Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тирозин - фенол-лиаза

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Демидкина, Татьяна Викторовна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

институт молекулярной биологии

им. в. а. энгельгардта

На правах

рукописи

УДК 577.152.41

ДЕМИДКИНА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА ТИРОЗИН - ФЕНОЛ-ЛИАЗА: СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ Специальность 03.00.03 - "молекулярная биология"

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение 4

Глава 1. Обзор литературы "Структурные и функциональные

исследования пиридоксаль — Р — зависимых ферментов".

1.1. Катализ с участием пиридоксаль — Р 8

1.2. Классификация пиридоксаль — Р — зависимых ферментов 11

1.3. Пространственные структуры пиридоксаль — Р — зависимых 15 ферментов

1.4. Контроль реакционной специфичности 31 пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

1.5. Обеспечение субстратной специфичности 35 пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

1.6. Роль отдельных аминокислотных остатков 43 пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

1.7. Роль моновалентных катионов в ферментативном катализе 57

Глава 2. Результаты и обсуждение

2.1. Очистка тирозин — фенол—лиазы и исследование 69 физико — химических параметров фермента

2.1.1. Получение гомогенных препаратов фермента 71 из Citrobacter intermedius и из Erwinia herbicola

2.1.2. Исследование четвертичной структуры фермента 72

2.1.3. Клонирование и секвенирование гена 73 тирозин — фенол — лиазы из Citrobacter freundii

2.2. Исследование каталитических свойств тирозин — фенол —лиазы

2.2.1. Исследование факторов, определяющих субстратную 78 специфичносить тирозин — фенол—лиазы

2.2.2. Влияние моновалентных катионов 88 на тирозин — фенол—лиазу

2.2.3. Трансаминирование — побочная реакция, катализируемая 96

тирозин — фенол—лиазой

2.3. Кристаллизация и структурные исследования тирозин — фенол —лиазы

2.3.1. Получение кристаллов апофермента и холофермента 107

2.3.2. Четвертичная структура тирозин — фенол —лиазы 111

2.3.3. Вторичная, третичная структура 116 и доменное строение субьединиц

2.3.4. Пространственная структура холофермента и локализация 119 центра связывания моновалентного катиона в пространственной структуре холофермента

2.3.5. Кристаллизация и структурные исследования 127 фермент — ингибиторных комплексов

тирозин — фенол—лиазы

2.4. Исследование мутантных форм тирозин — фенол —лиазы 139

2.5. Химический механизм реакции Р — элиминирования, 153 катализируемой тирозин — фенол —лиазой

Глава 3. Методы исследования 155

Основные результаты и выводы 171

Список цитированной литературы 175

ВВЕДЕНИЕ.

Ферменты, содержащие в качестве кофермента пиридоксаль — 5' — фосфат, катализируют разнообразные реакции метаболизма аминокислот — трансаминирование, Р — элиминирование, 0 — замещение, а,Р — декарбоксилирование, альдольное расщепление, рацемизацию. Пиридоксаль — 5' — фосфат (пиридоксаль — Р) является уникальным коферментом, поскольку ни один из известных ныне коферментов не участвует в катализе столь разнообразных реакций, Субстратную и реакционную специфичность каждого конкретного пиридоксаль — Р— зависимого фермента обеспечивает его белковая часть,

Несмотря на физиологическую важность реакций, катализируемых этими ферментами, и медицинскую и коммерческую ценность продуктов этих реакций, структурные основы механизма действия этих ферментов исследованы до сих пор недостаточно. До 1993 г. пространственные структуры были определены только для ферментов, принадлежащих к классу трансфераз. В 1993 г. были определены пространственные структуры двух пиридоксаль — Р — зависимых ферментов — тирозин — фенол — лиазы и диалкилглициндекарбоксилазы, Позднее были определены трехмерные структуры еще нескольких ферментов.

Определение пространственных структур для разных классов пиридоксаль — Р — зависимых ферментов и для ферментов одного класса, но использующих различные аминокислоты в качестве субстратов, позволит получить новые важные данные для понимания одной из основных проблем биологии — проблемы взаимосвязи структура — функция ферментов, выяснить пути эволюции пиридоксаль — Р — зависимых ферментов и создать

фундамент для конструирования ферментов, обладающих оптимальными свойствами для их применения в биотехнологии и медицине.

