Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АТФазная активность в мембранах UNC и TRK мутантов анаэробно выращенных Escherichia Coli

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АТФазная активность в мембранах UNC и TRK мутантов анаэробно выращенных Escherichia Coli"

РГб од г \ НЕОН 1993

ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВАСИЛЯН АНАИТ ВЕЛЛЕРОВНА

АТФазная АКТИВНОСТЬ В МЕМБРАНАХ' икс И ТЕК МУТАНТОВ АНАЭРОБНО ВЫРАЩЕННЫХ езснен1сша соы

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1993

Работа выполнена на биологическом факультете Ереванского государственного университета.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор А.А.ТРЧУБЯН

Официальные оппоненты: член-корреспондент Национальной

Академии наук Республики Армения, доктор биологических наук, профессор С.С.ОГАНЕСЯН

доктор медицинских наук И.Р.САЛКЯН

Ведущее учреждение - Институт микробиологии Национальной

Академии наук Республики Армения

Защита диссертации состоится "о&З" ЬсЮМлЯ* 1993г. в ас на заседании специализированного совета К 055.01.08 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук по специальностям "биохимия" и "биофизика" при Ереванском государственном университете по адресу: 375049 г.Ереван, ул. Алека Манукяна, I (Ереванский государственный университет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке университета.

Автореферат разослан iM&iXs 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук старший научный сотрудник

--- ' Л.Г.АНАНЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В регуляции функций клетки огромная роль принадлежит мембранным ферментным системам транспорта ионов и трансформации энергии, взаимодействие которых друг с другом и с другими механизмами приобретает важное значение.

Полувековая история изучения таких систем, содержащих АТФ-азы, показала, что именно они, энергетически обеспечивая активный транспорт веществ, создают и поддерживают их неравномерное распределение между клеткой и средой и служат важнейшим регуля-торным механизмом клетки. f^f -АТФазы, являясь основным компонентом мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов, работают, согласно хемиосмотической теории энергетического сопряжения (Mitchell, 1961, 1966, 1968 ), как вторичные протонные 'системы и трансформируют энергию трансмембранного протонного градиента генерируемого первичными протонными системами, в энергию фосфатной связи и синтезируют АТФ. Эта же АТФаза у анаэробных или анаэробно выращенных бактерий, функционируя как первичный протонный насос, трансформирует энергию гидролиза АТФ в энергию Д^хН, используемую вторичными системами для осуществления своих функций. В обоих случаях, функционируя как вторичная или первичная транспортная система, Р т -АТФаза взаимодействует с другими - первичным или вторичными системами соответственно косвенно через энергетический посредник -ди-Н.

Вместе с тем, эта яе АТФаза у бактерий, согласно результатам, полученным Грчуняном с соавт. (С.М.Мартиросов, А.А.Грчу-нян, 1981,1384,1386; А.А.Трчунян, 1384,1989,1990; А.А.Трчунян И др., 1384,1986,1587,1989,1991; Martirosov and Trchounian, IS8I, 1982, I983, 1986; Trchounian et al.,1987, 1992; Martirosov et al.,1988; Trchounian and Ogandjanian,I9&9), И высказанной на их основе гипотезе (С.М.Мартиросов и др.,. 1982; Bourd and Martirosov, 1983; Trchounian et al.,I987;Trchounian, 1992 ), работая как первичный протонный насос, непосредственно взаимодействует со вторичной - калиевой транспортной системой без энергетического посредничества ДрН и объединяется в единый механизм, функционирующий как ff^-I^-Hacoc. Среди пактов, полученных в пользу гипотезы, наиболее важными представляются:

I) выведение H* через f у -АТФазу в обмен на поглощение К* через Тхк (или ей подобную)систему осуществляется с устойчивой стехиометрией для n,n< -дициклогексилкарбодиимцд(ДЦКД ^чувствительных потоков катионов, равной 2Н* на один 1С1"; 2) 2Н+/КГЬ—

обмен наблюдается только при интактных как f^f -АТФазе, так и

1 о

Ттк системе: мутации в генах, кодирующих эти механизмы, обязательно отражаются на протонно-калиевом обмене; 3) 2Н+/К+-обмен при определенных: значениях протоно-движущей силы, в сумме (0,5 В) близких "фосфатному потенциалу клетки", может реверсировать с синтезом молекулы АГФ; 4) ДДКД-чувствительная АТФазная активность -в протопластах бактерий, существенно возрастает при увеличении концентрации К* и этот феномен исчезает при uncA и trkA

мутациях, ведущих к остановке f f -АТФазы и trk системы соот-

i о

ветственяо. К -зависимая ДЦКД-чувствительная АТФазная активность обнаруживается также в изолированных мембранах и препаратах f.f -АТФазы.

