Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование каталитических свойств F1-АТФаз анаэробной Lactobacillus casei и аэробной Micrococcus luteus бактерий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование каталитических свойств F1-АТФаз анаэробной Lactobacillus casei и аэробной Micrococcus luteus бактерий"

. • * if

российская акадеиия на? ордена ленина институт биохихии ин. а.н.баха

на правах рукописи УДК 577.158.8

КОРИЕР СВЕТЛАНА САМУИЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ FrAT©a3 АНАЭРОБНОЙ Lactobacillus easel) И АЭРОБНОЙ micrococcus luteus) БАКТЕРИИ.

03.00.04 - Биологическая хиния

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории Функциональной биохимии мембран института биохимии им. А.н.Баха РАН. .

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

е.н.островский

3 руководстве диссертацией принимала участие кандидат биологических наук Е.И.Нилейковская Официальные оппоненты: доктор биологических наук Р.А.Звягильская доктор биологических наук А.Н.Тихонов '

Диссертация направлена на официальный отзыв в Институт биохимии и физиологии микроорганизмов (г. пущино).

Зашита диссертации состоится 1992 Г.

•час. на заседании специализированного совета (К oo2.96.oi) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохинии им.А.Н.Баха РАЕ (И7071 Носква, Ленинский пр., зз, корп.г).

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН ¡117071 Носква, ленинский пр., зз, корп.1).

Автореферат разослан "2-0" 1992 г.

Ученый секретарь специализированного ссьета доктор биологических наук н.и.нолчанов

ОНлЛЛ ХЛРДК'

актузльность ~ ? а б г. е! к и. изучений лрсчесссз п?есорз"о?эния :-:герг.";: ; - слна у.э оулзаиентэльн:;^ ":?.длч

современно?: бвохингге. ог=с:шый зклал з сояииашге '.«аиизкиз. лехапих з основа этих г.ропессоз, зиеслг съзлаиие и эксперимента ль пая разработка лринп.чпа хенпсс.чсгическогз сопряжения, лрелполагяллего запасание энергии з пиле трзнсменбрг.гп;с.1 с разности электрохимических потенпмалоз чсяов зезорода (л/1.,4' лря работа дихательноя лепи и а'-ятезаы. Основной зала ■-•ей з. настсяшез зремя стало выяснение конкретных нолекуляшых . Механизмов сункпкоикрсвгнкя. оеркентоз - лресбразовагелеа зттерпш, л з первую очередь загкеяшего фермента системы энергообеспечения клетки - :г*-АТ5азного комплекса, имеюпаяся кнсаркапия о стуктуре и каталитических свойствах этого эермента. выделенного из иенбран митохондрий, хлоропластов и пелого ряда бактерия. свидетельствует о высокой степени слохности изучаеноп системы, сравнение а+-АТФаз из различных источников показало, что при сохранении единого плана строения - эти комплексы состоят из двух частей: фактора Г1 - каталитической части, и вактора Ко - н*-проводяпего канала, погругенного з гидроообный слой ненбраны -. наблюдается вариабильность полипептидного состава кахпого из компонентов комплекса, причем н*-АТФазы зукариотических клеток состоят из большего количества разных полиаептидов. несмотря на наличие богатого экспериментального натериала о свойствах • АТФазного

-е-

комплекса. л о сих пор не разработан единый механизм его

'Функционирования, олна из современных гипотез механизма

Функционирования К+-АТФаз. предложенная Винограловын (Vinoiradov,

193ч-) постулирует сушествование двух изо$юрм Фактора fj, олна из

которых приспособлена лля синтеза, а другая - лля гидролиза АТФ,

причем "переключателем" режимов функционирования служит пентр

прочного связывания алф: связывание адф в этом центре Фиксирует

Фермент в его "синтетической" изоформе (MlnKov et al., i960,

Vinogradov, 1984). В связи с этим изучение соотношения между

протонными АТФазани анаэробных бактерий,-не обладающих первичными

генераторами а л ♦ и синтезирующими АТФ только за счет гликолиза, ■ ' Н

и обратимыми протонными АТФазани FQFj-типа из дышаших бактерии, митохондрий . и хлоропластов может пролить свет на возможное различие путей синтеза и гидролиза АТФ и поэтому является актуальной задачей в исследовании н+-АТФаз.