Данная работа посвящена исследованию структуры и механизма действия одного из малоизученных пиридоксаль — Р — зависимых ферментов — тирозин — фенол — лиазы (КФ 4.1.99.2), участвующей в метаболизме L — тирозина.

Главной целью настоящей работы явилось исследование механизма действия тирозин — фенол —лиазы с использованием кинетических, спектральных методов, рентгеноструктурного анализа и сайт — направленного мутагенеза, В ходе исследования были сформулированы следующие основные задачи: исследование физико-химических и каталитических характеристик фермента; определение пространственной структуры фермента и фермент — ингибиторных комплексов; выяснение роли белковой части в обеспечении субстратной и реакционной специфичности тирозин — фенол —лиазы.

В работе получен ряд приоритетных результатов: определена аминокислотная последовательность тирозин — фенол — лиазы из С. freundii и установлено местоположение остатка лизина , связывающего кофермент; получены кристаллы и определены трехмерные структуры ano— и холоферментов тирозин — фенол —лиазы из двух бактериальных источников и двух фермент—ингибиторных комплексов, моделириующих элементарные стадии реакции {5 —элиминирования; исследованы факторы, определяющие субстратную и реакционную специфичность фермента; показано, что тирозин — фенол —лиаза вступает в реакцию побочного трансаминирования; исследовано влияние моновалентных катионов на фермент и определены структурные основы этого влияния; получены и

исследованы мутантные формы фермента, содержащие замену аминокислотных остатков активного центра фермента. На основе полученных данных предложен механизм действия фермента.

Практическая ценность работы в первую очереь состоит в том, что определение пространственной структуры тирозин — фенол —лиазы из С freundii, выполненное методом тяжелоатомных производных, позволило использовать эту структуру как базовую для решения пространственных структур других ферментов методом молекулярного замещения. Использование метода молекулярного замещения вместо метода тяжелоатомных производных для решения пространственных структур белков существенно ускоряет решение трехмерной структуры нового белка. Пространственные структуры тирозин — фенол —лиазы из Erwinia herbicola и триптофан — индол —лиазы из Proteus vulgaris были решены этим методом.

Установление пространственной структуры тирозин — фенол —лиазы внесло важный вклад в понимание путей эволюции пиридоксаль — Р — зависимых ферментов; полученные нами данные были использованы при создании современной классификации этих ферментов.

Клонирование и экспрессия гена тирозин — фенол —лиазы в клетки Escherichia coli позволили получать значительное количество белка, что необходимо для развития работ по исследованию антимеланомной активности фермента и для использования тирозин — фенол —лиазы в биотехнологии для синтеза аналогов L —тирозина, применяемых в фармакологии и в медицине.

Работа выполнена в ИМБ РАН в сотрудничестве с ИК РАН, ИНЭОС РАН. В работе также принимали участие коллеги из универститетов штатов

Джорждия и Нью-Йорк (США), университета г. Йорк (Великобритания) и Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гамбурге. Вклад отечественных и зарубежных коллег отражен в публикацих по теме диссертации.

Работа выполнены при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований, Научного совета по белковой инженерии, медицинского института им. Г. Хьюза (США), международного фонда Фогарти (США), национального научного фонда Швейцарии.

глава 1.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР "СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ПИРИДОКСАЛЬ-Р-ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ".

В настоящее время установлены пространственные структуры нескольких пиридоксаль — 5'— фосфат — зависимых ферментов, для некоторых из них имеются данные сайт — направленного мутагенеза, что, наряду с классическими биохимическими исследованиями, позволяет приблизиться к пониманию структурных основ, обеспечивающих субстратную и реакционную специфичность этих ферментов, что и является предметом данного обзора.

1.1. Катализ с участием пиридоксаль-5'-фосфата.

