Становление микробиоценоза кишечника, показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использовании новых пробиотических штаммов лактобацилл

Петраков, Евгений Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Становление микробиоценоза кишечника, показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использовании новых пробиотических штаммов лактобацилл
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Становление микробиоценоза кишечника, показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использовании новых пробиотических штаммов лактобацилл"

На правах рукописи

-р

Петраков Евгений Сергеевич

СТАНОВЛЕНИЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА,

ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ У ТЕЛЯТ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ НОВЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ

03.03.01 - физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

004613953 2 д ш 201()

Боровск 2010

004613958

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищеварительного тракта ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных»

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Тараканов Борис Васильевич Официальные оппоненты*, доктор биологических наук, профессор

Харитонов Леонид Васильевич доктор биологических наук

Фомнчев Юрий Павлович

Ведущая организация: Московская Государственная академия Ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. 1А. Скрябина

Защита состоится гч ноября 2010 года'в часов на заседании диссертационного совета Д 006.030.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 249013, Калужская область, г. Боровск, пос. Институт, ВНИИФБиП с.-х. животных. Телефон 8(495)9963415, факс 8(48438)42088

Автореферат диссертации разослан 1Л- 2010 года и

размещен на официальном сайте института vvwvv.bifip2006.narod.ai 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук у/ В.П. Лазаренко

Щг 1. Общая характеристика работы

Актуальность работы. Одним из наиболее эффективных методов профилактики дисбактериозов у молодняка с.-х. животных является использование заместительной терапии, направленной на восстановление кишечного биоценоза путем регулярного введения живых бактерий - представителей нормальной кишечной микрофлоры, получивших название пробиотики.

Пробиотики нормализуют состав микробиоценоза кишечника, за счет сдерживания размножения патогенных и условно-патогенных микробов, что является важным фактором защиты организма от развития кишечных инфекций. Оказывают стимулирующее влияние на иммунологический статус. Увеличивается количество Т-лимфоцитов, активизируется функция В-лимфоцитов, повышается фагоцитарная активность нейтрофилов, стимулируется синтез иммуноглобулинов различных классов, что приводит, в конечном итоге, увеличению резистентности и повышению интенсивности роста животных.

К пробиотическим микроорганизма предъявляется ряд требований, такие как антагонизм по отношению к потенциальным патогенам, толерантность к неблагоприятным факторам пищеварительного тракта, способность к адгезии на эпителии слизистой кишечника и др. Но для проявления положительного влияния пробиотика на макроорганизм крайне желательно, чтобы микроорганизмы, обладающие полезными свойствами, подтвержденными лабораторными испытаниями, были изолированы из нормальной микрофлоры тех видов животных, для которых создается пробиотик. Создание новых эффективных пробиотических препаратов для телят требует выделения штаммов от молодняка крупного рогатого скота и оценки их влияния на ряд физиологических показателей животных.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение новых штаммов лактобацилл с пробиотическими характеристиками и оценка их влияния на становление микробиоценоза пищеварительного тракта, морфологическую картину крови, неспецифическую резистентность и интенсивность роста у телят.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выделить из пищеварительного тракта телят лактобациллы и отобрать штаммы, наиболее полно отвечающие требованиям предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам;

2. Изучить становление микробиоценоза кишечника телят, при введении в рацион выделенных штаммов лактобацилл на протяжении первого месяца жизни;

3. Определить неспецифическую резистентность и морфологические показатели крови телят, после использования выделенных штаммов лактобацилл на протяжении первого месяца жизни;

4. Сравнить интенсивность роста телят, получающих добавку из пробиотических лактобацилл, с их сверстниками.

Научная новизна работы. Впервые из пищеварительного тракта телят выделены гетероферментативные лактобациллы с высокой антагонистической активностью против потенциальных патогенов, устойчивые к неблагоприятным факторам кишечника и безвредные для животных. Изучены штаммы Ь. /егтепШт В238/06 и В395/06, использование которых обеспечивает оптимизацию нормального микробного баланса в кишечнике, ингибирование роста потенциальных патогенов, повышение неспецифической резистентности организма и снижение продолжительности расстройств функций пищеварения, сопровождающихся диарейным синдромом, у телят.

Практическая значимость работы.Применение выделенных штаммов антагонистических лактобацилл в качестве пробиотических у телят первого месяца жизни позволило повысить среднесуточные приросты живой массы на 22% и сократить среднюю продолжительность расстройств пищеварительной системы в расчете на одну голову практически на 40%, что говорит о высокой эффективности применения данных штаммов у молодняка жвачных животных и перспективности разработки препаратов - пробиотиков на их основе.

Положения, выносимые на защиту

1. Из содержимого кишечника телят выделены новые штаммы L. fermentum В238/06 и ВЗ95/06, отвечающие всем требованиям, предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам;

2. Введение в рацион телят этих штаммов лактобацилл, в физиологически оправданных дозировках, оказывает оптимизирующее действие на становление кишечной микрофлоры и неспецифическую резистентность у телят;

3. Совместное применение штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 существенно увеличивает их профилактическую эффективность при расстройствах функций пищеварения телят и прирост их живой массы в сравнении с раздельным использованием штаммов.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований доложены: на региональной научно - практической конференции «Использование инновационных разработок НИУ региона для повышения эффективности сельскохозяйственного производства», (Калуга, 2010); международной научно - практической конференции «Физиологические механизмы становления и поддержания функций организма», (Сухум, 2010); XXI съезде физиологического общества им.И.П. Павлова, (Калуга, 2010).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 111 стр., содержит И таблиц, 4 рисунка. Включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы, предложения практике и список литературы, включающий 190 источников, в том числе 90 иностранных.

2. Материалы и методы исследований

Для выделения чистых культур Lactobacillus spp. использовали фекалии телят, полученные при акте вынужденной дефекации. Отбор фекалий проводили в опытном хозяйстве «Ермолино», Калужской области. Из 10 -граммовых навесок фекалий готовили серийные разведения на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и производили посев в агаризованную среду Рогозы в модификации Тараканова, элективную для лактобацилл (Тараканов Б.В., 2006). После культивирования в термостате в течение 72 часов при температуре 39°С выросшие изолированно колонии пересевали в

жидкую среду МРС, приготовленную по прописи De Mann J.C., Rogosa М., Sharpe М.Е., 1960. Одним из важных признаков при идентификации лактобацилл является отсутствие у них катал азы, которую тестировали с использованием набора для определения каталазы (производство НИЦФ, г. Санкт-Петербург). Все выделенные культуры были первично идентифицированы как Lactobacillus spp. по морфологии клеток при микроскопии (неподвижные, грамположительные палочки), отсутствии спорообразования и каталазы, специфических потребностях в ростовых веществах.

Штаммы молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли в среде Рогозы в модификации Тараканова. Культуры хранили в холодильнике при температуре 4-8°С и пересевали ежемесячно.

Изучение антибактериальных свойств лактобацилл проводили методом отсроченного антагонизма в двухслойном агаре. Для установления штаммов, продуцирующих в качестве антибактериальных веществ микроцины (бактериоцины с низкой молекулярной массой), использовали методику, описанную Хмель И.А. с соавторами (Хмель И.А., Манохина И.М., Баскж Е.И. и др., 1993). В качестве индикаторных культур использовали штаммы дикого типа: 10 штаммов Escherichia coli spp. и 9 штаммов Salmonella spp., выделенных от свиней, 10 штаммов Staphylococcus spp. и 10 штаммов Enterococcus spp., выделенных от мышей, а также музейные штаммы: Salmonella rostock, S.derby, S.thyphimurium colEl, S.utrecht, S.london 1446, S.ditblin 42, S.bovis morbipicans 988, S.give, S.heidelberg 287, S.kirkae, S.stanly, Escherichia coli 113-3, E.coli K-12 W-3350, E.coli K-88, E.coli 817-020, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis OG-1.

Процессы адгезии изучали по методике Брилис с соавторами (Брилис В.И., Брилине Т.А. и др. 1986), на дважды отмытых в фосфатном буфере эритроцитах телят. Чувствительность к антимикробным веществам у выделенных микроорганизмов определяли методом диффузии в агаре в соответствии с общепринятыми методиками (с помощью стандартных дисков производства НИЦФ, г. Санкт-Петербург). Дня изучения

толерантности выделенных лактобацилл к неблагоприятным факторам желудочно-кишечного тракта в опытные пробирки с 5мл среды MPC вносили: желчь для получения следующих концентраций - 20% и 40%,этанол для получения концентрации в 2%,4%,6% и 8%, 0,2% фенола, NaCl в концентрации 2%,4% и 6%. Суточную бульонную культуру добавляли по 0,5 мл в каждую из опытных пробирок, культивировали при температуре 39°С. Через 24 часа фиксировали наличие или отсутствие роста.

Исследования на выживаемость лактобацилл в искусственном желудочном соке проводили по методике, описанной Casey P.G. et al. (2004). Окончательную идентификацию изолятов осуществляли с помощью тест-системы для биохимической идентификации бактерий до вида API-5Û, производства БиоМерье (Франция), с использованием программного обеспечения apiweb - API 50 CHL V5.0.

Оценку влияния антагонистических лактобацилл на становление микрофлоры кишечника, неспецифическую резистентность и роста животных проводили в научно-хозяйственных опытах. Первый опыт проводился с февраля по апрель 2009 года на центральной ферме ОПХ «Ермолино» (Калужская область), в период массовых отелов на телятах холмогорской породы. На ферме имеется родильное отделение и профилакторий для новорожденных. В 3-х дневном возрасте телят переводили в индивидуальные домики, расположенные на открытом воздухе. Уход за телятами и их кормление осуществлялось в соответствии со схемами и требованиями, принятыми в хозяйстве. Ежедневно телята получали не менее 5 литров цельного молока, на седьмой день начинали вводить заменитель цельного молока «Кормилак», на десятый концентраты.

Контрольную и две опытные группы формировали по методу пар - аналогов (Овсянников А.И., 1976) по мере рождения телят. В каждую группу набирали по семь голов, по три бычка и четыре телочки. Различия по средней массе животных между группами не превышали пяти процентов.

Для оптимизации микробиоценоза кишечника новорожденным телятам опытных групп выпаивали ежедневно, однократно, по 50 мл культуры, содержащей в среднем по ЗхЮ8 колониеобразующих единиц (КОЕ) в одном миллилитре, то есть по 1,5хЮ10 живых

микробных клеток на голову. Животные 2-й группы получали штамм L. fermentum В238/06, а третьей группы - штамм L. fermentum В395/06.

Учитывали день возникновения расстройств пищеварения, сопровождающихся диареей, и их продолжительность, сохранность телят и прирост массы тела в течение первого месяца жизни.

Контроль за состоянием микрофлоры пищеварительного тракта осуществляли путем микробиологических исследований фекалий, которые получали при акте вынужденной дефекации. Отбор проб проводили на 10-й, 20-й и 30-й день опыта. Изучалось количественное содержание в химусе сальмонелл, эшерихий, протеев, грибов рода кандида, бифидо- и лактобактерий.

Для изучения неспецифической резистентности на 30-й день опыта у животных контрольной и опытных групп брали пробы крови. Определяли: фагоцитарную активность клеток крови по Кост и Стенко (Кондрахин И.П., 2004), бактерицидную активность сыворотки крови по модифицированному методу Бухарина и Созыкина (Саруханов В.Я. с соавт., 2007), содержание лизоцима по методу Емельяненко (1980).

Количество эритроцитов и лейкоцитов определяли на гематологическом анализаторе Stat fax 1904 Plus Biochemistry Photometer (USA). Лейкограмму выводили путем микроскопии мазков крови, приготовленных общепринятыми методами и окрашенных по Романовскому-Гимза.

Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным колориметрическим методом.

Второй научно - хозяйственный опыт был проведен в 2010 году, с 1 марта по 24 мая, в том же хозяйстве. Изучалась возможность включения смеси антагонистических лактобацилл штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 в схему кормления телят, в качестве пробиотика.

Для проведения опыта, по мере рождения телят, было сформировано три группы животных по методу сбалансированных групп - аналогов (Овсянников А.И., 1976). Аналогичность групп определялась фенотипическими качествами, соблюдалась через исходные средние показатели по группам в целом (пол, живой вес,

возраст, физиологическое состояние). В каждую группу набирали по 20 животных, по 10 бычков и телочек. Учитывали приросты живой массы, фиксировали данные по нарушению нормального функционирования пищеварительной системы. Первая опытная группа в дополнение к основному рациону, получала ежедневно по 50 мл смеси антагонистических культур лактобацилл Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06, в пропорции 1:1, с титром живых микробных тел в миллилитре в среднем 4,5x109, выращенных в ереде, содержащей 10% сухого обезжиренного молока. Вторая опытная группа получала в дополнение к основному рациону по 50 мл пробиотика «Лактоамиловорин». Третья группа являлась контрольной и получала основной рацион, принятый в хозяйстве и аналогичный по составу с первым опытом.

Для оценки достоверности различий межгрупповых средних использовали /-критерий (Плохинский Н.А., 1980).

З.Результаты собственных исследований 3.1 Биология гетероферментативных лактобацилл пищеварительного тракта телят 3.1.1 Выделение лактобацилл из кишечника телят и их скрининг на антагонизм Для изучения было выделено 150 микробных культур, от 10 животных, дополнительно было получено 50 культур ранее изолированных профессором Б.В. Таракановым. Все выделенные на элективных средах штаммы представляли собой грамположительные палочки, каталазонегативные, неспорообразующие и были первично идентифицированы как лактобациллы, с присвоением названия Lactobacillus spp. В№, где .М'-номер данный при выделении (сокращенное обозначение LBB№).