Пель работы. настоящая работа посвяшена изучению особенностей Функционирования и • каталитических свойств изолированного еактора Fj н+-АТФазы из нембран анаэробной бактерии Lactobacillus easel и Н*АТФазы аэробной бактерии Micrococcus lateus с целью сравнения этих ферментов, Физиологической функцией которых является гидролиз (Lxaseii и синтез (H.luteusi АТФ.

научная новизна и практическая ценность работы, впервые подробно исслеюваны каталитические свойства -изолированной fj-АТФазы менбоан L.casei. показано, что по ряду характеристик -

суг.г.тьзтнпй :п;и',:с1'.'чи.ос?;;, влиянию на дтоагную актязность геухвзлент:-:•]:■• депстпию ряза активато-юз и 'лнгпс-итсроз

Р5С7борккня Фериект имеет-большое сходство с г^АТФазоп. азгобной оактерия лли^еи?. а такге с известными .»<-АТОазами из .мембран животных, растения и других дышащих бактерий, в то хе зремя, изолированная ?1-АТ0азз ь.саге! ? отличие от других н+-АТОаз имеет ряд особенностей з каталитических свойствах: отсутствуют кооперативное взаимодействие каталитических пентроз Фернента; центр прочного связывания МгАЗФ (предпологительно. язляюпийся "переключателем" режимов - функционирования Фермента гидролазный/синтетазный), и - как следствие - торможение реакции з процессе гидролиза АТФ. отсутствуют также регуляция активности фермента с помошью белкового ингибитора и ферридоксин-тиоредуктазной системы - регулягорных систем, свойственных другим Н+-АТ©азам.

впервые исследованы качественный и количественный состав

нуклеотидов, связанных с изолированными Г^АТФазами Ь.саге! и

млшеиз.' Установлено, что АТФаза ь.саге! не содержит связанных

ну1;леотидов. АТФаза н.1и!еиз содержит нуклеотиды адениновой (АЛ®

и АТФ) и гуанозиновой (ГЛФ) природы. Показана принципиальная

возможность синтеза ГТФ из ГЛФ и ФНеорг неибрансвязанной

л^-АТФазой К1сгососсиз инеиз за счет энергии да --' н

полученные данные углубляют имеющиеся представления о механизме Функционирования мембранных н'-АТФаэ и являются важным аргументом в пользу гипотезы различных путей синтеза - гидролиза

АТС. Примененный в настоящей работе сравнительный анализ •'аэробной" и "анаэробной" 'АТФаз, и разработанный метод исследования составг связанных нуклсотидов могут быть использованы прг исследовании АТФаз из других бактерия.

Апробация работы. Результаты исследований были "долонены на симпозиуме "Кальция и биологические мембраны" (Иркутск, 1965), негреспубдикансккх школах-ксноеренциях молодых ученых по биоэнергетике (билияак, 1906, уагород, 1907, дилигак,' 19бй), 6-ой Европейское биоэнергетической конференции (Нидерланды, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликованы Н статьи и г тезисов. -

структура к обьек диссертации, диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов -исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа излогена на 120 страницах, машинописного текста ■ и содерБИт f таблиц и (5 рисунков. Библиография составляет/^ ниаменовании работ отечественных и зарубежных авторов.

НАТ2РИАЛЫ И ИЕТ02Ы ИССЛЕДОВАНИЯ

3 работе использовали бактерии Lactobacillus easel var. anamnosus i А ТСС т4б9).Культуру поддерживали б обезжиренном молоке и зыращивали з анаэробных условиях при 37°с з течение го часов в среде, содержавшей а трилтон , o,7Z дроггевой экстракт, у/, глюкозу и о,5х фосфат калия, рн 7,о. клетки разрушали в Хьюз^лрессе и с помощью дифференциального центрифугирования получали мембранные частицы, которые использовали для выделения Ki-АТФазы.

Культуру бактерий Micrococcus lysofleiKticus, штакн Флеминга (2665) поддергивали на агаровых косяках, вактерии выращивали з питательной среде, которая состояла из \1 пептона, 1Z дрохгевого гиролизата, о,5/. Nací, рн т,г. инокулятон слухила 24-часовая культура, выращенная на качалке при 30°с в колбах эрленнейера (750мл), содержащих 200 .нд среды. Для сбора биомассы бактерии выращивали в тех хе условиях в течение 5 часов, мембранные Фрагменты получали путем обработки клеток лизоцинон с последующим дифференциальным .центрифугированием, полученные менбранные Фрагненты использовали для выделения Fj-АТФазы, а такхе для получения суббакгериальных частиц.