1 о

Непосредственное взаимодействие внутри мембраны и объединение f f -АТФазы с irk системой в единый механизм с образованием мембранного суперкомплекса представляется понятным. Объединение этих систем при таких низкоэЗфективных энергетических процессах в клетке, как гликолиз, приводит, по оценке Трчуня-на (1989), к экономии до 50-52 % АТФ внутри клетки и уменьшению диссипации энергии. F^F -АТФаза, объединяясь с Trk системой, приобретает способность не только генерировать Д^ыН, но и создавать высокий К+ градиент между клеткой и средой. Эта же АТФаза кокет синтезировать АТФ, используя наравне сДрьН и К4" градиент. Trk система, объединяясь с f^f -АТФазой, работает как ЛФ-зависимая система, способная создать высокий К"1" градиент. Высказано предположение о том, что взаимодействие мевду. этими двумя механизмами мембраны может осуществляться через ди-тиол-дисульфидные связи с переходом 2sh—»-s-s + Eg + 35 ндк, когда наблщцаётся выделение молекулярного водорода (вакгатуап Martirosov, 1989 ). При этом необходимо участие третьего компонента - например, формиат ьодород лиазы,- поставляющего восстановительные эквиваленты (Н++ е~) для объединенного механизма.

Однако, механизм и регуляция такого прямого взаимодействия между ? F -АТФазой и калиевым транспортом остаются непонятны-

ми. Не обнаруживается связи мехду une -опероном е.сои , кодирующим f ï -АТФазу, и trk генами, определяющими Формирование Тгк, системы. К тому же недавно Эпстайном с соавт. ( D03ch et al., 1991 ) обнаружены новые trk гены, находящиеся в различных участках хромосомы, роль которых должна быть изучена. Высказано предположение о том, что Trk активность у аэробно выраженных бактерий формируется двумя механизмами, отличающимися друг от друга trk& и-fcrkH генопродуктами ( D0sch et al.,I99I ). Но генетический анализ представляется недостаточным. Может ли Trk система в анаэробных условиях и при отсутствии f^f -АТФазы функционировать как отдельная система и обладать А&азной активностью? Может ли взаимодействие между f^f -АТФазой и Trk системой определяться trk генами? Все ли trk гены функционально активны в бактериях при росте в анаэробных или аэробных условиях?

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение ДЦКД-чувствительной АТФазной активности в мембранах, изолированных из анаэробно выращенных Unc и trk мутантов е.coli .

Были поставлены следующие основные задачи:

1) изучить ДЦКД-чувствительную АТФазную активность изолированных мембран: выявить ее зависимость от концентрации КГ1" и выяснить специфичность;

2) определить природу ДЦКД-чуЕСтвительной АТФазной активности в изолированных мембранах с использованием мутантов е.coli с делецией une -оперона, кодирующего ï^f -АТФазу, и дефектами в trk генах; выявить ее зависимость от условий роста бактерий и ■шла метаболизма;

3) выявить роль trk генов, кодирующих Trk систему, в определении зависимости ДДКД-чувствигельной АТФазной активности от концентрации К+; сравнить роль этих генов в росте и накоплении К* у бактерий при различных условиях.

Научная новизна работы. В работе выявлена значительная (двукратная) стимуляция ДЦКД-чувствительной АТФазной активности в изолированных мембранах бактерий с помощью К* и показано, что такая стимуляция наблюдаетеялри увеличении концентрации т?ъ+, но не Na+, и не ci-, или но С использованием мутантов е.coli с делецией une -оперона и с дефектами в различных trk генах установлено, что такая АТФазная активность определяется TV -

1 о

АТФазой и стимулируется с помощью К4" лишь у предшественника и , но не-ЬгкА , -ЬгкР или ^кН мутантов. Стимуляция АТФаз-ной активности с помощью К*" определяется анаэробным ростом бактерий и не наблюдается при росте в присутствии нитратов и нитратном дыхании или аэробном росте в присутствии лактата. Тгкб- и <;гкН мутанты существенно отличаются друг от друга па зависимости их роста от концентрации К* в среде и накоплению этих катионов в клетке.

