Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие формиат-водород-лиазы в протонно- калиевом обмене Escherichia Coli

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Участие формиат-водород-лиазы в протонно- калиевом обмене Escherichia Coli"

Форма 3.3

ЕРЕВАШКИИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

БАГРАМЯН КАРИНЕ АЛЬБЕРТОВНА

УЧАСТИЕ Ф0РМИАТ-В0Д0Р0Д-ЛИАЗЫ В ПРОТОННО-КАЛИЕВОМ ОБМЕНЕ ESCHERICHIA СОЫ

(03.00.02. - Биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1990

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Ереванского ордена Трудового Красного Знамени государ ственного университета.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор С.М. МАРТИРОСОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Д.Н.ОСТРОВСКИЙ

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник A.B. ГЮЛЬХАВДАНЯН

Ведущая организация: Институт биологической физики

АН СССР

Защита диссертации состоится ссофя. 1990 г.

в / А-^часов на заседании специализированного бовета К.055.01.08. по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (375049, Ереван, ул. Мравяна, I, Ереванский госуниверситет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан " 1л. "

l-tühSflii 1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Л.Г. АНАНЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы., Согласно хемиосмотической теории Митчелла ( flitchell , 1961, 1966, 1968, 1974, 1979), первичные системы, которые способны извлекать энергию из энергетически богатых соединений, генерируют разность электрохимических потенциалов для ионов водорода. Затем, энергия, накопленная в электрической и осмотической форме, используется вторичными транспортными системами для совершения той или иной полезной работы (Николе, 1985; Скулачев, 1989). Взаимосвязь первичной и вторичной систем осуществляется косвенно через делокализован-ный электрохимический градиент, ионов водорода.

Вместе с тем, в последние годы появилось множество экспериментальных данных, которые не укладываются в рамки хемиосмотической Теории ( Bourd, Martirosov , 1983; Боуег , 1984; Ferguson, 1985; Robillard, Konings , 1982; Slater et al.,1985; viilliams , 1988). Приведем три примера, относящиеся к экспериментам на бактериях.

Количественный анализ связи между электронтранспортной цепью, протондвижущей силой и транспортом ионов в бактериях показал, что поглощение некоторых веществ не может иметь место без функционирования электронтранспортной цепи, даже в условиях когда имеется значительный электрохимический потенциал ионов водорода (Elferink et al. , 1985). Более того, несмотря на падение величины наблюдалось увеличение накопления веществ (Elferink , 1986).

У алкалофильных бактерий величина д|Ц значительно ниже того значения, которое необходимо для фосфорилирования ( Guf-fanti et al. , 1981;Krulwich , 1986; Krulwich, Guffanti, 1989). Тем не менее, при работе' дыхательной цепи наблюдается синтез АТФ, который требует лишь циркуляции ионов Н* через мембрану, хотя некоторая величина ДJit все же необходима (Guffenti, Krulwich , 1988). Создается впечатление, что элек-тронтранспортные цепи могут вступать в прямой контакт с вторичными транспортными системами.

У ряда анаэробно выращенных бактерий установлено, что две генетически независимые мембранные системы Н^-АТФаза и

^-транспортер Игк -система объединяются в суперкомплекс,функционирующий как Н^-К^-Насос (Воигс!, Наг^гозоу » 1983; Кигва-гуап, Иаг^гоаоу , 1978а-с; !Чаг-Ыгозоу, ТгсЬоип1ап • 1982). Внутри такого суперкомплекса часть энергии гидролиза АТФ от Н+-АТФазы ?0Р1 должна передаваться, прямо на Тгк -систему, чтобы обеспечить градиент по К4" в 2-Ю3.

Формирование суперкомплексов из отдельных мембранных систем является, по-видимому, общим свойством сопрягающих мембран бактерий ( Воигй,Мах^з.гоБСУц' , 1983). Переносчики Сахаров, такие как фосфоенолпируват-фосфотрансферазная система (ФТС) и лактозная пермеаза, а также аденилатциклаза, могут попарно образовывать суперкомплексы; в этом случае функционирование одной системы тормозит работу другого механизма и за счет этого достигается регуляция метаболизма клетки. Некоторые авторы склонны считать даже, что такие огромные и сложные мультифер-ментные системы как гликолиз или цикл трикарбоновых кислот работают как отдельные пространственно ориентированные структуры (Любарев, Курганов, 1989; 1)уиЪагеу, Кш^апоу , 1989).

