Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функционирование митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала при различных физиологических и патологических состояниях

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Функционирование митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала при различных физиологических и патологических состояниях"

На правах рукописи

Шигаева Мария Ивановна

Функционирование митохондриалыюго АТФ-зависимого калиевого канала при различных физиологических и патологических состояниях организма

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ 2 ДЕН 2010

Пущино 2010

004615691

Работа выполнена в Пущинском государственном университете на базе Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Миронова Галина Дмитриевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Звягильская Рената Александровна

доктор биологических наук, профессор Новоселова Елена Григорьевна

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского, МГУ, г. Москва

Защита диссертации состоится «22>> 2010 г. в У1 Ъ .

на заседании совета Д002.093.01 потащите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан « ИО.^рЯ 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, А г

к.ф,-м.н. Н.ФЛанина

Актуальность проблемы. Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал (митоКдтф), осуществляющий вход калия в митохондрии, в последнее время привлекает внимание многих исследователей в связи с установлением его ключевой роли в защите миокарда от ишемии [Gross G. et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. В частности, было показано, что введение животным фармакологических активаторов митоКАТФ каналов перед продолжительной ишемией миокарда оказывает эффект, подобный ишемическому прекондиционированию, т.е. приводит к положительным экспериментальным и клиническим результатам, таким как сокращение зоны инфаркта и восстановление ритма сердца [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Tsai et al., 2002; Krylova et al, 2006]. Однако, механизм такой кардиопротекции до сих пор не вполне понятен и требует изучения.

В нашей лаборатории недавно был обнаружен метаболический активатор митоКатф - уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2005]. На модели острого инфаркта миокарда у крыс были показаны антиишемический и антиаритмический эффекты его метаболических предшественников - уридина и УМФ [Krylova et al., 2006]. Известно, что уридин, в отличие от самого УДФ, проникает в клетку [Matsushita et at., 1970]. Кроме того, в нашей же лаборатории было обнаружено, что при стимуляции работы митоКАТФ активируется и система выхода калия из митохондрий в обмен на протон [Mironova et al., 2010]. Было предположено, что результатом активации рециклизации калия в митохондриях может быть снижение интенсивности окислительного стресса и, как следствие, восстановление энергетического баланса в ишемизированном миокарде.

По данным ряда исследователей [Ferranti R. et al, 2003], митоКАт«> может регулировать продукцию активных форм кислорода, генерация которых существенно возрастает как при ишемии, так и в процессе старения организма. Поскольку при старении увеличивается риск возникновения ишемических повреждений тканей, можно предположить наличие возрастных изменений в функционировании митоКАТФ канала.

Ранее было показано, что усиление процесса транспорта катионов, и в частности калия, в митохондриях имеет важнейшее значение для поддержания теплообразования в некоторых тканях гибернирующих животных, обеспечивая интенсивный несократительный термогенез при пробуждении в условиях неактивной митохондриальной АТФ-синтетазы при низких температурах тела (2-25°С) [Миронова и др., 1986]. Изучение особенностей АТФ-зависимого транспорта К+ у гибернирующих животных, находящихся в различных физиологических состояниях, начатое ранее в нашей лаборатории [Fedotcheva et al., 1985], позволит лучше понять механизмы несократительного термогенеза при разогреве зимоспящих животных от критически низких температур до температуры тела.

Цель работы: изучить механизм кардиопротекторного действия активаторов митоКатф при ишемии, а также функциональную роль канала при ряде патологических и физиологических состояний организма, в частности при старении и в терморегуляции организма.

В соответствии с целью работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Изучить влияние активаторов митоКдтф канала на энергетический обмен миокарда и систему антиоксидантной защиты в условиях нормоксии и острой ишемии;

2) На модели «ишемия-реперфузия» миокарда исследовать влияние активатора митоКатф на снижение зоны инфаркта миокарда, подобрав при этом оптимальную схему его введения;

3) В экспериментах in vitro и in vivo показать адаптогенный эффект активации митоКатф в формировании долгосрочной устойчивости организма к гипоксическим условиям;

4) Выявить изменения функционирования митоКАТФ канала при старении организма;

5) На модели гибернирующих сусликов исследовать роль митоКдтф канала в механизме несократительного термогенеза.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что активация митоКАТф его природным активатором в условиях ишемии миокарда способствует сохранению энергетического и антиокислительного статуса миокарда. Предположено, что эти свойства канала могут лежать в основе механизма, опосредующего кардиопротекторный эффект активации митоКЛТФ при инфаркте миокарда. Впервые установлено антиишемическое действие метаболической активации канала на модели ишемии-реперфузии миокарда, при этом подобрана наиболее эффективная схема введения препарата. В экспериментах как in vitro, так и in vivo, впервые показан адаптогенный эффект активации митоКатф растительным антигипоксическим препаратом флавоноидного ряда. В данной работе впервые показано снижение функционирования митоКдтф канала в митохондриях печени и сердца крыс при старении организма. Также впервые показана активация цикла калия в митохондриях сердца при пробуждении гибернирующих животных.

Научно-практическое значение работы. Предложенный в работе механизм защитного влияния активации митоКдтф при ишемии и ишемии-реперфузии может быть основой для разработки средств профилактики и лечения ишемических повреждений миокарда. Предшественник метаболического активатора митоКдтф, использованный в работе - уридин-5'-монофосфат, может служить основой для создания новых эффективных антиишемических лекарственных препаратов, действие которых опосредуется активацией митоКАто-Показанный в работе адаптогенный эффект активатора канала растительного происхождения открывает перспективу их использования для формирования долгосрочной толерантности организма к гипоксическим условиям. Выявленное в работе снижение функционирования митоКдтф с возрастом также позволит более четко разработать методы профилактики и, возможно, лечения ишемических повреждений миокарда. Обнаруженные изменения в функционировании канала у гибернирующих животных, находящихся в различных физиологических состояниях, помогут лучше понять механизмы несократительного термогенеза у теплокровных животных.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация»

(Пущино, 2005, 2007 и 2009), 9-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино 2005), VIII Всемирном конгрессе International society for adaptive medicine (ISAM) (Москва, 2006), 10-й всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (С.-Петербург, 2007), ХХ-м съезде Физиологического общества им. Павлова (Москва, 2007), 5-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007), 32-м FEBS конгрессе (Австрия, 2007), международных конференциях «Biological motility: achievements and perspectives» (Пущино, 2008, 2010), конференции с международным участием «Высокогорная гипоксия и геном» (п.Терскол, Кабардино-Балкария, 2008), 5-й Всероссийской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы двадцать шесть печатных работ, из них пять — статьи в отечественных и зарубежных журналах, одна принята в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах, иллюстрирована 12 рисунками и 16 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследованиях использовались митохондрии печени и сердца крыс, выделенные общепринятым методом дифференциального центрифугирования.

Схемы процедур были подобраны в соответствии с требованиями Декларации Совета Европейского Союза 86/609/ЕЕС.

Модель острой экспериментальной ишемии миокарда. В работе использовались крысы линии Вистар весом 250-300 г. Животных наркотизировали введением этаминала натрия (50 мг/кг) внутрибрюшинно, после чего в правую яремную вену вводился полиэтиленовый катетер для инъекций растворами и лекарственными препаратами. Затем выполнялась трахеотомия и в отверстие трахеи вводилась стеклянная канюля, соединенная с аппаратом искусственного дыхания. Животным подавался комнатный воздух при скорости 60-65 вдохов в минуту. Грудную клетку вскрывали в четвертом межреберье слева. Левую коронарную артерии (ЛКА) лигировали на уровне нижнего края ушка левого предсердия, согласно стандартной методике [Selye Н., 1960]. В результате возникала окклюзия ЛКА, приводящая к регионарной острой ишемии миокарда. Длительность окклюзии составляла 60 мин, после чего лигатуру снимали. Контроль ишемии и реперфузии осуществляли по ЭКГ.

Модель ишемии-реперфузии миокарда. Острую ишемию воспроизводили в соответствии с протоколом, описанным выше. Длительность окклюзии на модели ишемии-реперфузии составляла 30 мин, после чего лигатуру снимали и осуществляли реперфузию сердца в течение 120 мин. Развитие ишемии контролировали по ЭКГ.

Внутривенное введение животным модуляторов митоКАтФ- УМФ растворяли в стерильном 0,9%-ном К'аС1 и вводили внутривенно в количестве 30 мг/кг в соответствии с одной из четырех схем эксперимента (Результаты и обсуждение). Специфический ингибитор митоКАТФ 5-гидроксидеканоат (5-ГД) растворяли в стерильной дистиллированной воде и вводили внутривенно за 10 минут до окклюзии в дозе 5 мг/кг. Контрольным животным вводили 0,3 мл стерильного физиологического раствора. Все животные были поделены на 7 экспериментальных групп, в зависимости от вводимых препаратов (Таблица 1)

Таблица 1. Схема введения препаратов крысам.

Вводимые препараты Группы животных

1 2 3 4(иш; 5(Иш] б(иш; 7(иш;

УМФ - + - - + - +

5-ГД - - + - - + +

После выполнения эксперимента животных декапитировали, извлекали сердца и проводили анализы параметров ишемического повреждения. Определения зоны риска и зоны некроза миокарда методом двойного окрашивания. После 120 мин реперфузии вокруг JIKA вновь затягивали лигатуру и внутривенно вводили 0,5 мл 5% раствора синего Эванса (ICN, США). Краситель окрашивал в темно-синий цвет участки сердца с неизмененным кровоснабжением. После визуализации границы между окрашенными и неокрашенными участками сердце быстро вырезали, тщательно промывали физиологическим раствором и разрезали в поперечном направлении на пять срезов одинаковой толщины. Базальные. поверхности срезов сердца для определения зоны риска фотографировали цифровой фотокамерой, совмещенной со стереомикроскопом (МБС-10, «JIOMO», Санкт-Петербург). Затем срезы миокарда помещали в 1% раствор 1,2,3 - трифенилтетразолия хлорида (TTC, ICN, США), окрашивающий жизнеспособную ткань в ярко-красный цвет, и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С и рН 7,4. В результате дифференцировались участки потенциально жизнеспособной ткани (красного цвета) и участки погибшей ткани (не окрашивались) — зона некроза. Базальные поверхности срезов фотографировали повторно. Планиметрическое определение площадей зоны риска и зоны некроза миокарда проводили при помощи пакета прикладных программ STATGRAPHICS. Размер зоны риска выражали в процентах от общей площади среза. Размер зоны некроза выражается в процентах от площади зоны риска.