Полученные результаты указывают на то, что зависимость ДЦКД-чувствительной АТФазной активности изолированных мембран от концентрации К4" определяется Р Р -АТФазой и Тгк системой и может быть объяснена лишь прямым непосредственным взаимодействием этих транспортных систем внутри мембраны бактерий с образованием единого механизма. Они позволяют предположить, что 1;гкО ген не обладает функциональной активностью в анаэробно выращенных бактериях. Они указывают также на то, что сама Тгк система в отдельности не обладает АТФазной активностью и что она нуждается б АТФ, скорее всего, как в регуляторе ее активности.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования и полученные результаты о специфической стимуляции ДЦКД-чувствительной АТФазной активности мембраны бактерий с помощью К1" существенно расширяют сведения об АГФазных механизмах мембраны и указывают на совершенно новый факт - специфическую стимуляцию активности -АТФазы в анаэробно выращенных бактериях с помощью К1" посредством ее прямого, взаимодействия с Тгк калиевой транспортной системой.

Полученные данные могут быть использованы для повышения эффективности использования бактерий и поиска новых путей направленной регуляции их жизнедеятельности в биотехнологии.

Апробация работы. Результаты исследований, приведенных в работе, докладывались на Международной конференции "Ион-движущие АТФазы. Структура, функции и регуляция" (Кливленд, США, 1992), а также на семинаре лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии Чикагского университета (Чикаго, США, 1991).

Работа апробирована на заседании кафедры физиологии и анатомии растений биологического Факультета Ереванского госуниверси-

тета от 12 мая 1993 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 работах, в том числе 3.статьях.

Объем работы. Диссертация изложена на 95 страницах и содержит 8 таблиц и 13 рисунков. Указатель литературы включает 108 наименований литературных источников, из них 20 на русском языке. .

Содержание работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. В обзоре литературы приводятся современные представления о бактериальных АТФазах и их роли в транспорте катионов. Краткое содержание остальных глав и разделов работы приводится ниже.

. . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактерии. В работе использовали факультативно-анаэробные грамотрицательные е.coli : предшественник и мутанты с une -делецией и с дефектами в различных trk генах, выведенные проф. В.Эпстайном в лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии Чикагского университета, США. Краткое описание мутантов приведено в табл. I. Мутанты с une -делецией не росли на среде с сукцинатом натрия, мутанты с дефектом е trkA гене не росли на среде с содержанием К** в 5 мМ.

Таблица I. Краткое описание мутантов E.coli , использованных

в работе.

Штамм Генот ИП Литература

ТК2076 mal lacZ nadA trp pyrF ЫтзАВС^ trkD1 Dosch et al.,

ТК2205 lacZ nadA kdpABC5 trkA4-05 trkD1 1991

ТК2321 nadA trp metE kdpABC5 trkD1 trkG82

TJC2654 lacZ nadA trp kdpABC5 trkD1 trkH1

ТК2685 TK2076 trkG92 ît_

FRAG90 lacZ Kal kdpABC5 trkD1

FRAG92 lacZ Kal kdpABC5 trkD1 trkG82 del(zdaV-

FRAG96 lacZ Kal kdpABC5 trkD1 trkH1 11

FRAG111 FRAG90 del(trkE4-19)

FRAG115 PRAG90 del(imc) ЗВЕ

FRAG116 PRAG92 del(unc) gx

FRAG11? PRAG96 delCunc) як

36 все штаммы также: p- rha thi

age

штаммы выведены специально для наших исследований

Культивирование бактерий. Бактерии гранили на косяках трип-тонного (I % триптона, 0,5 $ дрожжевого экстракта и I % хлорида калия) агара или агара Эндо в чашках Петри при 3-5°С.

Бактерии выращивали'в жидких ростовых средах:

- В пептонной среде (Durgaryan and Martirosov, 1978 ), С0г-дергащей 2 % пептона, 0,5 % хлорида натрия, 0,2 % фосфата калия (двухзамещенного), 0,2 % глюкозы, рН 7,2-7,4;

- в солевой среде (Rhoads et al., 1976 ), содержащей 46 мМ фосфата калия (двухзамещенного), 23 мМ фосфата калия (одно-замещенного), 8 мМ сульфата аммония, 0,4 мМ сульфата магния, 0,1 % сульфата железа, 3 мМ цитрата натрия, витамина Bj- в количестве I мг/л и 16 мМ глюкозы (или сукцината, или лактата натрия), рН 7,2-7,4.

В ряде экспериментов для выращивания бактерий, осуществляющих нитратное дыхание ( JConings and Kaback, 1973; Koni.ngs and Boonstra, 1976 ), в среды добавляли 10 мМ нитрата натрия.

