Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт одновалентных катионов у бактерий: транспортные системы и принципы их взаимодействия

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Транспорт одновалентных катионов у бактерий: транспортные системы и принципы их взаимодействия"

ТНШССГИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ГРЧУНЯН Ш АМ5АРЦУМ0ШЧ

УДК 577.352.315+23

ТРАНСПОРТ ОДНОВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ У БАКТЕИ1Й: ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ И ПШНЩПЫ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

(03.00.02 - Биофизика)

Автореферат

ТВШСИ - 1989

ТБИЛИССКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ТРЧУНЯН АРМБН АЫБАРЦШОЕИЧ

УДК 577.352.315+23

ТРАНСПОРТ ОДНОВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ У БАКТЕРИЙ: ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕШ И ШИНЩШ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТЕИЯ

(03.00.02 - Биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степэни доктора биологических наук

ТЗШСИ - 1989

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Ереванского ордена Трудового Красного. Знамени государственного университета.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Д.Ш0СТРСВ(Ж2

V _

Доктор биологических наук, профессор Л.С.ЯГУЖШСКИЙ Доктор биологических наук, профессор С.Г .ГАЛАКТИОНОВ

Ведущее учреждение:

Институт биологической физики СССР, г. Цущино-на-Оке

Защита состоится " " 19 г. в __ часов

на заседании специализированного Совета Д 057.03.19 при Тбилисском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (380043 г.Тбилиси, ул. Университетская 2, 1ГУ, биологический факультет ).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Тбилисского госуниверситета.

Автореферат разослан "__ 19 г.

Учении секретарь специализированного Совета, доктор б иол .наук ^

Н.Г.ШТРЙКАДЗЕ

_ з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕШСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В осуществлении связи клетки с окружающей средой огромная роль принадлежит мембранным механизма!.: трансформации энергии и транспорта катионов, изучение взаимодействия которых" друг с другом приобретает первостепенное значение.

В современной физико-химической биологии известно, что две мембранные системы клетки могут взаимодействовать друг с другом через специализированные посредники. Согласно хемиосмоти-ческой гипотезе Митчелла •( Mitchell, 1961,1966,1968,1976,1965 "первичная" система - дыхательная, или фотосинтетическая цепь и.Н+-АТФазный комплекс рхро работает как протонный насос, вырабатывает д, а "вторичная"- использует ее в качестве источника энергии для таких процессов, как, например, синтез АТФ и транспорт катионов (В.П.Скулачев, 1972,1974; Э.Рэкер, 1979; С.М.Мартирооов, 1981; Дж.Николс, 1985; Л.Л.Гринюс, 1986; Harold, 1972,1977,1978; Hamilton, 1975; Kaback, 1976,1977.1986; Waat, 1980; Davidson and Kn&ff, 1982; Maloney, 1982; Jenck,19Ö3; Konings, 1983; Kagava, 1981;; Konings etal., 1981;; Harold and Kakinuma, 1985 ), Меяду первичными и вторичными транспортными сиотемами происходят косвенное взаимодэйстше выступает дальнодействущим источником конвертируемой энергии для мембраны. Множество экспериментальных данных не оставляет сомнений в правильности хемиосмотической гипотезы и косвенного взаимодействия транспортных систем в мембранах митохондрий и бактерий.

Вместе с тем, за последние года стали накапливаться данные о том, что первичные и вторичные системы мембран митохондрий (И.П. Красинская и др., 1984; В.Н.Маршанский и др., 1984; Л.С.Ягужин-ский, И.П.Красинская, 1987; we3terhoff et ai., 1981,1984; кга-sinskaya et al., 1981;; Novgorodov and Yaguzinsky, 1935; Yagiainsky et al,, 1986; Westerhof^, 1986 ) и

бактерий (Konings, 1983; Elferink et al,, 1981;; Konings et al., • 198I;; ELferink, 1986; Kruiwich, 1986 ) могут вступать в ггряглоe взаимодействие друг с другом без посредничества образуя

белок-белковые комплексы. Во внутримембранное взаимодействие вступает различные транспортные белки бактерий (И.Я.Калачев и др., 1980,1981s А.Г.Волошн и др., 1983; ГЛ.Бурд, С.М.Мартиро-

СОВ, 1985; Peterkovsky and Gasdar, 1978; Bourd and Hartirosov, 1983; Voloshin et al., 19Ö3; Cinl et al., 1981).; peterkovsky and Libarman, 198$ ), образуя домены для мембранной регуляции транспорта и клеточного метаболизма. Эти данные указывают на необходимость углубления и расширения принципа взаимодействия мембранных систем клетки друг с другом. Взаимодействие и передача энергии между различными системами могут происходить нэ только косвенно черезно и, возможно, прямо при непосредственном контакте.

Транспортные системы мембраны бактерий, ввиду относительной простоты и автономности последних, представляют наибольший интерес. Бактерии накапливают К+ против градиента в концентрациях, на несколько порядков превышающих содержание этих катионов В среде ( Schultz -and Solomon, 1961; Solomon, 1961; Zarlengo and Schultz, 1966} Damadlan, 1968, 1973; Nakajima et al., 1979J Backer and Harold, 1980; Bakker and Mangarich, 1981; Erecinska at al,, 1981; Meury and Kepes, 1981; Shonheit et al., 1981; ).

K+ играет важную ¡.оль в жизнедеятельности бактерий, в частности, в росте ( MacLeod and Snell, 19ÎJ.7, Schultz and Solomon,1961; Harold et al., 1967; Asghar et al., 1973} Ereeinska et al.,1901; Monot et ai., 1982 ) t в поддер&ании тургорного давления (С.С.Дургарьян, С.М.Мартиросов, 1980; С.М.Мартиросов, 1981; Orskov,igli-8; Ebstein and Schultz, 1965, 1968; Rhoads and Epstein, 1978; Meury and Kepes,1981} Heury et al.,1985;£jjstein,19Ö6 ), в стабилизации(В.П.Скулачав, 1978; И.И.Броун и др., 1979; И.И.Броун, Ю.В.Ким, 1982; А.Л.Драчев и др., 1984; skula-. chev, 1978} Arshavsky et al.,1981; Galperin et al., 1982 ), в регуляции транспортных и метаболических процесоов (С.М.Мартиросов и др., 1980,1982; Е.О.Пучков и др., 1982; А.П.Алимов и ДР., 1984; Ennis and Libin, 1961; Lubin and Ennis, 1964; Zarlengo and Schultz, 1966; Willis and Ennis, 1968; Ermia and Artman, 1970; Suetler, 1970} Ennis, 1971} Damadian, 1973} Kay and Gay, 1981; Hartirosov et al., 1981} Martirosov and Trohounian, 1981; Tukahashi and Ogure, 1981} Abbe and Yamado, 1982} Henderson and Potuznik, 1982} Tokuda et al., 1982} Keevil et al., 1981}.; Ere-cinska and Deutsch, 1985} Letellier and Boulanger, 1986; Walder-haug et al., 1987 ). Важное значение приобретают данные о роли К+ для увеличения продуктивности продуцентов аминокислот (А.К.

Хачатрян и др., 1986). В настоящее время у бактерий идентифицированы две основные транспортные системы, осуществляющие про-тивограднентное поглощение К+ (В.Н.ГершаноЕич, I980;Rhoads at al.,1976}* Epstein and Laimins, 1980} Helmer et al.» 1902} Koba-yashi, 1982; Heefner, 1982} Silver, 1983; Harold and Kakinuna, 1985; •'Rosen, 1986; walderhaug et al., 1987; Bakker, 1988 ). В изучении одной из них - kd£ у е.coll достигнут успех,- обнаружена К+-зависимая АТФаза (Ebstein et al., 1978, 1982j.j Laimins et Ol., 1978, 1981; Hesse et al., 1981). ). Предполагается, что другая система - тгк у e.coii представляет собой К+-ионо-фор и использует в качестве источника энергии д^^ и регулируется С помощью АТФ (Bakker, 1980, 1981, 1988; Meury and Kepes, 198I; Bakker and Mangerich, 1982; Kepes, 198^; Stewart et al., 1985 ). Такая же система у s.faecaii3 , по предложенной модели-( Bakker and Harold, 1980; Harold and Kakinuma, 1985 ), осуществляет вторичную транслокацяга K+ в симпорте с Н4". Тем самым, допускается косвенное взаимодействие этой системы транспорта К+ с протонными насосами бактерий через ДД-^.

Вместе с тем, у в.coll (С.С.Дургарья-i, С.М.Мартиросов, 1980; С.М.Мартиросов и др., 1980; Durgaryan and Martirosov, 1978; Mar-tirosov and Trchounian, 1981 ) И S.faecalis (С.М.Мартиро-cob, Л.С.Петросян, 1980; С.М.Мартиросов и др., 1982; Martirosov and petrosian, 1981 ) обнаружен ДЦКД-чувствительный обмен 2Н+ клетки на один К+ среды, осуществляемый Н+-К+-насосом, который включает в себе, по-видимому,РдР и тгк . И связь транспорта этих катионов осуществляется, скорее всего, не через

A/V.

Ни одна из предложенных моделей не объясняет совокупность данных по транспорту катионов у бактерий; остается неизученным транспорт Н+ и К+ у широкого ряда бактерий. На примере транспорта Н+ через f fq и К+ через тгк представляется актуальным изучение принципов взаимодействия транспортных систем клетки и обоснование принципа прямого взаимодействия без посредничества Д^-1дня' совместного экономного использования конвертируемой энергии.

Цаяью настоящей работы явилось изучение транспорта Н+ и К* у анаэробно и аэробно выращенных факультативно анаэробных, анаэробных и аэробных грамотрицательных и грамположительных бакте-

рий ж установление цришдатов взаимодействия транспортных систем мембран бактерий.

Были приняты к разрешению следующие основные задачи:

1) определить распределение К+ между клеткой и средой у бактерий и выяснить црироду сил, создающих и поддерживающих высокое распределение этих катионов между клеткой и средой, включая особенности генерации

2) выявить црироду поглощения К+ у анаэробно и азробно выращенных Е.соИ и определить, происходит ли изменение характера транспорта катионов при переходе от анаэробиоза к аэробиозу;

3) изучить регуляцию транспорта катионов в связи с энергетическим обменом бактерий и установить роль периплазматического пространства;

4) определить основные закономерности транспорта катионов у различных видов бактерий;

5) изучить принципы взаимодействия транспортных систем мембран бактерий друг с другом, на примере взаимодействия Р-^и тгк обосновать цриндап прямого взаимодействия мембранных систем с образованием белок-белковых суперкомплекоов для совместного экономного использования конвертируемой энёргии и предложить модели надмолекулярной организации транспорта катионов. Научная новизна работы. Б результате исследований о использованием широкого набора бактерий и их мутантов накоплен новый экс' периментальный материал по транспорту катионов и трансформации

энергии у бактерий и предложен новый принцип прямого взаимодействия транспортных систем мембран для совместного экономного использования конвертируемой энергии.