Приготовление проб ткани миокарда для HPLC. Эксперимент был проведен на самцах крыс линии Вистар. Все животные, использованные в эксперименте, были разделены на 7 групп (Таблица 1). Крыс наркотизировали введением этаминала натрия (50 мг/кг) внутрибрюшинно, затем проводили трахеотомию и подключение к аппарату искусственной вентиляции легких (см. выше). Через 60 минут после окклюзии сердца вырезали, замораживали в жидком азоте и растирали до порошкообразного состояния в охлажденной фарфоровой ступке. Все дальнейшие мероприятия проводили при 4°С. Навеску измельченной ткани

(300 мг) заливали охлажденной 6% HCIO4 в соотношении ткань:кислота 1:5 экстрагировали проводили в течение 25 мин на льду. Затем пробы центрифугировали 10 мин на центрифуге Mini Spine (Eppendorf) при 14 ООО об/мин и 4°С. Супернатант нейтрализовали охлажденным 0,5 М раствором триэтаноламина в 1,5 М К2СО3, pH 7,0. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при тех же условиях. Супернатант замораживали в жидком азоте и хранили до анализа.

HPLC-аналт содержания в пробе уридиповых и адепиповых нуклеотидов. Анализ осуществляли с помощью колонки «РгоРас РА 1» (4 х 250 мм, 10 мкм) (США) с применением хроматографа марки «Knauer» (Германия). Детектирование проводили при длине волны 254 нм. Для полного разделения нуклеотидов применяли градиентную элюцию с использованием дистиллированной воды и 0.37 М (NH4)C03, pH 9.2. Хроматографирование осуществляли по следующей схеме: 0-5 мин — элюирование смесью, 59% Н20 и 41% (NH4)C03; 5-27 мин — элюирование от 41% до 100% (NH4)C03; 27 -37 мин — элюирование 100% (NH4)C03; 37-42 мин — элюирование от 100% до 41% (NH4)TO3; 42-52 мин — элюирование 59% А и 41% В. Скорость объемной подачи элюента составляла 1 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл. Расчет количественного состава нуклеотидов в образцах проводили методом внешнего стандарта с применением программы 1.52.0.0 для Windows.

Определение показателей энергетического обмена и системы антиоксидаитной защиты и перекисного окисления липидов в ткани миокарда проводили по стандартным методикам.

Энергозависимый АТФ-ингибируемый вход it в митохондрии определяли методом спектрофотометрии по скорости набухания митохондрий в гипотонической среде, содержащей 50 мМ KCl, 5 мМ Na2HP04, 0.5 мМ MgCI2, 0.1 мМ ЭГТА, 5 цМ цитохром с, 1 цМ олигомицин, 10 мМ HEPES-NaOH (pH 7.4) при длине волны 520 нм, постоянном перемешивании и термостатировании при 26 С на спектрофотометре Shimadzu UV-2401 PC (Япония). Набухание инициировали добавлением 5 мМ сукцинат в присутствии 2 рМ ротенона. Концентрация митохондриалыгого белка в ячейке составляла 0.2 мг/мл.

2,4-ДНФ-индуцированный АТФ- зависимый выход it из митохондрий оценивали при помощи К+-селективного электрода. Среда инкубации митохондрий содержала: 170 мМ сахарозы, 80 мМ D-маннит, 5 мМ NajHP04, 10 мМ Трис-HCl (pH 7.4). Выход К+ из митохондрий индуцировали добавлением 50 цМ ДНФ. Концентрация митохондриального белка в ячейке составляла 1-1,5 мг/мл.

Количество it в митохондриях определяли при помощи К+-селективного электрода после добавления в среду инкубации митохондрий детергента -— Triton Х-100. Концентрация митохондриального белка в ячейке составляла 1-1,5 мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Изучение механизмов кардиопротекторного действия активации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала на модели острой ишемии и ишемии-реперфузии миокарда.

Ранее в многочисленных работах было показано, что введение фармакологических активаторов митоКатф перед продолжительной ишемией миокарда, по аналогии с ишемическим прекондиционированием миокарда, приводит к положительным экспериментальным и клиническим результатам [McCullough et al 1991; Gross et al 1992; Grover et al 1992]. В нашей лаборатории был обнаружен природный активатор митоКАТФ каналов - уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Mironova et al 2004], и установлено, что его предшественники уридин и уридин-5'-монофосфат (УМФ) существенно снижают индекс ишемической альтерации и способствуют восстановлению нормального ритма сердца в условиях острой ишемии, т.е., обладает антиишемическими и антиаритмическими свойствами [Krylova et al 2006].

На основании описанных выше работ было сделано предположение, что ключевую роль в защите сердца при ишемии играет активация митоКатф канала. Однако механизм, по которому активация данного канала приводит к наблюдаемым эффектам, был не вполне понятен. Для его выяснения нами были проведены исследования по изучению влияния активации митоКДТФ на биоэнергетический обмен и систему антиокислительной защиты клетки в условиях острой ишемии миокарда. В нашей лаборатории было показано, что при активации работы калиевого канала, осуществляющего вход калия в митохондрии, активируется и система выхода калия из них [Mironova et al 2010]. Мы полагаем, что активация рециклизации калия в митохондриях приведёт к снижению интенсивности окислительного стресса (снижении накопления реактивных форм кислорода), а также к восстановлению энергетического баланса в ишемизированном миокарде. Однако, прежде всего, необходимо было убедиться, что вводимый внутривенно УМФ в ткани миокарда быстро метаболизирустся до УДФ, который выполняет в тканях функцию активатора канала.

1.1. Изменение уровня уридиповых нуклеотидов в ткани миокарда в условиях нормоксии и острой ишемии миокарда.

В работе было изучено изменение концентрации уридиповых нуклеотидов и, в частности УДФ, в ткани миокарда в условиях нормоксии и острой ишемии до и после введения УМФ. Препарат УМФ вводился за 5 минут до окклюзии ЛКА. Пробы ткани для анализа брали через 65 минут после введения препарата. Данные представлены в таблице 2.

У интактных животных на долю УДФ, являющегося активатором митоКатф, приходится ~ 30% от суммарного количества уридиповых нуклеотидов в ткани миокарда. При внутривенном введении УМФ в условиях нормоксии происходит увеличение количества всех уридиноных нуклеотидов, в том числе в 1,5 раза — УДФ.

Таблица 2. Концентрация уридиновых нуклеотидов в ткани миокарда через 65 минут после внутривенного введения животным УМФ в условиях нормоксии (Н) и острой ишемии (И) миокарда.____

Группа животных УМФ, нмоль/г ткани УДФ, нмоль/г ткани УТФ, нмоль/г ткани Сумма уридиновых нуклеотидов

Контроль 15,62 ± 1,20 37,71 ±2,59 96,42 ± 12,30 153,75 ± 17,56

УМФ (Н) 18,05 ±2,72 50,75 ± 8,84* 125,3 ± 17,48 194,1 ±22,34*

Ишемия (И) 13,66±1,19 49,14±5,95* 73,03±7,35 135,83 ± 12,9*

И + УМФ 14,02±1,34 70,10±13,10** 78,14±9,32 162,3 ± 17,5**

Отличия статистически достоверны (р<0,05): * -по сравнению с контрольной группой, ** -между группами И+УМФ.

При ишемии миокарда суммарное содержание уридиновых нуклеотидов в ткани миокарда несколько падает, по всей видимости, за счет заметного сокращения фракции У ТФ. При этом количество как УМФ, так и УДФ в ткани миокарда увеличивается, вероятно, за счет распада УТФ. Возможно, это одна из защитных реакций организма.

В условиях острой ишемии при введении животным УМФ за 5 мин до окклюзии наблюдалось повышение суммарного содержания уридиновых нуклеотидов, при этом количество УДФ повышалось на 90% по сравнению с физиологической нормой. Количество УМФ в ткани в этом случае сохранялось на прежнем уровне, тогда как количество УТФ несколько снижалось. Это дает основание предположить, что в кардиомиоцитах в условиях острой ишемии происходит синтез УДФ - активатора \штоКДТФ канала путем фосфорилирования поступающего в клетку из кровотока экзогенного УМФ и дефосфорилирования УТФ, имеющегося в клетке.

Таким образом, введение УМФ за 5 мин до моделирования острой ишемии, спустя час после его введения, способствует выраженному увеличению количества УДФ — метаболического активатора митоКАтф в ткани миокарда, что, по всей видимости, опосредует обнаруженные нами ранее антиишемический и антиаритмический эффекты этого препарата при острой ишемии миокарда [Кгу1оуа е1 а1., 2006]. Кроме того, было сделано заключение, что увеличение в крови УМФ приводит к увеличению общего пула уридиновых нуклеотидов в клетках миокарда, вероятно за счет его проницаемости в клетку через клеточную мембрану.

1.2. Энергетический баланс и окислительные процессы при острой ишемии миокарда и их коррекция в результате активации митоКАТФ

Работа по моделированию острой ишемии миокарда проводилась на базе НИИ экспериментальной медицины РАМН, г. Санкт-Петербург, с участием диссертанта.

1.2.1. Влияние активации митоКАтФ на энергетический статус ткани миокарда в условиях нормоксии и острой ишемии.

В работе было изучено влияние активации митоКАХФ на количество адениновых нуклеотидов, креатинфосфата (КрФ) и гликогена в ткани миокарда в условиях- острой ишемии миокарда. Также было исследовано влияние активации

7

канала на количество образуемого в ткани лактата, как основного показателя интенсивности процесса гликолиза в клетке.

В условиях нормоксии при введении УМФ наблюдалось повышение суммарного пула адениновых нуклеотидов, причем в наибольшей степени увеличивалась фракция АМФ, тогда как изменения концентрации АТФ не превышали 8-10 % (Таблица 3).

Таблица 3. Концентрация адениновых нуклеотидов в миокарде через 60 минут после внутривенного введения животным УМФ в условиях нормоксии и острой ишемии миокарда.____

Группа животных АМФ, АДФ, АТФ,

нмоль/г ткани нмоль/г ткани нмоль/г ткани

Контроль 322 ± 26 730 ±56 2578 ± 209

УМФ 450 ±45* 991 ±45* 2760 ±133

5-ГД 454 ±41* 725 ±55 1979 ±395

Ишемия (И) 414 ±44* 559 ±17* 1566 ±133*

И + УМФ 273 ±18** 595 ±56 2252 ±300**

И + УМФ+5-ГД 518 ±68" 791 ±67 1538 ±228"

Отличия статистически достоверны (р<0,05): * -по сравнению с контрольной группой,

**- между группой ишемии и группой И+УМФ, # -между группами И+УМФ и И+УМФ+5-ГД.

При моделировании острой ишемии в ткани миокарда к 60-й минуте наблюдалось заметное падение уровня АТФ (на 40%). Уровень АМФ при этом наоборот повышался по сравнению с контролем. Предварительное введени животным УМФ в условиях острой ишемии приводило к восстановленш количества АТФ в миокарде практически до уровня контроля. При этом введени специфического ингибитора митоКАТФ — 5-гидроксидеканоата (5-ГД) заметн ослабляло положительный эффект УМФ на уровень АТФ в ткани.