Пиридоксаль — 5' — фосфат (пиридоксаль — Р) катализирует

разнообразные реакции превращений аминокислот и аминов в растворах, но без регио— и стереоспецифичнсти, присущей ферментативному катализу с его участием. Принципы механизма реакций, катализируемых пиридоксаль — Р, были предложены практически одновременно и независимо А.Е. Браунштейном и М.М. Шемякиным и Д. Мецлером и Э, Снеллом (1,2). Способность пиридоксаль — Р катализировать различные реакции объясняется двумя особенностями его химической структуры: образованием иминов с аминогруппами аминокислот и аминов и оттягиванием электронов в образовавшемся имине к атому азота пиридинового кольца кофермента, что приводит к ослаблению связей заместителей при атоме углерода альдиминной связи. Во всех пиридоксаль — Р — зависимых ферментах кофермент образует основание Шиффа (или

внутреннй альдимин) с аминогруппой остатка лизина активного центра. При взаимодействии с субстратом он образует внешний альдимин путем реакции трансальдиминирования. Все дальнейшие превращения, катализируемые пиридоксалевыми ферментами, происходят путем миграции протонов и/или отщеплением заместителей у углеродных атомов аминокислоты — субстрата (рис. 1). Электр оноакцепторная способность пиридинового кольца кофермента стабилизирует отрицательный заряд на атомах С4', Са, С(3, Су и понижает энергетический барьер переходных состояний реакций. Все реакции, катализируемые пиридоксаль — Р — зависимыми ферментами, проходят через две общие стадии — внешний альдимин и хиноидное промежуточное производное, являющееся продуктом отщепления одного из заместителей при атоме углерода альдиминной группы внешнего адьдимина. Для объяснения роли белковой матрицы в обеспечении реакционной специфичности пиридоксалевых ферментов в 1966 г. Н. Данатаном была предложена гипотеза (3), которая позже нашла подтверждение данными рентгеноструктурного анализа. Согласно этой гипотезе, молекулярные орбитали связи у С —а —атома внешнего альдимина, перпендикулярной плоскости пиридинового кольца кофермента, имеют наибольшее перекрывание с электронами ж — системы иминной связи и пиридинового кольца и поэтому расщепляются в первую очередь. Кристаллографические исследования аспартатаминотрансферазы (4), диалкилглициндекарбоксилазы (5), тирозин — фенол — лиазы (6) показали, что протон для первого и последнего ферментов и карбоксильная группа для второго фермента перпендикулярны плоскости пиридинового кольца кофермента во внешнем альдимине, как это и следовало ожидать, исходя из типа катализируемых этими ферментами реакций. Гипотеза Данатана

Ь+ н х

Н X

Аминокислота, а+

амин

+ РЬР * а. Гот

Альдимин N +

Н

Электрофильное присоединение (исключая Н+ ) при С а Р-Элиминирование / присоединение (нуклеофильное, + X )

Кетимин Р -Элиминирование / присоединение

Кетокислота, кетон + N113 + РЬР

]

3 -

0

1

О—р—о— II

о

а ?Р-Ненасыщенный ^ + альдимин Н

у -Элиминирование / присоединение (нуклеофильное +У )

р ,у -Ненасыщенный N хиноид н

Р ,у -Ненасыщенный кетимин

Рис. 1. Реакции, катализируемые пиридоксаль — Р — зависимыми ферментами. Стадии Ь3 и Ь4 необратимы. Стадия ] состоит из нескольких элементарных стадий.

и

объясняет роль белковой части пиридоксаль — Р — зависимых ферментов на стадии образования хиноидного промежуточного комплекса.

Дальнейшие превращения на пути разнообразных реакций, катализируемых пиридоксаль — Р — зависимыми ферментами, сложны и требуют контролируемых белком миграций протонов и уходящих групп. Эти процессы катализируются остатками активных центров каждого из ферментов и различия в организации кислотно — основных групп в активных центрах, вероятно, и обеспечивают различия в реакционной и субстратной специфичности в семействе пиридоксаль — Р — зависимых ферментов.

1.2. Классификация пиридоксаль-Р-зависимых ферментов.

Современная класификация пиридоксаль — Р — зависимых ферментов предложена в 1994 г. Эволюционные взаимоотношения пиридоксаль-Р-зависимых ферментов были проанализированы с использованием различных алгоритмов сравнения амнокислотных последовательностей (7). Этот анализ включал рассмотрение около 300 последовательностей для пятидесяти ферментов. Он позволил установить, что имеется несколько семейств гомологичных белков, происходящих от разных предшественников. Рассмотрение реакционной специфичности ферментов, наряду с анализом аминокислотных последовательностей и пространственных структур, позволило предложить региоспецифическую классификацию пиридоксаль — Р — зависимых ферментов, которая в настоящее время является общепринятой, Согласно этой классификации, ферменты разделяют на три региоспецифических семейства, а,Р и у в которых осуществляеся катализ разрыва связей у соответствующих (а,р,у )

