Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль системы окисления янтарной кислоты в энергетическом обмене головного мозга

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль системы окисления янтарной кислоты в энергетическом обмене головного мозга"

г г ¡з ^ 1 1 ^

, г ».-.»г) ^чЗ

' АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИИ . Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН

На правах рукописи

Хазанов Вениамин Абрамович

роль СИСШЧЫ окисления янтарной кислоты в энЕртичпаом обмене гололно! о мол"а

0:3.00.0-1 - йюхгаяш 14.00.25 - Фармакология

Автореферат Диссертации на ,соискание ученой степени доктора медицинских наук

' /

Томск - 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра РАШ

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор

М.Н. Кондрашова

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор A.C. Саратиков

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

A.M. Дыгай

доктор медицинских наук, профессор Т.О. Федорова

доктор медицинских наук, ст.н.с. Н.В. Канская

Ведущая организация - Институт фармакологии РАШ (Москва)

Защита диссертации состоится 31 марта 1993 г. на.заседании Специализированного совета Д 084.28.01 при Сибирском Ордена трудового красного знамени медицинском университете (634050, Томск, Московский тракт, 2). • :

С диссертацией можно ознакомиться в научной части Сибирского.. медицинского университета.

Автореферат разослан " . <реВраля_ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, д.м.н., профессор

S.U. Белобородова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В головном мозге существует более

тесная, чем в других органах., связь системы энаргопродукции и функциональной активности органа. Это обусловлена исключительно высокой интенсивностью процессов образования и утилизации энергии, отсутствием в мозге запасов субстратов окисления и кислорода, наличием гематоэнцефалического барьера, тесной связью обмена тсриазнюе ~л возСузд&ьцкх моздаюроь iTHSii. аминокислоты группы глух£!«йга) с системой ш'^охоидриального окисления in..i'iBÖ— нов, Ю.Кисляков, 19Т9; А.Лабори, 1974; А.Лениндкер, 1985; B.SlesJo, 1978].

Глюкоза является основным- энергетическим субстратом клеток мозга, а кинетические характеристики гликолиза допускают его 40-кратную активацию при возрастании энергозапросов [А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит и др., 1981; A.Chapman, В.Meldrum, B.Sleajo, 1977: J.Folbergrova, М.ТпэтяГ; ' B.Siea jo, 1981; B.Sie3 je, 'l 97g]. В QBasH с низкой проницаемостью ГЗВ для лактата защита органа от лактацидоза обеспечивается реакциями утилизации конечных продуктов гликолиза митохондриями (MX) [А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит и др., 1981; B.Slesjo, 1978]. Однако, принятая концепция регуляции митохондриального окисления, основанная на контролирующей роли узких мест ЦТК (цитратсинтязная и изоцитратдегидрогенпзноя реакции) и шфувгтдегидрогеназнсго комплекса не позволяют объяснить,-каким образом осуществляется метаболизм излишне продуцируемой при возрастающих .энергозапросах молочной кислоты, поскольку в норме вышеупомянутые ферменты работают со скоростями, близкими к максимально возможным [Э.Ньюсхолм, К.Стар!, (9'i"7; д.Уайт, З'.Хелллер, Э.Смит и др., 1981].

Существуют многочисленные данные, показывающие высокую стабильность содержания АТФ в ткани моя г я при гатологичоских оог.тоя-|.1ях, сопровождающихся экс ремалышми внергозатратами ПЗ.Архипон;

A.Булонцов, 1986; Г.Зенкевич, 1 ЭТО; К.Иванов, Ю.Кисляксш, 1979; У.Ласт, Дж.Иасоннеу, 1982; К.Погодаев, 1986; М.Самойлов, 1У85; Е.Хватовя, А.Сидоркине, Г.Миронова, 1987; H.Bachelard, 197 в ;

B.Siesjo, 1978], К таковым, в частности, относятся стресс-реакция, генерализованные судорожные припадки, церебральная- ишемия [B.SleaJo,- 1978). По существующим представлениям, основными механизмами, поддерживающими стабильность аденилатного эноргетическо-

го заряда клеток мозга являются, . наряду с окислительным фосфори-лированием, нуклеозид-дафосфат-киназная реакция, связывающая пул' ГТФ и АТФ, и креатинкиназная реакция, поддерживающая взаимосвязь пула КФ и АТФ [А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит и др., 1981; Е.Хватова, А.-Сидоркина, Г.Миронова, 1987% Пул КФ в отношении АТФ выполняет буферную функцию и затрагивается только при уменьшении аденилат-■ного энергетического заряда' либо снижении внутриклеточного рН [С.Лиходий, Ст.Лиходий, Л.Сибельдина и др., 1988; №.Назз, 1983; И.СогЬеП, -А.Ьаргоок, И^иппаНу, е1; а1., 1988; Е.Иетого, 1978]. Содержание ГТФ является одним из наиболее лабильных - показателей состояния системы энергопродукции головного мозга [Е.Хватова, Е.Щуматова, Г.Миронова и др., 1976; Е.Хватова, А.Сидоркина, Г.Миронова, 1987; ' Е.Хватова, А.Сидоркина, Л.Якобсон, В.Ваулина, 1981 ].. Синтез ГТФ в реакции субстратного фосфоршшровадая при образовании из 2-оксоглутарата янтарной кислоты указывает на особое значений этого звена ЦТК в регуляции энергетического метаболизма мозга.

Существующее представление о функционировании ЦТК предполагает основной приток субстратов в цикл через пируватдегидрогеназ-ный комплекс и равномерную интенсификацию кругооборота цикла ' при необходимости увеличения продукции АТФ МХ [Э.Ныосхолм, К.Старт, 1Э77; А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит и др., 1981], Вместе с тем, медленные ферменты (изоцитратдегидрогеназа и цитратсинтаза), в рамках теории функционирования замкнутого цикла Кребса, ограничивают возможность интенсификации продукции макроэргов органеллами, что не согласуется с данными об уровне, .компенсируемых окислительным фосфорилированием, энергозатрат мозга при экстремальных энергозапросах [К.Иванов, Ю.Кисляков, 1979; Р.Глебов, :Г.Крыжановский, 1983]. . , '

М.Н. Кондрашова [1989, 199П, на основе стр^ктурно-киндти-ческой организации митохондриальных процессов пришла к заключению-о существовании быстрого и медленного путей метаболизма субстратов в МХ и доминирующей активации быстрого пути при возрастании энергозапросов органа. Быстрый путь представляет собой ускоренный механизм образования и окислейия янтарной кислоты (ЯК) через сопряжение сукцинатдегидрогеназной (СДГ) реакции с аспартат-аминот-рансферазой и 2-оксоглутаратдегидрогеназой. Он замыкается в цикл с участием аминотрансфераз цитозоля, поддерживая приток'субстра-

tob (глутамат, пируват, малат) в MX. Обходя начальный медленный участок ЦТК, быстрый путь позволяет реализовать кинетическое преимущество СДГ и мощность окисления генерируемой в MX ЯК обеспечивает интенсивную продукцию ГТФ и АТФ. В 1000 раз большая мощность потока водорода и электронов при окислении вндогешо продуцируемой ЯК, по сравнению с другими субстратами MX, обеспечивает высокий уровень энергетической регуляции метаболизма органелл, поддержание ионного (Са2+, If1") гомсостаза клеток мозгп, вносит ыслад в активную анттгерекиснуп защиту Ш.Ковдрашова, 1989; B.Chance, B.Schroeder, 19611.

Не ясно, в какой мере предложенная схема регуляции энергопродукции Ж реализуется.в формировании адаптивной реакции органа при патологиях,- характеризующихся экстремальными энергозапросами, каковы механизмы реализации потенциальной активности системы окисления ЯК при нарастании патологического воздействия. Отсутствуют данные, в какой степени сукцинатзависимзя система энергопродукции реально участвует в поддержании метаболического гомеостаза головного мозга, осуществляя контроль энергетической регуляции метаболизма, поддерживая взаимосвязь гликолиза и мг.то-хондриального окисления, обеспечивая кальциевый гомеостаз нейронов. Практически не исследовано участие системы окисления ЯК в антиперекиеной защите головного мозга. Неизвестно, как описттне механизмы участвуют в реализации терапевтического эффекта лекарственных препаратов, используемых в неврологии.

В качестве моделей патологии ЦНС мы использовали стресс-реакцию, неполную общую церебральную ивемию и генерализованные судорожные припадки. Первая и вторая модели соответствуют ведущим компонентам большинства патологических процессов головного мозга [З.Араратян, 1984; М.Биленко, 1989; С.Ефуин, В.Шпектор, 1981; Р.Кветнанский, Т.Белова, О.Опршаловя, Ю.Ч/лмэн, 1981; B.Sieojo, 19781, а последняя отражает состояние крайней степени выраженности энергозатрат органа [К.Погодаев, 1964, 1986; В.Повдеев, 1980; H.Bachelard, 19Т6; A.Chapman, В.Meldrum, B.SlesJo, 1977; L.King, O.Lowry, J.Pasaoneau, V.Venson, 196'П. Известно,. что формирование повреждения клеток мозга при указанных патологических состояниях тесно связано с нарушением процессов энергопродукции [В.Síesjo, 19781, однако роль системы окисления янтарной кислоты в адаптивной и патологической реакциях органа в рамках изложенных

- А -

представлений совершенно не учитывается и до настоящего времени не исогэдована. Практически не изучено,- с позиции регуляции реакций быстрого пути окисления субстратов в МХ, влияние на сукцинат-зазисиму» энергопродукцию мозга используемых при вышеуказанных формах патологии препаратов - адаптогенов, антигипоксантов, анти-конзульсантов.