Впервые установлено, что распределение К4" между клеткой и средой у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий выше, чем у аэробно выращенных, и соответствующий калиевый равновесный потенциал существенно превосходит • при этом анаэробно выращенные и анаэробные бактерии имеют меньший А^р, чем аэробно выращенные и аэробные.

Обнаружено двухфазное поглощение К+ у анаэробно выращенных грамотрицательных и однофазное - у аэробно выращенных грамотрицательных и анаэробных и аэробных грамполохительных бактерий. Впервые показано, что быстрое поглощение К* в первую фазу у анаэробно выращенных грамотрицателъинт г поглощение К4" у аэроб-

но выращенных грамотрицателъных и анаэробных и аэробных грам-положительных бактерии осуществляется через тгк (илитгк -подобную) систему. Медленное поглощение К* во вторую фазу осуществляется через "дефектную" мс. (или Мс -подобную) систему.

Впервые установлено, что ДЩ-чувствительный обмен 2Н+ клетки на' один К+ среды в первую фазу поглощения К+ имеет место у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий и осуществляется механизмом, включающим в себя РхР0 и тгк систему. Для обмена 2Н+ на один К+ о участием тгк системы должен обязательно функционировать р1?о ; генетические дефекты в субъединицах рхр0 сказываются на характере обмена Ж4" на один К* и при дефекте в о. субъединице р0 Н+-К+-обмен исчезает.

Установлена роль периплазматического пространства грамотри-цательных бактерий в регуляции транспорта катионов, в частности, обмена 2Н+ на один К+; указана взаимосвязь обмена 2Н+ на один К+ с изменением поверхностного заряда бактерий.

Впервые осуществлена реверсия механизма, обменивающего 2Н* на один К*, и показана возможность синтеза АТФ с помощью р1ро с использованием градиента концентраций К* со стехиометрией 2Н+: К+: АТФ.

Выявлена зависимость ДЦКД-чувствительных се1феции Н+ и АТФ-азной активности протопластов, изолированных мембран и р1р0 от содержания К+ в среде, наблюдаемую у анаэробно выращенных бактерий и только при структурной целостности р^ и тгк системы.

Впервые установлена связь характера функционирования транспортных систем катионов со способом выращивания бактерий и типом клеточного метаболизма.

На примере р1р0 и тгк системы обосновывается новый принцип взаимодействия транспортных систем мембраны клетки друг с другом - прямого взаимодействия внутри мембраны с образованием белок-белковых комплексов для совместного экономного использования конвертируемой энергии. Внутримембранное взаимодействие транспортных систем для совместного использования конвертируемой энергии отражает общую закономерность, характерную для анаэробно выращенных и■анаэробных бактерий при низкоэффективных энергетических процессах в клетках, тгк (или&к -подобная) система у аэробно выращенных и аэробных бактерий работает отдельно я косвенно взаимодействует с другими транспортными сис-

- 8 - _

темами мембраны через посредничество

Научно-практическо-е значение работы. Принцип прямого внутри-мембранного взаимодействия транспортных систем для совместного использования конвертируемой энергии клетки открывает новые возможности в решении проблемы образования белок-белковых комплексов в мембране и кластеризации мембранных белков, изучении надмолекул^фной организации транспортных систем и установлении связи функций мембраны с клеточным метаболизмом.

Результаты о взаимосвязи характера транспорта катионов и действия факторов внешней среды со способом выращивания бактерий и типом клеточного метаболизма, а также об особенностях регуляции транспорта катионов с помощью периплазматического пространства важны для направленной регуляции мембранных функций клетки в биотехнологии, повышения продуктивности продуцентов.

Работа выполнена в рамках важнейших работ по общесоюзным научно-техническим программам (№№ госрегистрации 8I060I45 и 01870074669).

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Ш Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси 1981), Всесоюзной школе по биоэнергетике (Дилижан, 1982), Первом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Ш Республи канской научной сессии по вопросам биофизики (Ереван, 1982), Международном симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среда" (Пущино, 1983), Ш Советско-Швейцар оком симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Ташкент, 1983), XI Всесоюзном совещании по транспортным АТФа-зам (Ташкент, 1985), Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные-механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1986), П Республиканской научной конференции по физико-химической биолс ши (Ереван, 1986), IX Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Сегед, 1987), Всесоюзной конференции "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов" (Рига, 1987), заседании секции биохимии мембран Московского отделение Всесоюзного биохимического общества (Москва, 1987), Всесоюзно! совещании "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино , 1988), ХП Йенском симпозиуме по биофизической химии "Направления биоэлектрохимии биополимеров и мембран" (Веймар,

1988), Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболиз-ма"(Пущнно, 1989), др.

Публикации. Материалы диссертации опубликовав в 48 работах, в том числе 30 статьях, из них 14 - в журнале "Биофизика", 2 -в журнале "Биологические науки", 7 - в журнале " Bioeiectro-chemistry and Bioenergeti.es"»

Объем работы. Работа изложена на 343 страницах машинописного текста и додержит 35 таблиц и 71 рисунок. Библиография включает 534 наименований литературных источников, из них 71 на русском и 463 на иностранных языках.

Структура работы. Работа состоит из введения, семи глав, выводов и указателя литературы.

В первой главе приводятся современные представления о транспорте катионов у бактерий, Н+-АТФазном комплексе и дыхательной цепи как первичных протонных транслоказах, транспорте К+ и их роли в жизнедеятельности бактерий, обсуждается проблема взаимодействия мембранных систем клетки.

Краткое содержание остальных глав приводится ниже.

МА.ТЕГИАШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Бактерии. Исследования цроводаш на следующих бактериях: г- факультативно анаэробных грамотрицательных E.coli : диком типа E.coii к 1200 , мутантах, дефектных по калиевому транспорту, uno -мутантах с дефектами в субъединицах f1pq и их предшественнике (табл." I); -

- факультативно анаэробных грамотрицательных s.typhiriurlum : ДИКОМ типе S.typhimurluri LT 2 , uno.-мутанте S.typhimurium ИИ1. дефектном по Н+-АТФазе, и его предшественнике тнзг ;

- факультативно анаэробных грамотрицательных s.enteritidis штамм Исаченко и p.mirabiiis:

- анаэробных грамположительных b.saiivariua 3071 и облигат-НО аэробНЫХ граМПОЛОЖИТеЛЬНЫХ M.luteua .

Бактерии хранили, выращивали и подготавливали к эксперименту по принятым методам. Сферопласты бактерий получали путем обработки клеток с помощью лизоцима или пенициллина (каЬаск, 1971). Протопласты бактерий получали путем обработки клеток с помощью Э.ЩГА и лизоцима ( Repaske, 1956; Kobayashi et al., 1978 )• Изолированные мембраны бактерий получали по методу Кэбака (КаЬаск, 1971 ) . ВЫДеЛЯЛИ с ПОМОЩЬЮ ДеЗОКСИХОЛата НатрИЯ (Poster

Таблица I. Краткое описание мутантов е.coll , попользованных s работе

Мутант Дефектный белок Генотип Литература

Б*coll кар F- lao gal mal tfei Rhoads et al.,

ТК 1001 kdisABOÍ trkDl 1976

E.ooli Trk F** lao nal rha nadA Rhoads- and Eb-

тк 509й tV^A'l0? tI<knl stein, 1977

E.coli _ f" argHl entAit-03 pyrEl(l Oibson et al..

AN ЗЬ.6 elvC7 rpsL109 arpEljij. X" 1977

E.coli С( F- argE3 thi rati xyl gal Butlin et al.,

AN 120 uncAi|01 3trA70ii suoEífí). 1973

E.coli Ot (Р-ц) F" argHl entA403 pyrEíjl Qibsón et &1.,

AN 718 unoAif.01 rPSL109 supEiíit X~ 1977

В.coli F" argHl entAlí.03 pyrElfl Сох et al.,

AN 817 unoDíj.09 rpsL109 supEÍfif. 1978

E.coli <T<V F" argHl entAÍ).03 pyrEljl Downia et al.,

AN 1256 uno(JÍ).28 n>sL109 sudEI^. X~ I960

E.coli 6 (Px) F~ argHl entAlj.03 pyrElíl Gibson et al.,

AN 78I tmcCl).2íj. rpsL109 supEÍ|l| 7Г 1977

E.coli А <Ро> F argHl tbi mtl xyl gal Butlin et al.,

AN 302 ш1овц.01 strA70k sudEUi x~ 1973

E.ooli a (F0) F~ argHl entAlj.03 pyrEÍjl aibson et al«,

AN 719 unoB¡j.02.rp8L109 sudEI(1|. >" 1977

E.coli f" argHl entAíj.03 pyrElp. Downia et al.,

AN Ц19 unoFl|i>9 rpaL109 sudEUj. 7Г 1981

E.ooli 0(Ро) F" argHl entAli.03 pyrEltl Downie et al«,

1 AN 9^6 uncEíi29 rpsL109 stapEljl). X* 1979

8 этот штамм называется ив 109

and Fillingame, 1979; Leingruber et al.,1931 ). Размеры бактерий измеряли при помощи микроскопа, площади поверхностей и внутриклеточные объемы рассчитывали с учетом периплазматичес-КОГО пространства (Solomon, 1961; Damadian,1963;stock et al.1977) и сухого веса или количества белка. Титр бактерий определяли подсчетом колоний после высева на твердые среды или методом предельных разведений. Белок определяли по методу Лоури с со-авт. ( Lonry et al., 1951 )•

Транспорт катионов изучали потенциометрическим методом с помощью селективных электродов. Внутриклеточное содержание К1" определяли по выходу этих катионов из бактерий после их обработки толуолом (Eisenstadt, 1972 ) и методом пламеннофотометричвского анализа. Величину д^К-^/ f определяли как сумму электрического и химического компонентов;Д^р идрН рассчитывали по распределению ТФФ+ и салициловой кислоты между клеткой и средой, определяемых с помощью селективных электродов. О поверхностном заряде бактерий судили по величине электрокинетического потенциала, определяемого методом клеточного электрофореза. Внутриклеточную концентрацию АТ$ определяй люминометрическим методом го люци-ферин-люциферазной реакции (strehier, 1974 ) в незначительной модификации (Lundin and Thore, 1975 ). АТФазную активность определяли по высвобождению Фн после реакции о АТФ в единицу времени на мг белка. Фн определяли спектрофотометрически го методу Тауски и Шора (Tausski and shorr, 1953 ) Стандартную ошибку средних величин и критерий достоверности Стьюдента для разницы определяли по методу Стрелкова (1966).

НЕРАВНОМЕРНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ К+ МЕЗДУ КЛЕТКОЙ И СРЕДОЙ И дДн+ У ЕАКГЕЕИЙ '

Анаэробно выращенные к,coli; s.typhimuriurn и анаэробные L.saiiTarlua при перенесении в среду с глюкозой и умеренным содержанием К* интенсивно накапливают эти катионы, и распределение К1" между клеткой и средой достигает высоких значений, существенно превышающих 1С? (табл. 2). ,В накоплении К+ в клетке и создании высокого, расцредфгения Kt между клеткой и средой играет роль тгк система, так как у мутанта е.coli тк5090 дефектной №к системой эти эффекта не наблюдаются. Внутриклеточное содержание К+ и распределение этих катионов между клеткой и

Таблица 2. Распределение К* между клеткой ц оредой,

равновеоный потенциал идЦ->у анаэробно выращенных и* анаэробных (А) и аэробно выращенных (Б) бактерий.

Внутриклеточная активность определена в момент максимальной аккумуляции после введения глюкозы в первую Фазу поглощения К+ у анаэробно выращенных бактерии (рис. 2,4). Распределение К*" между клеткой н средой расотатано как отношение внутриклеточной активности К к активности К1" в..среда. рассчитан по уравнению Нернста. рН 7,4-7,6.

Бактерия

Активность К*" в среде

(Ш)

Распределение К+ между клеткой и средой

(Ш)

А.

Е.соИ К 12(» 3 . ЪурЫдцг^лдп

Ь Т 2

Ь.за11уаг1иа

3071 Б.

Е.со11

к 12(7\):

в присутствии цианида:

3 . ЪурМмиг 1ит ЬТ 2

0,48 £ 0,01

0,15 £ 0,01

0,64 £ 0,02 0,23 ± 0,03

0,51 £ 0,05 0,98 £ 0,05 0,19 £ 0,00

2529 ± 118

2464 £ 361

1008 ± 96 1717 ± 204

721 £ 73 434 ± 35 585 £ 50

207 £ I

207 £ 2

179 £ 5 198 ¿3

175 - 2 162 ¿3 169 £ 3

142 ¿3

120 £ 4

125 ± 4 148 £ 4

169 £ 4 160 £ 4 166 £ 3

(МагЪ1гозоу апа ТгЫюипЛап, 1986; Тге1юип1аа et а1., 1987)

- 13 -

средой как у аэробно выращенных E.ooli и s.typhimuriun f так и у аэробно выращенных и обработанных с помощью цианида е. ooli значительно ниже (табл. 2).

В накоплении К"1- в клетке и создании высокого распределения этих катионов между клеткой и средой у бактерий существенную роль долкен игратьу анаэробно выращенных и анаэробных бактерий составляет около -150 -160 мВ, цри этом о изменением jfl среды происходит перераспределение его компонентов. Деэнергизованные бактерии обладают Дф, при этом последний как У ДИКИХ ТИПОВ E.coll И S.typhlmurium , ТЭК И yuno -мутантов с нефункционирующнм plpo чувствителен к ДВД. Глюкоза приводит к кратковременному увеличению дф, подавляемому о помощью ДДКД и наблюдаемому цри структурной целостности PjF^ Trk.-Аэроб но выращенные е. оoil и з.^тоЫшцг1шаи аэробныем.1и-toua имеют заметно больший дф, при этой ДЦКД увеличивает его у аэробно выращенных B.eoii (рис. I).

Полученные факты говорят о непростой связи между распределением К+ между клеткой и средой н у бактерий. Если распределение К4 между клеткой и средой создается благодаря накоплению К* внутри клетка подф, то калиевый равновесный потенциал будет близок дф. Если же распределение К+ создается благодаря К^-наоооу о использованием энергии АТФ, то может существенно превышать дф. Сопоставив эти данные (табл. 2) , можно заключить, что в создании высокого распределения К* между клеткой и оредой у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий участвует система активного поглощения К1", скорее всего, тгк . функционирующая как КГ^-насоо, а у аэробно выращенных -транспортная система, работающая как К+-ионофор, использупций в качестве движущей аилы дф.

ТРАНСПОРТ КАТИОНОВ У в.соы : ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ И ТИП КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА Транспорт Н* и К+ у анаэробно выращенных s.coii . Анаэробно выращенные B.ooil в среде о глюкозой и умеренным содержанием К+ секретируют Н+ и поглощают К1" в две фазы (рис. 2), в первую из которых происходит ДЦКД-зависимый и осмочувствитальный обмен 2Н+ ■ клетки на один К* среда через Н+-К+-насос (С.С.Дургарьян, С.М.Мартиросов, 1980; С.М.Мартиросов И др., 1980; Durgaryan and Martiroaov, 1978; Hartirosov and Trohounian, 1981 ) И BO BTO—

§-160 .

-140

-120

-100

Рис. I. Влияние ДЦКД наД^у аэробно (1,3) и анаэробно (2) выращенных в»coll k12qj,

Положительный осмотический шок в. 430 мосМ, т§ 7,5-7,6, активность К+ 1,92 Ш; 3-бактерии обработаны цианидом К в концентрации 2 ivi.h ДЦВД введен (стрелки) в концентрации 0,25 Ш.

(Martirosov and Trcho-

unian, 1966)

10 20 ВРЕМЯ (мин)

руга - ДДКД-чувствительный обмен Н+ клетки на К+ среды с неустойчивым отношением штоков катионов. При этом кинетические параметры поглощения К1" в первую фазу близки к таковым Trk системы (ffixoads et ai.,1976 ) (табл. 3).

Арсенат подавляет как секрецию Н+, так и поглощение К4" у е. coli . В присутствии протонофоров (КХФГ) скорость секреции Н* остается высокой, однако поглощение К+ не наблюдается. Н+-К+-обмен зависит, скорее всего, от АТФ, нежели от Ар-ц+.

Валиномицин приводит к резкому уменьшению скорости поглощения К*, что исключает пассивный характер поглощения этих катионов в первую фазу.

При уменьшении температуры ДЩД-чувствительные потоки Н*" и К* падают пропорционально с одним и тем же о.10 , при этом отношение потоков остается равным 2.

Транспорт Н+ и К* у аэробно выращенных е. coli . Аэробно выращенные E.coli в среде с глюкозой, сукцинатом или молочной кислотой и умеренным содержанием К1" в отличие от бактерий, выращенных в анаэробных условиях, сежретируюг Н* и поглощают К* в

ВРЕМЯ (мин)

Рис; 2, Кинетика транспорта Н+ и К+ у анаэробно (сплошные кривые) и аэробно (пунктирные кривые) выращенных B.coii к 12(A)«

1,4-бактерии отмыты Ь дистиллированной воде и перенесены в экспериментальный раствор с осмотичностью 430 мосМ, 2-тот же эксперимент в присутствии ДЦКД в концентрации 0,25 М, 3-бактерии отмыты в растворе с осмотичностью 800 мосМ, созданной с помощью сахарозы, и перенесены в экспериментальный раствор; 4-цианид калия в концентрации 2 М\ рй 7,8; глюкоза в концентрации 50 tMi 2(пунктир)- цианид калия в концентрации 2 Ш. (Martirosov and Trchounian, 1986)

одну (разу (рис. 2). Аэробно выращенные и обработанные с помощью цианида p.coii поглощают К+ также в одну фазу, однако на кривой секреции Н4" наблюдается перегиб, характерный для анаэробно выращенных бактерий (рис. 2).

ДЦКД не влияет на поглощение К+ у аэробно выращенных Е,соИ. если экзогенным источником энергий служит глюкоза, и медленней, но подавляет поглощение К+, если источником энергии является сукцинат. У аэробно выращенных и цаанид-обработанных е.coil ДЦКД подавляет поглощение К+ и секрецию IT1" (рис. 2). Поглощение К+ у аэробно выращенных бактерий не чувствительно к осмотическому шоку (рис. 2).

Создается впечатление, что транспорт Н+ и К+ у аэробно выращенных и цианид-обработанных Е.ооН подобен таковому в первую фазу поглощения К+ у анаэробно выращенных. Однако, отношение ДЦКД-чувствительных потоков Н+ и К+ у этих бактерий не постоянно и заметно изменяется при изменении факторов внешней среды. Уже этот факт указывает на существенное и важное отличие в тран спорте катионов у этих и анаэробно выращенных бактерий.

Арсенат и протонофоры (КХФГ) подавляют поглощение К+, и значит, и АТФ, идрн+ нужны для поглощения К+ у этих бактерий. Валиномивдн не уменьшает скорость поглощения 1С*" у них, что свидетельствует о пассивном характере этого цроцесса. Наконец, поток К+ с уменьшением температуры почти не меняется, однако поток Н+ резко падает.

К природе транспорта Н* и К* у анаэробно и аэробно выращенных E.coii . Наши исследования указывают на то, что ДЦКД-чувстви-тельный обмен 2Н+ клетки на один К"*" среда через ^-К^-насос обнаруживается только у анаэробно выращенных E.ooli'. Предполагалось, что этот обмен осуществляется о участием f1pq (С.М.Мар-тирооов, 1981} Martlrosov, 1979 ). Не исключалось, что рхр0 функционирует как Е'ЧС^-наооо, что не совпадало о общепринятой точкой зрения о том, ч»о РдР0 является чистым И^-насосом. Возможно , что р1?0 взаимодействует о калиевой транспортной сиоте-дай, формируя ff^-iïî-THaooc.