Следовательно, из результатов этой серии экспериментов можно сделат вывод, что предварительное введение УМФ при ишемии предупреждае наблюдаемый в этих условиях распад АТФ в кардиомиоцитах. Положительны эффект УМФ связан с активацией митоКАТФ, т.к. специфический ингибито канала его предотвращает. Таким образом, активация канала при ишеми предупреждает распад макроэргов в ткани миокарда в этих условиях.

Таблица 4. Влияние внутривенно введенного УМФ на биохимические показател энергетического обмена миокарда в условиях ишемии.__

Группа КрФ, цМ/г ткани Гликоген, г% Лактат, цМ/г ткани

Контроль 6,63 ±0,18 6,41±0,21 2,14±0,21

Ишемия (И) 2,75 ±0,13* 3,66±0,16* 5,71±0,74*

И+УМФ 6,55±0,33** 6,10±0,66** 5,77±1,04

И +УМФ + 5-ГД 2,73 ±0,13" — —

Отличия статистически достоверны (р<0,05): * - по сравнению с контрольной группой, **- между группами ишемии и И+УМФ, # -между группами И+УМФ и И+УМФ+5-ГД.

Активация митоКдтф в условиях острой ишемии способствует восстановлению содержания в ткани миокарда другого макроэргического соединения — креатинфосфата (КрФ), а также гликогена до контрольного уровня (Таблица 4). Это указывает на выраженный энергосберегающий эффект активации митоКдтф.

В то же время, УМФ не влияет на уровень лактата, который повышается при ишемии (Таблица 4). Это указывает на отсутствие влияния митоКдтф на процесс гликолиза. Восстановление уровня КрФ в ишемизированном миокарде иод влиянием УМФ блокируется специфическим ингибитором митоКАТФ канала 5-гидроксидеканоатом, подтверждая наше предположение о том, что на сохранение уровня макроэргов в ишемизированных клетках влияет именно активация МИТОКдгф.

1.1.3. Влияние активации митоКАТФ канала на показатели системы антиокислительной защиты организма и перекисного окисления липидов при острой ишемии миокарда.

Нами было предположено, что возможным механизмом кардиопротекторного действия фармакологических активаторов митоКАТФ канала, и УДФ в частности, является снижение генерации активных форм кислорода (АФК) в митохондриях при активации митоКдтф и К+/Н+ обмена в условиях гипоксии [Mironova et al., 2010]. Из литературных данных известно, что активация калиевого цикла в митохондриях приведет к их слабому разобщению и снижению скорости образования АФК в митохондриях [Korshunov et al., 1997]. Известно, что при гипоксии скорость образования перекиси повышается [Vanden Hoek et al., 1998]. Поэтому, перед нами была поставлена цель изучить влияние активации митоКАТФ на некоторые показатели окислительного стресса ткани миокарда при острой экспериментальной ишемии. В ткани миокарда определяли содержание гидроперекисей липидов (ГПЛ), восстановленного глутатиона (ВГ) и активность супероксиддисмутазы (СОД) после превентивного внутривенного введения УМФ. Измерения проводили через 60 минут после окклюзии ЛКА. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние УМФ на содержание гидроперекиси липидов (ГПЛ), супероксиддисмутазы (СОД) и восстановленного глутатиона (ВГ) в миокарде через 60 минут после окклюзии ЛКА.__

Группа ГПЛ (ОД480) СОД (у.е./мг белка) ВГ (рМ/г)

Контроль 0,070±0,009 2,27±0,24 34,37±4,62

Ишемия (И) 0,140±0,014* 1,63±0,11* 23,99 ±3,02*

И+УМФ 0,075±0,008** 2,21±0Д4** 33,83±3,73**

И+УМФ+5-ГД 0,130±0,014* 1,61±0,14# 22,75±1Д5*

Отличия статистически достоверны (р<0,05): * -по сравнению с контрольной группой,

**- между группой ишемии и группой ишемия+УМФ, * -между группами И+УМФ и

И+УМФ+-5-ГД.

Очевидными признаками развития окислительного стресса через 60 мин после окклюзии ЛКА являлось обнаруженное нами заметное возрастание содержания ГПЛ, а также снижение ВГ и ингибированис активности СОД в ткани миокарда.

Профилактическое введение УМФ, способствующее активации митоКдтф, приводило к предупреждению накопления ГПЛ и сохранению активности СОД на уровне контроля, а также к предотвращению падения уровня ВГ. При этом специфический ингибитор митоКдтф 5-ГД предупреждал положительное действие УМФ на данные показатели окислительного стресса, свидетельствуя о ключевой роли активации митоКдтф в снижении интенсивности перекисного окисления липидов и сохранении активности ферментов антиоксидантной системы митохондрий при ишемии миокарда.

Полученные в работе данные подтверждают нашу гипотезу о том, что механизм кардиопрогекторного действия активаторов канала связан со снижением генерации АФК, поскольку следом за активацией митоКАТФ следует активация К+/Н+ обмена [8с1юпГе1с1 е1 а!., 2003; 8сЬа!Ьиуеуа й а!., 2006] что, в свою очередь, приводит к слабому разобщению митохондрий и снижению как мембранного потенциала митохондрий, так и скорости образования перекисных радикалов в них [КогеЬипоу е1 а1., 1997]. Ускорение АТФ-зависимого транспорта К+ и активация калиевого цикла наблюдалось нами при адаптации организма к гипоксии [Мкопоуа е1 а1., 2010].

Представленные данные свидетельствуют о предупреждении развития окислительного стресса в ткани ишемизированного миокарда на фоне превентивно введенного УМФ. Устранение наблюдаемых кардиопротекторных эффектов специфическим ингибитором митоКатф - 5-гидроксидеканоатом позволяет сделать вывод, что предопределяющим в защитном эффекте УМФ является образование из него УДФ, который активирует митоКАТФ канал.

1.3. Антиишемический эффект активации митоКЛтф на модели ишемии-репепрфузии миокарда.

Антиишемический эффект УМФ был изучен также на модели «ишемия-реперфузия». Ишемия при этом развивается в течение 30 минут и затем следует 2-х часовая реперфузия. Известно, что при окклюзии ЛКА и последующей реперфузии возникает зона ишемии, включающая зону риска, сохраняющую жизнеспособность, и зону необратимо поврежденной ткани миокарда - зону некроза. Соотношение размеров зоны некроза и зоны риска является показателем ишемического повреждения миокарда, и было использовано нами при оценке кардиопротекторного эффекта активации канала в этих условиях.

Было установлено, что после ишемии/реперфузии формируется зона риска, которая охватывает 30-45% от объема ткани желудочков. Зона некроза составляет при этом 50-70% от величины зоны риска (Таблица 6).

В работе были опробованы четыре схемы введения УМФ. Согласно первым трем схемам препарат вводили однократно: за 5 минут до ишемии, за 30 минут до ишемии, и за 5 минут до реперфузии. Четвертая схема предусматривала двукратное введение УМФ: за 30 минут до ишемии и за 5 минут до реперфузии.

Контрольным животным вводили 0,3 мл физиологического раствора. Результаты представлены в таблице 6.

Необходимо отметить, что УМФ не оказывал существенного влияния на величину зоны риска, независимо от схемы введения препаратов. Что касается влияния УМФ на величину зоны некроза, то оно зависело от времени введения, а также от количества введений препарата. Так, при введении УМФ за 30 мин до ишемии наблюдалось лишь незначительное уменьшение размеров этой зоны, тогда как введение препарата за 5 мии до реперфузии приводило к уменьшению зоны некроза на 40%. При двукратном введении УМФ сокращение зоны некроза было наиболее выражено и составляет 50%. В обоих случаях этот положительный эффект устранялся введением 5-ГД, что свидетельствует о предопределяющей роли активации митоКдтф в наблюдаемом положительном эффекте УМФ.

Таблица 6. Влияние УМФ на величину зоны некроза миокарда крыс на модели

Группа Зона риска, % Зона некроза, %

И/РП (контроль) 39.Ш.8 67,0±5,7

И/РП+УМФ (5 мин до И) 36,7±5,4 66,3±4,4

И/РП +УМФ (30 мин до И) 35,9±3,9 57,0±3,7

И/РП + УМФ (5 мин до РП) 38,4±2,7 41.0±2,4*

И/РП + УМФ (5 мин до РП) +5-ГД (5 мин до УМФ) 39,8±5,1 69,5±9,8

И/РП +УМФ (30 мин до И + 5 мин до РП) 30Д±4,1 34,8±4,2*

И/РП +УМФ (30 мин до И + 5 мин до РП)+5-ГД (5 мин до УМФ) 30,8±1,8 65.7±6,7"

статистически достоверны между группами И/РП+УМФ и И/РП+УМФ+5-ГД

Исходя из выше представленных результатов, можно говорить о том, что первостепенное значение в формировании антиишемического эффекта активации митоКдтф па модели ишемии/реперфузии имеет введение УМФ непосредственно перед реперфузией. При двукратном введении препарата эффект усиливается, возможно, за счет предварительной инициации эндогенных защитных механизмов, в частности увеличения уровня УДФ - метаболического активатора митоКдтф, в ткани миокарда. При этом ведущую роль в реализации антиишемического действия УМФ играют митоКАТф - каналы, о чем свидетельствует отсутствие эффекта препарата при его введении на фоне их селективного ингибитора канала 5-ГД.

1.4. Предполагаемый механизм антиишемического действия УМФ.

Полученные в работе данные о снижении интенсивности окислительного стресса в условиях ишемии и сохранении высокого уровня макроэргических соединений в клетке, свидетельствуют в пользу развиваемого в лаборатории

представления о механизмах кардиопротекторного действия митоКатф- Согласно

И

полученным в работе и литературным данным механизм антиишемического действия УМФ представляется в следующем виде:

1. Введенный УМФ проникает через клеточную мембрану и фосфорилируется в клетке до УДФ, повышая его концентрацию (данные настоящей работы);

2. УДФ, будучи природным активатором митоКатф [Мтопоуа 2004], приводит к его активации в миокарде, с чем связан его кардиопротекторный эффект (данные настоящей работы);

3. Активация входа К+ в митохондрии сопровождается его выходом из клетки в обмен на Н+, то есть, активацией К+/Н+-обмена в митохондриях [йсЬб^Ыс! е1 а1., 2003; 8сИа1Ьиуеуа й а1., 2006; Миошл-а й а1., 2010];

4. Активация цикла К+ в митохондриях приводит к их разобщению, что сопровождается снижением скорости образования активных форм кислорода (АФК) [КогеЬипоу й а!., 1997 и данные настоящей работы];

5. Снижение скорости генерации АФК предупреждает окисление белков и липидов мембран, наблюдаемое при глубокой гипоксии и приводящее к некрозу ткани [Оп1Шз & На1еБ1гар 1995];

6. Снижение образования АФК предупреждает образование в митохондриях митохондриальной Са2+-активируемой СвА-чувствительной поры, открытие которой также ведет к некрозу ткани [Сготрйп 1999, Ко\¥акоУ5ку е1 а1., 1998,2001].