Первичный скрининг на антагонизм показал, что антагонистической активностью обладали только 24 штамма. При этом штаммов, продуцирующих низкомолекулярные

антибиотикоподобные субстанции - микроцины не было выявлено. При дальнейшем изучении ингибирующих способностей в отношении эшерихий, сальмонелл, стафилококков и энтерококков дикого типа, из этих 24 штаммов было отобрано 9, обладающих более широким

Таблица 1. Антагонистическая активность лактобацилл по

отношению к коллекционным индикаторным культурам

Тест-культуры Изучаемые лактобацидлы

LBB 5/08 LBB2 1/08 LBB 238/ 06 LBB 349/ 06 LBB 355/ 06 LBB 387/ 06 LBB 388/ 06 LBB 390/ 06 LBB 395/ 06

Salmonella rostok 23 21 - - 17 - - - 28

Salmonella derby 24 - 23 - - - 27 18 30

Salmonella typhimurium col El J 20 18 27 - 20 32 33 - 26

Salmonella Utrecht 29 22 16 - 18 - 20 - 14

Salmonella london 1446 32 - 30 30 20 - 32 - 20

Salmonella dublin 42 30 - 27 21 - 30 30 - 24

Salmonella bovis morbipicans 988 26 - 41 - - - 30 40 40

Salmonella give 38 42 39 40 39 42 42 - -

Salmonella heidelberg 287 40 37 - 41 39 40 42 38 39

Salmonella kirkae 42 42 34 38 40 41 42 40 41

Salmonella Stanly 41 34 22 21 24 39 38 41 42

Escherichia coli K-12 W-3350 39 40 48 41 40 39 40 42 40

Escherichia coliK-88 23 20 29 40 36 42 42 39 41

Escherichia coli 817-020 40 40 39 24 30 41 39 40 42

Micrococcus Intens 24 40 36 39 41 42 40 29 32

Staphylococcus aureus 30 11 12 16 12 11 17 10 19

Streptococcus faecalis OG-1 11 16 14 11 14 15 13 12 10

Klebsiella 4140 (K-7) 19 17 24 21 24 26 16 10 26

Примечание: Цифра показывает диаметр зоны подавления роста тест-культуры в мм

спектром подавления роста возможных патогенов, которые и были изучены более детально.

Все 9 штаммов подавляли рост сальмонелл дикого типа в 100% случаев, ингибировали не менее 90% от использованных в качестве индикаторных штаммов кишечной палочки и не менее 80% стафилококков и энтерококков дикого типа. Результаты скрининга на антагонизм в отношении коллекционных культур представлены в таблице 1. В качестве индикаторных культур для изучения ингибирующих способностей лакгобацилл нами использовались как грамположительные {Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), так и грамотрицательные микроорганизмы СEscherichia spp., Salmonella spp., Klebsiella spp.). Это связано с различным механизмом подавления роста микроорганизмов лактобациллами. Так, ингибирующее воздействие на грамотрицательную микрофлору обусловлено, в основном, продукцией молочной кислоты. В то время как антагонизм по отношению к грамположительным микроорганизмам проявляется за счет продукции антибиотикоподобных субстанций - бактериоцинов, микроцинов и др.

3.1.2 Адгезия лактобацнлл

Многие исследователи (Зинченко Е.В., Панин А.Н., 2000; Шендеров Б.А., 1998; Barrow P.A. et al., 1980) считают, что благоприятная колонизация кишечника задаваемыми пробиотическими штаммами возможна только в том случае, когда они обладают высокими показателями адгезии к энтероцитам животного -хозяина.

В этой связи, следующим этапом исследований стало изучение адгезивных способностей у высоко антагонистически активных представителей молочнокислых микроорганизмов. В связи с трудностью получения от телят клеток кишечника, пригодных для исследований, мы использовали отмытые в фосфатном буфере эритроциты. Кроме простоты получения в необходимых количествах, важное значение имеют их структурные особенности. На поверхности эритроцитов расположен гликофорин - вещество, идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов. Обработка полученных

результатов показала, что все 9 штаммов являются высокоадгезивыми(табл. 2). Однако индивидуальные различия индекса адгезивности варьировали в довольно больших пределах, от 5,0 до 7,61, что, вероятно, обусловлено особенностями строения и количества адгезинов на микробной стенке.

Микроорганизм считают неадгезивным при индексе адгезивности <1,75, низкоадгезивным - от 1,76 до 2,5, среднеадгезивным - от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивным при ИАМ выше 4,0.

_Таблица 2. Показатели адгезии лактобацилл_

Показатели* Изучаемые лактобациллы

LBB 5/08 LBB 21/ 08 LBB 238 /06 LBB 349/06 LBB 355/06 LBB 387/06 LBB 388/06 LBB 390/06 LBB 395/06

СПА 2,08 1,42 2,36 2,42 1,64 2,1 2,54 1,98 2,68

К 38 27,2 36 40 32,8 36,4 34,4 38,4 35,2

ИАМ 5,47 5,22 6,55 6,05 5 5,77 7,38 5,16 7,61

"■Примечание: в таблице СПА- средний показатель адгезии, показывает среднее количество микроорганизмов прикрепившихся к одному эритроциту. К- коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе, показывает количество эритроцитов, имеющих на клеточной стенке прикрепившиеся микроорганизмы, в процентах от общего числа эритроцитов. ИАМ- индекс адгезивности микроорганизма. Высчитывается по формуле: ИАМСПАхЮО/К.

3.1.3 Толерантность лактобацилл к неблагоприятным факторам пищеварительного тракта Немаловажное значение для прохождения в дистальные отделы кишечника придается устойчивости пробиотических

микроорганизмов к действию желудочного сока, желчных кислот и других повреждающих агентов (Червинец Ю.В. и др., 2006; Sanders J.W. et al., 1998; Corzo G., Gilliland S.E., 1999; Casey P.G. et al, 2004). Поэтому заключительным этапом при отборе лактобацилл, имеющих в перспективе производственное значение, являлось изучение их толерантности к неблагоприятным факторам желудочно - кишечного тракта. При изучении роста выделенных, культур в условиях желудочно-кишечного тракта было установлено: все 9 культур

хорошо росли в присутствии 0,2% фенола, 20% и 40% желчи; этанол не влиял на рост лактобацилл при повышении концентрации до 6%; 2,4% КтаС1 не останавливали роста бактерий. Данные по устойчивости лактобацилл к неблагоприятным условиям, по которым получены вариабельные результаты, приведены в таблице 3.

Следует отметить, что при изучении роста тестируемых культур в условиях высокого осмотического давления (2, 4 и 6% №С1), присутствии этанола, фенола, желчи, различия в ростовых характеристиках были не значительны. Совсем другая картина наблюдалась при исследовании выживаемости в искусственном желудочном соке, в состав которого дополнительно введена желчь. Выживаемость различных штаммов отличалась в десятки раз и составляла от 0,05% до 4,94% от первоначально внесенной концентрации бактерий.

Таблица 3. Показатели роста лактобацилл при неблагоприятных условиях_

Изучаемые лактобациллы

показатель LBB 5/08 LBB 5/08 LBB 5/08 LBB 5/08 LBB 5/08 LBB 5/08 LBB 5/08 LBB 5/08 LBB 5/08

4%NaCl + - + + - + + + +

6% NaCf + - - + - + + + +

8% этанол + - + + + + + + +

Выживаемость

искусственном желудочном соке, % 4,94 0,025 0,71 0,016 1,143 0,05 0,364 0,359 0,569

Эти данные согласуются с результатами, полученными Casey P.G. et al. (2004), при изучении выживаемости различных видов лактобацилл в условиях желудочного сока. Вероятно, столь сильное подавление жизнедеятельности микробных культур объясняется комплексным воздействием на них высокой кислотности, желудочных ферментов и желчи.

3.1.6 Чувствительность к антибиотикам Наиболее целесообразно применение пробиотических препаратов в качестве профилактического средства с первых дней жизни для становления нормальной микрофлоры пищеварительного

тракта. Несмотря на то, что лактобактерии проявляют антагонистическое действие по отношению к патогенным микроорганизмам, их применение в качестве лекарственного средства не оправдано.

Это связано с тем, что для полноценного проявления благоприятного воздействия на организм необходимо время на колонизацию пищеварительного тракта. При различных пищевых токсикоинфекциях, дисбактериозах и заболеваниях со смешанной этиологией, транзит пищевых масс по кишечнику ускорен в связи с диарейным синдромом и времени на колонизацию недостаточно. В таких случаях показана антибиотикотерапия. Однако, как известно, антибиотики влияют не только на патогенную микрофлору, но в том числе и на бифидобактерии, лактобациллы и другие группы полезных микроорганизмов, что приводит ко вторичным дисбактериозам. Для избежания этого во время антибиотикотерапии рекомендуется вводить пробиотические микроорганизмы, устойчивые к используемым средствам и способствующие сохранению нормального микробиотопа в кишечнике. Показатели устойчивости выделенных лактобацилл к различным антимикробным препаратам показаны в таблице 4.

Проанализировав все полученные данные, мы пришли к выводу, что наиболее перспективными в качестве основы для создания пробиотиков для молодняка крупного рогатого скота являются штаммы Lactobacillus spp. В238/06 и Lactobacillus spp. В395/06. Эти культуры показали широкий и сильный по действию спектр ингибиции потенциальных патогенов, обладали самыми высокими показателями адгезии, были толерантны к большинству неблагоприятных факторов пищеварительного тракта и имели высокий процент выживаемости в условиях желудочного сока. Оба штамма устойчивы к действию ванкомицина, канамицина, левофлоксацина, слабо подавляются тетрациклином и могут использоваться совместно с этими препаратами.

Таблица 4. Показатели антибиотикорезистентности лактобацилл

Антибиотик, содержание в диске Изучаемые лактобациллы

LBB 5/08 LBB 21/08 LBB 238/ 06 LBB 349/ 06 LBB 355/ 06 LBB 387/ 06 LBB 388/ 06 LBB 390/ 06 LBB 395/ 06

Тетрациклин, 30 мкг 3 - <1 9 8 9 9 <1 6

Рифампицин, 5 мкг 18 16 17 15 12 18 13 15 11

Оксациллин, 10 мкг 6 3 6 7 5 3 3 3 5

Кларитромицин, 15 мкг 15 13 12 15 12 13 И 14 8

Клиндамицин, 2 мкг 15 15 17 13 16 18 13 14 12

Эритромицин, 15 мкг 12 10 12 9 8 10 9 8 8

Левом ицетин, 30 мкг 17 - 15 13 12 14 14 13 Л?.

Ванкомицин, 30 мкг - - - - - - - -- -

Амикацин, 30 мкг 9 6 3 3 - 6 - - <1

Стрептомицин, 30 мкг 9 5 3 2 - 7 - - -

Капам ицин, 30 мкг 7 5 - - - 2 . - - -

Неомицин, 30 мкг 5 4 2 2 - 8 - 2 3

Гентамицин, 120 мкг 8 8 4 6 3 7 5 4 4

Фурадонин, 300 мкг 15 16 12 20 15 19 21 1 22

Бензилпенициллин, Ю ЕД 21 20 19 26 20 27 28 14 26

Ампициллин, 10 мкг 20 20 21 26 2.1 28 27 19 27

Доксицикпин, 30 мкг 1 1 - 23 18 22 22 - 20

Левофлоксацин, 5 мкг - - - 1 - - - - -

Ципрофлоксацин, 5 мкг - - - - - - - - -

Линезолид, 30 мкг 17 17 24 28 19 21 20 21 23

Мсропенем, 10 мкг 20 21 26 32 24 35 30 25 32

Примечание: Цифра показывает диаметр зоны подавления роста лактобацилл в мм, - наблюдается резистентность к антибиотику, хороший рост культуры

Окончательная идентификация этих штаммов , до вида, проведенная с использованием тест-системы API-50, производимой

фирмой БиоМерье (Франция), показала, что с достоверностью 93,9% исследуемые штаммы относятся к виду Lactobacillus fermentum.

3.2 Воздействие Lactobacillus fermentum В238/06 и 395/06 на организм телят - молочников 3.2.1 Становление микрофлоры кишечника у телят При проведении первого научно - хозяйственного опыта по изучению влияния выделенных нами лактобацилл (штаммы L. fermentum В238/06 и В395/06) на микрофлору кишечника, были зафиксированы различия по изучаемым показателям между опытными и контрольной группой. Первая группа контрольная, вторая и третья получали соответственно Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06. Количественные результаты некоторых микробиологических показателей кишечника в различные периоды опыта, полученные при исследовании микрофлоры кишечника телят, представлены в таблице 5.

Таблица 5. Количество микроорганизмов в фекалиях телят в различные периоды опыта, КОЕ/г_

Группа микроорганизмов День опыта Группа животных

1 контрольная 2 OP+LBB 238/06 1 3 OP+LBB 395/06

Эшерихш, 107 10 16,4±0,7 4,9±1,0* 6,0±1,0*

20 7,2±1,7 2,1±0,8* 7,3±2,5

30 4,7±1,4 0,8±0,4" 3,8±1,8

Сальмонеллы, 103 10 5,6±2,4 7,3±3,1 3,1±0,3

20 4,0±1,0 1,3±0,3* 1,8±0,3*

30 13,0±3,2 1,3±0,6' 1,9±0,8*

Лактобациллы, 108 10 5,9±1,1 4,9±1,6 8,2±0,5

20 0,4±0,2 4,3±0,6* 4,5±1,1"

30 2,6±1,0 2,9±0,5 4,5±1,Г

Бифидобактер ии, 108 10 4,1±1,8 2,9±1,1 6,6±0,9

20 0,9±0,05 1,5±0,2* 2,7±0,5*

30 1,8±0,5 3,2±1,0 5,2±1,5*

Примечание: Здесь и далее * Р<0,05 по f-критерию при сравнении с контрольной группой.

По содержания бактерий рода Proteus и грибов рода Candida достоверных различий не было зафиксировано.