Очистку растворимых АТФаз L.casei и H.luteus проводили с помощью гельфильтрации на колонке с тоеперл hv 55f. .гомогенность полученного препарата проверяли с помощью диск-злектроФореза в 5Z полиакриламидном геле в нативных условиях по неиоду Дэвиса

-б-

(Orasteir;, Davu, 1964), а также с помощью электрофореза в градиентном 7-гОл геле в присутствии додецилсульфата Na по методу Лзммои (Laenmly, 1970).

Концентрацию белка определяли по ентоду лоури и др. (Lovrry et al.. i 951).

скорость АТваэной реакции определяли: а) по количеству образовавшегося фосфата по методу Ратбана и Бетлаха (Rathbun and БеШасЬ, 1969); б) спектрофотонетрически по убыли HADH в сопряженной АТФ-регенирирующей системе, содержащей ©ЕП. пируваткиназу и лактатдегидрогеназу (Vasllyeva et aL, 1980); в) по радиоактивной метке - [32Р] (Чумаков и др., 1980).

измерение скорости фосфорилирования проводилось: а) флуориметрически по изменению интенсивности флуорисцепции HADFH (340-460) в системе, содержащей глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу и UADF; б) по включению в АДФ радиоактивной метки - [згРцеорг].

для определения нуклеотидов, связанных с белкой, Fj-АТФазу обрабатывали раствором перхлорвоя кислоты; образовавшийся осадок денатурированного бедка отбрасывали, а в нейтрализованном растворе определяли количественный и качественный состав нуклеотидов. Нуклеотиды в растворе определяли хронагографически с пононыо fplc на носителе Нопо о.

результаты и обсуждение

!. выделение и очистка растворимой АТФази из кекбран Lactoba rillus easel;

золорастэориму» часть АТФаэы из мекбран бактерии ь.сагя! выделяли, используя традиционную обработку буфером с низкой' ионной силой в присутсвии ЗДТА. АТоазу пз "ЭДТА-зкстракта" очищали до практически гомогенного сосгояязя с помощью гель-фильтрации на колонке с Тоеперл hw 55". эта процедура дала нам возможность снизить потери АТОазной активности при очистке, а такге суиественно сократить время очистки ®ернента. после гель-фильтрации получали о,з-о,5 иг очииенпоа "¡¡-АТ^азы с удельной активностью з-з нкколь/иин х иг белка .

Чистоту препарата проверяли с помощью аналитического электрофореза в б г полиакриламидном геле. При окраске кунасси п-250 выявлялась только одна белковая полоса . При обработке гелей расгворон HgAT® з присутствии нитрата сввнца по методу Вахштекна и нейселя (Vacbstem and Helsel, 195Т) з этой зоне выявлялась АТФазная активность.

Неоднозначные результаты были получены при изучении субьедияичной структуры Fj-АТФазы из L.casei. Ранее в работах Нилеиковсхоя с соавт. (BiKetov et ai., 1955) било установлено, что эта АТОаза, з отлкчие. от н+-АТ©аз из другях источников, имеет лишь один тип больших субъединиц. Такси к результат был первоначально получен и з данной работе: после электрофореза

денатурированнов АТФазы в iov. полиакриламидном геле в

присутствии 1Z дсс-На выявлялся только один компонент, что указывает на прасутсвие в молекуле АТФазы субьединиц с идентичным молекулярным весом, равным чз кда. однако поззе был получен препарат' АТФазы. электрофорез которой-в-денатурирующих условиях выявлял наличие двух типов больших субьединиц с молекулярным весом 54 кда и 60 кда, что соответствует данным нильгроиа с соавторами (Нильгром, 1939) о суеьединичнои структуре АТФазы L.casei. Еознозно, эти различия являются результатом деградации белка или артефактов выделения и очистку. Нельзя такзе исключить, что в процессе многократных пересевов культуры L.casei в ней произошли адаптивные изменения, которые привели к некоторой модификации сгрутуры белка. Вопрос остается открытым к требует дальнейшего изучения. Одним из перспективных путей дальнейших исследований структуры АТФазы из L.casei представляется использование генетических подходов.