Глава 2. Адаптогеннап роль митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала в формировании долгосрочной устойчивости организма к гипоксии.

Учитывая выше представленные данные, можно предположить, что активация митоКатф может опосредовать защиту ткани не только при кратковременной ишемии, но и участвовать в формировании долговременной адаптации организма к гипоксии. С этой точки зрения, было интересно изучить влияние активации канала на формирование общей толерантности организма к острой гипоксии в условиях in vivo. В лаборатории было установлено, что интервальная гипоксическая тренировка животных способствует выраженной активации митоКатф [Mironova et al 2010]. В этой связи, можно предположить, что препараты, обладающие адаптогенной и антигипоксической активностью, будут обладать аналогичным эффектом на митоКатф- Среди них, в настоящее время, наиболее широко используются в клинической медицине растительные флавоноидсодержащие антигипоксические препараты.

Целью данной части работы было изучение влияния одного из таких препаратов, «Экстралайфа» (ЭЛФ), на активность митоКАТФ в митохондриях, а также на формирование в экспериментах in vivo общей толерантности организма к гипоксичсским условиям. Кроме того, была поставлена задача доказать роль митоКатф в формировании этой устойчивости. Препарат «Экстралайф» является водорастворимым экстрактом цветков Phentaphylloides fruticosa. Он содержит большое количество флавоноидов, включая кверцетин, и обладает широким спектром биологической активности [Lukyanova L.D. et al., 2007].

В экспериментах с митохондриями печени и сердца в условиях in vitro было показано двухфазное действие ЭЛФ как на ДНФ-индуцированный АТФ-зависимый выход Kf из митохондрий, так и на их энсргозависимое набухание (Рис. 1).

Концентрация ЭЛФ, ш7л

Б)

03 I ал

J

í 0.1J

? 0,1

' 0,03

rh

Контроль

loo цм

■■^гд

Рис.1. Влияние ЭЛФ на энергозависимое набухание митохондрий. А) дозозависимость активации набухания митохондрий сердца и печени от концентрации ЭЛФ. За 0 % принята величина контроля; Б) Устранение активирующего эффекта 5-гидроксидеканоатом на модели энергозависимого набухания митохондрий.

В работе установлено, что в области низких концентраций (0,005 до 1 мг/л) препарат оказывает активирующий эффект на митоКагф, который сменяется ингибирующим действием при повышении концентрации до 10 мг/л и выше. Необходимо отметить, что это совпадало с проявлением обнаруженных ранее у ЭЛФ анти- и прооксидантньгх свойств, соответственно [Лукьянова Л.Д. и др., 2007], причем прооксидантные свойства ЭЛФ наблюдались при введении больших, нефизиологических доз препарата. Установлено также, что АТФ-зависимый транспорт К+ в митохондриях сердца был более подвержен влиянию препарата, чем в митохондриях печени.

Наблюдаемая в результате воздействия ЭЛФ активация АТФ-зависимого транспорта К+ в митохондриях устранялась 5-ГД - специфическим ингибитором митоКатф (Рис. 1Б). Таким образом, действие ЭЛФ в интактных митохондриях связано со специфической активацией АТФ-зависимого транспорта К+.

В свете представленных в работе данных, активация работы митоКАТф канала должна способствовать увеличению общей толерантности организма к гипоксии, а подавление работы канала - снижению сс переносимости. В условиях in vivo было изучено общее адаптивное влияние активации митоКАТф препаратом «Экстралайф» у животных, подвергнутых острой нормобарической гипоксии (Рйс.2).

Для оценки резистентности организма к гипоксии использовали два параметра: 1 — время потери позы (ВПП) - период от момента достижения «высоты» 11500 метров до момента, когда животное принимает боковое положение и утрачивает способность сохранять нормальную для него позу. ВПП отражает формирование адаптивных признаков в субкритических условиях; 2 — время жизни на критической высоте (ВЖ) - период от момента достижения «высоты» 11500 метров до наступления у животного 2-го атонального вдоха. ВЖ

характеризует предельные резервные возможности организма и его жизнеспособность в экстремальных условиях.

Рис.2. Влияние ЭЛФ на признаки толерантности организма к гипоксии (ВЖ и ВПП) in vivo. За 100 % взята величина контроля.

При введении ЭЛФ (20 мг/кг внутрибрюшинно) за 30 мин до подъема животных в барокамере на критическую высоту, наблюдалось увеличение ВПП в 10-12 раз, а ВЖ в 8 раз (Рис. 2), что указывает на увеличение толерантности организма к гипоксическим условиям. Специфический ингибитор митоКдтф 5-гидроксидсканоат (5-ГД) в значительной степени устранял наблюдаемый адаптогенный эффект препарата «Экстралайф», не влияя существенно на параметры резистентности к острой гипоксии контрольных животных. Следовательно, наблюдаемые адаптогенные эффекты в большой степени опосредованы активацией митоКАТф.

Представленные выше экспериментальные данные, полученные в экспериментах как in vitro, так и in vivo, позволяют сделать вывод, что активация митоКдтф канала способствует, увеличению долгосрочной общей толерантности организма к экстремальным гипоксическим условиям, т.е. оказывает адаптогенный эффект.

Глава 3. Функционирование митохондриальной системы транспорта калия при старении организма

Известно, что частота развития инфаркта миокарда у человека увеличивается с возрастом. Поэтому, в плане изучения роли митоКатф в развитии инфаркта, была поставлена задача выявить возрастные изменения в функционировании канала. В настоящей работе использовались крысы разного возраста (1,3,8 и 24 месяца).

3.1. Возрастные изменения скорости транспорта калия и количества иона в митохондриях.

Изучение активности митоКАТФ проведено с использованием двух моделей: 1) 2,4-ДНФ-индуцированного выхода калия из митохондрий и 2) энергозависимого входа калия в митохондрии.

В ходе работы на обеих моделях было обнаружено существенное снижение активности транспорта калия в митохондриях обеих тканей с возрастом (Рис. 3)

ЯД Сердце Г Г* Г>ч»и|.

1 месяц 3 месяца 8 месяцев 24 месяца

Рис.З. Скорость ДНФ- индуцированного АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях печени и сердца животных разного возраста.

При измерении количества калия в митохондриях печени и сердца крыс было показано, что наибольшее количество этого иона обнаружено в митохондриях печени и сердца у молодых одномесячных и трехмесячных крыс (Таблица 7).

Таблица 7. Количество К+ в митохондриях печени и сердца крыс разного возраста, рАТ/мг белка.______

Печень Сердце

1 месяц 75,76 ±8,93 74,77 ±7,4

3 месяца 62,14 ±5,39 79,35 ± 7,55

8 месяцев 58,66 ± 7,73* 86,12 ±4,26

24 месяца 36,34 ± 11,54* 47,82 ±9,26*

*Отличия статистически достоверны по сравнению с группой животных в возрасте 1 месяц (р<0,05).

У взрослых 8-ми месячных крыс его количество снижается приблизительно на 20% в митохондриях печени и остается практически без изменений в митохондриях сердца. У старых крыс количество калия в митохондриях обоих тканей снижено в 1,5-2 раза по сравнению с молодыми животными.

3.2. Регуляция митохондриального транспорта К* у животных разного возраста.

Об изменениях в регуляции митоКЛТФ с возрастом можно судить по измерению константы ингибирования канала (Кщ) АТФ, который является его метаболическим регулятором. Данные представлены на рисунке 4.

4>

У

• 1 месяц

♦ 3 месяца £ месяцев

^ ▼ 24 месяца

АТФ, цМ

АТФ, Ц.М

Рис.4. Кривые ингибирования АТФ митоКАТФ канала в митохондриях печени (А) и сердца (Б) у животных разного возраста. Данные получены на модели 2,4-ДНФ-индуцированного выхода калия.

В митохондриях обеих тканей на возрастном промежутке 1-3 месяца наблюдается небольшое увеличение константы ингибирования АТФ (от 8,12±0,52 рМ до 11,56±1,32 рМ в митохондриях печени и от 12,11±1,45 цМ до 19,78±2,06 рМ в митохондриях сердца). При дальнейшем взрослении животных константа ингибирования существенно снижается (до 3,5±0,48 рМ в митохондриях печени и 4,5±0,38 цМ в митохондриях сердца 8-ми месячных животных). Далее, по мере старения животных, проявляются тканевые различия величины К1Д. В митохондриях печени животных в возрасте 24 месяца эта константа продолжает уменьшаться и составляет 2,41±0,32 рМ, что может свидетельствовать об увеличении сродства митоКАТФ канала к АТФ при старении животного, либо о снижении экспрессии канала с возрастом. Митохондрии же сердца старых животных становятся низко чувствительными к АТФ и 50%-го ингибирования практически не наблюдается. Отсутствие 100%-го ингибирования канала при общем снижении его активности у 24-месячных животных является, возможно, компенсаторной реакцией на снижение экспрессии канала с возрастом, поскольку, как было показано выше, активная работа митоКАТФ необходима для защиты миокарда от ишемических повреждений, вероятность которых существенно увеличивается при старении.

3.3. Полуколичественный анализ митоКАтф в митохондриях печени и сердца крыс разного возраста.

Проведенный иммунохимический анализ показал, что при старении организма количество митоКАтф несколько снижается (Рис.5), однако существенным это снижение назвать нельзя. Следовательно, с возрастом в

16

митохондриях печени происходит снижение экспрессии этого белка, но оно может только частично обусловливать снижение активности канала и изменение константы ингибирования для АТФ при старении животного.

13 8 24

55 кДа -

100 87 61 59

Рис.5. Количество митоКАТФ, измеренное методом иммуноблота в митохондриях печени крыс разного возраста. Сверху указан возраст животных (месяцы). Цифры под фото - относительное количество белков, измеренное путем денситометрии мембран. За 100% взято количество митоКАТФ у животных в возрасте 1 месяц.

Таким образом, при старении организма имеет место как изменение чувствительности канала к регуляторам, так и снижение экспрессии белка-канала. Результатом этого является снижение функционирования не только митоКАТФ канала но, по всей видимости, всего митохондриального цикла К+, т.к. активность К+/Н+-антипортера находится в прямой зависимости от активности митоКАТФ [8сЬбпГе1<1 й а1., 2003; БсИаПэиуеуа а а1., 2006].