Анализ характера транспорта Н* и К* у мутантов в.оон о дефектами но калиевому транспорту f в. coll тк îooi и тк 509 ) указал-следупцев:

• поглощение К* в первую фазу у анаэробно выращенных K^ooii и

Таблица 3. Кинетические параметры поглощения К+ у анаэробно выращенных и анаэробных (А) и аэробно выращенных и аэробных (Б) бактерий

Бактерия А Б

Ci/M) 7 тах (Шаль/ /Г,МИН) «м (Ш) V тах (Шоль/ /г.мин)

E.coli К12(Л)

первая фаза: 3,7 1,57 3,4 0,45

вторая фаза: E.coli ТК 1001 13,0 0,04

первая фаза: 1,9 0,63 1,7 0,37

вторая фаза: 16,0 0,15

E.coli ТК 509 13,3 0,40

S•typhimuriun LT 2 2,1 0,44 2,0 0,27

S.enteritidis штамм Исаченко: 2,8 0,51

энергозависимое:

в отсутствии источника энергии: 2,1 0,40

P.mirabilis 3,5 0,91

L.3alivarius 3071 3,3 0,31

M.luteus В 109 2,7 0,40

аэробно выращенных бактерий осуществляется через тгк систему; поглощение К+ во вторув фазу у анаэробно выращенных бактерий ~ через "дефектную" тгк систему;

- при работе тгк системы у анаэробно выращенных s.coii осуществляется ДЦКД-чувстштельный обмен 2Н+ клетки на один К+ среда, а щи работе "дефектной" тгк системы происходит ДШД-чувствительный Н+-К+-обмен с неустойчивым отношением потоков катионов.

Изучение Н+-К+-обмена у uno -ьфтантов E»coii , дефектных по отдельным субъединицам р1ро , имело принципиальное значение для определения связи fxf0 с поглощением К* у бактерий, в частности, с тле системой при ДЦКД-чувствительном обмене 2Н+ клетки на один К+ среды. Проведенный анализ характера транспорта Н* и К+ у une -мутантов е«соИ показал следующее (табл. 4):

- дефекты в oí., ¡5 и If субъединицах F-^e.coií ah 120, ah 718,ah 817 и an 1256 ), приводящие к потере АТФазной активности p1fo (Coz et al.» 1978, 1981} Dunn, 1978; Kanazawa at al., 1978,1981;; Fa-ylo et al., 1978} Senior, 1983 ), подавляют ДЦКД-чувствитель-ный обмен 2Н+ клетки на один К+ среда с участием тгк системы;

- дефект в £ субъеданице e.coií an 73i ) нарушает спонтанное отключение механизма обмена 2Н+ на один К+;

- дефект в а. субъеданице fo(e.cq11 ah 382,аи 719 } приводит к потере ДЦКД-зависимостн и осмочувствигельности обмена 2Н+ на один К4-;

- дефект в ъ_ субъединице fo(e.qo11 ah iíg.9 ) подавляет обмен 2Н+ на один К1", при этом исчезает ДЦКД-чувствителъность Н+-К"*"-обмена;

-г единственный дефект, ведущий к подавлению поглощения К+ и связанного с ним Н+-К+-обмена, связан с с_ субъединицей f0 ( е. с о.

li АИ 936 ).

Таким образом, генопродукт jmc -оперона у анаэробно выращенных Е»оо11 имеет отношение к поглощению К*, при этом дефекты в субъеданицах отражаются на функции только тгк системы, в то время, как дефекты в субъеданицах затрагивают функции как тгк , так и "дефектной" £гк систем. Результаты указывают что для поглощения К+ через Тгк систему должен обязательно функционировать р1ро . Приходится утверждать, что Н+-К+-насос, обменивавший 2Н+ клетки на один К4" среда, состоит из f^ и

- 19 -

Таблица 4. Функционирование механизмов транспорта IT1" и К+ у uno -мутантов в.ооИ.

Штамм Фаза роста Функционирование механизмов транспорта Н* и К+ Чувствительность транспорта К1" и К+

Обмен 2Н+ на один К в первую фазу Неустойчивый обмен во вторую фазу к ЩКД к осмотическому шоку (первой фазы и поглощения К )

стехиометрия ДЩ-чувстви-тельных потоков Н™ к К* количество экс-пери-ментов

АН зЪ.6 Стац. 1,8 ± 0,1 5 + +

Лог. 2,2 ± 0,1 b + + +

АН 120 Стац. - 6 + + -

АН 718 Стац. - 3 + + -

Лог. — 3 + + —

АН 817 Стац. — 3 + + -

Лог. — b + + —

АН 1256 Стац. - 5 + + —

Лог. - b + + -

AN 781 Стац. 2,2 ± 0,1 6 + + +

Лог. 2,0 ± 0,1 6 + + +

АН 382 Стац. 2,0 ± 0,1 10 + - -

AN 719 Стац. 2,0 ± 0,1 5 + — —

Лог. 1,8 ± 0,2 3 + - —

АН 110.9 Стац. — 3 + - -

Лог. — 5 + — —

АН 936 Стац. — 3 - — -

Лог. — b — — —

Знаки + или - обозначают присутствие или отсутствие факта соответственно; стехиометрия неустойчивого -к -обмена колеблется от 4 до 14.

(Martirosov and Trohounlan, 1983)

- 20 -

■IT;; системы. Иными словами, р1ро и Trie система у анаэробно взращенных е.coil , объединяясь в белок-белковый комплекс, функционируют вместе как Н+-К+-насос. Мы допускаем также, что р и "дефектная" тгк 'система вместе осуществляют ДЦКД-чув-ствктельный Н+-К+-обмен с неустойчивым отношением потоков катионов.

ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСПОРТА КАТИОНОВ У E.COLI Регуляция транспорта Н+ и К+ у е.coli с помощью тургорного давления. Грамофгцателъныэ е. coli поддерживают высокое тур-горное давление благодаря накоплению К+ в клетке (С.С.Дурга-рьян, С.М.Мартиросов, 1980; С.М.Мартиросов, 1981; Огзкоу,191;8; Epatoin and Schultz, 1965f 1968; Керез et al., 1976; Rhoads et al.,1976; Durgaryan and Martirosov,i978) через ОСНОВНУЮ Trk систему поглощения K+ (Rhoads ot al., 1976; Rhoads and Idstein, 1978; Halmer et al., 1982; Epatoin, 1986; Walderhaug ot al,,

1987 ). Установлено, что скорость поглощения К+ через ату систему и количество поглощаемых катионов возрастают с увеличе-гаем осмотического давления среды, или понижением тургорного давления ( Rhoads and Epstein, 1978; Rhoads et al., 1978; Meury and Kepos, 1981 ), что, возможно, приводят к перестройке тгк системы, увеличивая ее активность.

Вместе с тем, анаэробно выращенные е.coli поглощают К+ через Trir систему ь обмен на 2Н+, секретируемых из клеток через FjF причем такой обмен осмочувствителен. Высказано предположение о том, что поглощение К+ у е.coli регулируется осмотическим давлением среда посредством (С.М.Мартиросов, 1981; Martirosov 1979 ), вступающим, как свидетельствуют наши данные, во взаимодействие с тгк системой, образуя Н+-К+-насос. Допускается, что тгк система не имеет собственного регуляторного механизма, и предполагается, что периялазматический белок как клапан зажимает вход р0 при повышении тургорного давления, подавляя р1р0 и открывает его при понижении, включая f1p0 . В своей модели Зястайн (Epstein, 1986 ) также постулирует роль белка, пронизывающего периплазматическое пространство, в регуляции другой -Kdp системы с помощью тургорного давления.

С одной стороны, изученный характер Н+-К+-обмена у анаэробно выращенных мутантов е.coli о дефектами по калиевому транспорту, определенные кинетические параметры поглощения К* в первую фазу

10

ВРЕМЯ (мин)

(А.А.Трчуняя, 1984)

Рис. 3. Кинетика секреции Н+ из анаэробно выращенных з. soli К12(Л) в присутствии протонофоров.

1-<Зактерии отмыты в дистиллированной воде и перенесет в экспериментальный раствор с осмотичностыо 570 мосИ, 2-тот se эксперимент в присутствии КХФГ в концентрации 0,01 ill, 3-бактерип отмыты в растворе с осмотичностью 800 мосМ, созданной с помогши сахарозы, и перенесены в экспериментальный раствор с ЮМ'Г; глюкоза в концентрация 50 pH 7,8, активность К+ 1,92 iМ, ДЦКД введен (стрелш) з концентрации 0,5 Ш.

свидетельствуют о том, что осмочувствительное поглощение К+ в эту фазу, действительно, осуществляется через тгк систему.

С другой стороны, осмочувствительностью у анаэробно выращенных E.coii обладает и сам рхр0 . Если с помощью протонофоров резко уменьшить A, то К+ начнет выходить в среду по градиенту концентраций, и в таких условиях обмен 2К1" клетки на один К+ среды через Н+-К+-насос будет происходить непрерывно, пока в среде имеется глюкоза. Действительно, в присутствии КХФГ секреция Н+ из E.coii усиливается и значитально подавляется с помощью ДЦКД (рис. 3). Подобный эффект отсутствует у uno -мутанта с дефектом в р ( E.coii ан 718 ). При этйм ДЦКД приводит к усилению выхода К* из бактерий. Эти результаты' говорят о тем, что секреция ff*" в присутствии протонофоров осуществляется, в основном, в результате работы f1pq . При повышении тургорного давления в присутствии протонофоров секреция Н+ значительно меньше и ДЦКД не подавляет ее (рис. 3). Следовательно, в потоке Н+ из клеток четко выявляется ДЦКД-зависимая и осмочувстЕп-гальная компонента, связанная с р1р0 .

Далее, ДЦКД-зависимый и осмочувстнитвлькый обмен 2Н+ клетки га один К* среды с участием тгк системы отсутствует у uno -му-гантов E.coii с неработающим FjFq . Более того, у uno-мутантов з дефектом в а. субъединице Р0 исчезает ДЦКД-зависимость и осио-

чувствительность обмена 2Н+ на один К+ (табл. 4).

Наконец, поглощение К+ через тгк систему не обнаруживает осмочувствительности у аэробно выращенных е.coll, когда fxp0 работает в Н^-АТФсинтетазном режиме. Однако, если с помощью цианида подавить дыхательную цепь, то F1P0 начинает работать в обратном режиме и сразу появляется чувствительность ЗДКД-за-висимых секреции Н+ и поглощения К+ к тургорному давлению.

Совокупность данных говорит о том, что как обмен 2Н+ клетки на один К+ среды с участием к^ и тгк системы у анаэробно выращенных E.coli , так и сам f.jF0 в анаэробных условиях при Н+-АТФазном режиме работы обладают чувствительностью и ДЩ, и к тургорному давлению. И как ДЦКД-зависимость, так и осмочув-ствительность поглощения К+ через ick систему и обмена 2Н+ на один К+ связаны, возможно, не с irk , а с f^ .

Нам удалось показать, что ДЩ и тургорное давление конкурируют за подавление обмена 2КГ1" клетки на один К+ среды.

