом или сукцинат аммония.
Ингибиторный анализ, выполненный на гомогенате, изолированных МХ сердца и печени с помощью низких концентраций И-этилмалеимида (0,5мМ), показал, что ощелачивающий эффект связан с симпортом аниона фосфата и Н* внутрь МХ в ходе фосфорилирования АБР, как это было независимо показано О.ВоЬше [1978].
На перфузируемой почке собаки «АТФ-азную нагрузку» задавали дозированным повышением проницаемости клеточных мембран путем изменения состава перфузата (перфузировали эмульсией перфторорганических соединений, стабилизированной неионогенным ПАВ проксанолом. Замена про-ксанола 168 на проксанол 268 или плюроник Р68 приводила к повышению проницаемости мембран клеток почки и соответственно к активации АТФ-аз, поддерживающих трансмембранные градиенты ионов. В таких условиях до-
бавление глюкозы в перфузат существенно снижало рН и, напротив, внесение 1 мМ сукцината натрия способствовало защелачиванию среды, подобно тому, как это наблюдалось на гомогенате сердца крысы.
Таким образом и в гомогенате, и на перфузируемом органе активация глюкозой субстратного фосфорилирования приводила к увеличению вклада гликолиза в энергообеспечение и к развитию' ацидоза. Тогда как добавкой сукцината можно было увеличить вклад окислительного фосфорилирования в обеспечение АТФ-азной нагрузки и достаточно эффективно уменьшить ацидоз.
Совместно с Н.П.Ким [N.P.Kim et al., 1989; Н.П.Ким, Е.И.Маевский и др., 1996] было исследовано взаимное влияние совместного окисления экзогенных глюкозы, лактата и сукцината в гомогенате сердца крыс, так .как во время и после гипоксии всегда имеется глюкоза и избыток лактата, которые существенным образом определяют энергетическое состояние и кислотно-основную обстановку в тканях. Косубстратные взаимодействия исследовали с использованием меченой 1,6 |4С-глюкозы. Оказалось, что в гомогенате сердца крысы без добавления других субстратов 60% глюкозы превращается до лактата и пирувата, а 40% окисляется до С02. Добавление лактата сильно тормозило окисление глюкозы. При одновременном добавлении сукцината с лактатом или сукцината с глюкозой наблюдалось интенсивное окисление лактата, и снижение использования глюкозы. При этом устранялось закисле-ние среды и возрастал уровень АТР (табл. 3).
Таблица 3.
Изменение концентрации лактата, АТР и величины рН при инкубации гомо-гената сердца крысы с глюкозой , лактатом и сукцинатом
Субстраты Концентрация лактата [АТР] в конце инкубации рН после инкубации (исходно рН 6,9)*
окисления до инкубации после инкубации
1 5 мМ глюкозы (п=5) 2,80 ±0,14 5,00 ±0.17 1,27 ±0,49 6,39 ±0.05
2 5 мМ глюкозы + 10 мМ лактата (п=7) 12,80 ±0,14 9,35 ±0,15 Pt < 0.001 0,39 ±0,13 6,39 ±0,08
3 5 мМ глюкозы + 5 мМ сукцината (п=5) 2,80 ±0,14 не определяется 1,38 ±0,29 Р2 < 0.02 6,64 ± 0,06 Pi.2 < 0.05
4 5 мМ сукцината +10 мМ лактата (п=10) 12,80 ±0,14 6,20 ±0,16 Р2< 0.001 1,66 ±0,12 Р2< 0.001 7,33 ±0,08 Pi.2,3< 0.001
* Примечание: во время преинкубации гомогената без субстрата значение рН инкубационной среды снижалось с 7,4 до 6,90+0,04. Индекс при Р показывает с какой групой проведено сравнение.
Эти данные, необходимо учитывать при введении больным значительных количеств глюкозы, что может увеличивать вклад гликолиза в энергообеспечение и способствовать развитию ацидоза. Еще более опасным представляет-
ся использование лактатного буфера (препарат Лактосол) «для устранения метаболического ацидоза» [В.Д.Машковский, 1996]. Избыток лактата опасен не только тем, что способствует гипоксическому сдвигу редокс состояния ПН в цитозоле клеток, уменьшению окисления эндогенной глюкозы и падению в связи с этим уровня АТР, но может также серьезно нарушать окислительное фосфорилирование в МХ [Н.8егщег, 1975]. Введение же сукцината на фоне избытка эндогенного лактата и глюкозы способно нормализовать тканевое дыхание, восстановить его доминирование над гликолизом и резко уменьшить ацидоз.
Таким образом, ожидаемый и обнаруженный на уровне МХ, гомогената и перфузируемого органа противоацидотический эффект отдельно взятого экзогенного сукцината проявляется также и в условиях кометаболизма сукцината с лактатом и глюкозой и сопровождается улучшением энергетического состояния тканевого препарата.
Полученные данные позволяют полагать, что выявленные механизмы купирования метаболического ацидоза могут быть реализованы на уровне целого организма и являются весомым аргументом в пользу использования экзогенного сукцината при физических нагрузках для уменьшения ацидоза, ограничивающего работоспособность [Н.Н.Яковлср; С075" К-БаИНп, 1975-1978; Ф.Д.Голник, Л.Герсман, 1982; Дж.О.Холлоши,1982].
2.4.2. Куннрование сукцннатом ацидоза при рабочей гипоксии (физической нагрузке)
Как уже упоминалось в условиях гипоксии на фоне почти полной восста-новленности ПН сохраняется достаточно высокая степень окисленности фла-вопротеидов [Я.ЗсЬок е1 а!., 1969]. Возможно, поэтому в первую очередь нарушается окисление МАБ-зависимых субстратов [М.Н.Кондрашова и др., 1973, 1997; Л.Д.Лукьянова, 1989-1997], а флавин-зависимые субстраты, и в частности сукцинат, могут еще окисляться. По-видимому, с таким избирательным окислением связано, почти двукратное снижение содержания сукцината в печени крыс после 15-минутной гипоксической гипоксии [Е.И.Маевский, 1971].
На уровне целого организма противоацидотическое действие сукцината было исследовано нами совместно с А.С.Розенфельдом [1983] в условиях рабочей гипоксии, создаваемой физической нагрузкой (плавание крыс 15 минут с грузом 6% от массы тела). После плавания отношение лактат/пируват в крови животных возрастало с 13±0,7 (в покое) до 54±2,2 (р<0.01); рН крови снижалось с 7,41 ±0,01 до 7,17+0,02 (р<0.01), концентрация бикарбоната в плазме крови падала с 24±2,3 до 16±1,5 мМ (р<0.05), что соответствует снижению внутриклеточного рН на 0,6 единицы [К.ЗаЫт е1 а!., 1978]. Одновременно возрастали скорости дыхания МХ, выделенных из скелетных мышц после плавания животных: величины Уз увеличивались при окислении сукцината с глутаматом и пирувата с малатом на 36% и 41% (р<0.05), V.» - на 60% и 90%(р<0.05). .
В случае введения животным перед плаванием сукцината аммония (15 мг на кг массы тела) рН крови снижалось в меньшей степени - до 7,28+0,14, отношение лактат/пируват не превышало 28±1,4 и практически полностью предотвращалось повышение скоростей дыхания МХ (без признаков разобщения окислительного фосфорилирования).
Отсюда был сделан вывод о том, что в условиях целостного организма экзогенный сукцинат также способствовал уменьшению симптомов рабочей гипоксии, в частности, глубины посленагрузочного ацидоза, как и на уровне изолированных тканевых препаратов.