Судя по существенному снижению скорости транспорта калия в митохондриях старых крыс, можно предположить, что с возрастом снижается функционирование митохондриального цикла калия, что приводит к перевосстановленному состоянию дыхательной цепи. Результатом этого является обнаруженное во многих исследованиях увеличение с возрастом генерации АФК, которые являются основными повреждающими мембрану факторами при старении организма [Ашвипоу е1 а12001; Шабалин и др, 2002].

Глава 4. Функционирование митоКАТФ канала у гибернирующих животных в различных физиологических состояниях (спячка, пробуждение, летняя активность).

Как уже обсуждалось выше, открытие митоКЛТф приводит к активации митохондриального цикла К+ и, как результат, к мягкому разобщению митохондрий. При разобщении дыхательной цепи наблюдается, как известно, повышенное тепловыделение. Ранее в работе Федотчевой [Федотчева т др., 1986], проведенной в нашей лаборатории, на митохондриях печени было показано изменение скорости транспорта калия через мембрану митохондрий гибернирующих животных при смене физиологических состояний. Однако, тогда еще не было известно, что энергозависимый транспорт К+ в митохондриях осуществляется АТФ-зависимым калиевым каналом и не были отработаны методы определения его функциональной активности. Кроме того, исследования у гибернирующих животныхпроводились только на митохондриях печени. Поэтому мы провели эту работу на новом методическом уровне и изучили функционирование митоКАтФ как в ткани печени, так и сердца, а также его регуляцию при гибернации животных.

В данной части работы были изучены функционирование митоКАТФ и его регуляция у гибернирующих сусликов в состояниях спячки, пробуждения и летней активности.

4.1. Изменение скорости АТФ-зависимого транспорта калия его количества в митохондриях сердца и печени при смене метаболических состояний.

Изучение активности митоКАТФ проводилось с использованием модели АТФ-ингибируемого энергозависимого набухания митохондрий [йагНё 1998], а также модели 2,4-ДНФ-индуцированного АТФ зависимого выхода К+ из митохондрий. Данные, полученные на модели энергозависимого входа К+ в митохондрии представлены в таблице 8.

Таблица 8. Изменение оптической плотности при энергозависимом входе К+ в митохондрии печени и сердца у сусликов, находящихся в различных метаболических состояниях, А8/мин*мг белка.__

Метаболическое состояние Печень Сердце

Спячка (2-5° С) 0,154 ±0,005 0,153 ±0,024

Спячка (6-9° С) 0,188 ± 0,03 0,178 ±0,031

Пробуждение (25 ° С) 0,325 ± 0,025* 0,611 ±0,051*

Активность (37° С) 0,189 ±0,013** 0,28 ±0,014**

Различия достоверны по сравнению: *с состоянием спячки, **с состоянием пробуждения

(р<0,05).

На обеих моделях была показана корреляция между активностью митоКАтф и интенсивностью термогенеза. Так, в состоянии спячки при температуре тела 2-5°С, скорость АТФ-зависимого транспорта калия минимальна, но она заметно возрастает с началом пробуждения при повышении температуры тела до 6-9°С. Во время активной фазы пробуждения животных, при температуре тела 25-28°С, активность митоКАТф возрастает в митохондриях обеих тканей (в 2-2,5 раза в митохондриях печени, в 3-4 раза в митохондриях сердца). По достижении активного состояния интенсивность АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях снижается, что соответствует литературным данным об уменьшении скорости теплообразования при переходе сусликов от состояния пробуждения в активное состояние.

При измерении количества К+ в митохондриях было обнаружено, что в митохондриях печени в состояниях спячки и летней активности оно практически одинаковое, тогда как при пробуждении увеличивается в 1,5-2 раза (Рис. 6). В митохондриях сердца сусликов, в отличие от печени, при выходе животных из состояния спячки наблюдается лишь небольшая тенденция к росту количества калия (Рис. 6). По всей видимости, это связано с постоянной, хоть и менее активной во время спячки, сократительной работой сердца.

л

Я Печень I I Сердце

иробуастение

активность

Рис.6. Содержание калия в митохондриях печени и сердца сусликов С//<?//ш' ипс1иШи.ч, находящихся в различных метаболических состояниях.

Т.о., исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что повышение теплопродукции прямо коррелирует с активацией митоКдтф канала. Мы предполагаем, что, по всей видимости, в митохондриях печени сначала активируется только вход калия, тогда как в митохондриях сердца активируется весь цикл калия, поскольку там на фойе резкого увеличения скорости входа иона в митохондрии его количество сохраняется практически на прежнем уровне.

4.2. АТФ-регуляция митохондриального транспорта калия при помощи А ТФ у животных, находящихся в различных метаболических состояниях.

Ингибиторный анализ проводился с использованием двух вышеописанных моделей. Значения констант, полученных на модели энергозависимого набухания митохондрий приведены в таблице 9.

Таблица 9. Константы иншбирования АТФ (цМ) на модели энергозависимого входа калия в митохондрии печени и сердца сусликов, находящихся в различных метаболических состояниях.

Печень Сердце

Спячка (6-9°С) 9,884 ±2,05 5,847 ±0,64

Пробуждение (25°С) 1 6,091 ± 1,02* 4,131 ±0,72

Активность (37°С 25,494 ±6,77** 6,524 ±1,84

Различия достоверны по сравнению: *с состоянием спячки, ** с состоянием пробуждения (р<0,05)

Ингибиторный анализ показал, что в митохондриях печени, константа ингибирования зависит от физиологического состояния животных. При выходе сусликов из состояния спячки транспорт К+ становится более чувствительным к

АТФ, о чем свидетельствует уменьшение константы ингибирования в 1,5 раза. По достижении активного состояния Кщ увеличивается в 4-4,5 раз по сравнению с состоянием пробуждения. Для митохондрий сердца, напротив, характерно отсутствие существенных изменений Кш для АТФ при смене физиологических состояний у животных.

Следовательно, можно сделать вывод, что при переходе сусликов из одного физиологического состояния в другое в митохондриях печени происходит изменение сродства митоКАТФ канала к регуляторам, вероятно, из-за изменений в его структуре, в то время как в митохондриях сердца этого не наблюдается. Изменения в структуре канала могут быть обусловлены различной степенью окисления вН-групп белка-канала при смене метаболических состояний, что существенно влияет на функционирование митоКАТФ [О^опеу й а1., 1999]. Отсутствие существенных изменений величины К[д в митохондриях сердца может быть связано с постоянной, хоть и менее активной во время спячки, сократительной работой сердца.

ВЫВОДЫ.

1. Показано что УМФ крови может быть источником образования в клетках миокарда метаболического активатора митоКатф канала -УДФ;

2. На модели острого инфаркта миокарда у крыс установлено, что внутривенное введение УМФ приводит к предупреждению распада макроэргических соединений (АТФ и креатинфосфата), а также гликогена в ишемизированном миокарде, за счёт активации митоКатф канала;

3. Показано, что активация митоКАТФ канала устраняет нарушения окислительно-восстановительных процессов в миокарде, наблюдаемые при ишемии, что лежит в основе предлагаемого в работе механизма кардиопротекторнош действия активаторов канала;

4. На модели ишемия-реперфузия, также как и на модели острой ишемии, при активации митоКАХФ канала наблюдается выраженный кардиопротекторный эффект, заключающийся в снижении зоны некроза миокарда;

5. Обнаружено, что антигипоксический флавоноид-содержащий препарат растительного происхождения активирует митоКАТф канал как в эксперименте in vitro, так и in vivo приводя, в условиях целого организма, к значительному повышению общей толерантности организма к гипоксии;

6. Установлено, что активность митоКдтф канала значительно снижается по старения животных, что частично связано с нарушишем регуляции и экспрессии белка-канала;

7. Показана значительная активация митоКАТФ канала при выходе животных из состояния спячки, частично связанная с изменением регуляции белка-канала в митохондриях, что может играть важную роль в повышении теплообразования в этом состоянии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи

1. I.B. Krilova, E.V. Kachaeva, О.М. Rodionova, А.Е. Negoda, N. Evdokimova, M.I. Balina, N.S.Sapronov, G.D. Mironova; The cardioprotective effect of uridine and uridine-5'-monophosphate: The role of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel. Experimental Gerontology, 2006,41(7): 697-703;

2. Миронова Г.Д., Качаева E.B., Калина М.И., Крылова И.Б., Родионова О.М., Евдокимова Н.Р., Сапронов Н.С. Митохондриальный АТФ - чувствительный калиевый канал. II. Роль канала в защите сердца от ишемии, Вестник Российской АМН, 2007, №2, с. 34-43;

3. Г.Д. Миронова, М. И. Шигаева. Н.В. Белослудцева, Е.Н. Гриценко, К.Н. Белослудцев, Э.Л. Германова, Л.Д. Лукьянова Влияние некоторых флавоноидсодержащих препаратов растительного происхождения на активность митохондриального АТФ-зависимого калиевого капала. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2008, Лг° 8, стр. 96-100;

4. Шигаева М.И.. Гриценко Е.Н., Мурзаева С.В., Горбачева О.С., Таланов ЕЛО., Миронова Г.Д. Возрастные изменения Функционирования митохондриальной системы транспорта калия. Биофизика, 2010, № 5, с.1030-1037;

5. G.D. Mironova, МЛ. Shigaeva. E.N. Gritsenko, S.V. Murzaeva, O.S. Gorbacheva, E.L. Germanova, L.D. Lukyanova; Functioning of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel in rats varying in their resistance to hypoxia. Involvement of the channel in the process of animal's adaptation to hypoxia. J. of Bioenergetics and Biomembranes, 2010, V. 42, № 6, pp 492-503;

6. Миронова Г.Д., Шигаева М.И.. Гриценко E.H., Мурзаева С.В., Германова Э.Л., Горбачёва О.С., Лукьянова Л.Д. Особенности работы митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала у животных с различной толерантностью к гипоксии до и после курсовой гипоксической тренировки. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, принята в печать.