Вышеизложенное свидетельствует о высокой актуальности проблемы изучения формирования адаптивной реакции в системе энергопродукции головного мозга при нарастающих энергозапросах, в частности оценки вклада быстрого и медленного пути окисления субстратов, а также роли ЯК в поддержании метаболического гомеостаза органа в норма, при патологических состояниях и в механизме действия лекарственных препаратов. Вскрытие фундаментальных механизмов регуляции энергетического метаболизма головного мозга в норме и патологии необходимо для успешной разработки патогенетически обоснованной фармакотерапии и.создания лекарственных препаратов нового типа действия. Настоящая работа выполнялась в рамках разработки новых высокоэффективных адаптогенов, антигипоксантов и антиконвульсантов,

Цель исследования. Эксперимент в льнов обоснование доминирующей роли системы образования и окисления янтарной кислоты головного мозга в формировании адаптивной реакции энергетического метаболизма органа при нарастающем патологическом воздействии , на примерах иммобилизационного стресса, судорожных припадков, неполной генерализованной церебральной ишемии и их фармакотерапии.

Основные задачи исследования

1. Изучить роль системы окисления янтарной кислоты в поддержании энергетического гомеостаза митохондрий головного мозга ин-тактшх крыс.

2. Выявить вклад сукцинатзависимой энергопродукции в формирование основных этапов адаптивной реакции головного мозга на нарастающие энергозапросы при кммобилизационном стрессе, судорожных припадках, неполной генерализованной церебральной ишемии.

3. Оценить вклад быстрого пути метаболизма'субстратов в митохондриях в поддержание уровня рН, кальциевого гомеостаза мозга, энергетической регуляции штохондриальных процессов, в норме, при стрессе, судорожных припадках и церебральной ишемии.

4. Исследовать вклад системы сукцинатзависимой энергопродук-

щш в реализацию терапевтического эффекта адаптогенов, антикон-вульсантов, антигипоксантов при защите головного мозга от повреждения соответственно при шмобилизйциотгом стрессе, генерализованных судорожных припадках, церебральной ишемии.

Научная новизна работы

1. Впервые установлено участие в анергопродукции -головного мозга быстрого и медленного путей окисления субстратов в митохондриях. Показана доминирующая роль быстрого пути при нарастании энергозапросов органа, реализация кинетических преимуществ системы окисления янтарной кислоты в рамках функционирования быстрого кластера ЦТК, роль реакций переаминирования глутамата в образова-' нии эндогенной янтарной кислоты, важная физиологическая роль механизма активации и торможения сукцинатдегидрогеназы в обеспече-нгат адаптивной реакции митохондрий при стрессе, судорожных припадках и церебральной ишемии. В нормоксических "словиях эксперимента исследовано состояние энвргопродукции миохондрий мозга с позиции оценки вклада быстрых и медленных реакций ЦТК, показана высокая чувствительность сукцинатдегидрогеназного и трансаминаз-ного звеньев быстрого пути окисления субстратов к высоким концентрациям кислорода при Ггшероксии.

2. Впервые исследовано участие быстрого кластера ЦТК в формировании адаптивной реакции головного мозга при нараставдей нагрузке на систему энергопродукции. Показано на уровне функционального состояния митохондрий наличие трех этапов адаптивной реакции

возбуждения, резистентности и истощения. Выяь эна доминирующая активация реакций быстрого пути окисления субстратов при уменьшении вклада МБ-зависимых дегидрогеназ в цикле Кребса на этапе тревоги и резистентности и ингибирование на этапе истощения. Продемонстрирована первичная роль системы образования и окисления янтарной кислоты в формировании на уровне митохондрий трех этапов адаптивной реакции голоеного мозга при иммобилизационном стрессе, судорожных припадках и церебральной ишемии. Впервые показана активация кальцийт-транспортирущей функции митохондрий,-ограничение развития лактацидо.за, перекисного окисления липидов в ткани мозга ■ при "формировании этапа резистентности на уровне реакций быстрого пути окисления субстратов в цикле трикарбоновых кислот.

3. Впервые установлена взаимосвязь адаптогенного действия п-тирозола, противосудорожного действия фенобарбитала и бензона-ла, антигипоксического действия бемитила, этомерзола, натрия

. оксибутирата и эмокситша со способностью указанных препаратов активировать адаптивную реакцию быстрого пути окисления субстратов в цик^е Кребсг на этапах тревоги и резистентности и тормозить развитие этапа истощения адаптивной реакции энергетического метаболизма головного мозга.

4. Разработан новый методический подход к исследованию митохондрий мозга - нормоксические условия эксперимента, который позволил приблизить реакции органелл к таковым in situ и устранить маскирующее влияние гипероксического воздействия кислорода на ти-оловые ферменты и восстановленность переносчиков дыхательной цепи. Выявлена сезонная динамика процессов окислительного фосфори-лирования в митохондриях мозга, ее связь с функциональным состоянием органа. На основе сочетания методов математической статистики и теории нечетких множеств разработан и применен для оценки функционального состояния митохондрий оригинальный комплексный количественный критерий.

Научно-практическая ценность работы

1. Усовершенствован комплекс методических приемов позволяющий углубленно изучить митохондрии мозга в условиях, максимально сохраняющих их нативное состояние. Разработана оригинальная конструкция гомогенизатора ткани мозга, конструкция установки для исследования•выделенных митохондрий в условиях контролируемого состава газовой среды и температурного режима. , Отработаны приемы оценки и коррекции сезонных особенностей метаболизма миохондрий при исследовании функционального состояния органелл (авторское свидетельство N13777L0), что особенно важно для исследований, проводимых в разные сезоны года. Разработанный и апробированный нами способ- исследования митохондрий мозга в условиях, соответствующих внутриклеточным по содержанию кислорода в используемых средах (авторское свидетельство N1745258), позволяет получить более точные данные о состоянии процессов энергопродукции в ЦНС в норме, патологии и при исследовании действия лекарственных препаратов. При внпо;чении данного исследования нами разработан и апробирован комплексный количественный критерий интактности функци-

опального состояния митохондрий, который может быть использован в исследовании различных биологических объектов, 'анализируемых по большому числу параметров, в ситуациях, требующих принятия однозначного решения (авторское свидетельство Ш668945).

2. Сформулированно_ представление о роли быстрого пути окисления субстратов в митохондриях в развитии адаптации и дезадаптации 'системы энергопродукции головного мозга при патологических состояниях, сопровождающихся экстремальными энергозапросами, указтает па целесообразность поиска лекарственных препаратов, активирующих реакции быстрого пути окисления субстратов в цикле Кребса и ограничивающих глубокое ингибирование среди средств, оказывающих прямое или опосредованное влияние на активность сукцинатдегидрогеназы, обеспечивающих продукцию эндогенной янтарной кислоты в реакциях ГАМК-шунта и активирующих реакции пере ам-пнирования в ткани мозга. В работе показана обоснованность фармакологической активации реакций образования и окисления эндогенной янтарной кислоты на этапе формирования активней резистентности энергетического метаболизма головного мозга при стрессе, судорогах и церебральной ишемии и использования препаратов, ограничивающих последствия срыва энергетической регуляции на этапе истощения компенсаторных возможностей системы сукцинатзввисиу.ой энергопродукции (антиоксиданты). Продемонстрирована важность для восстановления метаболического гомеостаза органа реактивации быстрого кластера ЦТК (устранение глубокого торможения сукцинатдегидрогеназы) при патологиях, сопровоздагацихся выраженным низкоэнергетическим сдвигом в системе митохондриального окисления головного мозга.

3. Полученные в ходе выполнения работы данные,, касающиеся биоэнергетических аспектов действия исследованных препаратов, вошли.в материалы, представленные в Фармакологический коштет мгз ГФ для разрешения клинических испытаний: п-тирозола в качестве средства повышения неспецифической сопротивляемости организма: этомерзола и эмоксишша, как корректоров нарушений кровоснабжения и энергетического метаболизма головного мозга.,

Основнье ПОЛОЖЕНИЯ, вьиосимье НА ЗАЩИТУ

1. Адаптивная реакция системы энергопродукции головного мозга на экстремальные воздействия характеризуется начальной активацией

быстрого пути окисления субстратов в ■ митохондриях, последующим поддержанием ьысокой активности процесса, переходом в глубокое ингибирование при истощении компенсаторных возможностей.

2. Поддержание энергетического гомеостаза головного мозга при формировании адаптивной реакции связано с доминирующим окислением янтарной кислоты.

3. Лекарственные препараты, поддерживающие активность быстрого пути окисления субстратов в митохондриях, способствуют сохранению энергетического гомеостаза головного мозга.

Апробация работы

Результаты настоящего диссертационного исследования докладывались на Международном симпозиуме по достижениям и церспективам в исследовании митохондрий'(Бари, Италия, 1985), Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического метаболизма" (Пущино, 1986), Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Москва, 1988), Всесоюзной конференции "Физиология, патофизиология и фармакология мозгового кровообращения" (Тбилиси, 1983), VI Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент, 1988), III Всесоюзной конференции "Биоантиоксид анты" (Москва, 1989), Международной конференции "Регуляция свободнорадикальных реакций" (Варна, Болгария, 1989), Всесоюзной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы" (Москва, 1989), 20-м съезде федерации европейских биохимических обществ. (Будапешт, - Венгрия, 1990), Третьем конгрессе общества фармакологов Болгарии (София, 1990), Всесоюзной конференции "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990), Всесоюзной конференции "Молекулярные .механизмы и регуляция энергетического метаболизма" (Пущино, 1990), II Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), Всесоюзном совещании по результатам клинического и экспериментального исследования препаратов 1% и 3% эмоксипина и мексидола (Москва, 1991), 15-м международном съезде биохимиков (Иерусалим,'Израиль, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ, •получено 3 авторских свидетельства.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из ввдения, обзора литературы, посвященного роли системы окисления . янтарной

жислоти в'"энергетическом обмене головного мозга, главы материалы \ методы исседовашш, главы результаты исследования, заключения, зыводов и библиографического указателя. Работа изложена на 317 зтраиицвх, иллюстрирована 72 таблицами и 34 рисунками. Библиография включает 422 источника.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 1500 крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г.