Как показали наши исследования, популяция кишечной палочки в пищеварительном тракте контрольной группы значительно превышала или находилась количественно на одном уровне с популяцией лактобацилл. Это не характерно для телят находящихся на молочном вскармливании и говорит о нарушениях условий содержания и кормления животных. Панин А.Н. и Малик Н.И. (2006) отмечают, что аналогичное изменение микрофлоры пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, характеризующееся значительным снижением уровня лакто- и бифидобактерий, присутствием спорообразующих бактерий, стафилококков, протея, плесневых и дрожжеподобных грибов, присуще интенсивным технологиям выращивания животных, искажающим процессы формирования кишечного микробиотопа у новорожденных. При этом, хотя численность кишечной палочки возрастает, количество эшерихий со сниженной ферментативной активностью может достигать 30-40%. Избыточное присутствие в составе кишечного биотопа условно - патогенной микрофлоры негативно сказывается на процессах микробного пищеварения и снижает усвоение кормов. Сбраживание углеводов энтеробактериями, клостридиями, гнилостными бактериями и плесневыми грибами происходит по типу уксуснокислого и маслянокислого брожения,снижающего энергетическую ценность корма. Побочные продукты метаболизма условно - патогенных бактерий и плесневых грибов - биогенные амины и микотоксины в высокой мере токсичны для теплокровных животных. Учитывая, что часть энергии рациона расходуется на поддержание жизнедеятельности кишечной микрофлоры, потери энергии при негативном изменении состава кишечного микробиотопа бывают ощутимы (Панин А.Н., Малик Н.И., 2006).

Применение гетероферментативных лактобацилл вида Lactobacillus fermentum, выделенных нами в ходе исследований й обладающих способностью ингибировать рост многих видов возможных патогенов, позволило оптимизировать микрофлору пищеварительного тракта. Уровень бифидобактерий и лактобацилл

значительно возрос, на фоне одновременного снижения количества кишечной палочки и сальмонелл. При использовании штамма Ь. /егтепШт В238/06 на протяжении 30 дней уровень эшерихий и сальмонелл составил 16% и 10% соответственно, в сравнение с контролем. Использование штамма Ь. /егтепШт В395/06, в такой же период, позволило снизить уровень потенциально опасных групп микроорганизмов, однако их количество оказалось выше и составляло 81% и 15% от количества эшерихий и сальмонелл соответственно в содержимом дистальных отделов кишечника контрольной группы. В то же время, при оценке влияния данных штаммов на би-фидобактерии и лактобациллы оказалось, что применение I. /егтепШт В395/06 позволило повысить их количество на 288% и 173% соответственно, а при использовании Ь. /егтепШт В238/06 эти показатели были ниже и составляли 177% и 111% соответственно, в сравнении с контролем.

Для сравнения возрастной динамики изменений микрофлоры пищеварительного тракта полученные данные были отображены в рисунках 1 и 2. При сравнении возрастной динамики изменений микрофлоры пищеварительного тракта видно, что тенденции возрастных изменений различных видов микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры, во всех группах схожи. Так, во всех трех группах наиболее высокое содержание эшерихий было зафиксированно на 10-й день опыта с постепенным снижением их количества к месячному возрасту. Мы объясняем это особенностями содержания телят: первые три дня жизни телята находятся в одном помещении со взрослыми животными различных физиологических состояний и в это время наблюдается высокое обсеменение их организма потенциально патогенной микрофлорой. При переводе на содержание на открытом воздухе с учетом низких температур, характерных для этого времени года, уровень микробного загрязнения окружающей среды значительно уменьшается, контакт с поголовьем других возрастов отсутствует, что приводит к снижению количества этих микробов в организме телят. Наблюдается естественная санация организма, но под влиянием введения в организм животных антагонистических лактобацилл этот процесс протекает интенсивнее. Подобная ситуация наблюдается и при учете сальмонелл. Резкий

скачок их количества в контрольной группе на 30-й день опыта вероятно обусловлен введением в рацион недоброкачественных кормов. В опытных группах этого не произошло благодаря профилактическому применению пробиотических микроорганизмов на протяжение месяца.

Рисунок 1. Содержание в фекалиях телят: А - эшерихий, Б-сальмонелл

* 18

5 16 м

1 „14 £ ^

0 212 §¿10

1 о8

§ н 6

¡о

и .

<Н 4 т

5 ■>

* 0

ш О

л * „

2 ч* о 2

а ¡3 х

<10

о ш к о <и

у §

5С

ае

ю 4

рисунок!. А

------------»1 группа

---8-2 группа

3 группа

10 день

20 день

30 день

рисунок 1.Б

■г 1 группа *2 группа .1.3 группа

10день

20 день

30 день

Рисунок 2. Содержание в фекалиях телят: А - лактобацилл, - бифидобактерий

■ 1 группа е 2 группа 8 3 группа

10 день

20 день

30 день

рисунок 2,Б

|| а 1 группа

■

ж 2 группа В 1,3 группа

10 день

20 день

30 день

Во всех группах наиболее высокие показатели по содержанию бифидо- и лактобактерий, наблюдались на 10-й день, затем было некоторое снижение их количества к 20-му дню с последующим ростом. Это можно объяснить особенностями питания. В первые дни

теленок получает коровье молозиво и молоко, и в эти дни наблюдается самое высокое содержание молочнокислых микроорганизмов. При введении в рацион заменителей цельного молока (ЗЦМ) на седьмой день жизни и концентратов на десятый, их количество в кишечном тракте снижается.

Так же следует учитывать, что в состав заменителя цельного молока(«Кормилак»), используемого в хозяйстве, входит концентрат соевого белка, который не образует сгустка в сычуге. Это может спровоцировать ускоренное прохождение химуса по пищеварительному тракту. Однако, с постепенной адаптацией организма к новому продукту их уровни постепенно увеличиваются. 3.2.2 Влияние лактобацилл на гематологические показатели,

неспецифическую резистентность и рост животных Немаловажный интерес представляло влияние этих штаммов на иммунную систему молодняка крупного рогатого скота, в частности на некоторые показатели неспецифической резистентности. Имеются многочисленные сведения о способности лактобацилл влиять на систему иммунитета, которое проявляется в стимуляции фагоцитарной активности нейтрофилов, макрофагов, синтеза иммуноглобулинов, образования интерферонов, интерлейкинов и фактора некроза опухолей (Цой И.Г. и др., 1994; Иммунобиологические препараты..., 2002; Marteau P., Rambaud J., 1993; Schiffrin E.J. et al., 1995). По данным Лопатиной Т.К. и др. (1997), представители рода Lactobacillus стимулируют подавленную иммунную систему и не влияют на иммунную систему находящуюся в нормальном состоянии.

Они способны стимулировать систему перитонеальных макрофагов, активировать клетки и структуры, связанные с морфологическим субстратом клеточного иммунитета (Ленцнер А.А. и др., 1987; Saito Hajime et al., 1986). Наши исследования подтвердили, что вышеперечисленное полностью относится и к виду Lactobacillus fermentum.

Показатели крови показаны в таблице 6. Все показатели находятся в пределах физиологической нормы. Следует отметить достоверное повышение содержания гемоглобина в крови животных опытных групп. Вероятно это можно объяснить несколькими

причинами. Так, продукты метаболизма лактобацилл катализируют бактерицидную и ферментную активность лактопероксидазной системы молока, повышая ее защитные функции (Reiter В. et al., 1980). При этом, лактоферрин, входящий в лактопероксидазную систему, может конкурировать с микробными клетками за органически связанное железо и ограничивать рост железозависимых микроорганизмов, повышая количество железа, всосавшееся в кровь и необходимое доя постройки гемоглобина.

Немаловажным представляется так же то, что введение пробиотических лактобацилл снизило, количественно, популяцию протеолитических микроорганизмов, одним из конечных продуктов метаболизма которых являются биогенные амины, ингибирующие деятельность многих систем, в том числе и эритропоэз. За счет этого, опосредованно, произошла оптимизация кроветворения и повышение уровня гемоглобина в крови, но в пределах физиологической нормы.

Таблица 6. Гематологические показатели у подопытных телят в 30-дневном возрасте_

Группа животных

Показатель 1 2 3

контрольная ОР+LDB 238/06 ОР+LBB 395/06

Эритроциты, млн/мкл 7,86±0,27 7,89±0,191 8,14±0,37

Лейкоциты, тыс/мкл 4,86±0,27 4,24±0,21 3,3±0,15*

Гемоглобин, г/л 90,44±3,79 101,34±2,44* 111,36±3,93*

Лейкоцитарная формула, %:

базофилы 1,6 1,2 1

эозинофилы 1 1,4 1,6

Нейтрофилы:

г' юные - - -

палочкоядерные 14,2 12 8,4

сегментоядерные 33,2 21,2 22

лимфоциты 42,4 58,4 61,4

МОНОЦИТЫ 7,6 7,6 6,6

Что касается лейкоцитарной формулы, то во всех группах она соответствовала лейкограмме здоровых животных, но в опытных

группах повысилась доля лимфоцитов за счет снижения доли сегментоядерных нейтрофилов.

Показатели неспецифической резистентности телят приведены в таблице 7. Как видно из таблицы, в опытных группах, получавших в течение месяца штаммы I. /егтеШит В238/06 и В395/06, фагоцитарная активность нейтрофилов и макрофагов повысилась на 53% и 18,3% соответственно, в сравнении с контрольной группой. Общая бактерицидная активность сыворотки крови так же возросла, но разница с контролем была не столь существенна и составляла 6,7% и 3,6% соответственно.

Таблица 7. Показатели неспецифической резистентности у телят в 30-дневном возрасте._

Показатель Группа животных

1 контрольная 2 ОР +LBB 238/06 3 ОР+LBB 395/06

Фагоцитарная активность, % 23±3 35,2±3,19 27,2±4,79

Бактерицидная активность сыворотки крови, % 84,17±4,04 89,78±1,56 87,23±2,85

Лизоцим сыворотки крови, мкг/мл 17±0,7 35±1,2* 40±2,1*

По данным Денисенко В.Н. (1976), среднее количество лизоцима в сыворотке крови телят холмогорской породы месячного возраста составляет 15,41±1,74 мкг/мл. Таким образом, в контрольной группе уровень лизоцима находился в пределах нормы (17 мкг/мл). Однако, в опытных группах количество лизоцима, установленное в сыворотке крови, превышало этот показатель более чем в два раза и составляло 35±1,2 мкг/мл для группы, получавшей L. fermentum В238/06, и 40±2,1 мкг/мл для группы, которой давали L. fermentum В395/06. Вероятно, определенную роль в этом сыграло то, что по данным Глушановой H.A. (2003), Ленцнера A.A. и др. (1987), Максимова В.И. и др. (1988), лактобациллы могут продуцировать лизоцим и выделять его в окружающую среду. Возможно, кроме

стимуляции собственно лизоцим - продуцирующих клеток организма телят, небольшое количество микробиального лизоцима могло всасываться в кровь и циркулировать в кровеносном русле.

Таблица 8. Нарушения функций пищеварения и прирост живой массы подопытных телят_

Группа животных

Показатель 1 контрольная 2 оривд 238/06 3 ОР+ЬВВ 395/06

п, гол. 7 7 7

Количество

животных имевших

нарушения функций 3 4 3

пищеварения, гол

Общая

продолжительность, 16 18 8

дней

Средняя

продолжительность в расчете на одну голову, дн/гол 5,33 4,5 2,67

% к контролю 100 84,4 50,1

Живая масса в начале опыта, кг 27,1 ±0,2 26,9±0,2 27,6±0,3

В конце опыта, кг 46,6±0,3 50,4±0,8* 49,9±0,8*

Среднесуточный прирост 643±6 775±20* 733±25*

% к контролю 100 120,5 113,9

Оптимизация микробиоценоза кишечника, повышение иммунного статуса и увеличение содержания гемоглобина в крови животных 2-й и 3-й групп (на 12% и 23% соответственно) привели к сокращению продолжительности нарушений функций пищеварения в расчете на одну голову, по сравнению с контролем, во 2-й группе на 13,6%, а в 3-й группе на 50%, что благоприятно отразилось на росте молодняка и существенно повысило среднесуточные приросты телят (табл. 8).

3.2.3 Эффективность совместного применения штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 при выращивании

телят

Результаты научно - хозяйственного опыта показали, что выделенные штаммы лактобацилл L. fermentum В238/06 и В395/06 оказывают благотворное влияние на организм телят первого месяца жизни. Они способствуют становлению нормальной микрофлоры кишечника путем стимуляции развития популяций бифндобактерий и лактобацилл и элиминации из биотопа сальмонелл и кишечной палочки, что приводит к более эффективному использованию энергии корма и, соответственно, увеличению среднесуточных привесов. Оказывают достоверное влияние на такие физиологические показатели как уровень гемоглобина и лизоцима в крови, общая бактерицидная активность сыворотки крови, фагоцитарная активность клеток крови. Однако, отобранные культуры оказывали разное по степени выраженности воздействие на баланс микрофлоры и защитные системы организма. Так, штамм L. fermentum В238/06 оказывал более выраженное ингибирующее действие на популяции эшерихий и сальмонелл кишечника, уровни фагоцитарной и бактерицидной активности крови при его применении были выше, чем при использовании L. fermentum В395/06. В то же время, штамм L. fermentumB395/06 более выраженью стимулировал увеличение количества бифндобактерий и лактобацилл в кишечнике и концентрацию лизоцима в сыворотке крови. В связи с этим было решено соединить полезные качества каждого из штаммов использовав их смесь в равной пропорции. Количество живых микробных клеток в 1 мл препарата было решено повысить до 4,5x109. Для сравнения эффективности положительного влияния на организм растущих телят выделенными штаммами вида L. fermentum с существующими препаратами, был выбран пробиотик «Лактоамиловорин». Основой данного пробиотика является штамм Lactobacillus amylovorus БТ-24/88. Препарат предназначен для телят при диарейных заболеваниях, нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте и замены антибиотиков в стартерных комбикормах (Тараканов Б.В., 1998).

При проведении опыта учитывались показатели заболеваемости и приростов живой массы у телят. Результаты эксперимента приведены в таблице 9.

Как видно из таблицы, среднесуточные приросты телят, получавших на протяжении месяца смесь антагонистических лактобацилл Ь. /егтешит В238/06 и В395/06, на 22% превышали показатели контрольной группы. Продолжительность нарушений функций пищеварительного тракта составляла 60,4% от времени, в течение которого фиксировались аналогичные нарушения функций у телят контрольной группы.