Несмотря на значительное количество экспериментальных да~~ казательств, собранных в течение десяти лет Мартиросовым с сотрудниками (Мартиросов, 1985; Воигс!, Маг-Ыгоэоу , 1983; МаагЫ-гобоу, ТгсЬюитеп , 1983, 1986) о возможности образования ионного транспортного суперкомплекса у анаэробно выращенных бактерий, тем не менее остался ряд принципиально важных вопросов, без которых проблема прямой передачи энергии между двумя белками оставалась по-прежнему неявней.

Обычно передача энергии в энергосоцрягакхцих мембранах сопряжена с передачей восстановительных эквивалентов от к акцептору. Например, в дыхательной или фотоиндуцируемой цепи. Было ясно, что ни Н^-АТФаза р^ , ни Вдс -система не являются носителями окислительно-восстановительных локусов, таких как, скажем в хинонах или цитохромах.

Поэтому прямое взаимодействие двух транспортных белков без участия редокс элемента казалось сомнительным, и незримо стоял вопрос: а нет ли в процессе взаимодействия Н^-АТФазы и (Егк-белком третьего участника, обеспечивающего эти системы восстановительными эквивалентами? И второе, какие лиганды могли бы слу-

жить акцепторами или донорами восстановительных эквивалентов на транспортных белках?

Далее, в гипотезе, предложзнной Мартиросовым с сотрудниками, утверждаемся, что энергия от Н^-АТФазы к ^гк -системе передается прямо. Это означает, чтодjUtf* не может служить энергетическим посредником в таком взаимодействии. Тем не менее, эксперименты показывают, что без поглощения К1" не наблюдается ( Martirosov, Itchoimian. , 1986). С другой стороны, работа суперкомплекса - TrkJ определяется стехиометрическим соотношением ( Durgaryan,■Martirosov , 1978 ; Martirosov , Trchounian , 1982), что подразумевает перенос через Н*-насос двух ионов водорода. Это противоречило хорошо известным термодинамическим расчетам о том, что стехиометрия PqP^ определяется отношением

АТФ/ЗН+ при фосфатном потенциале равном 52 кДж/моль иаШн*- равном 17 кДи/моль (Николе, 1985; Ferguson, Sorgato , 1982; Kashket , 1983). Без понимания механизма прямой передачи энергии невозможно ответить на изложенные выше вопросы.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось выяснение механизма прямой передачи энергии внутри ионного транспортного суперкомплекса р,-^ - фгк} у анаэробно выращенных бактерий Escherichia coli . Нами были приняты к исследованию следующие задачи:

1. Установить природу донора восстановительных эквивалентов, участвующего во взаимодействии Н^-насоса FqF^ и К^-транс-портера lirk -системы у анаэробно выращенных е.coli.

2. Провести сравнительный анализ характера связи между деятельностью протонно-калиевого насоса и редокс-состоянием мембран мутантных штаммов E.coli , дефектных по калиевому транспорту или функциям TqF^ Н^-АТФазы.

3. Определить роль в функционировании транспортного суперкомплекса и природу функциональных групп, участвующих в процессе передачи энергии между системами, формирующими суперкомплекс.

4. Попытаться построить количественную модель ионного транспортного суперкомплекса, которая объясняла бы механизм взаимодействия первичной и вторичной транспортных систем.

Научная новизна и научно-практическая ценность работы. В

результате проведенных нами исследований впервые показано, что в процессе протонно-калиевого обмена у анаэробно выращенных бактерий Escherichia coli участвует мембранно-связанный мультифер-ментный комплекс формиат-водород-лиаза, осуществляющий производство молекулярного водорода у этих микроорганизмов. Использование окислителей и восстановителей, а также мутантов с дефектом по транспорту калия или Н^-АТФазе PqP^ позволило установить центральное место тиоловых групп белков в ионном обмене.

В работе показана важность электрохимического градиента ионов водорода (дJU в формировании редокс-профиля тиоловых групп для реализации активности переносчика, и установлено, что в качестве регулятора редокс-состояния тиоловых групп белков в отсутствие aJH д*- может выступать восстановитель - дитиотреитол.