2.4.3. Влияние приема сукцината на кислотно-основную систему крови у спортсменов при физической нагрузке
2.4.3.1. Закономерности формирования реакций кислотно-основной системы (КОС) крови спортсменов при физической нагрузке исследовали совместно с А.С.Розенфельдом [1983] в течение года на 66 спортсменах разной квалификации и 26 нетренированных добровольцах. Обследуемые ежемесячно выполняли тестирующие велоэргометрические (ВЭ) нагрузки: фиксированные по мощности на уровне 70% максимального потребления кислорода и предельные ступенчатые нагрузки до отказа. Анализ реакций КОС крови испытуемых в ответ на предъявляемые нагрузки позволил предложить новый функциональный критерий, который мы назвали диапазоном реактивности КОС. Диапазон реактивности КОС определяется как разность между величиной рН при предельной работе до отказа (рН предел) и рН крови при стандартной умеренной иди субмаксимальной по мощности нагрузке (рН станд): с! КОС = рН предел - рН станд.
В процессе спортивного развития по мере адаптации организма к нагрузкам (1КОС возрастал от 0,14 ед рН у спортсменов 2 разрядов до 0,55 ед рН у мастеров спорта международного класса. Расширение с1КОС обусловлено уменьшением кислотного сдвига рН при стандартной нагрузке и увеличением глубины ацидоза, при котором спортсмен способен выполнять предельную нагрузку до отказа
2.4.3.2. Влияние сукцината на кислотно-основную систему крови у спортсменов при физической нагрузке. Не описывая весь цикл исследований, остановимся на конечном результате использования субстратов энергетического обмена в качестве пищевой добавки. Нами показано, что прием сукцината аммония, однократный (непосредственно перед работой) и повторный в течение 10 дней, или однократный прием смеси сукцината № и глутамата Ыа (в более высокой дозе) способствуют уменьшению падения рН при стандартных нагрузках мощностью 300 вт ( в течение 3 мин) с 7.23±0.01 до 7.3110.01, приводят к повышению работоспособности на 14-32% (р<0,05) при повторных высоко мотивированных нагрузках до отказа в условиях более глубокого ацидоза. Иными словами, сукцинат аммония и смесь сукцината с глутаматом расширяют диапазон реактивности КОС крови при физических нагрузках подобдо тому, как это происходит в процессе спортивного развития.
При проведении этих исследований мы в полной мере отдавали себе отчет в том, что в условиях организма нельзя сводить эффекты сукцината только к включению его в метаболические превращения в МХ. На основании собственных данных и результатов, полученных рядом исследователей, следует учитывать наличие вазодилятационного действия сукцината, его влияние на деоксигенацию гемоглобина [А.С.Розенфельд,1983]. Не исключено, что наряду с субстратным действием, молекула сукцината может обладать сигнальной функцией [М.Ы. Коп^авЬоуа е1 а1.,1991], например, в качестве вещества, образующегося в условиях кислородного дефицита и сигнализирующего различным системам организма о наличии очага аноксии. Об этом могут косвенно свидетельствовать наши эксперименты, в ходе которых было обнаружено, что даже в 10 раз меньшие, несубстратные дозы сукцината (2 мг на кг веса) оказывали выраженное действие на физическую работоспособность, величину отношения лактат/пируват в плазме крови и экскрецию катехоламинов с мочей.
В исследованиях выполненных совместно с М.Н.Кондрашовой и И.Б.Гузаром [Е.МаеУБку е1 а1., 1979] мы показали, что на уровне МХ некоторые эффекты введенного в организм сукцината подобны влиянию малых доз адреналина. О возможном участии катехоламинов в активации дыхания МХ после введения крысам сукцината свидетельствует ликвидация стимулирующего действия сукцината в случае одновременного введения животным Р-адреноблокатора обзидана [А.С.Розенфельд, 1983]. Приведенные данные дают основание полагать, что в условиях организма реализуется не только прямое субстратное действие сукцината.
2.5. Особенности реакции дыхательной цепи митохондрий при
гипоксии и ишемии.
Разработка и оценка эффективности средств, способствующих сохранению МХ в условиях гипоксии и ишемии, требуют выявления различий в симптомах и механизмах, реализующихся в МХ при гипоксии и ишемии. В условиях гипоксии клетки и ткани не теряют связи с целым организмом и функционируют как открытая система с интенсивным массообменом, ограниченным лишь притоком кислорода. Напротив, при ишемии клетки оказываются в условиях закрытой системы - без доступа субстратов и кислорода, без регуляторных сигналов с более высокого иерархического уровня, без оттока накапливающихся метаболитов. Очевидно, именно поэтому при гипок-сических состояниях МХ повреждаются в меньшей мере, чем при ишемии. Однако на уровне МХ до настоящего времени нет четкого описания и понимания того, чем отличаются МХ тканей, перенесших гипоксию, от МХ после ишемии.
В эксперименте, выполненном на 120 беспородных белых крысах самцах, полярографически исследовалось фосфорилирующее дыхание МХ, выделенных после острой гипоксической гипоксии и тотальной ишемии органа. МХ выделяли из печени - весьма устойчивой ткани, и из сердца и коркового слоя почек крыс - высокочувствительных к гипоксии тканей. Оказалось, что после кратковременной гипоксической гипоксии (подъем животных в баро-
камере на "высоту" 8000 м) скорость дыхания МХ в 3 состоянии возрастала более чем на 40% (р<0,05) и в меньшей степени в 4 состоянии; соответственно возрастала величина дыхательного контроля. Скорость дыхания МХ сердца крысы повышалась через 15 мин, а МХ почки и печени через 30 и 60 мин гипоксии. Через 2 часа пребывания на «высоте» 8000 м также, как и при адаптации животных к хронической гипоксической гипоксии, активации дыхания МХ не наблюдалось. [Е.И.Маевский, 1971]
На основании анализа, выполненного in vivo и in vitro мы выявили следующие факторы, ответственные за активацию дыхания МХ после острой гипоксии.
Гормональное воздействие на уровне ткани, обусловленное гипоксиче-ским стрессом. Подобная активация дыхания наблюдалась после введения малых доз адреналина (0,1 мг на кг веса) [M.N.Kondrashova, I.B.Gusar, E.I.Maevsky, 1981] и в случае спонтанно увеличенной продукции глюкокор-тикоидов [А.М.Генкин, Н.А.Глотов, Е.И.Маевский, 1973].
Уменьшение щавелевоуксусного торможения окисления сукцината, очевидно, обусловлено повышением степени восстановленности ПН в МХ. При этом исчезает стимуляция глутаматом окисления сукцината. Обычно глутамат эффективно снимает щавелевоуксусное торможение сукцинатде-гидрогеназы, что проявляется в активации на 15-20% дыхания МХ из тканей животных, находившихся в нормоксических условиях [М.Н.Кондрашова, Е.И.Маевский, и др.1973; E.Maevsky, N.Brüstovetsky, 1981]
Мобилизация ионов кальция и свободных жирных кислот. Добавление в среду выделения и инкубации комплексообразователей 1 мМ ЭГТА или ЭДТА, или обезжиренного альбумина (1 мг на мл среды) существенно уменьшает постгипоксическую активацию дыхания, также как и у животных, перенесших холодовой стресс [Н.Н.Брустовецкий, Е.И.Маевский и др.,1984,1986; N.Brüstovetsky, I.Maevsky et al.,1985, 1986].