Бактерии в анаэробных условиях выращивали в колбах, полностью (или при соотношении объемов среды и колбы 1:1,25) залитых средой и наглухо закрытых, без встряхивания при 37°С. Бактерии в аэробных условиях выращивали в колбах, залитых средой при соотношении объемов среды и колбы 1:10, при непрерывном встряхивании при той же температуре. Бактерии инокулировались из ночной культуры и росли до стационарной фазы в течение 9-15 час.

За ростом бактерий следили по изменению оптической плотности суспензии, определяемому с помощью колориметра.

Скорость роста бактерий в солевых средах с различным содержанием К*" определяли в интервале, когда логарифм оптической плотности суспензии линейно возрастал во времени.

Подготовка бактерий к эксперименту. Количество бактерий в единице объема (титр) определяли подсчетом колоний после высе-

ва суспензии на твердые среда, или по калибровочным кривым, полученным с помощью колориметра.

Сухой вес бактерий определяли взвешиванием после их отмывки в 70 % этаноле и высушивания при G0°C.

Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al. 1951 ) или колориметрическим обнаружением Си+ после взаимодействия белка со щелочным си2+ с помощью реагента по методу фирмы " Pierce " (США).

Мембраны бактерий изолировали путем осмотического лизиса .. сферопластов, полученных после обработки клеток с помощью ли-зоцима по методу Кэбака ( Kaback, 1971 ) ; в ряде экспериментов вместо натрий-фосфатного буфера использовали трис-морфоли-ноэтансульфоновая кислота( mes ) буфер.

Мембраны бактерий, осуществляющих нитратное дыхание,, изолировали- по методу КОНИНГСЯ И Кэбака (Konings and КаЪаск, 1973. ).

АТФазная активность.. АТФазнукг активность определяли по высвобождению неорганического фосфата (Фн) после, реакции мембран (5Q-80 мкг) с 5 1M АТФ-трис ( Sigma , США) в 50 мМ трис-НС1 буфере, pH 7,5, содержащем 2,5 мМ сульфата магния, хлориды калия или натрия и другие соли (см. результаты). АТФазную -активность мембран бактерий, осуществляющих нитратное дыхание, определяли в буфере, содержащем также 10. мМ формиата и 10 мМ нитрата натрия. Реакцию иницировали введением АТФ и останавливали в отбираемых во. времени пробах с помощью 5 % додецилсуль-фата. натрия.. .

Неорганический фосфат определяли спектрофотометрически по методу Йоргенсена И Петерсена (Jorgensen and Peterpen, 1982 ).

Величину ЖЩ-чувствиг ельной АТФазной активности рассчитывали как- разно.сть между значениями АТФазной активности в отсутствии и в присутствии ДЦКД, при этом мембраны преинкубиро-вали с ДЦКД, 0,1 мМ,, в течение.10-15 мин.

Изучение транспорта ионов через мембраны бактерий. За транспортом ионбв следили по изменению их активности в среде, определяемой потенциометрическим методом с помощью ионоселектив-ных электродов (З.Ф.Антонов, Е.И.Асташкин, 1977). Экспериментальная среда представляла собой фосфатно-трисовый буфер, со-

держащий 0,4 мМ сульфата магния, хлориды калия и натрия. Количество транспортируемых Н"1" определяли калибровкой титрованием с помощью HCi по 0,5 мМ. Оценку изменения активности К1" в среде производили по калибровочной криво! и по уравнению Никольского (Б.П.Никольский, Е.А.Матерова, 1980).

За транспортом К* следили также по изменению внутриклеточной концентрации этих катионов, определяемой с помощью пламенного фотометра (Lexington , марки 143, США). В суспензию бактерий вводили хлорамфеникол в концентрации 50 мкг/мл, бактерии собирали с помощью мембранного фильтра "Miinpore ", инкубировали в безкалиевой среде в отсутствии и присутствии 10 мМ 2,4-динитро$енола(ДНФ) в течение 30 мин при 30°С, и переносили в раствор, содержащий 2Q- мМ глюкозы, 300 мМ сахарозы, и хлорид калия.

Результаты обрабатывали статистически с определением стандартной ошибки и критерия достоверности Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. АТФазная активность в изолированных мембранах анаэробно выращенных trk- мутантов E.eoii

Стимуляция ДЦКД-чувствительной АТФазной активности с помощью К*.. При изучении АТФазной активности изолированных мембран дикого предшественника в-coli ТК2076 (таблД), выращенного . в анаэробных условиях в среде с глюкозой, обнаруживалось значительное возрастание как суммарной, так и ДЦКД-чувствительной АТФазной активности, стимулируёмое увеличением концентрации К4" от нуля до 100 ыМ (табл.2).