Таблица 1

Классификация пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

Фермент тип реакции1 семейство

Рацемазы ab|b.,a

аланина 2

Ацилтрансферазы abjb4a

а — аминолевулатсинтаза а

1 — аминоциклопропан — 1 — а

карбоксилатсинтаза

Альдолазы ab,b4a

серингидроксиметилтрансфераза а

Декарбоксилазы abtb4a 2

подгруппа I

глициндекарбоксилаза

подгруппа II а

ароматических аминокислот, гистидина,

глутамата

подгруппа III 2

орнитина (бактериальная), лизина, аргинина

(биодеградативная

подгруппа IV 7

орнитина (эукариотическая), аргинина

(биосинтетическая

Аминотрансферазы ab [Cd

подгруппа I а

аспарагиновой кислоты,

ароматических аминокислот,

аланина,

подгруппа II а

орнитина, ацетилорнитина, лизина

подгруппа III 2

D — аминокислот,

аминокислот с разветвленной цепью

подгруппа IV а

серина, фосфосерина

ß-Замещающие лиазы afycffct^a

селеноцистеинлиаза, а

цистеиндесульфгидраза а

ß-Элиминирующие, abtej

ß-замещаюшие лиазы

триптофан — индол —лиаза, а

тирозин — фенол—лиаза, а

треониндегидратаза, ß

L —, D — сериндегидратаза, ß

цистатионин — ß-лиаза Y

у—Лиазы abjCfhigj

цистатионин—у—лиаза, У

метионин — у—лиаза Y

у-Синтазы ab[CfhMcb,a

цистатионин—у — синтаза, Y

метионинсинтаза, Y

ß-Синтазы at^eet^a

триптофансинтаза, ß

цистеинсинтаза ß

1 Стадии обозначены в соответствии с рис, 1

углеродных атомов. Следовательно, ферменты семейства а катализируют реакции с разрывом связей при а —углеродном атоме субстрата а ферменты семейств Р и у катализируют реакции разрыва (и образования) связей у Р и у углеродных атомов их субстратных аминокислот. В табл. 1 приведен список некоторых ферментов и их классификация.

Авторы классификации предположили, что предшественники пиридоксаль — Р — зависимых ферментов были региоспецифическими ферментами и их реакционная специфичность возникла раньше, чем субстратная специфичность. Вероятно, пиридоксаль — Р — зависимые ферменты возникли на очень ранней стадии эволюции, так как их аминокислотные последовательности не имеют ничего общего с аминокислотными последовательностями ни одного из ферментов, не использующих пиридоксаль — Р в качестве кофактора (7).

К самому многочисленному семейству а принадлежат и наиболее изученные в функциональном плане аминотрансферазы и большинство пространственных структур в настоящее время определено именно для этой группы, В семейство а также входят декарбоксилазы, ацилтрансферазы, некоторые рацемазы и альдолазы и две Р — элиминирующие лиазы — тирозин — фенол—лиаза и триптофан — индол —лиаза.

Аминотрансферазы были разделены на четыре подгруппы — I, II, II, IV. Ферменты подгрупп I, II, IV могут быть выравнены по трем функционально важным инвариантным остаткам — аспарагиновой кислоте, взаимодействующей с атомом азота пиридинового кольца кофермента, остатку лизина, связывающему кофермент и остатку аргинина, связывающему а — карбоксильную группу субстрата, Все эти ферменты

катализируют транспорт протона исключительно на si стороне внешнего альдимина (7). Для этих подгрупп можно предположить дивергентную эволюцию от общего предшественника, Аминотрансферазы подгруппы III, в которую входят аминотрансфераза D — аминокислот и аминотрансфераза L — аминокислот с разветвленной боковой цепью, катализируют транспорт протона с ге — стороны (8). Кристаллографическое исследование аминотрансферазы D — аминокислот показали, что структура активного центра этого фермента зеркально отражает структуру активного центра аминотрансфераз подгрупп I, II, IV (9). Группа III и группы I, II, IV вероятно, являются продуктами конвергентной эволюции.

Принадлежность двух ß — �