Иммобилиззщгашшй стресс моделировали то Р.Кветнанскому и зоавторам [1981]. Развитие стресс-реакции животного контролирова- ; ни по состоянию тимуса, надпочечников и слизистой желудка животах [Г.Селье, 1972]. У крыс стадия тревоги наступает при' 3,5-часовой иммобилизации, стадия резистентности - при иммобилизации в течение 24 ч и стадия истощения - 48 ч.

Генерализованный судорожный припадок выбывали внутрибрюшинным зведением животным корааола СR.Turner, .196Ы в виде 1% водного эаствора в дозе, приводившей к 100% гибели животных (максимальные соразоловые судороги), что составляло летом 100 мг/кг и зимой 130 иг/кг. Декаптаци.0 животных проводили в период наибольшей выражен-юсти тонической фазы судорожного припадка.

Неполную генерализова: лую церебральную ишемию моделиров ¡ли _ шревязкой у крыс под эфирным наркозом обеих сонных артерий на 5, 45 мин, 2 и 3,5 часа. Контролем служила группа локноопериро-}а}шых животных. По реакции крыс на перевязку-сонных артерий мы •• шделяли, а затем и раздельно анализировали низкоустойчивую груп-гу животных, которые погибали, начиная с 4 часг ишемии, и устой-1ивую, особи которой переживали этот период.

Адаптоген п-тирозол [А.Саратиков, 1974] вводили животным шутрижелудочно-по. одному разу в сутки ежедневно в течеше .10 щей в дозах от 25 до 150 мг/кг, последнее введение производили ¡а сутки до иммобилизации.

Исследованные антиконвульсанты иньецировали животным внутриб-жяшино в противосудорожной дозе, равной 1/30 ДЦ(50), что для фе-юбарбитала и бензонала соответственно равнялось 12,5.мг/кг и 10 ir/кг, в форме взвеси в 1% слизи крахмала; контрольные животные • юлучали эквиобъемное количество растворителя. Декаптировали крыс юрез '40 мин послэ инъекции - во время развития максимальной ак-

- Ю -

тивности препарата. Введение корачола животным, получившим анти-конвульсант, проводили через 40 мин после инъекции последнего,;-декапитировали крыс спустя время, необходимое для развития тонической фазы припадка у интактных животных после введения коразо-ла.

Изучаемые ан""'гипоксанты в форме водного раствора вводили . животным внутрибрюшинно за '1 ч до перевязки сонных артерий в про-тивогипоксических дозах: этомерзол и бемитил - 50 мг/кг, натрия оксибутират - 100 мг/кг, эмоксигога - 5 мг/кг.

Митохондрии-мозга выделяли методом дифференциального центрифугирования, с использованием разработанных нами приемов, позво-ляюдих хорошо сохранить нативное состояние органелл Ш.Кондрашова и соавт., 1987].

Функциональное состояние выделенных митохондрий исследовали полярографлческим методом (полярограф РА-2 ЧСФР) по изменению содержания кислорода в среде инкубации с помощью закрытого алектро-да Кларка в различных метаболических состояниях по Чансу (Chance, Williams, 1956]. Измерение поглощения кислорода в пробе проводили в закрытой термостатируемой (t=26°C) с регулируемой подачей газовой смеси ячейке оригинальной конструкции (рац.предложение, удостоверение N 116 от 11.03.90г.)..

Среда выделения содержала 0,3 М сахарозы (фирмы "Beckman"), 0,01 М трис-буфера, 0,2 мМ ЭДТА (реактивы фирмы "Signa"), pH 7,4. В ре 'оте использован гомогенизатор оригинальной конструкции (рац. предложение, удостоверение К103 от 20.10.89 г.)

MX инкубировали в среде, содержащей 0,17 М сахарозы (фирмы "Beckman"), 40 мМ KCl /004), 5 мМ КН2Р0Д (004), 10 мМ трис-буфера (фирмы "Sigma"), 0,2 мМ ЭДТА (фирмы "Sigma"), pH 7,4. В качестве субстратов окисления использовали янтарную кислоту 5 мМ, яблочную кислоту 3 мМ, пировиноградную кислоту 3 мМ, глутаминовую кислоту 3 мМ, а-глицерофосфат 3 мМ, ß-гидроксибутират 3 мМ (все субстраты фирмь' "Sigma").

С целью детальной оценки состояния jhctomh сукцинат- и NAD-зависимой систе» энергопродукции MX мозга крыс использованы следующие методические приемы:

1. Оценка, вклада сукцината и NAD-зависидах субстратов в уровень дыхания MX ..¿.Маевский, М.Кондрашова, 1978; Е.Окон,1979].

2. Выявление замаскированного торможения сукцинатдегидрогена-

зы .___(Т-СЛГ) —[М.Кондраиовз,"" Е.Григоршжо", 1581; Е.Григоренко,

М.Кокдраиова, 19333.

3. Определение вклада с/кислекия эндогенной янтарной кислоты з дыхательную активность митохондрий СМ.КондрЕ.аова и соавт., 197?i.

Расчет всех показателей дыхательной активности MX проводили с помощью разработанной нами прсрсммк для персональной 32J (pau. предложение, удостоверение N71 от ¿2.11.88 г.).

Энергозависимый транспорт Са2+ органеллами оценивали по убыли иона в срече инкубацщт }££ иономьтрическа на приборе ЕА 9ZG i ¡¡мша "Orion Research") с использованием Са~'-селективного электрода (модель 93-20, фирма "Orion Research") и электрода сравнения (модель 90-01 той же фирмы). Электрический сигнал регистрировали на самописце SE 120 (фирма "ВВС Goers Jíetrawatt"). Состав среды выделения: 0,3 М сахарозы, 10 мМ трис-буфера. Состав среды инкубации для опытов по оценке действия препаратов, in Yivo : 0,17 М сахарозы, 10 мМ трис-буфера, 40 мМ КС1, 5 мМ КНдРО^, 5 мМ ЯК. Са3+ вносили до концентрации в среде инкубации 0,2 мМ (количественно добавка составляла 300 нгат Са2+).

Измеряли скорости фосформирующего дыхания MX в условиях активации Mg-зависимой АТФ-азы. Данный тест моделирует дыхание в клетке в условиях по выше того потребления энергии. Применяли его для выявления прямого действия изучаемых препаратов на митохонд-риальную систему энергопродукции. Среда инкубации содержала: 0,17 М сахарозы, 40 мМ КС1, 5 mM KHgPO^, 10 шМ трис-буфера, 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ ЯК, 0,05 мМ АДФ, 0,4 мМ MgCi2-

Прямое защитное действие антигипоксантов на повреждаемые MX исследовали на модели вр .ленной деградации (старения) суспензии органелл. Изучаемые препарты вносили в 1/2 супернатанта • после первого центрифугирования гомогената мозга до концентрации 10 мкМ, что приблизительно соответствует их содержанию в мозге в условиях экспериментов in situ [С.Бойко и соавт., 1987], или вводили экспериментальным животным в средне терапевтических дозах за 1 ч до забоя. Для старения пробирки с выделенными описанным выше способом, ресуспендированными MX помещали в термостатируемую при 26° С водяную баню на 20 и 40 мин.

О состоянии процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ткани мозга животных при исследуемых патологиях и действии изучаемых препаратов судили по кинетике накопления малонового диальде-

гида - вторичного продукта ПОЛ и уровню накопления первичных продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов и оснований Шиффа СЮ.Владимиров, А.Арчаков, 1972].

Белок определяли по методу Lowry (0.Lowry, F.Roaenbrough, 19511 с использованием стандартных наборов фирмы Sigma (США) и с помощью разработанной нами методики. Последняя более экономична по затратам реактивов и, особенно, времени, что позволило корректировать в ходе работы количество белка MX в маточной суспензии и, следовательно, добиваться большего постоянства условий эксперимента.

Весь экспериментальный материал подвергнут статистическому анализу. Для оценки достоверности различий исследуемых рядов данных использовали метод парных сравнений по критерию Вилкоксона -Манна - Уитни, а также t-критерий Стьюдента. Часть данных обработана ,с помощью разработанного нами на основе сочетания теории нечетких множеств и приемов математической статистики оригинального метода комплексной количественной оценки функционального состояния MX (агторское свидетельство N1668945). Анализ данных проводили на компьютере мАрр1е-2е" с помощью пакетов статистической обработки результатов "Interatat" фирмы Serendipity Systems Inc., "BlOBtatistics III" фирмы R.C. Targett,' "Statpak 3.11" фирмы-Northwest Analytical Inc., а также с помощью разработанной наш орипшальной программы расчета коэффициента интактности функционального состояния MX.

Для графического представления результатов использована программа "Graph-in-Box 1.31", New England Software Inc. для IBM-AT.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 3.1, Разработка metoqob исследования митохондрии мозга Применение в эксперименте'высокочувствительных методов исследования позволило регистрировать по изменению функционального состояния MX.отклонение от норму физиологического состояния организма/органа, дало возможность оценки нормы и патологии с позиций эноргетического состояния органелл- [М.Кондрашова,. 1965, 1975, 1979, 1987]. Разработанные ' нами методические подходы позволяют сохранить интактность органелл и более полно выявить в реакциях выделенных MX метаболические сдвиги . in Bitu [М.Кондрашова и соавт., 1987; Т.Зимина, В.Хазанов, 1986; А.Саратиков й соавт.,

'1997; О.Панина, В.Хазанов, 1939; В.Хазанов, Л.ПооорехиЯ, 1991].