Таблица 9. Нарушения функций пищеварения и прирост живой массы подопытных телят при проведении производственного опыта

Показатель Группа животных

1 контрольная 2 ОР+ смесь штаммов 3 ОР+ «Лактоамиловорин

п, гол. 20 20 20

Количество животных имевших нарушения функций пищеварения, гол 12 15 9

Общая продолжительность, дней 61 46 35

Средняя продолжительность в расчете на одну голову, дней 5,08 3,07 3,89

% к контролю 100 60,4 76,6

Живая масса: в начале опыта, кг 28,3±0,3 28,4±0,3 28,3±0,3

в конце опыта, кг 49, Ш,2 53,9±1,3 53,4±1,7

среднесуточный прирост, г 697 850 836

% к контролю 100 122 120

WF^ Эти показатели сопоставимы с данными, полученными при раздельном использовании этих штаммов, однако использование смеси исходных штаммов позволило получить более высокие среднесуточные приросты. Применение пробиотика «Лактоамиловорина» в такой же период, позволило получить увеличение среднесуточных приростов на 20%, и сокращение продолжительности болезни до 76,6%, в сравнение с контролем. Таким образом, при включении антагонистических лактобацилл штаммов L. fermentum В238/06 и В395/06 в технологическую схему кормления телят, с целью оптимизации микробиоценоза кишечника, иммуномодулирующего воздействия и повышения их живой массы, полученные результаты были выше, чем при использовании зарегистрированного пробиотика «Лактоамиловорин».

4. Выводы

1. Из пищеварительного тракта клинически здоровых телят выделены и изучены новые штаммы лактобацилл, идентифицированные как Lactobacillus fermentum В238/06 и ВЗ95/06, отвечающие требованиям предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам.

2. Введение в рацион телят - молочников штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06, в течение первого месяца жизни животных, оказывает оптимизирующее влияние на становление микробиоценоза их кишечника, стимулируя развитие молочнокислых и бифидобактерий и уменьшая численность популяций сальмонелл и кишечной палочки.

3. Штаммы Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 оказывают выраженное влияние на неспецифическую резистентность телят. Они достоверно повышают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов на 53%, общую бактерицидную активность сыворотки крови на 18,3% и более чем в два раза содержание лизоцима в крови. Отмечено достоверное увеличение содержание гемоглобина в крови животных опытных групп.

4. Повышение естественных защитных сил организма телят и оптимизация микробиоценоза кишечника приводит к сокращению продолжительности нарушений нормального функционирования пищеварительной системы. В совокупности с более полноценным использованием питательных веществ корма, за счет элиминации

протеолитических микроорганизмов, это приводит к повыь^ЩЩ среднесуточных приростов на 20,5%, в сравнении с контрольной группой.

5. Совместное применение штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 существенно увеличивают профилактическую эффективность к расстройствам функций пищеварения телят и прирост их живой массы в сравнении с раздельным использованием штаммов. При этом продолжительность расстройств пищеварения телят удалось снизить на 39,6% и повысить среднесуточные приросты на 22%.

Предложения производству Предлагается использовать выделенные штаммы лактобацилл в качестве основы для создания нового пробиотика для телят-молочников, для оптимизации микрофлоры пищеварительного тракта, повышения неспецифической резистентности и улучшения процессов пищеварения в кишечнике, что обеспечивает высокую продуктивность животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Петраков Е.С., Тараканов Б.В. Воздействие пробиотических штаммов Lactobacillus fermentum на микрофлору кишечника, неспецифическую резистентность и рост телят-молочников // Проблемы биологии продуктивных животных, 2009, 4, 91-96.

2. Петраков Е.С. Биологическая характеристика лактобацилл, выделенных от телят с целью отбора пробиотических культур Н Проблемы биологии продуктивных животных, 2010, 1, 111-117.

3. Петраков Е.С. Изменения кишечной микрофлоры при использовании пробиотических лактобацилл у телят // Молодой ученый, 2010, 9(20), 78-83.

4. Тараканов Б.В., Петраков Е.С. Эффективность использования Lactobacillus fermentum при выращивании телят молочников до месячного возраста II Материалы региональной научно-практической конференции по проблеме: «Использование инновационных разработок НИУ региона для повышения эффективности сельскохозяйственного производства» под ред.

В.Н. Мазурова - Калуга: ГНУ Калужский НИИСХ Рссельхозакадемии. 2010, -с.151-155.

5. Петраков Е.С., Тараканов Б.В. Пробиотический потенциал двух штаммов Lactobacillus fermentum выделенных от телят II Материалы Международной научно-практической конференции «Физиологические механизмы становления и поддержания функций организма». -Сухум, 2010. -с.407.

6. Петраков Е.С. Влияние пробиотической культуры гетероферментативных лактобацилл на продуктивность и неспецифическую резистентность телят-молочников // XXI Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. -М. -Калуга: Типография ООО «БЭСТ-принт», 2010. -с.475.

Отпечатано ИП Донской В. Н. г. Калуга, Марата, 7, оф. 100. Тел.: 8 903 815 8629, 8 910 529 51 28 Заказ №231 тираж 50

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петраков, Евгений Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Пищеварительная система молодняка крупного рогатого скота и её микрофлора.

1.2 Расстройства пищеварения у новорожденных телят и их профилактка.

1.3 Влияние нормальной лактофлоры на макроорганизм.

1.4 Адгезия лактобацилл к эпителиоцитам кишечника.

1.5 Влияние лактобактерий на иммунные реакции организма.

1.6 Антагонистическое влияние лактобактерий.

1.7 Продукция лактобациллами биологически активных веществ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Выделение штаммов лактобацилл.

2.2 Изучение антагонистических свойств у лактобацилл.

2.3 Изучение физиолого-биохимических свойств лактобацилл.

2.4 Изучение острой токсичности лактобацилл.

2.5 Постановка научно - хозяйственных опытов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Биология гетероферментативных лактобацилл пищеварительного тракта телят.

3.1.1 Выделение лактобацилл из кишечника телят и их скрининг на антагонизм.

3.1.2 Кислотообразование как антагонистический фактор лактобацилл кишечника.

3.1.3 Адгезия лактобацилл.

3.1.4 Толерантность лактобацилл к неблагоприятным факторам пищеварительного тракта.

3.1.5 Ферментативная активность лактобацилл.

3.1.6 Чувствительность к антибиотикам.

3.1.7 Исследование острой токсичности штаммов Lactobacillus fer-mentum В238/06 и В395/06.

3.1.8 Характеристика отобранных штаммов лактобацилл.

3.2 Воздействие Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/ на организм телят - молочников.

3.2.1 Становление микрофлоры кишечника у телят.

3.2.2 Влияние лактобацилл на гематологические показатели, иммунную систему, расстройства функций пищеварения и рост животных.

3.2.3 Эффективность совместного применения штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 при выращивании телят.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Становление микробиоценоза кишечника, показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использовании новых пробиотических штаммов лактобацилл"

Обоснование необходимости проведения исследований

После распада СССР в стране произошли значительные изменения-агропромышленного комплекса наиболее явно выразившиеся» в животноводстве. Существенно сократилось поголовье всех видов скота, что обусловило падение производства животноводческой продукции. По данным заместителя директора Департамента животноводства и племенного дела Минсельхоза РФ X. А. Амерханова, с 1991 по 2007 г. поголовье крупного рогатого скота в нашей стране сократилось с 55 до 21,5 млн. голов, в том числе мясного - с 1,5 млн. до 452 тыс. голов, производство говядины снизилось в 2,5 раза, импорт возрос до 45%.

Такая же ситуация наблюдается в молочном скотоводстве. С 1990 по 2008 г. численность коров снизилась с 20,7 до 9,2 млн голов. Их доля в общем поголовье крупного рогатого скота повысилась с 36,3 до 43,6%. Производство молока снизилось в 1,7 раза, а в пересчете на душу населения с 376 до 221 кг (Оксанич Н., 2009).

Снижение качества питания в последние годы обусловлено как недостаточным потреблением питательных веществ, в первую очередь полноценных белков животного происхождения и витаминов, так и контаминацией животноводческой продукции ксенобиотиками техногенной и биологической природы. Безопасность и качество продукции животного происхождения неразрывно связаны. Невозможно гарантировать качество продуктов питания, если игнорировать биологические, токсикологические и радиологические факторы риска (Панин А.Н., Малик Н.И1, 2006).

Значительно повысились требования к качеству получаемой сельскохозяйственной продукции, что обусловлено возрастающем уровнем загрязнения окружающей среды. Получение экологически чистой продукции является первостепенной задачей для животноводства.

Широко стал применяться термин «безопасность продуктов питания». Это связано с многочисленными публикациями о возможности накопления антибиотиков и целого ряда стимуляторов роста в-тканях животных при их использовании. Продукты убоя таких животных, при определенных условиях, могут быть источником не только различных пищевых токсикозов и ток-сикоинфекций, но и- вызывать нарушения обмена веществ, связанное' с повышенным уровнем в организме1 как самих стимуляторов? роста, так и продуктами'их метаболизма.

Кроме этого, во всем мире отмечен рост количества мутантных штаммов микроорганизмов с высокой лекарственной устойчивостью. Их появление спровоцировало широкое и бесконтрольное применение антибиотиков. При изучении 187 культур, выделенных из различных йогуртов, производимых в странах Европейского Союза, была обнаружена устойчивость к кана-мицину у 79% изолятов, к ванкомицину у 65%, к тетрациклину у 26%, пенициллину у 23%, эритромицину у 16% и хлорамфениколу у 11%; при этом большая часть культур характеризовалась множественной лекарственной устойчивостью (Теттгетап Я., 2003). Снижение активности существующих антибиотиков ведет к созданию новых, более сильных, препаратов. Это создает порочный круг, появление новых штаммов резистентных к новым препаратам, и т. д.

Сейчас остро стоит вопрос скорейшего восстановления скотоводства, продиктованный жизненно важной потребностью в обеспечении продовольственной безопасности страны. Для увеличения количества выходной продукции животноводства, кроме внедрения новых схем по содержанию, кормлению и воспроизводству животных, широко применяют различные препараты стимуляторы роста. Нередко, в качестве таких стимуляторов используют антибиотики. Однако это влечет целый ряд негативных последствий.

При* нарушении условий содержания и кормления молодняка процессы сукцессии кишечных микроорганизмов нарушаются в негативную сторону. При этом в составе кишечного биоценоза устанавливается высокая концентрация стафилококков, протея, дрожжеподобных грибов и других микроорганизмов, снижен популяционный уровень бифидобактерий и молочнокислых бактерий, а структура популяции' эшерихий изменяется в сторону уменьшения ферментативной активности. Большую часть популяции лакто-бацилл и бифидобактерий представляют клоны с низкими колонизационными характеристиками и слабыми антагонистическими свойствами.

К основным причинам, вызывающим сдвиги в кишечном микробиоценозе, относятся первичные и вторичные иммунодефициты у молодняка, снижение колострального иммунитета, нарушение условий кормления и содержания матери и потомства, часто вакцинация (Малик К.И., Панин А.Н., 2001).

Под действием ряда экзогенных (антибиотики, вакцинация) и технологических факторов нарушается микроэкологическое равновесие кишечного биотопа, что приводит не только к доминированию потенциально патогенных микробов. Ускоряются темпы изменчивости условно - патогенных микроорганизмов, усиливаются генетический обмен и скорость формирования клонов, несущих плазмиды лекарственной устойчивости и нередко включающих гены, детерминирующие адгезивные, цитотоксические и энтероток-сические свойства условно - патогенных бактерий (Панин А.Н., Малик Н.И., 2006).

Это вызывает дисбактериозы, проявляющиеся в виде диареи, вялости и общего ослабления организма. Ранее, для лечения кишечных расстройств массово применялись антибиотики, но в 2003 году Европарламент и Совет Европы запретили использовать антибиотики в качестве стимуляторов роста в кормах животных и птицы. Тенденция по отказу от антибиотиков наблюдается и в России. Поэтому возникла необходимость в альтернативных препаратах, обладающих антимикробными и р о сто стимулирующими свойствами, быть безвредными и не депонироваться в организме (Долгов B.C., 2007).

Мировой опыт показывает, что наиболее полно этим целям отвечает заместительная терапия, направленная на восстановление кишечного биоценоза путем' регулярного- введения живых бактерий - представителей нормальной кишечной микрофлоры, под названиемпробиотики.

Помимо общего регуляторного воздействия на кишечный микробиоценоз,. пробиотики оказывают стимулирующее влияние на иммунологический статус. Увеличивается количество Т-лимфоцитов, активизируется функция В-лимфоцитов, повышается фагоцитарная активность нейтрофилов. Одновременно идет коррекция как кишечного микробиоценоза, так и иммуноде-фицитных состояний. Анализ иммунотропного действия пробиотиков показал, что основной мишенью для их стимулирующего действия является клеточное звено иммунитета (Малик Н.И., Панин А.Н., 2001).

В настоящее время стоит вопрос о поиске новых, экологически безопасных и не дорогих добавок для применения при выращивании молодняка крупного рогатого скота, которые смогут нормализовать микрофлору телят и повысить естественную резистентность организма, и за счет этого снизить заболеваемость животных и повысить их продуктивность. Несмотря на длительную историю использования таких добавок, многие аспекты этого вопроса остаются спорными и не до конца освещенными. Единая концепция пробиотикотерапии (включающая такие вопросы как происхождение и вид микроорганизмов, используемых в качестве пробиотических, оптимальное количество штаммов в препарате, дозировка живых микробных клеток на голову и др.) не выработана. Это указывает на необходимость проведения исследований нормальной микрофлоры пищеварительного тракта телят, с целью выявления и отбора штаммов, молочнокислых бактерий, обладающих пробиотическими свойствами.

Актуальность работы Перечень пробиотиков, зарегистрированных в Российской Федерации, насчитывает около 80 наименований отечественных и импортных пробиотических препаратов. Пробиотические культуры используются в составе кормовых добавок для молодняка животных, ими обогащают заменители цельного молока, витаминные, минеральные, ферментные кормовые добавки.