Тезисы конференций

1. Качаева Е.В., Балина М.И., Негода А.Е., Миронова Г.Д. Возрастные изменения активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала сердца крыс. //Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2005, стр. 245-247;

2. Негода А.Е., Качаева Е.В., Крылова И.Б., Балина М.И.. Родионова О.М., Сапронов Н.С., Миронова Г.Д. Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал: структурная организация и роль в кардиопротекции. //Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2005, стр. 268-270;

3. Качаева Е.В., Балина М.И., Негода А.Е. Изменение активности митохондриального ЛТФ-чувствительного калиевого канала в зависимости от метаболического состояния животных. II 9-я Пущинская школа- конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века», 2005, стр. 70;

4. Belosludtsev K.N., Kopylov А.Т., Balina M.I.. Belosludtseva N.V., Lukyanova L.D., Mironova G.D. Effect of flavonoid-containing preparations from plants on ATP-dependent potassium channel and Ca2+-activated pores in mitochondria. VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM), 2006, p.178;

5. Шигаева М.И.. Кузичкин Д.С. Роль митохондриальной системы переноса К+ в адаптации к гипоксии. // 10-я всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей « Человек и его здоровье», 2007, с 224225;

6. Шигаева М.И. Возрастные изменения функционирования митохондриальной системы транспорта калия. // 10-я всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье», 2007, стр. 519520;

7. Belosludtsev K.N., Gritscnko E.N., Belosludtseva N.V.. Shigaeva M.I.. Lukyanova L.D., Mironova G.D. The mitochondrial ATP-dependent K+ channel and palmitate/Ca2+-activated pore in adaptation of animals to hypoxia. // 32th FEBS Congress (Austria), 2007, p.124;

8. Шигаева М.И.. Белослудцева H.B., Белослудцев K.H., Чернохвостое Ю.В., Миронова Г.Д. Возрастные изменения в функционировании митохондриального А'ГФ-зависимого калиевого канала и пальмитат/Са2+-активируемой поры. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2007,стр. 202-204;

9. Белослудцев К.Н., Гриценко Е.Н., Белослудцева Н.В., Шигаева М.И.. Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д. Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал и резистентность животных к гипоксии. // XX Съезд Физиологического Общества им. И.П. Павлова, 2007, стр. 17;

Ю.Гриценко Е.Н., Шигаева М.И., Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В.,.Тихонов В.П., Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д.. Влияние препаратов курильского чая на и чая «Амла» на АТФ-зависимый калиевый канал и Са2+-активируемые поры в митохондриях. II XX Съезд Физиологического Общества им. И.П. Павлова, 2007, стр. 203;

11 .Шигаева М.И.. Гриценко Е.Н., Белослудцева Н.В., Белослудцев К.Н., Чернохвостов Ю.В., Кузичкин Д.С., Миронова Г.Д. Роль митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала в адаптации к гипоксии. // 5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», 2007, стр.93;

12.Shigaeva M.I., Chernochvostov Y.V., Gritsenko E.N., Murzaeva S.V., Mironova G.D. Age-related changes in functioning of mitochondrial K+-transport system. // Biological motility: achievements and perspectives, 2008, p.178-181;

13.Лежнев Э.И., Шигаева M. И.. Белослудцева Н.В., Гриценко Е.Н. Белослудцев К.Н., Германова Э.Л., Лукьянова Л.Д., Миронова, Г.Д. Активация митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала

флавоноидсодержащими препаратами. // «Высокогорная гипоксия и геном» п.Терскол, 2008, стр. 74;

14.Шигаева М.И., Гриценко Е.Н, Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д. Механизм адаптации животных к гипоксии связанный с активацией рециклизации калия в митохондриальной мембране, 5-ая Всероссийская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», 2008, стр. 95;

15.Миронова Г.Д., Шигаева М.И.. Гриценко E.H., Недорубов A.A., Белослудцев К.Н., Мурзаева C.B., Лукьянова Л.Д. Механизмы адаптации организма к гипоксии, опосредованные активацией митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2009,стр. 523-527;

16ЛНигаева М.И.. Гриценко Е.Н, Павлик ЛЛ., Недорубов A.A., Мошков Д.А., Миронова Г.Д. Изучение структуры и локализации белка 57 кДа и доказательство его принадлежности к системе АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2009,стр. 638-642;

17.Шигаева М.И. Роль митохондриальной системы АТФ-зависимого транспорта калия в процессе старения и адаптации организма к гипоксии. // Сборник работ молодых ученых ИТЭБ РАН, 2009;

18.Недорубов A.A., Гриценко Е.Н, Павлик ЛЛ., Шигаева М.И., Мошков Д.А., Миронова Г.Д. Выявление общности в структуре канальных субъединиц цитоплазматического и митохондриального АТФ-зависимых калиевых каналов. //IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», г. Казань, 2009, стр. 362;

19.Shieaeva M.I.. Bulion V.V., Krylova I.B., Seiina E.N., Sapronov N.S., Gritsenko E.N., Gorbatcheva O.S., Mironova G.D. Involvement of mitochondrial ATP-dependent potassium channel in the regulation of oxidative processes in ischemic myocardium, age changes in channel activity. // Biological motility: achievements and perspectives, 2010, p.244-247;

20.Шигаева М.И.. Миронова Г.Д. Предполагаемый механизм кардиопротекторного действия активации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала в условиях ишемии. //Сборник работ молодых ученых ИТЭБ РАН, 2010

Подписано в печать:

16.11.2010

Заказ № 4540 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шигаева, Мария Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Системы транспорта калия в митохондриях.

1.1. Митохондриальный цикл калия.

1.2. Система входа калия в митохондрии.

1.3. Система выхода калия из митохондрий.

1.4. Физиологическое значение транспорта К+ в митохондриях.

2. Биофизические свойства митоКдтф.

2.1. Проводимость одиночного митоКдтф канала и их кластеризация.

2.2. Селективность и потенциалзависимость митоКатф.

3. Структурная организация митохондриального и цитоплазма-тического КАТф каналов.

3.1. Структурная организация цитоКдтф.

3.2. Структурная организация митоКАТФ.

4. Регуляция митоКдтф канала.

4.1. Метаболические модуляторы митоКатф канала.

4.1.1. Регуляция дифосфонуклеотидами.

4.1.2. Гормонал ъная регуля ция м ит оКа тф.

4.1.3. Регуляция митоК^гФ жирными кислотами.

4.2. Фармакологические модуляторы митоКатф канала.

4.3. Регуляция Катф каналов редокс-агентами.

5. Роль митоКдтф в кардиопротекции.

5.1. Роль митоКАтфВ адаптации организма к гипоксии.

5.2. Возможные механизмы защиты сердца при гипоксии, опосредованные активацией митоКАТФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Моделирование острой ишемии и ишемии-реперфузии миокарда.

1.1. Моделировние острой экспериментальной ишемии миокарда.

1.2. Анализ электрокардиограмм.

1.3. Внутривенное введение животным модуляторов митоК^тФ.-.

1.4. Моделирование ишемии-реперфузии миокарда.

1.5. Определение зоны риска и зоны некроза миокарда методом двойного окрашивания.

2. НРЬС-анализ содержания уридиновых и адениновых нуклеотидов в ткани миокарда.

2.1 Приготовление проб ткани миокарда для НРЬС.

2.2. НРЬС-анализ содержания в пробе уридиновых и адениновых нуклеотидов.

3. Определение показателей энергетического обмена в ткани миокарда.

3.1. Определение уровня креатинфосфата в ткани миокарда.

3.2. Определение уровня гликогена в ткани миокарда.

3.3. Определение уровня лактата в ткани миокарда.

4. Определение показателей перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты в ткани миокарда.

4.1. Определение уровня гидроперекисей липидов.

4.2. Определение активности супероксиддисмутазы.

4.3. Определение уровня восстановленного глутатиона.

5. Выделение митохондрий из ткани сердца.

6. Выделение митохондрий из ткани печени.

7. Выделение и очистка К+-транспортирующего белка м.м. -55 кДа из митохондрий печени крыс.

8. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле.

9. Нативный электрофорез и электроэлюция белка с геля.

10. Реконструкция К+-транспортирующего белка м.м. 55 кДа в БЛМ.

11. Вестерн-блот анализ.

12. Получение и очистка антител к митохондриальному ¡^-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа.

12.1. Иммунизация животных.

12.2. Очистка антител.

13. Непрямой дот-анализ титра антител.

14. Полярографическое определение параметров дыхания митохондрий.

15. Изучение энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии.

16. Исследование АТФ-зависимого ДНФ-индуцированного выхода К+ из митохондрий при помощи К+-селективного электрода.

17. Определение количества К+ в митохондриях.

18. Тестирование устойчивости животных к гипоксии.

19. Определение времени жизни и времени потери позы у животных в экспериментах in vivo.

20. Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Изучение механизмов кардиопротекторного действия активации митохондриального АТФ - зависимого калиевого канала на модели острой ишемии и ишемии-реперфузии миокарда.

1.1. Изменение уровня уридиновых нуклеотидов в плазме крови и ткани миокарда в условиях нормоксии.и острой ишемии.

1.2. Энергетический баланс и окислительные процессы при острой ишемии миокарда и их коррекция в результате активации митоКдтф.

1.2.1. Влияние активации митоКАТФ на энергетический статус ткани миокарда в условиях нормоксии и острой ишемии.

1.2.2. Влияние активации митоКАТФ канала на показатели системы антиокислительной защиты организма и перекисного окисления липидов при острой ишемии миокарда.

1.3. Антиишемический эффект активации митоКдтф на модели ишемии-репепрфузии миокарда.

1.4. Предполагаемый механизм антиишемического действия УМФ.

Глава 2. Адаптогенная роль митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала в формировании долгосрочной устойчивости организма к гипоксии.

2.1. Активация митоКАТФ в суспензии митохондрий печени и сердца флавоноидсодержащими препаратами, обладающими антигипоксическими свойсвами.

2.2. Исследование роли митоКдтф канала в формировании резистентности организма к гипоксии в условиях in vivo.

Глава 3. Функционирование митохондриальной системы транспорта калия при старении организма.

3.1. Возрастные изменения дыхания митохондрий.

3.1.1. Возрастные изменения дыхания митохондрий печени.

3.1.2. Возрастные изменения дыхания митохондрий сердца.

3.2. Возрастные изменения количества и скорости транспорта К+ в митохондриях печени и сердца.

3.3. Регуляция системы АТФ-зависимого входа К+ в митохондриях животных разного возраста.

3.3. Полуколичественный анализ белка, являющегося канальной субъединицей митоКдтф, в митохондриях печени и сердца крыс разного возраста.

Глава 4. Функционирование митоКдтф канала у гибернирующих животных в различных физиологических состояниях (спячка, пробуждение, летняя активность).

4.1. Параметры дыхания митохондрий печени и сердца сусликов, находящихся в различных физиологических состояниях.

4.1.1. Изменение дыхания митохондрий печени при смене метаболического состояния.

4.1.2. Изменение дыхания митохондрий сердца при смене метаболического состояния.

4.2. Изменение скорости АТФ-зависимого транспорта калия и его количества в митохондриях сердца и печени при смене метаболических состояний животного.