И если осмочувствительность обмена 2Н+ на один К1" связана с наличием периплазматического пространства, то она должна исчезнуть при разрушении последнего и, действительно, исчезает у сферопластов, полученных путем обработки клеток с помощью лизоцима.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что, во-первых, поглощение К* через %гк систему и обмен 2Н+ клетки на один К+ среда у анаэробно выращенных грам-отридательных е.coli регулируется, возможно, посредством f1p чувствительным к т^горному давлению, и во-вторых, регуляция' р1ро 0 шмощьи тургорного давления осуществляется через F0 и исчезает при разрушении перишгазматичеокого пространства. Мы допуокаем более сложную роль f^ в_жизнедеятельнооти бактерий: он является не только генератором AjU^ но и регулятором накопления К+ в клетке и тургорного давления. Осмочувотвитель-ностью должны, по-видимому, обладать ионные насосы, которые должны включаться в необходимый период адаптации бактерий на короткое время, что Moaei предотвратить потери энергии, особенно при низкоэффективных энергетичэоких процессах в клетке. , Транспорт Н* и КГ*" и поверхностный заряд в» coil . Большинство бактерий несут отрицательный поверхностный заряд (С.В .Тучин и др., 1979; Heiohof and Eobola« 1973) Kantcheva «t al., 1979,

1962; Popdomitrova et ai., 1985) , который, возможно, контролирует перенос катионов (Bernhards and Glase, 1982 )«

Анаэробно выращенные e.cqii обладают отрицательным поверхностным зарядом, который соответственно изменяется при двухфазном Н+-К+-обмене с быстрым и резким падением в первую фазу, чувствительным к ДЩ и тургорному давлению. Такое двухфазное изменение поверхностного заряда наблюдается только лишь при двухфазном Н+-К+-обмене и отсутствует у "безкалиевых" клеток, мутантов и сферопластов, у которых не наблюдается этот обмен.

Полученные результаты, а также данные о том, что при обмене 2Н+ клетки на одан К1" среды у бактерий генерируется дЦЛ чувствительный к ДЦКД и тургорному давлению, с одной стороны, и выведенное соотношение между электрокинетическим и мембранным потенциалами для замкнутых мембранных структур (В.В.Лемешко и др., 1981), с другой, указывают на взаимосвязь между изменением поверхностного заряда,дЦ^ и Н+-К+-обменом у е.coll . Совокупность данных позволяет заключить, что поверхность как ин-тактных бактерий, так и их сферопластов обладает отрицательным зарядом и изменение поверхностного заряда бактерий связано с Н+-К+-обменом через f1p0 и тгк систему.

ТРАНСПОРТ КАТИ СНОВ У РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Объединение Н+-АТФазного комплекса и конститутивной системы поглощения К+ в единый комплекс, функционирующий как Н+-К+~на-ооо, обмениващий 2Н+ клетки на один К"1" среды, отражает, возможно, общую закономерность, заключающуюся в объединении мембранных белков бактерий в жесткие суперкомплексы при низкоэффективных энергетических процессах в клетке. Сравнительное изучение транспорта Н+ и К+ у различных видов, бактерий представляет интерес и потому, что, как указывается в одном из последних обзоров Эпстайна с соавт. (waiderhaug et ai.» 1987), почти нет ' исследований транспорта К"1" В других Enterobacteriaoeaa , но "вполне вероятно, что системы транспорта K*E.coii подобны транспортным системам IT1" в других Enterobacterlaoeaa ТаКИХ как Salmonella И Shigella ".

Транспорт Н+ и К* у факультативно анаэробных и анаэробных бактерий. Анаэробно выращенные s»typhimuriun в среде с глюкозой и умеренным содержанием К1" секретируют ff1" и поглощают К* также в две фазы (рис. 4), в первую из которых происходит дщ-зави-

ВРЕМЯ (мин)

Рис. 4. Кинетика транспорта Н+ и К+ у анаэробно (сплошные кривые) и аэробно (пунктирные кривые) выращенных Э. •ЬурМтигЗ.Щп ЬТ 2.

Условия и обозначения те же, что и на рис. 2; однако ДЦКД (2) в концентрации I Ш; осмотический шок (3) создан (стрелка) введением сахарозы (300 мосМ).

(Тгс1юип1ап вЪ а!., 1987)

симый и осмочувствительный обмен 2Н4" клетки на один К+ среды и во вторую - ДЦКД-чувствительный Н+-К+-обмен с неустойчивым отношением потоков катионов. Аэробно выращенные s.typhimurium секретируют Н+ и поглощают К+ в одну фазу (рис. 4), однако обмена 2Н+ клетки на один К+ среда не осуществляют.

Кинетические параметры быстрого поглощения К+ в первую фазу у анаэробно выращенных s.typhimurium и поглощения К+ у аэробно выращенных близки к таковым тгк системы у E.coii (табл. 3) и свидетельствуют, возможно, о наличии у этих бактерий тгк-подобной систеглы.

Поглощение К+ через тгк -подобную систему как у аназробно выращенных s.typhimurium , так и у аэробно выращенных подавляется с помощью ДЦКД (рис. 4) и не наблюдается в присутствии арсената и протонофоров. При этом арсенат при отсутствии фосфата в среде полностью подавляет поглощение К+, а при наличии фосфата уменьшает скорость поглощения К+ и накопление этих катионов в клетке.

Различия в характере транспорта Н+ и К+ у анаэробно и аэробно выращенных s.typhimurium заключаются также в следующем:

- валиномицин уменьшает скорость поглощения К+ у анаэробно выращенных бактерий и не влияет на нее у аэробно выращенных;

- с уменьшением температуры ДЦКД-чувствительнне потоки Н+ и К+ у анаэробно выращенных бактерий уменьшаются пропорционально о одним и тем же и сохранением стехиометрии; ДЦКД-чувствительный поток Н+ у аэробно выращенных бактерий резко падает, однако поток К+ почти не изменяется.

Чувствительность Н+-К+-обмена к ДЦКД, устойчивость стехиометрии ДЦКД-чувствительных штоков катионов, равной 2Н+ клетки на один К+ среды,и характер Н+-К+-обмена у une -мутантов с нефункционирующей Н+-АТФазой (табл. 5) указывают на то, что такой обмен у анаэробно выращенных s.typhimurium осуществляется единым механизмом, образованным наряду с Тгк -подобной системой, по-видимому, ДЦКД-чувствительным рхро .

Совокупность результатов по транспорту Н+ и К+ у s.typhimurium вместе с данными о накоплении К+ в клетке и распределении этих катионов между клеткой и средой позволяет утверждать, что характер транспорта Н+ и К+ у этих бактерий, как и у E.coii , зависит от способа выращивания: анаэробно выращен-

Таблица 5. Сравнительный характер транспорта Н+ и К4" у дикого

типа и мутантов s.typhimurlua

Характер S.t-vnhimu irluw

LT 2 •IH 32 uao-мутаит ТН U

Поглощение К+ в две фазы в среде с глюкозой и умеренным содержанием Кг Перегиб на кривой секреции НМсм.рис. 4) Чувствительность транспорта катионов к ДЩ Чувствительность Н+-К+-об-мена в первую фазу поглощения К к осмотическому шоку Стехиометрия ДЩ^чувотви-тельных потоков Ег к 1Г" + + + 2,0±0,1 + + + + 2,0*0,1 + неустойчивая от 4 до 14

ные бактерии осуществляют двухфазный Н*-К+-обмен со стехиометрией ДЦКД-чувсгвительных потоков катионов в первую фазу, равной 2Н+ плетки на один К* среды; аэробно выращенные - Н+-К+-обмен с неустойчивым. отношением ДЩ-чувстштельных потоков катионов.

Анаэробно выращенные s.enteritiais штамм Исаченко в среде без источника энергии поглощают К* в одну фазу (рис. 5), кинетические параметры такого поглощения близки к таковым тгк системы у E.coii (табл. 3). Это поглощение К+ не подавляется с помощью ДЩ, не зависит от рй и осмотического шока, при этом не наблюдаетоя секреция НГ1" (рис. 5). При введении источника энергии (глюкозы) наблюдается вторичное поглощение К"1" (рис. 5) о близкими кинетичеокими параметрами (табл. 3), однако оно подавляется с помощью ДЩ и зависит от тургорного давления, при этом секретируютоя IT*" (рис. 5) и отношение ДЦКД-чувстнительных потоков катионов равно 2Н* клетки на один К+ среды. Совокупность этих и других данных свидетельствует о ТОМ, ЧТО У анаэробно выращенных g.anteritldla поглощение К+ наблюдаетоя как в отсутствии, так и в присутствии экзогенного источника энергии. Оно осуществляется через одну и ту же Тгк -подобную систему, характер работы которой различен: мы допускаем, чжо эта система функционирует как отдельно, так и в комплексе о f f , и в последнем случае имеет место ДЩ-чувстви-

ВРЕМЯ (мин)

Рис. 5. Кинетика секрещш Н* и поглощения К+ у анаэробно

выращенных з.епьвг1ы<11я штамм Исаченко.

1-бактерии отмыты в растворе ЭДГД в концентрации 10 мМ и перенесены в экспериментальный раствор с осмотичностью 430 мосМ, 2-оактерии отмыты в том же растворе, содержащем ДЦКД в концентрации I г,М, и пэресены в экспериментальный раствор с ДЦКД в той же концентрации; рЫ 7,2, глюкоза введена (стрелка) в концентрации 50 Ш.

(В.А.Тер-Никогое.ян и др., 1988).

- 28 -

тельный обмен 2Н+ на один К4".

Анаэробно выращенные P.mlrabllla И анаэробные L.3allvariua тайке обменивают 2Н+ клетки на один К+ среды с участием, по-видимому, ДЦКД-чувствительного F1P0 и ТгЕ -подобной системы (табл. 3).

Транспорт К* у аэробных бактерий. Аэробные M.mteua поглощают К"*" в одну фазу через тгк -подобную систему (табл. 3), такое поглощение К4 не изменяется с уменьшением температуры и подавляется с помощью протонофоров. Кажется, что наблюдаемое поглощение К4" у этих бактерий идет подф , что подтверждается в опытах с использованием валиномицина.

Обнаруженный наш обмен 2Н+ клетки на один К+ среда у анаэробно выращенных. E.coli, s.typhlmurlum, s.enterltldla, p.mlrabllla и анаэробных L.saiivarlua , а также результаты, свидетельствующие о подавлении такого обмена с помощью ДЦКД и об участии в нем j^k (или Мс -подобной) системы поглощения К+, шесте с данными об обмене 2Н+ клетки на один К4" среды у анаэробных s.faacaii» (С.М.Мартирооов, Л.С.Петросян, 1980; С.М.Мар-ТИросов И др., 1982; Martlrosov and Petrosian, 1981 ) и наличии у них -подобной системы (коЬауааМ, 1982 ), а также об обмене 2Н* клетки на один К4" среды с участием тгк -подобной системы у анаэробно выращенных р .vulgaris и анаэробных L.iao-tis (А.А.Трчунян и др., 1986) позволяют утверждать, что ДОКД-чувствительный обмен 2Н+ клетки на один К4" среды у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий осуществляется, скорее всего, с участием и тгк (или Тгк -подобной) системы, объединяющихся вместе в единый комплекс, функционирующий как Н+-К+-на-сос. Возможно, что такой обмен через Н+-К+-насос является общим свойством большинства анаэробных бактерий.

ПРИНЦИПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ МЕМБРАН ЕАКГЕШЙ

В настоящее время получены многочисленные данные, подтверждающие справедливость разделения транспортных систем мембран клетки на »"первичные" и "вторичные", между которыми осуществляется косвенное взаимодействие через дальнодействугаций посредник AjU^. всегда ли это так? Может ли оказаться так, что независимые мембранные системы вступают в непосредственное . прямое взаимодействие друг с другом без посредничества

Н+-К+-НАС0С У БАКТЕРИЙ

Воя совокупность наших результатов позволила допустить, что в мембранах анаэробно выращенных и анаэробных бактерий две независимые системы FjFq и Trk система имеют возможность внутри-мембранного взаимодействия и, объединяясь, образуют Н+-£+-на-соо, который обменивает 2Н4" клетки на один К+. среды (рис. 6>. тгк система, объединяясь с f-^ , потребляет энергию ATI и работает как К+-насос,_Вместв с тем, FjF0 , объединяясь с Мс, генерирует не только Д^^ч-, но и создает высоко^распределение К4- между клеткой.и средой. В аэробно выращенных и аэробных бактериях^^ система работает как отдельная система, используя д<|>в качестве источника энергии для создания распределения К+ между клеткой и средой (рис. 6).

Физическое обоснование объединения FiPq и Trie системы в единый механизм, функционирующий как Н+-К+-насос. Наиболее важным физическим обоснованием объединения p^fji тгк системы в единый механизм, функционирующий как Н+Ч{+-наоос, у анаэробно выраженных и анаэробных бактерий и раздельного функционирования этих систем у аэробно выращенных и аэробных является следующее:

- стехиометрия ДЦКД-чувствителъного обмена 2Н+ клетки на один К4" среды через fxf0 и тгк систему крайне устойчива у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий, что прямо указывает на то, 'что этот устойчивый обмен должен осуществляться единым механизмом;

- валиномицин оказывает противоположное действие на поглощение К4" через систему у анаэробно выращенных и анаэробных и аэробно выращенных и аэробных бактерий, уменьшая и, наоборот, усиливая (или не изменяя) поглощение К4" соответственно;

- 0д_0 для потока Н+ через рдр0 и потока К+ через "систему

у анаэробно выращенных бактерий один и тот же и близок 2-3, перенос обоих катионов идет, возможно, через один и тот же механизм и недаффузионным путем; этот же коэффициент для потоков обеих катионов у аэробно выращенных бактерий различен и для потока К4- близок I, возможно, что тгк система работает как диффузионный канал.

Hain сделан расчет энергии, необходимой для работы Н+-К+-на-ооса. Приходится постулировать, что эффективность насоса близка & 80-80 % и он чрезвычайно экономно расходует энергию на гене-рациюдр^+ и создание высокого распределения К+ между клеткой

А.

шкода

клеточная стенка

среда периплазма^-——у* клетка тическое мембрана

Б. пространство

К+ч "

дыхательная :епь

Рис. 6. Предполагаемые модели взаимодействия рхр0 и тгк сиртемы в мембранах анаэробно (А) и аэробно (Б) выращенных бактерий. БК-б ело к-клапан 1^гсЬоип1ш1 вt а1., 1987)

и срэдой.

Реверсия Н+-К+-наоооа и синтез АТФ. ¡гМ^-насос должен быть обратимым и в определенных условиях работать в режиме реверсии. Тогда должны наблюдаться следующие явления:

- реверсия насоса должна наблюдаться в отсутствии ДЦКД и запускаться при положительном осмотическом-шоке (понижении тур-горного давления);

- стехиометрия ДЦКД-чувствительного Н+-К+-обмена должна быть "обратной";

- реверсия должна иметь место только при определенных значениях дф,д¡Я и градиента концентраций К1" и возможна, если величина др^/ р в сумме сД|и^+/Р будет близка фосфатному потенциалу клетки;

- при реверсии должен наблюдаться синтез АТФ.

Эксперимент, представленный на рис. 7, был разработан в соответствии с этими оценками. Нагл удалось реверсировать Н+"-К+-насоо, обменивающий 2Н+ на один К+, и синтезировать АТФ с его помощью, при этом стехиометрия полного обратного цикла насоса равна 2Н+ : К+ : АТФ.

Н"Мс+-насос и секреция Н*. Посколько Н+-^С+-насос, се1фетиругащий Н+ из клетки, включает в себе, скорее всего, р^, то было бы естественным, чтобы ДЦКД-чувствительная секреция Н+ через р1ро проявляла зависимость от содержания К+ в среде, и такая зависимость проявлялась только при структурной целостности рз_Р0 и Тгк системы.

Секреция Н+ из анаэробно выращенных е.соИ в безкалиевой среде с глюкозой идет с постоянной скоростью и значительно -почти на 60 % возрастает при введении 5 Ш К+ в среду, при этом такое возрастание наблюдается лишь при положительном осмотическом шоке, подавляется с помощью ДЦКД, исчезает у мутантов с неработающей Н+-АТФазой (е. оо11 ли 718 ) или дефектом по тгк системе (в.ооИ.тк 509 ) и не наблюдается у аэробно выращенных бактерий.

Н^-К^-насос и АТФазная активность. Б безградиентных условиях при работе Н+-К+-насоса у анаэробно выращенных бактерий должна обнаружиться ^-зависимая ДЦКД-чувствительная АТФазная активность, которая зависит от структурной целостности р^ и» системы.

ВЕЗИ (мин)

Рис, 7. Реверсия Н^-К^-насоса и синтез АТФ у анаэробно выращенных B.coli К 12ГМ.

Бактерии отмыты в дистиллированной воде и перенесены в экспериментальный раствор с осмотичностью 570 мосМ, глюкоза (Ех)4в концентрации 5 «Л!, рН 6,75, осмотичеокий шок создан (стрелки) введением сахарозы (300 моей); пунктир - тот же эксперимент без вторичного осмотического шока; отклонения даны как стандартные, количество экспериментов равно 6.

По нашим оценкам, на 15-ой мин распределение К+ между клеткой и средой достигало 500-1000, д Ш около 2 и д^ около -100 мВ.

(Martirosov and Trohounian, 1982)

- 33 -

Протопласты с нарушенной с помощью толуола проницаемостью и изолированные мембраны анаэробно выращенных E.coli демонстрируют возрастание ДЦКД-чувствительной АТФазной активности при увеличении содержания К+ в среде (рис. 8). Зависимость ДДКДг чувствительной АТФазной активности от содержания К+ в среде отсутствует у протопластов и изолированных мембран аэробно выращенных бактерий (рис. 8). К^-завясимая ДЦКД-чувствитальная АТФазная активность обнаруживается и у протопластов анаэробных L. 3aiivarius , при этом возрастание ДЦКД-чувствительной АТФазной активности с увеличением содержания К4" до 5-10 Ш сущест-венее и составляет 152-166 %.

Если.такая АТФазная активность, действительно, связана с Н+-К^-насооом, образованным рхр0и аде системой, то она должна наблюдаться только при структурной целостности этих систем; хотя нельзя исключить альтернативного пути влияния К4" на АТФаз-ную активность у бактерий ( Fein3tein,l977; smigan at al.,1986).

ДЩ-чувствительная АТФазная активность возрастает о увеличением содержания К+ в среде до 5-10 Ш у мутанта с дефектом по системе (e.qoII тк iooi ) и предшественника гто -мутантов ( е.соИ. ah 3L|Ь ) на 33-61 и 44-69 % соответственно и резко подавляется и не проявляет зависимости у мутанта с дефектом по тгк системе (e.coií тк 509 ) и uno -мутанта с дефектом в р^ (E.coli ah 718 ). ^-зависимая АТФазная активность, нечувствительная к ДЦКД, проявляется у мутанта о дефектом по мс системе (е.coll тк 509 ) после инкубации в безкалиевой среде а у uno -мутанта с дефектом в ¿ оубьеданицэ ?0 (в. coll ah 719 ) • Исчезновение чувствительности К+-зависимой АТФазной активности к ДЦКД у мутанта о дефектом в,Р0 , а также резкое уменьшение ДЦКД-чувствительной АТФазной активности у мутанта с дефектом в г^ указывают на то, что наблюдаемая АТФазная активность, чувствительная к ДЦКД, связана именно с рхро .

Полученные результаты объяснима лишь о учетом того, что р^р и №к система объединятся вместе bi единый комплекс, функционирующий как ff^-íC^-Hacoc, врутри которого происходят прямая передача энергии.

АТФазная активнооть р-,рп и 'Тгк система. Обнаруаенио К^нзага сяких и ДЦКД-чувотБительных оекреции Н* у антакгных кгеток я АТФазной активности у протопластов и изолированных кзэбран анаэ-

0,4

,0.2

а

о

2,0

1,0

- 34 -

АНАЭР0Ш0 ВЫРАЩЕННЫЕ АЭРОШО ВЫРАЩЕННЫЕ

ПР0Т0ШЕАС1Ы

п п п п п

е 0,0 1,0 4,6 9,0 77,0 0,0^04^9,0 77,0

- " " ИЗОЛИРОВАННЫЕ п АКШВНОЛЪ К (Ш)

МЕМБРАНЫ

В 0,8 0,4

Г

§ "0,0 4,6 §3,0

1+

п п п

г?

1 о

0,0 4,6

77,0

1

И_Q.

п

0,0 4,6

77,0 0,0 4,6

77,0

Рис. 8. ШЩ-чувствительная АТФазная активность протопластов, изолированных мембран и в. coil при различной активности К1" в среде.

■ - в %, АТФазная активность в безкапиевой среде - 100 %.