Таблица 2. Стимуляция ДЦКД-чувствительной АТФазной активности мембран, изолированных из анаэробно выращенных

Концентрация ы среде АТФазная активность (нМоль Фн/мин.мг белка)

Суммарная ДЩ-чувствительная

о. 5 100 76,3+ 7,5 98,2 + 9,1 114,0 ± 11,6 31,3 + 1,7 (100 %) 49,0 + 3,0 (157 Я Р<0,01 62,8 + 3,1 (198 JS) Р <0,001

из 4 экспериментов.

Влияние одновалентных ионов на ДЦКД-чувствигелыщо АТФазную активность. Если возрастание АТФазной активности мембран бактерий при увеличении концентрации К* в среде определяется им как одновалентным катионом, то оно будет наблюдаться и при замене К4" на другие катионы, скажем на Rt» или На ; если же оно связано с калиевой транспортной системой, в данном случае, с Trk , то оно будет наблюдаться лишь при замене К* на нъ+ , но не на Na* , т.к. последний не переносится через калиевую систему (вак-ker et ai. , 1984). Более того, подобный_эф}ект не должен зависеть от замены анионов, скажем,cl на N0^ .

Действительно, как суммарная, так и ДЦКД-чувствительная АТФ-азная активность мембран е.coli ТК2076 существенно возрастали также при увеличении концентрации Rb+, но не иа+или анионов от нуля до 100 мМ. Эти данные позволяют допустить, что стимуляция

ДЦКД-чувствительной АТФазной активности с помощью К"*" опосредуется, скорее всего, через калиевую транспортную систему. ДЦКД-чувствительная АТФазная' активность в trk мутантах. Мутации в trk генах, ответственных за активность Trk системы у e.coü ( Bosch et ai. , 1991), должны отражаться, на наблюдаемой стимуляции ДЩ-чузствительной АТФазной -активности мембран с помощью К1". Презде всего,. trkA мутация, при которой не наблюдается никакой Trk активности у бактерий ( Epstein and^® 1971; Rhoads et al. , 1976), должна полностью снять стимуляцию ДЦКД-чувствительной АГФазной активности с помощью К"1".

При изучении АТФазной активности мембран, изолированных из анаэробно выращенных trk мутантов е.coli , удалось показать, что:

1) АТФазная активность trk мутантов приблизительно одинакова в безкалиевой среде и сравнима с величиной АТФазной активности в мембранах их предшественника;

2) при trkA мутации ДЩ-чувствительная АТФазная активность не возрастает при увеличении концентрации в среде; подобный эффект получен и при trkE или trkн мутациях (рис. I), при этом в последнем случае отмечалось даже уменьшение. АТФазной активности;

3) при trkG мутации наблюдается почти такая же стимуляция ДЦКД-чувствительной АТФазной активности при увеличении кощен-

трации К+ от нуля до 100 ыМ, как и у предшественника (рис. I).

Последний результат представляется удивительным, ибо согласно данным Эпстайна с соавт. ( Dosch et al. , 1991), trkG и txkH' мутации у аэробно выращенных Б.coli фенотипически сходны.

КОНЦЕНТРАЦИЯМИ^ мМ)

Рис. I. Изменение ДЦКД-чувствительной АТФазной активности изолированных мембран анаэробно выращенных trk мутантов Е- coli при увеличении концентрации К* в среде: В тк 2205; □ ТК265Ч-; Ш ТК2685, S "PRAGHI.

Полученные результаты указывают на то, что ДЦКД-чувствитель-ная АТФазная активность мембран бактерий, стимулируемая с помощью К*", связана с активностью. Они свидетельствуют также о том, что мутации в trkG и trkH генах у бактерий при анаэробном росте дают различные эффекты; при этом можно допустить, что trkG ген функционально неактивен при анаэробном росте.. Влияние une -делеции на АТФазную активность и ее стимуляцию с помощью К*. Если ДЦКД-чувствительная АТФазная активность мембран бактерий определяется -АТФазой, то она должна исчезнуть при делеции une -оперона, ведущей к отсутствию -АТФазы в мембране.