З.1.1., Сезонные особенности реакций выделенных митохондрии

Нами.установлены существенные колебания скорости окисления ЯК в ИХ мозга в разные сезоны года. Наиболее низкие величины наблюдаются летом, максимально высокие - весной; позыгоние скорости окпслепия сукцкнота обусловлено возрастанием скорости дыхания в состоянии 4 по Чансу. Осенью и весной отмечено снижение сопряженности окислительного фосфориляросзнкя, при этом время фоофот?т»ли-рованпл добавлю :ной АДФ осень» возрастало, а весной уменьшалось. Последнее, очевидно, связано с высокой скоростью фосфорилирующего дыхания органелл Еесной, которая на 59% превышала показатель зимнего периода (Р<0,01 ) и на 95% соответствующее значение летом' (Р<0,01). "Чистое" ЯАЛ-зависимое дыхание органелл (окисление . 2-оксоглутарата в присутствг-п! малоната) практически не изменялось в течение года, лишь в весенний период оточено возрастание УЗ и небольшое, ко статистически значимое уменьями? величины АДФ/О осенью! Сезонное разобщение окислительного фсс&орилирования связано с нарастанием уровня свободных жирных кислот.

Результаты ьхсперимента дали нам основание рассматривать осенний и весенний периоды, как нестабильные периоды перестройки метаболизма и побудили проводить большую часть экспериментов по _ исследованию патологических процессов и действия лекарственных препаратов в летнее и зимнее время.

Углубленный аналиь состояния сукцинат-зависимого дыхания МХ выявил низкий уровень Т-СДГ детом и высокий - зимой, обнаружено нарастание в зимний период уровня эндогенной ЯК в МХ, что согласуется с нарастанием содержания в мозгу зимой серотонина [Л.Нурманд, М,Оттер, 1983], играющего•важную роль в формировании Т-СДГ С Е.Григоренко, М.Кондрашова, 1983; Р.Кривченкова, 1974], и с.интенсивным сукцинат-эавискмкм термогенеоом ГР.Ахмеров, 1981, 1983]; весенний подъем скорости окисления ЯК, по нашим данным, отражает разобщение окислительного фосфорилирования.

Выявление сезонные особенности сукцилат- и МБ-зависимого дыхания МХ, указывают на наличие двух стабильных, периодов митохонд-риальной активности - зима, лето и двух переходжх - осень, . весна. Стабильные периоды от переходных отличаются, в осноеном, высокими показателями сопряженности окислительного фссфорилирова-

ния. Зимний и летний периода различаются разной интенсивность образования и окисления ЯК; более интенсивный процесс зимой con ровождается компенсаторным нарастанием Т-СДГ. Соответственно диа пазон функциональной лабильности органелл летом выше чем зимой.

3.12. Переход от "гипероксических" к "нормоксическим" условиям эксперимента

Известно, что энергопродуцирукщие реакции МХ зависят от парциального давления кислорода в окружающей органеллы сред« [Л.Гринберг, 1973; М.Кондрашова и соавт., 1973; Л.Лукьянова i соавт., 1982]. Традиционно выделение МХ и исследоваше их дыхательной активности проводят в гипероксической, но сравнению с внутриклеточной, среде, насыщенной воздухом [М.Кондрашова, А.Ана-ненко, 1973]. Однако, при этом на учитывается регуляторная рол! кислорода, как субстрата, в реакции образования ингибитора СДГ -оксалоацвтата (ОАА) Ш.Кондрашова и соавт., 1973, 1987], а также возможное токсическое действие кислорода на сульфгидрильные группы тиоловых ферментов МХ, в частности, дегидрогеназ, ■ аминот-рансфераз и АТФ-вз [М.ГаСибов, А.Эмирбекова,. -1974; С.Елисеева и соавт., 1973; А.Лукаш и соавт., 1976], что может влиять на функциональное состояние органелл.

• Мы сравнили показатели дыхания МХ мозга крыс, исследованных с применением сред, уравновешенных по газовому составу с воздухом .гипероксические условия), с показателями органелл, изученных в условиях, когда среды выделения и инкубации МХ, а также все используемые растворы реагентов (субстраты, АДФ и т.д.) предварительно насыщали газовой смесью (кислород - 4%, диоксид углерода -8%, азот - 88%) иод контролем газоанализатора АВЬ-4 фирмы "Radiometr", (Дания), что соответствовало парциальному давлению кислорода 30 торр и ссс-тносимо со средними значениями парциального давления втого '"аза внутри клетки [К.Иванов, Ю.Кисляков, 1979; Е.Когаленко и соавт., 1975].

В нормоксических условиях по сравнению с "гипероксией" на 70% возрастает скорость фосфэрилирующвго дыхания МХ при окислении сукцгаата с соответствующим сокращением на 40% времени фосфорили-роьания АДФ и увеличением на 101 % диапазона дыхательной активности органелл при неизменной величине коэффициента сопряженности окислительного фосфорилирования. Внесение в среду инкубации сов-

местно с сукцинатом активаторов СДГ а-глицерофосфота и (3-гид-роксибутирата либо глутамата усиливало различие в состоянии Ж в гштер- и нормоксических условиях инкубации.

Установлено, что снижение эффективности.активаторов СДГ при "гипероксии" связано с повышенным образованием ингибитора фермента - ОАА на фоне недостаточно эффективной утилизации последнего в реакциях перзаминирования. Применение донаторов БН-групп цистеина и меркаптоэтанола показало, что ингиСирсвыша дыхания МХ и угнетение рсак-;й шреаминирования в лшзрс&шчвских условиях связано с непосредственным окислением тиоловых групп митохонд;лальных ферментов кислородом.

Переход к "нормоксическим" условиям характеризуется ¡шгибиро-ванием. МБ-зависимого дыхания МХ, очевидно, вследствие аллостери-' ческого ингибирования ИМ)-зависимых дегидрогеназ КАШ, концентрация которого в органеллах возрастает при снижении парциального давления кислорода.

Таким образом, предложенные нами нормоксические условия выделения и исследования митохондрий позволяют сохранить подавляемую гипероксией сукцинат-зависимую и трансаминазную фрак/щи дыхания органелл, ограничивают гиперактивность ИЛБ-зависимого дыхания, что в целом предупреждает развитие метаболического дисбаланса в системе митохондриального окисления и приближает реакции органелл к таковым "1п а11и".

Разработанный нами "нормоксический" подход в исследовании МХ защищен авторским свидетельством N1745258.

3.13. Разработка комплексного количествгч'юго критерия

оценки функционального состояния митохондрии

Необходимость сравнения действия различных факторов на функциональное состояние МХ, оцениваемое на основа анализа большого числа полярографических параметров, поставила перед нами задачу разработки метода интегральной количественной оценки изучаемого объекта.

На основе использования математического аппарата теории нечетких множеств [Л.Заде, 1974; К.Танака,. 1986) и приемов матема- • тической статистики нами разработан комплексный количественный критерий, получивший название показатель интактности функционального состояния МХ (ИФ). Расчет критерия, позволяющего комплексно.'

оценивать функциональное состояние МХ в числовой . шкале 10; 13, производили по следующей формуле: п

Иф " I

1=1

где п - число измеряемых параметров, а^ - весовой коэффициент 1-го параметра, расчитываемый по формуле:

а1 =

п '

1=1

где Ъ^ - балл от 1 до 10, присваеваемый каждому 1-му параметру, в зависимости от его важности, группой экспертов в процессе диалоговой работы с компьютером.

Из формулы ясно, что: п

I а1 = 1 1=1

ц^(Х^) - степень принадлежности значения X 1-го параметра терму "интактные МХ":

1

1+[ —— 1 231 (мор1 - - Х^ ^Клев^

= 1, при Мср^ - 51 ^ Мср1 + 1 Б1

1 1 251 - МсР1 -

, при Х1 < Мср1 -

, при Х^ > Мср.^ +

где Клев., Кпр. -показатели степени, задаваемые группой экспертов в режиме ¿налога с компьютером; Мср^, - среднее арифметическое и исправленное среднее квадратическое отклонение 1-го параметра.

Предложенный метод позволяет обнаружить изменения функционального состояния МХ на-уровне компенсаторных реакций организма,

но выявляемые с помощью традиционного способа статистической обработки результатов; получить комплексную количественную характеристику функционального состояния МХ, характеризующую степень сохранности и поврежденное™ исследуемых оргэнелл, что, в свои очередь, делает возможным однозначные' выводы о степени воздействия различных факторов на изучаемый объект и сравнение силы этих воздействий между собой, выявление статистически достоверных изменений на уровне компенсаторных реакций, на выявляемых при оСичиоЛ обработке результатов с помощью приемов математической, статистики.

Разработанный метод защищен авторским свидетельством N1668945 и реализован нами в виде программы для персонального компьютера.

32. Система окисления сукцината митохонории мозга крыс при иммобилизационном стрессе и ввеоении апаптогена п-тирозспа

МХ принимают активное участие в энергообеспечении адаптивной реакции клеток, однако, роль системы окисления' сукцината в эюм процессе не достаточно ясна, практически не исследовано влияние на сукцинат-зависимую энергопродукцию адаптогенов' [М.Кондрашовэ, Е.Григоренко, 1931, 1985; Ф.Меерсон, М.Пшенникова, 1988; Л.Панин, 1983; В.51ез^о, 1978].

Полученные наш даннъ,;- указывают на активное участие сист мы . окисления ЯК в реализации на уровне МХ адаптивного процесса з ткани мозга при иммобйлизацконном стрессе. Изменения функционального состояния выделеышх органелл отражают три этапа стресс-реакции организма. В стадию тревоги МХ реагируют гиперактивным окислением ЯК. В стадию резистентности развивающееся компенсаторное Т-СДГ _ сдеркиваот гиперактивное окисление ЯК, в органеллах сохраняется высокий уровень энергетической регуляции метаболизма, реакции быстрого кластера ЦТК, обеспечивающие сукцинат-зависимую ягтергопродукцию доминируют над окислением ЯАБ-зависимых субстратов.

