Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование нуклеотидсвязывающих центров митохондриальной F1-АТФ-АЗЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вульфсон, Евгений Наумович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. СТРОЕНИЕ Г-рАТФ-азы

1.1, Молекулярный вес и субъединичный состав ?1-АТФ-азы.

1.2, Стехиометрия субъединиц в молекуле ^-АТФ-азы. II

1.3. функции скбъединиц ^-АТФ-азы.

1.4. Пространственная структура ^-АТФ-азы.

ГЛАВА 2. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ^-АТФ-азы

2.1. Общие каталитические свойства ?|-АТФ-азы

2.2. Связывание -Г-рАТФ-азой нуклеотидов и неорганического фосфата

2.3. Влияние АДФ на каталитические свойства -Г-рАТФ-азы.

2.4. Кооперативность взаимодействия между каталитическими центрами ^-АТФ-азы. Модель поочередно функционирующих каталитических центров

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Препаративные методы

1.2. Аналитические методы.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Прочное связывание адениновых и гуаниновых нуклеотидов митохондриальной ?^-АТФ-азой. Влияние связанных нуклеозиддифосфатов на каталитические свойства фермента.

2.2. Кооперативность в связывании АДФ и неорганического фосфата в каталитическом центре митохондриальной £|-АТФ-азы.

2.3. Взаимодействие митохондриальной ^-АТФ-азы с новым фотоактивируемым аналогом АТФ-3'-(,2' М2-нитро-4-азидобензоия)-аденозш-5~ трифосфатом. Локализация центра, осуществляющего одно-центровый катализ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование нуклеотидсвязывающих центров митохондриальной F1-АТФ-АЗЫ"

Система превращения энергии в сопрягающих мембранах митохондрий, хлоропластов и бактерии является одной из наиболее сложных ферментативных систем, известных в настоящее время. Она состоит из переносящих электроны комплексов ферментов дыхательной или фотосинтетической цепи и Н+-АТФ-азного комплекса. Энергия, освобождаемая в результате окисления субстратов дыхания или при фотосинтезе, аккумулируется в виде трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода (д^Н*) и используется затем Н?-АТФ-азой для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата / 1-3 /. В большинстве типов животных клеток и у многих видов бактерий более 80% необходимого для жизнедеятельности АТФ синтезируется этим путем / 4 /.

Однако при отсутствии доступных субстратов окисления или в анаэробных условиях (митохондрии и бактерии), а также в темноте (хлоропласта и фотосинтезирующие бактерии) Н+-АТФ-азный комплекс способен гидролизовать АТФ, что приводит к генерации л^Н? на сопрягающих мембранах / 4 /. Для ряда анаэробных бактерий, например ^ге^¿ос.ос.с.и.,5 ^схеса^/ез , гидролиз АТФ и сопряженная с ним генерация д |ч Н"!" является основной физиологической функцией Н*-АТФ-азы / 5 /. В этом случае гидролиз АТФ - практически единственный источник дучН*, необходимого для обратного переноса электронов, транспорта различных метаболитов, восстановления пиридиновых нуклеотидов, и, возможно, бактериального таксиса / 5,6 /. Таким образом, ясно, что независимо от направления катализируемой Н^-АТФ-азой реакции и природы сопрягающих мембран, этот фермент играет ключевую роль в энергетическом обмене клетки. Неудивительно, поэтому, что механизм функционирования и регуляции Н+-АТФ-азы является объектом всестороннего изучения многочисленных групп исследователей.

Исследования, проведенные в последние годы, подтвердили справедливость гипотезы Бойера и сотр. / 7,8 / об энергообеспечении реакции синтеза АТФ, осуществляемой Н+-АТФ-азным комплексом сопрягающих мембран. Согласно этой гипотезе, энергия необходима не для самой реакции образования АТФ из АДФ и неорганического фосфата в каталитическом центре Н+-АТ^азы, а лишь для освобождения б раствор вновь синтезированной молекулы АТФ / 7,8 /. Действительно Фельдману и Сигману удалось продемонстрировать синтез прочно-связанного с ферментом АТФ на препаратах Н+-АТФ-азного комплекса в условиях деэнергизации / 9 /. Гидролиз же АТФ, по мнению этих авторов / 9 /, а также Бойера и сотр. / 7,8 / представляет собой обращение соответствующих стадий АТФ-синтетазной реакции.

Н+-АТФ-азные комплексы сопрягающие мембран состоят из двух структурно и функционально отличных компонентов - так называемых факторов Р0 и / 10 /. Фактор 3?0 - нерастворимый в воде комплекс гидрофобных белков, формирующий протонпроводящий путь к (или от) фактора / II /. Фактор (растворимая ^-АТФ-аза), легко отделим от мембраны и фактора £0 и является собственно каталитическим компонентом Н+-АТ^-азного комплекса / 12 /. Растворимая АТФ-аза катализ1фует те же самые парциальные реакции синтеза АТФ, что и мембраносвязанные препараты Н+-АТФ-азы в отсутствии думН+ (см.обзоры / 13,14 /), а также синтез прочносвязанного АТФ из АДФ и неорганического фосфата / 15-17 /. Таким образом, ^-АТФ-аза представляется наиболее удобным объектом для исследования механизма кооперативных взаимодействий между каталитическими центрами фермента в процессе гидролиза (синтеза) АТФ.

Целью настоящей работы явилось исследование свойств нуклео-тидсвязывающих центров митохондриальной ?^-АТФ-азы. Показано, что адениновые и гуаниновые нуклеозиддифосфаты связываются в каталитических центрах нативной Г-рАТФ-азы, образуя в отсутствии АТФ или ГТФ прочные комплексы с ферментом. При связывании в одном из каталитических центров фермента АДФ, но не ГДФ,наблюдается ингиби-рование АТФ-азной активности.

Реактивация неактивного комплекса ^-АТФ-азы с АДФ может быть достигнута либо медленной АТФ (ГТФ)-зависимой диссоциацией АДФ, либо связыванием в каталитическом центре фермента I молекулы Фн в дополнение к АДФ. В то же время, необходимым условием для связывания ферментом Фн является наличие нуклеозиддифосфата САДФ или ГДФ) в одном из каталитических центров ^-АТФ-азы.

Переход из активного в неактивное состояние наблюдается также для З-^-АТФ-азы, лишенной прочносвязанных нуклеотидов, при одно-центровом гидролизе АТФ. Уменьшение начальной скорости АТФ-азной реакции в этом случае коррелирует с диссоциацией Фн из комплекса фермента с продуктами гидролиза АТФ. Обращение ингибирования также как и в случае нативного фермента достигается связыванием I молекулы неорганического фосфата на молекулу ?д--АТФ-азы.

Исследована локализация центра, осуществляющего одно-центро-вый катализ, при помощи нового фотоактивируемого аналога АТФ - 3-(2')-(2-нитро-4-азидобензоил)-аденозин-5/-трифосфата (НАБ-АТФ). Показано, что этот центр расположен на -субъединице фермента, как и каталитические центры, функционирующие при стационарном гидролизе АТФ, и, по-видимому, является одним из них.

Из полученных результатов следует, что нуклеозиддифосфаты и неорганический фосфат связываются как в каталитических, так и в некаталитических центрах фермента кооперативно, причем характер кооперативных взаимодействий нуклеотидсвязывающих центров определяется типом гетероциклического основания нуклеотида. Медленные переходы £]--АТФ-азы из активного в неактивное состояние контролируются типом связанного в каталитическом центре нуклеозиддифос-фата, а также связыванием другого продукта АТФ-азной реакции - Фн. На основании полученных данных предложена гипотеза о функциональной неоднородности центров прочного связывания нуклеотидов мито-хондриальной ^-АТФ-азой: один из "прочносвязанных" нуклеотидов локализован в каталитическом центре, а два других - в некаталитических центрах фермента.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. СТРУКТУРА Р-рАТФ-АЗЫ

1.1. Молекулярный вес и субъединичный состав Р|-АТФ-азы

Растворимая РрАТФ-аза была изолирована из большого количества различных биологических систем, и во всех случаях молекулярный вес целого фермента и составляющих его субъединиц оказывается очень близким. Так, молекулярный вес 5^-АТФ-азы определенный методами ультрацентрифугирования или гель-фильтрации варьирует для препаратов фермента из различных источников от 320 до 400 КДа (для обзора см./ 18-20 /), В действительности этот диапазон еще меньше, а наблюдаемые различия в величинах молекулярных весов объясняются не столько отличиями препаратов ^-АТФ-азы друг от друга, сколько экспериментальной ошибкой в определении молекулярного веса, обусловленной склонностью фермента к диссоциации на субъединицы на холоду / 21 /.

Значение молекулярного веса, принятое для митохондриальной Р^-АТФ-азы составляет примерно 360 КДа (см.табл.1Для хлоро-пластной Р^-АТФ-азы более достоверной величиной долгое время считалось 320 КДа / 22,23 /. Однако, методом ультрацентрифугирования в присутствии метанола в качестве стабилизирующего агента Иошида и др. / 24 / получили значение молекулярного веса 380 КДа. Еще большее значение - 400 КДа было получено в лаборатории Хаммеса / 25 /. Авторы пришли к выводу, что заниженные величины молекулярного веса, полученные в ранних работах обусловлены значительной примесью диссоциировавшего на субъединицы фермента в использованных препаратах. В диапазоне 360-380 КДа лежат и данные для наиболее изученных бактериальных -Г-рАТФ-аз: 360 КДа - для г ¡с/ч' а со// / 26 / и 380 КДа - для термофильной бактерии Р5 -3 / 24 /.

Методом гель-электрофореза препаратов З^-АТФ-азы в присутствии ДДС—N а обычно выявляется 5 хорошо различимых белковых полос (для обзора см. / 18-20,35 /), обозначаемых в порядке убывания молекулярного веса <¿,^3 , ^, сГ и £. Значения молекулярных весов этих субъединиц препаратов З^-АТФ-азы, выделенных из различных источников, лежат в следующих интервалах: - 53-62 КДа, р - 5057 КДа, % - 28-43 КДа, <Г - 12-21 КДа, 6 - 7,5-14 КДа / 18-20,35 /.

Таблица I

Молекулярный вес растворимой митохондриальной £т-АТФ-азы и ее субъединиц Молекулярный вес .килодальтоны 'Литературный митохондрий £т-АТФ--азы субъединицы источник оС / ! V 1 ! 6

Сердце быка 360 53 50! 25 12,5 7,5 / 18,27 /

Сердце быка 347 54 50 33 17 5,7 /28/

Сердце быка 330 53 5о: 25 12,5 7,5 / 29 /

Сердце быка 394 59 55 29 13 8,7 / 30 /

Печень крысы 380 62 57 36 ~ — / 31 /

Бурый жир хомяка ! 380 56 54 33 13,4 9,5 / 32 / ооисс/ихго/яисез сепз-Гае с ; 400 58,5 55 34 10 8,6 / 33 /

Оисск<хг-отисл5 сеге-\zlsiaB 340 58,5 54 38,5 31 12 / 34 /

Значительное расхождение в опубликованных величинах молекулярных весов субъединиц ^-АТФ-азы обусловлено, по-видимому, несовершенством метода гель-электрофореза в присутствии ДЦС-№, использованного в подавляющем большинстве исследований. Действительно,как видно из табл.1, значения молекулярных весов, определенные этим методом, сильно различаются между собой даже для препаратов фермента, выделенного из одного и того же источника.

В ряде случаев были описаны препараты -Fj-АТФ-азы, не содержащие минорных (<$*-, £ - или -) субъединиц. Так, Козлов и Микелъ-саар / 36 /, применяя ультразвуковую обработку митохондрий при рН 5,2 выделили Fj-АТФ-азу, не содержащую <$*- и S-субъединиц. Фермент, содержащий лишь и jS-субъединицы, причем с одинаковым молекулярным весом, был получен Бикетовым и др. / 37,38 / из анаэробной бактерии ¿ас to Radius &asе<*. В зависимости от методики выделения бактериальные / 39 / и хлоропластные / 40 / Fj-АТФ-азы могут быть получены без 6*-субъединщы. Эти результаты не представляются удивительными, так как предполагается, что минорные субъединицы осуществляют связь между факторами-Fj и 3?0 (см.ниже). По-видимому, в определенных условиях сродство минорных субъединиц к фактору-Fq оказывается выше, чем к </- и fi -субъединицам ij-АТФ-азы. Альтернативным объяснением является их потеря во время длительной процедуры очистки.

Резюмируя данные, описанные в главе I.I,необход шло отметить, что выделенные из различных источников Fj-АТФ-азы структурно чрезвычайно похожи между собой. Это полисубъединичные ферментные комплексы, обычно состоящие из пяти типов полипептидов, с общим молекулярным весом 360-380 КДа. Значения молекулярных весов двух больших - и ft -субъединщ для всех описанных препаратов также близки и лежат в диапазоне 50-60 КДа.

1.2. Стехиометрия субъединщ в молекуле ^--АТФ-азы

Стехиометрия субъединщ в молекуле ij-АТФ-азы являлась предметом оживленной дискуссии в течение многих лет. Основная проблема заключалась в том, сколько копий </- и ^-субъединиц входит в состав фермента - 2 или 3. Некоторые авторы на основании измерения площадей пиков, соответствующих различным субъединицам, на элек-трофореграмме ?2-АТФ-азы, а также на основании сопоставления молекулярных весов отдельных субъединиц и целого фермента пришли к выводу, что состав митохондриальной ^-АТФ-азы соответствует формуле <¿ъfi*1{S£' /33,41/.

Однако Сениор, анализируя количество ЗН-групп в ^-¡--АТФ-азе и ее субъединицах, предположил, что I молекула фермента содержит 2о£-, и 2 &-субъединицы / 42 /. Версхур и др. / 43 /, а также Статтерхейм и др. / 44 /, изучая связывание ауровертина с -З^-АТФ-азой и изолированной £ -субъединицей высказали предположение, что в молекулу фермента входят 2^-субъединицы. Таким образом, сформировалась альтернативная точка зрения на стехиометрию субъединиц ^-АТФ-азы £>1 -у£ ¿а » что также примерно соответствует общему молекулярному весу фермента. В пользу этой стехиометрии говорили и данные по ковалентному перекрестному "сшиванию" субъединиц митохондриальной З^-АТФ-азы бифункциональными реагентами / 45 /, а также рентгеноскопическое изучение кристаллов фермента / 46 /.

Исследования последних лет, однако, показали, что стехиометрия субъединиц в митохондриальной ^-АТФ-азе все-таки соответствует формуле . Такая стехиометрия подтверждается, например, данными по включению радиоактивной метки в субъединицы ^-АТФ-азы из митохондрии 8а,с,скаготу.сез с&г&ушсш, выращенных в среде с добавленными £"^С]-аминокислотами / 47 / и данными по определению количества ^Н-групп в Ъ -субъединицах этого фермента / 48 /. С другой стороны, аналогом адениновых нуклеотито-дов - р-фторсульфобензоилденозином - могут быть избирательно модифицированы 3 £ -субъединицы на моль митохондриальной ^-АТФ-ааы / 49 /.

Кроме того, были уточнены данные Сениора по содержанию ^Н-гилп в «¿-субъединицах 5рАТФ-азы из митохондрий сердца быка / 50 /, а

Бичи и сотр. / 51 / показали, что в ранних работах, посвященных связыванию ауровертина, авторы использовали завышенный коэффициент

14 экстинции антибиотика. Сходные опыты по связыванию [ С] -ауровертина, проведенные Винье и сотр. / 52 /, свидетельствуют в пользу наличия трех / -субъединиц в молекуле £рАТФ-азы. Амзель и сотр. 53 /, исследуя кристаллы £т-АТФ-азы из митохондрий печени крысы х о методом дифракции рентгеновских лучей с 9 А разрешением, обнаружили, что в каждой симметричной половине молекулы фермента расположены по три глобулы, соответствующие по размеру и уЗ-субъединицам, тем самым уточнив свои ранние данные / 46 /, полученные с меньшим разрешением. Необходимо отметить и функциональные исследования последних лет, прямо свидетельствующие в пользу того, что в молекуле митохондриальной £рАТФ-азы имеется шесть нуклеотид-связывающих центров, расположенных лишь на Л- и р -субъединицах (подробно см.ниже).