Действительно, АТФазная активность в мембранах из une цу-тантов Е.СОИ FRAG116 или FRAG117 резко подавлена, она почти в 5 раз меньше, чем у предшественников. ДЩД-чувствитель-ная АТФазная активность практически отсутствует (табл. 3). Малая ХТФазная активность возрастает незначительно при увеличении концентрации К*" от нуля до 100 мМ независимо от замены К*" на нъ+ или Na+ (табл. 3),

Таблица 3. АТФазная активность изолированных мембран анаэробно выращенных trk мутантов Е-coli с une -делецией * ■ при разных концентрациях катионов в среде

Мутант Концентрация вещества в среде (мМ) АТФазная активность (нМоль Фн/мин.мг белка)

Суммарная В^и^ствии ДЩ

TITRA G116 0 12,5 (100 %) 11,1 (100 %)

KCl : 5 II;5 ( 92 %) 11,2 (101 %)

100 14,9 (119 %) 14,5 (131 %)

0. 9,4 (100 %)

Rbci : 100 13,0 (136 %)

Nací : 100 12,2 (130 %)

FRAG117 0. 11,7 (100 %) 10,5 (100 %)

Kol : 5 12,3 (105 %) 11,2 (107 %)

100 14.0 (120 Í) 12.6 (120

из 2 экспериментов.

Полученные результаты представляются достаточными для утверждения о том, что ДЦКД-чувствительная АТФазная активность в мембранах анаэробно выращенных s.coli есть активность -АТФ-азы и ее стимуляция.-с помощью К1" связана с îrk системой. Они могут свидетельстйовать.о непосредственной связи -АТФазы с тгк системой. Результаты указывают такте на то, что Trk система в отсутствии FjFj -АТФазы не обладает собственной АТФазной активностью.

Зависимость стимуляции ДЦКД-чувствительной АТФазной активности с помощью К* от способа выращивания бактерий и типа клеточного метаболизма. Ранее при изучении Н^К^-обмена у бактерий ( Маг-tirosov and Trchounisn , 1886; Trchounian et al. , 1987,

1992) и АТФазной активности у протопластов и изолированных мембран (Martirosov et al. , 1988; Trchounian and Ogandjanian, 1989; Trchounlan et al. , 1992) было показано, что прямое взаимодействие мевду ?1?0 -АТФазой и Тгк системой в мембране наб-лвдается только лишь при росте бактерий в анаэробных условиях. В последующем было установлено, что такое взаимодействие мевду этими системами наблюдается при анаэробном росте бактерий в • среде с глюкозой и отсутствует при их анаэробном росте в присутствии нитратов ( Bagramyan and Martirosov , 1989). Тогда напрашивался вопрос - может ли ЖКД-чувствительная АТФазная активность мембран стимулироваться с помощью К1" при росте бактерий в присутствии нитратов. Может ли тгк система в этих условиях, а также при росте в аэробных условиях функционировать как отдельная система и обладать АТФазной активностью.

Бактерии при росте в анаэробных условиях в присутствии нитратов осуществляют нитратное дыхание ( Konings and Boonstra, 1976), тогда y^Q-АТФаза функционирует, в соответствии с хеми-осмотической теорией ( Mitchell , 1961, 1966, 1968), как вторичная система, косвенно взаимодействуя с первичными протонными насосами через Д^ьН. И как предполагается, не вступает в прямое взаимодействие с Тгк системой. В этом случае как суммарная, так и ДЩ-чувствительная АТФазная активность мембран е.coli ТК2076 близка по величине с такой в мембранах этих же бактерий, выращенных в анаэробных условиях в среде с глюкозой; но не зависит от концентрации К4" в среде при ее увеличении от нуля до 100 мМ (в реакционной среде содержались нитрат и форми-ат натрия). Подобный по значению результат был получен и тогда, когда мембраны изолировали из аэробно выращенных бактерий: малая АТФазная активность, нечувствительная к ДЩ, наблюдается у une -мутанта е. coli ÎRAG115 и не зависит от концентрации К* в среде, содержащей также б -лактат.

2. Накопление К*" в анаэробно выращенных *rk мутантах Б.coli .

Мутанты е.coli с дефектами в trk генах проявляют неодинаковую потребность в К* для роста. TrkG мутант е.coli ТК2685 вполне подобен предшественнику (е.coli ткго7б ) и растет с высокой скоростью в средах с концентрациях К+ выше 0,4 мМ

Б то же время trkA , trkE и trkH мутанты растут с высокой скоростью лишь при гораздо больших концентрациях К* в среде (рис. 2). Эти результаты могут свидетельствовать о разнице в транспорте IC1" у trkG и trkH мутантов е. coli . Они подтвердились и

Рис. 2. Зависимость скорости анаэробного роста trk мутантов Е.coli от концентрации К4" в среде.

Бактерии, выращенные в анаэробных условиях в пептонной среде с глюкозой в течение 16-20 час, перенесены в солевые среды с различным содержанием 1С". Количество' экспериментов равно 3, стандартная ошибка не выходит за пределы обозначений.