В стадию истощения нарастают явления низкоэнергетическсго сдвига, контроль скорости дыхания МХ в большей степени определяется не энергетической .регуляцией, а уровнем углубляющегося Т-СДГ; угнетение реакций быстрого кластера ЦТК способствует'сни- • жению продукции в ходе субстратного фосфоршшрования важнейшего регулятора энергетического метаболизма - ГТФ, что сказывается в

дальнейшей дезорганизации метаболи,теских процессов, накоплении в цитозоле лактата. Ограничение потока электронов в дыхательную цепь вследствие выраженного Т-СДР формирует диспропорцию между ■ интенсивностью АТФ-синтетазных и АТФ-гидролазных реакций, результатом является повышенный выход ионов Н* во внемитохондриальное пространство/ снижение рН цитозоля.

Учитывая выявленную нами зависимость способности МХ мозга аккумулировать ионы Са от окисления сукцината, но не НАБ-зависи-мых субстратов [В.Хазанов, 1984], а также показанное при глубоком стрессе на МХ других органов снижение кальций-транспортирующей функции МХ [А.Бабский, 1985], можно предполагать в период углубления Т-СДГ нарушение кальциевого гомеостаза и в клетках мозга. Отражением этого феномена является показанная нами активация ПОЛ и разобщение окислительного фосфорилирования в стадию истощения иммобилизационного стресса. Очевидно, прогрессирующее Т-СДГ является одним из ключевых звеньев всего кзскада патологических реакций повреждения нейронов при стрессе в период декомпенсации.

Как показали наши исследования, предупреждение адаптогенным препаратом п-тирозолом развития стадии истощени" при стресс-реакции организма проявляется на уровне МХ ограничением гиперактивного окисления сукцината в стадию тревоги, пролонгацией периода резистентного состояния системы окисления ЯК и предупреждением развития явлений глубокого низкоэнергетического сдвига при нарастающей ._агрузке на сукцинат-завиоимую систему энергопродукции. По-видимому, защитный антистрессорный эффект препарата обусловлен описанными ранее синаптотропным, антиоксидантным действием и показанной нами способностью ограничивать гиперактивность СДГ.

33. Система окисления янтарной кислоты мозга крыс при экспе

римента льныу суоорогах и действии антиконйульсантов

Экспериментальные судороги позволяют исследовать формирование неспецифической адаптивной ' реакции системы энергопродукции в условиях нарастающей экстремальной нагрузки и сохранении поступления к клеткам мозга субстратов окисления и кислорода. Имеющиеся в литературе данные не позволяют однозначно объяснить, каким образом поддерживается достаточный уровень энергопродукции во время эпилептической а! .'■ивности мозга и каков патогенез развития глубокого низкоэнергетического сдвига, лежащего в основе повреждения

нейронов при эпилепсии [К.Погодаев, 1964, 1986; B.SlesJo, 19781. Механизм противосудорожного действия антиконвульсантов с позиции их влияния на систему окисления ЯК не изучен.

.По нашим данным, низкоэнергетический сдвиг, развивающийся в МХ мозга во время судорожного припадка, компенсируется преимущественно за счет окисления'ЯК; во всех случаях нами отмечены характерные признаки предшествующей гипврактивноста реякцлй быстрого кластера ЦТК без признаков усиления окисления NAD-зависимых субстратов.

Углубленный анализ функционального состояния МХ летом и зимой, выделение двух типов реакции МХ в зимнее время, применение активаторов СДГ и низких концентраций ЯК позволили получить данные, однозначно указывающие на развитие в период активации СДГ при судорогах компенсаторного торможения фермента. Степень торможения прямо пропорциональна предшествующей гиперактивности и носит вначале защитный, охранительный характер.

Защитная функция Т-СДГ превращается в патологическую при нарастании явлений низкоэнергетического сдвига (повторные судороги). В стадию резистентности состояния системы митохондриального окисления (после однократного судорожного припадка) Т-СДГ выявляется на фоне доминирующей энергетической регуляции процесса окислительного фосфорилирования. В стадию истощения, по аналогии с состоянием развивающимся в терминальную стадию иммобилизацион-ного стресса у неустойчивой группы животных, контроль дыхательной активности органелл осуществляется на уровне заингибироваиных де-гидрогеназ с развитием каскада патологических реакций вплоть до структурных, повреждений ..айронов вследствие активации ПОЛ. Это подтверждается отмеченым нарастанием лактацидоза, разобщением окислительного фосфорилирования, увеличением содержания в мозге продуктов ПОЛ.

Отдельного внимания, в свете полученных результатов, заслуживает взаимосвязь при судорогах реакций гликолиза и митохондриального окисления. Очевидно, в период экстремальной нагрузки ка систему энергопродукции' в поддержание ну ла макроэргов вносят вклад оба эти механизма продукции АТФ. Судя по нашим данным, при сохранении энергетической регуляции метаболизма продукты гликолиза полностью утилизируются МХ. При этом, по-видимому, реализуется, описанное Б.Чансом [В.Chance, G.Hollinger, 19611, кинети-

ческое преимущество окисления ЯК и ■ имеет место, показанный М.Н.Кондрааговой [1989, 19913, феномен монополизации окислением сукцината энергопргадукции МХ.

Анализ полученных результатов с учетом современных данных литературы о доминирующем включении продуктов гликолиза в метаболизм Ж через реакции карбоксилирования при сопутствующей интенсификации процессов переаминирования [М.Кондрашова, 1989, 1991; Н.Яиззе1, H.Taegtmeyer, 1991; H.Taegtmeyeг, 1978] дает основания предполагать, что выявленная нами активация СДГ при судорогах поддерживается наработкой ЯК в реакциях быстрого кластера ЦТК.

Из полученных нами результатов следует, что состояние всех систем поддержания энергетического гомеостаза мозга теснейшим образом связано с состоянием системы окисления сукцината. Ингибиро-вание СДГ должно,драматически влиять на состояние всех путей утилизации субстратов и может инициировать каскад патологических реакций, характерных для стадии истощения процесса адаптации системы энергопродукции головного мозга к экстремальным энергозапросам при судорогах. Показано, что в развитии Т-СДГ важнейшую роль играет истощение пула глутамата, поскольку его уровень поддерживает аспартатаминотрансферазную реакцию - важнейший путь утилизации в МХ ингибитора СДГ оксалоацетата. Факты, указывающие на существенную роль угнетения при судорогах других путей метаболизма 0АА (цитратсинтазной реакции, реакций обращения ЦТК) отсутствуют.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о ключевой, роли системы окисления ЯК в поддержании энергетического гомеостаза мозга при судорогах, в формировании всех стадий адаптивной реакции системы энергоснабжения органа. ;

Антиконвульсанты фенобарбитал и бензонал в противосудорожных дозах изменяют состояние сукцинат-зависимой системы энергопродукции, не влияя на сопряженность процесса окислительного фосфорили-рования. Фенобарбитал активируем окисление ЯК вызывая компенсаторное нарастание Т-СДГ, а бензонал йнгибирует скорость окисления МХ сукцината, однакоД замаскированная Т-СДГ активность фермента „ при этом возрастает. Показано,, что изменение состояния системы окисления ЯК под действием исследованных антиконвульсантов связано с прямым ротенон-подобным действием фенобарбитала и мало-нат-подобшм бензонала на МХ мозга. Интегральный эффект' каждого

из-препаратов па_систему-энёргопродунции головного мозга обусловлен изменением состояния быстрого кластера ЦТК.

Поддержание антиконвульсантами в определённых рамках активности сукцинат-зависимого пути окисления субстратов в • Ж способствует формированию резистентности системы энергопродукции головного мозга в условиях экстремальной нагрузки, в частности, при генерализованном судорожном припадке. Препараты разными путями, но вместе с тем однонаправленно, изменяют состояние СДГ в ткани мозга. ©ецобарбитял за счет рстенон-подобного действия зк-тивкруст фермент, приводя к компенсаторному нарастанию Т-СДГ за счет активации естественных регуляторных механизмов, а бензонал, первично ограничивая активность фермента, затем вызывает нарастание сдерживаемой Т-СДГ активности последнего. М.Н. Кондрашова называет такое состояние СДГ. перенапряженным СМ.Кондрашова и соавт., 1987]. Оно отличается высокой задемпфированностью системы, как в ответ на активирующее, так и тормозное воздействие.

Известно, что чем в более спокойном состоянии находится система знергопродукции до нагрузки, тем более высокими показателями она характеризуется в процессе активированной энергопродукции [М.Кондрашова и соавт., 19871. Антиконвульсанты, несмотря на разные точки приложения действия, отклоняют сукцинат-зависимую систему эноргопродукции от состояния равновесия покоя, тем самым резко ограничивая гиперактивность при введении конвульсантэ.

Описанное модулирующее влияние фенобарбитала и бензонала на функциональное состояние системы сукцинат-зависимой энергопродукции головного мозга отражает лишь одну из сторон многогранного механизма противосудорожного действия барбитуратлв. Вместе с тем, вскрытые закономерности дают основание для целенаправленного поиска ■ препаратов, регулирующих состояние наиболее быстрого звена энергопродукции* мозга. В первую очередь это важно для ограничения при необходимости гиперактивности системы, пролонгации состояния резистентности, предупреждения развития состояния истощения и целенаправленного восстановления активности СДГ при состояниях глубокого ингибирования фермента. Последнее является важнейшим условием сохранения жизни больных, находящихся в состоянии дательного эпилептическ го статуса или последующей комы.

3.4. Система окисления сукиин та головного мозга крыс при

церебральной ишемии и (действии антигипоксантов

Ишемия мозга является ведущей компонентой в патогенезе цереб-роваскулярных расстройств, в том числе описанных выше стресс-реакций и судорожных состояний СМ.Биленко, 1989; В.31ез^о, 1978]. Специфика метаболизма головного мозга дает основание предполагать, что именно быстрый кластер ЦТК ответственен за характер течения адаптивных процессов в системе гликолиз - митохондриальное окисление в процессе ишемии органа, однако этот вопрос до настоящего времени не исследован [М.Кондратовч, 1989; В.31ез;)о, 1978].