робно выращенных и- анаэробных бактерий, связанных о Тгь

системой, однозначно указало на объединение этих транспортных систем в суперкомплекс. Тогда, при жесткой связи с- ТА системой АТФазная активнооть выделенного из анаэробно выращенных бактерий могла бы также обладать зависимостью от содержания К4". ДЦКД-чувствительная АТФазная активность г1?0 , выделенного из анаэробно выращенных в.coli , резко возрастает-о увеличением активности К* до 5-77 М (рис. 8). Такая зависимоот£ отсутствует у , выделенного из аэробно выращенных бактерий. Возможно, что J**, выделенный из анаэробно выращенных бактерий, включает в себя К+-связывающие и транспортирующие белки, работа которых зависит от содержания К+. Результаты подтверждают предположение' об объединении FjJ с Trie системой в единый суперкомплеко и, на наш взгляд, не оставляют места альтернативным предположениям. Более того, при электрофоретическом разделении в ПААГ с додецилсульфатом натрия , выделенного только из анаэробно выращенных в. coli (проведенном в Институте биологической физики АН СССР) обнаруживаются дополнительные белки.

Объединение с тгк системой в единый суперкомплекс, функционирующий как ^-^-насос, имеет термодинамическую и био-логичеокую целесообразность, оно позволяет бактериям сэкономить значительное количество АТФ для других нужд клетки.

Н+-К+-АНШП0РТ 7 БАКТЕШЙ

Наши исследования обнаружили, что во вторую фазу поглощения К1" у анаэробно выращенных грамотрицательных бактерий осуществ-.. ляется ДЦКД-чувствительный обмен Н+ клетки "на К1" среда с неустойчивым отношением потоков катионов, который представляет собой Н^ЧС^-антипорт. При этом нужны и То , и "дефектная" Trie система. В мембранах анаэробно выращенных бактерий ?0 , лишенный ?! , может, как мы допускаем, объединиться о системой, образовав ионообменный белок-белковый комплекс, функционирующий как Н+ЧС^-антипорт.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Транспортные системы клеточной мембраны, в большинстве своем представляющие белки, не имеют единого способа их структурной организации. В жидкомозаичной модели мембраны ( aLager a»d ю,-coIbob, 1972) допускается, что белка и липида не представляют

фиксированной структуры. Однако, в сопрягающих мембранах, обогащенных белками, в первую очередь, в мембране бактерий должна иметь место определенная взаимная организация белков, только в этом случае они могут достаточно эффективно выполнять свои функции.

В настоящее время имеется множество данных о латеральной неоднородности мембраны, наличии тесных белок-белковых связей и образовании целых белковых комплексов (А.С.Кащ>ельянц, 1982; А.Е.Любарев, Б .И .Курганов, 1986; Holmes et al.,1981).; Kaprellants 1965 ), укладывающиеся в рамки жидкомозаичной модели. Известны примеры того, что транспортные системы мембраны представляют собой олигомерные формы белков. Ассоциация гомологичных мембранных белков отражает, по-видимому, один аопект проблемы внутримембранного взаимодействия систем.

Предпринятое наш изучение транспорта катионов и принципов взаимодействия транспортных сиотем у бактерий позволяет прийти к весьма интересному, на наш взгляд, заключению о том, что два и более различных мембранных белка могут объединиться друг о другом и образовать гетерологический белок-белковый суперкомплекс. Такой суперкомплекс образуют р1р0 . и система у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий, когда эти транспортные системы вступают в прямое внутримембранное взаимодействие друг с другом. Он формируется для совместного экономного использования конвертируемой энергии при низкоэффективных энергетических процессах в клетке.

Внутримембранное взаимодействие транспортных белков наблюдается не только у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий. В работах Бурда с соавт. (И.Я.Калачев и др., 1980; 1981; А.Г.Вопо-шин и др., 1983; ГЛ.Бурд, С.М.Мартиросов, 1985; Bourd and Маг-tirosov, 1983 ) и др.авторов допускается внутримембранное взаимодействие фермента Ед ФТС системы как с лактозной пермеазой, так и с мембранной аЬенилатциклазой у бактерий. О внутримембран-ном взаимодействии дыхательной цепи с лактозной пермеазой у бактерий указывается в работах Конингса с соавт. (mferinic et ai., 1983» 1984, 1985i Konings, 19Ö3i Koninge et al., 198^ ),

Внутримембранное взаимодействие дыхательной цепи с Р^о У бактерий предполагается в ряде работ (Keil, 1979; Keil et ai,, 19811 Krulwich,1986 ).

- 37 -

Наши результаты и литературные сведения позволяют ставить проблему прямого внутримембранного взаимодействия систем с образованием белок-белковых суперкомплексов.

Взаимодействие между транспортными системами мембраны клетки осуществляется и прямо без посредников, и косвенно, скажем, через энергетический посредникд|Пд+. В каждом случае принцип взаимодействия транспортных систем мембраны друг с другом определяется, по-видимому, функциональным состоянием клетки.

БЫВОД1

1. Анаэробно выращенные факультативно анаэробные е.coll. _s* typhlmori-um и анаэробные l. saiivariua интенсивно накапливают К1" против градиента концентраций этих катионов и создают их высокое распределение мажду клеткой и средой; соответствующий калиевый равновесный потенциал значительно превышает др^+/р. Расцределение К+ между клеткой и средой у аэробно выращенных & colt и з.typhinuritcn меньше и соответствующий хорошо совпадает сдЦЛ При этом анаэробно выращенные и анаэробные бактерии генерируют меньший дф, чем аэробно выращенные и аэробные.

2. Характер транспорта Н+ и К+ у E.ooli зависит от способа выращивания и типа клеточного метаболизма. Анаэробно выращенные в.coil обменивают Н* клетки на К1" среда в две фазы, в первую из которых с участием системы осуществляется быстрый устойчивый ДЦКД-чувстштельный обмен 2Н+ клетки на один К1" среды, а во вторую с участием "дефектной" Хек. системы - медленный Н+-К+-обмен с неустойчивым отношением ДЦКД-чувствительных потоков катионов. Аэрфбно выращенные и аэробно выращенные и обработанные с помощью шанида E.ooli осуществляют Н+-К+-обмен с Tr-k системы с неустойчивым отношением потоков катионов.

Н+-К+-обмен у анаэробно и аэробно выращенных E.ooli отличается также следующим:

- ДЦКД подавляет Н+-К+-обмен у анаэробно выращенных бактерий и не влияет на него у аэробно выращенных;

- осмотический шок включает механизм обмена 2Н+ клетки на один К+ среды у анаэробно выращенных бактерий и не оказывает воздействия на Н+-К+-обмен у аэробно выращенных;

- валиномицин приводит к резкому уменьшению скорости поглощения К+ в первую фазу у анаэробно выращенных бактерий и не вли-

- 38 -

яет (или усиливает) на поглощение К1" у аэробно выращенных; - с понижением температуры ДЦКД-чувствительные потоки Н+' и К+ в первую фазу у анаэробно выращенных бактерий уменьшаются строго пропорционально, а у аэробно выращенных - поток Н+ резко падает, однако поток К+ почти не изменяется.

3. Механизм обмена 2Н+ клетки на один К+ среды у jB.ooii наряду с тук системой включает в себе рхр0 .

4. Обмен ZH+ клетки на один К+ среды через p1fq и 3£к систему регулируется тургорным давлением клетки и такая регуляция осуществляется через перишазматическое пространство. Этот же обмен контролируется также отрицательным зарядом поверхности бактерий.

5.-Анаэробно выращенные s.tTphimurium, s.enteritldla. m^rabiiia и анаэробные L.saiivarius также осуществляют

ДЦКД-чувствительный обмен 2Н+ клетки на один К+ среды с участием мс -подобной системы.и, скорее всего, PjFo . Аэробно выращенные 3.typhimorium и аэробные м.1^ецэдоглошают К4" через Тгк-подобную систему, однако обмена 2Н+ клетки на один К+ среды не осуществляют.

6. Обмен 2Н+ клетки на один К+ среды может реверсировать, и тогда 2Н+ среды обмениваются на один К+ клетки и с помощью fifq с использованием градиента концентраций К4" синтезируется одна молекула АТФ.

V. ДЦКД-чувствительные секрещя Н+ у интактных клеток и АТФ-азная активность у протопластов и изолированных мембран проявляют зависимость от содержания К+ в среде, существенно возрастая при увеличении активности этих катионов. Такая зависимость наблюдается только у анаэробно выращенных бактерий и только лишь щи структурной целостности рхро и системы.

ДЦКД-чувствитеяьная АТФазная активнооть FjF0 , выделенного из анаэробно выращенных бактерий, строго зависит от содержания IT1", и такая зависимость отсутствует в препаратах , вы-

деленного из аэробно выращенных бактерий.

8. Выдвигается и обосновывается принцип прямого внутримем-бранного взаимодействия генетически независимых транспортных систем бактерий и Trie системы с образойанием жесткого бе~ локг-белкового комплекса для совместного экономного иопользова-

ния конвертируемой энергии при низкоэффективных энергетических процессах в клетке. При этом суперкомплекс рхр0 -тгк функш-онирует как Н+-К+-насос, обменивающий 2Н+ клетки на одан К* среда и создающий высокое распределение К+ между клеткой и средой.

У аэробно выращенных и аэробных бактерий -эти транспортные систели работает раздельно и косвенно взаимодействуют друг с другом через посредничество

Выражаю благодарность доктору биологических наук, профессору Сергею Мушеговичу Мартиросову за помощь, советы, замечания, консультирование и сотрудничество в работе.

- 40 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕШЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мартиросов С.М., Трчунян A.A., Варданян А.Г. Системы обмена Н+ на К+ у E.coii // Биофизика.- 1982,- Т. 27.- С. 48-61.

2. Мартиросов С.М., Паносян Г.А., Трчунян A.A. Модель протон-но-калиевых транспортных систем // Биофизика,- 1982.- Т. 27.-С. 249-252.

3. Гонян С.А., Карагулян Э.А., Мартиросов С.М., Трчунян A.A. Электрофоретическая подвижность клеток е. coli при ионном обмене // I Всесоюзн.биофизич.съезд. Тезисы докл.стенд.сообщи.~ М., 1982.- Т. С. 205.

4. Карагулян Э.А., Трчунян A.A., Ванян П.А. и др. Регуляция транспорта ионов у бактерий // I Всесоюзн.биофизич.съезд. Тезисы докл.стенд.сс збщн,- М., 1982,- Т. I,- С. 206.

5. Мартиросов С.М., Трчунян A.A. Молекулярная конструкция ионообменных систем у бактерий // I Всесоюзн.биофизич.съезд. Тезисы докп.сгенд.сообщн,- М., 1982.- Т. I,- С. 218.

6. Трчунян A.A., Мартиросов С.М, Синтез АТФ с помощью Н+-К+~ насоса у бактерий // I Всесоюзн.биофизич.съезд. Тезисы докл. стенд.сообщи,- М., 1982,- Т. I,- С. 209.