Однако Малик Н.И. и Панин А.Н.(2001),, показывают, что при мониторинге рынка пробиотиков; подавляющее число разработок не востребованы* практикой. Указанное обстоятельство дает основание авторам предполагать, что протективная; активность>многих пробиотических препаратов не обеспечивает заявленного авторами, эффекта. Они пришли-к выводу о том, что реальная потребность в экологически безопасных препаратах для профилактики же-лудочно - кишечных болезней, кажущаяся простота композиций пробиотика и снижение требований к содержанию и оформлению результатов научных и производственных испытаний привели к тому, что практически каждый научный или околонаучный коллектив считает способным реализовать себя в разработке пробиотических препаратов. При выборочном контроле пробио-тиков, выпускаемых различными производителями, авторы выявили основные причины, отрицательно влияющие на их качество: контаминация посторонней микрофлорой; замена одного пробиотического штамма другим; несоблюдение показателя жизнеспособности клеток в одной дозе препарата; несовершенство методов контроля качества; введение в препарат различных добавок без согласования с Ветфармбиосоветом; несоблюдение режимов хранения.

Одной из главных причин неэффективности пробиотиков может быть чужеродность используемых микроорганизмов реципиенту, которому они предназначаются (Коршунов В.М. и др., 1996).

Поэтому, для создания эффективных пробиотических препаратов для молодняка жвачных животных, необходим поиск новых штаммов микроорганизмов, являющихся представителями нормальной микрофлоры пищеварительного тракта телят, обладающих высокой антагонистической активностью по отношению* к патогенам и отвечающих требованиям, предъявляемым к пробиотикам.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы.являлось выделение новых штаммов лактобацилл с пробиотическими характеристиками и оценка их влияния на становление микробиоценоза пищеварительного тракта, морфологическую картину крови, неспецифическую резистентность и интенсивность роста у телят.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выделить, из пищеварительного тракта телят лактобациллы и отобрать штаммы, наиболее полно отвечающие требованиям предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам;

4. Сравнить интенсивность роста телят, получающих добавку из пробио-тических лактобацилл, с их сверстниками.

Научная новизна работы. Впервые из пищеварительного тракта телят выделены гетероферментативные лактобациллы с высокой антагонистической активностью против потенциальных патогенов, устойчивые к неблагоприятным факторам кишечника и безвредные для животных. Изучены штаммы Ь. /егтепНап В238/06 и В395/06, использование которых обеспечивает оптимизацию нормального микробного баланса в кишечнике, ингибирование роста потенциальных патогенов, повышение неспецифической резистентности организма и снижение продолжительности расстройств функций пищеварения, сопровождающихся диарейным синдромом, у телят.

Положения, выносимые на защиту

1. Из содержимого кишечника телят выделены новые штаммы L. fermentum В238/06 и В395/06, отвечающие всем требованиям, предъявляемым к про-биотическим микроорганизмам;

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Петраков, Евгений Сергеевич

5. Выводы

1. Из пищеварительного тракта клинически здоровых телят выделены и изучены новые штаммы лактобацилл, идентифицированные как Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06, отвечающие требованиям предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам.

2. Введение в рацион телят — молочников штаммов Lactobacillus' fermentum В238/06 и В395/06, в течение первого месяца жизни животных, оказывает оптимизирующее влияние на становление микробиоценоза их кишечника, стимулируя развитие молочнокислых и бифидобактерий и уменьшая численность популяций сальмонелл и кишечной палочки.

6. Предложения производству

Предлагается использовать выделенные штаммы лактобацилл в качестве основы для создания нового пробиотика для телят-молочников, для оптимизации микрофлоры пищеварительного тракта, повышения неспецифической резистентности и улучшения процессов пищеварения в кишечнике, что обеспечивает высокую продуктивность животных.

Заключение

Как видно из вышеизложенного, лактобациллы являются постоянными представителями нормального микробиоценоза кишечника сельскохозяйственных животных. При этом их влияние на макроорганизм благотворно и многогранно. Так, они подавляют жизнедеятельность многих патогенных микроорганизмов, оказывают выраженное иммуномодулирующее воздействие, продуцируют многочисленные микронутриенты, участвуют в процессах пищеварения. В этой связи, лактобактерии представляются основным объектом для использования в качестве основы для пробиотических препаратов, а поиск новых высоко антагонистически активных штаммов, выделенных из пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, является актуальной задачей для исследований.

2. Материалы и методы исследований 2.1. Выделение штаммов лактобацилл

Для выделения чистых культур Lactobacillus spp. использовали фекалии из кишечника телят, взятые в возрасте-до 30 дней при акте вынужденной дефекации. Отбор фекалий производили в опытном» хозяйстве «Ермолино», Калужской области, в мае 2008 года в стерильные чашки Петри. Из 10 — граммовых навесок фекалий готовили серийные десятикратные разведения на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и производили посев в агаризованную среду Рогозы в модификации Тараканова, элективную для лактобацилл (Тараканов Б.В., 2006). Среда содержит: триптический гидроли-зат казеина - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; КН2Р04 - 6 г; цитрат аммония двухзамещенный - 2 г; солевой раствор - 5 мл; глюкозу - 20 г; твин 80 - 1 мл; ацетат натрия - 25 г; ледяную уксусную кислоту (99,5%) - 1,32 мл; мясо -пептонный бульон - 100 мл; цистеин солянокислый - 0,5 г; агар-агар - 20 г; капустный отвар - 900 мл; рН среды 5,4. Среда обладает высокой селективностью и применяется для первичного выделения лактобацилл из пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. После культивирования в термостате в течение 72 часов при температуре 39°С пересевали выросшие изолированно колонии в жидкую среду МРС, приготовленную по прописи Де Манна с соавторами (De Mann J.С., Rogosa М., Sharpe М.Е., 1960). Среда содержит: пептон - 1г; мясной экстракт - 1 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; глюкоза - 2 г; твин 80-0,1 г; К2НР04 - 0,2 г; CH3C00Na-3H20 - 0,5 г; триаммонийцитрат - 0,2 г; MgS04-7H20 - 0,02 г; MnS04-4H20 - 0,005 г; дистиллированная вода - 100 мл; рН среды 6,0 - 6,5; культивировали при 39°С в течение 24 часов.

Одним из важных дифференцирующих признаков при идентификации лактобацилл является отсутствие у них каталазы. Для изучения использовали набор для микробиологических исследований для определения каталазы (производство НИЦФ, г. Санкт-Петербург). Метод основан на способности каталазы расщеплять перекись водорода с образованием пузырьков газа. Ход исследования: на поверхность предметного > стекла, с помощью петли, переносили суточную культуру, выращенную на лактобакагаре, среде для выделениями культивирования лактобацилл (производство ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии; г. Оболенск). Сверху наносили каплю 1-3% перекиси водорода. Положительная реакция - появление пузырьков газа.

Все выделенные культуры были первично идентифицированы как Lactobacillus spp. по морфологии клеток при микроскопии (неподвижные, грам-положительные палочки), отсутствии спорообразования и каталазы, потребности в ростовых веществах.

Штаммы молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли методом пересева в среду Рогозы в модификации Тараканова ежемесячно. Между пересевами культуры хранили в холодильнике при температуре 4-8°С.

2.2. Изучение антагонистических свойств у лактобацилл

Изучение антибактериальных свойств лактобацилл проводили методом отсроченного антагонизма в двухслойном агаре. На плотную среду МРС высевали методом укола бактериологической петлей 1-4 культуры лактобацилл на одну чашку Петри и культивировали при температуре 39°С в течение 72 часов. Далее, на крышку наносили несколько капель хлороформа и оставляли чашки перевернутыми на 30 минут. Убитые в парах хлороформа бактерии помещали на 30 мин в термостат для испарения хлороформа. Затем на чашки наслаивали слой 0,7%-ного полужидкого питательного агара с равномерно распределенной в нем тест-культурой и вновь культивировали при 39°С в течение ночи. Положительный результат учитывали по появлению вокруг инактивированных колоний лактобацилл зон отсутствия роста тест - культур.

Для. установления штаммов, продуцирующих в качестве антибактериальных веществ микроцины (бактериоцины с низкой молекулярной массой), использовали методику, описанную Хмель И.А. с соавторами (Хмель И.А., Манохина И.М., Басюк Е.И. и др., 1993). На поверхность плотной среды МРС с нанесенными, выросшими и обработанными в парах хлороформа-колониями, накладывали стерильный целлофан. Сверху на целлофан наносили 0,7%-ный питательный агар с равномерно распределенной тест - культурой. Инкубировали* в течение суток при температуре 39°С. Вокруг колоний, продуцирующих микроцины, появлялись зоны задержки роста. Метод основан на способности веществ с низкой молекулярной массой проникать через поры в целлофане.

В качестве индикаторных культур использовали штаммы дикого типа: 10 штаммов Escherichia coli spp. и 9 штаммов Salmonella spp., выделенных от свиней, 10 штаммов Staphylococcus spp. и 10 штаммов Enterococcus spp., выделенных от мышей, а также музейные штаммы: Salmonella rostock, S.derby, S.typhimurium colEl, S.utrecht, S.london 1446, S.dublin 42, S.bovis morbipicans 988, S.give, S.heidelberg 287, S.kirkae, S.stanly, Escherichia coli 113-3, E.coli K-12 W-3350, E.coli K-88, E.coli 817-020, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis OG-1.

2.3. Изучение физиолого-биохимических свойств лактобацилл

Для изучения ферментативных свойств выделенных культур по отношению к различным углеводам готовили жидкую среду МРС, в которую в отличие от оригинальной прописи не вносили глюкозу, а добавляли изучаемые углеводы в количестве 1 грамм на 100 мл среды. В качестве индикатора использовали бромкрезолпурпур в виде 1,6%-ного спиртового раствора. Культивировали при температуре 39 °С до 5 суток. О ферментировании углеводов судили по изменению окраски среды. Проверена ферментативная активность в отношении 25 углеводов, из которых 16 приведены в определителе бактерий Берджи: арабиноза, целлобиоза, фруктоза, галактоза, лактоза, мальтоза, манит, манноза, мелецитоза, рафиноза, рамноза, салицин, сорбит, сахароза, трегалоза, ксилоза, а 9 дополнительно использованы нами, это: лак-тулоза, сорбоза, арабино-галактан, фукоза, нутроза, тураноза, инулин, raftilose Р-95, raftiline ST.

В зависимости от того, какие продукты образуются при1 сбраживании глюкозы - только молочная кислота* или также другие органические продукты и СОз, молочнокислые бактерии принято подразделять на гомофермента-тивные и гетероферментативные (Шлегель Г., 1987). Это деление отражает коренные различия в путях катаболизма Сахаров. Основным дифференцирующим признаком является газообразование гетероферментативными бактериями при ферментации глюкозы. Для выявления газообразования засевали исследуемые культуры методом укола бактериологической петлей в пробирку с 5 мл полужидкого 0,7%-ного лактобакагара и сверху заливали 1 мл голодного агара. О способности к газообразованию судили через 24 часа выдержки в термостате при 39°С, по образованию выделяющимся углекислым газом разрывов в агаровом столбике в пробирке.

Энергию кислотообразования определяли по количеству титруемой молочной кислоты (Кугенев П.В., Барабанщиков Н.В., 1978), накопленной бактериями при посеве на обезжиренное 10%-ное молоко за 24 часа. Ход определения: в колбу емкостью 100мл отмеряли пипеткой 10мл исследуемого молока и 20мл дистиллированной воды (воду добавляли для того, чтобы отчетливее уловить розовый оттенок при титровании), в смесь добавляли 3 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина; из бюретки по каплям добавляли в колбу при постоянном помешивании 0,1н раствор едкого натра до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение минуты. Результат выражали в градусах Тернера (Т°). Под условными градусами понимается количество миллилитров точно 0,1н раствора щелочи (КОН или №ОН), необходимое для нейтрализации 100мл молока, разбавленного вдвое дистиллированной водой, при индикаторе фенолфталеине. Так же устанавливали коэффициент кислотности в граммах молочной кислоты. Для этого количество градусов титрования умножали на 0,009 (количество граммов молочной кислоты, эквивалентное одному миллилитру 0,1н щелочи). Кроме этого устанавливали активную кислотность молока путем измерения рН, проводимого при помощи автоматического рН-метра рН410 (производство «НПКФ Аквилон», г. Москва).

Процессы адгезии изучали по методике Брилис с соавторами (Брилис В.И., Брилине Т.А\ и др. 1986), на дважды отмытых в фосфатном буфере эритроцитах телят. В пробирку вносили по 0,5 мл взвеси эритроцитов и суспензии микробов в концентрации 109 клеток/мл, инкубировали в течение 30 минут при 39°С и готовили из смеси мазок. Готовые мазки окрашивали по методу Романовского-Гимза, подсчет адгезированных микроорганизмов вели под микроскопом. Использовали показатели; средний показатель адгезии (среднее количество микробов прикрепившееся к 1 эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения), коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе (процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы) и индекс адгезивности микроорганизмов (среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците, исчисляется по формуле ИАМ=СПАх100/к).

Чувствительность к антимикробным веществам у выделенных микроорганизмов определяли методом диффузии в агаре в соответствии с общепринятыми методиками (с помощью стандартных дисков производства НИЦФ, г. Санкт-Петербург). Концентрации антимикробных средств в дисках соответствовали: тетрациклина-ЗОмкг, рифампицина-5мкг, оксациллина-Юмкг, кларитромицина-15мкг, клиндамицина-2мкг, эритромицина-15мкг, левомицетина-ЗОмкг, ванкомицина-ЗОмкг, амикацина-ЗОмкг, стрептомицина-ЗОмкг, канамицина-ЗОмкг, неомицина-ЗОмкг, гентамицина-120мкг, фурадо-нина-ЗООмкг, бензилпенициллина-ЮЕД, ампициллина-Юмкг, меропенема-Юмкг, линезолида-ЗОмкг, ципрофлоксацина-5мкг, левофлоксацина-5мкг, доксициклина-ЗОмкг.