2. Каталитические свойства изолированной раствориной АТФазы Lactobacillus easel.

Очищенная растворимая Fj-АТФаза L.casei гидролизует АТФ со скоростью 7 нкмодь/мин нг. . в присутствии Kg2* она способна гидролизовать кроме АТФ другие нуклеозидтрифосфаты: ГТФ, УТФ и ИТФ (таблица 1). При использовании в качестве субстратов АДф, АНФ и пирофосфата гидролитическая активность не обнаруживается, это указывает на отсутствие в препаратах фермента других

габлица i. субстратная специфичность изолированно:; растворимся АТФазы L.casei.

субстрат активность,и

АТФ 100

АДФ 0

АМФ 0

ГТФ 25

УТФ 30

РРнеорг 0

Активность измеряли в среде, содержащей 50нм Трис-hci, рн 7.5, o.ih sei, бмН Hgso^, б ми нуклеотида или пирофосфата, 5 мкг АТФазы с удельной активностью б мкмоль/мин мг.

таблица 2. зависимость изолированной АТФазы L.casei от природы двухвалентного иона меиалла.

металл

Hg МП Ca со Zn

ш

активность, у. ме : АТФ

м_;_гл_

64 77 143 5' '36 О

100 190 100 50 100 И

АТФазную активность измеряли в среде, содерхашей 50 нм трис-на, РН 7.5, 0.1 м KCl, б нм АТФ, б мм хлорида соответствующего металла, 5 ккг АТФазы с удельной активностью 5 нкноль/нин мг

фосфогидролаз. зависимость активности фермента от концентрации AT®, представленная в двойных обратных величинах, линейна в диапазоне концентрации от o.i до г.5 мн. Определенное в этой зависимости значение Кш составляет 0.2 нй.

Гидролиз AT© АТФазой Lactobacillus easel протекает, как и в случае других н+-АТ©аз, в присутствии ионов двухвалентных неталлов. АТФазная активность изменяется в ряду двухвалентных катионов, образующих субстратный комплекс с АТФ, следующим образом: Нпг+ > Нгг+ = Zn2+ = саг+ > Сог+ > Nl2+ (таблица 2).

Одна из возмохностей выяснить, в какой степени Н+-АТ®аза Lactobacillus easel в изолированном виде отличается от н+-АТ©аз FoFj-типа, заключается в сравнении этих ферментов по чувствительности к ингибиторам и активаторан.

в таблице 3 приведены данные по влиянию различных ингибиторов и активаторов на изолированную АТФазу L.casei. из таблицы видно, что изолированная АТФаза, подобно Fj-АТФазаи из других источников, теряет чувствительность к низким концентрациям

ДЦКД и сильно ННГИбИРУеТСЯ HBD-C1.

Обработка мембран L.casei или раствориного фермента трипсином в различных условиях ( соотношение АТФаэа:трипсин 10:1 - i:i ) не приводила к стимуляции АТФазной активности, что как правило, происходит в случае блокирования ферментативной активности природным белковым ингибитором. Обработка таких хе препаратов реагентон на SH-группы белков - дитиотреитолом в

Таблица з. ' действие ингибиторов и активаторов на изолированную АТФазу L.casel.

Вещество концетрация активность,

— 100

дцкд 0.5MH 100

HBD-C1 о.гмн 10

Дитиотреитол- 1 - 50MH 100

Трипсин АТФаза:трипсин 1:1 - 10:1 100

HaN3 юмн 50

Ha2so3 80МН гоо

HaCl (KCl) гоомн 270

Октилглюкозид юмн гоо

40MH 300-600

концентрации 1 -50 мн по стандартный методикам такзсе не влияла на АТФазную активность, подобно тому, как это происходит у аэробных бактерий (HileykovsKaya et al.,1976) и хлоропластов (Hills, 1950). таким образом, отсутствие стимуляции АТФазной активности трипсином и SH-реагеитами указывает на отсутствие у L.casei регуляции АТФазной активности с помощью белкового ингибитора или Ферридоксин-тиаредуктазной системы.