Активация фосфолипазы А2. Ингибитор фосфолипазы А2 бромфенацил-бромид, добавленный в инкубационную среду в концентрации 1 мМ также уменьшает постгипоксическую активацию дыхания МХ [Н.Н.Брустовецкий, Е.В.Гришина, Е.И.МаевскийД989,1990].
Набухание МХ и активация в связи с этим переноса восстановительных эквивалентов на уровне цитохрома b [Н.Брустовецкий и др.,1990; N.Brüstovetsky et al., 1990]. Повышение тоничности среды приводит к сжатию митохондрий и подавлению дыхания в 3 состоянии: для подавления Уз в «нормоксических» МХ необходимо было повысить осмотичность до500 мОсм, тогда как после острой гипоксии - до 700 мОсм. Отметим, что противоположная гипоксии ситуация имеет место при гибернации (зимней спячке), когда МХ сжаты и чрезвычайно медленно потребляют кислород, [Н.Брустовецкий, В.Гогвадзе, Е.Маевский,1988; N.Brüstovetsky et al., 1990].
Активация фосфолипазы А2 и набухание МХ после гипоксии, очевидно, являются следствием воздействия повышенных концентраций свободных жирных кислот и ионов кальция [Ю.В.Евтодиенко, 1978].
В МХ, выделенных из печени крысы после ишемии, вызванной инкубацией изолированной печени в 0,15М МаС1 при 26° С, через 30 и 60 минут ишемии наблюдалось почти двукратное снижение У3 и повышение У4, соответственно падал дыхательной контроль и снижалось отношение АДФ/О. Эти явления разобщения окислительного фосфорилирования через 30-60 минут ишемии носили обратимый характер и устранялись одновременным добавлением в инкубационную среду ЭГТА, обезжиренного бычьего альбумина и глутамата. В поздние сроки (90 мин и более) наблюдалось необратимое нарушение параметров окислительного фосфорилирования вплоть до появления обратного дыхательного контроля.
Таким образом для МХ, перенесших в ткани острую гипоксию, характерны активация сопряженного с фосфорилированием дыхания, а после ишемии - разобщение окислительного фосфорилирования и подавление дыхания. Заметим, что одни и те же агенты - комплексообразователи, связывающие кальций, и обезжиренный альбумин, сорбирующий свободные жирные кислоты, - способствуют обращению гипоксических и ишемичских отклонений в реакциях МХ. Но при этом постгипоксическая активация дыхания сопровождается активацией окисления сукцината, тогда как после ишемии наблюдаются явные признаки разобщения и торможения окисления как ЫЛО-зависимых субстратов, так и сукцината.
По-видимому, мобилизация жирных кислот и кальция при гипоксии имеет внемитохондриальный генез, запускается гормональными факторами, тогда как при ишемии - является результатом повреждения мембран и деэнергиза-ции МХ. Очевидно, что состояние гипоксии, когда МХ и клетки работают как открытая система, намного предпочтительнее состояния ишемии, когда МХ и клетки ишемического очага являются закрытой системой и довольно быстро подвергаются необратимым повреждениям.
Следовательно достаточно перевести ткань из состояния ишемии в гипок-сическое, чтобы существенным образом улучшить состояние МХ. С этой точки зрения оптимальным противоишемическим средством мог бы быть препарат, обладающий реологическими и газотранспортными свойствами, например, кровезаменитель на основе эмульсий перфторорганических соединений.
2.6,Оценка эффективности эмульсий перфторорганическнх соединений по реакциям митохондрий печени.
Газопереносящие эмульсии полностью фторированных органических соединений (ПФОС) привлекли внимание исследователей в качестве потенциальных кровезаменителей - переносчиков кислорода в связи с тем. что их можно использовать без опасения развития иммунной несовместимости, передачи вирусных или иных инфекций и производить из синтетического сырья в необходимых количествах. Они могут использоваться при лечении анемической и циркуляторной гипоксии, тромбо-эмболических состояний и травматического шока, вместо крови для региональной перфузии конечностей при химио-и радиотерапии, для сохранения отключенных от кровотока
органов при реконструктивных операциях и подготовке донорских органов к трансплантации и т.п. [Н. 81оукег, Т.Каггито1:о,1969; Ь.С1агк, 1970; Р.Сеуег, 1973,1981; Г.Я.Розенберг, Н.И.Афонин, 1979; Г.Р.Иваницкий, Ф.Ф.Белоярцев, 1986; К.П.Иванов, 1993; Н.А.Онищенко и др. 1985; В.В.Мороз, 1994; В.С.-Ярочкин 1997; Г.А.Софронов, 1997].
Проблема создания эмульсий ПФОС связана с отбором компонентов и получением стабильной композиции, способной в достаточной мере компенсировать дефицит массопереноса и газообмена в условиях организма.
2.6.1.Отбор ПФОС и поверхностно-активных веществ - стабилизаторов эмульсий ПФОС.
Суть вопроса заключалась в том, что ПФОС, образующие стабильные эмульсии, например, перфтортрибутиламин, аккумулируются клетками рети-кулоэндотелиальной системы на срок, сопоставимый со временем жизни животных. Напротив, быстро выводящиеся из организма ПФОС, например, перфтордекалин (ПФД) не образует стабильных эмульсий (по крайней мере с поверхностно-активными веществами (ПАВ) типа проксанолов - блоксопо-лимеров окиси этилена и пропилена). Более того эмульсии, полученные из смеси быстро выводящихся ПФД и перфтортрипропиламина, вызывали гибель кроликов в течение 4-6 недель после введения всего 10 мл на кг веса животного [Н.И.Кукушкин и др, 1989; У.ОЬгаг1зоу сЧ а1., 1993].
Под руководством академика И.Л.Кнунянца (ИНЭОС АН СССР) были синтезированы ПФОС, обладающие промежуточными свойствами. Среди этих ПФОС в лаборатории Ф.Ф.Белоярцева (ИБФ АН СССР) при нашем участии был отобран перфтор-Ьт-(4-метилциклогексил)-пиперидин - ПФМЦП [АС № 1094287, 1984].
Для оценки качества и возможной биологической активности ПФОС, проксанолов и готовой эмульсии ПФОС в ИБФ АН СССР была создана система физико-химического анализа и биологического тестирования на объектах разного уровня организации. Использование МХ в качестве тест-системы было обусловлено тем, что изменение параметров, характеризующих функциональное состояние МХ, можно измерить количественно, а сами МХ имеют высокую чувствительность к различным полярным и неполярным органических и неорганических соединениям и ионам [В.П.Скулачев, 1969; Л.С.Ягужинский и др., 1978; М.Н.Кондрашова и др, 1978]. Мы также учитывали опыт Ю.С.Ротенберга [1978] по удачной экстраполяции на уровень целого организма некоторых эффектов, выявленных при изучении воздействия токсических соединений на изолированных МХ.
Действительно контакт МХ печени с ПФОС или с проксанолами, содержащими примеси соответственно недофторированных или гидразонактивных соединений в концентрации Ю^ч-Ю^М, сопровождался торможением потока восстановительных эквивалентов на уровне гидрофобного ротенон-чувствительного участка между ПН и ФП в дыхательной цепи.