Ведущей компонентой ишемического поврездения тканей является гипоксия, вместе с ■ тем, практически не изучено влияние антиги-поксантов на быотрый.путь окисления субстратов в МХ [М.Кондрашо-ва, 1989; Л.Лукьянова, 1989].

Результаты проведенного исследования МХ мозга при ишемии позволяют выделить 3 этапа реакции систрчы энергопродукции органа: первый этап (15 - 40-минутная ишемия) - доминирующая активация сукцинат-зависимого дыхания, второй этап (2 часа ишемии) - стабилизация за счет компенсаторного Т-СДГ на повышенном уровне хорошо, энергетически отрегулированного окисления сукцината при начальном угнетении КАБ-зависимого дыхания МХ и третий (после 3,5 часов ишемии) - срыв энергетической регуляции энергопродукций органелл, патологически выраженное угнетение сукцинат- и МБ-зависимого дыхания.

У 56% крыс к 3,5 ч ишемии начинались'генерализованные судорожные припадки, заканчивающиеся гибелью животного ("неустойчивые" к ишемии крысы), остальные выживали ("устойчивые"). В группе "устойчивых" животных явления низкоэнергетического сдвига в МХ моз^а, 'определяющие изменения в сукцинат-зависимой системе энер-гопртдукции развиваются медленнее и к 3,5 ч ишемии отмечено сохранение эффактаыного энергетического контроля метаболических реакций органелл. Состояние метаболической дезадаптации в труппе "неустойчивых" крыс развивается за счет угнетения реакций быстрого кластера ЦТК и, в пергую очередь, процесса переаминирования ОАА второго метаболического комнартмента МХ, развитии глубокого Т-СДГ.

Судя по полученным данным, в механизме активации быстрого пути окисления субстратов в МХ мозга при ишемии играет роль как ак-

тивация сукцинат-тиокиназной реакции вследствие снижения уровня П'Ф, так и активация СДГ гипоксическим повышением восстаковлен-ности переносчиков дыхательной цепи, что создает условия монополизации сукщшатом энергопродукции органолл.

Полученные результат согласуются с выводом Л,Д.Лукьяновой [!989] относительно первичного нарушения электронтранспортной функция дыхательной цепи при дефиците кислорода на МВ-зависда^м участке .дыхательной цепи.

Г5ямог;1шв "нормсчссичо ского* подхода исследования МХ позволило установить, что эндогенная ЯК, продуцируемая в ходе работы быстрого кластера ЦТК при участии реакций переаминирования и играющая важную роль в осуществлении адаптивной перестройки энергетического метаболизма МХ, интенсивно нарабатывается у животных, устойчивых к циркуляторной гипоксии, и минимально продуцируется в группе "неустойчивых" крыс. Гиперокскческив условия эксперимента практически полностью маскируют ети различии.

Результаты нашей работ;; показывают, что каскад шемическсго поврпадония клеток мозга связан, в первую очередь, с несостоятельностью реакций быстрого кластере» ЦТК. Утеря кальиий-нккумулиру щей способности МХ мозга, развитие тканевого лактвципоза, г.к~ тивоция ШЛ при церебральной ишомии непосредственно связана с ги^ированиом СДГ. Причем, гипокоическая компонента ишемии, очевидно, играет роль и в активация СДГ, формируя состояние ре- • зистонтности системы энергопродукции мозга, и в переходе к декомпенсации за счет накопления ингибиторов СДГ - ОАА, недоокислешп.ч продуктов метаболизма катохоламинов, серотошша. Последние не!1ро-медиаторы активно высвобох^аются из депо при ишемии Ш.Самойлов, 1985; Р.Киёкег!, С.Тг1тагс1Ц, 1989). Наряду с шгибированием СДГ, как и при судорогах, при ишемии постепенно истощаются запасы доступного для реакций переаминирования в МХ мозга глутяматп, что ограничивает поступление в срганелиы карбоксилировашш* продуктов гликолиза, уменьшает продукцию эндогенной ЯН в реакциях быстрого пути окисления субстратов.

Проведенное исследование выявило общие закономерности-формирования адаптивной.реакции на.уровне МХ, ключевую роль в регуля- ' ции метаболизма субстратов в органеллах наиболее быстрого из ферментов ЦТК - СДГ, наличие в МХ мозга двух маршрутов окисления субстратов - быстрого и медленного, преобладание первого маршрута

при увеличении энергозатрат органа либо развитии гипоксии. Вскрыта закономерность реакции быстрого кластера ЦТК на нарастающую нагрузку на систему энергопродукции мозга, показаны механизмы развития торможения быстрого пути окисления субстратов.

Изложенные данные хорошо согласуются с представлениями о преобладании наиболее быстрых путей метаболизма в регуляции направленности потока субстрата СО.Э.Шноль, 19793 и указывают новое направление в разработка патогенетически обоснованной фармакокор-рекции дезадаптации системы эноргопродукции головного мозга.

Все исследованные нами антигипоксанты проявили действие на связанные с сукцшат-аавистоЛ энергопродукцией-реакции быстрого кластера ЦТК.

Бемитил на начальных этапах циркуляторной ишемии способствует развитию адаптивных реакций МХ. На более поздних этапах патологии препарат препятствует наступлению декомпенсации, система сукци-кат-зовисимой йнергопродукции, монополизировав энергообеспечение органелл, продолжает поддерживать МХ в состоянии сохраненной энергетической регуляции.

Этомерзол на 1 этапе реакции системы энергопродукции МХ мозга на ишемию не проявляет выраженного действия, .однако, уже на 2 этапе способствует проявлению доминирования системы окисления сукцината в энергообеспечении органа. На фоне этомерзола к 3,5 ч циркуляторной ишемии в МХ мозга наблюдается эффективный энергетический контроль метаболических процессов, сохранение высокой активности сукцинат-зависимого дыхания, сдерживаемого нарастающим Т-СДГ, и соответствующая норме активность МАИ-зависимых процессов. .

На-оксибутират на начальных этапах ишемии не влияет на развитие низкоэнергетического сдвига и сопутствующее ему нарастание изменений е системе сукцинат-зависимой энергопродукции головного мозга. К 3,5 ч патологии под действием препарата все показатели дыхательной активности МХ при. оуислении ЯК находятся на уровне таковых в группе ложнооперирозашшх крыс. Анализ показателей дыхательной активности МХ показывает, что Ка-оксибутират способствует образованию.в -реакциях ГАМК-шунта эндогенной ЯК, поддерживая тем самым активное функционирование быстрого пути окисления субстратов в органеллах.

Эмоксипин, по нашим данным,. способствует активации при ишемии

трансаминазного звена быстрого кластера окисления субстратов в КОС мозга. Очевидно, препарат поддерживает образование ЭЯК в реакциях быстрого кластера ЦТК, обеспечивая полноценную взаимосвязь цито-золя и МХ, усиливая приток субстрата в органеллы в виде карбокси-лированных продуктов гликолиза. Вероятно, являясь структурным аналогом витамина В&, эмоксипин поддерживает полноценное функционирование трансаминаз необходимо для аффективного включения ОЛА первого, метаболического кошартмента МХ п ццкл'Крабса на уровне квтоглутарата,„способствует наработке в реакции субстратного, фосфорилирования важнейшего метаболического регулятора энергетического обмена - ГТФ и дальнейшего его поступления в цитозоль в виде ФЕП, обеспечивая при этом полноценное удаление ингибитора СДГ - ОАА второго метаболического компартмента.

На основе полученных нами данных можно предположить, что ан-. тиацидотическое действие препарата при ишемии связано, в первую очередь, о нормализацией функционирования быстрого кластера ДТК и устранении тем самым ведущей компоненты метаболического ацидоза -этставаюи скорости А'ГФ-синтетазы от величины АТФ-азной нагрузки.

Следовательно, поддержание исследованными антипшоксантами активности реакций быстрого кластера ЦТК при церебральной ишемии юрмализует энергетический метаболизм мозга, препятствует развитию ишемического каскада повреждения. При этом видно, что п_д-рэржка активности быстрого кластера ЦТК возможна разшми путями. !еркаптобензимидазолы . бемитил и этомерзол ограничивают развитие '-СДГ, эмоксипин поддерживает реакции переаминирования, обеспечи-1ая, очевидно, продукцию эндогенного глутамата и активноо переа-инировяние ОАА первого метаболического компартмента МХ с образо- . ёнием 2-оксоглутарата, а затем ЯК. На-оксибутират уменьшает -СДГ за счет дополнительного образования ЭЯК в реакциях АМК-шунта. "

Таким образом, проведенное исследование выявило общие законо-эрности формирования адаптивной реакции на уровне МХ, ключевую эль в регуляции метаболизма субстратов в органеллах наиболее острого из ферментов ЦТК - СДГ, наличие в МХ мозга двух маршру-эв окисления, субстратов - быстрого и медленного, преобладание" зрвого маршрут* при увеличении энергозатрат органа либо развитии шоксии. Вскрыта^закономерность реакции быстрого кластера ЦТК на фэстающую нагрузку на систему энергопродукции мозга, показаны

механизмы развития тормозенил быстрого пути окисления субстратов. Продемонстрирована возможность фармакологического воздействия на быстрый путь окисления субстратов в МХ с целью поддержания энергетического гомеостаза головного мозга при экстремальных энергозапросах.

Получешке в работе результаты объединенны в предлагаемой таблице.