Для изучения толерантности выделенных лактобацилл к неблагоприятным факторам желудочно-кишечного тракта в опытные пробирки с 5мл среды MPC вносили: желчь для получения следующих концентраций - 20% и

40%,этанол для получения концентрации в 2%,4%,6% и 8%, 0,2% фенола, NaCl в концентрации 2%,4% и 6%. Суточную бульонную культуру добавляли по 0,5 мл' в каждую из опытных пробирок, культивировали при температуре 39°С. Через 24 часа фиксировали наличие или отсутствие роста.

Желчные кислоты оказывают мощное противомикробное действие, поэтому микрофлора ЖКТ выработала механизмы сопротивления действию желчи (Gunn J.S., 2000). По сравнению с грамотрицательными, грамположи-тельные бактерии, как правило, менее устойчивы к желчным кислотам, выделяющимся в двенадцатиперстную кишку, таким как N-ацильные соединения, конъюгированные с глицином или таурином (AlinY.T. et al., 2003). Во многих исследованиях получены данные о способности лактобацилл и бифидобакте-рий переносить кислотность желудка и действие желчных солей, присутствующих в ЖКТ, с вариабельностью между штаммами (Charteris W.P. et al., 1998; Prasad J. et al., 1998; Haller D. et al., 2001). Существуют методы, позволяющие моделировать имитацию транзита по ЖКТ, например методика Haller et al. (2001), предусматривающая инкубирование при рН 2,0-3,0 в физиологическом растворе в течение 1-2 ч, затем помещение в 1%-ный желчный бульон (CBS). Однако, желудочный сок, кроме низкого значения активной кислотности, содержит в себе ряд ферментов и солей. Данная методика не предусматривает изучение комплексного воздействия всех факторов желудочного сока на бактерийную клетку. Поэтому для проведения исследования на выживаемость в искусственном желудочном соке была выбрана методика, описанная Casey P.G. et al. (2004). Искусственный желудочный сок по прописи, предложенной Casey P.G. (Casey P.G., Casey G.D. et al., 2004), содержит на 1 литр сока: 35 г D-глюкозы, 20,5 г NaCl, 6 г КН2РО4, 1,1 г СаСЬ, 3,7 г КС1, 0,5 г бычей желчи (SERVA), 133 мг пепсина, 1 г лизоцима. Добавляли концентрированную соляную кислоту до получения значения рН* 1,85. В отличие от стандартной прописи, нами было решено не вводить в состав искусственного желудочного сока лизоцим, так как известно, что наибольшая активность лизоцима наблюдается при значениях рН от 3,5 до 7. Исследуемые штаммы выращивали- на лактобакагаре в течение суток при температуре 39°С, смывали 1 мл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl и смешивали с 5 мл желудочного сока. Готовили серийные разведения сразу после смешивания и. через 30 минут. Посев из разведений производили на лактобакагар, а подсчет выросших колоний вели через 48 часов. Для оценки выживаемости лактобацилл в искусственном желудочном соке рассчитывали процент живых микробных клеток от количества первоначально внесенных.

Окончательную идентификацию изолятов проводили с помощью тест-системы для биохимической идентификации бактерий до вида API-50, производства БиоМерье (Франция), с использованием программного обеспечения apiweb - API 50 CHL V5.0.

2.4. Изучение острой токсичности лактобацилл

В связи с тем, что мы должны были изучить влияние выделенных антагонистических штаммов лактобацилл, наиболее полно отвечающих требованиям применяемым к пробиотикам, на рост и некоторые физиологические показатели телят, было решено исследовать острую токсичность этих штаммов. В качестве основы для исследований были взяты «методические инструктивные документы по изучению препаратов для животноводства и ветеринарии» (Ветеринарные препараты, 1988), раздел по изучению острой токсичности препаратов. Изучение проводили на линейных мышах. Исследуемые штаммы засевались на лактобакагар и после выращивания в течение 72 часов при 39°С выросшие колонии смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия и проводили титрование с целью установления концентрации живых клеток в. смыве. Было взято по пять животных на каждый штамм, трем стерильно вводили взвесь живых микроорганизмов в концентрации 1x10 9-11 КОЕ/мл внутрибрюшинно, двум животным задавали штаммы перорально, по 1 мл с концентрацией 1хЮ10 клеток. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно по 1 мл физиологического раствора, а также использовали животных без каких-либо добавок. Наблюдение вели в течение 72 часов, при стандартных условиях содержания. Затем животных умертвляли в парах хлороформа и производили посев из внутренних органов (селезенки, печени, почек и сердца с кровью), для изучения возможного обсеменения органов введенными микроорганизмами.

2.5 Постановка научно - хозяйственных опытов

Первый научно - хозяйственный опыт проводился с февраля по апрель 2009 года на центральной ферме ОПХ «Ермолино» (Калужская область), в период массовых отелов на телятах холмогорской породы. На ферме имеется родильное отделение и профилакторий для новорожденных. В 3-х дневном возрасте телят переводили в индивидуальные домики, расположенные на открытом воздухе. Уход за телятами и их кормление осуществляось в соответствии со схемами и требованиями, принятыми в хозяйстве. Ежедневно теля га получали не менее 5 литров цельного молока, на седьмой день начинали вводить заменитель цельного молока «Кормилак», в состав которого входят: молоко сухое обезжиренное; сыворотка молочная подсырная; концентрат соевого белка; смесь жиров; моноглицериды; инол пищевой; премикс кормовой ПКК61-1. С десятого дня в рацион вводили сено, овес и стартерный комбикорм ПК-1.

Для профилактики диареи новорожденным телятам опытных групп выпаивали ежедневно по 50 мл культуры, содержащей в среднем по 3x108 колониеобразующих единиц (КОЕ) в одном миллилитре, то есть по 1,5x1010 живых микробных клеток на голову. Животные 2-й группы получали штамм Ь. /егтепШт В238/06, а третьей группы - штамм Ь./егтепШт В395/06.

Клинические наблюдения за телятами вели ветеринарные специалисты хозяйства. Они учитывали день возникновения расстройств пищеварения и их продолжительность, сохранность телят и прирост массы тела в течение первого месяца жизни.

Контроль за состоянием микрофлоры пищеварительного тракта осуществляли путем микробиологических исследований фекалий, которые получали при-акте вынужденной дефекации. Отбор1 проб проводили на 10-й, 20-й и 30-й день опыта. Изучалось количественное содержание в, химусе сальмонелл, эшерихий, протеев, грибов рода кандида, бифидо- и лактобактерий. Для этого разведения фекалий высевали на соответствующие элективные среды с последующим подсчетом количества выросших колоний.

Для изучения неспецифической резистентности на 30-й день опыта у животных контрольной и опытных групп брали пробы крови. Взятие крови у телят проводили с соблюдением правил асептики и антисептики из яремной вены в две стерильные пробирки. В одной из пробирок кровь стабилизировали гепарином (2,0-2,5 Ед/мл), а другую использовали для получения сыворотки. Сыворотку крови получали после ее свертывания при температуре +18-20°С, с последующим центрифугированием при 800g в течение 10 минут. Определяли: фагоцитарную активность клеток крови по Кост и Стенко (Кондрахин И.П., 2004), бактерицидную активность сыворотки крови по модифицированному методу Бухарина и Созыкина (Саруханов В.Я. с соавт., 2007), содержание лизоцима по методу Емельяненко (1980).

Определение фагоцитарной активности клеток крови основано на том, что при контакте с иммунологически чужеродными частицами специализированные клетки крови (моноциты, гранулоциты) поглощают (фагоцитируют) и разрушают их внутриклеточными ферментами. Ход определения: в ви-далевскую пробирку вносят 1 капилляр Панченкова со стерильным 4% -ным раствором цитрата натрия, два капилляра крови и 1 капилляр живой однодневной культуры с концентрацией 1-2 млрд/мл микробных клеток (Е. coli 113-3). Полученный раствор тщательно перемешивают и помещают в термостат на 1 час при 37°С. Содержимое пробирки после инкубации перемешивают и на предметных-стеклах готовят мазки; их подсушивают, фиксируют и окрашивают обычными методами. В приготовленных и окрашенных гематологическими красителями препаратах подсчитывают 100 нейтрофилов под иммерсионной системой микроскопа. Высчитывают процент фагоцитирующих клеток - показатель фагоцитарной активности.

Ход определения бактерицидной активности сыворотки крови: в пробирку помещали 20 мкл сыворотки крови, 2000 мкл питательного бульона и 300 мкл тест - культуры Е. coli 113-3 с концентрацией 1 млрд микробных1 тел в 1 миллилитре. Инкубировали в течение 90 минут при температуре 39°С, периодически перемешивая. Исследования вели на фотоэлектроколориметре марки КФК-2-УХЛ4.2, в кюветах длинной 5 мм, при длине волны 590 нм. Расчет вели по формуле: BA(%)=100-(D2-Di/Dk2-Dki)x100, где БА - бактерицидная активность, в процентах; Dr оптическая плотность опытных образцов сыворотки крови до инкубирования с тест - культурой, D2- оптическая плотность тех же образцов после инкубирования; DKt и DK2- оптическая плотность контрольных образцов, без добавления сыворотки крови, соответственно до и после инкубирования.

Количество эритроцитов и лейкоцитов определяли на гематологическом анализаторе Stat fax 1904 Plus Biochemistry Photometer (USA). Лейко-грамму выводили путем микроскопии мазков крови, приготовленных общепринятыми методами и окрашенными по Романовскому-Гимза.

Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным колориметрическим методом. Метод основан на том, что гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином ге-миглобинцианид (цианметгемоглобин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется фотометрически, при длине волны 540 (500-560) нм.

Содержание лизоцима определяли чашечным методом, основанным на способности лизоцима растворять взвешенный в агаре ацетоновый порошок из клеточных оболочек Micrococcus lysodeictikus. Степень литической активности определяется путем измерения диаметра зоны лизиса вокруг лунки в агаре, в которую был внесен исследуемый материал. Лизоцимную активность опытных проб определяют накладывая полученный результат на калибровочную кривую, построенную на основании показателей, отражающих диаметр зон лизиса, полученных при использовании серийных разведений* определенной концентрации стандартного кристаллического- лизоцима, лиофили-зированного из яичного белка марки «В», с определенной активностью.

Для оценки достоверности различий межгрупповых средних использовали t-критерий (Плохинский Н.А., 1980).

Второй научно — хозяйственный опыт был проведен в 2010 году, с 1 марта по 24 мая, в том же хозяйстве. Изучалась возможность производственного внедрения смеси антагонистических лактобацилл штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 в технологическую схему выращивания телят, с целью оптимизации микробиоценоза кишечника и повышения их живой массы. Для проведения опыта было сформировано три группы животных по методу сбалансированных групп - аналогов (Овсянников А.И. 1976) по мере рождения телят. Аналогичность групп определялась фенотипическими качествами, соблюдалась через исходные средние показатели по группам в целом (пол, живой вес, возраст, физиологическое состояние). В каждую группу набирали по 20 животных, по 10 бычков и телочек. Учитывали привесы живой массы, фиксировали данные по расстройствам функций пищеварения у животных (сопровождающихся диарейным синдромом). Первая опытная группа в дополнение к основному рациону, получала ежедневно по 50 мл смеси антагонистических культур лактобацилл Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06, в равной пропорции, с титром живых микробных тел в среднем 4,5x109, выращенных в среде, содержащей 10% сухого обезжиренного молока. Вторая опытная группа получала в дополнение к основному рациону по 50 мл пробиотика «Лактоамиловорин». Третья группа являлась контрольной и получала основной рацион, принятый в хозяйстве и аналогичный по составу с первым опытом.

3. Результаты собственных исследований.

3.1 Биология гетероферментативных лактобацилл пищеварительного тракта телят.

3.1.1 Выделение лактобацилл из кишечника телят, и их скрининг на антагонизм Для изучения было выделено 150 микробных культур, дополнительно было получено 50 культур ранее изолированных профессором Б.В. Таракановым. Все выделенные на элективных средах штаммы представляли собой грамположительные палочки и были первично идентифицированы как лак-тобациллы, с присвоением названия Lactobacillus spp. В№, где .уУ?-номер данный при выделении (сокращенное обозначение LBB№).

Первичный скрининг на антагонизм проводили в отношении штамма Е. coli 113-3, который используется как стандартная индикаторная культура в нашей лаборатории. Антагонистической активностью различной степени обладали только 24 штамма. При этом, штаммов продуцирующих низкомолекулярные антибиотикоподобные субстанции - микроцины не было выявлено. При дальнейшем изучении ингибирующих способностей в отношении эше-рихий, сальмонелл, стафилококков и энтерококков дикого типа, из этих 24 штаммов было отобрано 9, обладающих наиболее широким спектром подавления роста возможных патогенов, которые и были изучены более детально.

Все 9 штаммов подавляли рост сальмонелл дикого типа в 100% случаев, ингибировали не менее 90% от использованных в качестве индикаторных штаммов кишечной палочки и не менее 80% стафилококков и энтерококков дикого типа. Результаты скрининга на антагонизм в отношении коллекционных культур представлены в таблице 1. В качестве индикаторных культур для изучения ингибирующих способностей лактобацилл нами использовались как грамположительные (Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), так и грамотрицательные микроорганизмы {Escherichia spp., Salmonella spp., Klebsiella spp.). Это связано с различным механизмом подавления роста микроорганизмов лактобациллами. Так, ингибирующее воздействие на грамотрицательную микрофлору обусловлено, в основном, продукцией молочной кислоты. В то время как антагонизм по отношению к грампо-ложительным микроорганизмам проявляется за счет продукции антибиоти-коподобных субстанций - бактериоцинов, микроцинов и др.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петраков, Евгений Сергеевич, Боровск

1. Алехина Г.Г., Суворов А.Н. Пробиотики новый подход к старым проблемам//Успехи современного естествознания, 2007, 6, 36-39.

2. Алиев А.А. Липидный обмен и продуктивность жвачных животных. -М.: Колос, 1980. -381с.

3. Алиев А.А. Обмен веществ жвачных животных. М.: НИЦ «Инженер», 1997, - 564 с.