Также по три копии и -субъединиц входят в состав молекулы бактериальной -РрАТФ-азы. Так, РрАТФ-аза из термофильной бактерии РБ -3 содержит всего три ЗН-группы, которые титруются только в -субъединицах фермента / 54 /. Химическая модификация РрАТФ-азы, изолированной из Езо^епоЬ/си ооЬ' , дициклогексилкар-бодиимидом приводит к ингибированию АТФ-азной активности фермента, которое коррелирует с ковалентным включением в -субъединицу I моля ингибитора на моль ЗРрАТФ—азы / 55 /. Анализ модифицированного фермента методом электрофокусировки в присутствии диссоциирующих агентов выявил, что при полной инактивации всего лишь

30-35$ р -субъединиц содержат остаток дициклогексижарбодиимида / 56 /. (Модифицированная дициклогексижарбодиимидом ^ -субъединица содержит на один отрицательный заряд меньше, чем нативная). Другие данные, указывающие на стехиометрию ^/¿уй для препаратов бактериальных £-рАТФ-аз, были получены в опытах по выделению фермента из &сАепс.А/а со£/ / 57,58 /, М/огососси, з 1цлосЫс£1&и,$ / 59 /, и Р5 -3 / 60 /, выращенных на средах, содержащих радиоактивно-меченные аминокислоты или сахара, а также в опытах по реконструкции активной З-^-АТФ-азы из индивидуальных очищенных субъединиц / 61,62 /.

Менее определенная ситуация сложилась к настоящему моменту в случае хлоропластной Р^-АТФ-азы. На основании многочисленных данных, аналогичных приведенным выше, долгое время считалось, что в состав молекулы этого фермента входят две ьС - и две р -субъединицы / 63-66 /. Стехиометрия «¿¿А, хорошо соответствовала принятому до последнего времени молекулярному весу хлоропластной -Г-ц-АТФ-азы - 320 КДа (подробно см.выше). Однако, проверка этих данных, проведенная независимо в нескольких лабораториях, привела к неожиданному результату: во всех случаях авторы сделали вывод в пользу стехиометрии ^ъРъ^Ъ^, / 67-69 /. Этот вывод представляется тем более обоснованным в свете данных о чрезвычайной консервативности структуры ^-АТФ-азы в процессе эволюции живых организмов / 70 /. Действительно, в первичных последовательностях больших субъединиц фермента, выделенных из филогенетически очень далеких источников,наблюдается высокая степень гомологии / 50 /. Очень сходны оказываются и четвертичная структура, а также основные каталитические свойства митохондриальной, хлоропластной и бактериальной £-£-АТФ-азы / 70 /.

Таким образом, можно заключить, что все ?2-АТФ-азы, независимо от объекта, из которого они были изолированы, содержат по три копии с/- и £> -субъединиц и одну у -субъединицу. 5 - и £,-субъеди-ницы, по-видимому, также представлены одной копией на молекулу фермента, хотя данные по их содержанию в ^-АТФ-азе не так многочисленны. Кроме того, следует отметить функциональную и структурную негомологичность (Г - и £,-субъединиц для различных препаратов фермента. Так, первичная последовательность 6-субъединицы бактериальной и хлоропластной Р-рАТФ-азы гомологична первичной последовательности <Г-субъединицы митохондриального фермента / 71,72'/, а бактериальная и хлоропластная ^-субъединица - белку, придающему чувствительность митохондриальной Р^-АТФ-азе к олигомищшу (ОБСР) и ассоциированному с фактором 3?0 / 73 /.

1.3. Функция субъединиц ^-АТФ-азы

Одним из наиболее продуктивных методов исследования специфических функций субъединиц, входящих в состав ^-АТФ-азы, является получение фермента, тем или иным способом лишенного соответствующих субъединиц. Впервые Р|-АТФ-азу без $ - и ¿-субъединиц удалось получить в нашей лаборатории Козлову и Микельсаару / 36 /. Полученный препарат обладал такой же АТФ-азной активностью и каталитическими свойствами, что и нативная Р^-АТФ-аза, однако не реконструировался с фактором Р0 / 35,74 /. Авторы сделали вывод о том, что об -, £ - и ^ -субъединицы формируют каталитический центр фермента, а и Ь осуществляют контакт между факторами 3?0 и ^ / 74 /.

Позднее справедливость этого вывода была подтверждена Кагавой и сотр. в опытах по реконструкции Р-^-АТФ-азы из термофильной бактерии Р5-3 из индивидуальных очищенных субъединиц / 62,75 /. Для реконструкции активного фермента оказались необходимыми только и ^-субъединицы / 62,75 /. Авторы также пришли к выводу, что комплексы oCfi выполняют собственно каталитические функции, а Ц -субъединица играет структурную роль в образовании каталитически активных e¿j8- комплексов / 75 /. Кагаве и сотр. удалось реконструировать и 5- g -субъединицы с фактором F0 / 76 /. При этом наблюдалось существенное ингибирование протонной проводимости через фактор ¥Q / 76 /. По-видимому, комплекс играет роль про-тонпроводящих "ворот" между 5*0 и комплексом <¿ifib1{ ж 0СУ~ ществляет структурную связь между протонным каналом и каталитической частью фермента.

Сходные результаты были получены и с íj-АТФ-азой из Estherfthicu оо¿¡. Смешение очищенных препаратов t¿-, ^-субъеди

2+ ниц с последующим диализом против буфера, содержащего АТФ и Мд привело к реконструкции АТФ-азной активности / 61,77-79 /. Интересно отметить, что наиболее эффективно реконструкция проходила при молярном соотношении j6 -и ^-субъединиц равном 3:3:1 / 61 /. Кроме того, был изолирован и комплекс S- и ¿-субъединиц в стехиометрии 1:1 / 80 /. В случае Pj-АТФ-азы из Esohe/chia. co¿¡ / 61,81 / и хлоропластной Pj-АТФ-азы / 40,82 / комплекс сГ& или просто (Г-субъединица также осуществляют связь между и фактором £0иблокируют пассивную протонную проводимость последнего.

Другим чрезвычайно эффективным способом выяснения специфической роли субъединиц, входящих в состав Pj-АТФ-азы, является химическая, афинная и фотоафинная модификация фермента. Остановимся сначала на модификации Pj-АТФ-азы фотоактивирующими аналогами нуклеотидов. Для изучения нуклеотидсвязывающих центров фермента были использованы два основных типа фотоафинных меток. Это 8-азидо- и З^-арилазидо-производные адениновых нуклеотидов. В первом случае реакционноспособная азидная группа располагается на пуриновом кольце, а во втором - связана с рибозным остатком нук-леотида через цепь углеродных атомов. Оба класса фотоактивируемых аналогов обладают хорошим сродством к ^-АТФ-азе и их связывание и/или фотозависимое включение предотвращается адениновыми нуклео-тидами, т.е. кодификация фермента 8-азидо- или з'-адрилазидо производными нуклеотидов может рассматриваться как истинно афинное мечение.

Фотооблучение митохондриальной / 83-85 /, бактериальной / 86 / и хлоропластной / 87,88 / ^-АТФ-азы в присутствии 3'-арилазидо-производных АТФ или АДФ приводит к ковалентному включению аналога нуклеотида в сС - и £>-субъединицы фермента. При этом обе субъединицы метятся примерно в одинаковой степени. Также в </- и уЗ-субъ-единицы ^-АТФ-азы ковалентно включается после фотооблучения 3'-арилазидопроизводное негидролизуемого аналога АТФ-АМФ-РЩ5 / 89 /. Сходные результаты были получены и при использовании другого фото-активируемого аналога АТФ (АДФ), в котором реакционноспособная бензофенольная группа тоже связана с третьим атомом углерода ри-бозного остатка нуклеотида - 3'-0-(4-бензоил)бензоил-АТФ {АДФ) / 90,91 /. Ни в одном случае не описано взаимодействие фотоактивируемых з'-производных нуклеотидов с минорными субъединицами г-рАТФ-азы.

Фотооблучение митохондриальной ^-АТФ-азы в присутствии 8-азидо-АТФ приводит к ковалентному включению нуклеотида в />-субъединицу фермента / 92 /. Однако, при добавлении ионов метятся как об- так и ^З-субъединицы / 93 /. 8-азидо-АДФ также включается в обе субъединицы ЗЕ^-АТФ-азы из митохондрии / 94 /, хлоро-пластов / 95 / и бактерий / 93 / независимо от присутствия ионов М^рТ. Данные для препаратов'бактериальных З^-АТФ-аз, однако, противоречивы. Так, 8-азидо АТФ преимущественно включается в ^5-субъединицу фермента, выделенного из /У/огососсыл 1иЛеи,$ / 97 / и в об -субъединицу фермента из термофильной бактерии Р5-3 / 98 /. Напротив, 2-азидо-АДФ / 99 / и 8-азидо-1-Лр-этено АТФ / 100 / включаются только в ^З-субъединицы £|-АТФ-азы. Опять-таки ни в одном случае не описано взаимодействие аналогов нуклеотидов с минорными субъединицами.

Таким образом, из результатов по фотоафинному мечению ^-АТФ-азы однозначно следует, что нуклеотидсвязывающие центры расположены только на об- и -субъединицах. Однако, на основании вышеизложенных данных нельзя сделать определенного вывода о локализации каталитического центра (центров) на субъединицах фермента. Хотя в ряде случаев ингибирование АТФ-азной активности коррелирует с модификацией £-субъединицы / 92,98,100 /, этого явно недостаточно для однозначного заключения о локализации активного центра.

Более определенная информация о расположении каталитических и некаталитических центров на субъединицах -^-АТФ-азы была получена в опытах с применением химически реакционноспособных аналогов АТФ и реагентов, модифицирующих функциональные группы белков.

Модификация ^-АТФ-азы реакционноспособными аналогами адени-новых нуклеотидов - 4-(Н-2-хлорэтил^-метиламино)бензоиламидом АТФ / 101 /, смешанным ангидридом АТФ и мезитиленкарбоновой кислоты / 102 /, р-фторсульфонилбензоиладенозином / 103,105 / приводит к специфическому включению радио активно-меченных аналогов в субъединицы фермента и параллельному уменьшению АТФ-азной активности. С другой стороны, включение I моля диальдегидного производного АДФ в оС -субъединицу ?^-АТФ-азы практически не влияет на каталитическую активность фермента / 108 /. Таким образом, можно сделать вывод, что каталитические центры ?2-АТФ-азы расположены на £ -субъединицах.

- 19

Справедливость этого вывода подтверждается данными по химической модификации фермента реагентами, взаимодействующими с функциональными группами белков. Так, Fj-АТФ-азы, выделенные из различных источников, ингибиругатся 4-хлор-7-нитробензофуразаном / I07-II0 /, дициклогексилкарбодиимидом / 55,111,112 /, М-этокси-карбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолином / 113,114 /, 1-циклогексил--3- (2 -морфо лин о э т ил) к ар б од иимид ом / 115 / и хинокриновым производным иприта / IIS /. Во всех случаях инактивация сопровождается ковалентным включением ингибитора только в ß -субъединицу фермента. Ингибирования Pj-АТФ-азы, вызванного специфической модификацией оС- или ^-субъединицы^в литературе не описано.

На первый взгляд представляется удивительным, почему информация, полученная при помощи фотоактивируемых аналогов АТФ оказывается менее определенной, чем в случае химически реакционноспо-собных аналогов нуклеотидов. Эти различия объясняются, по-видимому, двумя причинами. Во-первых, после фотооблучения возбужденный остаток нитрена может неспецифически реагировать практически с любым аминокислотным остатком белка. В то же время для ковалент-ного включения химически реакционноспособного аналога АТФ (АДФ) в фермент необходимо наличие соответствующего (обычно нуклеофиль-ного) аминокислотного остатка в непосредственной близости от ре-акционноспособной группы нуклеотида. Действительно, легко представить себе ситуацию, когда в ферменте для нуклеотида доступны как каталитический, так и некаталитический центры, и фотоактиви-руемый аналог будет реагировать с обоими центрами (субъединицами), а химически реакционноспособный - лишь с тем, где в непосредственной близости имеется необходимый аминокислотный остаток.

Второй причиной меньшей специфичности фотоактивируемых аналогов нуклеотидов является локализация по крайней мере одного из доступных нуклеотидсвязывающих центров ij-АТФ-азы в области контакта об- и ß-субъединиц. Действительно, Шафером и др. / 117 / было показано, что фотооблучение фермента в присутствии З'-арил-азидо-(8-азидо)-АТФ приводит к ковалентному "сшиванию" и ß -субъединщ. В тех случаях, когда азидная группа связана с пурино-вым кольцо нуклеотида, часто удается наблюдать включение фото-активируемых аналогов только в /-субъединицу (8-азидо-АТФ,2-ази-до-АДФ, 8-азидо-1-Ш -этено-АТФ). С другой стороны, при модификации Fj-АТФ-азы 3'-производными АТФ или АДФ наблюдается ковалент-ное включение аналогов как в о£-, так и в ß -субъединицы (см.выше). На основании этого можно предположить, что рибозный остаток АТФ (АДФ), связанного в каталитическом центре,находится в области контакта оС- и jS-субъединиц. В то же время химически реакционноспо-собные аналоги нуклеотидов / I0I-I03 / взаимодействуют с ферментом в области связывания ^-фосфата АТФ и модифицируют только jS-субъ-единицу ij-АТФ-азы.

В заключение этой главы резюмируем данные о специфических функциях субъединиц, входящих в состав ij-АТФ-азы. Большие d- и ß -субъедшицы несут нуклеотид связывающие центры фермента, причем каталитический центр (центры) расположен на ß -субъединице, а некаталитический - на об . ^-субъединица необходима, по-видимому, для поддержания каталитически активной конформации комплекса oLß.

Г- и & -субъединицы формируют протонные "ворота" фактора 5?0 и осуществляют связь с каталитическим компонентом оСъ ß$ % Н+-АТФ-азного комплекса.

1.4. Пространственная структура ij-АТФ-азы

Электронно-микроскопическое исследование препаратов Pj-АТФ-азы, выделенных из митохондрий сердца быка / 118 /, печени крысы 119 /, дрожжей / 34,120 /, а также из хлоропластов / 121 / и бактерий / 122-124 /, показало, что фермент представляет собой о сферическую частицу с диаметром около 100 А. Из приведенных в о этих работах рассчетов следует, что при диаметре в 100 А бежовая глобула должна обладать молекулярным весом примерно в 300-400 КДа, что соответствует экспериментально измеряемым величинам (см.главу

1.1 этого раздела). На электронных микрофотографиях видно, что молекула 3?т-АТФ-азы состоит из шести хорошо различимых глобул с ± о диаметром около 30 А каждая, расположенных в виде правильного шестиугольника / 119-124 /. Они, по-видимому, соответствуют шести большим (^ и р ) субъединицам фермента.

Однако, кажущемуся планси-фному расположению ой- и ^-субъ-единиц на электронных микрофотографиях противоречат многочисленные данные по модификации ЭР^-АТФ-азы бифункциональными "сшивающими" реагентами. Так, Вингфильд и Боксер / 125 /, показали образование сшивок между -субъединицами фермента, обработанного диметилсуберимидатом, образующим ковалентные "мостики" между 6-аминогруппами лизина. При этом димеров субъединиц типа и не наблюдалось / 125 /. Винье и сотр. / 126,127 / также не наблюдали образования димеров типа ^3/3 при перекрестном "сшивании" субъединиц митохондриальной ^-АТФ-азы. Сходные результаты были получены к при использовании других бифункциональных сшивающих реагентов / 45,57,64,128,129 /. Из анализа данных, полученных с бифункциональными сшивающими реагентами с различным расстоянием между реакционноспособными группами, следует, что Л -субъединицы в молекуле РрАТФ-азы в значительно большей степени сближены между собой, чем -субъединицы, что противоречит их кажущемуся пленарному расположению в углах- правильного шестиугольника.

Значительный прогресс в исследовании четвертичной структуры j-АТФ-азы был достигнут в последние годы благодаря использованию компьютерной обработки изображений как отдельных частиц, так и тонких кристаллов фермента. Применение этой техники для изучения ми-тохондриальной ij-АТФ-азы / ISO / и ïj-АТФ-азы, выделенной из Lo,c,to&ati lus case'i/ 38 /, выявило двуслойное расположение субъединиц в молекуле фермента. Схематическое изображение полученной модели представлено на рис.1. Видно, что шесть субъединиц ij-АТФ-азы располагаются в двух слоях (по три в каждом слое) в вершинах треугольной антипризмы. При этом, имея общую вершину, две треугольные пирамиды, образующие антипризму, развернуты примерно на 60° относительно друг друга. Сходная модель была предложена Шаффером и сотр. / 131 / при наложении изображений ïj-АТФ-азы,полученных при повороте подложи образца на определенный угол.