Впервые удалось использовать платиновый электрод в комбинации со стеклянным титансиликатным электродом для обнаружения в экспериментальной среде молекулярного водорода, что позволило дифференцировать истинные значения редокс-потенциала от "артефакта", создаваемого молекулярным водородом.

Совокупность экспериментальных данных, полученных в настоящей работе, сделала возможным создание количественной модели ион' ного транспортного суперкомплекса, объясняющего механизм передачи энергии и восстановительных эквивалентов с помощью формиат-водород-лиазы в процессе взаимодействия двух транспортных белков

Результаты исследований позволяют сделать как частные выводы, важные для биофизики и биохимии микроорганизмов, так и обсудить общебиологические аспекты передачи энергии без посредничества Полученные данные могут быть использованы для повышения эффективности применения бактерий в биотехнологии.

Апробация работы. Основной материал диссертационной работы обсуждался на научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета Ереванского госуниверситета.

Результаты исследований доложены на У-ой Всесоюзной Межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), на Всесоюзном совещании "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино, 1988), на Ш-ей Республиканской конференции аспирантов Арм.ССР, посвященной 70-летию ВЖЖ (Ереван, 1989), на Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических

мембранах" (Кара-Даг - Пущино, 1989).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 5 статей.

Объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 25 рисунков. Библиография включает 188 наименований литературных источников, в том числе 142 на иностранном языке.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав: I - обзор литературы, П - материалы и методы исследований, Ш - результаты исследований, 1У - обсуждение результатов; выводов и списка использованной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактерии. Исследования проводили на грамотрицательных факультативно анаэробных бактериях Escherichia coli K-I2 Ш, дикий тип, а также на его мутантах: ТК-509 (2240), ТК-509 (2242) (ßhoads, Epstein , 1977; Epstein,et el., 1978) и лн 936 ( Сох, Gibson , 1974; Downie et al., 1979).

Культивирование бактерий и их подготовка к эксперименту. Выращивание бактерий в анаэробных условиях осуществляли в однолитровой колбе, залитой 800 мл жидкой ростовой среды, содержащей: 2% пептона; 0,5% NaCl; 0,2% КН2Р04 и 0,2% глюкозы; pH 7,27,4 (37^). В аэробных условиях бактерии E.coli выращивали при непрерывном встряхивании в однолитровой колбе, залитой 150 мл солевого раствора, содержащего: 46 мМ КН^РО^; 23 мМ ftpHPO^ 8 мМ

; 0,4 мМ iigSO^ ; 6 мкМ EeSO/+ ; 20 мМ сукцината натрия, pH 7,2-7,4 (37^). "Нитратные клетки" получали при выращивании бактерий в анаэробных условиях в присутствии 100 мМ NallO^ Бактерии выращивали до ранней стационзрной (18-22 ч) фазы роста.

Клетки отмывали центрифугированием^ и переносили в экспериментальный раствор, содержащий от 1x10 М до ЗхЮ^М KCl j ix IO^M iTaCl ; 4x10 MgSO^ ; от 0,02 M до 0,1 M триса и от 0,02 M до 0,2М НдРО^.а также 0,01 М iTaHO^ для "нитратных бактерий", СрН 7,8) и в растворы для разрушения клеточной стенки бактерий. В течение эксперимента добавляли глюкозу и другие реактивы.

"Дырявые протопласты" E.coli получали с помощью обработки клеток лизоцимом и толуолом (Repaske , 1956). Такая обработка бактерий приводила к образованию "дырявых протопластов", ко-

торые сохраняли нормальное функционирование -зависимой ДДЩ1,— чувствительной АТФазной активности ( Martirosov et al., 1988) и позволяла проводить эксперимент в безградиентных условиях. Количество бактерий в единице объема (титр) определяли высевом бактерий на твердые питательные среды с последующим подсчетом колоний.

Изучение транспорта ионов с помощью ионселективных электродов. Транспорт ионов через бактериальную мембрану изучали потен-циометрическим методом, определяя изменение их активности с помощью стеклянных катионселективных электродов, чувствительных к

и Н4" (Никольский, Матерова, 1980).

Для всего диапазона измерений pH среды, калибровкой в экспериментальном растворе титрованием соляной кислотой по 0,5 мМ определяли количество транспортируемых ионов ff1". Изменения активности ионов К*" в среде оценивали по стандартной калибровочной кривой и по уравнению Никольского.