Результан< экспериментов по стимуляции АТФазной активности ионами одновалентных металлов представлены на рисунке 1. при повышении концентрации солей Naci и КС1 до зоо мн в обоих случаях наблюдается одинаковая стимуляция АТФазной активности на зоох. зависимость стимуляции АТФазной активности от концентрации указанных солей имеет прямолинейный характер. При замене анионов СГ на sc>42" характер стимуляции АТФазной активности не' изменяется. По-видимому, наблюдаеный эффект объясняется неспецифическим действиен солей, а именно - оинной силой, которую они создают.

На рисунке 2 представлена зависимость активности растворимой АТФазы Lactobacillus easel от концентрации октилглкжозида. из рисунка видно, что при концентрациях выше концентрации ницелообразования происходит значительная активация фермента, в работах нашей группы было показано, что активация изолированной АТФазы происходит такхе в присутствии других детергентов: холата Na, деоксихолата и тритона х-юо. но перечисленные детергенты активируют растворимую АТФазу лишь в 1.5 - г раза. Ны получали различную степень активации фермента октилглюкозидон (1.5 - 10 раз) в зависимости от исходной удельной активности препарата. Хранение фермента при 0°с в течение 7-10 дней приводило, как правило, к значительной его инактивации, однако, активность, измеряемая в присутствии октилглюкозида, всегда составляла примерно ю нкмоль/нин мг белка, нохно предполохить, что очищенный препарат растворимой АТФазы L.casel

мес1 м

Рис. 1 Влияние ионов одновалентных металлов на активность изолированной РгАТФазы Ь.сазе! : (а) КС1, (❖) ИаС1.

октилгжкозвд, м

Рис.г Активация растворимой АТФазы Ь.саге! октилглюкозидом. Реакционная среда содержала 50мН трис-на, рн 7.5, 5мн меАТФ

подвергается медленным конформационным изменениям, приводящим ■ к его инактивации, а октилглюкозид восстанавливает активную конформацию белка.

особого внимания заслуживают поведение АТФазноя активности АТФазы Ь.сазе1 во времени при гидролизе АТФ и ингибирующее Елияние азида на активность. Эти процессы подробно исследованы на примере Р^-АТФазы митохондрий сердца быка, в присутствии АТФрегенерирующей системы АТФазная активность как изолированной, так и мембраносвязанной митохондриальной КоРрАТФазы уменьшается в ходе гидролиза АТФ. в случае митохондриального фермента уменьшение активности в ходе гидролиза АТФ вызывается образованием неактивного комплекса с АДФ, связывающийся в центре с высоким сродством к зтону лиганду. (УаэПуеуа Е.А. ег а1„ 1962) Образовавшаяся неактивная форма Фермента, по-видинону, . стабилизируется азидом натрия в микроиолярных концентрациях.

На рис.з представлена кинетическая кривая АТФазнои реакции, регистрируемая по убыли ИАБН в сопряженной регенерирующей системе, видно, что начальная скорость реакции линейна (начало записи через ю с после добавления Фермента), в случае митохондриального 'фактора на этом участке наблюдалось сильное отклонение от линейности, "которое резко усугублялось при добавлении азида на в микромолярных концентрациях (УайИуеуа е.а. а1„ 1962). преинкубация АТФазы из Ь-саде! с 50 - юо нкн АДФ,

а такге с ляф и азидом На (юо нкН) в присутствии 1 ни Hgso4 не приводила к какому-либо ингибированию начальной скорости АТФазной реакции, регистрируемой в сопряженной АТО-регенерирующей системе.

Подавление активности АТФазы из L.casel под действием азида На происходит лишь при относительно высоких концентрациях ингибитора (рис.з, кривая г и рис 4). на рис 4- приведена зависимость скорости гидролиза Mg-ATP от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка при различных Фиксированных концентрациях азида па (в интервале концентраций i - 10 мК). подобная зависимость описывается схемой неполного неконкурентного ингибирования с к^=1.з мм и f^i-ss. таким образом, азид натрия действует на АТФазу из L.casel иначе, чем на митохондриальнуга АТФазу. отсутствие центра прочного связывания ндАДФ, т.е. центра, который по представлениям Виноградова (Vinogradov, 1984) ответственен за переключение режимов работы фермента гидролазный - синтетазный, находится в хорошем соответствии с представлениями об ориентированности АТФазы L.casel на функцию гидролиза АТФ.