ПФД, не содержащий аналитически определяемых примесей, не только не тормозил дыхание МХ, но активировал окисление ИАО-зависимых суб-
стратов и сукцината на 25-30%, (р< 0,05). В присутствии ротенона, также взаимодействующего с гидрофобным участком дыхательной цепи МХ между ПН и ФП, не наблюдалось влияния ни чистого ПФД, ни примесей ПФОС [Е.И.Маевский, 1980; Н.Н.Брустовецкий, Е.И.Маевский, 1980]. ПМЦП и ПФТБА такой активностью не обладали. Отсюда мы пришли к заключению о том, что, несмотря на химическую инертность, некоторые ПФОС.обладают биологической активностью, которая является результатом физического взаимодействия ПФОС с гидрофобными участками мембран или ферментных систем.
В последующем воздействие ПФОС на мембраны мы использовали для повышения устойчивости эритроцитов к механическим повреждениям [Е.И.Маевский, 1980,Е.А..Коваль, Е.И.Маевский ,1980, АС №990228, 1982]. Позже были показаны индукция синтеза цитохрома Р-450 по фенобарбиталь-ному типу под влиянием липофильных ПФОС [Ф.Ф.Белоярцев и др., 1986, В.В.Образцов и др., 1988] и способность ПФОС стабилизировать мембраны миокарда при кардиоплегии и перфузии изолированного сердца [Ю.М.Кокоз и др,1982; А.А.Фрейдин и др. 1982; Ф.Ф.Белоярцев, Б.И.Исламов, Е.И.Маевский, 1983; Б.И.Исламов, 1987, С.И.Воробъев, 1994].
Неионогенные ПАВ - стабилизаторы эмульсий ПФОС - проксанолы 268 и плюроник F-68 разобщали окислительное фосфорилирование и подавляли фосфорилирующее дыхание МХ. Более слабое ПАВ - проксанол 168 стимулировал фосфорилирующее и разобщенное дыхание МХ на 20-30%, практически не влияя на отношение ADP/O. Позже мы обнаружили, что эмульсии ПФОС, стабилизированные проксанолом 168, минимально повреждали клеточные мембран почки и сердца при перфузии и кардиоплегии [Ф.Ф.Белоярцев и др. 1983; Е.И.Маевский и др., 1996].
В результате комплексной оценки эмульсий ПФОС и их компонентов, включающей исследования и на изолированных МХ, была создана рецептура достаточно стабильной и биосовместимой эмульсии ПФОС. При нашем непосредственном участии был разработан способ получения эмульсий ПФОС [Ф.Ф.Белоярцев, Г.Р.Иваницкий,1981; Е.И.Маевский и др. 1982; Ф.Ф.Белоярцев, Е.И.Маевский, Б.И.Исламов, 1983]. Технологическая часть этой работы защищена авторскими свидетельствами и патентами [АС№ 1298976, 1986; № 1389049, 1985; Патенты РФ № 1570261, 1993; № 2070033, 1996] и использована в регламенте изготовления и во Временной фармакопейной статье на препарат Перфторан.
2.6.2.0ценка газотранспортных свойств эмульсий ПФОС по реакциям митохондрий. Одним из ключевых вопросов при создании эмульсий ПФОС является оценка их газотранспортной функции in vivo. Несмотря на высокую растворимость кислорода в ПФОС (порядка 40-48 об% при р02 760 мм рт.ст,), абсолютная кислородная емкость эмульсий, содержащих всего 10 об.% фторуглеродной фазы, невелика: примерно в 3 раза выше, чем кислородная емкость воды и всех традиционных плазмозаменителей, но при физиологических значениях р02 в 20 раз ниже, чем у цельной крови. Поэтому,
даже при повышении р02 во вдыхаемом воздухе до 550 мм. рт. ст. и высоком содержании ПФОС в крови после 65% кровезамещения эмульсией ПФОС, абсолютное количество кислорода, переносимого в физически растворенной форме относительно невелико [Е.И.Маевский и др., 1989; Г.Р.Иваницкий, С.И.Воробьев, 1997]. Для повышения кислородной емкости эмульсий ПФОС на фирмах Green Cross Corporation (Япония) [1981, 1985], Alians (США) [1995] были созданы препараты, содержащие 20, 35 и даже 50 об.% ПФОС. Однако эти препараты не нашли применения, так как газотранспортные свойства эмульсий ПФОС определяются не столько абсолютной кислородной емкостью, сколько динамической кислородной емкостью, то есть отношением абсолютной кислородной емкости к вязкости препарата, а также облегчением диффузии газов, реологическими свойствами препарата и способностью частиц эмульсии ПФОС проникать в спазмированные и патологически измененные, суженные сосуды [R.Naito, K.Yokoyama, 1975-1985; И.Н.Кузнецова, 1984-1997; Г.Р.Иваницкий, С.И.Воробьев, 1997].
Разработанные нами эмульсии содержат частицы ПФОС со средним размером около 0,1 мкм и имеют в 1,5 раза меньше вязкость, чем кровь. При этом их динамическая кислородная емкость выше, чем у препаратов, содержащих более высокие концентрации ПФОС [Е.И.Маевский и др., 1989; Г.Р.Иваницкий, С.И.Воробьев, 1997]. Благодаря этому возможна доставка кислорода от эритроцитов, находящихся в магистральных капиллярах, в суженные сосуды и коллатерали при анемической и обтурационной гипоксии и ишемии. Согласно данным И.Н.Кузнецовой [1989, 1997] при наличии в кровотоке даже небольшого количества эмульсии ПФОС формируется новая цепочка передачи кислорода: эритроцит - частицы ПФОС - плазма крови -ткани. Соответственно, можно было ожидать, что эмульсии ПФОС окажутся достаточно эффективными противоишемическими препаратами, несмотря на малую кислородную емкость.
Для оценки эффективности эмульсий ПФОС на уровне организма у крыс замещали 60-65% объема циркулирующей крови эмульсией ПФОС или бел-ково-солевым раствором. После кровезамещения часть животных находилась при повышенном рОг, а другие - в атмосфере воздуха. После замеров обычных параметров, характеризующих газотранспортную функцию крови, из печени животных через 6 часов, сутки и пять суток выделяли MX и оценивали их состояние по вышеустановленным критериям.
Наиболее ярко различия между MX печени после кровезамещения эмульсией ПФОС и белково-солевым раствором проявлялись через 6 часов после операции (рис.6). В случае использования белково-солевого раствора, даже при нахождении животных в атмосфере с повышенным содержанием кис-лорда, наблюдалось грубое необратимое ишемическое повреждение фосфо-рилирующего дыхания MX печени при окислении как сукцината, так и ß-оксибутирата, вплоть до появления «обратного дыхательного контроля»: торможения дыхания после добавления ADP. После кровезамещения эмульсией ПФОС в тех же условиях сохранялся обычный по знаку дыхательный контроль, а при нахождении животных в атмосфере с повышенным содержа-
нием кислорода наблюдалась активация дыхания МХ без явлений разобщения окислительного фосфорилирования.
Рис.6. Дыхание МХ печени крыс через 6 часов нАт02ВМШ1
- на мг быка
после наркоза без кро-
вопотери, ложного кро-везамещения (взятая кровь сразу возвращена животному) или после кровезамещения 65% объема циркулирующей крови белково-солевьш составом или эмульсией ПФОС. После кровезамещения животных помещали в атмосферу воздуха (р02 150 мм рт. ст.) или в атмосферу с повышенным рС>2 до 550 мм рт. ст. Каждая кривая построена по средним данным из 6-8 экспериментов. Среда инкубации, как на рис. 1.