Величину мембранного потенциала (дФ) рассчитывали по распределению ТФФ+ между клеткой и средой, измеряемому потенциомет-рически с помощью мембранных селективных электродов, изготовленных по руководством проф. Л.Л. Гринюса (Вильнюсский госуниверситет) . ТФФ+ в экспериментальный раствор вводили в концентрации Ix IO^M (Гринюс, 1986).

Величину редокс-потенциала (ЕЪ и еГь ) определяли с помощью титансиликатного стеклянного электрода и платинового точечного электрода, который, в отличие от стеклянного, чувствителен к молекулярному водороду в среде (Шульц и др., 1984).

Химическим способом наличие Hg в экспериментальной среде определяли с помощью метода, основанного на реакции обесцвечивания раствора KMnO^ (2х10~%) молекулярным водородом колориметрическим способом (Некрасов, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Связь между функционированием протонно-калиевого насоса и производством молекулярного водорода у бактерий Escherichia coli . В ранних исследованиях транспорта К1" у бактерий E.coli было показано ( Durgaryan, Martirosov , 1978), что эти клетки осуществляют осмочувствительный Д1ДЦ-зависимый обмен Н* на К*", связанный с функционированием протонно-калиевого насоса ( M~rti-

rosov, Trchounian , 1981), обменивающего 2H4" клетки на один К* среды.

На рис.1 представлен характер изменения редокс-состояния бактериальной суспензиии потоков Н* и К* у анаэробно выращенных E.coli . Кинетические кривые, изображенные на рисунке, обнаруживают двухфазность поглощения ионов К*, а на кривой Независимости наблюдается перегиб, связанный с завершением функционирования Н+-К*-насоса ( Durgaryon, Martirosov , 1978). Крутое уменьшение величиныд^р после добавления в среду глюкозы в период работы насоса свидетельствует о том, распределение ионов К^ у анаэробно выращенных бактерий осуществляется не по градиенту электрического поля, в отличие от аэробно выращенных клеток, подтверждая, таким образом, имеющиеся в литературе данные ( Martirosov, Trchounian , 1986). Важной особенностью данных, представленных на рисунке, является выброс Hg клетками бактерий в период функционирования ЙН^/К^-обмена, регистрируемый платиновым электродом и установленный химическим путем, в результате чего редокс-потенциал суспензии снижается до -600 и более милливольт. Вместе с тем, стеклянный электрод продолжал фиксировать лишь глубокие восстановительные процессы, начавшиеся после введения 5актерий в свежую среду(рис.1; Е-^и Е^).

Как известно, у анаэробно выращенных бактерий E.coli в зредах, содержащих сахара, происходит синтез мембранно-связанно-ро ферментного комплекса - формиат-водород-лиазы (ФВЛ), окисля-ощвй формиат до COg и Hg (Готтшалк, 1982). Производство Hg, а зледовательно и синтез ФВЛ, не наблюдается у аэробно выращенных E.coli , а также и у бактерий, выращенных«в условиях анаэробиоза, но в присутствии нитратов, в которых полностью подавлен синтез ФВЛ (Шлегель, 1987). Вместе с тем, аэробно выращенные клет-<и не осуществляли ни 2Н+/К^-обмен, ни двухфазное поглощение К4" [Мартиросов, Трчунян, 1986). Наши эксперименты показали, что анаэробно выращенные в присутствии нитратов бактерии, синтезирующие нитратредуктазу вместо ФВЛ, не осуществляют -обмен, сарактерный для "нормальных" анаэробно выращенных E.coli . На-тротив, общая картина процесса напоминает ту, что наблюдалась г аэробно выращенных бактерий, для которых установлено ( Martirosov, Trchounian , 1986) раздельное функционирование двух фанспортных систем: fqf^ и тис , использующую в качестве источ-

20 30 ВРЕМЯ (мин)

Рис Л. Кинетика К*"—К4"—обмена ,редокс-с ос тояния мембран (Е^, Е^'),производства Hg (пунктир) и мембранный потенциал

анаэробно выращенных бактерий E.coli K-I2 (Я). Глюкозу (Гл) вводили после бактерий (Б) - 50 мМ.Е h и редокс-потенциал,фиксируемый платиновым и ти-тансиликатным электродами, соответственно.