нами была исследована АТФазная активность Фермента в условиях так называемого одноцентрового катализа. Грабмеером и соавторами (Grubmeyer, 1931) было установлено, что освобождение продуктов АТФазной реакции из митохондриального Фактора к$ в условиях, когда концентрация субстрата соизмерима с концентрацией АТФазы, происходит крайне медленно. как показали наши эксперименты с АТФазой из l.casel, в условиях одноцентрового катализа не происходит включения радиоактивной метки /у-32р/атф

Рис.з действие азида Na на кинетику АТФазной реакции Fj-АТФазы L.casei. Реакционная среда содерхала гомм трис-нс1, рн 7.4, о.ш KCl, 1MH НйАТФ, 1МН фосфоенолпируват, О.ЗМ HADH, 1МН Н8АТФ, по 30 единиц активности пируваткиназы и лактатдегидрогеназы (1). 5мн кан3 (2). стрелкой указан моммент добавления г.5 нкг АТФазы.

Рис.4 Ингибирование АТФазной реакции под действием азида ка. Реакционная среда содержала гомм трис-НС1, рн 7,4, о.1И ГС1, 1ин нвэо^. 1мн оософенолпитуват, о.змН НАГН, по зо единиц активности пируваткиназы и лактатдегидрогеназы. концентрация ингибитора - о (0), 1 (V), 2 (•), 5 (О), ю (Д).

бо фракцию фарнента, что может свидетельствовать об отсутствии прочного связывания субстрата в каталитическом центре.

Было показано такхе, что в условиях одноцентрового катализа АТФаза из ь.сазе! гидролизует ИеАТФ с относительно высокой скоростью (смотри рис. 5 ). Увеличение концентрации атф кг порядок приводило лишь к десятикратному возрастанию скорости АТФазнов реакции, т.е, е этом диапазоне концентраций нг наблюдалось кооперативного взаимодействия между каталитическим?: центрами фермента.

0.x

• 0.5 AT« , (wdi)

. I

Рис.5 зависимость скорости гидролиза АТФ Fj-АТФазой от концентрации субстрата. Реакционная среда содертала гомн трис-HCl, pH 7.5, о.гн KCl, 15 нм АТФазы. На врезке изобракен начальный участок зависимости.

-183. исследование нуклеотидсвязываюцих центров А'ГФаз из ненбран L.casat и H.luteus.

Одним из подходоэ к изучению иолсхулярного иехгккзна синтеза и гидролиза АТ4- н^-АТСазой является изучение процессоз связывания нуклеотидов в различных центрах связывания растворимых Fj-ATOac.

Иаксинальное количество нуклеотидсвязывающих центров раствориной части АТФаэы - фактора Fj равно шести. Из них три быстро обмениваются с нуклеотидаии среды.являются неспецифическими для нуклеотида, Hg-зависиныии и проявляют яркозырахенную отрицательную кооперативность по связыванию, такин ооразон, СЕОпства трех быстрообиениваемых центров определяют их как потенциальные каталитические центры.трк других центра очень медленйо обмениваются с нуклеотидаии среды , аденин-специфичцы и нг-независимы. 3 связи с этим предполагается, что эти последние центры - некаталитические.

В нашей работе мы исследовали нуклеотидсвязывающие центры Fj-АТФаз Lactobacillus easel и Klcrococcus luteus. В препаратах изолированной АТФазы Lactobacillus easel не было обнаружено связанных нуклеотидов.

АТФаза из нембран H.luteus была очииена по модифицированной методике Солтока и др. (Hunoz, Solton, 1969). метод выделения Фермента основан на свойстве АТФазы. выходить из мембран в рэстеор при обработке менбран буфером с низкой ионной силой (3 мн Трис-nci, рн 7.5). к внесенным нами в методику солтона изменениям откосятся: уменьшение числа промывок препаратов бактериальных

ненбран, а такхе применение гельоильтрации на Тоеперл НУ 55К . Внесенные в методику изменения позволяют уменьшить трудоемкость оперций и приводят к получению стандарного препарата с высокой удельной активностью, в результате очистки был получен препарат АТФазы с удельной активностью 15 мкмоль нг^мин*1. электрофоретический анализ выделенного препарата по методу дзвиса показал, что фермент не содержит значительных белковых примесеп.

витая, тн

Рис.5 Разделение снеси нуклеотидов, экстрагированных с изолированной Fj-АТФазы H.luteus, оинообменнэй хроматографией на носителе hono q (Farmacia).