80 70 60 50 40 30 20 10
шн
MP
MX Сукцинат
L
П
МЭР
ÄDP
I —
МХ Сукцинат
КОНТРОЛЬ
■ без кровопотери
■ лояное К'ровЕзамещенне
КРОВЕЗАМЕЩЕНИЕ белково-солевым Эмульсией ПФОС составом
> pOj воздуха 150 мм рг ст - рС^вгодута 550 мм рт ст
Согласно вышеописанным критериям отличий МХ, перенесших острую гипоксию, от МХ, выделенных после тотальной ишемии, ясно, что эмульсия ПФОС эффективнее обеспечивает поддержание функций МХ, чем обычные кровезаменители, так как при использовании эмульсий ПФОС вместо ише-мического повреждения (разобщения окислительного фосфорилирования и подавления фосфорилирующего дыхания) наблюдаются сдвиги, похожие на постгипоксическую активацию фосфорилирующего дыхания МХ при использовании стандартной после массивного кровезамещения процедуры обогащения вдыхаемого воздуха кислородом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты изучения анаэробных окислительно-восстановительных превращений субстратов в митохондриях животных, интенсивности и энергетической эффективности различных путей анаэробного образования сукцината и их регуляции, а также вклада митохондрий в поддержание кислотно-основного состояния ткани при АТФ-азных нагрузках позволили выявить ключевую роль воспроизводства и окисления сукцината в увеличении вклада митохондрий в энергообеспечение при кислородном голодании. Эти данные могут служить теоретическим и экспериментальным обоснованием практи-
ческого использования субстратов источников сукцината для поддержания энергетического обмена в тканях при гипоксии и ишемии, а также - экзогенного сукцината в качестве противогипоксического средства и проти-воацидотического препарата, в частности, в условиях рабочей гипоксии, обусловленной повышенным потреблением кислорода при физической нагрузке.
Выявлена способность эмульсий перфторорганических соединений переводить митохондрии из состояния, характерного для ишемии после массивного кровезамещения, с явлениями разобщения окислительного фосфори-лирования, в состояние, близкое к постгипоксической активации, практически без разобщения окислительного фосфорилирования. Эти данные позволяют оценить созданный препарат эмульсии перфторорганических соединений как эффективное противоишемическое средство.
Представленный материал свидетельствует о перспективности изучения метаболических превращений, протекающих в митоходриях при кислородном голодании, и использования механизмов поддержания функций митохондрий для разработки, создания и оценки эффективности новых противо-гипоксических и противоишемических средств, таких как экзогенные субстраты энергетического обмена (в качестве метаболически активных пищевых добавок) и препаратов, улучшающих массообмен кислорода и метаболитов в тканях.
Основные выводы
1. Исследован адаптивный механизм редокс-зависимой энергопродукции в митохондриях при кислородном голодании - анаэробное образование сукцината. Впервые показано, что скорости и энергетическая эффективность различных путей анаэробного образования сукцината в митохондриях неодинаковы и варьируют в широком диапазоне в зависимости от вида субстратов источников сукцината и энергетического состояния митохондрий. Обнаружено. неизвестное ранее переключение различных путей анаэробного образования сукцината: в течении аноксии: энергетически более эффективные пути сменяются энергетически менее эффективными.
2. Активация анаэробного образования сукцината различными экзогенными субстратами в разной мере улучшает энергетическое состояние митохондрий и изолированных клеток - кардиомиоцитов и культивируемых клеток почки.
3. Обращено внимание на роль окислительного фосфорилирования в регуляции рН при АТФ-азных нагрузках. Показана возможность оценки и повышения вклада окислительного фосфорилирования в поддержание рН при АТФ-азных нагрузках путем активации дыхания экзогенным сукцинатом.
4. Вопреки сложившимся представлениям о невозможности включения экзогенного сукцината в метаболические превращения из-за его плохого проникновения в неповрежденные клетки и ткани, с помощью радиоактивной и стабильной изотопных меток показано, что экзогенный сукцинат может ин-
тенсивно окисляться до углекислого газа и скорость его окисления многократно возрастает при физической нагрузке.
5. Введение животным и прием спортсменами препаратов сукцината уменьшают развитие метаболического ацидоза при мышечных нагрузках и способствуют повышению работоспособности.
6. Установлены отличительные особенности реакций митохондрий, перенесших в ткани острую гипоксию и ишемию: активация дыхания и окислительного фосфорилирования после острой гипоксии и разобщение окислительного фосфорилирования и подавление фосфорилирующего дыхания после ишемии.
7. Показано, что в отличие от традиционных плазмозаменителей эмульсия перфторорганических соединений обеспечивает такое улучшение массооб-мена в тканях, которое на уровне выделенных митохондрий печени может быть оценено как переход от ишемии к гипоксии.
8. Полученные данные дают основание использовать для коррекции ки-слорододефицитных состояний источники анаэробного образования сукцината и экзогенный сукцинат в качестве средств метаболической поддержки^ эмульсии перфторорганических соединений в качестве противоишемическо-го препарата. Субстрать; - источники анаэробного образования сукцината следует использовать для защиты от анаэробиоза и гипоксии, а экзогенный сукцинат - для коррекции собственно гипоксических состояний.
Список использованных сокращений
ADP - аденозиндифосфат
AMP - аденозинмонофосфат
АОС - анаэробное образование сукцината
АСП - аспартат
АТР - аденозинтрифосфат
АТФ-аза - аденозинтрифосфатаза
а-КГ - а-кетоглутарат
(3-ОМ - (3-оксимасляная кислота
КОС - кислотно-основное состояние
КрФ - креатинфосфат
MX - митохондрии
NAD - никотинамидадениндинуклеотид NADP-никотинамидаденидинуклеотидфосфат ОАА - оксалоацетат
ПАВ - поверхностно-активное вещество
ПН- пиридиннуклеотиды
ПНН - пиридиннуклеотиды восстановленные
р02 - парциальное давление (напряжение) кислорода
ПФД - перфтордекалин;
ПФМЦП - перфтор-Ы-(4-метилциклогексил)-пиперидин; ГТФТБА - перфтортрибутиламин; Pi - фосфат неорганический
ТФФ - тетрафенилфосфоний;
С1ССР - carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone
ФАД - флавинадениндинуклеотид
ФЕП - фосфоенолпируват;
ФП - флавопротеиды
ЦТК -цикл трикарбоновых кислот.
ЭГТА - этиленгликоль бис(р-аминоэфир)-Щ<,]чП,>Г-тетраацетат; ДцН+ - электрохимический трансмембранный потенциал ионов водорода.
Основные публикации по теме диссертации
1. Генкин A.M., Глотов H.A., Маевский Е.И. Влияние острой гипоксии и введения глутамата натрия на реакции дыхательной цепи митохондрий некоторых органов. // Митохондрии /Под ред. С. Е. Северина - М., 1973. - с. 8284.
2. Кондрашова М.Н., Маевский Е.И., Бабаян Г.В., Саакян И.Р., Ахмеров Р.Н. Адаптация к гипоксии посредством переключения метаболизма на превращения янтарной кислоты. // Митохондрии /Под ред. С.Е. Северина - М., 1973.-с. 112-129.
3. Волков М.С., Генкин A.M., Маевский Е.И., Глотов H.A. Глутаминовая кислота. Биохимическое обоснование практического использования. - Свердловск: Средне-Уральское книжное издательство, 1975. - 120 с.
4. Розенфельд A.C., Маевский Е.И. Коррекция посленагрузочного ацидоза с помощью янтарнокислого натрия и натриевой соли глутаминовой кислоты в эксперименте и спортивной практике // Терапевтическое действие янтарной кислоты / Под ред. М.Н. Кондрашовой - Пущино, 1976. - с. 150-152.