(иМ)

0,2 0,4

0,6

0,8

1.0

(мМ)|

12

18

24

Б Гя

(мВ)

200

1

£ а - 0

Щ -

й- -200

-400

- -600

Рис.2. Одновременная за-(_uß) пись кинетики протонно-калиевого обмена, редокс состояния и мембранного потенциала у мутанта Е. coli AN -936. Условия эксперимента и обозначения те же, что и на рис Л.

170

140

- 110

80

50

О 10 20 30 ВРНМЯ (мин)

_ - II -

ника энергии aJU^-

Предполагаемая связь ФВЛ и АТФ-зависимого супекомплекса £ FqP^- TrkJ продолжает поддерживаться, даже если в качестве экзогенного источника энергии использовать лактат вместо глюкозы, поскольку лактат, образуясь в процессе деградации глюкозы во время гликолиза, может превращаться в формиат и ацетат с одновременным синтезом одной молекулы АТФ,

Блокирование функций Н^-К^-нзсоса. Отсутствие синтеза ФВЛ, о котором мы судили по образованию в среде Hg, вел» к потере функций 2HVK":-обмена. Каким образом нарушение работы Н^-К^-на-соса могло бы отразиться на функционировании ФВЛ у E.coli ?

Блокирование работы насоса отрицательным осмотическим шоком или с помощью ДЦОД, т.е. выключение функций Н*-АТФазы pqp1 (Burgaryan , Hartirosov, 1978), удаление ионов К4" из среды, которое, естественно, останавливало деятельность Trio-системы ( Epstein , Kim , 1971) - все это сопрововдалось отсутствием Hg в среде, т.е. нарушением процесса образования ФВЛ в клетках бактерий.

Работы Эпштейна с соавторами (Epstein , Laimins , 1980;Rho-ads , Epstein , 1977) свидетельствуют о том, что поглощение К1" через Trk -систему_происходит с высокой скоростью и зависит как от АТФ, так и отдЛ/jji-. Такая зависимость Н^-К^-обмена от АТФ хорошо проявляется в присутствии арсената, подавляющего синтез АТФ, но не влияющего на величину/sJU jj*- (Klein, Boyer , 1972). В этом случае, несмотря на значительную величинуд(^, полностью подавлены как поглощение К% так и синтез ФВЛ, т.е. арсенат, с одной стороны, ингибируя синтез АТФ в клетке и лишая Н+-К/-насос источника энергии, блокирует образование и ФВЛ, нарушая, по-ви-цимому,процесс деградации глюкозы и образования формиата в клетке.

Протонно-калиевый обмен и образование молекулярного водорода у мутантов е. coli . Чтобы внести большую ясность в природу звязи между суперкомплексом Г - Trk} и ФВЛ у анаэробно выра-ценных бактерий s.coli , необходимо было исследовать характер -обмена и работы ФВЛ у мутантов E.coli , дефектных по той ми иной транспортной системам. Анализ данных показал, что мутации по trk -генам (E.coli ТК 509 (2240) ведут к уничтожению и 'rk -системы и к прекращению операций Еу? , хотя при этом на-

блюдается медленное поглощение К4". Вместе с тем, дефекты по trk и kdp -генам (E.coli ТК 509 ( 2242) приводят к полному исчезнове* нию поглощения К* у этих бактерий, хотя при этом также не нарушается процесс синтеза формиат-водород-лиазы (ФВЛ), сопровождающийся выбросом Hg из клеток.

Блокирование функций Н^-АТФазы в мутантных штаммах е.

coli ТК 509 (2240) и ТК 509 (2242) с помощью ДЦВД или отрицательным осмотическим шоком прекращает процесс образования Hg также как и у дикого типа; к таким же результатам приводит и удавление ионов К4" из среды, несмотря на то, что процесс поглощения ионов К4" у мутанта E.coli ТК 509 подавлен и в обычных условиях.

Мутации в une -кластере хромосомы, кодирующей синтез минорной субъединицы протонного канала гфН^-АТФазы (штамм E.coli AN 936), ведут к полному исчезновению поглощения К4, с одной стороны, и производства Hg, с другой (рис.2).