4.3. Регуляция митохондриального транспорта калия при помощи АТФ у животных, находящихся в различных метаболических состояниях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функционирование митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала при различных физиологических и патологических состояниях"

Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал (митоКдгф), осуществляющий вход калия в митохондрии, был обнаружен относительно недавно методом пэтч-кламп во внутренней мембране митохондрий [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой из внутренней мембраны митохондрий был выделен белок м.м. ~60 кДа, обладающий свойствами данного канала [Миронова и др., 1981], и при реконструкции в БЛМ ингибируемый физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996

I)]

В настоящее время к этому каналу привлечено внимание большого числа исследователей, как в области биоэнергетики, так и медицины, поскольку почти сразу после его обнаружения в клетке было установлено, что он играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [McCullough et al., 1991; Gross G. et al., 1992; Grover et al., 1994; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. В частности, было показано, что введение животным фармакологических активаторов митоКатф непосредственно перед продолжительной ишемией оказывает эффект, подобный ишемическому прекондиционированию, т.е. приводит к положительным экспериментальным и клиническим результатам, таким как сокращение зоны инфаркта и восстановление ритма сердца, тогда как введение ингибитора канала предотвращало ишемическую прекондицию [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Tsai et al., 2002; Krylova et al, 2006]. Однако, механизм такой кардиопротекции до сих пор не вполне понятен и требует изучения.

Биофизические свойства данного канала и его физиологическая роль в настоящее время достаточно хорошо исследованы [Inoue et al., 1991; Миронова и др., 1996 (I, И); Garlid et al., 1997; Grigoriev et al., 1999; Mironova et al., 1999; 2004]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоКдтф, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Показано, что ряд гормонов могут активировать этот канал [Tsai et al., 2002; Er et al., 2004; Nishida et al., 2009]. Ведется поиск других эффективных метаболических активаторов митоКЛГФ, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать, и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Недавно в нашей лаборатории был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКдтф - уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004] и показано эффективное антиишемическое и антиаритмическое действие его предшественников - уридина и уридин-5 монофосфата (УМФ) на модели острого инфаркта миокарда у крыс [Krylova et al., 2006]. Известно, что уридин, в отличие от самого УДФ, проникает в клетку [Matsushita et at., 1970]. Кроме того, в нашей же лаборатории было обнаружено, что при стимуляции работы митоКдтф активируется и система выхода калия из митохондрий в обмен на протон [Mironova 2007]. На основании выше указанных данных, было сделано предположение, что результатом активации рециклизации калия в митохондриях может быть снижение интенсивности окислительного стресса и, как следствие, восстановление энергетического баланса в ишемизированном миокарде.

По данным ряда исследователей [Ferranti R. et al, 2003; Garlid et al., 2003], митоКАТФ может регулировать продукцию активных форм кислорода, генерация которых существенно возрастает как при ишемии, так и в процессе старения организма. Поскольку при старении увеличивается риск возникновения ишемических повреждений тканей, можно предположить наличие возрастных изменений в функционировании митоКдтф канала. Выявление этих изменений позволит осуществить коррекцию используемых методов кардиопротекции, а также предложить новые пути лечения сердечно-сосудистых заболеваний и ишемических повреждение различных тканей.

Ранее было показано, что усиление процесса транспорта катионов и, в частности, калия в митохондриях имеет первостепенное значение для поддержания теплообразования в некоторых тканях гибернирующих животных, обеспечивая интенсивный несократительный термогенез при пробуждении в условиях неактивной митохондриальной АТФ-синтетазы при низких температурах тела (2-25°С) [Миронова и др., 1986]. Изучение особенностей АТФ-зависимого транспорта К+ у гибернирующих животных, находящихся в различных физиологических состояниях, начатое ранее в нашей лаборатории Федотчевой Н.И. [Fedotcheva et al., 1985], позволит лучше понять механизмы несократительного термогенеза при разогреве зимоспящих животных от критически низких температур до температуры тела.

В связи с вышеуказанным, в настоящей работе был исследован механизм кардиопротекторного действия физиологического активатора канала - уридин-5'-дифосфата при ишемии миокарда. Также изучены особенности функционирования митоКатф при некоторых физиологических и метаболических состояниях организма и его роль в повышении общей долгосрочной толерантности организма к гипоксическим условиям и процессе терморегуляции.

Цель работы: изучить механизм кардиопротекторного действия активаторов митоКатф при ишемии, а также функциональную роль канала при ряде патологических и физиологических состояний организма, в частности при старении и в терморегуляции организма.

В соответствии с целью работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Изучить влияние активатора митоКЛТф канала на энергетический обмен миокарда и систему антиоксидантной защиты в условиях нормоксии и острой ишемии на модели острой ишемии миокарда;

2) На модели «ишемия-реперфузия» миокарда исследовать, влияние активатора митоКатф на снижение зоны инфаркта, подобрав при этом оптимальную схему его введения;

3) В экспериментах in vitro и in vivo показать адаптогенный эффект активации митоКдтф в формировании долгосрочной устойчивости организма к гипоксическим условиям;

4) Выявить изменения функционирования митоКатф канала при старении организма;

5) На модели гибернирующих сусликов исследовать роль митоКатф канала в механизме несократительного термогенеза.

Новизна исследования. Впервые обнаружено, что активация митоКатф его природным активатором в условиях ишемии миокарда способствует сохранению энергетического и антиокислительного статуса миокарда. Предположено, что эти свойства канала могут лежать в основе механизма, опосредующего кардиопротекторный эффект активации митоКдтф при инфаркте миокарда. Впервые установлено антиишемическое действие метаболической активации канала на модели ишемии-реперфузии миокарда, при этом подобрана наиболее эффективная схема введения препарата. В экспериментах как in vitro, так и in vivo, впервые показан адаптогенный эффект активации митоКАТФ растительным антигипоксическим препаратом флавоноидного ряда. В данной работе впервые обнаружено снижение функционирования митоКАТф канала в митохондриях печени и сердца крыс в процессе старения организма. Также впервые показана активация цикла калия в митохондриях сердца при выходе гибернирующих животных из спячки.

Научно-практическое значение работы. Предложенный в работе механизм защитного влияния активации митоКдтф при ишемии и ишемии-реперфузии может служить основой для разработки средств профилактики и лечения ишемических повреждений миокарда. Предшественники метаболического активатора митоКАТФ, использованные в работе - уридин и уридин-5'-монофосфат, могут быть использованы для создания новых эффективных антиишемических лекарственных препаратов, действие которых опосредуется активацией митоКАтФ. Показанный в работе адаптогенный эффект активатора канала растительного происхождения открывает перспективу его использования для формирования долгосрочной толерантности организма к гипоксическим условиям. Выявленное в работе снижение функционирования митоКдтф с возрастом также позволит более четко разработать методы профилактики и, возможно, лечения ишемических повреждений миокарда. Обнаруженные изменения в функционировании канала у гибернирующих животных, находящихся в различных физиологических состояниях, помогут лучше понять механизмы несократительного термогенеза у теплокровных животных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шигаева, Мария Ивановна

выводы.

1. Показано что УМФ крови может быть источником образования в клетках миокарда метаболического активатора митоКАТф канала -УДФ;

2. На модели острого инфаркта миокарда у крыс установлено, что внутривенное введение УМФ приводит к предупреждению распада макроэргических соединений (АТФ и креатинфосфата), а также гликогена в ишемизированном миокарде, за счёт активации митоКАТФ канала;

3. Показано, что активация митоКАТФ канала устраняет нарушения окислительно-восстановительных процессов в миокарде, наблюдаемые при ишемии, что лежит в основе предлагаемого в работе механизма кардиопротекторного действия активаторов канала;

4. На модели ишемия-реперфузия, также как и на модели острой ишемии, при активации митоКАТФ канала наблюдается выраженный кардиопротекторный эффект, заключающийся в снижении зоны некроза миокарда;

5. Обнаружено, что антигипоксический флавоноид-содержащий препарат растительного происхождения активирует митоКАТФ канал как в эксперименте in vitro, так и in vivo приводя, в условиях целого организма, к значительному повышению общей толерантности организма к гипоксии;

6. Установлено, что активность митоКАтФ канала значительно снижается по старения животных, что частично связано с нарушением регуляции и экспрессии белка-канала;

7. Показана значительная активация митоКАТФ канала при выходе животных из состояния спячки, частично связанная с изменением регуляции белка-канала в митохондриях, что может играть важную роль в повышении теплообразования в этом состоянии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе были исследованы особенности функционирования митоКдтф при разных метаболических (старение, гибернация) и патологических (острая ишемия, ишемия-реперфузия) состояниях организма.

Ранее в нашей лаборатории был обнаружен метаболический активатор митоКатф - уридин-5'-дифосфат (УДФ), который, однако, не способен транспортироваться в клетку через клеточную мембрану из плазмы крови. Из литературы было известно, что один из предшественников УДФ - уридин способен свободно проникать в клетку [Matsushita et al., 1970], однако в отношении УМФ такой способности ранее показано не было.

В данной работе показано увеличение пула уридиновых нуклеотидов в миокарде при внутривенном введении УМФ. В состоянии острой ишемии, по сравнению с состоянием нормоксии этот пул увеличивается, особенно за счет фракции УДФ, который, как сказано выше, является активатором митоКЛТФ. Активация же митоКЛТФ при введении УМФ, как было нами показано ранее [Krylova et al., 2006], имеет ярко выраженный кардиопротекторный эффект, который заключается в уменьшении индекса ишемической альтеррации миокарда и нормализации ритма. Однако механизм, посредством которого активация митоКЛТФ приводит к защите миокарда от ишемических повреждений, был не вполне понятен.

Известно, что одним из негативных последствий ишемии миокарда является существенное падение уровня макроэргов в клетке, в частности АТФ и креатинфосфата. В результате проведенных исследований было выяснено, что предварительное введение животным УМФ за 5 минут до окклюзии ЛКА, способствующего активации митоКАТФ, приводило к восстановлению количества креатинфосфата и АТФ в ишемизированном миокарде до уровня контроля. При введении препарата УМФ на фоне селективного ингибитора митоКдтф - 5-гидроксидеканоата уровень обоих макроэргов в миокарде снижался до величин, наблюдаемых в условиях острой ишемии. Следовательно, активация митоКатф в кардиомиоцитах в условиях ишемии оказывает выраженное энергосберегающее действие.

Одним из способов активации энергетического обмена в ишемизированной ткани является поддержание субстратного обеспечения гликолиза, который играет важную роль в образовании макроэргических соединений в кардиомиоцитах. В условиях ишемии запасы субстратов гликолиза (глюкозы и гликогена) быстро истощаются. Проведенные исследования показали, что при введении УМФ происходит нормализация содержания гликогена в миокарде, однако ингибитор митоКдтф - 5-ГД практически не обращает этот эффект, свидетельствуя об отсутствии влияния активации митоКАТФ канала на этот процесс. По всей видимости, это происходит за счет увеличения в клетке, при введении животным УМФ, УДФ-глюкозы, используемой для синтеза гликогена.