Предложенная модель хорошо согласуется с данными по рентгеноо структурному анализу ij-АТФ-азы, выполненному с 9 А разрешением / 53 /. Амзель и др. / 53 / показали, что фермент состоит из шести морфологических единиц, расположенных в виде двух тримеров, причем пространственное расположение глобул может быть аппроксимировано треугольной антипризмой.

К сожалению, в настоящее время нет данных о взаимном расположении с/- иjS-субъединиц в молекуле ij-АТФ-азы. Наиболее привлекательной выглядит гипотеза об их расположении в разных слоях таким образом, что при реконструкции ^-АТФ-азы с фактором -F0 fi-субъединицы оказывались бы ближе к плоскости мембраны (т.е. к протонному каналу), чем об-субъединицы / 132 /. Косвенно в пользу этой гипотезы говорит тот факт, что об-субъединицы легко могут быть экстрагированы из Н+-АТФ-азного комплекса при обработке суб-митохондриальных частиц Li СЕ / 133 /. Остальные белки, входящие в состав Н+-АТЗьазного комплекса,в этих условиях не диссоциируют,так

Рис. I Подборка отдельных молекул митохондриалъной Р-рАТФ-азы. Контрастирование уранилацетатом. Увеличение 300 ООО. Различные проекции предложенной модели показаны в правой части рисунка. Цупрун и др. /130/. как добавление очищенной об -субъединицы восстанавливает каталитическую активность фермента и способность к генерации при гидролизе АТФ / 153 /.

В заключение этого раздела кратко резюмируем основные данные о структурной организации растворимой З^-АТФ-азы. Фермент представляет собой полисубъединичный комплекс с молекулярным весом примерно 360 КДа. В его состав входят пять типов полипептидов, обозначенных в порядке убывания молекулярного веса <¿,^6, сГ и £ в стехиометрии ¿ъРъ^'дЪ . Нуклеотидсвязывающие центры £]--АТФ-азы расположены на больших субъединицах, причем каталитические центры - на ^З-субъединицах, а некаталитические - на об-субъединицах. *{ , сГ и £ обеспечивают каталитически активную кон-формацию комплекса и осуществляют его связь с протонным каналом (фактором £0). В первичной структуре соответствующих субъединиц, выделенных из различных источников, обнаруживается высокая степень гомологии. Все известные на сегодняшний день ?-АТФ-азы имеют очень сходную четвертичную структуру.

ГЛАВА П. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Р-рАТФ-АЗЫ

Из результатов, изложенных в предыдущем разделе,еледует, что ^-АТФ-азы, выделенные из самых разнообразных источников, поразительно схожи в своей структурной организации. Трудно поэтому ожидать существенных различий в каталитических свойствах митохонд-риального, хлоропластного и бактериального ферментов. Однако, при обсуждении современных представлений о механизме функционирования З^-АТФ-азы приходится в основном ограничиться данными, полученными для митохондриального фермента. Это обусловлено следующими обстоятельствами.

Во-первых, работы по изучению каталитических свойств бактериальных ïj-АТФ-аз практически отсутствуют в литературе. Их исследование в подавляющем большинстве ограничивается лишь структурными аспектами. Хлоропластная же ïj-АТФ-аза является латентной, т.е. не обладает существенной АТФ-азной активностью / 184,135 /. Активация фермента может быть достигнута либо при нагревании до 60°С и выше в присутствии восстанавливающих агентов / 134 /, либо про-теолизом / 135 /. В обоих случаях неясно,в какой степени данные, полученные на таких препаратах,не являются артефактом обработки фермента. Поэтому большинство исследователей ограничиваются изучением мембраносвязанной хлоропластной АТФ-азы, активация которой может быть достигнута в условиях близких к нативным, - генерацией на мембране д/Ш+ / 136,138 /. Следует отметить, однако, что сопоставление результатов настоящей работы с рядом недавно полученных для хлоропластного фермента данных, свидетельствует в пользу того, что в основе механизма функционирования митохон-дриальной и хлоропластной Fj-АТФ-азы лежат одни и те же основные закономерности (подробнее см.раздел "Результаты и обсуждение" и "Заключение").

И, наконец, именно для митохондриальной ij-АТФ-азы в последние годы наметился значительный прогресс в понимании общих принципов механизма гидролиза (и, соответственно, синтеза; АТФ.

2.1. Общие каталитические свойства Fj-АТФ-азы

Митохондриальная Fj-АТФ-аза гидролизует АТФ со скоростью 60-100 мкмоль/мин мг. Фермент не проявляет большой специфичности к типу гетероциклического основания субстрата. Taie, ИТФ гидроли-зуется примерно с такой же скоростью как и АТФ, а ГТФ - со скоростью примерно в 3 раза меньшей / 12,138,139 /. ïj-АТФ-аза отщепляет также % -фосфат от пиримидиновых нуклеозидтрифосфатов и различных аналогов АТФ с модифицированным пуриновым кольцом (например, £-АТФ или изо-ГТФ) / 12,139,140 /.

Рибозный остаток нуклеотидов, по-видимому, не играет существенной роли в механизме связывания нуклеозидтрифосфатов с активным центром £-£-АТФ-азы. 2'-дезокси-АТФ, З'-о-метил-АТФ / 139 /,а также различные производные АТФ по 2' (З') углеродным атомам рибо-зы / 141 / являются либо субстратами, либо сильными конкурентными ингибиторами фермента.

Ионы Мдр+ или другие ионы двух- или трехвалентных металлов необходимы для гидролиза АТФ митохондриальной ^-АТФ-азой / 12 /.

Мй2+ и ^е3?' практически так же эффективны, как в то время

2+ 1+2 2+ как в присутствии Са , СаТ и Со скорость реакции оказывается существенно ниже / 142,143 /. Считается, что истинным субстратом реакции является МдАДФ, а свободные М^р? и АТФ - конкурентными ингибиторами фермента / 142,144 / МдАДФ также является конкурентным ингибитором Г|-АТФ-азы с К^ примерно равной Ю~4 М / 119,144 /.

Зависимость скорости нуклеозидтрифосфатазной реакции от концентрации нуклеотида для всех нуклеозидтрифосфатов, кроме АТФ,подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен / 138,145,146 /. В случае гидролиза АТФ эта зависимость имеет двухфазный характер и может быть апроксимирована двумя прямыми, соответствующими двум кажущимся значениям Км, отличающимися примерно на порядок / 33,138,145,146 /. Добавление в среду для измерения АТФ-азной активности некоторых анионов приводит к "спрямлению" этой зависимости в координатах Лайнуивера-Берка / 33,138,145,146 /. Более подробно эти результаты будут обсуждаться ниже в главе 2.4 этого раздела.

2.2. Связывание ^-АТФ-азой нуклеотидов и неорганического фосфата

В соответствии со стехиометрией больших субъединиц митохонN дриальная Pj-АТФ-аза содержит шесть нуклеотидсвязывающих центров / 93,147 /. Эти центры сильно различаются по специфичности и сродству к нуклеотидам и, несколько условно, могут быть подразделены на две группы: центры обратимого и практически необратимого ("прочного") связывания нуклеотидов. К последним относятся центры, способные сохранять связанные в них АТФ и (или) АДФ после гельфиль-трации, обработки активированным углем и многократного переосаждения фермента сульфатом аммония / 148 /.

Прочносвязанные нуклеотиды, обычно АДФ и АТФ, содержатся практически во всех выделенных препаратах ïj-АТФ-азы, хотя их количество варьирует в зависимости от источника фермента '(для обзора см. / 148 /). Для митохондриальной îj-АТФ-азы их количество равно 3 / 89,147-151 /. Следует отметить, что прочносвязанные нуклеотиды нековалентно связаны с ïj-АТФ-азой. Так, их отделение от фермента можно провести в сравнительно мягких условиях: гель-фильтрацией ïj-АТФ-азы через сефадекс в буфере, содержащем 50$ глицерина / 150 / или сульфат калия в высокой концентрации / 152 /. Лишенный прочносвязанных нуклеотидов по методу Гэррета и Пенефски / 150 / фермент может быть реконструирован с АДФ, АТФ или негид-ролизуемым аналогом АТФ-АМФ-РйР / 147,150 /.

Интересно отметить, что митохондриальнан. ij-АТФ-аза содержит также 2 центра прочного связывания ионов / 153 /, причем удаление прочносвязанных с ферментом нуклеотидов не приводит к их диссоциации / 153 /.

Обратимое связывание АДФ З-^-АТФ-азой впервые наблюдали Рэкер и сотр. / 154 /. Авторы показали, что преинкубация митохондриаль-ной ïj-АТФ-азы с низкими концентрациями АДФ и последующее переосаждение фермента сульфатом аммония приводит к связыванию примерно I моля нуклеотида на моль ïj-АТФ-азы. Инкубация полученного кош

- 28 лекса с АТФ приводит к диссоциации связанного АДФ / 154 /.

Позднее эти результаты были подтверждены в опытах Каттерола и Педерсена / 155 / и Хилборна и Хаммеса / 156 /. Было показано, что ^-АТФ-аза способна связывать I моль АДФ в отсутствии ионов и 2 моля АДФ на моль фермента в присутствии / 155,156 /. При этом значение константы связывания первой молекулы АДФ в присутствии шф* составляет 3-8.10""^ М, а второй - примерно М / 155,156 /. В отсутствие АДФ также связывается с очень высоким сродством. Сходные результаты были получены также на хлоро-пластной / 157 / и бактериальной / 86 / ^-АТФ-азе.

Вопрос об участии центров обратимого и прочного связывания нуклеотидов в катализе АТФ-азной (АТФ-синтетазной) реакции в настоящее время остается открытым. Большинство исследователей считают, что прочносвязанные нуклеотиды не являются интермедиатами синтеза или гидролиза АТФ. Это мнение основано на меньшей скорости обмена этих нуклеотидов с добавленными в среду инкубации по сравнению со скоростью АТФ-синтетазной реакции / 158,159 /. Однако,были получены и альтернативные данные / 160 /. Что касается центров обратимого связывания, то наиболее распространенная точка зрения заключается в том, что центр с высоким сродством к АДФ является некаталитическим, а центр с низким сродством - каталитическим / 155-157 /. Основным аргументом в пользу этого предположения является совпадение константы связывания ферментом МдАДФ с константой конкурентного ингибирования МдАДФ в АТФ-азной реакции / 119, 155-157 /.

Более рациональная - функциональная - классификация нуклео-тидсвязывающих центров митохондриальной ^-АТФ-азы была предложена в работе Кросса и Нэлина / 147 /. Авторы показали, что преинкуба-ция лишенной прочносвязанных нуклеотидов ^-АТФ-азы в присутствии

I мМ М^АТФ с последующим отделением свободных лигандов приводит к связыванию 5 молей адениновых нуклеотидов на моль фермента / 147 /. Последующая инкубация такого фермента с МдАТФ в аналогичных условиях приводит к тому, что 2 молекулы предварительно связанного нуклеотида обмениваются с вновь добавленными. Те же две молекулы связанного АДФ (АТФ) диссоциируют и при инкубации фермента с насыщающими концентрациями АМФ-РДОР. При этом 3 молекулы АМФ-Р.МР оказываются связанными с молекулой З^-АТФ-азы / 147 /. Авторы делают вывод о существовании двух классов нуклеотидсвязы-вающих центров Iнезависимо от их сродства к адениновым нуклеоти-дам;. К первому классу относятся три центра, неспособные обменивать связанные в них нуклеотиды при гидролизе АТФ, т.е. некаталитические, а ко второму - три обменивающие нуклеотиды центра, которые авторы считают каталитическими / 147 /.

Следует отметить, что сам по себе обмен связанных нуклеотидов при гидролизе АТФ еще не означает, что центр, в котором он происходит,является каталитическим. Однако, при условии, что -АТФ-аза содержит по три копии об - и £ -субъединиц, и что три центра заведомо являются некаталитическими, эта точка зрения выглядит вполне обосновано. Наличие нескольких каталитических центров в молекуле ^-АТФ-азы следует также из ряда независимых данных, которые будут обсуждаться в главе 1.4 этого раздела.

На основании того, что митохондриальная ^-АТФ-аза содержит три прочносвязанных нуклеотида (см.выше) и того факта, что три связанных с ферментом нуклеотида не способны обмениваться со свободными при гидролизе АТФ, Кросс и Нэлин / 147 /, а также Сеньор и Вайз / 161 / высказали гипотезу об идентичности необмениваемых центров и центров прочносвязывания нуклеотидов и их локализации на сб -субъединицах 3?1-АТФ-азы. Однако гипотеза о локализации прочносвязанных нуклеотидов в некаталитических центрах фермента / 147,161 / противоречит высказанной ранее точке зрения, что центр обратимого связывания АДФ с высоким сродством также является некаталитическим / 155-157 /. Действительно, принимая во внимание, что в состав £|-АТФ-азы входят по три копии сС- и ^З-субь-единиц, трудно себе представить, что фермент содержит четыре некаталитических и два каталитических центра. Один из аспектов настоящей работы посвящен этому вопросу. Из полученных результатов следует, что центр обратимого связывания АДФ с высоким сродством является одним из альтернативных каталитических центров.

Митохондриальная Р-рАТФ-аза способна специфически связывать I молекулу неорганического фосфата с К^ = 80 мкМ при рН 7,5, причем ¡урО^" является той анионной формой, которая взаимодействует с ферментом / 162,163 /. Применив фотоактивируемый аналог фосфата 2-нитро-4-азидофенилфосфат, Винье и сотр. / 164,165 / показали, что центр связывания фосфата находится на р-субъединице фермента, т.е., по-видимому, в каталитическом центре. Ковалентное включение I моля фотоактивируемого аналога фосфата на моль фермента приводило к полной инактивации митохондриальной ^-АТФ-азы / 164 /. Учр1тывая, что неорганический фосфат не ингибирует АТФ-азную реакцию, катализируемую ферментом / 12,142 /, этот результат на первый взгляд представляется пародоксальным. Однако, он легко может быть объяснен при помощи данных, полученных в настоящей работе, в рамках схемы кооперативного взаимодействия между каталитическими центрами (см.главу 2.4 этого раздела, а также "Результаты и обсуждение").

2.3. Влияние АДФ на каталитические свойства

Fj-АТФ-азы

Впервые возможность медленных переходов фермента из активного в неактивное состояние, имеющих, по-видимому, регуляторное значение, была постулирована Мойл и Митчеллом / 166 /. Дальнейшие исследования подтвердили справедливость этой гипотезы. Так, Ди Пиет-ро и сотр. / 167,168 / наблюдали медленное АДФ-зависимое ингибиро-вание митохондриальной ij-АТФ-азы, которое обращалось преинкуба-цией с МдАТФ. Сложную картину ингибирования фермента после пре-инкубации с АДФ наблюдали также Харрис и сотр. / 140,169 / и Томассен и Клунгсойер / 170 /.

Значительный прогресс в понимании взашлодействия З^-АТФ-азы с АДФ был достигнут благодаря работам Виноградова и сотр. / 171-177 /. Авторы показали, что АДФ может с очень высоким сродством взаимодействовать с митохондриальным ферментом с образованием неактивного комплекса. Такой комплекс может образовываться как при связывании АДФ З-рАТФ-азой, так и в результате удержания ферментом АДФ, образующегося в ходе АТФ-азной реакции. Диссоциация неактивного комплекса фермента с АДФ значительно ускоряется в присутствии АТФ. Другие нуклеозиддифосфаты такого комплекса с ферментом не образуют / I7I-I77 /.

К сожалению, подавляющее большинство этих данных было получено на мембраносвязанных препаратах АТФ-азы / 171,173-177 /, что значительно затрудняет функциональную локализацию этого АДФ-свя-зывающего центра. Авторы, однако, предполагают / 171,174 /, что АДФ взаимодействует с регуляторным центром с высоким сродством к нуклеозиддифосфату (см.выше). Связывание в этом центре АДФ, по мнению Виноградова и сотр. / 173,177 /, переводит фермент из

АТФ-гидролазной" (т.е.способной к гидролизу АТФ) конформации в "АТФ-синтетазную" (способную лишь к синтезу, но не к гидролизу АТФ).