Анаэробно выращенные бактерии E.coli, как дикий тип, так и мутанты, дефектные по Trie-системе или же по обеим - и и

Kdp -системам, а также une-мутант E.coli AN 936, где не нарушен процесс синтеза АТФ и в которых разность электрохимических потенциалов ионов водорода (в нашем случае дер, при pH около 8,0) достигает значительной величины, не способны транспортировать К*" через Trk-систему и осуществлять синтез ФВЛ, если по какой-либо причине не функционирует Fq^I : в результате ли действия ДЩЦ, отсутствия положительного осмотического шока или же мутации в iPqF^ , препятстующей секреции двух ионов Н* через а,

значит и одновременному поглощению ионов К4" через Тгк-систему, в то время как при нефункционирукхцих Trk и Kdp -системах, но нормальной , образование Hg остается неизменным.

Действие окислителей и восстановителей SH -групп на протан-но-калиевый обмен. Для того, чтобы установить, каким образом осуществляется передача энергии между двумя транспортными системами и какие функциональные группы могут участвовать в этом процессе, мы исходили из пионерских исследований Робилларда и Ко-нингса (Konincs et al., 1984; Robillord, Konings, 1984) из которых следует: важность восстановленного состояния ВН -групп транспортера, необходимость aJII^ в формировании такого восстановленного редокс-профиля SH -групп, ингибирукхцее и активирующее действие окислителей и восстановителей пи -групп на транс-

юртер. Введение в среду окислителя феррицианида (K,Fe(cn)6 ), вмещающего редокс-потенциал в область положительных значений ¡+150- 1+175}мВ), несмотря на сохранение работы Н^К^-насоса, рез-со замедляет его функции, притормаживая всё мембранные процессы, зключая и работу ФВЛ по окислению формиата. В то же время дитио-греитол (ДТТ), восстанавливающий сульфгидрильные группы, замет-10 ускоряет все процессы. Правильное расположение SH и s-s-свя-}ей по обе стороны мембраны, согласно теории Робилларда и Конин-'са (Robillard, Konings , 1984) имеет важное значение для функционирования транспортных систем и, в частности, от этого зави-:ит Код систем переноса. Об этом свидетельствуют и приводимые вы-ie данные.

Несмотря на заметное уменьшение величины дер при гликолизе, ;го величина все же остается достаточно высокой, чтобы влиять ia формирование редокс-профиля мембраны ( Elferink , 1986). Толь-:о введение в среду протонофора (КХФГ) сделало возможным подав-[ение работы Н^-К^-насоса и производства Н^ (рис.3). В то же |ремя ДТТ полностью восстанавливал и функции насоса, и функции >ВЛ. Более того, вторичный осмотический шок повторно включал на-:ос, если в суспензию вводили ДТТ (рис.3). Получается, что дф/

ДТТ оказывают как-бы одинаковое влияние на редокс-состояние H -групп, тем самым, регулируя работу всей системы. Эксперимен-ы, проведенные на аэробно выращенных клетках, для которых .из-естно, что они не содержат ни ^-К^-насоса, ни ФВЛ, а для погло-ения К* используют энергиюпоказали, что в условиях полого подавления Ajlt ^-зависимого поглощения ионов К*" с помощью ХФГ ДТТ не способен был восстановить работу Н±К*-насоса. Такой е результат был получен в случае подавления АТФ-зависимого по-лощения К1" арсенатом и для клеток, выращенных в анаэробных ус-овиях в присутствии нитратов.

Толуоловая обработка протопластов S.coli , т.е. создание езгрздиентных условий, приводила к аналогичным результатам, поученным при использовании протонофора, т.е. к отсутствию Н^ в успензии клеток (табл.). Процесс восстанавливался лишь после ведения в среду восстановителя SH-групп, ДТТ, несмотря на на-ичие всех необходимых компонент в реакционной смеси: формиата, энов Ii1" и АТФ. Исследование "дырявых протопластов", полученных з мутантах е.coli AIT 936 (une -мутанте) и ТК 509 (2242), дефект-

Eb'Eh

О 10 20 30 ВРЕМЯ (мин)

Рис.3. Подавление Н^К^-обмена и производства молекулярного во дорода в анаэробно выращенных клетках E.coli K-I2 (Я) ' помощью протонофора (КХФГ, 1хЮ~^М) и последующее восст новление всех характеристик с помощью дитиотреитола (ДТ ЗхЮ'^М). Для повторной активации Н^-К^-обмена с помощь: вторичного осмотического шока была добавлена сахароза (300 мосМ).