5. Розенфельд A.C., Маевский Е.И. Влияние кроссового бега на кислотно-щелочное равновесие крови у спортсменов в подготовительном периоде // Конькобежный спорт. - 1976. — № 1. — с. 36-38.
6. Маевский Е.И., Розенфельд A.C., Городецкий Я.Ю. Ответная реакция кислотно-щелочного равновесия крови конькобежек на повторную нагрузку. // Конькобежный спорт. - 1977. - № 2. - с. 53-55.
7. Маевский Е.И. Кондрашова М.Н. Роль митохондрий в глюконеогенезе // Регуляция энергетического обмена и физиологическое состояние организма / Под ред. М.Н.Кондрашовой. - М, Наука, 1978. - с. 145-165.
8. Кондрашова М.Н., Маевский Е.И. Взаимодействие гормональной и мито-хондриальной регуляции.// Регуляция энергетического обмена и физиологическое состояние организма / Под ред. М.Н.Кондрашовой. - М, Наука, 1978. - с.217-229.
9. Кондрашова М.Н., Маевский Е.И. Активация сукцинатдегидрогеназы как основа "анаэробной" работы и устойчивости к гипоксии // Митохондриаль-ные процессы во временной организации жизнедеятельности / Под ред. М.Н. Кондрашовой. - Пущино, 1978. - с. 6-12.
10. Kondrashova M.N., Maevsky E.I., Gusar I.B., Anisimov V.N., Kaminsky Yu.G. Kosenko E.A. Endogenous succinate in mitochondria respiration under different states of organism // First European bioenergetic conference: Abstracts. -Bologna, Italy, 1980. - pp. 371-372.
11. Маевский Е.И. Биологические эффекты фторуглеродов и проксанолов // Перфторированные углероды в биологии и медицине./ Под ред. Ф.Ф. Белоярцева - Пущино, 1980.-с. 76-81.
12. Верещагина В.М., Маевский Е.И. Анализ выхода калия из эритроцитов при физической нагрузке и моделировании лактатного ацидоза // Патологическая, физиология и экспериментальная терапия. - 1980. - № 5. - с. 41-45.
13. Kondrashova M.N., Gusar I.B., Maevsky E.I., Wul'fius E.A., Andreev A.L. Participation of endogenous succinate in the action of phisiological doses of adrenaline // 6th Joint Symposium of the Biochemical Societies of the GDR and USSR "Regulation in metabolism and bioenergetics": Abstracts. - Tallinn, 1981 -p. 167.
14. Maevsky E.I., Brustovetsky N.N. The origin of the hypoxic activation of the mitochondrial respiration// 9-th Colloquium on bioenergetics and mitochondria: Abstracts. - Elbingerode, GDR, 1981. - p. 12.
15. Каймачников Н.П., Маевский Е.И. Модель регуляции концентрации глюкозы в крови при физической нагрузке.// Биофизика. - 1982. — т. XXVII. —№ 4 - с. 698-702.
16. Maevsky E.I., Gusar I.G., Rosenfeld A.S., Vdovochenko V.I., Maljuk V.I., Rotenberg Yu.S., Kondrashova M.N. Doesn't succinic acid mediate adrenaline stimulation in mitochondria?//II Europ. bioenerg. conf.: Abstracts - Lyon, 1982. -p. 589-590.
17. Кокоз Ю.М., Кобринскеий E.M., Фрейдин A.A., Исламов Б.И., Маевский Е.И., Белоярцев Ф.Ф., Иваницкий Г.Р. Действие газопереносящей эмульсии перфторуглеродов на миокард (ионный транспорт, сократительная активность и чувствительность к медиаторам) // Докл. АН СССР. - 1982 - т. 270. -№ 2. - с. 459-462.
18. Фрейдин А.А., Кокоз Ю.М., Кобринский Е.М., Маевский Е.И., Илларионов Э.Ф., Быстрицкий Г.И., Белоярцев Ф.Ф., Иваницкий Г.Р. Влияние неио-ногенных поверхностно-активных веществ (проксанолов) на натриевые и калиевые токи в миокарде.// Докл. АН СССР. - 1982 - т. 270. - №3. - с. 728731.
19. Голубев A.M., Васильев А.Э., Шибаев Н.В., Маевский Е.И., Исламов Б.И. и др. Морфологический анализ органов крыс после массивной замены крови эмульсией перфтортрибутиламина // Архив патологии. - 1982. - т. XLIV. -№ 11 - с. 55-60.
20. Белоярцев Ф.Ф., Иваницкий Г.Р., Исламов Б.И., Маевский Е.И., Шибаев Н.В., Брустовецкий Н.Н. Замещение больших количеств крови газопереносящей средой на основе эмульсии перфторуглеродов. // Докл. АН СССР. -1983. - т. 270 - № 2. - с. 487-491.
21. Маевский Е.И., Шибаев Н.В., Капцов В.В., Примак-Миролюбов В.Н. и др. Первый опыт получения крупных партий эмульсий перфторуглеродов для экспериментальных и клинических целей. // Медико-биологические аспекты применения эмульсий перфторуглеродов/ Под ред. Ф.Ф. Белоярцева - Пущи-но 1983. - с. 39-47.
22. Белоярцев Ф.Ф., Исламов Б.И., Маевский Е.И. Перфузионный и беспер-фузионный методы защиты миокарда с помощью эмульсий перфторуглеродов. - Пущино, 1983. - 24 с.
23. Белоярцев Ф.Ф., Маевский Е.И., Исламов Б.И. Фторосан - плазмозамени-тель с функцией переноса кислорода на основе эмульсии перфторуглеродов.
- Пущино, 1983. - 19 с.
24. Брустовецкий H.H., Маевский Е.И. Данилова JI.C., Колаева С.Г., Иваниц-кий Г.Р. Изменения эффективности окислительного фосфорилирования, скорости дыхания и транспорта ионов Ca в митохондриях печени крыс и сусликов при различных уровнях термогенеза. // Докл. АН СССР. - 1984. - т. 276.
- № 5. - с. 1260- 1263.
25. Дынник В.В., Маевский Е.И., Григоренко Е.В., Ким Ю.В., Субстратное угнетение в цикле трикарбоновых кислот. // Биофизика. - 1984. - т. XXIX -№ 6. - с. 954-958.
26. Dynnik V., Maevsky Е., Kim Yu., Khasanov V., Stoichiometric control by CoA esters and inhibition by malate of Krebs cycle.// Studia biophys. - 1984. -102.-p. 197-215.
27. Маевский Е.И., Розенфельд A.C., Кондрашова М.Н. О роли окислительного фосфорилирования в поддержании pH при АТФ-азных нагрузках // Метаболическая регуляция физиологических функций / Под ред. М.Н. Кондра-шовой, Ю.Г. Каминского — Пущино, 1984. - с. 26-27.
28. Маевский Е.И., Брустовецкий H.H., Тупикина Е.В. Оценка кислородного режима при массивной замене крови эмульсией перфторуглеродов по реакциям митохондрий печени крыс // Фторуглеродные газопереносящие среды / Под ред. Ф.Ф. Белоярцева - Пущино, 1984. - с. 141-146.
29. N.N.Brustovetsky, E.I.Maevsky, S.G.Kolaeva, L.S.Danilova, N.G.Solomonov, Role of the Ca cycle in uncoupling of oxidative phosphorylation in liver mitochondria of cold-acclimated rats.// Comp. Biochem. Physiol. - 1985. - 82B. -№ 3 - p. 545-547.