7. Карагулян Э.А., Трчунян A.A., Ванян П.А. и др. Поглощение ионов калия у бактерий и осмотическое давление среды // Ш Респ. научн.сессия по вопросам биофизики. Тезисы докл.и стенд.сообщн, Ереван, 1982,- С. 47.

8. Трчунян A.A. дМ^+-заьисимый протонно-калиевый обмен у бактерий // Ш Респ.научн.сессия по вопросам биофизики. Тезисы докл.и стенд.сообщн,- Ереван, 1982.- С. 58.

9. Martirosov S.M., Erchounian A.A. An electrochemical study о. energy-dependent potassium accumulation in E.coii. 9. Reversal the mechanism exchanging 2H+ for K+ with the soupled synthasis oí ATP // Bioelectrochem.Bioenerg.- 1982,- V. 9.- P. 459467.

10. Мартиросов С.М., Трчунян A.A. Обратимость протонно-калие-вого насоса и синтез АТФ„у е. coli // Биофизика.- 1983,- Т. 28.- С. 83-86.

. II. Трчунян A.A. Выход ионов калия из бактерий и факторы, оп-

- 41 -

ределявдие зтот цроцесо // Биолог.я.Армеюга.- 1983.- Т. 36.605-608.

12. Hartirosov 5.И,, Trchounian A.A. An electrochemical study of energy-dependent potassium accumulation in E.coli. 10, Operation of transport systems exchanging H+ for K+ in unc-mutanta // Bioelectrochem.Bioenerg,- 1933,- V. 11.- P. 29-36.

13. Trchounian A.A. Proton-potassium antipcrt in bacteria. Properties and proposed construction // XII Int.3yu5s.0n bioelectro-chem. Abstracts.- Stuttgart, 1983.- p. 69.

14. Trchounian A.A., Martirosov S.M. Transport of H+ and K+ in mutants of B.coli with defects in ATPase'1 complex // FEMS Int.symp. "Environmental regulation of microbial metabolism". Abstracts.- Pushchino, 1983.- p. 212-213.

15. Durgaryan S.S., Oganessian M.I., Ter-Hikogos3ian V.A., Trchounian A.A., Kartlrosov S.M. The mode of potassium accumulation in aerobic bacteria // III Sov.-Swiss syrap. "Biological membranes. Structure and function". Abstracts.- Tashkent, 1983.-

P. 177.

16. Мартиросов C.M., Трчунян A.A. Роль отдельных субъединиц АТФазы f1fq в водородно-калиевом обмене // Биофизика,- 1984.Т. 29.- С. 255-258.

17. Карагулян Э.А., Гонян O.A., Трчунян A.A. Обмен Н+ на К+ и изменение электростатического заряда поверхности у в.coli // Биофизика.- 1984.- Т. 29.- С. 319-320.

18. Трчунян A.A. Осмочувствительный трансмембранный Н+-поток у бактерий // Биолог.ж.Армении.- 1984.- Т. 37.- С. 77-79.

19. Трчунян A.A., Карагулян Э.А., Ванян П.А. Осмотический контроль функции Н+-АТФазного комплекса у е.coli // Биолог.ж.Армении.- 1984.- Т. 37.- С. 836-844.

20. Trchounian A.A. Proton-potassium antiport In bacteria. Properties and proposed construction // Bioelectrochem.Bioenerg.-1981j..- V. 13.- P. 231-232.

21. Гонян O.A., Карагулян Э.А., Трчунян A.A. Связь поверхностного заряда грамотрицательных бактерий.с ионным обменом // Био-лог.ж.Армении.- 1985.- Т. 38.- С. 250-256.

22. Мартиросов С.М., Трчунян A.A. Взаимодействие систем транспорта Н+ и -К4" у анаэробно и аэробно выращенных е. coll // Биофизика.- 1986.- Т. 31.- С. 464-468.

23. Мартиросов С.М., Трчунян A.A. Поглощение К+ у е.coil , выращенных в аэробных условиях // Биофизика.- 1986,- Т. 31.- С. 626-630.

24. Тер-йикогосян В.А., Трчунян A.A. Влияние валиномицина на поглощение К+ у M«lysodeiktlcus // Биофизика.- 1986.- Т. 31.-С. 526-527.

25. Тер-Никогосян В.А., Трчунян A.A., Мартиросов С.М. Характер поглощения К+ у анаэробно выращенных s.typhinurium // Биофизика.- 1986,- Т. 31.- С. 825-828.

26. Трчунян A.A., Дургарьян С.С., Огандаанян Е.С. и др. Исследование способности анаэробно выращенных бактерий обменивать 2Н+ клетки на одан К+ среды и поддерживать высокое распределение К+ между клеткой и средой // Биол.науки.- 1986.- № 12.-

С. 82-88.

27. Трчунян A.A., Тер-Никогосян B.AI у различных бактерий // Биолог.ж.Армении.- 1986,- Т. 39.- С. 221-227.

28. Трчунян A.A., Огандаанян Е.С., Мартиросов С.М. Прямая передача энергии при структурном объединении Н^АТФазы и К+-ио-нофора у бактерий // Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена. Тезисы докл.Всесоюзн.симп.- Пущино, 1986.-С. 41-42.

29. Трчунян A.A., Огандаанян Е.С., Тер-Никогосян В.А. и др. Механизмы транспорта К+ и их роль в жизнедеятельности бактерий // П Респ.конф.,. поев.цробл.физ.-хим.биол. Тезисы докл.- Ереван, 1986,-С. 89.

30. Martlroaov S.M«, Trchounian A.A. An electrochemical study of energy-dependent potasiäium accumulation in e.ooli. 11. The Trie system in anaerobioally and aerobically grown cells // Bio-eleotrochem.Bioenerg,- 1906,- V. 15.- P. 1Д7-1|2б.

31. Огандаанян E.C., Трчунян A.A., Мартиросов C.M. Активный транспорт ионов калия через мембраны молочнокислых бактерий и Биофизика.- 1987.- Т. 32.- С. 292-294.

- 43 -

32. Трчунян А.А., Тер-Никогосян В.А., Мартиросов С.М. К природе Н+-К+-обмена у анаэробно и аэробно выращенных s.typhimuri-шп // Биофизика.- 1987.- Т. 32,- С. 609-613.

33. Огандаанян Е.С., Трчунян А.А. Внутриклеточный рН и перераспределение компонентов у молочнокислых бактерий // Биолог.к.Армении.- 1987.- Т. 40.- С. 236-237.

34. Трчунян А.А. Роль ионов калия в жизнедеятельности бактерий // Биолог .ж.Арлении.- 1987,- Т. 40.- С. 267-275.

35. Варданян А.Г., Трчунян А.А. Мембранный потенциал и транспорт ионов у бактерий // Совр.пробл.биотехнол.микроорганизм. Тезисы докл.конф.- Рига, 1987.- С. 103.

36. Трчунян А.А. К проблеме внутримембранного взаимодействия транспортных белков у бактерий // Совр.пробл.биотэхнол.микроорганизм. Тезисы докл.конф.- Рига, 1987.-С. 173.

37. Trchounian А.А., Ter-Nikogossian V.A., Martirosov S.M. Energy-dependent K+ uptake and H+-K+-exchange in Salmonella ty-phimuriura // Bioelectrochem.Bioenerg.- 1987,- V, 17»- P. 183192.

38. Trchounian A.A., Ogandjanian E.S., Martiroaov S.M. H+-K+-exohange and in Lactobacillus заЦуаг!из // Bioelectro-chem.Bioenerg.- 1987,- V. 17.- P. 503-508.

39. Trchounian A.A. Direct intramembrane and indirect interactions between transport systems (H+-ATPase and K+-lonqphore)

in anaerobically andaerobically grown bacteria // 9th Int. symp.on bioelectrochem.bioenerg. Abstracts.- Szeged» 1987,- p. 30.

40. Trchounian A .A. H -ATPasa complex P1PQof gramnegative bacteria in anaerobic conditions is regulated by turgor pressure. Electrochemical evidences // 9th Int.symp.on bioelectrocheia.bi-Denerg. Ab3tract3.- Szeged, 1987.- P. 63.

41. Тер-Никогосян B.A. ,чТрчунян А.А.', Мартиросов C.M. Особен-юоти поглощения К+ у s.eñtektiaia // Биофизика.- 1988.- Т. З.г- С. 310-313.

42. Hirtiroaov 3.11., Ogandjanian Е.З., Trchounian А.А. An

SLeotrochemical study of energy-dependent potassium accumulation in E.ooli« 12. The K+-dependent АТРазе activity (Arguments to the structural association of H+-ATFase with K+-ionophore) // Bioelectroohem.Bioenerg.- 1908.- V. 19.- 353-35?.

43. Trchounian A.a. Bioelectrochemical approach in grounds of the principle of intramembranal interaction of transport systems in-bacteria // Xllth Jena symp. on Biophys.Chem. "Trends in bio-eleotrochemistry of biopolymers and membranes". Abstracts.- Wei-ишр, 1988,- P. 58.

44. Trchounian A .A., Vardanian A.O. The membrane potential value and the cell metabolism type in baoteria // Xllth Jena, symp, on Biophys.Cham, "Trends in bioelectrochmiatry of biopolymers and membranes". Abstracts.- Weimar, 1988.- P. 62.

45. Трчунян A.A. Экономия АТФ при структурном объединении Н+-АТФазы и К^-ионофора в Н+-К+-насос.// Биофизика.- 1989.- Т. 34.-С. 525-526.

46. Трчунян А.А., Огаядаанян Е.С. н, н«-дщиклогексилкарбодаи-иид-чувствительная К+-зависимая секреция IT1" из анаэробно выращенных в. о oil // Биофизика,- 1989.- Т. 34.- С. 322-323.

47. Трчунян А.А., Оганджанян Е.С., Маотиросов С.М. Изучение н,н •-дициклогексилкарбодиимид-чувствительной К^-зависимой АТФ-азной активности у Escherichia coli // Биол.науки.-1989,- № 5.- С. 90-95.

48. Трчунян А.А., Огаядаанян Е.С. Принципы взаимодействия систем транспорта Н* и К1" и тип клеточного метаболизма у бактерий // Всесоюзн.конф."Регуляция микробного метаболизма". Тезисы докл.- Пущино, 1989,- С. ПО.

ВФ 04075

Заказ 1591

Тираж 100

Филиал № 1 типографии цветной печати Государственного Комитета Армянской ССР по делам издательств, полиграфии я книжной торговли, Ереван, Калинина, 56.