ЗН+-*- 2Н+-*- Гликолиз

АТФ

АДФ, Фн

снаружи

Рис.4. Модель ионного транспортного суперкомплекса, состоящего из Н^-АТФазы ^qI1^, Trk -системы поглоще1ия К4" и формиат-водород-лиазы (ФВЛ).

ных по калиевому транспорту, показали, что в безградиентных условиях производство Н^ (и синтез ФВЛ) в них полностью отсутствует, независимо от того, был введен восстановитель или нет (табл.)

Таблица

Производство Hg в "дырявых протопластах" е.coli . "Дырявые протопласты" получали по методу, описанному в разделе "Материалы и методы исследований"; pH раствора 7,8; знак "плюс" означает наличие Hg в суспензии протопластов.

добавки без ДТТ в присутствии ДТТ

k-12ü) к-12 Ш an-936 нс-509 (224-2)

формиат (ф.) ф. + К1" ф. + АТФ ф. + АТФ + К*" ф. + АТФ + К+ + ДДЗД - + + -

Основываясь на данных большой серии работ (Мартиросов,1985; МеаМп.гозоу, ТгсИоиМап , 1981-1986; Маг-Йговслг , 1990), на результатах наших исследований и на общем представлении о принципах связи между мембранными системами (ХсгчЪахе^/, Киг§впоу, 1989) иы попытались построить количественную модель ионного транспортного суперкомплекса, внутри которого происходит прямая передача энергии от ЕфР^ к Тгк-системе. Согласно этой модели (рис.4), Б-Э -связь является "посредником" между мембранными системами, а БН -связь - "накопителем" энергии. Из трех Н1", проходящих через , один Н* затрачивается на восстановление бн -группы, а е~ при этом отбирается из формиата. Другая бн -группа восстанавливается атомом Н, взятым также от формиата. Поскольку 2бн-»-й-в переход сопряжен с высвобождением 35 кДж/моль энергии ( Маг-tn.roсоу , 1990), то считая обе 8Н -группы равноценными, надо думать, что 8Н -группа на й?к содержит запас энергии около 17,5 кДж/моль. Эта энергия близка к той величине, которая найдена из максимального распределения по ионам К*(Трчунян и др., 1986) с учетом погрешностей в теоретической оценке и в эксперименте. Калиевый равновесный потенциал приблизительно в 180-220 мВ является также характерной особенностью изученных ранее бактерий ( Иаг-

tirosov, Trchounian , 1986,* Trchounian et al., 1987; Vardanian, 1988). Из двух оставшихся H4", проходящих через PqP^ , один Н4" переносится против градиента электрического поля около 150 мВ (др=14,5 кДж/моль), а другой Н* переносится только против град! ента рН (электронейтральный обмен Н* на К*" при стехиометрии 2Н*/ К+ (Durgaryan, Martirosov , 1978). Таким образом, суммарные затраты энергии достигают приблизительно 35 кДж/моль, в то время как в системе выделяется около 52 кДж/моль энергии гидролиза одной молекулы АТФ, т.е. эффективность системы равна почти 67%. И это при том, что не учитывается возможная энергия, выделяемая при деградации формиата. Очевидно, что такой запас энергии сове! шенно необходим анаэробным бактериям из-за того, что протонный ь сос является единственным источником энергии для Ajli ^-зависимого переноса аминокислот, Сахаров и т.д.

Предложенная в работе модель мультиферментного транспортного суперкомплекса предполагает обязательное участие формиата в прямом взаимодействии двух транспортных белков, поставляющего восстановительные эквиваленты на сульфгидрильные группы обоих белков. С другой стороны, прямая передача энергии между первичной и вторичной системами невозможна, очевидно, без регуляции. Эту функцию и берет на себя в естественных условиях дШ^. В бег градиентных условиях редокс-состояние тиоловых групп может формироваться с помощью восстановителя дитиотреитола, т.е. механиз/v прямой передачи энергии все же невозможен без hJU ¡j+ •

Суперкомплекс [р^р^ - Trk-ФВЛсформированный из трех гене тически независимых систем, является фенотипически новой системой, работающей и как Н^-К^-насос и как окислитель.