30. Белоярцев Ф.Ф., Кайдаш A.H., Исламов Б.И., Маевский Е.И., Кокоз Ю.М., Фрейдин A.A., Образцов В.В. Оценка возможностей использования фторуг-леродной кардиоплегии для противоишемической защиты миокар-да.//Вестник Акад. медицинских наук СССР. - 1986. - № 6. - с. 37-43.
31. Белоярцев Ф.Ф., Иваницкий Г.Р., Маевский Е.И., Образцов В.В., Шехтман Д.Г. Химически инертные фторуглероды - индукторы ферментов моноокси-геназной системы микросом печени // Докл. АН СССР - 1986- т. 286,- №. 3.-с. 729-732.
32. Brustovetsky N.N., Mayevsky E.I. Regulation of the degree of coupling of oxidation with phosphorylation in rat liver mitochondria: relation to thermogenesis.//l V Europ.Bioenerg.Conf.: Abstracts. - 1986 - v. 4. - p. 381.
33. Исламов Б.И., Маевский Е.И., Воробьев С.И., Кобринский Е.М., Лубяко А.А., Саксон М.Е. Влияние проксанолов на электромеханическое сопряжение в миокарде и их вклад в защиту от ишемии эмульсиями фторуглеродор. //Вестник Акад. медицинских наук СССР. - 1987. - № 2 - с. 40-45.
34. Dynnik V.V., Maevsky E.I., Kosenko Е.А., Kaminsky Yu.G., Stoichimetric traps in the tricarboxylic acid cycle. I. Self-inhibition and triggering phenoomena // Biochem.Intern. - 1987. - v. 14. - No. 2. - p. 199-210.
35. Брустовецкий H.H., Гогвадзе В.Г., Маевский Е.И. Биохимические основы торможения и активации дыхания митохондрий печени гибернирующйх сусликов.// Биологические науки. - 1988. -№ 4. - с. 14-20.
36. Онищенко Н.А., Иваницкий Г.Р., Вазагашвили М.О., Маевский Е.И., Жу-каускас Г.Ю., Илгявичуте .Я.С., Сафонов А.А., Воробьев С.И., Оранская Г.А. Целесообразность введения фторуглеродной эмульсии в организм трупного донора перед забором почек для трансплантации. // Вестник хирургии им. И.И.Грекова. - 1989. - т. 143. - № 7. - с. 94-95
37. Kim N.P., Ovchinnikov I.V., Guliamov D.S., Mayevsky E.I. Energy value of glucose and lactate for the myocardium in patients with mitral stenosis // Cor et Vasa.- 1989.-31 -№ 4-p. 306-311.
38. Brustovetsky N.N., Mayevsky E.I., Grishina E.V., Gogvadze V.G., Amerkhanov Z.G. Regulation of the rate of respiration and oxidative phosphorylation in liver mitochondria from hibernating ground squirrels, Citellus undulatus // Сотр.Biochem.Physiol. - 1989. - т. 94B. - № 3. - p. 537-541.
39. Маевский Е.И., Гришина E.B., Окон M.C., Кутышенко В.П. Анаэробное образование сукцината и ресинтез АТФ в митохондриях тканей крыс // Фармакологическая коррекция гипоксических состояний/ Под ред. Л.Д.Лукьяновой. - М., 1989. - с. 80-86.
40. Брустовецкий Н.Н., Амерханов З.Г., Гришина Е.В., Маевский Е.И. Влияние тоничности среды на скорость дыхания и окислительное фосфорилиро-вание в митохондриях печени активных и гибернирующих сусликов.// Биохимия. - 1990. - т. 55. - № 2. - с.201-209.
41. Brustovetsky N.N., Amerkhanov Z.G., Grishina E.V., Mayevsky E.I. The influence of the tonicity of the medium on the rate of respiration and oxidative phosphorylation in the liver mitochondria of active and hibernating gophers.// Biomedical Science. - 1990. - v. 1. - № 1 - p. 102.
42. Brustovetsky N.N., Amerkhanov Z.G., Grishina E.V., Mayevsky E.I. Bc-complex is the main regulatory site of respiratory chain of the liver mitochodria of hibernating ground squirrels //-VI Europ. bioenerg. conf.: Abstracts. - 1990. - v. 6.-p. 12.
43. Brustovetsky N.N.,Amerkhanov Z.G., Grishina E.V., Mayevsky E.I. Role of phospholipase A in regulation of the functions of liver mitochondria of hibernating ground squirrels.// VI Europ. bioenerg. conf.: Abstracts. - 1990. - v. 6 - p. 8.
44. Брустовецкий Н.Н., Маевский Е.И., Гришина Е.В. Роль Na/K-АТФэзы в активации дыхания изолированных кардиомиоцитов ненасыщенными свободными жирными кислотами.// Цитология. - 1990. - т. 32. - № 9. - с. 921922.
45. Брустовецкий Н.Н., Егорова М.В., Маевский Е.И. Окислительная активность митохондрий печени активных и гибернирующих сусликов при различных условиях инкубации.// Биохимия. - 1991, - т. 56 - № 8.-е. 15221527.
46. Брустовецкий Н.Н., Егорова М.В., Гришина Е.В., Маевский Е.И. Активация окислительного фосфорилирования и энергозависимого поглощения ионов Са+2 и К+ митохондриями печени гибернирующих сусликов в гипотонической среде.// Биохимия. - 1991. - т. 56. - № 8. - с. 1528-1534.
47.Брустовецкий Н.Н., Егорова М.В., Гришина Е.В., Маевский Е.И., Кокоз Ю.М., Зинченко В.П. Механизм активации дыхания изолированных кардиомиоцитов крысы ненасыщенными свободными жирными кислотами. Роль ионов Na+.// Биологические мембраны. - 1991. - т. 8. - № 8. - с. 824-829
48. Брустовецкий Н.Н., Егорова М.В., Гогвадзе В.Г., Гришина Е.В., Кокоз Ю.М., Маевский Е.И. Na'-зависимый механизм стимуляции дыхания изолированных кардиомиоцитов крысы арахидоновой кислотой. Роль перекисного окисления липидов и фосфолипазы hj.H Биологические мембраны.-1991,-т.8. -№ 8,- с.907-911.
49. Obraztsov V., Sklifas A., Maevskii Е., Shekhtman D., Kukushkin N. Is the induction of cytochrome P-450 a cause of rabbit death after injection of perfluorodecalin emulsion? II Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics. 1992, INCO-TNC, Moscow, 597-600.
50. Brustovetsky N.N., Egorova M.V., Mayevsky E.I. Regulation of oxidative activity and of liver mitochondria of active and hibernating gophers. The role of phospholipase A2./I Сотр. Biochem. Physiol. - 1992. - v. 102B - № 3. - p.635-638.
51. Maevsky E.I, Grishina E.V., Rosenfeld, A.S., Okon M.S., Kondrashova M.N. -Substrate exchange in hypoxic animal _ cells.// Workshop on intercellular communication: Abstracts. - Pushchino,1994. - p. 65.
52. Grishina E.V., Maevsky E.I., Brustovetsky N.N., Okon M.S. Energy efficiency of anaerobic substrate transformation in rat liver mitochondria.//Hypoxia Medical Journal. - 1996.-№ 2. - p. 30.
53. Maevsky E.I., Grishina E.V. Preservation of anienal mitochondria under hypoxia by means of anaerobic redox substrate transformation. //Hypoxia Medical Journal. - 1996. - № 2. - p. 43-44.