Таблица 1

Действие лекарственных птэепаратоЕ на развитие адаптивной реакции в системе энергопродукции головного мозга

Фа--? адаптивной реакции. Основные звенья метаболического сдвига в системе енергопродукции головного мозга Действие препаратов

1 2 3 4 5 б 7

Т Р . Е ' В 0 Г А Гиперкомпенскрованный низкоэнергетический сдвиг. Активация быстрого пути окисления субстратов в митохондриях. Эффективный энергетический контроль метаболизма митохондрий. + + + + + - +

Р . Е 3 И с X Е Н. Т Н 0 с т ь. Компенсированный низкоэнергетический сдвиг. Доминирующая активация сукцинат-зависимой энергопродукциисдерживаемая нарастающим торможением сукцинатдегидрогеназы, угнетение МБ-зависимого дыхания митохондрий. Сохранение энергетического контроля метаболизма" митохондрий. + + + + + + +

и с т 0 щ Е н и Е Декомпенсировзнный низкоэнерге-. тическид сдвиг. Ингибирование быстрого пути окисления субстратов в митохондриях вследствие угнетения сукцинатдегидрогеназы : торможение МО-зависимого дыхания митохондрий. Срыв энергетической регуляций метаболизма митохондрий, инициация каскада патологических реакций в органеллах. + + - + + - +

Примечание:

1 - п-тирозол, 2 - фенобарбитал, 3 - бензонал, 4 - бомитил, 5 - этомерзол, б - Иа-оксибутират, 7 - эмоксшпш.

Знаками (+) и (-) помечено наличие и, соответственно, отсутствие действия препарата на данном этапе адаптивной реакции.

, ВЫВОДЫ

1. В результате исследования участия реакций быстрого пути окисления субстратов в процессе, адаптации энергетического метаболизма' головного мозга крыс при иммобилг.зацнонном стрессе, судорогах и церебральной ишемии в развитии указанных' форм патологии выделено 3 стадии состояния митохондрий, которые соответствуют стадиям тревоги, резистентности и истощения общего адаптационного синдрома. Начальная стадия характеризуется активацией сукци-нат-зависимого дыхания; вторая - проявляется высоким уровнем окисления сукцината, сдерживаемого нарастающим торможышем сукци-натдегадрогеназы при снижении скорости окислешш КАЕ-зшзисимых субстратов и сохранении еысокого уровня энергетической регуляции процесса окислительного фосфорилирования; третья стадия характеризуется нарастанием торможения -.лодинатдегидрогеназы на фоне низкого уровня окисления ГШ)-зависимцх субстратов, уменьшением энергетического контроля уровня дыхания митохондрий, разобщением окислительного фосфорилирования.

2. Реализация общего адаптационного синдрома на уровне митохондрий отражает возрастающую нагрузку на энергетический обмен головного мозга и проявляется доминиротзтшом системы "окисл&шш янтарной кислоты в поддержании энергетического гомеостаза органа и развитием глубоких па.^логических изменений при истощении ее компенсаторных возможностей. Активность системы окисления эндогенной янтарной .кислоты при патологии поддерживается состоянием реакций переаминирования глутаматп.

3. Независимо от типа исследованной патологии, увеличение нагрузки на систему энергопродукции головного мозга сопровождается разделением животных на устойчивую и неустойчивую грузны; различие мовду грушами проявлялось в период развития третьей стадии адаптивной реакции - в неустойчивой группе развивалось глубокое ингибирование системы окисления янтарной кислоты, а в группе устойчивых признаки ингибирования отсутствовали.

4. Окислению янтарной кислоты пр!щадлежит исключительная роль в поддержании способности митохондрий аккумулировать ионы кальция. На начальных этапах адаптивной реакции митохондрий в период активации' сукцинат^зависимого окисления происходит возрастание скорости накопления кальция и кальциевой емкости органелл, а в период ингибирования окисления янтарной кислоты - снижение 'величины этих показателей. Одновременно торможение сукцинатдегидроге-назы сопровождается снижением тканевого рН и формированием условий, способствующих активации перекисного окисления липидов.

5. В плане влияния на биоэнергетику мозга общим свойством исследованных препаратов является действие на быстрый путь окисления субстратов в митохондриях, пролонгирование этапа резистентности и предотвращение развития этапа истощения адаптивной реакции органелл на нарастающие энергозапросы при иммобилизацион-ном стрессе, судорожных припадках и церебральной ишемии. В частности:

а) адаптоген п-тирозол ограничивает гиперактивное окисление сукцината и препятствует глубокому торможению сукцинатдегидроге-назы;

б) антиконвульсанты фенобарбитал и бензонал влияют на сукци-' натдогидрогеназу за счет ротенон-подобного действия первого и ма-лонат-подобного действия второго препаратов;

в) антигипоксанты бемитил, этомерзол и эмоксипин усиливают, а натрия оксибутират не влияет на адаптивную активацию сукцинат-за-висимого дыхания митохондрий в стадию тревоги и резистентности реакции энергетического метаболизма головного мозга, все препараты предотвращают глубокое ингибирование сукцинатдегидрогеназы в стадию истощения; действие бемитила и этомарзола связано с непрямым влиянием на активность фермента, натрия оксибутират включается в метаболизм ГАЖ-шунта, обеспечивая продукцию эндогенной янтарной кислоты, а эмоксипин поддерживает активность реакций пе-реаминирования.

Стабилизация исследованными препаратами в состоянии резистентности системы сукцинат-зависимой энергопродукции головного - мозга при патологии обеспечивает сохранение энергетического гоме-остаза органа, поддержание кальциевого баланса, уровня рН, предупреждает развитие перекисного окисления липидов.

б. Системе окисления янтарной кислоты в ткани головного мозга принадлежит ключевая роль в'обеспечении энергопродукции органа, поддержании метаболической взаимосвязи митохондрий и цитозоля нейронов: Подтверждено наличие в головном мозге быстрого пути образования и окисления янтарной кислоты, исключающего участие мед-, ленных реакций цикла Кребса. Показана доминирующая активация этого пути метаболизма субстратов при адаптации органа к нагрузкам. Продемонстрирована возможность фармакологической модуляции состояния пути быстрого окисления субстратов в митохондриях с формиро-. ' ванием активной резистентности системы энергопродукции к нарастающей нагрузке.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Энергетический метаболизм головного мозга крыс под влиянием противосудорожной терапии // Актуальные вопросы психиатрии. -Томск, 1983. - вып.1. - С.213-214 (совместни с Т.В. Шушпановой).

2. К механизму митохондриальной регуляции эпилептической активности мозга // Молодые ученые и специалисты народному хозяйству. -Томск, 1983. - С.120-121.

3. Влияние фенобарбитала, бензонала и галодифа на митохондрии мозга крыс "ин витро" // Вопросы теоретической и клинической медицины. - ТОМСК, 1984. - ып.Ю. - С.138-141.

4. Влияние коразолового судорожного припадка на транспорт Ca митохондриями мозга крыс // Вопросы теоретической и клинической медицины. - Томск, 19Ь4. - вып.10. - С.141-143.

5. Влияние препарата родиолы на окисление сукцината митохондриями мозга крыс в весеннеосенний период // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. - Томск, • 1984. - Т.1. - С.187-189 (совместно с Т.А. Зиминой).

6. Stoichiometric control by CoA-thloeoters and Inhibition by malate of the trlcarboxilate cycle // Studla Biophyalca (Berlin). - 1984.- V.102.- N.3. - P.193-213 (with. V.V.Dynnlk, iu.V.Klm, E.I.MaevBky).

7. Влияние фенобарбитала и бензонала на окисление сукцината,и кетоглутарата митохондриями мозга крыс // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 1985.-N12.- С.692-694 (совместно с А.С.Саратико-вым).

8. Succinate oxidation 1л .rat brain mitochondria under ex-

perlmental epileptic seizures // International symposium on achievements.- and perspectives oi mitochondrial research: Abstracts.-Bari (Italy), 1985 (with A.S.Saraticov).

9. ADP-independent ozldatlon of succinate and NADH provides enûothennness // International symposium on achievements and perspectives oi mitochondrial research: Abstractd.-Bari (Italy), 1985 (with R.Achmerov, I.Saakjan, M.Kondrashova, G.Mironova, N.Fedotcheva, E.Grigorenko).

. .10. Окисление сукцината митохондриями мозга крыс при экспериментальном судорожном припадке // Бюлл. эксперим. биологии и ме-. дицины.- 1986. N1. - С.35-38 (совместно с Т.А.Зиминой, А.С.Сара-

тикойым).

11. Анализ вклада окисления сукцината в скорость дыхания и восстановленность пиридиннуклеотидов митохондрий мозга крыс // Молодые ученые и специалисты ускорению НТП.~ Томск, 1986.- С.52 (совместно с Г.Г.Вон).

12. Вклад ■ингибирования сукцинат-зависимой энергопродукции ткани мозга в противосудорожное действие бензонала // Молодые ученые и специалисты ускорению НТП.- Томск, 1986.- С.53 (совместно с Н.Б.Олейник).

13. Коррекция нарушений энергетического обмена мозга некоторыми модуляторами активности сукцинатдегидрогеназы // Молодые ученые и специалисты ускорению НТП.- Томск, 1986.- С.81' (совместно с Г.Г.Вон).

14. Сохранение нативности митохондрий мозга при выделении и работе с ними // Молодые ученые и специалисты ускорению НТП.-Томск, 1986.- 0.86 (совместно с Т.А.Зиминой).' •

15. Вклад окисления сукцината в уровень дыхания и восстановленность придиннуклеотидов митохондрий мозга.крыс // Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического метаболизма": Тей. докл.- Пущино, 1986.-С.20 (совместно с Г.Г.Вон).

16. Влияние введения животным адаптогена на состояние системы окисления сукцината в,митохондриях мозга кры. при иммобилизацион-ном стрессе Всесоюрчый симпозиум "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического метаболизма": • Тез. докл.- .Пущино, 1986.-С.145 (совместно с Т.А.Зиминой, Г.Г.Вон, Е.Н.Селютиной).