О ТК2076; Д ТК2205 j ■ ТК2654; □ TK26S5; • 7RAG111.

при изучении подобных зависимостей у trko и 1?гкн мутантов е. coli с une -делецией.

При изучении транспорта К4" у trk мутантов Е-coli , выращенных в анаэробных условиях, удалось зарегистрировать разницу мегду trkG и trkH мутантами, обедненными К4* инкубацией в без-калиевой среде без источника углерода и азота. При этом trkG мутант е. coli 'ГК2685 в среде с глюкозой и умеренным содержанием К*" интенсивно накапливает К"1" в течение 5 мин, после которых наблюдается уменьшение внутриклеточной концентрации этих катионов и через 15 мин начинаемся менее интенсивное накопление К*" (рис. 3). TrkH мутант Е.coli ÎK2654 в этих же условиях лишь незначительно накапливает К*" (рис. 3). Эти же мутанты после обеднения К+ с помощью динитрофенола не проявляют заметной разницы в накоплении К+, хотя trkG мутант Е.coli тк 2521 накапливает К+ с несколько большей скоростью. При этом

КОНЦЕНТРАЦИЯ К+ (мМ)

БРЕМЯ (мин)

Рис. 3. Накопление К* в анаэробно выращенных trk мутантах

Е. coli .

Бактерии обедняли К"*" инкубацией в безкалиевой среде в течение 30 мин, накопление К/ определяли после добавления глюкозы (20 мМ) и Г (I мМ) в среду; положительный осмотический шок: ДТК2654. о ТК2635.

накопление К*" подавлялось с помощью ДЩ.

Результаты подтверждают то, что trkg и trkH мутанты е.coli , выращенные в анаэробных условиях, имеют разницу в накоплении К1", trkG мутант подобен предшественнику. Эти результаты, полученные при изучении транспорта К*" у бактерий с помощью пламенного фотометра, были подтверждены при изучении Е^-К^-обмена с помощью ионоселективных электродов. При этом характер Н^-К*"-обмена у trkG мутанта s. coli ТК2685 отличается от такового у trkE или trkH мутантов. При вторичном осмотическом шоке, вызванном с помощью сахарозы, происходит усиление секреции Н"1" и резкое увеличение поглощения К*" у trkG мутанта, в то время как подобные эффекты отсутствуют у других trk мутантов. Такое включение быстрого Н^К^-обмена у trkG мутанта подавляется с помощью ДЩ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изученная в настоящей работе стимулируемая с помощью К+

ДЦКД-чувствительная АТФазная активность в мембранах анаэробно выращенных бактерий, определяемая ?1?0-АТФазой и Trk системой, представляется важным фактом в установлении прямого взаимодействия между этими двумя транспортными механизмами внутри мембраны. Наш установленный факт указывает, что значительная стимуляция АТФазной активности F^-АТФазы с помощью К1" осуществляется лишь при интактной Тгк системе и только у анаэробно выращенных в.coli . Объяснение этого феномена прямым взаимодействием -АТФазы с тгк системой предполагает наличие определенного механизма такого взаимодействия и путей его регуляции.

Что касается механизма прямого взаимодействия эчшх транспортных систем внутри мембраны, то предложена модель, в соответствии с которой такое взаимодействие осуществляется через дити-ол-дисульфидные группы транспортных белков, расположенные внутри мембраны, посредством реакции 2 зн—s-s + Hg + 35 кДж, для осуществления которой необходимы восстановительные эквиваленты ( Bagramyan and Martirosov , 1989).

Ддя поиска возможных путей регуляции прямого взаимодействия этих транспортных систем внутри мембраны анаэробно выращенных бактерий представляются интересными следующие факты:

1) характер распределения белков по мембране зависит от метаболизма клетки ( Ransen and Waksmann , IS80); причем качественный состав мембранных белков у аэробно и анаэробно выращенных Е-coli не имеет больших отличий (отличаются лишь по наличию двух белков) ( visser et al. ( 1984); однако количественные отличия существенны - белки в гораздо больших количествах присутствуют в анаэробно выращенных бактериях;

2) В E.coli открыт агсЗ ген (bin and luchi f 1991), кодирующий, как предполагается, мембранный белок, служащий сенсором кислорода: в отсутствие кислорода этот, белок, связывая АТФ или фосфорилируясь, взаимодействует с цитоплаздатическим белком, который репрессирует синтез ферментов, участвующих в процессах аэробного метаболизма.