ВЫВОДЫ

1. Методом одновременной записи потоков if1" и К*", редокс-со-стояния бактериальной суспензии и мембранного потенциала показано, что протонно-калиевый обмен, осуществляемый Н^-АТФазой PqF1 и ^-транспортером, Trk -системой, сопровождается продуцированием молекулярного водорода в анаэробно выращенных бактериях Escherichia coli.

2. В аэробно выращенных клетках E.coli , а также в бактериях, синтезирующих нитрат-редуктазный комплекс, в которых отсутствует формиат-водород-лиаза, не наблюдается ни производства мо-

лекулярного водорода, ни исследуемого протонно-калиевого обмена со стехиометрией АТФ:2Н+:К*", ß то же время, подавление функций этого обмена (понижение осмотического давления, добавление дициклогексилкарбодиимида, удаление ионов калия из среды) ведет к блокаде продуцирования Hg.

3. Мутанты E.coli ТК-509 (2240) и ТК 509 (2242) с дефектом по калиевому транспорту, по-прежнему демонстрируют производство молекулярного водорода. Однако, une -мутант E.coli ли 936 с нефункционирущей Н^-АТФазой , не продуцирует молекулярного водорода. Дитиотреитол - восстановитель сульфгидрильных групп, резко усиливает протонно-калиевый обмен, тогда как окислитель феррицианид существенно уменьшает этот обмен, замедляя все процессы.

4. Поглощение ионов калия клетками, выращенными в анаэробных условиях, также как и клетками, выращенными в нитратной среде, блокируется протонофором. Однако, дитиотреитол полностью восстанавливает как поглощение ионов К4, так и образование молекулярного водорода, но только у анаэробно выращенных бактерий.

5. Эксперименты позволили построить модель мультиферментно-го мембранного транспортного суперкомплекса, состоящего из фор-миат-водород^-лиазы (донора восстановительных эквивалентов), Н4-АТФазы FqE^ (донора энергии) и К*-транспортера, М- -системы (акцептора энергии). Внутри этого суперкомплекса осуществляется прямая передача энергии за счет реакции 2sh-*s-s + н2 +35кДж/М Процесс регуляции работы такого суперкомплекса осуществляется с помощью Aßt jj*; последний может быть заменен искусственным, химическим соединением - дитиотреитолом.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Баграмян H.A. Редокс-состояние мембран бактерий Escherichia coli, выращенных анаэробно // Труды У Всесоюзной Межуниверситетской конференции "Биология клетки", Тбилиси, 1987. - С.7

2. Баграмян К.А., Карагулян Э.А., Трчунян A.A., Саркисян Г.Г. Величина окислительно-восстановительного потенциала бактериальной суспензии и редокс-состояние мембран клеток /./ Биолог, ж. Армении. - 1988. - T.4I.'- С.394-398.

}. Баграмян К.А. Лактат как источник энергии й работе мультифер-

ментного комплекса е.coli // Биолог.ж.Армении. - 1989. - Т. 42. -С.981-985.

4. Баграмян К.А., Мартиросов С.М., Саркисян И.Г. Энергоснабжение ионного канала с помощью дитиол-дисульфидных переходов // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Одиночные ионные кана лы в биологических мембранах". - Кара-Даг - Пущино, 1989. -С. 7

5. Bagramyan К.А., Martirosov S.M. Eormationof an ion transport supercomplex in Escherichia coli. An experimental model of direct transduction of energy // FEBS Lett., 1989. - V.246. -P.149-152.

6. Баграмян К.А. Поглощение К1" и редокс-потенциал анаэробно выращенных Escherichia coli// Тезисы докладов Ш-й Республиканской конференции аспирантов Арм.ССР (посвященной 70-летию ВЛЮМ), Ереван. - 1989. - T.I. - С.74

7. Баграмян К.А., Мартиросов С.М. Связь между производством Hg

и энергозависимым обменом ионов Н+ на К4" у бактерий E.coli// Биофизика, 1990. - Т.35. -С.440^143.

8. Баграмян К.А., Мартиросов С.М. Разность электрохимических потенциалов для Нойонов как регулятор редокс-профиля мембраны при АТФ-зависимом транспорте ионов у бактерий E.coli // Биофизика, 1990. - Т.35. - С.624-627.