17. Гомеостаь>фование физиологических функций на уровне митохондрий // Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза.- Красно-

—------------------------------------ з: -

ярок, 1987.- 0.40 - 65 (совместно с М.Н.Кондрзшовой, Е.В.Григо-ранко, A.M.Бабским). •

18. Защитное действие бемитила при гипоксии мозга // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных ¡rpeiTDps.-тов. - Томск, 1987. - Т.З. - С.14-16 (совместно о Ю.Г.Бобковым, М.А.Ивановой, А.С.Саратиковым, М.Б.Плотниковым, Т.М.Плотниковой, 0.П.Паникой, Е.А.Кобзевой).

19. Влияние п-тирозолз на дыхательную функцию митохондрий мозга крыс в разные фазы иммобилизациокйого стресса // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. -Томск, 1937. - Т.З. - С.18-19 (совместно с Т.А.Зиминой).

20. Окисление сукцината митохондриями мозга крыс при экспериментальной ишемии // Всесоюзная конференция "Фармакологическая коррекция гипоксических ' состояний": Тез. докл.- Ижевск, 1988.-С.136 (совместно с 0.П.Паниной).

• 21. Механизмы предупр«жде1>ия бемитилом постишвмической гжо-перфузии мозга // Всесоюзная конференция "Физиология, патофизиология и фармакология мозгового кровообращения": Тез. докл.-Тбилиси, 1988. - С.145 (совместно с М.Б.Плотниковым, i.M.Плотниковой, З.В.Коробовой, 0.П.Паниной, Е.А.Кобзевой).

22. Антигилоксанты - эффективные корректоры нарушений кровоснабжения и метаболизма мозга при циркуляторной гипоксии // VI Всесоюзный съезд фармакологов: Тез. докл.- Ташкент, 1988.-С.291 (соемостно с М.Б.Плотниковым, Т.М.Плотниковой, Т.В.Якимовой, Г.А.Чернышевой, З.В.Коробовой, О.П.Паниной, Е.А.Кобзевой).

23. Влияние эмоксипина на показатели дыханий митохондрий мозга крыс // III Всесоюзная конференция' "Биоантиоксиданты": Тез. докл.-Москва, 1989.- С.155 (совместно с 0.П.Паниной, А.А.Шведовой) .

24. Способ 'количественной оценки изменения функционального состояния митохондрий // Конференция "Фундаментальные науки - медицине и здравоохранению": Тез. докл.-Иркутск, 1989.-Ч.1. -С.42-43 (совместно с О.П.Паниной).

25. Влияние актопротектора бемитила на анергозависимые реакции митохондрий мозга крыс // Конференция "Фундаментальные науки

- медицине и здравоохранению": Тез. докл.-Иркутск, 1988.-41.-• С. 116-11.7 (совместно с 0.П.Паниной).

26. Antioxidant properties of drugs (emoxlpln, bemltil,

5-ЕТОВ) contribution to their protective action under Incomplete ischemia // International conference "Regulation of free radical reactions": Abstracts.-Varna, 1989.-N72 (with O.P.Panlna, E.A.Kobzeva, A.A.Shvedova).

27. Новый подход в интегральной количественной оценке действия лекарственных препаратов на функциональное состояние биологических систем // Всесоюзная конференция "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы": Тез. докл.-Москва, 1989.-0.243 (совместно с О.П.Паниной).

28. Succlnate-dependent brain energy production under circulation Ischemia // International symposium on structure, function and biogenesis of energy transfer systems: , Abstracts. -Вагу (Italy), '1989 (with O.P.Panlna, N.B.Olelnik). '

29. Особенности энергетического метаболизма мозга при его неполной ишемии //. Бюллетень Томского научного центра АМН СССР.-Томск, 1989. - вып.1. - С.36-45 (совместно с Т.М.Плотниковой, О.П.Паниной, Е.А.Кобзевой, М.Б.Плотниковым).

30. Антигипоксические и антиокислительные свойства бемитила // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 1989. - N5. - С.583-585 (совместно с'М.Б.Плотниковым, А.С.Саратиковым, Т.М.Плотниковой, О.П.Паниной).

31. Способ измерения скорости транспорта ионов H и К митохондриями // Информационный листок ЦНТИ. - Томск, 1989. - N176-89 (совместно с О.П.Паниной). .

32. Пропорциональный регулятор температуры // Информационный листок ЦНТИ. - Томск, 1989. - N7-89 (совместно с Н.В.Паниным, О.П.Паниной, А.И.Романш).

33. Способ исследования дыхательной ' активности митохондрий мозга // Информационный листок ЦНТИ. - Томск, 1990. - N52-90 (совместно с А.С.Саратиковым, Т.А.Зиминой, Е.А.Красновым, Н.А.Ку-лижпшювой). - .

34. Механизмы церебропротел горного эффекта этомерзола при ишеш..„• мозга // Бюллетень Томского научного центрг АМН СССР. -Томск, 1990. - вып.2. - С.17-18 (совместно с М.Б.Плотниковым, Т.М.Плотниковой, З.В.Коробовой, Е.А.Кобзевой, О.П.Паниной).

35. Индивидуальные особенности лабораторных животных и психотропная активность'препаратов // Актуальные проблемы фармакологии и поиска но; jx лекарственных прпаратов.- Томск,

990. -Т "Л .-С, 210- 215 (совместно с Н.И.Сусловым).

36. Применение теории нечетких множеств для оценки функцко-ального состояния митохондрий // Актуальные проблемы фармаколога и' поиска новых лекарственных препаратов.- Томск, 990.-Т.4.-С. 191-194 (совместно с О.П.Паниной, Н.В.Паниным).

37. Фармакологическая коррекция нарушений энергетического го-зостаза головного мозга крыс,при ишемии // Актуальные проблемы армвкологии и поиска новых лекарственных срцаратов.- Томск, 353.-Т.4.-о.220-222 (совместно о О.П.Пзннкой, А.К.ПоОорским).

38. Способ интегральной количественной оценки изменения функ-юнального состояния митохондрий // Депонировано в ВИНИТИ. ->сква, 1990. - N4942-B.-13C. (совместно с О.П.Панино», Н.В.Пани-!М).

39. Brain mitochondrial reactions under circulation ischemia ' 20th Meeting oi Federation of European Biochemical Societies: istracts. - Budapest, 1990.-P.30 (with O.P^anJna, A.N.Poborsky, B.Oleinik).

40. Antilschemic drugs influence on physico-chemical operties oi rrts brain mitochondrial and plasmatic membraina in rmal conditions and experimental Ischemia // Third Congress oi e Bulgarian Pharmacological sosiety: Abstracts. - Sofia, 90.-P.348 (with Y.V.Kalashnlcova, .J.V.Shabanova).

41. Rats brain mitochondria functional condition under tabolic lactacldosls, antilschemic drugs treatment actions // lrd Congress of the Bulgarian Pharmacological sosiety: 3tracts. - Sofia, 1990.-P.351 (with A.N.Poborsky).

42. Rats brain mitochondria energy-de^-ndent calcium. msport ■ under circulation hypoxia and antilschemic drugs Jection // Third Congress of the Bulgarian Pharmacological Jiety: Abstracts-. - Sofia, 1990.-P.350 (with O.P.Panlna).

43. New integral quantity method oi mitochondrial functional iditlon alteration in drugs action mechanism research // Third igres3 of the Bulgarian Pharmacological sosiety: Abstracts. -'la; 1990.-P.349 (wi^h O.P.Panlna, N.V.Par.in).

44. Исследование функционального состояния митохондрий мозга с при циркул горной гипоксии // Всесоюзная конференция "Сизио-ия и биоэнергетика гипоксии": Тез. докл.-Пущино, 1990 (сов-тно с А.Н.Поборским, О.П.Паниной).

.45. Регуляция кислородом реакций митохондрий мозга // Всесоюзная конференция "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического'метаболизма": Тез. докл.- Пущино, 1990 (совместно с А.Н.Поборским). .

46. Функциональное состояние митохондрий мозга крыс при острой циркj ляторной гипоксии и профилактическом введении эмоксипина // II Всесоюзная конференция "Фармакологическая коррекция ги-поксических состояний": Тез. докл.-Гродно, 1991 .-С..183-184 (совместно с А.Н.Поборским).

47. Изменение вязкости митохондриальных мембран мозга крыс при острой циркуляторной гипоксии // II Всесоюзная конференция "Фармакологическая коррекция . гипоксических состояний": Тез. докл.-Гродно, 1991.-0.33-34 (совместно с Ю.В.Калашниковой).

. 48. Предупрежде-ние эмоксипином нарушения энергетического метаболизма митохондрий мозга крыс при церебральной ишемии // Всесоюзное совещание по результатам клинического и экспериментального исследования препаратов 1% и 3% эмоксипина и мексидола: Тез; докл. .- Москва, 1991 (совместно с А.Н.Поборским).

49. Исследование дыхания митохондрий мозга крыс в гипери нор-моксических условиях // Бюлл.. эксперим. биологии и медицины.-1991. - N9.- С.258-260 (совместно с А.Н.Поборским).

50. Air oxlgen reduces the rate of phosphorylating succinate oxidation In isolated mitochondria '// FEBS letters, . in publication (with.A.'N.Poborsky, M.N.Kondrashova). % -

51. Роль быстрого мастера цикла трикарбоновых кислот в поддержании энергетического гомеостаза головного мозга // Бюллетень Томского научного центра АМН СССР. - Томск, 1992. - вып.4. -С.75-82.

АВТОРСКИЕ СВИДЕТЕЛЬСТВА

'1. Способ ■ исследования дыхательной активности митохондрий // Авторское свидетельство N1377730, 1987 г. (в соавторстве с А.С.Саратиковым, Т.А.Зиминой, Е.А.Красновым 1.

2. Комплексный количественный критерий для оценки функционального состояния митахондрий // . Авторское свидетельство N1668945, 1989 г. (в соавторстве с О.П.Паниной, Н.В.Паниным).

3. Метод получения- митохондрий мозга // Авторское свидетельство N1745258, 1991 г. (в соавторстве с А.Н.Поборским).