Интересно отметить, что феноменологически близкие эффекты наблюдали на митохондриальной Fj-AT^-азе Ректенвельд и Хесс / 178/ и Ровери и сотр. / 179 /. Авторы обнаружили, что при измерении скорости АТФ-азной реакции в миллисекундной шкале наблюдается увеличение скорости гидролиза АТФ ij-АТФ-азой, которая в течение примерно 100 мсек достигает стационарного значения. Удаление прочно-связанных с ферментом нуклеотидов приводит к исчезновению лаг-фазы / 179 /. Минков и сотр. / 172 /, а также Хакни / 180 / наблюдали те же эффекты в минутной шкале после преинкубации Fj-АТФ--азы с ионами В этом случае лаг-фаза также исчезала после удаления прочносвязанных с ферментом нуклеотидов / 172 /.

Однако если ингибирование АДФ АТФ-азной активности фермента обусловлено заполнением одного из центров прочного связывания, т.е. некаталитического (или необменивающего нуклеотиды в рамках терминологии Кросса и Нэлина / 147 /), возникает парадоксальная ситуация. Действительно, при стационарном гидролизе АТФ все некаталитические центры заполнены нуклеотидами, тем не менее Pj-АТФ-аза активна. Из результатов настоящей работы следует, что ингибирование ij-АТФ^азы АДФ, описанное Виноградовым и сотр. / I7I-I77 /, обусловлено связыванием АДФ в одном из альтернативных каталитических центров фермента (центра обратимого связывания АДФ с высоким средством) и образованием медленно диссоциирующего комплекса с Pj-АТФ-азой (см."Результаты и обсуждение").

Сходный механизм реализуется, по-видимому, и в случае перехода хлоропластной Fj-АТФ-азы из активного в неактивное состояние. Многочисленные данные свидетельствуют в пользу того, что латентность хлоропластного фермента обусловлена связыванием АДФ в одном из центров с высоким сродством / 181-183 /. Косвенные данные, полученные в самое последнее время, указывают на локализацию этого АДФ в одном из каталитических центров фермента / 184,185 /. i.4. Кооперативность взаимодействия между каталитическими центрами -ЗР-рАТФ-азы. Модель поочередно функционирующих каталитических центров

Впервые модель поочередно функционирующих каталитических центров была предложена Репке и сотр. / 185 / и позднее Адольфсеном и Моудрианакисом / 187 /. Авторы постулировали осцилляцию ij-АТФ-азы между двумя альтернативными, но каталитически эквивалентными состояниями в процессе гидролиза АТФ / 186,187 /. Дальнейшее развитие и экспериментальное обоснование этого механизма связаны с работами Бойера и сотр. / 7,8,188 /.

Согласно современным представлениям,связывание АТФ в одном из каталитических центров фермента конформационно сопряжено с диссоциацией АДФ и Фн из альтернативного. Схема, иллюстрирующая последовательность происходящих в процессе каталитического акта событий, представлена на рис.2. Видно, что в ответ на связывание молекулы АТФ (стадия I) происходит конформационная ( д^Н+-зависимая в энергизованной системе) перестройка АТФ-азы,в результате которой АТФ становится прочносвязанным с ферментом, а сродство к АДФ и Фн падает (стадия 2). В дальнейшем связанный в центре с высоким сродством АТФ гидролизуется (стадия 3), но для освобождения продуктов реакции в раствор необходимо связывание новой молекулы АТФ в альтернативном каталитическом центре (стадия 4) и конформационная перестройка, аналогичная стадии 2 (стадия 5). На рис.2 схема Бойера и сотр. / 7,8,188 / изображена для двух кооперативно взаимодействующих каталитических центров, однако она легко может быть распрос

Рис. 2 Схема поочередно функционирующих каталитических центров, предложенная Бойером /7,8/. Знаки" >" или V обозначают промежуточное прочное связывание субстратов.

- 35 транена и на три альтернативных центра / 189 /.

Для обоснования кооперативного взаимодействия между каталитическими центрами Pj-АТФ-азы в литературе обычно рассматривается несколько групп экспериментальных данных. Во-первых, это - отклонения от линейности в координатах Лайнуивера-Берка при гидролизе АТФ (см.главу I.I этого раздела). Однако, следует отметить, что результаты по изучению стационарной кинетики ij-АТФ-азы могут иметь и другое объяснение. Действительно, недавно в нашей лаборатории Дробинской / 190 / было показано, что наблюдаемая двухфазная зависимость гидролиза АТФ от концентрации нуклеозидтрифосфа-та в двойных обратных координатах обусловлена не взаимодействием альтернативных каталитических центров фермента,, а изменением концентрации активной Fj-АТФ-азы в процессе реакции / 190 /. Причиной убыли активного фермента в процессе гидролиза АТФ является накопление медленно диссоциирующего комплекса Pj-АТФ-азы с АДФ, описанного Виноградовым и сотр. / 175,176 /. Добавление анионов, стимулирующих распад неактивного комплекса ^-АТФ-аза-АДФ / 176 /, приводит к линейной зависимости скорости от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка / 33,138,145,146,170,190 /.

С другой стороны, кинетика гидролиза ИГФ (ГТФ) -Fj-АТФ-азой подчиняется классическому уравнению Михаэлиса-Иентен. Предпола-^отсутствием кооперативного взаимодействия между каталитическими/ гается, что это обусловлено ли(5(У%ентрами при гидролизе этих субстратов, либо тем, что разные стадии каталитического цикла определяют скорость ферментативной реакции при гидролизе АТФ и ИГФ / 145,146,169 /. Однако, на самом деле при гидролизе ИГФ (ГТФ) не образуется медленно диссоциирующего неактивного комплекса фермента с ВДФ (ГДФ) / 175 / и поэтому нет никаких оснований думать, что механизм ИТФ-азной (ГТФ-азной) реакции чемт-то отличен от механизма АТФ-азной реакции. В пользу этого вывода говорит и недавнее исслето дование зависимости скорости интермедиатного Фн- 0-обмена от концентрации нуклеозидтрифосфата при гидролизе АТФ и ИГФ / 191 /. Авторы не смогли обнаружить различия в механизме гидролиза этих нук-леозидтрифосфатов / 191 /.

Сходным образом объясняются, по-видимому, и данные, полученные Ларди и сотр. / 145,192 /. Так, было показано, что введение ИМФ-РМР, негидролизуемого аналога ИГФ, в среду измерения ИГФ-азной активности приводит к появлению "отрицательной кооперативности" / 145,192 /. Известно, что негидролизуемые аналоги нуклеозидтри-фосфатов обладают очень высоким сродством к каталитическим центрам ij-АТФ-азы и образуют медленно диссоциирующие комплексы / 145,147, 150,192,193 /. Следовательно, наблюдаемая "отрицательная коопера-тивность" легко может быть объяснена медленным установлением равновесия между активной и неактивной формами фермента. Таким образом, к настоящего моменту ясно, что отклонения от закона Михаэли-са-Ментен при гидролизе АТФ не являются проявлением кооперативного взаимодействия альтернативных каталитических центров, а есть следствие неадекватного определения начальной скорости реакции.

Вторая группа данных, объясняемых обычно кооперативным взаимодействием каталитических центров, - это данные по химической модификации ij-АТФ-азы. В нескольких случаях описана полная инактивация фермента в результате ковалентного включения I молекулы ингибитора в ß -субъединицу iFj-АТФ-азы. К таким ингибиторам относятся 4-зргор-7-нитробензофуразан / 107 /, дициклогексилкарбодиимид /55/ и Ы-циклогексил-^-М-(4-метилморфолиний-этил)карбодиимид / 115 /. Вообще, ситуация, когда модификация одной из субъединиц, несущих активный центр, приводит к полной потере каталитической активности, является типичной для кооперативных ферментов (см.обзор /194/). Однако в случае нТ-АТФ-азы интерпретация этих данных осложняется тем, что сопряженно с гидролизом АТФ происходит трансмембранный перенос протонов. Иными словами, легко представить себе, что модификация какой-то группы (групп), не принимающих непосредственного участия в катализе АТФ-азной реакции, но необходимых для сопряжения гидролиза с переносом протонов, приводит к инактивации фермента. На такую возможность указывают данные Кросса и Нэлина о том, что модификация 4-хлор-7-нитробензофуразаном остатка тирозина митохондриальной З^-АТФ-азы не меняет количества мест связывания адениновых нуклеотидов / 147 /. Следовательно, этот остаток тирозина локализован вне каталитического центра фермента.

Третья группа данных, подтверждающих механизм кооперативно взаимодействующих альтернативных каталитических центров, была получена в лаборатории Бойера в опытах по изучению реакций изотопного обмена с участием АТФ, АДФ, Фн и Н2О - субстратов и продуктов АТФ-азной реакции / 7,8,188,189,191,195,193 /. Наиболее убедительные результаты были получены в опытах по измерению включе-18 ния кислорода 0 из воды в неорганический фосфат, образующийся то при гидролизе АТФ (так называемый Фн~Н2 0 интермедиатный обмен / 195 /).

Если реакция гидролиза АТФ в каталитическом центре £-рАТФ-азы протекает необратимо, то в образующемся Фн обнаруживается лишь то то один атом 0, Наблюдаемый более высокий уровень включения 0 в фосфат при гидролизе АТФ / 189,195 / свидетельствует в пользу того, что в каталитическом центре фермента устанавливается динамическое равновесие АТФ + Н2О ^±:АДФ + Фн, т.е. реакция гидролиза АТФ обратима и обратный процесс (фосфорилирование АДФ неорганическим фосфатом) протекает со скоростью большей, чем освобождение АДФ и Фн из каталитического центра З^-АТФ-азы. Так, при концентрации АТФ меньшей, чем 1-2 мкМ, АТФ-азная реакция сопровождается образованием фосфата, у которого все четыре атома кислорода замеще-т Q ны на изотоп 195 /. Повышение концентрации субстрата привото дило к понижению уровня включения 0-кислорода из воды в образующейся фосфат. При концентрации АТФ 30-40 мкМ и выше лишь один атом то кислорода - 0 оказывался связанным с Фн / 195 /. Из полученных результатов следовало, что при низких концентрациях субстрата скорость фосфорилирования АДФ неорганическим фосфатом в каталитическом центре îj-АТФ-азы по крайней мере на порядок выше, чем скорость освобождения АДФ и Фн из каталитического центра в раствор, и что увеличение концентрации АТФ приводит к увеличению скорости освобождения продуктов реакции из каталитического центра фермента / 195 /. Эти результаты были интерпретированы авторами как указание на то, что при высоких концентрациях субстрата ■Fj-АТФ-аза связывает вторую молекулу АТФ и это связывание приводит к увеличению скорости освобождения АДФ и Фн из каталитического центра фермента / 195,196 /.

На основании анализа концентрационной зависимости от АТФ то распределения количества 0-атомов в молекулах неорганического фосфата оказалось возможным сделать выбор между различными механизмами гидролиза АТФ. Авторы считают, что наблюдаемые эффекты могут быть объяснены только кооперативным взаимодействием каталитических центров (а именно ускорением диссоциации продуктов реакции из одного каталитического центра в ответ на связывание субстрата в другом), но не существованием регуляторного центра связывания АТФ (АДФ) или гетерогенностью популяции фермента / 196 /.

Однако: существование двух альтернативных каталитических центров в молекуле митохондриальной ij-АТФ-азы было впервые прямо показано Грабмейером и Пенефски / 197 / при помощи 2/,3/-0-(2,4,6-тринитрофенил)-аденозин-5/-трифосфата. -З^-АТФ-аза связывает 2 моль тринитрофенильного аналога АТФ на моль фермента, причем оба центра в равной степени способны к гидролизу связанного нуклеотида / 197,198 /• Грабмейер и Пенефски показали также, что заполнение второго центра любым гидролизуемым нуклеотидом значительно ускоряет расщепление тринитрофенильного аналога АТФ в первом центре / 198 /.

Впоследствии так называемый одно-центровый катализ (т.е. гидролиз субстрата, связанного в одном каталитическом центре фермента) был показан и для АТФ / 199,200 /. АТФ,также как и три-нитрофенильный аналог АТФ,связывается в первом каталитическом то центре с очень высоким сродством (К^ = 10 М) / 199 /. Насыщение АТФ альтернативного каталитического центра ускоряет диссоциацию продуктов гидролиза - АДФ и неорганического фосфата, примерно в 10^ раз / 200 /.

Грабмейером и сотр. / 199 / были также определены термодинамические константы и константы скоростей отдельных стадий АТФ-азной реакции. Так было показано, что гидролиз (а, следовательно, и синтез) АТФ в каталитическом центре ij-АТФ-азы протекает без выделения энергии; константа равновесия этого процесса близка к I / 199 /. Интересно отметить также, что К^ ддф в условиях одно-центрового катализа составляет 3*10 M / 199 /. То же самое значение К^ было получено много раньше Кэнтли и Хаммесом / 156 / для центра обратимого связывания АДФ с высоким сродством. Как подробнее обсуждалось в главе 2 этого раздела, многие авторы рассматривали функции этого центра как регуляторные. Однако данные Грабмейера и сотр./ 199 / указывают (но не доказывают), что этот центр является именно каталитическим, а не ре-гуляторным.

Действительно, можно предположить, что крайне низкая скорость диссоциации продуктов из комплекса с ферментом в процессе одно-центрового катализа (в ТО4 раз медленнее, чем в условиях стационарного гидролиза АТФ / 199 /) обусловлена не отсутствием субстратов в альтернативном каталитическом центре, как это следует из схемы Бойера и сотр. / 7,8,188 /, а оцределяется свойствами самого центра, осуществляющего одно-центровый катализ. Други- . ми словами, одно-центровый катализ является просто расщеплением АТФ в регуляторном центре, который,в условиях стационарного гидролиза АТФ является некаталитическим.

В настоящей работе, используя новый фотоактивируемый аналог АТФ - з' (2/ )-(2-нитро-4-азидобензоил)-аденозш-5/-трифосфат (НАБ-АТФ) мы исследовали локализацию центра, осуществляющего одно-центровый катализ в молекуле ?х-АТФ-азы. Из полученных результатов следует, что этот центр расположен на -субъединице фермента, как и каталитические центры, функционирующие при стационарном гидролизе АТФ, и, следовательно, является одним из них.

Резюмируя раздел о каталитических свойствах Pj-АТФ-азы необходимо отметить, что механизм функционирования этого фермента к настоящему моменту остается невыясненным. Пожалуй, единственным твердо установленным фактом является то, что в стационарных условиях гидролиз АТФ осуществляется, по меньшей мере, двумя поочередно функционирующими каталитическими центрами. Однако, ни механизм кооперативных взаимодействий между ними, ни роль некаталитических центров в катализе AT казной реакции до сих пор остаются непонятными. Неясно также, как функционально соотносятся многочисленные данные по связыванию -ïj-АТФ-азой адениновых нуклеотидов и неорганического фосфата с данными по структурной организации фермента, т.е. с конкретными нуклеотидсвязывающими центрами, и как заполнение этих центров контролирует переход З^-АТФ-азы из активного в неактивное состояние. Зтим вопросам и посвящена экспериментальная часть настоящей работы.

ЭКСПЕР МЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Вульфсон, Евгений Наумович

выводы

1. Исследованы свойства нуклеотидсвязывающих центров натив-ной и лишенной прочносвязанных нуклеотидов Р^;-АТФ-азы из митохондрий сердца #ыка. Показано, что лишенная прочносвязанных нук-леотидов РрАТФ-аза способна связывать 5 моль адениновых и 2 моль гуаниновых нуклеотидов на моль фермента, из которых 2 моль и I моль, соответственно, связываются в способных к обмену нуклеоти-дов (каталитических) центрах. Нативная РрАТФ-аза в тех же условиях связывает 3 моль адениновых нуклеотидов на моль фермента:

2 моль - в способных и I моль - в неспособных к обмену нуклеотидов центрах. Молекула нативной Р-рАТФ-азы связывает также I молекулу ГДФ в обменивающем нуклеотиды центре.

2. Добавление эквимолярных количеств адениновых и гуаниновых нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатов к лишенной прочносвязанных нуклеотидов -Р^-АТФ-азе приводит к их "прочному "связыванию в каталитическом центре фермента. Нуклеозидтрифосфаты гидролизуются, после чего образующии>неорганический фосфат медленно диссоциирует из комплекса с ферментом, а нуклеозиддифосфат остается связанным с Р-рАТФ-азой. Скорость диссоциации фосфата, образующегося в ре- . зультате одно-центрового гидролиза АТФ, из каталитического центра лишенной прочносвязанных нуклеотидов РрАТФ-азы почти на порядок больше, чем из каталитического центра нативного фермента.