Эти две общие возможности можно дополнить специфической. Наши данные о стимуляции АТФазной активности ? ^ -АТФазы в изолированных мембранах с помощью К+ у trkG ' , но не у trk\,

trk£ или trkH мутанта E. coli , а также об отличиях в росте и транспорте К*" у этих мутантов позволяют допустить, что trkG ген не обладает функциональной активностью в анаэробно выращенных бактериях и его активность при анаэробном росте в присутствии нитратов или аэробном росте бактерий определяет отдельную работу тгк системы, косвенно взаимодействующей с ^^ -АТФазой или другими протонными насосами в мембране через дрН. Нельзя, конечно, исключить и то, что trkG ген может быть связан с другим механизмом накопления К*" в клетке.

Надо также заметить, что К*", как показано (Е.О.Пучков и др., 1982), принимает прямое участие в гликолизе, активируя фосфо-фруктокиназу или пируватфосфокиназу. В таком случае приходится учесть еще одну возможность регуляции - прямое взаимодействие этих транспортных систем, обеспечивающее высокую скорость и большее накопление IC1" в клетке при гликолизе С Marti го s ov and îrchoanian , 1986; Trchounian et al. , 1987), регулируется глюкозой или другими метаболитами в процессе гликолиза. Такая возможность интересна и тем, что показана регуляция К^ка-нала, составляющего основу тгк системы, глюкозой или другими метаболитами ( Meury et al. , 1980, 1985).

ВЫВОДЫ

1. ДЦКД-чувствительная АТФазная активность мембран, изолированных из анаэробно выращенных s.coli , значительно (двукратно) возрастает при увеличении, концентрации К*" в среде от нуля до 100 мМ. Стимуляция этой активности наблюдается при замене К1" на къ+ , но не Na"1", cl" или noj~ .

2. Мутации в trk генах, кодирующих Тгк систему калиевого транспорта, отражаются на стимуляции ДЦКД-чувствительной АТФ-азной активности мембран с помощыо-К*": стимуляция наблюдается у trkG , но не у trkA. , trks или trkH мутантов; у последнего мутанта АТФазная активность даже понижается с увеличением концентрации K+ в среде.-

3. Делеция une -оперона, кодирующего ^^ -АТФазу, у trkG и trkH мутантов б.coli приводит к резкому падению АТФазной активности и исчезновению ДЦКД-чувствительной компоненты. АТФ-азная активность у них лишь несколько возрастает при увеличе-

нии концентрации К*, яъ^или Na+ в среде у анаэробно выращенных бактерий и практически не изменяется при увеличении концентрации К* у аэробно выращенных бактерий в присутствии т> -лактата.

4. Стимуляция ДЦКД-чувствительной АТФазной активности мембран с помощью К* не наблюдается у бактерий, выращенных в анаэробных условиях в присутствии нитратов и осуществляющих нитратное дыхание.

5. Рост tvkG мутанта в отличие от других trk мутантов Е.со-li не зависит от концентрации К*" в среде при значениях выше 0,4 мМ, при этом накопление К*" у этого мутанта существенно больше.

6. ДЦКД-чувствительная АТФазная активность мембран анаэробно выращенных Е.coli , стимулируемая с помощью К1", абсолютно зависит от функционирования -АТФазы и Trk системы, что объясняется прямой связью между этими двумя транспортными механизмами внутри мембраны. Trk система может функционировать самосто-ягельно и не обладает собственной АТФазной активностью.

7. Trkg ген, как предполагается, не обладает функциональной активностью в анаэробно выращенных бактериях.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Василян А.В., Оганджаяян Е.С., Трчунян А.А. Активность Trk системы поглощения К1" у анаэробно выращенных мутантов Е.coli с une -делецией // Биолог, ж. Армении.- 1992,- Т. 45.- Л 4.

2, Trchounian А-Л., Vassilian А.У. Potassium-stimulated N,U'-dicyclohexylcarbodiinide-sensitive ATPase activity in the membranes of anaerobically grown Kscherichia coli // Ann. N. Y. Acad. sci.- 1992-- V. 671.- P. 4-90-492.

Trchounian A.A., Ogandjanian S-S-, Bagramyan K.A., Vassilian A.V. Ion exchange and interaction between transport systems in bacteria // 7th Eur. Bioenerg. Conf. Abstracts.-Eelsinki.- 1992.

4. Трчунян A.A., Василян A.B. АТФазная активность и транспорт 1С1" в мембранах анаэробно выращенных trk мутантов Sscherichia coli // Биохимия.- 1993,- Т. 58.- JS 7.