4. Андреева И.В. Потенциальные возможности применения пробио-тиков в клинической практике// Клин, микробиол. и антимикроб, химиотер., 2006, т.8,2, 151-172.

5. Анохин Б.М. Профилактика болезней телят в условиях интенсификации сельскохозяйственного производства. Воронеж, 1987. - 87 с.

6. Антипов В.А., Субботин В.М. Эффективность и перспективы применения пробиотиков//Ветеринария, 1980, 12, 55-57.

7. Ануфриева Т.А., Борисова О.А., Жбанова Т.В., Борисова И.А. Смешанные инфекции животных: обзор литературы. Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ», 2010. - 123 с.

8. Апатенко В. М. Смешанные инфекции сельскохозяйственных животных. 2-е Изд. Перераб. и дополн. Киев: Урожай. -1990, - 62 с.

9. Бекер М.Е., Лиенинын Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. М., 1990.-334 С.

10. Белоусова Е.А., Никитина Н.В., Мишуровская Т.С., Златкина А.Р. Восстановления кишечной микробиоты: возможности препаратов на основе микробных метаболитов// Консилиум, 2005, 1,9-13.

11. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий// Микробиология, 2001, 4, 67-74.

12. Бондаренко В.М. Классификация бактерий рода Lactobacillus. Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002, Т.1. -С.140.

13. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их терапевтического эффекта// Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2004, 3, 83-87.

14. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Воробьева М.А. Механизм действия пробиотических препаратов// БиоПрепараты, 2003, 3, 2-5.

15. Брилис В.И., Брилине Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов// Лабораторное дело, 1986, 4,210-212.

16. Бухарин О.В. Антилизоцимный признак бактерий и перспективы его практического использования //В сб.: Персистенция микроорганизмов. -Куйбышев, 1987, 4-10.

17. Бухтилов Ф.Н. , Кошевая Г.И., Ливанов К.С., Смолин А.И., Бочарова А.Г., Бухтилова Н.С., Щеткина A.A. Развитие кишечной микрофлоры у новорожденных телят// Ветеринария, 1981, 4, 37-38.

18. Ветеринарные препараты. Справочник / Под ред. А.Д. Третьякова. -М.: ВО «Агропромиздат», 1988. -319 с.

19. Вильсенс А.Т.Е., Ваще Кастеле Ж.С., Деметер Р.Л. Содержание стафилококков и микрококков в сыром молоке. XII Меж-дунар. конгр. по мол. делу. М.: Пищепром., 1971, 259-260.

20. Глотов А., Шкиль Н., Глотова Т. Особенности проявления вирусных и ассоциативных вирусно-бактериальных болезней крупного рогатого скота// Ветеринария с.-х. животных, 2009, 2, 17-27.

21. Глушанова H.A. Биологические свойства лактобацилл// Бюллетень сибирской медицины, 2003, 4, 50-58.

22. Глушанова H.A., Блинов А.И. О биологической и антагонистической активности «сухого» и «жидкого» пробиотика «NARINE»// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2005, 1(39),148-153.

23. Глушанова H.A., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотиче-ских и индигенных лактобацилл в условиях совместного культивирования in vitro//Микробиология, 2005, 2, 56-61.

24. Голиков А.Н., Базанова Н.У. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 242-245.

25. Головко В.А., Апатенко В.М., Копиецкий В.Ф. Пространственно временные отношения при факторной инфекционной патологии, ассоциированной с острым кишечным заболеванием телят// Вет. консультант, 2007, 13, 11-14.

26. Григорьева Г.И., Арбузова A.A., Кульчицкая М.А., Панитков М.А. Роль микроорганизмов (бактерий и вирусов) в возникновении желудоч-но кишечных заболеваний новорожденных телят// Вет. патология, 2005, 4, 108-113.

27. Давидов Р.Б. Молоко. М.: Колос, 1969. - 327 с.

28. Данилевская Н.В. Фармакологические аспекты применения про-биотиков в ветеринарии электронный ресурс.// Биотехнологическая фирма «Компонент»: библиотека. URL: http://www.bf-component.nj/library.html

29. Денисенко В.Н., Печников Г.Н., Грызлова О.Н., Емельяненко П.А. Роль иммуноглобулинов в формировании механизмов естественной резистентности новорожденных телят// Сельскохоз. биология, 1994, 2, 98-103.

30. Диланян З.Х Молочное дело. 2-е изд. М.: Колос, 1967. - 296 с.

31. Долгов B.C. Использование пробиотиков в животноводстве// Доклады РАСХН, 2007, 5, 48-50.

32. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. М.: Медицина, 1969.-С.152-219.

33. Донченко А.С., Магер С.Н. Ассоциативное проявление вирусно -бактериальных инфекций на примере лейкоза и туберкулеза крупного рогатого скота// Вестн. РАСХН, 2005, 5, 66-67.

34. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: Грантъ, 2002. -296 с.

35. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение// Антибиотики и химиотерапия, 1999, 6, 33-40.

36. Емельяненко П.А Методические указания по тестированию естественной резистентности телят. — М., 1980, 29 с.

37. Зинченко Е.В., Панин А.Н. Иммунобиотики в ветеринарной практике. Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2000. -164 с.

38. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Наровлянский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных// Иммунология, 2004, 25(5), 288-290

39. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Шаповалова О.В. Влияние бактерий рода Lactobacillus на миграционную активность макрофагов// Микробиология, 2006, 6, 40-44.

40. Ивановский А.А. Иммуностимуляторы и их роль в повышении резистентности животных к болезням. Киров: Зональный НИИСХ Северо-Востока, 2005. - 68 с.

41. Иммунобиологические препараты и перспективы их использования в инфектологии/ Под редакцией Онищенко Г.Г., Алешкина В.А., Афанасьева С.С., Поспеловой В.В. М., ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002. -608 с.

42. Иноземцев В.П., Самсонов О.В., Талер Б.Г. Профилактика незаразных болезней основа сохранности животных// Ветеринария, 2000, 11,913.

43. Кавардаков В.Я., Кайдалов А.Ф., Баранников А.И., Косее Г.И. Корма и кормовые добавки: учебно-методическое и справочное пособие. — Ростов-на-Дону, 2007. 512 с.

44. Калачнюк Гл. Интенсивна впчщвля телят при зниженних витратах молока i зерна / Гл. Калачнюк, L. И. Грабовенськш / Львив.: Каменяр, 1983. -86 с.

45. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета// Иммунология, 2002, 2, 77-80.

46. Кондратьева В., Наумова Н., Ветшева А. Влияние метицилина на биохимические показатели крови. Профилактика и ликвидация болезней домашних животных и птиц. Ульяновск, 1980. - С. 45-48.

47. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к коррекции микрофлоры кишечника// Вест. РАМН, 1996, 2, 60-65.

48. Кугенев П.В., Барабанщиков Н.В. Практикум по молочному делу. Изд. 5-е, перераб. и доп. М., «Колос», 1978. -240 с.

49. Курилов Н.В. , Кроткова А.П. Физиология и биохимия пищеварения жвачных. М.: Колос, 1971. -432 с.

50. Ленцнер A.A., Лактофлора животного организма и ее защитные функции// Теоретические и практические проблемы гнотобиологии. — М.: Агропромиздат, 1986. С. 195-200.

51. Логинов С.И., Табакаев В.В., Семенова О.Н. Гематологические и иммунологические показатели у крупного рогатого скота при лейкозе на эн-зоотичных по анаплазмозу территориях// Сиб. вестн. с.-х. науки, 2005, 2, 2430.

52. Лопатина Т.К., Бляхер М.С., Николаенко В.Н. Иммуномодули-рующее действие препаратов эубиотиков// Вестн. РАМН, 1997, 3, 30-34.

53. Малик К.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты// Ветеринария, 2001, 1, 46-50.

54. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник/ под ред. проф. И.П. Кондрахина. М.: КолосС, 2004. - 520 с.

55. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Методические указания МУК 4.2.577.96. -М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. -95 с.

56. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Григорьева Е.А. Влияние бактерий рода Lactobacillus на цитотоксическую активность спленоцитов экспериментальных животных// Микробиология, 2007, 3, 53-57.

57. Овсянников А.И. Основы опытного дела в животноводстве. М., «Колос», 1976, - 304 с.

58. Оксанич Н. Выход из кризиса по государственной программе// Животноводство России, 2009, 6, 2-6.

59. Панин А.Н. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био, 2002, 2(17), 4-7.

60. Панин А.Н., Малик Н.И. Пробиотики неотъемлемый компонент рационального кормления животных// Ветеринария, 2006, 3, 3-6.

61. Панин А.Н., Малик Н.И., Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био, 2002, 3(18), 9-12.

62. Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунобиология и кишечная микрофлора. — М.: Аграрная наука, ИК «Родник», 1998. 48 с.

63. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В. Второе рождение пробиоти-ков//Ветеринарная газета, 1995, 17(79), 3.

64. Пивняк И.Г., Тараканов Б.В. Микробиология пищеварения жвач ных. М.: Колос, 1982 . - 247 с.

65. Пикина А.П., Смеянов В.В., Ефимов Б.А., Байнов H.A., Brook I., Reeves G.,Коршунов В.М. Первичный скрининг штаммов бифидобактерий и лактобактерий с целью разработки на их основе эффективных препаратов -пробиотиков//Микробиология, 1999, 6, 34-38.

66. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. -М.: Медицина, 1984. 144 с.

67. Плохинский H.A. Алгоритмы биометрии. М: Изд-во Моск. унта, 1980,- 150 с.

68. Плященко С.И., Сидоров В.Т., Трофимов А.Ф. Получение и выращивание здоровых телят. Минск: Урожай, 1990. - 222 с.

69. Рой Дж.Х.Б. Выращивание телят/ перевод с английского Г.Н. Жид-коблиновой и Д.В. Карликова// -М.: Колос, 1982. 470 с.

70. Садуахасова С.А., Кушугулова А.Р., Рахимова С.Е., Оралбаева С.С., Бисенова Н.М., Алмагамбетов К.Х. Характеристика антагонистических и кислотообразующих свойств Lactobacillus casei// Микробиология, 2007, 1, 84-87.

71. Саруханов В .Я., Исамов H.H., Мирзоев Э.Б., Кобялко В.О. Модификация метода определения бактерицидной активности крови сельскохозяйственных животных// Сельскохозяйственная биология, 2007, 2, 119-122.

72. Сидорович М. Влияние технологии на адаптацию телят в профи-лакторный период// Молочное и мясное скотоводство, 2003, 5, 12-13.

73. Субботин В.В., Сидоров М.А. Основные элементы профилактики желудочно-кишечной патологии новорожденных животных// Ветеринария, 2004,1,3-6.

74. Тараканов Б.В. Использование пробиотиков в животноводстве. -Калуга: Опер, типогр. Облкомстата, 1998. 53 с.

75. Тараканов Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. — М.: Научный мир, 2006.- 188 с.

76. Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных. Кишинев: «Штиница», 1990. - 189 с.

77. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г. К механизму антагонистической активности лактобацилл//Микробиология, 1989, 2, 3-8.

78. Федорова О.О. Спорообразующие анаэробные бактерии — антагонисты патогенных видов энтеробактерий // В сб.: Персистенция микроорганизмов. Куйбышев, 1987, 125-130.

79. Федотов В., Останина Е.Чувствительность микрофлоры цыплят к антибиотикам при пуллорозе тифе птиц. Профилактика и терапия болезней животных Алтая с учётом изменения морфологии. - Барнаул, 1981, 110-111.

80. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии// Иммунология, 1997, 5, 4-7.

81. Хмель И.А., Манохина И.М., Басюк Е.И. Характеристика энтеробактерий, продуцирующих антибиотики широкого спектра действия мик-роцины//Генетика, 1993, 29(5), 768-776.

82. Хоменко A.C., Погорелый А.О. Лечебно профилактические свойства комплексных препаратов содержащих нитрофураны// Ветеринария, 1984, 7, 64-65.

83. Цой И.Г., Сапаров A.C., Тимофеева И.К. Иммуностимулирующее действие лактобактерий на цитотоксичность естественных клеток киллеров и продукцию интерферона// Микробиология, 1994, 6, 112-113.

84. Чахава O.B. Гнотобиология — учение о микрофлоре организма хозяина// В кн.: Теоретические и практические проблемы гнотобиологии. М.: Агропромиздат., 1986.-С.14-19.

85. Чахава О.В. Гнотобиология. М.:Медицина, 1972. - 284 с.

86. Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Шабанова* H.A., Самоукина A.M., Червинец В.М. Бактериоциногенные высокоантагонистические штаммы лактобацилл// Микробиология, 2006, 7, 78-82.92. ■ Чернышев А.И. Диспепсия и сохранность телят. Казань, 1989. 35 с.

87. Чернышев А.И. Как сохранить телят. Казань, 1986. - 112 с.

88. Чурикова В.В., Викторов Д.И. Основы микробиологии и вирусологии. Воронеж: Издательство ВГУД989. - 272 с.

89. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно кишечных и респираторных болезней телят и поросят// Вет. патология, 2003, 2, 25-28.

90. Шендеров Б.А. Лекция на XIV школе-семинаре «Современные проблемы физиологии пищеварения», Пущино-на-Оке, 1997// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1998, 1, 61-66

91. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том III. Пробиотики и функциональное питание. М.: Грантъ, 2001.-288 с.

92. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. — Москва: «Мир», 1987.-567 с.

93. Эклз К.Г. Молочное скотоводство США. М.: Сельхоз-гиз, 1960. -638 с.

94. Яшин А.В, Современные представления о патогенезе токсической диспепсии у телят// Материалы научно-практич. конф. СПбГАВМ. — С.Петербург, 2000, 86-87.

95. Annuk H., Shchepetova J., Kullisaar T., Songisepp E., Zilmer M., Mikelsaar M. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates//J. Appl. Microbiol., 2003, 94, 403-412.

96. Atkinson R.L., Klatzer F. H., Stewart G.F. Laktose in animal and humen feeding// A review J. Dairy Science, 1957, 40, 1114.