54. Маевский Е.И., Гришина E.B., Окон M.C., Брустовецкий Н.Н. Сравнительная оценка вклада анаэробного образования сукцината из различных субстратов в митохондриях печени.//Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве./ Под ред. М.Н. Кондрашовой, Ю.Г. Каминского, Е.И. Маевского. - Пущино, 1996. - с. 42- 52.
55. .Маевский Е.И., Розенфельд А.С., Вазагашвили М.В., Чилая С.М. Возможность окисления введенной янтарной кислоты в условиях организма. // 34
Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве./ Под ред. М.Н. Кондрашовой, Ю.Г. Каминского, Е.И. Маевского. - Пущине, 1996.-с. 52-57.
56.. Ким Н.П., Маевский Е.И., Овчинников И.В., Ахмеров Р.Н., Кондрашова М.Н. Регуляция энергетического обмена в гомогенате миокарда спомощыо сочетания глюкозы, лактата и сукцината. // Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. / Под ред. М.Н. Кондрашовой, Ю.Г. Каминского, Е.И. Маевского. - Пущино, 1996. - с. 106-113.
57. Маевский Е.И., Верещагина В.М., Гришина Е.В., Розенфельд A.C. Биохимическое обоснование практического использования метаболитов в коррекции гипоксических состояний при парентеральном и энтеральном питании.// Парентеральное и энтеральное питание в хирургии / Под ред. Е.И. Маевского, Л.Н. Костюченко, Ю.Н. Ляшенко, В.Б. Хватова. - Пущино, 1997. - с. 5-17.
Патенты и авторские свидетельства на изобретения **
58. Способ консервирования клеток крови: A.c. 990228 СССР, МКИ А61 К 35/14, 1982 /Брустовецкий H.H., Маевский Е.И., Белоярцев Ф.Ф., Шибаев Н.В.
59. Перфтор-М-(4-метилциклогексил)-пиперидин как основа газоперенося-щих перфузионных сред: A.c. 1094287 СССР, ДСП, 1984 /Кнунянц И.Л., Макаров К.Н. Снегирев В.Ф., Гервиц Л.Л., Комарова Л.Ф., Шайдуров B.C., Заболотских В.Ф., Гончаренко A.A., Жирнов О.М., Белоярцев Ф.Ф., Маевский Е.И., Исламов Б.И., Серушкин И.Л., Мухин В.Ю., Бильдинов К.Н.
60. Способ получения перфторуглеродных эмульсий: A.c. 1298976, ДСП, 1986 /Белоярцев Ф.Ф., Маевский Е.И., Шибаев Н.В., Капцов В.В., Кукушкин В.И., Алымов A.B., Энман В.К., Исламов Б.И.
61. Способ обработки перфгорорганических эмульсий для сохранения крове-замещающих свойств: A.c. 1389049, ДСП, МКИ А 61 К 9/10, 1987 /Ковалев О.И., Маевский Е.И., Михалев О.И. Образцов В.В., Тальрозе В.Л., Трофимов В.И., Шипунова H.A.
62. Способ лечения аноксии конечности А. С. № 160254], приоритет от 26,12,1986, МКИ А 01 N 1/00/ Кипренский Ю. В., Онищенко H.A., Карасев А. Б. Маевский Е. И. и др.
63. Способ определения пригодности донорских почек к пересадке: A.c. 1325732, ДСП, МКИ А 01 N 1/00, 1987 /Шумаков В.И, Сафонов A.A., Белоярцев Ф.Ф., Долбин А.Г., Онищенко H.A., Глушаков A.C., Маевский Е.И.
64.1-Оксил 2,2,6,6-тетраметил-(или 2,2,3,5,6-гексаметил) пиперидил-4-перфтор-энантоаты в качестве спиновых зондов для сред, содержащих фто-руглероды: A.c. 1441729, ДСП, МКИ С 07 D 211/94, 1987 /Михалев О.И., Шапиро А.Б., Баргамова М.Д., Белостоцкий A.M., Маевский Е.И., Львова Г.В., Чхеидзе И.И., Казарова Е.Б., Сускина В.И., Кнунянц И.Л. 65. Способ очистки жидких перфторуглеродов: Патент РФ 1570261, 1993 г./ Маевский Е.И., Образцов В.В., Гудкова О.В., Кулакова Г.М.
66. Способ получения перфторуглеродных эмульсий для медицинских целей Патент РФ № 2070033, 1996 г /Воробьев С.И., Иваницкий Г.Р., Маевский Е.И., Склифас А.Н., Исламов Б.И., Шибаев Н.В., Белоярцев Ф.Ф.
67. Антидиабетическая средство на основе янтарной кислоты, положительное решение от 21 октября 1997 г. на выдачу Патента РФ на заявку № 96119910/14. /Каминский Ю.Г., Кондрашова М.Н, Косенко Б.А., Маевский Е.И., Аникеева С.П.,
68. Пищевая добавка «Яшавит», положительное решение от 18 ноября 1997 г. на выдачу Патента РФ на изобретение по заявке №96120571/13. /Каминский Ю.Г., Косенко Е.А., Маевский Е.И., Саакян И.Р., Кондрашова М.Н., Хазанов В.А.
Маевский Евгений Ильич (Россия)
«Коррекция гипоксических состояний путем поддержания функций митохондрий»
Исследованы редокс-зависимые превращения субстратов в митохондриях (MX) печени, сердца и почек крыс и морской свинки. Установлено, что активация анаэробного образования сукцината (АОС) экзогенными субстратами улучшает энергетическое состояние MX, кардиомиоцитов и клеток почки. Показаны энергетическая регуляция, разная энергетическая эффективность и •зависимость от длительности анаэробиоза различных путей АОС. Обнаружено противоацидотическое действие сукцината при АТФ-азных нагрузках на тканевых препаратах, органах, и на уровне целого организма при мышечных нагрузках. Впервые в условиях организма показано окисление экзогенного сукцината до СОг. По состоянию фосфорилирующего дыхания MX печени после массивного кровезамещения оценено противоишемическое действие эмульсии перфторуглеродов. Полученные данные использованы при создании противогипоксических препаратов.
Eugene I. Maevsky (Russia)
«Correction of hypoxic states by mitochondria metabolism support». Redox-dependent substrate metabolism was investigated in isolated mitochondria (MT) under hypoxic condition. Substrate stimulation of different anaerobic succinate production (ASP) ways improved an energy state of MT and cells. It was found that various pathways of ASP had common energy control, but different efficiency and dependence on duration of anaerobiosis. It was shown that succinate could reduce acidosis at the ATP-ase load in homogenate and organ, and under muscle work of animal or people. It was revealed that exogenous succinate can metabolize into carbon dioxide in animal and human. Analysis of rat liver MT respiration and oxidative phosphorylation showed antiischemic activity of perfluorocarbon emulsions at blood replacement. On the base of obtained results developed approaches to the creation of new antihypoxic means.
-
Маевский, Евгений Ильич
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 1998
-
ВАК 03.00.04
- Морфофункциональные характеристики митохондрий кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда при инкубации в условиях гипоксии
- Функционирование митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала при различных физиологических и патологических состояниях
- Роль системы окисления янтарной кислоты в энергетическом обмене головного мозга
- Оценка и прогнозирование влияние гипоксии на энергетические процессы мозга с применением математических моделей.
- Свойства митохондриальной креатинкиназы мозга в условиях ишемии и интервального гипоксического прекондиционирования