3. Нативная Р-рАТФ-аза способна связывать I моль неорганического фосфата на моль фермента. Удаление прочносвязанных нуклеотидов приводит к тому, что РрАТФ-аза теряет способность взаимодействовать с Фн. Добавление эквимолярного количества нуклеозид-дифосфатов к лишенной прочносвязанных нуклеотидов -РрАТФ-азе восстанавливает способность фермента связывать фосфат, причем вое

- 117 становление связывания Фн коррелирует с заполнением АДФ одного каталитического центра ij-АТФ-азы. Значения Kj связывания фосфата для нативного фермента и фермента, лишенного прочносвязанных нуклеотидов и реконструированного с эквимолярным количеством АДФ, одинаковы и составляют 130 мкМ.

4. Связывание ij-АТФ-азой нуклеотидов и неорганического фосфата носит кооперативный характер: заполнение одного каталитического центра фермента резко понижает сродство альтернативного каталитического центра к соответствующим лигандам. ГДФ и Фн не способны связываться во втором каталитическом центре Pj-АТФ-азы (его сродство к этим лигандам очень низкое) и, соответственно, не инги-бируют скорость АТФ-азной реакции.

5. Переходы ij-АТФ-азы из активного в неактивное состояние обусловлены связыванием в каталитическом центре фермента АДФ, но не ГДФ. Связывание в этом же центре неорганического фосфата обращает это ингибирование. В том случае, когда два каталитических центра фермента заполнены АДФ, добавление фосфата не вызывает реактивацию Pj-АТФ-азы, так как Фн не способен связываться во втором каталитическом центре. /

6. Синтезирован новый фотоактивируемый аналог АТФ - 3 (2 )-(2-нитро-4-азидобензоил)-аденозин-5/-трифосфат. В темноте НАБ-АТФ является субстратом для митохондриальной Pj-АТФ-азы. НАБ-АТФ (НАБ-АДФ) также как и АТФ способен связываться в двух каталитических и трех некаталитических центрах фермента. НАБ-АТФ гидролизуется Fj-АТФ-азой в условиях одно-центрового катализа; после диссоциации Фн, образующийся комплекс фермента с НАБ-АДФ, так же как и с АДФ, не обладает АТФ-азной активностью.

7. Фотооблучение комплекса Fj-АТФ-азы с НАБ-АТФ (НАБ-АДФ), полученного в условиях одно-центрового гидролиза НАБ-АТФ, приводит

- 118 к ковалентному включению аналога АТФ в JJ -субъединицу фермента. Необратимое ингибирование АТЗЬазной активности Pj-АТФ-азы при этом коррелирует с ковалентным включением I моль НАБ-АТФ (НАБ-АДФ) на моль фермента. Центр, осуществляющий одно-центровый катализ в молекуле Pj-АТФ-азы, является одним из каталитических центров, функционирующих при стационарном гидролизе АТФ.

8. Предложена гипотеза о функциональной неоднородности так называемых центров "прочного связывания" в молекуле нативной Fj-АТФ-азы: один из прочносвязанных нуклеотидов расположен в каталитическом, и два - некаталитических центрах фермента.

- 105 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние годы было предложено несколько гипотез о механизме функционирования протонной АТФ-азы (АТФ-синтезы) / 7,8,13, 14,220-222 /. В настоящее время ни одну из этих гипотез нельзя считать доказанной. Один из наиболее важных вопросов, по которому различные группы исследователей не пришли к единому мнению, - вопрос о том, является ли последовательность стадий реакции гидролиза АТФ обращением соответствующих стадий АТФ - синтетазной реакции.

Пенефски / 193 / и Педерсен / 223 / независимо предположили участие разных активных центров Н+-АТФ-азы в катализе реакций синтеза и гидролиза АТФ. Основные экспериментальные данные, на которых основано предположение о различных путях АТФ-азной и АТФ-син-тетазной реакций, были получены в опытах с негидролизуемым аналогом АТФ-аденилилимидодифосфатом. АМФ-РИР в низких концентрациях ингибирует АТФ-азную реакцию и не ингибирует реакцию синтеза АТФ / 193,223-226 /. Субмитохондриальные частицы, преинкубированные с АМФ-РМР, синтезируют АТФ с теми же скоростями, что и контрольные препараты; скорость же АТФ-азной реакции в этом случае в начальный момент времени низка и лишь постепенно (за десятки секунд) достигает уровня контрольного фермента / 227 /. Пенефски / 193 / и Педерсен / 223 / предположили, что при низких концентрациях АМФ-Р№? взаимодействует только с "АТФ-гидролазным", но не с "АТФ-синтетазным" каталитическим центром фермента, чем и объясняется "одностороннее" влияние АМФ-РИР на Н+-АТФ-азу.

Сходная гипотеза была предложена недавно Виноградовым / 222 / на основании "одностороннего" влияния АДФ на Н+-АТФ-азу субмито-хондриальных частиц. Феноменологически действие АДФ в качестве

- 106 одностороннего" ингибитора фермента весьма сходно с действием АМФ-РИР. Действительно, преинкубация субмитохондриальных частиц с низкими концентрациями АДФ приводит к ингибированию начальной скорости гидролиза АТФ, в то время как АТФ-синтетазная активность фермента оказывается не чувствительна к такой обработке / 171,174/. Авторы предполагают, что центр связывания АДФ с высоким сродством является каталитическим центром "АТФ-синтетазы" (не не "АТФ-азы") и что связывание и диссоциация АДФ контролирует переход фермента из "АТФ-азной" (способной к гидролизу АТФ) в "АТФг-синтетазную" (способную лишь к синтезу, но не к гидролизу АТФ) конформацию / 174,222 /. Реактивация фосфатом АТФ-азной активности субмитохондриальных частиц, преинкубированных с АДФ, согласно этой гипотезе, обусловлена резким понижением сродства АТФ-азы к нуклеозиддифос-фату в присутствии Фн, и последующей диссоциацией АДФ из комплекса с ферментом / 177 /.

В настоящей работе, однако, показано, что контролирующая активность фермента молекула АДФ локализована в каталитическом центре АТФ-азы, а реактивация фосфатом неактивного комплекса р£-АТФ-аза - АДФ легко может быть объяснена образованием комплекса АТФ-аза-АДФ-Фн, являющегося интермедиатом АТФ-азой реакции. Кроме того, в нашей лаборатории было показано, что ингибирование АТФ-азной, но не АТФ-синтетазной активности субмитохондриальных частиц АМФ-РНР / 227 / и АДФ / 228 / обусловлено высоким сродством этих нуклеотидов к каталитическому центру фермента в отсутствии на митохондриальной мембране. Генерация дрН+ (условия измерения АТФ-синтетазной активности) приводит к резкому снижению сродства каталитического центра Н+-АТФ-азы к АМФ-РИР и АДФ, и, как следствие, к их освобождению из комплекса с ферментом / 227,228 /.

Таким образом, создается впечатление, что мембранный потен

- 107 циал снижает сродство каталитического центра Н+-АТФ-азы не только к АТФ, АМФ-PNP, но и к АДФ. С другой стороны, в присутствии фосфата АДФ прочно связывается с каталитическим центром митохондриалъ-ной АТФ-азы даже в условиях энергизации мембраны, что и обеспечивает протекание АТФ-синтетазной реакции. Можно думать, что различное влияние мембранного потенциала на сродство каталитического центра АТФ-азы к АТФ, АМФ-PNP и АДФ (сродство снижается при генерации дрН+) и к АДФ + Фн (при генерации Д|Щ+ сродство не меняется или даже несколько возрастает / 188 /)определяется различиями в заряде этих соединений. Комплекс АДФ с фосфатом более отрицательно заряжен, чем АДФ, АТФ или АМФ-РНР. Взаимодействие трансмембранного потенциала с зарядами субстратов и продуктов АТФ-син-тетазной реакции (прямое или опосредованное ¿^Независимым прото-нированием каких-либо групп в АТФ^азном комплексе) является, по-видимому, основой механизма превращения энергии АТФ на сопрягающей мембране / 132 /.

Мембранный потенциал регулирует также сродство каталитического центра АТФ-азы к природному белковому ингибитору фермента / 229 /. Генерация на мембране д^Н"!" цриводит к быстрой реакции комплекса АТФ-азы с белковым ингибитором / 230-232 /, чем и обусловлена различная чувствительность парциальных реакций синтеза АТФ к этому пептиду / 233,234 /.

Еще одна группа данных, которая обычно рассматривается как свидетельствующая в пользу того, что синтез и гидролиз АТФ протекает в различных центрах Н+-АТФ-азы, - это данные по взаимодействию фермента с неорганическим фосфатом. Pj-АТФ-аза способна специфически связывать I моль Фн на моль фермента / 162-165 /, однако ингибирования фосфатом стационарной скорости гидролиза АТФ не наблюдается / 142,177 /. Сторонники гипотезы о различных путях

- 108

АТФ-азной и АТФ-синтетазной реакции предполагают, что Фн способен связываться лишь в "АТФ-синтетазном", но не в "АТФ-азном" центре фермента. Однако из схемы поочередно функционирующих каталитических центров предложенной Бойром и сотр. / 7,8,188 /, следует, что связывание субстратов (или продуктов) АТФ-азной реакции в одном каталитическом центре приводит к резкому понижению сродства к АТФ (АДФ и Фн) альтернативного центра. В стационарных условиях при высоких концентрациях субстрата гидролиз АТФ катализируется тремя активными центрами фермента / 189 /. При этом два центра заполнены нуклеотидами (АТФ или АДФ + Фн) / 147 /, и связывание в третьем свободном центре АТФ вызывает освобождение продуктов гидролиза из первого. Следовательно, наблюдаемые константы ингибирования АТФ-азной реакции в стационарных условиях различными соединениям отражают сродство третьего или в некоторых условиях (например, при очень низкой концентрации АТФ в среде измерения АТФ-азной активности) второго каталитического центра к использованным ингибиторам. В то же время, из результатов настоящей работы следует, что неорганический фосфат связывается в первом каталитическом центре Pj-АТФ-азы. Неудивительно поэтому, что наблюдаемое, связывание Фн никак не соотносится с ингибирова-нием АТФ-азной реакции. Действительно, известно, что сродство фермента к адениновым нуклеотидам существенно уменьшается при заполнении первого каталитического центра. Так, например, значения констант связывания в первом и втором каталитических центрах Pj-АТФ-азы составляют соответственно 10"% и 2*Ю~5М для АМФ-PNP / 147 / и 3-Ю~7М и 5* 10""% для АДФ / 155,155 /.

Сходная ситуация реализуется, по-видимому, и в случае не адениновых нуклеозиддифосфатов. ГДФ (ИДФ) не ингибирует АТФ-азную активность фермента в условиях стационарного гидролиза АТФ / 12,

- 109

192 /. Это соответствует полученным в настоящей работе данным о пониженном сродстве гуаниновых нуклеотидов по сравнению с едени-новыми ко второму каталитическому центру Р^-АТФ-азы. При этом фермент катализирует энерго-зависимые реакции с участием ГТФ (ИГФ), что свидетельствует в пользу единого механизма гидролиза всех нук-леозидтрифосфатов. Например, было показано, что гидролиз ИГФ приводит к генерации д|чН+ такой же величины, как и при гидролизе АТФ / 235 /.

Одностороннее" ингибирование АТФ-азной активности было также обнаружено при ковалентной модификации фермента некоторыми ингибиторами £]--АТФ-азы. Было показано, что модификация фермента 4-хлор-7-нитробензофуразаном / 107,108 / приводит к подавлению АТФ-азной активности, в то время как АТФ-синтетазная активность реконструированных с фактором Р0 препаратов модифицированной РрАТФ-азы почти неотличается от таковой в контрольных опытах / 236 /. Однако в результате более подробного исследования, проведенного теми же авторами, выяснилось, что АТ<ЗЬазная активность, реконструированной с мембраной Р^-АТФ-азы, может быть восстановлена кратковременной инкубацией субмитохондриальных частиц в условиях энергизации (т.е. в условиях, необходимых для измерения синтеза АТФ) / 237 /. Частичную реактивацию фермента, модифицированного 4-хлор-7-нитро-бензофуразаном, в результате преинкубации Рд--АТФ-азы в присутствии ДМСО наблюдали также Бойер и сотр. / 238 /. Учитывая, что 4-хлор-7-нитробензофуразан инактивирует РрАТФ-азу, реагируя с остатком тирозина, локализованным вне каталитического центра фермента / 147/, полученные данные / 237,238 / означают, что при реконструкции с мембраной в молекуле Р^--АТФ-азы происходят какие-то конформацион-ные перестройки, которые ускоряются мембранным потенциалом. Действительно, известно, что дяН? необходим для сборки и реконструкции

- но каталитически-активного фермента в митохондриях / 239 /.

Из подробного исследования всех известных на сегодняшний день ковалентных ингибиторов РрАТФ-азы, проведенного Хатефи и сотр. / 240 /, следует, что практически во всех случаях наблюдается полная корреляция между ингибированием АТФ-азной и АТФ-синтетазной активностей фермента. Это означает, что синтез и гидролиз АТФ осуществляется в одних и тех же нуклеотидсвязывающих центрах Н"!"-АТФ-азы.

Другим вопросом, принципиальным в рамках любой гипотезы о механизме функционирования Н+-АТФ-азы, является вопрос о том, являются ли прочносвязанные нуклеотиды интермедиатами каталитического цикла. Как уже отмечалось в "Обзоре литературы" полученные данные об участии прочносвязанных нуклеотидов в АТФ-синтетазной реакции противоречивы / 158-130 /. Из результатов настоящей работы следует функциональная "неоднородность" центров прочного связывания нуклеотидов. Так, в главе I и 2 было показано, что один из прочносвязанных нуклеотидов локализован в каталитическом центре РрАТФ-азы. В то же время, из того факта, что молекула нативной РрАТФ-азы связывает три молекулы АДФ, из которых только две обмениваются при гидролизе АТФ (глава I), следует, что два других центра прочного, связывания нуклеотидов митохондриального фермента являются некаталитическими.

Таким образом, результаты экспериментов по определению функций прочносвязанных нуклеотидов в механизме катализа АТ^-син-тетазной реакции, могут значительно различаться между собой в зависимости от методики исследования. Действительно, если некаталитические центры РрАТФ-азы не участвуют в катализе АТФ-синтетазной реакции, то в зависимости от того, какие нуклеотид связывающие центры фермента будут заполнены нуклеотидами (способные или неспособные к обмену при гидролизе АТФ) могут быть получены противоположные результаты. В том случае, когда "прочносвязанный" нуклеотид окажется связанным в каталитическом центре фермента, он будет яв-лятся интермедиатом АТФ-синтетазной реакции, а в том случае, когда в неспособном к обмену нуклеотидов центре Р^-АТФ-азы, - неизвестно.

На рис.24 представлена схема, построенная на основании полученных в настоящей работе данных, иллюстрирующая переходы РрАТФ-азы из активного в неактивное состояние при связывании АТФ, АДФ и Фн с ферментом. Митохондриальная РрАТФ-аза содержит 3 прочносвязанных нуклеотида, два из которых расположены в некаталитических центрах фермента и один- в каталитическом (1ц- рис.24). Связывание

2+

I или 2 моль АДФ на моль ^-АТФ-азы в присутствии Мд Т приводит к инактивации фермента (12, П2 и И^, рис.24). Неорганический фосфат вызывает реактивацию -Е^-АТФ-аэы только в том случае, когда АДФ содержится в одном, но не в двух каталитических центрах фермента (1д, Пд и Шд, рис.24), что обусловлено высоким сродством Фн лишь к первому каталитическому центру Рц--АТФ-азы.

По-видимому, переходом типа 1->П (рис.24) обусловлена латент-ность35 хлоропластной АТФ-азы. Так, полученные независимо в нескольких лабораториях данные свидетельствуют в пользу того, что переход фермента из активного в неактивное состояние контролируется прочным связыванием АДФ в условиях деэнергизации и его освобождей Изолированная хлоропластная РрАТФ-аза, а также мембраносвязанный фермент в условиях деэнергизации мембраны практически не обладают АТФ-азной активностью, т.е. являются латентными. Активация обоих препаратов АТФ-азы может быть достигнута соответствующими обработками фермента (см."Обзор литературы").