для определения качественного и количественного состава нуклеотидов, их отделяли от белка. - в растворе нуклеотиды определяли хроматографически с помощью FFLC на носителе Hono Q (Farmacia). Нуклеотиды, связавшиеся с ионообненником, элюировали градиентом ионной силы. Нуклеотиды идентифицировали по вренени задержки выхода пика. Вид профиля элюции представлен на рис....

исследуя Fi-АТФазу из H.iuteus, мы сбнарухили, что белок, очищенный др aoz-ной чистоты (злектрофоретически), содергиг прочносвязанные нуклеотиды адениновой ( АД® и атф ) и гуаназиновой ( гдф ) природы.

Количественно состав нуклеотидов варьировал в различных пробах Fj-АТФазы от • выделения к выделению (смотри Таблицу ■ 4). ■ Общее количество нуклеотидов. связанных с белком, варьировало от 0.5 ноль на моль АТФазы до 2.5 ноль на ноль АТФазы. сунмарное количество адениновых нуклеотидов изненялось. в интервале 0.25 моль/ноль Fj - 1.5 моль/ноль Ft, ИЗ НИХ АДФ 0.13 МОЛЬ/МОЛЬ Fj -о.б ноль/моль! АТФ 0.05 МОЛЬ/МОЛЬ- Fj - 1.3 моль/мол^, количество . гд® варьировало в пределах 0.2 ноль/ноль Fj -1ноль/нольГ1. нухно отметить,..что при хранении выделенного белка количество связанных нуклеотидов уменьшалось.

Была сделана попытка исследовать, в каких хе именно центрах сЕлзаки эти нуклеотиды.для этого очищенную Fj-АТФазу, содерхащую связанные нуклеотиды, инкубировали в присутствии Mg в растворах нуклеотидов - АТФ, АДФ, ГТФ и ГДФ. затем белок отделяли от нуклеотидов среды как это описано выше и вновь определяли состав

— -' —

таблиц?. 4. нуклеотиды, сня35п-п с изолирование к A Tía Зое ил U--M

f номер зкег

Нуклеотпд ! 1 » с 3 4 г; д

1 f » " моль/моль ATvcjLÍ

АТФ » ! 0.91 0.7 0.86 0.53 с.05

АДФ O.Bí о.17 о.-? o.s! o.'í

ГдС ! 0.73 олз о.е 0.3í 0.-v3

суммарное КОЛИЧЕСТВО : 1.37 t i 1.3 2.1 2,37 0.65

5» препарат Атоазк после длительного хранения

нуклестидоз, связанных с белкой.

Оказалось, что инкубация РгАТФазы в течение o.s - г часоЕ при 37ЭС с насысаияеи концентрацией KgAT® (5 нН)' приводила к значительному уменьшению количества связанного с белком где.

■Si

Инкубация Fj-ATSasu з аналогичных условиях с 5 ми нзГТФ приводила к уменьшению количества связанного ало, но практически не влияла на коллчестзо связанного атф. йояно предполагать, что атф связан з медленнообмениваемон некаталитическон центре. гдф и адф, по-видимому, связаны в быстрообмениваемон каталитическом центре и могут быть вытеснены другими нуклготидаии. •

Известно, что природной функцией к*-АТФазы в H.luteus являете:! синтез АТФ. Обнаружив нуклеоткды гуаназиновой природы, прочносвязанше с растворимой (каталитической) частью дгоазы, мы

Рис.7 синтез АТС и ГТФ мембрансвязанной АТоазой нлшеия. Реакционная среда содергала Нерез гомИ, рН 7.4, НгЗОц 5нН, сахарозу о.г5Н, [згР]гнгР04 1нн, налат юнм и 1ни адф (о) или 1нн гдф (л); то хе в присутствии дцкд (•) и разобщителя (ш).

решили проверить,' не является ли данная АТФсинтегаза еще и ГТФсинтетазой.

Для этого по стандартной методике были получены фосфорилирующие частицы, суббактериальные частицы, содержащие' г^, синтезировали атф и гтф из [рр]рцеорг и адф и гдф соответсвенно. Б качестве субстрата- дыхания для создания электрохимического градиента протонов использовали малат. Обнаруженный синтез гт® сравним по величине с синтезом АТФ. При концентрации нуклеотидов 1 ни скорости фосфорилирования' были равны 39.5. (АДФ) и 33.6 (гдф) нмоль нг^нин"1 (рйс.7). Фосфорилирование ГДФ было

к дцкд. око ингибировалось цианидом в концентрации 0.5 мк на в концнтрации 5 - ю мн - аа юох, а также хкс в кокпектрации 4.э мкн - практически полностью.