При ишемии, помимо снижения в миокарде количества макроэргов и субстратов гликолиза и окислительного фосфорилирования, увеличивается интенсивность окислительного стресса, которая выражается усилением перекисного окисления липидов, снижением активности глутатионовой системы и ферментов, утилизирующих образовавшиеся АФК. Профилактическое введение УМФ, приводящее к активации митоКдтф канала, снижало уровень ГПЛ до уровня контрольных животных, предотвращало падение.уровня ВГ в миокарде в условиях ишемии и способствовало сохранению на, прежнем уровне активности СОД. Эти положительные эффекты УМФ полностью устранялись ингибитором митоКАТФ 5-ГД, что свидетельствует о сохранении равновесия процессов ПОЛ и активности антиоксидантной системы именно на фоне активации митоКЛТФ.

Механизм действия' УМФ - предшественника активатора митоКАТФ (УДФ), может быть связан с активацией всего цикла калия в митохондриях, работа которого приводит к слабому разобщению и, как следствие, предупреждает образование в митохондриях АФК. Это, в свою очередь, может предупреждать увеличение ГПЛ, восстановление глутатиона и падение активности антиоксидантных ферментов, наблюдаемые при ишемии без введения препарата.

На модели ишемии-реперфузии также было показано, что УМФ обладает кардиопротекторным эффектом УМФ. Он заключается в снижении зоны некроза миокарда, наиболее выраженном при двукратном введении препаратов: за 30 мин до окклюзии ЛЕСА и за 5 мин до реперфузии. Этот эффект может быть связан с увеличением суммарной дозы препарата или с предварительной инициацией эндогенных защитных механизмов. При этом ведущую роль в реализации антиишемичеекого действия УМФ играют митоКдтф - каналы, о чем свидетельствует отсутствие эффекта препарата при их введении на фоне селективного ингибитора 5-ГД.

Полученные в работе данные о снижении интенсивности окислительного1 стресса в условиях ишемии и сохранении высокого уровня макроэргических соединений в клетке, свидетельствуют в пользу развиваемого в лаборатории представления о механизмах кардиопротекторного действия митоКдтф- Согласно нашим представлениям, введенный УМФ проникает через клеточную мембрану и фосфорилируется в клетке до УДФ, повышая его концентрацию. УДФ, будучи природным активатором митоКЛТФ [Mironova et al., 2004], приводит к его активации в миокарде. Активация! входа1 К+ в митохондрии сопровождается его выходом в обмен на Н+, то есть, активацией К+/Н+-обмена в митохондриях [Schonfeld et al., 2003; Schalbuyeva.et al., 2006; Mironova et al., 2010]! Активация же цикла K+ в митохондриях приводит к их разобщению,, что сопровождается снижением скорости образования, активных форм кислорода [Korshunov et' al., 1997]. Снижение генерации^ АФК предупреждает окисление белков И' липидов мембран, наблюдаемое при глубокой', гипоксии и, приводящее к некрозу ткани [Griffits & Halestrap 1995]; а также предупреждает образование в митохондриях митохондриальной. Са2+-активируемой GsA-чувствительной поры, открытие которой также ведет к некрозу ткани [Crompton 1999, Kowaltovsky et al., 1998, 2001].

В экспериментах in vitro и in vivo, с использованием антигипоксических флавоноидсодержащих препаратов, было показано, что активация этими препаратами митоКдтф канала способствует увеличению долгосрочной общей толерантности организма к экстремальным гипоксическим условиям, что выражалось существенным увеличением времени потери позы и времени жизни животных на критической высоте. Таким образом, был сделан вывод, что активация канала в субкритических условиях оказывает адаптогенный эффект.

При исследовании возрастных изменений функционирования митоКдтф было показано значительное снижение активности канала по мере старения животных. В" совокупности с данными об уменьшении количества К+ в митохондриях печени и сердца старых животных это может свидетельствовать о снижении активности всего митохондриального цикла К+ при старении. Обусловлено это, как показано в работе, как некоторым снижением экспрессии митоКлтф в клетках при старении животных, так и изменениями его чувствительности к регуляторам. Транспорт К+ в митохондриях сердца при старении организма становится менее чувствительным к АТФ и, возможно, к другим регуляторам, по сравнению с митохондриями печени, что может иметь адаптивное значение в связи с необходимостью постоянной сократительной работы сердца, вне зависимости от внешних условий.

Усиление транспорта калия в митохондриях печени и сердца способствует активации термогенеза при выходе гибернирующих животных из состояния спячки, а величина активности митоКдтф коррелирует с изменениями температуры тела у гибернирующих животных. В состоянии глубокой спячки, когда все обменные процессы в организме заторможены, активность митоКдтф также очень низка, однако резко повышается во время пробуждения, когда необходим быстрый разогрев животного. Это может приводить к локальному падению- мембранного потенциала и в результате к легкому разобщению дыхательной цепи, что в свою очередь приводит к усилению теплообразования. Т.о., активация митоКдтф может являться основным механизмом, запускающим несократительный термогенез.

Таким образом, можно заключить, что активация митоКАТФ способствует защите сердца от гипоксии, предупреждает развитие ишемических повреждений миокарда, в том числе при старении, а также является важным звеном в прцессе несократительного термогенеза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шигаева, Мария Ивановна, Пущино

1. Бакеева Л.Е., Брустовецкий H.H. Межмитохондриальные септированные контакты в клетках печени суслика Citelius undulates при зимней спячке.// Биол: Мембр. 1993, 13(1): 36-43.

2. Иванов К.П. Современная теория терморегуляции и зимняя спячка. // Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. 1986, с. 49-54.

3. Качаева Е.В. Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии. Кандидатская диссертация. Пущино, 2007.

4. Кондрашова М.Н., Ахмеров Р.Н., Григоренко Е.В., Федотчева Н.И., Миронова Г.Д. Торможение окисления янтарной кислоты как причина снижения теплопродукции при спячке. // Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. 1986, с. 55-60.

5. Ленинджер А. Митохондрии. М., «Мир», 1966.

6. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. М., «Мир», 1974.

7. Лукьянова Л.Д., Германова Э.Л., Лыско А.И. Энерготропное, антигипоксическое и антиоксидантное действие флавоноидов1. // Вестник РАМН. 2007. №2. С.55-62.

8. Методы биохимических исследований. Под ред. М.И.Прохоровой.- • Л.:Изд-во Ленингр.Университета, 1982.

9. Миронова Г.Д., Федотчева Н.И., Макаров П.Р., Проневич Л.А., Миронов Г.П. Белок из митохондрий сердца быка, инициирующий канальную калиевую проводимость бислойных липидных мембран. // Биофизика. 1981, 26(3): 451-457.

10. Миронова Г.Д. Катион-транспортирующие белки митохондриальной и цитоплазматической мембран. Диссертация доктора биологических наук. 1985, 270с.

11. Миронова Г.Д., Маслова Г.М., Федотчева Н.И., Миронов Г.П. Участие мтиохондриальных систем транспорта в термогенезе теплокровных животных. // В сб. Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. Л.: Наука. 1986, с.64-68.

12. Миронова Г.Д., Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю., Кондрашова М.Н. Транспорт калия и дыхание митохондрий при выходе суслика из состояния зимней спячки. // Механизмы зимней спячки. Пущино, 1987, с. 39-47.

13. Миронова Г.Д., Федотчева Н.И., Скарга Ю.Ю., Копецки Я., Хоуштек И. Сравнительный анализ термогенных систем митохондрий печени и бурой жировой ткани. // Механизмы природных гипометаболических состояний. Пущино, 1991, с. 34-43.л

14. Миронова Г.Д., Скарга Ю.Ю., Григорьев С.М., Яров-Яровой В.М., Александров А.В., Коломыткин О.В. АТФ-зависимый калиевый канал митохондрий печени крысы. I. Выделение, очистка и реконструкция канала в БЛМ.//Биол. Мембр. 1996, т. 13, № 4, с.396-404.

15. Миронова Г.Д., Григорьев С.М., СкаргаЮ.Ю., Негода А.Е., Коломыткин О.В. АТФ-зависимый калиевый канал митохондрий печени крысы. II. Ингибиторный анализ, кластеризация канала. 1996, т. 13, № 5,с. 537-544.

16. Миронова Г.Д., Качаева Е.В., Копылов А.Т. Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал I. Структура канала, механизмы его функционирования и регуляции. Вестник Российской АМН, 2007, №2, с 24-33.

17. Миронова Г.Д., Качаева Е.В., Балина М.И., Крылова И.Б., Родионова О.М., Евдокимова Н.Р., Сапронов Н.С. Митохондриальный АТФ -чувствительный калиевый канал. II. Роль канала в защите сердца от ишемии, Вестник Российской АМН, 2007, №2, с. 34-43;

18. Негода А.Е. Механизм функционирования и регуляция митохондриального КАТФ канала. // Диссертация кандидата биологических наук. 2001, 120с.

19. Негода А.Е., Качаева Е.В., Миронова Г.Д., Чайлахян Л.М. Механизм регуляции митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала адениновыми нуклеотидами. // Доклады Академии Наук, 2005, т.400, №1, с. 1-4.

20. Петрищев Н.Н., Шляхто Е.В., Власов Т.Д., Галагудза М.М. Ишемическая адаптация миокарда: патофизиологические механизмы и возможные перспективы практического применения. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2001; 87(5): 688-705.

21. Скарга Ю.Ю. Система электрогенного транспорта ионов калия в митохондриях и ее участие в термогенезе бурой жировой ткани . // Дисс.Канд.биол.наук.1994, с. 101.

22. Федотчева Н.И., Мирзабеков Т.А., Миронов Г.П., Миронова Г.Д. Изменения транспорта калия в митохондриях печени сусликов при зимней спячке. // Укр.Биохим.Журн. 1984, 54(2): 190-193.

23. Федотчева Н.И. Система транспорта ионов К+ в митохондриях и ее функционирование в гипометаболических состояниях. Дисс.Канд.биол.наук.1989, с. 139.

24. Шортанова Т.Х., Шугалей В.С., Головина Т:Н. Особенности регуляции метаболизма у зимнеспящих. // Эволюционные аспекты гипобиоза и зимней спячки. 1986, с. 40-43.

25. Aguillar-Bryan L., Nichols С., Wechesler S., Clement J., Boyd A., Gonzales G., Herrera-Sosa H., Nguy K., Nelson D. Cloning of the b-cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin secretion. // Science. 1995, 268: 423-426.28