II

III

Нативная Pj-АТФ-аза Щ

2+

Фт

Акт. Неакт.

Глицерин 50 %

Лишенная ирочносвязанных нуклеотидов Pj-АТФ-аза

Акт,

Ф. L

Акт.

Неакт.

Акт. МдАТР

Реконструированная с нуклеотидами Р-рАТФ-аза

Фт t—i

Акт

Рис. 24 Схема, иллюстрирующая переходы З^-АТФ-азы из активного ("акт.") в неактивное ("неакт.") состояние. Кружочками изображены большие (¿0 и £ ) субъединицы фермента. Верхний ряд — центры, неспособные к обмену связанных нуклеотидов при гидролизе АТФ (некаталитические), нижний - обменивающие (каталитические) центры. Знак "#" означает отделение Р^-АТФ-азы от несвязанных нуклеотидов и фосфата (отделение от среды инкубации, содержащей М^АТФ ). Остальные пояснения см. в тексте.

- 114 нием при генерации на мембране / 181-183 /. При этом ГДФ сам не вызывает инактивации фермента, но значительно снижает скорость его инактивации АДФ / 241 /. Медленное уменьшение АТФ-азной активности наблюдается также в случае преинкубации хлвропластной ^-АТФ-азы с низкими концентрациями АТФ (одно-центровый катализ?) / 182 /. Описано и влияние неорганического фосфата на взаимодействие фермента с АДФ / 215,243 /. Авторы считают, что инактивация хлоропласт-ной ^-АТФ-азы обусловлена связыванием АДФ в регуляторном центре с высоким сродством / 182,183,215,241-243 /. Однако полученные недавно данные указывают на то, что этот центр связывания АДФ является каталитическим / 184,185 /. Таким образом, сопоставление результатов исследований хлоропластной АТФ-азы с результатами настоящей работы свидетельствуют в пользу общности механизмов, лежащих в основе функционирования и регуляции хлоропластного и мито-хондриального ферментов.

Регуляция активности Н+-АТФ-азы АДФ, связанным в одном из каталитически центров фермента, может осуществляться и в условиях иг у1уо . Так, при падении трансмембранного потенциала связывание АДФ в третьем каталитическом центре фермента в отсутствии Фн (сродство неорганического фосфата ко второму и к третьему каталитическому центру крайне низкое, так как даже при концентрации Фн, равной 10 мМ, не наблюдается ингибирования АТФ-азной активности) будет приводить к инактивации АТФ-азы после освобождения продуктов реакции из первого каталитического центра. При этом заполнение нуклео-тидсвязывающих центров фермента адениновыми нуклеотидами и фосфатом будет соответствовать состоянию Шд на рис.24.

Другим механизмом, ответственным за переход фермента из активного в неактивное состояние иг У1УО, может служить внутрифермент-ная транслокация АДФ из некаталитического в каталитический центр

- 115

Н?-АТФ-азы. Возможность такой внутриферментной транслокации нуклеотидов следует из данных, полученных недавно в нашей лаборатории автором настоящей работы совместно с И.А.Козловым, Я.М.Миль-громом и М.Б.Мураталиевым.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вульфсон, Евгений Наумович, Москва

1. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Glynn Research, Bodmin, 1966.

2. Mitchell P, A chemiosmotic molecular mechanism for protontranslocating adenosine triphosphatases. PEBS Lett., 1974, v. 43, N 2, p. 189-194.

3. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М.: Наука, 1972.

4. Abrains A., Leimgruber R.M. The N,N ;-diciclohexylcarbodiimidesensitive ATPase in Streptococcus faecalis membranes.-in: Membranes and transport/Martonosi, A.N. ed. New York and London; Plenum Press, 1982, v. 1, p. 465-471.

5. Skulachev V.P. Pathways of generation and utilization ofelectrochemical potential of H ions. in: Soviet scientific reviews. Biology/ed. by Skulachev V.P. - Amsterdam: Overseas Publ. Association, 1980, v. 1, p. 239-312.

6. Boyer P.D. Oxidative phosphorylation and photophosphorylation.

7. Coupling mechanisms in cupture, transmission and use of energy.-Annu. Rev. Biochem., 1977, v. 46, p. 957-966.

8. Boyer P.D. On the mechanism of H+-ATP synthaseIn: Chemiosmotic proton circuits in biological membranes, volume honoring Peter Mitchell, P.Hinkle, V.P. Skulachev eds., Massachusetts: Addison-Wesley Publishing Company, 1982, p. 395-406.

9. Kagawa Y., Racker E. Partial resolution of the enzymes catatlysing oxidative phosphorylation. VIII. Properties of a factor conferring oligomycin sensitivity on mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1966, v. 241, N 10, p. 2461-2466.

10. Козлов И.А., Скулачев В.П. Протонные аденозинтрифосфатазы.1. М.: Наука, 1977.

11. Kozlov I.A., Skulachev V.P. Н -Adenosine triphosphatase andmembrane energy coupling.-Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 463, N 1, p. 29-89.

12. Peldman R.I., Sigman D.S. The synthesis of enzyme-bound ATPby soluble chloroplast coupling factor 1J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N 4, p. 1676-1683.

13. Sakamoto J., Tonamura Y. Synthesis of enzyme-bound ATP bymitochondrial soluble F^-ATPase in the presence of dimetyl-sulfoxide.-J. Biochem., 1983, v. 93, N 6, p. 1601-1614.

14. Yoshida M. The synthesis of enzyme-bound ATP by the FpATPase from the thermophilic bacterium PS3 in 50% dimethylsul-foxide.-Bio chem. Biophys. Res. Commun., 1983, v. 114, N 3, p. 907-912.

15. Senior P.E. The structure of mitochondrial ATPase.-Biochim.

16. Biophys. Acta, 1973, v. 301, N 2, p. 249-277.- 121

17. Pedersen P.L. Mitochondrial adenosine triphosphatase.-Bioenergetics, 1975, v. 6, N 3, p. 243-275.

18. Amzel L.M. Structure of I^-ATPase.-J. Bioenerg. Biomembranes,1981, v. 13, N 3/4, p. 109-121.

19. Penefsky H.S., Warner R.C. Partial resolution of the enzymescatalysing oxidative phosphorylation. VI. Studies on the mechanism of cold inactivation of mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1965, v. 240, N 12, p. 46944802.

20. Farron P. Isolation and properties of a chloroplast couplingfactor and heat-activated adenosine triphosphatase.-Biochemistry, 1970, v. 9, N 19, p. 3823-3828.

21. Paradies H.H., Zimmermann J., Schmidt U.D. The conformationof chloroplast coupling factor 1 from spinach in solution J. Biol. Chens., 1978, v. 253, N 24, p. 8972-8979.

22. Moroney J.V., Lopresti L., McEwen B.F., McCarty R.E., Hammes

23. G.G. The IvI -value of chloroplast coupling factor 1.-FEBS Lett., 1983, v. 158, 11 1, p. 58-62.

24. Paradies H.H., Schmidt U.D. Size and molecular parameters ofadenosine triphosphatase from Escherichia coli.-J. Biol. Chem., 1979, v. 254, N 12, p. 25257-5263.

25. Senior A.E., Brooks J.C. The subunit composition of the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase.-FEBS Lett., 1971, v. 17, N 2, p. 327-329.- 122

26. Knowles A.F., Penefsky H.S. The subunit structure of beefheart mitochondrial adenosine triphosphatase.-J, Biol, Chem., 1972, v. 247, N 20, p. 6624-6630.

27. Spitsberg V.L., Blair J.E. Evidence supporting the identityof beef heart mitochondrial chloroform released adenosine triphosphatase (ATPase) with coupling factor 1.~Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 460, N 1, p. 136-141•

28. Di Pietro A., Godinot C., Bouillant M.-L., Gautheron D.C.

29. Pig heart mitochondrial ATPase: properties of purified and membrane bound enzyme. Effects of flavonoids.-Biochimie, 1975, v. 57, N 5, p. 959-967.

30. Catterall W.A., Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase fromrat liver. I. Purification, homogeneity and physical properties.- J. Biol. Chem., 1971, v. 246, N 16, p. 4987-4994.

31. Cannon В., Vogel G. The mitochondrial ATPase of brown adipose tissue. Purification and comparison with the mitochondrial ATPase from beef heart.-FEBS Lett., 1977, v. 76, N 3, p. 284-289.

32. Takeshige K., Hess В., Böhm M., Zimmermann-Telshow. Mitochondrial adenosinetriphosphatase from yeast Saccharomyces cerevisiae. Purification, subunit structure and kinetics Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem., 1976, v. 357, p. 1б05-1б22.

33. Tzagoloff A., Meagher P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamicin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.-J. Biol. Chem., 1971, v. 246, IT 23, p. 73287336.

34. Senior A.E. The mitochondrial ATPase. In: Membrane proteinsin energy transduction/ed. by Capaldi R.A. New York and Basel: Marcel Dekker Inc., 1979, p. 233-278.- 123

35. Kozlov I.A., Mikelsaar. On the subunit structure of solublemitochondrial ATPase .-FEBS Lett., 1974, v. 43, N2, p. 212214.

36. Тихонова Г.В., Бикетов С.Ф., Кашо В.Н., Козлов И.А., Милейковокая Е.И., Островский Д.Н., Симакова И.М., Скулачев В.П. Особенности субъединичного состава Н+-АТФ-азы из анаэробной бактерии UcbbcuAsÄIr Биохимия, 1983, т. 48, № 9,с.1560-1568.

37. Biketov S.F., Kasho V.Ii., Kozlov I.A., Mileykovskaya Y.I.,

38. Ostrovsky D.N., Skulachev V.P., Tikhonova G.V., Tsuprun V.L. Eur. J. Biochem., 1982, v. 129, N 2, p. 241-250.

39. Futai M., Sternweis P.C., Heppel L.A. Purification and properties of reconstitutively active and inactive adenosine-triphosphatase from Escherichia coli.-Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1974, v. 71, N 7, p. 2725-2729.

40. Yonis H.M., Winget G.D., Racker E. Requirement of the $ subunit of chloroplast coupling factor 1 for photophosphoryla-tion.-J. Biol. Chem., 1977, v. 252, N 5, p. 1814-1818.

41. Gatterall W.A., Coty W.A., Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from liver mitochondria. III. Subunit composition.-J. Biol. Chem., 1973, v. 248, N 21, p. 7427-7431.

42. Senior A.E, Mitochondrial adenosine triphosphatase. Locationof sulfhydryl groups and disulfide bonds in the soluble enzyme from beef heart .-Biochemistry, 1975, v. 14, N 4, p. 660-664.

43. Verschoor G.J., Van der Sluis P.R., Slater E.C. The binding of aurovertin to isolated £ -subunit of (mitochondrial

44. ATPase). Stoichiometry of subunit in Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 462, N 3, p. 438-449.

45. Stutterheim A., Hennecke M.A., Berden J.A, Studies of thestructure and conformation of yeast mitochondrial ATPase- 124 using aurovertin and methanol as probes.-Biochim. Biophys, Acta, 1980, v. 592, N 3, p. 415-430.

46. Baird B.A., Hammes G.G. Chemical cross-linked studies ofbeef heart mitochondrial coupling factor 1.-J. Biol. Chem.,1977, v. 252, N45, p. 4773-4748.

47. Amzel L.M., Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from ratliver mitochondria. Crystallization and X-ray diffraction studies of the F .j-component of the enzyme.-J. Biol. Chem.,1978, v. 253, N 7, p. 2067-2069.

48. Todd R.D., Giesenbeck T.A,, Douglas M.G. The yeast mitochondrial adenosine triphosphatase complex. Subunit stoichio-metry and physical characterization.-J. Biol. Chem., 1980, v. 255, N 11, p. 5461-5467.

49. Gregory R., Hess B, The sulfhydryl content of yeast mitochondrial F-j ATPase and the stoichiometry of subunits.-FEBS Lett., 1981, v. 129, N 2, p. 210-214.

50. Esch F.S., Allison ÏÏ.S. On the subunit stoichiometry of the

51. F.j-ATPase and the sites in it that react specifically with p-fluorosulfonylbenzoyl-5'-adenosine.-J. Biol, Chem., 1979, v. 254, N 21, p. 10740-10746.

52. Walker J.E., Saraste M., Gay N.J. The une operon: nucleotidesequence, regulation and structure of ATP-synthase.-Biochim. Biophys. Acta, 1984, v. 768, p. 164-200.

53. Linnett P.E., Mülheim L.J., Beechey R.B. The stoichiometryof binding of the aurovertin to mitochondrial ATPases: revision of molar absorption coefficient.-J. Bioenerg. Bio-membr., 1983, v. 15, N 2, p. 81 -91.

54. Issartel J.P., Klein G., Satre M., Vignais P.V. Binding of

55. Yoshida M., Sone N., Hirata H., Kagawa Y. Evidence for threeeh subunits in one molecule of F^-ATPase from thermophilic bacterium PS-3.~Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, v. 84, N 1, p. 117-122.

56. Satre H., Lunardi J., Pougeois R., Vignais P.Y. Inactivationof Escherichia coli BF .j-ATPase by dicyclohexylcarbodiimide. Chemical modification of the J) -subunit.-Biochemistry, 1979, v. 18, N 13, p. 3134-3140.

57. Satre M., Bof M., Issartel J.-P., Vignais P.V. Chemical modification of F^-ATPase by diciclohexylcarbodiimide: application to analysis of the stoichiometry of subunits in Escherichia'coli P^.-Biochemistry, 1982, v. 21, IT 19, p. 4772-4776.

58. Bragg P.D., Hou C. Subunit composition, function and spatial2.f- 2+arrangement in the Ca and Mg -activated adenosine triphosphatases of Escherichia coli and Salmonella typhimu-rium. - Arch. Biochem. Biophys., 1975, v. 167, N 2, p. 311321.

59. Morphology, subunits and chemical composition.-J. Biochem., 1976, v. 80, II 1, p. 141-151.

60. Dunn S.D., Futai M. Reconstitution of a functional couplingfactor from the isolated subunits of Escherichia coli F^-ATPase. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, II 1, p. 113-118.

61. Yoshida M., Sone N., Hirata H., Kagawa Y. Reconstitution ofadenosine triphosphatase of thermophilic bacterium from purified individual subunits.-J. Biol. Chem., 1977, v. 252, N 10, p. 3480-3485.

62. Nelson N. Structure and function of chloroplast ATPase.

63. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 456, N 3/4, p. 314-338.

64. Baird B., Hammes G.G. Chemical cross-linking studies ofchloroplast coupling factor 1.-J. Biol. Chem., 1976, v. 251, N 18, p. 6953-6962.

65. Binder A., Jagendorf A., Ngo E. Isolation and compositionof the subunits of spinach chloroplast coupling factor protein.-J. Biol. Chem., 1978, v. 253, N 9, p. 3094-3100.

66. Merchant R., Shanner S.L., SelmaxL B.R. Molecular weight andsubunit stoichiometry of the chloroplast coupling factor 1 from Chlamydomonas reinhardii.-J. Biol. Chem., 1983, v.258, N 2, p. 1026-1031.

67. Harris D.A. The coupling ATPase complex: an evolutionary view.-Biosystems, 1981, v. 14, N 1, p. 113-121.

68. ICanazawa H., Kayano Т., Kiyasu Т., Futai M. Nucleotide sequence of the genes for J and £ subunits of proton-translocating ATPase from Escherichia coli.-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1982, v. 105, N 4, p. 1257-1264.

69. Vignais P.V., Satre M. Recent developments on structuraland function aspects of the F1 sector of H+-linked ATPase.-Mol. Cell Biochem. 1984, v. 60, N 1, p. 33-70.

70. Ovchinnikov Yu.A., Modyanov N.N., Grinkevich V.A., Aldanova

71. Kozlov I.A., Kondrashin A.A,, Kononenko V.A., Metelsky S.T.

72. Functional role of soluble mitochondrial ATPase subunits.-Bioenergetics, 1976, v. 8, N 1, p. 1-7.

73. Kagawa Y., Nukiwa N. Conversion of stable ATPase to labile

74. ATPase by acetylation, and the ¿ji and df subunit complexes during its reconstitution.-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981, v. 100, N 3, p. 1370-1376.

75. Yoshida M., Okajnoto H., Sone N., Hirata H., Kagawa Y. Reconstitution of thermostable ATPase capable of energy coupling from its purified subunits.-Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1977, v. 74, N 3, p. 936-940.- 128

76. Vogel G., Steinhart R. ATPase of Escherichia coli: purification, dissociation and reconstitution of the active complex from the isolated subunits.-Biochemistry, 1976, v, 15, N 2, p. 208-216.

77. Larson R.J., Smith J.B. Assembly of the catalytic unit ofthe Escherichia coli membrane ATPase in vitro requires the ^ chain.-Biochemistry, 1977, v. 16, IT 19, p. 4266-4270.

78. Futai M. Reconstitution of ATPase activity from the isolated

79. J, ,ß and £ subunits of the coupling factor . F^ of Escherichia coli.-Biochem. Biophys. Res. Commun.,1977, v. 79,1. 6 , p. 1231-1237.

80. Dunn S.D. The isolated^subunit of Escherichia coli F1-ATPase binds the S subunit.-J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N 10, p. 7354-7359.

81. Smith J.B., Sterweis . Purification of membrane attachmentand inhibitory subunits of the proton translocating adenosine triphosphatase from Escherichia coli.-Biochemistry, 1977, v. 16, IT 2, p. 306-311.

82. Andreo C.S., Patrie W.J., McCarty R.E. Effect of ATPase activation and the Si subunit of coupling factor 1 on reconstitution of phosphorylation.-J, Biol. Chem., 1982, v. 257, IT 17, p. 9968-9975.

83. Lunardi J., Lauquin G.J.M., Vignais R.V. Interaction of azidonitrophenylaminobutyryl-ADP, a photoaffinity ADP analog, with mitochondrial adenosine triphosphatase. Identification of the label subunits.-FEBS Lett., 1977, v. 80, IT 2, p. 317323.

84. Cosson J.J., Guillory R.J. The use of arylazido-j3-alanyl

85. ATP as photoaffinity label for the isolated and membranebound mitochondrial ATPase complex,-J.Biol. Chem., 1979, v. 254, N 6, p. 2946-2955.- 129

86. Lubben M., Lücken V., Weber J., Schäfer G. Azidonaphtoyl

87. ADP: a specific photolabel for the high-affinity nucleoti-de-binding sites of F.j-ATPase.-Eur. J. Biochem., 1984? v. 143, N 3, P. 483-490.

88. Lunardi J'*', Satre-M», Vignais P.V. Exploration of adenosine~5'-diphosphate adenosine-5'-triphosphate binding sites of Escherichia coli. Adenosine-5'-triphosphatase with arylazide adenine nucleotides.-Biochemistry, 1981, v. 20, N 3, P. 473-480.

89. Carlier H.-F., Holowka D.A., Hammes G.G. Interaction ofphotoreactive and fluorescent nucleotides with chloroplast coupling factor 1,-Biochemistry, 1979, v. 18, N 16, p.3452-3457.

90. Bruist Iii.F., Hammes G.G. Further characterization of nucleotide binding sites on chloroplast coupling factor 1.-Biochemistry, 1981, v. 20, N 22, p. 6298-6305.

91. Lunardi J., Vignais P.V. Studies of the nucleotide-bindingsites on mitochondrial F^-ATPase through the use of a pho-toactivable derivative of adenylylimidodiphosphatQiBiochim. Biophys. Acta, 1982, v. 682, N 1, p. 124-134.

92. Williams N., Coleman P.S. Exploiring the adenine nucleotidebinding sites on mitochondrial F-|-ATPase with a new photo-affinity probe, 3'-0-(4-benzoyl)benzoyl adenosine 5'-triphosphate .-J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N 6, p. 2834-2841.

93. Bar-Zvi D., Tiefert M.A., Shavit N. Interaction of the chloroplast ATP synthetase with the photoreactive nucleotide 3'-0-(4-benzoyl)benzoyl adenosine 51-diphosphate.-FEBS Lett., 1983, v. 160, N 1/2, p. 233-238.

94. Wagenvoord H.J., Van der Kraan I., Kemp A. Specific photolabelling of beef-heart mitochondrial ATPase by 8-azido--ATP.~Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 460, N1, p. 17-24.- 130

95. Wagenvoord R.J., van der Kraan I., Kemp A. Localization ofadenine nucleotide-binding sites on beef-heart mitochondrial ATPase by photolabelling with 8-azido-ADP and 8-azido--ATP.-Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 548, N 1, p. 85-95.

96. Wagenvoord R.J., Verschoor G.J., Kemp A. Photolabelling with8.azido-adenine nucleotides of adenine nucleotide-binding sites in isolated spinach chloroplast ATPase (CP^).-Bio-chim.-Biophys. Acta, 1981, v. 634, N 2, p. 229-236.

97. Verheizen J.H., Postma P.V., Van Dam K. Specific labellingof the (Ca2+ + Mg2+)-ATPase of Escherichia coli with 8-azido-ATP and 4-chloro-7-nitrobenzofurazan.-Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 502, N 2, p. 345-353.

98. Scheurich P., Schäfer H.-J., Dose K. 8-azido-adenosine5'-triphosphate as a photoaffinity label for bacterial P1-ATPase.- Eur. J. Biochem., 1978, v. 88, N 2, p. 253-257.

99. Schäfer H.-J., Scheurich P., Rathgeber G., Dose K., Kagawa Y.

100. Photoaffinity labeling of the coupling factor 1 from the thermophilic bacterium PS-3 by 8-azido-ATP.-PEBS Lett., 1984, v. 174, N 1, p. 66-70.

101. Sheurier P., Dose K. Photoaffinity labeling'of a low affi- 131 nity nucleotide binding site on the ß subunit of yeast mitochondrial F., -ATPase.-FEBS Lett., 1979, v. 108, N2 p. 253-258.

102. Budker V.G., Kozlov I.A., Kurbatov V.A., Milgrom Ya.M.

103. The interaction of mitochondrial ATPase with an alkylating ATP-analogFEBS Lett., 1977, v. 83, N 1, p. 11-14.

104. Esch F.S., Allison W.S. Identification of a tyrosine residue at a nucleotide binding site in the J3 -subunit of the14mitochondrial ATPase with p-fluorosulfonyl ^"C -benzoyl--5'-adenosine.-J. Biol. Chem.,/3?8 , v. 253, N 17, P.6100-6106.

105. Bitar K.G. Modification of F^-ATPase from yeast Saccharo3myces cerevisiae with 5'-p- H -fluorosulfonylbenzoyl adenosine .-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1982, v. 109, N 1, p. 30-35.

106. Di Pietro A., Godinot C., Martin L.C., Gautheron D.C. Affinity labeling of catalytic and regulatory sites of pig heart mitochondrial F-|-ATPase by 5'-p-fluorosulfonylben-zoyladenosine.-Biochemistry, 1979, v. 18, N 9, p. 17381745.

107. Kozlov I.A., Milgrom Y.M, The non-catalytic nucleotide-bin-ding site of mitochondrial ATPase is localized on the 06-subunit(s) of factor F-j.-Eur. J. Biochem., 1980, v. 106, N 2, p. 457-462.- 132

108. Ferguson S.J., Lloyd V/.J., Lyons H.H., Radda G.K. The mitochondrial ATPase. Evidence for a single essential tyrosine residue.-Eur. J. Biochem., 1975, v. 54, N 1, p. 117126.

109. Ferguson S.J., Lloyd W.J., Radda G.K. The mitochondrial ATPase selective modification of a nitrogen residue in the subunit.-Eur. J. Biochem., 1975, v. 54, N 1, p. 127-133.

110. Deters D.W., Racker E., Nelson M., Nelson H. Partial resolution of the enzymes catalysing photophosphorylation. XV. Approaches to the active site of coupling factor 1.-J. Biol. Chem., 1975, v. 250, N 3, p. 1041-1047.

111. Lunardi J., Satre M., Bot M., Vignais P.V. Reactivity of the jB subunit of Escherichia coli adenosine triphosphatase with 4-chloro-7-nitrobenzofurazan.-Biochemistry, 1979, v.18, N 24, p. 5310-5316.

112. Pougeois R., Satre M., Vignais P.V. Reactivityiof mitochondrial F-j-ATPase to dicyclohexylcarbodiimide. Inactivation and binding studies.-Biochemistry, 1978, v. 18, N 8, p.1408-1413.

113. Shoshan V., Selman B.R. The interaction of N,N'-dicyclohe-xylcarbodiimide with chloroplast coupling factor 1J. Biol. Chem., 1980, v. 255, N 2, p. 384-3Q9.

114. Pougeois R., Satre M., Vignais P.V. N-ethoxycarbonyl-2-etho-xy-1,2-dihydroquinoline, a new inhibitor of the mitochondrial F1-ATPase.-Biochemistry, 1978, v. 17, N 18, p. 3018-3023.

115. Ингибирование митохондриальной АТРазы водорастворимым кар-бодиимидом.-Биохимия, 1979, т.43, № 8, с.1404-1413.

116. Laikind P.K., Allison W.S. Quinacrine mustard inactivates the bovine heart mitochondrial F^-ATPase with the modification of the jS subunit.-J. Biol. Chem., 1983, v. 258,1. N 19, p. 11700-11704.

117. Schäfer H.-J., Mainka L., Rathgeber G., Zimmer G. Photoaffinity cross-linking of oligomycin-sensitive ATPase from heart mitochondria by 3'-arylazido-8-azido ATP.-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, v. 111, N 2, p. 732-739.

118. Kagawa Y., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. X. Correlation of morphology and function in submitochondrial particles.

119. J. Biol. Chem., 1966, v. 241, N 10, p. 2475-2482.

120. Catterall V/.A., Pedersen P.L. Structural and catalytic properties of mitochondrial adenosine triphosphatase.-Biochem. Soc. Spec. Publ., 1974, v. 4, p. 63-88.

121. Howell S.H., Houdrianakis E.H. Function of the "quantasoma" in photosynthesis: structure and properties of membrane-bound particles active in the dark reactions of photophos-phory1ation.-Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1967, v. 58, N 5,p. 1261-1268.- 134

122. Munoz E., Freer J.H., Ellar D.J., Saltor M.R.J. Membrane-associated ATPase activity from Micrococcus lysodeikticus.-Biochim. Biophys. Acta, 1968, v. 150, IT 3, p. 531-533.

123. Wakabayashi T., Kubota M., Yoshida M., Kagawa Y. Structure of ATPase (coupling factor TF^) from a thermophilic bacterium.- J. Mol. Biol., 1977, v. 117, N 3, p. 515-519.

124. Schnebli H.P., Vatter A.E., Abrams A. Membrane adenosine triphosphatase from Streptococcus faecalis. Molecular weight, subunit structure, and amino acid composition.-J. Biol. Chem., 1970, v. 245, IT 5, p. 1122-1127.

125. Wingfield P.T., Boxer D.H. Cross-linking of-isolated oligo-mysin-insensitive adenosine triphosphatase from ox heart mitochondria.-Biochem. Soc. Trans., 1975, v. 3, N 4, p.763-765.

126. Satre M., Klein G., Vignais P.V. Structure of beef heart mitochondrial F^-ATPase. Arrangement of subunit as disclosed by cross-linking reagents and selective labelling by radioactive ligands.-Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 453, IT 1, p. 111-120.2+

127. Bragg P.D., Hou C. Cross-linking of minor subunits in Ca ,2+

128. Mg -activated ATPase of Escherichia coli.-Biochem, Biophys. Res. Commun., 1976, v. 72, IT 6,p. 1042-1046.

129. Enns R., Cridde R.S. Investigation of the structural arrangement of the protein subunits of mitochondrial ATPase Arch. Biochem. Biophys., 1977, v. 183, IT 2, p. 742-752.

130. Kozlov I.A., Skulachev V.P. An H+-ATP synthetase: a substrate translocation concept.-Gurr. Top. in membranes and transport, 1982, v. 16, p. 285-301.

131. Farron P., Racker E. Studies on the mechanism of the conversion of coupling factor 1 from chloroplasts to an active adenosine triphosphatase .-Biochemistry, 1970, v. 9, N 19, p. 3829-3836.

132. Hoch G., Martin J. Photo-potentiation of adenosine triphosphate hydrolysis .-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1963,v. 12, N 3, p. 223-228.

133. Marchant R.H., Packer L. Light and dark stages in the hydrolysis of adenosine triphosphate by chloroplasts.-Biochim. Bipphys. Acta, 1963, v. 75, N 3, p. 458-460.- 136

134. Ebel R.E., Lardy H.A. Stimulation of rat liver mitochondrial adenosine triphosphatase by anions.-J. Biol. Chem., 1975,v. 250, N 1, p. 191-196.

135. Козлов И.А., Метельская В.A., Михайлов C.H., Новикова И.Ю.,

136. Флорентъев B.JI. Субстратная специфичность растворимой митохондрий АТРазы.-Биохимия, 1979, т.43,№ 4, с.702-707.

137. Harris D.A., Gomez-Fernandez J.С,, Klungsyer L., Radda G.K, Specificity of nucleotide binding and coupled reactions utilizing the mitochondrial ATPase.-Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 504, N 2, p. 364-383.

138. Schäfer G., Onur G., Schlegel H, Use of modified adenine nucleotides in mechanistic studies on oxidative phosphorylation: structure and space at. the catalytic site,-J. Bio-energ. Biomembranes, 1980, v. 12, IT 3/4, p. 213-232.

139. Selwyn H.J. Preparation and general properties of a soluble adenosine triphosphatase from mitochondria.-Biochem. J., 1967, v. 105, N 2, p. 279-288.

140. Dorgan L.J., Urbauer J.L., Shuster S.H. Metal dependence and thermodynamic characteristics of the beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1984, v. 259, N 5, p. 2816-2821.

141. Козлов И.А., Кононенко B.A. Взаимодействие растворимой ми-тохондриальной АТФазы с адениновыми нуклеотидами и Mg2*.

142. Биоорг.Хим., 1975, т.1, Л II, с.1545-1569.

143. Schuster S.M., Ebel R.E., Lardy H.A. Kinetic studies on rat liver and beef heart mitochondrial ATPase. Evidence for nucleotide binding at separate regulatory and catalytic sites.-J. Biol. Chem., 1975, v. 250, IT 19, p. 7848-7853.

144. Chernyak B.V., Chernyak V.Y., Gladysheva T.B., Kozhanova

145. Z.E., Kozlov I.A. Structural rearrangements in soluble- 137 mitochondrial ATPase.-Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 635, N 3, p. 552-570.

146. Cross R.L., Nalin C.M. Adenine nucleotide binding sites on beef heart P^-ATPase. Evidence for three exchangeable sites that are distinct from three noncatalytic sites.

147. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N 6, p. 2874-2881.

148. Harris D.A. The interaction of coupling ATPases with nucleotides.-Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 463, N 3/4, p. 245273.

149. Harris D.A., Radda G.K., Slater E.C. Tightly bound nucleotides of the energy-transduction ATPase, and their rolein oxidative phosphorylation. II. The beef heart mitochondrial system.-Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 459, H 3, p. 560-572.

150. Garrett N.E., Penefsky H.S. Interaction of adenine nucleotides with multiple binding sites on beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1975, v. 250, N 17, p. 6640-6647.

151. Tamura J.K., Wang J.H. Changes in chemical propertied of mitochondrial adenosine triphosphatase upon removal of tightly bound nucleotides.-Biochemistry, 1983, v. 22, N 8, p. 1947-1954.

152. Leimgruber R.M., Senior A.E. Removal of "tightly bound" nucleotides from soluble mitochondrial adenosine triphosphatase (p^.-j. Biol. Chem., 1976, v. 251, Ii 22, p. 71037109.

153. Senior A.E., Richardson L.V., Baker K., Wise J.P. Tight divalent cation-binding sites of soluble adenosine triphosphatase (P.j ) from beef heart mitochondria and Escherichia- 138 coli.-J. Biol. Chem., 1980, v. 255, N 15, p. 7211-7217.

154. Catterall W.A., Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from rat liver mitochondria. II. Interaction with adenosine diphosphate.-J. Biol. Chem., 1972, v. 247, N 24, p.7969-7967.

155. Hilborn D.A., Hammes G.G. Equilibrium binding of nucleotides to beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase.-Biochemistry, 1973, v. 12, N 5, p. 983-990.

156. Cantley L.C., Hammes G.G. Characterization of nucleotide binding sites on chloroplast coupling factor 1 .-Biochemistry, 1975, v. 14, N 13, p. 2968-2975.

157. Harris D.A., Batlscheffsky M. Bound nucleotide and phosphorylation in Rhodospirillum rubrum.-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, v. 86, N 4, p. 1248-1255.

158. Gresser M., Cardon J., Rosen G., Boyer P.D. Demonstration and quantitation of catalytic and noncatalytic bound ATP in submitochondrial particles during oxidative phosphorylation.- J. Biol. Chem., 1979, v. 254, N 19 , p. 10649-10653.

159. Schlodder E., Witt H.T. Relation between the initial kinetics of ATP synthesis and of conformational changes in the chloroplast I ATPase studied by external field pulses. -Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 635, IT 3, p. 571-584.

160. Senior A.E., Wise J.F. The proton-ATPase of bacteria and mitochondria.-J. Membrane Biol., 1983, v. 73, li 1, p. 105124.- 139

161. Penefsky H.S. Reversible binding of P^ by beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1977, v. 252, N 9, p. 2891-2899.

162. Kasahara M., Penefsky H.S. High affinity binding of monovalent P^ by beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1978, v. 253, N 12, p. 4180-4187.

163. Pougeois R., Lauquin G., Vignais P.V. Interaction of 4-azido-2-nitrophenzl phosphate, an inorganic phosphate photoreactive analogue, with chloroplast coupling factor 1 Biochemistry, 1983, v. 22, N 5, p. 1241-1245.

164. Moyle J., Mitchell P. Active/inactive transitions of mito2+chondrial ATPase molecules influenced by Mg anions and aurovertin.-FEBS Lett., 1975, v. 56, 11 1, p. 55-61.

165. Di Pietro A., Penin F., Godinot C., Gautheron D.O. "Hysteric" behavior and nucleotide binding sites of pig heart mitochondrial Fpadenosine 5'-triphosphatase.-Biochemistry, 1980, v. 19, N 25, p. 5671-5678.

166. Harris D.A., Dall-Larsen T., Klungsoyr L. Studies of the kinetics of the isolated mitochondrial ATPase using dinitrophenol as a probe.-Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 635, N 3, p. 412-428.

167. Thomassen J., Klungsoyr L. ATPase of bovine heart mitochondria. Modulation of ITPase activity by ATP, AJDP, acetylATP and acetyl AMP,-Biochim. Biophys. Acta, 1983, v. 723, N 1, p. 114-123.

168. Pitin A.P., Yasilyeva E.A., Vinogradov A.D. An inhibitory high affinity binding site for ADP in the oligomycin-sen-sitive ATPase of beef heart submitochondrial particles.-Biochem. Biophys. Res. Commun.,- 1979, v. 82, N 2, p. 434439.

169. Minkov I.B., Pitin A.P., Vasilyeva E.A., Vinogradov A.D.2+

170. Mg -induced ADP-dependent inhibition of the ATPase activity of beef heart mitochondrial coupling factor P^. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, v. 89, N 4, p. 13001307.

171. Vasilyeva E.A., Pitin A.P., Minkov I.B., Vinogradov A.D. Kinetics of interaction of adenosine diphosphate and adenosine triphosphate with adenosine triphosphatase of bovine heart submitochondrial particles.-Biochem. J., 1980, v. 188, N 3, p. 807-815.

172. Minkov I.B., Vasilyeva E.A., Pitin A.P., Vinogradov A.D. Differential effects of ADP on ATPase and oxidative phosphorylation in submitochondrial particles .-Biochem. Int., 1980, v. 1, N 5, p. 478-485.

173. Vasilyeva E.A., Minkov I.B., Pitin A.P., Vinogradov A.D., Kinetic mechanism of mitochondrial adenosinetriphosphatase. ADP-specific inhibition as revealed by the steady-state- 141 kinetics.-Biochem. J., 1982, v. 202, If1, p. 9-14.

174. Vasilyeva E.A., Minkov I.B., Fitin A.P., Vinogradov A.D. Kinetic mechanism of mitochondrial adenosine triphosphatase. Inhibition by azide and activation by sulphite.-Biochem.J., 1982, v. 202, N 1, p. 15-23.

175. Yalamova M.V., Vasilyeva E.A., Vinogradov A.D. Mutually dependent influence of ADP and P^ on the activity of mitochondrial adenosine triphosphatase .-Biochem. Int., 1983,1. N 4, p. 337-344.

176. Rectenwald D., Hess B. Pre-steady kinetics of nucleotide-triphosphate hydrolysis by mitochondrial F.^-ATPase from yeast .-FEBS Lett., 1979, v. 108, N 1, p. 257-260.

177. Roveri O.A., Muller J.L.M., Slater E.G. The pre-steady state and steady-state kinetics of the ATPase activity of mitochondrial F^.-Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 589,1. N 2, p. 241-255.2+

178. Hackney D.D. Interaction of Mg with beef heart mitochondrial ATPase (F^).-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979,v. 91, N 1, p. 233-238.

179. Carmeli C., Lifschitz Y. Effects of P± and ADP on ATPase activity in chloroplasts .-Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 267, N 1, p. 86-95.

180. Bar-Zvi D., Shavit N. Role of tight nucleotide binding in the regulation of the chloroplast ATP synthetase activities.-FEBS Lett., 1980, v. 119, N 1, p. 68-72.

181. Dunham K.R., Selman B.R. Regulation of spinach chloroplast coupling factor 1 ATPase activity.-J. Biol. Chem., 1981, v. 256, N 1, p. 212-218.

182. Czarnecki J.J., Abbott M.S., Selman B.R. Localization of the tight ADP-binding site on the membrane-bound chloroplast- 142 coupling factor one .-Eur, J. Biochem., 1983, v. 13б, H 1, p. 19-24.

183. Smith L.T., Rosen G., Boyer P.D. Properties of ATP tightly bound to chloroplast ATPsynthase.-J. Biol. Chem., 1983,v. 258, IT 18, p. 10887-10894.

184. Repke K.R.II., Schon R. Flip-flop model of energy interconversion by ATP synthetase.-Acta biol. Med. Germ., 1974,v. 33, IT 1,p. K27-K38.

185. Adolfsen R., Moudrianakis E.N. Binding of adenine nucleotides to purified 13S coupling factor of bacterial oxidative phosphorylation.-Arch. Biochem. Biophys., 1976, v. 172,1. U 2, p. 425-433.

186. Kayalar C., Rosing J., Boyer P.D. An alternative site sequences .' for oxidative phosphorylation suggested by measurement of substrate binding patterns and exchange reaction inhibitions. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, IT 8,p. 2486-2491.

187. Дробинекая И.Е. Изучение структурных перестроек и механизма функционирования митохондриальной АТФазы: Автореф.канд.дис. М., 1984.

188. Kasho V.N., Boyer P.D. Relationship of inosine triphosphate and bicarbonate effects on F^ATPase to the alternating site mechanism.-J. Bioenerg.Biomembr., 1984, v.16, N 5/6, p. 445467.- 143

189. Shuster S.M., Gepstein R.J., Lardy H.A. Effect of inosine-5'-(J* y -imido)triphosphate and other nucleotides on beef heart mitochondrial ATPase.-J.Biol.Chem., 1976, v. 251,1. 21, p. 6705-6710.

190. Penefsky H.S. Differential effects of adenylyl imidodiphos-phate on adenosine triphosphates synthesis and the partial reactions of oxidative phosphorylation.-J.Biol.Chem., 1974, v. 249, N 11, p. 3579-3585.

191. Heet K.N. Cooperativity in enzyme function: equilibrium and kinetic aspects.-Methods in Enzymol., 1980, v. 64, p. 139192.

192. Choate G., Hutton R.L., Boyer P.D. Occurrence and significance of oxygen exchange reactions catalysed by mitochondrial adenosine triphosphatase preparation.-J. Biol. Chem., 1979, v. 254, N 2, p. 286-290.

193. Hutton R.L., Boyer P.D. Subunit interaction during catalysis. Alternating site cooperativity of mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1979, v. 254, IT 20, p. 9990-9993,

194. Grubmeyer C., Penefsky H.S. The presence of two hydrolysis sites on beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase."" J. Biol. Chem., 1981, v. 256, N 8, p. 3718-3727.

195. Grubmeyer C., Penefsky H.S. Cooperativity between catalytic sites in the mechanism of action of beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1981, v. 256,1. 8, p. 3728-3734.

196. Grubmeyer C., Cross R.L., Penefsky H.S. Mechanism of ATP hydrolysis by beef heart mitochondrial ATPase. Rate constants for elementary steps in catalysis at a single site.-J.Biol. Chem., 1982, v. 257, N 20, p. 12092-12099.- 144

197. Gross R.L., Grubmeyer С., Penefsky H.S. Mechanism of ATP hydrolysis by beef heart mitochondrial ATPase. Rate enhancements resulting from cooperative interactions between multiple catalytic sites.-J. Biol. Chem., 1982, v. 257,1. N 20, p. 12100-12105.

198. Crane P.L., Glenn J.L., Green D.E. Studies on the electron transfer system. IV. The electron transfer particles.-Bio-chim. Biophys. Acta, 1956, v. 22, N 3,p. 475-488.

199. Knowles A.P., Penefsky H.S. The subunit structure of beef heart mitochondrial adenosine triphosphatase. Isolation procedure.-J. Biol. Chem., 1972, v. 247, N 20, p. 66176623.

200. Penefsky H.S. A centrifuge-column procedure for the measurement of ligand binding by beef heart P^Methods Enzymol. 1979, v. 56, p. 527-530.

201. Priebel K., Huth H., Jany K.D., Trommer W.E. Semi-reversible cross-linking. Synthesis and application of a novel heterobifunctional reagent.-Hoppe-Seyler's Z. physiol. chem., 1981, v. 362, S. 421-428.

202. Готтих Б.П., Краевский А.А., Пурыгин П.П. Аминоацильные производные нуклеозидов, нуклеотидов и полинуклеотидов. Синтез 3/(2/)-о-пептидил-нуклеотидов. Изв.АН СССР. Сер.хим., 1970, т.5, J& 8, C.II04-II09.

203. Munson К.В. Light dependent inactivation of (Na+, K+)-ATPase with a new photoaffinity reagent, chromium aryl-azido-ji -alanyl ATP.-J. Biol. Chem., 1981, v. 256, N 7, p. 3223-3230.

204. Ridström J. Assay of nicotinamide nucleotide transhydroge-nases in mammalian? bacterial and reconstituted system.-Methods Enzymol., 1979, v. 55, p. 261-275.

205. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations dodecyl sulfate-Polyacrylamid gel electrophoresis.- J. Biol. Chem., 1969, v. 244, N 16, p. 4406-4412.

206. Lowry O.H., Rosebrough 1T.G., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurements with folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, IT 1,p. 265-275.

207. Gornall A.G., Bardawill C.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction.-J.Biol. Chem., 1949, v. 177, W 2, p. 751-767.

208. Sakamoto J. Identification of the nucleotide-binding site for ATP synthesis and hydrolysis in mitochondrial soluble P1-ATPase.-J. Biochem., 1984, v. 96, IT 2, p. 475-481.

209. Sakamoto J. Effect of dimethylsulfoxide on ATP synthesis by mitochondrial soluble P^-ATPase.-J. Biochem., 1984, v. 96, IT 2, p. 483-487.

210. Schuster S.M., Reinhardt G.D., Lardy H.A. Studies . on the kinetic mechanism of oxidative phosphorylation.-J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 427-432.

211. Komatsu-Takaki M. Inorganic phosphate-dependent ADP binding on the chloroplast coupling factor and its participation in ATP synthesis.-J. Biochem., 1983, v. 94, N 5, p. 1095-1100.

212. Yeates R.A. Interaction of beef heart mitochondrial ATPase, coupling factor F.j, vri.th aurovertin.-Biochim. Biophys. Acta, 1974, v. 333, N 2, p. 173-179.

213. Керимов T.M., Мильгром Я.М., Козлов И.А., Ругге Э.К. Изучение конформационных изменений в растворимой митохондриалъной АТРазе методом спиновых меток¿Биохимия,1978,т.43,$ 8,с.1525-31.

214. Mitchell P. Cation-translocating adenosine triphosphatase models: how direct is the participation of adenosine triphosphate and its hydrolysis products in cation translocation?- PEBS Lett., 1973, v. 33, N 3, p. 267-274.

215. Hammes G.G. Unifying concept for the coupling between ion pumping and ATP hydrolysis or synthesis.-Proс. Natl. Acad. Sci USA, 1982, v. 79, N22, p. 6881-6884.

216. Виноградов А.Д. Каталитические свойства АТФсинтетазы митохондрий. Биохимия, 1984, т.49, 8, с.1220-1238.

217. Pedersen P.L. Adenosine triphosphatase from rat liver:separate sites involved in ATP hydrolysis and in the reversible, high affinity binding of ADP.-Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 64, N 2, p. 6Ю-616.

218. Holland P.C., LaBelle W.C., Lardy H.S. Differential inhibition of the exchange reactions associated with oxidative phosphorylation.-Biochemistry, 1974, v. 13, N 22, p. 45494553.

219. Melnik R.L., Ravares de Sousa L., Maquire J., Packer L. Action of the adenosine triphosphate analog, adenylyl- 147 imidodiphosphate in mitochondria.-Arch. Biochem. Biophys. 1975, v. 1бб, U 1, p, 139-144.

220. Melnik R.L., Donohue T. Use of an adenosine triphosphate analog, adenylyl imidodiphosphate, to evaluate adenosine triphosphate-dependent reaction in mitochondria.-Arch. Biochem. Biophys., 1976, v. 173, N 2, p. 231-236.

221. Chernj'-ak B.V., Kozlov I.A. Adenylylimidodiphosphate release from the active site of submitоchondrial particles ATPase.-FEBS Lett., 1979, v. 104, N 2, p. 215-219.

222. Гладышева Т.Б., Козлов И.А., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.Б. Исследование влияния мембранного потенциала на скорость гидролиза АТФ в субмитохондриальных частицах. Докл.АН СССР, 1984,т.276, В 4, с.980-983.

223. Pullman М.Е., Monroy G.C. A naturally inhibitor of mitochondrial adenosine triphosphatase.-J. Biol. Chem., 1963, v. 238, N 11, p. 3762-3769.

224. Harris D.A., Von Tschamer V., Radda G.K. The ATPase inhibitor protein in oxidative phosphorylation. The rate-limiting factor iro phosphorylation in submit о chondrial partic-les.-Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 548, II 1, p. 72-84.

225. Gomez-Puyon A., Tuena de Gomez-Puyon M., Ernster L. Inactive to active transitions of the mitochondrial ATPase complex as controlled by the ATPase inhibitог.-Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 547, N 2, p. 252-257.

226. Sorgato M.C., Galliazzo P., Valente M., Cavallini L., Pergusson S.J. Hydrolysis of ITP generates a membrane potential in submitochondrial particles.-Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 681, IT 2, p. 319-322.

227. Soong K.S., Wang J.H. Spontaneous reactivation of cova-lently labelled proton Adenosinetriphosphata.se.-Biochemistry, 1984, v. 23, IT 1, p. 136-141.

228. Kohlbrenner W.E., Boyer P.D. Catalytic Properties of beef heart mitochondrial ATPase modified with 7-chloro-4-nitro-benzo-2-oxa-1,3-diazole. J.Biol. Chem., 1982, v.257, N 7, p.3441-3446.

229. Лузиков В.H. Регуляция формирования митохондрий. Молекулярные аспекты.-М: Наука, 1980.

230. Matsuno-Yagi A., Hatefi Y. Inhibitory chemical modification of P^-ATPase: effects on the kinetics of adenosine-5'-triphosphate synthesis and hydrolysis in reconstituted system.-Biochemistry, 1984, v. 23, IT /7 , p. 3508-3514.- 149

231. Bar-Zvi D., Shavit N. Modulation of chloroplast ATPase by tight binding of nucleotides.-Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 681, N 3, p. 451-458.

232. Dunham K.R., Selman B.R. Interaction of inorganic phosphate with spinach coupling factor 1. Effects on ATPase and

233. ADP binding activity.-J. Biol. Chem., 1981, v. 256, N 19, p. 10044-10049.

234. Shonshan V., Strotmann. The effect of phosphate on light-induced exchange of ADP at the tight nucleotide binding site on CP1J.Biol.Chem., 1980, v. 255, N 3, p. 996-999.

235. Автор глубоко признателен Владимиру Петровичу Скулачеву за интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

236. Автор выражает искреннюю благодарность аспирантам и сотрудникам отделов биоэнергетики и изотопного анализа Межфакультетской проблемной лаборатории им.А.Н.Белозерско-го за постоянную дружескую помощь и поддержку.