таким образом, показана принципиальная возможность синтеза ГТФ АТОазоя за счет энергии а^ +.

концентрации атф и ГТФ в бактериальной клетке сравнимы между собой, например, Мзтьюс (Mathews, 1972) определил внутриклеточные концентрации гтс и атф в клетках е.соц, которые равны i.í а г.7 мК соответственно, поскольку in vivo Фатор "j АТФазы находится з непосредственном контакте с нуклеотидаии цитллазмы, тс способность синтезировать ГТО может быть одной из Физиологических функций Н+-АТФазы Hlcroccocus luteus.

ВЫВОДЫ.

1. Fj-АТФаза анаэробной бактерии Lactobacillus easel в отличие от других н+-АТФаз инеет ряд особенностей е каталитических' свойствах: отсутствие кооперативного

взаимодействия каталитических центров в процессе гидролиза АТФ; центра прочного связывания НгАТФ, и - как следствие - торможения реакции в процессе гидролиза АТФ. У фермента отсутствуют также регуляция активности с помощью белкового ингибитора и ферридо'ксин-тиоредуктазной системы - регуляторных систем, свойственных другин Н+-АТ®азам.

г,о р.-:лу характеристик - субстаткоп тытФичкостг, нлияеию г-: г.т-гг'ную окгпэзость дгухпалентннх kstkohop, действию ряда ¿■.стпзатороБ и ингибиторов ¡полированна.-! "ч-АТеаза ьназгобной Г&ктери:» Lactobacillus .-¿set имеет бокьпоз сходство с УрАТОазой -5Г-55коя c&ktspbk iHero;:"cci;s zutaus, з такке с известными v;-ATíu3aMv¡ из мембран аивотных, растений и друпи .чыпаших оапгерил.

изолированная Fj-АТФаза аэробной бактерии Hicrococois : к te us содержит связанные нуклеотиды адениновоп (AT© я АЛО) и гуанозпновой (ГЯФ) природы, показана принципиальная возможность скктеза ГТФ из гд® и ®неорг. мембраносвязаиной н+-АТСазой• H.luteus за счет энергии

1. Обнаруженные особенности каталитических свойств Fj-АТФазы Lactobacillus easel свидетельствуют о различии -в механизме действия Н+-А7Фазы, функционирующей как ■ гидролаза а анаэробной бактерии, и АТФаз из других объектов, функционирующих in vivo в гидролазнон и синтетазном рехимах. . .

список работ, опубликованных по теме диссертации.

нилейковская Е.И., Абуладзе А.Н., Корнер' С.С., Нечаев Л.И.,

Островсккй 2-Е. Особенности механизма функционирования Н+-Аттгзы из мембран анаэробной бактерии Lactobacillus easel. HOEiis представления о механизме функционирования н*-АТФаз. Биологические мембраны, 1965, т г, стр.И99-1205. г. иилекоЕСкая Е.И., кормер С.С. механизм функционирования Н+-АТФазы. ДОКЛ.АН СССР, 1985, T2S7, CTP 9В6-992 3. Abuladze A., Eorner S„ HllelKovsKaya Е., Ostrovsk.y D. Some pecularlties of functioning of H+-ATPase from the membranes of the anaerobic bacterium Lactobacillus easel, Eur.J.Biochen., 1937, vl67

'i. Абуладзе A.H., кормер c.c., Нечаев Л.И., нилейковская Е.И., Островский Д.Н. Са и Hg в активации Н+-АТ0аз. Нетипичные формы АТФаз прокариот. Тезисы всесоюзной конференции "са и биологические мембраны", 1955, Иркутск.'

5. Hlleiliovskaya е., former S. Bound nucleotides on the ATPase from Hicrococcus lysodeiKticus. 6th European Bioenergetlc Conference, August, 1990, Ketherlands.

6. HileyKovsKaya E.I., Kormer S.5., Allison W.S. . Significant quantities of endogenous GDF and ATP are prsent on catalytic sites of the FrATPase isolated from M.lysodelKtlcus in the absence of added nucleotides. Biochem.Hlophys.Acta, 1992, 1099.