97. BaiTow P. A., Brooker B.E., Fuller R. The attachment of bacteria to the gastric epithelium of the pig and its importance in the microecology of the intestine//J. Appl. Bacteriol., 1980, 96, 161-169.

98. Bjorck L. The lactoperoxidase system // In: Natural Antimicrobial Systems, 1985.-P. 18-30.

99. Blom H., Mortvedt C. Anti-microbial substances produced by food associated micro-organisms//Biochem. Soc., 1991, T.19, 694-698.

100. Bozza M., Satoskar A., Lin G. Targeted disruption of migration inhibitory factor gene reveals its critical role in sepsis// JEM, 1999, 189(2), 341-346.

101. Brashears M.M., Gilliland S.E., Buck L.M. Bilesalt deconjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus casei// J. Dairy Science, 1998, 36(3), 281-301.

102. Braunt M.P. The characteristics of strains of Selenomonas isolated from bovine rumen contents// Bacteriol, 1956, 72, 2, 162-167

103. Calandra T. Macrophage migration inhibitory factor and host innate immune responses to microbes// Scand. J. Infect. Dis., 2003, 35(9),-573-576.

104. Chen T., Toivanen P., Vainio O. Suppression of antigen-specific lymphocyte proliferation by Gram-positive bacterial cell walls// APMIS, 2002, 110(6), 490-498.

105. Clark D.S., Takacs J. Cases as preservatives// In: Microbial Ecology of Food./Ed. J.H. Silliker. -London, Academic Press, 1980. -P. 170-180.

106. Collins E.B., Aramaki K. Production of hydrogen peroxide by Lactobacillus acidophilus//J. Dairy Sci., 1980, 63, 353-357.

107. Collins M.D., Gibson G.R. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut// Am. J. Clin. Nutr., 1999, vol.69, 5, 1052-1057.

108. Condon S. Responses of lactic acid bacteria to oxygen // FEMS Microbial. Revs., 1987, 46. -P.264.

109. Corzo G., Gilliland S.E. Bile salt hydrolase activity of three strains of lactobacillus acidophilus// J. Dairy Science, 1999, 82, 472-480.

110. Cross M.L. Microbes versus microbes: immune signal generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens// FEMS, 2002, 34(9), 245-253.

111. Cummings J.H. Short chain fatty acids in the human colon// Gut, 1981, 22, 530-532.

112. De Mann J.C., Rogosa M., Sharpe M.E. A medium for the cultivation of Lactobacilli// J. Appl. Bact., 1960, 23, 130-135.

113. Drago L., Gismondo M.R., Lombardi A., de Haen C., Gozzini L. Inhibition of in vitro growth of enteropathogens by new Lactobacillus isolates of human intestinal origin// FEMS Microbiol. Lett., 1997, 153, 455-463.

114. Duval-Iflah Y., Chappuis J.C. Current Perspective on Microbiology-Ecology // In: Ed. H.J. Kug and C.A. Reddy, 1984. -P.264.

115. Fennel C. An investigation into effect of additing a specific strain of a lactic asid produsing organism to diet young calves in conventional calf rearing unit. Vitalink studies Ltd. Ireland, 1982.

116. Franz C.M., Holzapfel W.H., Slites M.E. Enterococci at the crossroads of food'safety// Int. J. Food. Microbiol., 1999, 47, 1-24.

117. Fuller R. Probiotics in man and animals// J. Appl. Bacteriol., 1989, 66, 365-378.

118. Fuller R., Newman H.N., Snoeyenbos G.H., Gould G.W., RhodesRoberts M.E., Charnley A.K. Microbial competition in the mouth and gastrointestinal tract. Natur. Antimicrobial System. Bath : Bath University Press, 1986. -P. 11-28.

119. Galdeano C.M., Perdigon G. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation// J. Appl. Microbiol., 2004, 97, 673-681.

120. Gevers D., Huys G., Swings J. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other Gram-positive bacteria// FEMS Microbiol. Lett, 2003, 225(1), 125-130.

121. Gill H.S., Rutherfurd K.J., Cross M.L. Dietary probiotic supplementation enhances natural killer cell activity in the elderly: an investigation of age-related immunological changes// J. Clin. Immunol., 2001, 21, 264-271.

122. Gilles Chanviere, Marie-Helene Coconnier Adhesion of human Lactobacillus acidophilus strain LB to human enterocyte like Caco-2 cells // J. General. Microbiol., 1992, V.138,8. P.1689-1696.

123. Gilliland S.E. Health and nutritional benefits from lactic acid bacteria//FEMS Microbiol. Rev., 1990, v.87, №1-2, 175-188.

124. Gilliland S.E., Nelson C.R., Maxwell C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus// Appl. Environ. Microbial., 1985, v.49, 2, 377-381.

125. Goldin B.R., Gorbach S.L. The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity// Amer. J. Clin. Nutr., 1984, 39, 756-761.

126. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Joint FAO/WHO Working Group. London, Ontario, Canada, 2002. -11 P.

127. Gunn J.S. Mechanism of bacterial resistance and response to bile// Microbe Infect., 2000 Jul; 2 (8), 907-913.

128. Haller D., Bode C., Hammes W.P., Pfeifer A.M.', Schiffrin E.J., Blum S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures// Gut, 2000, 47, 79-87.

129. Hamid A., Selman J.E. Investigations into the use of Streptococcus faecium (strain 68) as prevention against neonatal calf diarrheae// Ph. D. Tesis, Vet. Scool, Universiti of Glasgow, UK, 1980. 34 P.

130. Hoa N.T., Baccigalupi L., Huxham A. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders// Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66: 5241-5247.

131. Hoesl C.E., Altwein J.E. The probiotic approach treatment option in urology// Eur. Urol., 2005, 47, 288-296.

132. Hungate R.E. Studies on cellulose decompositing bacterial from rumen of cattle//J. Bacterial, 1967, -vol.53, 631 639.

133. Hiitt P., Shchepetova J., Loivukene K., Kullisaar T., Mikelsaar M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens//J. Appl. Microbiol., 2006, 100(6), 1324-1332.

134. Jones G.W. Adhesion to animal surfaces in Microbial adhesion and aggregation. Marshall K.C. (ed) Dahlem IConferencen, 1984, P. 71-84.

135. Kaila M., Isolauri E., Saxelin M., Arvilommi H., Vesikari T. Viable versus inactivated Lactobacillus strain GG in acute rotavirus diarrhea// Arch. Dis. Child., 1995,72,51-53.

136. Kaizu M., Sasaki M., Nakajama H., Suzuki Y. Effect of antioxidative lactic acid bacteria on rats fed a diet deficient in vitamin E// J. Dairy Sci., 1993, 76, 2493-2499.

137. Kato I., Yokokyra T., Mutai M. Macrophage activation by Lactobacillus casei in mice// Microbiol. Immun., 1983, 27: 611-618.

138. Kleerebezem M. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilisin autoregulate their own biosynthesis// Peptides, 2004, 25, 14051414.

139. Kullisaar T., Zilmer M., Mikelsaar M., Vihalemm T., Annuk H., Kai-rane C., Kilk A. Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics// Int. J. Food Microbiol., 2002, 72, 215-224.

140. Larlcin M. Probiotics strain for credibility// Lancet, vol. 354,1. 9193, -P. 1884.

141. Lee J.W., Shin J.G., Kim E.H. Immunomodulatory and antitumor effects in vivo by the cytoplasmatic fraction by Lactobacillus casei and Bifidobacterium longum// J. Vet. Sci., 2004, 5(1), 41-48.

142. Lilly D.M., Stilwell R.H. Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms// Science, 1965, 147, 747-748.

143. Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentation// FEMS Microbiol. Rev., 1990, 7(1-2), 149164.

144. Link-Amster H., Rochat F., Saudan K.Y., Mignot O., Aeschlimann J.M. Modulation of a specific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through fermented milk intake// FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1994, 10, 55-63.

145. London J. The ecology and taxonomic status of lactobacilli// Ann. Rev. Microbiol., 1976, vol. 30. P. 279-301.

146. Lund Bi, Edlund C. Probiotic Eriterococcus faecium strain is a possible recipient of the vanA gene cluster// Clin. Infect. Dis., 2001, 32, 1384-1385.

147. Marteau P., Rambaud J. Potencial of.using lactic acid bacteria for, therapy and immunomodulation in man// FEMS Microbiol. Rev., 1993, 12, 207220.

148. Metchnikoff E. Lactic acid inhibiting intestinal putrefaction. In: Chalmers Mitchell P, ed. The prolongation of life: optimistic studies. London: Heinemann, 1907, 161-183.

149. Mitsuoka T. Intestinal flora and host// Asian med. J. Japan, 1988, 7: 400-409.

150. Neutra M.R. Current concept in mucosal immunity. Role of M cells in transepithelial transport of antigens and pathogens to the mucosal immune system// AJP, 1998,274(5), 785-791.

151. Ogawa T., Asai Y., Tamai R., Makimura Y., Sakamoto H., Hashi-kawa S., Yasuda K. Natural killer cell activités of symbiotic Lactobacillus casei ssp. casei in conjugation with dextran// Clin. Exp. Immunol., 2006, 143, 103-109.

152. Orla M., Conneely Ph. Lactoferrin, Lactoperoxidase and Lizozyme: Nature's Protective Proteins // Presented ot Alltech's 8th Annual Symposium on Biotechnology in the Feed Industry, April, 1992, P. 123-133.

153. Ouwehand A.C., Vesterlund S. Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: Lactic Acid Bacteria: Microbial and Functional Aspects. Ed. Salminen S.A., von Wright A. and Ouwehand A.C. New York: Marcel Dekker, 2004, P.375-379.

154. Perdigon G., De Macias M.E.N., Alvares S. Systemic augmentation of the immuneresponse in mice by feeding fermentation milks with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus// Immunology, 1988, vol.63, №1, 37-44.

155. Perdigon G., Fuller R., Raya R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system// Curr. Issus. Intest. Microbiol, 2001, 2(1), 27-42.

156. Peuhkuri K., Lahteenmaki T., Sievi E., Saxelin M., Vapaatalo H., Korpela R. Antioxidative properties of Lactobacillus GG measured as prostacyclin and nitric oxide production in endothelial cell culture// Nutr. Today (Suppl.), 1996, 31, 53-54.

157. Plant L., Conway P. Association of Lactobacillus spp. with Peyer's patches in mice// CDLI, 2001, 8(2), 320-324.

158. Prasad J., Gill H., Smart J., Gopal P.K. Selection and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics// Int Dairy Journal 1998,8,993-1002.

159. Rafler J. Lactic acid bacteria and cancer: mechanistic perspective// Br. J. Nutr., 2002, 88(1), 89-94.

160. Reddy G.V., Shahani K.M., Banerjee M.R. Inhibitory effect of the yogurt on Ehrlich ascites tumor cell proliferation// J. National Cancer Institute, 1973, 50,815-817.

161. Reid G. Regulatory and clinical aspects of dairy probiotics// FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Cordoba, Argentina, 2001, 1-34.

162. Reid G. Safety of Lactobacillus strains as probiotic agents// Clin. Infect. Dis., 2002, 35:349-50.

163. Reiter B., Marshall V.M., Philips S.M. The antibiotic activity of the lactoperoxidase-thiocyanate-hydrogen peroxide system in the calf abomasum // Res. Vet. Sci., 1980, vol. 28. -P.l 16-122.

164. Rowland I.R., Grasso P. Degradation of N-nitrosamine by intestinal bacteria//J. Appl. Microbiol., 1975, 29, 7-12.

165. Sablon E., Contreras B., Vandamme E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis// Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2000, 68, 21-60.

166. Saito Hajime, Watanabe Takashi, Horikawa Yoshiya. Effects of Lactobacillus casei on Pseudomonas aeruginosa infection in normal and dexa-methasone treated mice// Microbiol, and Immunol., 1986, v.30, №3, 249-259.

167. Sanders J.W., Leenhouts K., Burghoom J., Brands J.R., Venema G., Kok J. A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation// Molecular Microbiology, 1998, 27, 299-310.

168. Schiffrin E.J., Rochat F., Linc-Amster H. Immunomodulation of human blood cells following the ingestion of lactic acid bacteria// J. Dairy Sci., 1995, 78,491-497.

169. Sheih Y.H., Chiang B.L., Wang L.H., Liao C.K., Gill H.S. Systemic immunity-enhancing effects in healthy subjects following dietary consumption of the lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus HN001// J. Am. Coll. Nutr., 2001,20, 149-156.

170. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions//Mol. Microbiol., 2005, 56, 845-857.

171. Takeda K., Suzuki T., Shimada S.I., Shida K., Nanno M., Okumura K. Interleukin-12 is involved in the enhancement of human natural killer cell activity by Lactobacillus casei Shirota// Clin. Exp. Immunol., 2006, 146, 109-115.

172. Tannok G.W. Effect of dietary and environmental stress on the gastrointestinal microflora. Human Intestinal Microflora and Disease. London: Acad. Press, 1983. P.517-539.

173. Temmreman R. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products// Int. J. Food Microbiol., 2003, 81(1), 1-10.

174. Van der Waaji D., Vries-Hospers H.G. Colonization resistance of the digestive tract; mechanism and clinical consequences// Ann. 1st. Super. Sanita, 1986, -vol.22, № 3, 875 882.

175. Vonk A.D., Schaafsma G., Dekker P.R. Relationship between intestinal transit time and iron absorption from milk and yogurt in rats // Neth. Milk Dairy., 1988, vol. 42, -P. 147-154.

176. Weizman Z., Asli G., Aisheikh A. Effect of a probiotic infant formula on infections in child care centers: comparison of two probiotic agents// Pediatrics, 2005, 115(1), 5-9.

177. Yang R., Ray B. Factors influencing production of bacteriocins by lactic acid bacteria// Food Microbiol., 1994, 11, 281-291.

Информация о работе

Петраков, Евгений Сергеевич
кандидата биологических наук
Боровск, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Становление микробиоценоза кишечника, показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использовании новых пробиотических штаммов лактобацилл - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы