Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тирозин - фенол - лиаза: структура и функция

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Тирозин - фенол - лиаза: структура и функция"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. ВА. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ДЕМИДКИНА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

ТИРОЗИН - ФЕНОЛ-ЛИАЗА: СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ

Специальность 03.00.03 - "молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химически наук

Москва - 1898 г.

Работа выполнена в Лаборатории химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор,

член—корреспондент РАН Е. С. Северин

Доктор химических наук, профессор,

член—корреспондент РАН А.И. Мирошников

Доктор биологических наук, профессор О.Л. Поляновский

Ведущая организация :

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Зашла диссертации состоится "О " ЛМ&Щ/1998 г.

часов минут на заседании^/ * Диссертационного совета Д. 002.79.01

Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, В—334, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Введение

Актуальность проблемы. Фермента, содержащие в качестве кофермента пиридоксаль--фосфат, катализируют разнообразные реакции метаболизма аминокислот - трансаминирование, элиминипрование, р-замещенис, а,{3-декарбоксилирование, альдольное расщепление, цемизацию. Пирвдоксаль-5 '-фосфат (пиридоксаль-Р) является уникальным коферменгом, скольку ни один из известных ныне коферментов не участвует в катализе столь разнообразных акций. Субстратную и реакционную специфичность каждого конкретного пирндоксаль-Р-висимого фермента обеспечивает его белковая часть. Не смотря на физиологическую важность акций, катализируемых этими ферментами, и медицинскую и коммерческую ценность продуктов их реакций, структурные остовы механизма действия этих ферментов исследованы до сих пор достаточно. До 1993 г. пространственные структуры были определены только для ферментов, «надлежащих к классу трансфер аз. В 1993 г. определены пространственные структуры двух ридоксалъ-Р-зависимых ферментов - тирозин - фенол-лиазы и диалкилглициидекарбоксилазы. вднее были определены трехмерные структуры фннтиндекарбоксилазы и рацемазы О-инокислот. Определение пространственных структур для разных классов пиридоксаль-Р-шеимых ферментов и для ферментов одного класса, но использующих различные аминокислоты качестве субстратов, позволит получить новые важные данные для понимания одной из яовяых проблем биологии • проблемы взаимосвязи структура - функция ферментов, выяснить та эволюции пирвдоксаль-Р-зависимых ферментов и создать фундамент для конструировать« рментов, обладающих оптимальными свойствами для их применения в биотехнологии и дицине.

Данная работа посвящена исследованию структуры и механизма действия одного из лоизученных пнридоксаль-Р-зависимых ферментов - тирозин - фенол-лиазы (КФ 4.1.99.2), ютвующей в метаболизме Ь-тирозяна.

Целя и задачи исследования. Главной целью настоящей работы явилось исследование хаиизма действия тирозин - фенол-лиазы с использованием кинетических, спектральных годов, рентгеноструктурного анализа и сайт-направленного мутагенеза. В ходе исследования ли сформулированы следующие основные задачи: исследование физико-химических и палитичсских характеристик фермента; определение пространственной структуры фермента и рмент-ингнбиторных комплексов; выяснение роли белковой части в обеспечения субстратной и 1КЦИОНВОЙ специфичности тирозин - фенол-лиазы.

Научная новизна. В работе получен ряд приоритетных результатов: определена аминокислотная последовательность тирозин - фенол-лиазы из С. freundii и установлено местоположение остатка лизина, связывающего кофермент; получены кристаллы и определены трехмерные структуры апо- и холоферментов тирозин - фенол-лиазы из двух бактериальных источников и двух фермент-ингибиторных комплексов, моделирующих элементарные стадии реакции р-элиминированих; исследованы факторы, определяющие субстратную и реакционную специфичность фермента; показано, что тирозин - фенол-лиаза вступает в реакцию побочного трансаминировання; исследовано влияние моновалентных катионов на фермент и определены структурные основы этого влияния; получены н исследованы мутантные формы фермета, содержащие замену аминокислотных остатков активного центра фермента. На основе полученных ■ данных предложен механизм действия фермента.

Практическая ценность работы в первую очереь состоит в том, что определение пространственной структуры тирозин - фенол-лиазы из С. freundii, выполненное метолом тяжелоатомных производных, позволило использовать эту структуру как базовую для решения пространственных структур других ферментов методом молекулярного замещения. Использование метода молекулярного замещения вместо метода тяжел оатомиых производных для решения пространственных структур белков существенно ускоряет решение трехмерной структуры нового белка. Пространственные структуры тирозин - фенол-лиазы из Erwima herbicola и триптофан -индол-лиазы из Proteus vulgaris были решены этим методом. Установление пространственной структуры тирозин - фенол-лиазы внесло важный вклад в понимание путей эволюции пиридоксзлъ-Р-зависимых ферментов; полученные нами данные были использованы при создании современной классификации этих ферментов. Клонирование и экспрессия гена тирозин - фенол-лиазы в клетки Escherichia coli позволили получать значительное количество белка, что необходимо для развития работ по исследованию акммеланомиой активности фермента и для использования тирозин - фенол-лиазы в биотехнологии для синтеза аналогов Ь^гирозина, применяемым медицине.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 16 -ой Конференции ФЕБО (Москва, 1984), 5-ом Всесоюзном Биохимическом Сьезде (Киев, 19X6), Международной Конференции "Биохимия витамина В«" (Финляндия, 1987), Международной Конференции "Ферменты, зависящие от пиридоксальфосфата и карбонильных соединений" (Япония, 1990), Международной Конференции "Современная энзимология: проблемы и перспективы" (Москва, 1992), Международных Конференциях "Кристаллизация биологических макромолекул* (ФРГ, 1991; США, 1993; Япония, 1995, Испания, 1997), Международной

нферендии "Биохимия витамина В6 и КК)" (Италия, 1994) и 2-ом Съезде Биохимического !щсства РАН (Москва, 1997).

Работа выполнена в ИМБ РАН в сотрудничестве с ИК РАН, ИНЭОС РАН. В работе также шпшали участие коллеги из университетов штагов Джорждия и Нью-Йорк (США), нверситета г. Йорк (Великобритания) и Европейской лаборатории молекулярной биологии в мбурге. Вклад отечественных и зарубежных коллег отражен в публикацих по теме диссертации, тор приносит благодарность всем коллегам, участвовавшим в выполнении работы и обсуждении результатов.

Работа выполнены при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского яда фундаментальных исследований, Научного совета по белковой инженерии, Медицинского статута им. Г. Хьюза (США), Международного фонда Фогарти (США), Национального ртого фонда Швейцарии.

I. Исследование физико-химических параметров тирозин - фенол-лиазы.

Бактериальная тирозин - фенол-лиаза катализирует обратимую реакцию р-элиминированиа реакцию р-замещеяия Ь^гирозина с образованием фенола, пирувата и аммиака. Фермент найден многих микроорганизмах, принадлежащих к энтеробахтерням а также у некоторых касекомых. мяческий механизм реакции р-элнмвнирования представлен на рис. 1. Он включает следующие югные стадии:

образование основания Шиффа юл внешнего альдямнна (Ш) между альдегидной группой ¡юрмента н а-амииогруппой аминокислоты-субстрата, 2) отрыв С-а-прстона с образованием ноцдного промежуточного производного (IV),

таутомернзацию фенольного фрагмента в циклогексадиспоновый (V) с последующим тшгарованием фенола.

Тирозин - фенол-лиаза обладает широкой субстратной специфичностью и эффективно гализирует реакцию Р-элиминирования Ь-серина, Ь-цистсина и ряда аминокислот, *ержавднх хорошую уходящую группу при р-углеродном атоме.

Тирозин - фенол-лиаза представляет значительный интерес для биотехнологии и цицины. Фермент может использоваться для синтеза Ь-тирозина и Ь-3,4-диоксифенилаланина ДОФА). Введение мышам тирозин - фенол-лиазы понижает уровень Ь-тирозина в плазме и яводит к ингибированию роста меланомной опухоли.

Рис. 1. Механизм реакции р-элимштрования Ь-тирозина, катализируемой тирозин - фенол-лиазой.

В данной работе исследовались каталитические и- структурные свойства в основном ермеита из' Crß-eundil. Кристаллизация и определение трехмерной структуры были выполнены н ля фермента из £ herbicola. Основной причиной использования в работе фермента из двух сгочяиков было то, что наличие двух подобных объектов часто помогает решить проблемы, вязанные с кристаллизацией фермента и его комплексов.

1.1. Получение гомогенных препарггов фермента из Citrobacter intermedius и из Erwwia herbicola.

Впервые гомогенные препараты тирозин - фенол-лиази получены японскими сследователями в 1970 г. из клеток С. intermedins и в 1972 г. из клеток £ herbicola.

Работы по установлению структуры и исследование механизма действия фермента нами ыли начаты в 1980 г. в лаборатории химических основ биокатализа ИМБ РАН под руководством кадемика A.B. Браунштейка. Нами разработан метод выращивания клеток С. inlermedius с «пользованием так называемой "бедной" среды, содержащей в качестве единственного источника глерода и азота L-тнрозин (1). Этот метод позволил увеличить содержание фермента в клеточном ксграете более чем на порвдок по сравнению с данными японских авторов. Это, ■ свою очередь, изволило разработать более простой метод очистки фермента (2) и значительно повысить его ыход (30.6 %) по сравнению со способом очистки тирозин - фенол-лиазы, описанным в итературе. Разработанный нами метод очистки позволил получал, высокоочищенные препараты нрозин - фенол-лиазы из С. intermedtus с удельной активностью в полтора раза вывее, чем писанная в литературе. Нами был также разработан метод очистки тирозин - фенол-лиазы из леток £ herbicola, позволивший получить гомогенные препараты фермента с высоким выходом и дельной активностью, превышающей описанную в литературе более чем в тря раза (3,4).

1.2. Исследование четвертичной структуры фермент«.

Литературные данные о четвертичной структуре фермента свидетельствовали, что .етрамер >ермента имеет молекулярную массу около 200000 Да, состоят из чегтырх субьеднниц с дикаковой молекулярной массой, две нз которых связывают кофермент. Связывание [иридоксаль-Р только двумя субьединицами тетрамера могло означать, что две другие убьединицы не участвуют непосредственно в катализе и, в принципе, могут иметь отличную от аталитнческих субьединиц первичную структуру.

Нами было выполнено самостоятельное исследование субъединичной структуры тирозин -)енол-лиазы из С. intermedia* (5,6). Гель-фильтрация белка в нативных и денатурирующих словиях подтвердила, что фермент является тстрамером с молекулярной массой 180 ± 20 кДа,

молекулярная масса мономера составила 45 кДа. Данные определения аминокислотного сосг белка показали, что полипетндная цепь, состоящая из 409 аминокислот, содержит 23 оста лизина и 22 остатка аргинина. Пептидные карты триптичсского гидролизата белка содержали пегггкдов, в нерастворимой части гидролнзата остававлось 34 пептида, что свидетельствовало идентичности аминокислотного состава субьединиц (5). Определение N-концевой аминокисл« показало, что N-концева* группа белка закрыта. В качестве С-концевой аминокислоты 6i определена одна аминокислота - Не (б). Изоэлекгрическая точка белка находилась при pH 4.9S Спектрофотометричесхое титрование алофермента пиридоксалъ-Р показало, что тетра: связывает четыре молекулы кофермента и все четыре центра связывания кофермента иденти1

(5).

Совокупность полученных результатов позволила заключить, что тетрамер тирози фенол-лиазы состоит из четырех химически идентичных и каталитически компегенп субьединиц.

1.3. Клонирование и секвенирование гена тирзин - фенол-лиазы.

Выше упоминалось, что мы выделяли тирозин - фенол-лиазу из двух бактериалы источников • из С. intermedius и из £ herbicela. В университете штата Джорджия (США; Филлипс исследовал фермент, выделенный из клеток Citrobacter freunäit. Мы сравн каталитические параметры ферментов из клеток С. intermedius и С. freundii в реакции элиминирования L-тирооина (неопубликованные данные), они оказались идентичны. Сравнс молекулярных масс ферментов методом масс-спектрометрин (неопубликованные данные) показ: что молекулярные массы (53.437 ± 4.3 Da) ферментов из двух источников также идентичны.

Последовательность 17 N-концевых аминокислот тирозин - фенол-лиазы из С. Interme, была определена в ИМБ РАН C.B. Шляпниковым (неопубликованные данные). Перед процед> секвенировакия на автоматическом секвенаторе белок подвергали обработке 0.5 N HCl, поскол как упоминалось выше, N-конец белка был закрыт. Последовательность 17 Оконце аминокислот фермента из С. freundii оказалась тождественна N-концевой последовательно определенной для фермента из С, freundii в университете штата Джорджия (США).

Совместно с П. Голлником (уинверститет огтата Нью-Йорк в Баффало, США) > Филлипсом (универститет штата Джорджия, США) ген тирозин - фенол-лиазы из С. freundii клонирован и аминокислотная последовательность фермента была определена по структуре ген; 8). Полная структура гена (2100 пар нуклеотндов) и аминокислотная последовательность 6 (456 аминокислот) показаны на рис. 2. Последовательность 456 аминокислот кодируется о; открытой рамкой считывания.

Для определения в аминокислотной последовательности фермента местоположения остатка нка, связывающего пнридоксаль-Р, альднминиую связь в холоферменте восстанавливали $3Щ. Из бромцнанового гидролизата в индивидуальном виде было очищено пять пептидов, из этых один содержал радиоактивность.

1 Т6ТАААТТЛССССАетААТТССССССАА5ТССАСАТетАААТААСАТСАААТААС0(ЗАТТ

61 АССАССТТТСССААТАААТАбАААТССТСТСТАТСССААТАЛЛСЛТАСТАТТАТТСАССО

121 ТАТАЛАТТСАТТССТСТСССАТССТССТСАТЛССТСССАТТТССАОААААТААСССССАТ

1В1 СТСТАТСАСОССАААААТСАСАТСТААСТСАСТСААССАААТАССАААСТСТСАААСААС

241 ССССТТТТСТАСАСТТТССТТТАСАСТТТТАСТСАТСТОААТСАСАААТАТАААТСССТС

301 ААСТСАГСССАСТСТСАСЛАААТССССТСТАСТСАТТСАССААТАСАСТАТСАССАСАСА

361 СТСОААА<ЗТТААСТТТТСАСТАТТТССССТСТССАСеСООССАсСАТСССАААТСССААА

421 тсаасасссааааааааасттсттсаататсаассссггааааааатоасстотсатттсс

481 атсасстасатггасасстттттаааттаттоссастслттаатсттсастаоостаттт

541 ссатаатсааттааатсттссатастссстссасаттатттстссссстсастсассасс

601 соаатасгтататттсатсасастттаттсатсаассасстатсстттасттсасаттаа

661 тасстасатсассастсттастссасааасаааатсааттатсссосасаасссттссот

MetAзnTyrProAlaGluProPheArq

721 АГТААААСССТТСАААСТОТАТСТАТСАТССССКСТСАТСААССССТТААСААААТССАС 11еЬу5 3егУа1С1иТЬгУа13егМе):11еРгоАгдАзрС1цАгд1.еи1,уз1,уз>^С1п

781 СААСССССАТАСААТАСТТТССТСТТАААТТССАААСАТАТТТАТАТТСАССТССТСАСА С1цА1а01уТугА5ПТЬгРЬеЬеиЬеиАапЗесЬузАБр11еТуг11еА5рЬеиЬецТЬг

841 ОТСАСТ5СС^СТААСССААТСА13ССАСААОСАОТСООССОССАТСАЗ'САТССОТСАТСАА АзрЗег51уТЬгАзпА1а>^ЗегАзрЬузС1пТд'рА1ав1уМеШеЫ4е101уА8рС1и

901 ОССТАСССССССАОССААААСТТСТАГСАТСТССАААСААСССТССАССААСТСТТТССС МаТугМаС1уЗегС1иАзпРЬеТугН1з1,еиС1иАгдТЬгУа1С1пС1цЬеиРЬе01у

961 ГГГАААСАТАГТСТТССТАСТСАССАСОССССССССОСАСААААССТОТТАТСССАССТе РЬеЬузН1з11еУа1РгоТЬсН1аС1пС1уАгдС1уА1аС1иАзпЬеиЬеиЗегС1пЪеи

1021 ССААТТАААССОССЗСААТАТОТТССССССААТАТСТАТТТСАСТАСТАССССТТАТСАС • А1а11еГузРго01у01пТу^а1А1аа1уА5пМе«угРЬеТЬсТЬгТЬгАгдТугН1я

1081 САССЗДАААААТССТСССаТСТТТСТССАТАТССТТСЗТСАССААбСССАССАТОССССТ С1пС1иЬузАвпв1уА1а\Ла1РЬеУа1Азр11е\га1АгдАзрС1иА1аН1зАзрА1аС1у

1141 СТаААТАТТ0СТТТТАААСаТСАТАТССАТСТТААААААТТАСАААААСТОА.ТТСАТСАА ЬеиАзп11еА1аРЬе1-узС1уАзр11еАзр1,еи1-уз1.узЬеи51Г1Ьуз1,еи11еАзрС1и

1201 АААССССССОАСААТАТТСССТАТАТТТСССТЗССАСТСАССЙТТААССТСССАССССОЙ ЬузС1уМаС1иАзп11еМаТуг11еСуз1лиА1аУа1М1гУа1АяпЬеиА1аС1уС1у

12 61 САСССбетТТССАТ5ССТААСАТ0ССССССетСССТ0ААСТСАСТССАССАСАТСССАТТ СХпРсоУа15агМе<Л1аАзпМееАгдА1аУа1АгдС1иЬеиТЬгА1аА1аН18С1у11е

1321 АААСТСТТСТАССАСССТАСССССГСССТАОААААССССТАСТТТАТСАААСАССААСАО ЬузУа1РЬеТугАзрА1аТЬгАгдСузУа1С11АзпА1аТугЕЬеХ1еЬузС1иб1пв1и

1381 САССССТТТСАОААСААОАССАТСеСАЗАСАТСетССАТСАСАТСТТСАССТАСОСССАС «пС1уРЬе01иАзп1,узЗег11еА1ае1и11еУа1Н18С1иМееРЬеЗегТу1А1аА8р

1441 ССТТОТАССАТОАСТССТААААААСАСТОТСТССТСААТАТСССССССТТССТСГССАТС

GlyCysThrMetSerGlyLysLvsAspCysLeuValAsnIleGlyGlyPheLe^lCysMet *

1501 ААССАТСАССАААТСТТСТСТТСТСССАААаАСТТАОТССТТСТСТАССААОССАТСССА АапАзрДзрС1иМеЪРЬе5ег5егА1аЬуа01иЬеиУа1Уа1Уа1ТугС1иС1уНеЬРго

1561 ГСТТАССССССССГССССОСАССССАСАТОСААСССАТССССАГТССТСТСССССААОСС ЗегТу1С1уС1уЬеиЛ1а61уАгдЛзрМеС51иЛ1аМеии.аХ1еС1уЬеиАгдС1иЛ1а

1621 АТССАетАТСАСТАСАТССАССАССвССТСААССАССТТСССТАТСТССбССАСААвСТв Ме^С1пТугС1иТуг11еС1иН15АгдУа1Ьузв1пУа1А1;дТугЬеиС1уА8рЬуз1,еи

1681 АААСССОСТОететАССвАТТСТТвААССССТе<ЗССвСТСА1ССССТА'ГГССГССАТССС ЬузА1аА1ае1уУа1Рго11еУа1С1иРгоУа1С1ув1уН18А1аУа1РЬеЬеиАарА1а

1741 ССТСССТТСТСТОАССАТСТСАСССАОСАССАОТТССССОСССАААСССТСеСТСССАСТ АгдРгоРЬеСуз01иН1эЬеиТЬгС1пАзрС1иРЬеРгоА1аС1пЗегЬеиА1аА1аЗег

1801 АТСТАТСТССЛААССвССвТАССТАСТАТОСАССССССААТТАТСТСТбССЙСССОТ ААТ 11еТугУа1С1иТЬгв1уУа1АгдЗегМе*С1иАгдС1у11е11еЗегА1аС1уАхдАзп

1861 ААССТОАСТОСТеААСАССАСАСССССАААСТССАААСССТОССТСТаАСТАТТССАСбС АзпУа1ТЬгС1у61иН1зН1аАгдРгоЬуаЬеиС1иТЬгУа1АгдЬеиТЬг11еРгоАгд

1921 СеССТТТЛТАСТТАСОСЗСАТАТСОАТСТАСТСССТОАССетАТТАТТАААСТТТАССАС . АгдУа1ТугТЬгТугА1аН1зМеЫ^рУа1Уа1А1аАзрС1у11е11е1.у81еиТуг01п

1981 САСАААСААСАТАТТССССаЗСТСААОТТГАТТТАССАОСССААССАССТСССТТТСТТТ Н1аЬу5С1иАзр11еАгдС1уЬеи1увРЬе11еТуг01иРго1.узС1пЬеиАгдРЬеРЬе

2041 АСТССАСОСТТТСАСТАТАТСТАААТААТААТТАТСОССССАТСТСАОСАТССаТССГГТ ТЪ гА1 аАгдРЬеАзрТугНеЕпс!

2101 ТТТ5АТТТСТТТТССАТСААСАС0АА5ТССТТТ

Рис. 2. Нуысотидна» носледовятслькостъ гена тирозин - феноп-гаюы ю С./тт1И и аминокислотная гослсдоеательносп, ферме»».

- Для псггтнда, содержавшего радиоактивность, четвертый шаг секвенирования содержал количсс радиоактивности, практически соответствовавшее количеству радиоактивности в исход пептиде и давал невдентифицируемый продукт (7). Очевидно, что этот цикл соответствс отщеплению остатка N-(5 '-фосфопиридоксил)-Ь-лнзина. На рис. 2 последовательности пепти бромцианового гидролиза, выделенных в гомогенном состоянии, подчеркнуты. Остаток лим связывающий кофермент (отмечен звездочкой), занимает положение 257 в полипептидной ц тирозин - фенол-лказы.

II. Исследование каталитических свойств тирозин - фенол-лиазы. 11.1. Исследование факторов, определяющих субстратную специфичность тирозин - фенол-лиазы. Большинство пиридоксаль-Р-зависимых ферментов, принадлежащих к классу лиаз, в • числе и тирозин - фенол-лиаза, обладают довольно широкой субстратной специфичностью. ,

асненил факторов, определяющих субстратную специфичность тирозин - фенол-лназы, мы ждовали взаимодействие фермента с рядом Ь-аминокислот, часть из которых являются шогами Ь-тирозина (9) а также с аминокислотами различного строения (10, 11). Большинство них оказались конкурентными ингибиторами фермента, образующими хииоидный комплекс и ализирующими обмен С-а-прстгона в 020 (табл. 1). Тирамин, р-фенилэтиламин и триптамин мвлялн очень слабый ингибирукнций эффект. Следовательно, наличие карбоксильной группы у тлеродного атома субстрата является одним из главных факторов, ответственных за Активность связывания субстрата с активным центром тирозин - фенол-лиазы. Эфиры и амиды клина и триптофана конкурентно ингибировали реакцию р-элиминирования Ь-тирозина. нако в амидах, в отличие от соответствующих аминокислот, не наблюдался обмен прогона у {-углеродного атома в 020, хотя из чисто химических соображений замена отрицательно яженион карбоксильной группы на нейтральную должна способствовать увеличению С-Н-хлотности соединения. Возможной причиной отсутствия обмена С-а-протона у амидов может гь то, что активная конформация альдимина с ортогональной ориентацией С-а-Н связи во ;шнем альдимине фиксируется в активном центре именно за счет электростатического имодсйствия карбоксильной группы субстрата с определенной группой активного центра.

Проведенное нами исследование взаимодействия 3-(4'-

гидроксифенил)прогоюновой кислоты с ферментом показало (12), что она является эффективным конкурентным ингибитором природного

субстрата (К,—1.25 мМ), ее связывание ухудшается при рН выше 8.0 и контролируется группой активного центра с рК в.4, что указывало на наличие в активном центре тирозин -фенол-лиазы кислотной группы, взаимодействующей с

карбоксильной группой

ингибитора. Данные

Рис. 3. Зависимость эффективности связывания

аминокислот от гидрофобности (*) их боковых целей. Закрашенными кругами обозначены аминокислоты с неразпстклаиюй боковой цепью, аминокислоты с разветвленной цепью обозначены незакрашенными крутани.

рентгеноетруктурного анализа подтвердили это предположение и будут обсуждены позднее.

Таблица 1

Конкурентное ингибирование тирозин - фенол-лиазы аминокислотами и подвижность С-а-протона в них

Ингибитор К„ мМ V™, обмена протона, % СП-основной реакции я, ккал/мол** А*» на 1 мг белка

Ь-тирознн 0.28* 100 2.24 -

3-фтор-1^гирознн 0.32« -

1>фенилаланин 1.7 60 2.37 0.46

^триптофан 2.4 25 2.55 0.167

Ь-глицин 85 - 0 -

Ь-аланин 16 3 0.40 0.331

Ь-валин 23 <5 1.46 0.01

Ь-лсйции 13 <6 1.91 0.05

Ь-изолейцин 60 <5 2.13 0.025

Ь-метионин 0.7 47 1.34 0.55

Ь-этионин 4.0 - 1.84 0.055

Ь-гомосерин 1.3 И 0.13 0.375

Ь-аспараги новая кислота 3.5 56 -1.77 0.113

Ь-глутаминовая кислота 5.0 4 -1.46 0.005

Ь-гистидин 8 - 0.60 0.005

Ь-норлейцин 8 - 1.91

* величина К»; "л- гидрофобное» бокового радикала аминокислоты

На рис. 3 представлена зависимость параметра -1ШпКч, которая характеризу< эффективность связывания аминокислот с тирозин - фенол-лиазой, от параметра гидрофобное! боковой цепи аминокислот я. В целом, корреляция иежлу этими величинами отсутствует. Д/ глицина, фсиилаланнна, норлейцниа зависимость эффективней связывания от гидрофобное]

шисывается прямой. Снижение прочности связывания для аминокислот с разветвленной боковой (елью, вероятно, связано со стерическими затруднениями. Положительные отклонения от прямой (аблюдались, во-первых, для тирозина, гомосерина, метионина и, во-вторых, для дикарбоновых аминокислот. Эти отклонения, особенно для тирозина, можно объяснить специфическими 13аимодействимн боковых цепей этих аминокислот в активном центре фермента. Аминокислоты, «держащие заряженные боковые группы, обладают отрицательными значениями гидрофобносги 1, при отсутствии других специфических взаимодействий в активном центре, должны иметь шзко; сродство к активному центру. Действительно, лизин и аргинин не являются ингибиторами гирозин - фенол-лназы. Однако дикарбоновые аминокислоты оказались эффективными сонкурентными ингибиторами фермента. Положительные отклонения от прямой для 1Спарагиновой и глутаминовой аминокислот достигают 3.0-3.5 ккал/моль. Это свидетельствует в тользу того, что между отрицательно заряженными боковыми группами этих аминокислот к руппой (группами) активного центра, скорее всего, существуют электростатические ■занмодейсгвия.

Исследование взаимодействия тирозин • фенол-лиазы с ароматическими аминокислотами -^-триптофаном, О-метил ^тирозином, З-фтор-Ь-тнрознном и З-йоя-Ь-тирознном позволило выявить трироду взаимодействия Ь-тирозика с активным центром фермента, обеспечивающего увеличение ¡родства субстрата помимо гидрофобного взаимодействия ( 9, 11, 13). Среди этих соединений голько З-фтор-Ь-тирозин подвергался ферментативному разложению с образованием пирувата и »-фторфенола. Остальные соединения эффективна связывались с ферментом и обменивали С-а-чрогтон на дейтерий в 1^0 (9, 11). Для Ь-фенялаланина было показано, что изотопный обмен троходит с 98% сохранением конфигурации у ос-углеродного атома, что соответствовало нттической чистоте исходного Ь-фенилаланина. Отсутствие ферментативного р-элиминировання у шбранных квазисубстратов, очевидно, объясняется невозможностью осуществления стадии )лиминирования ароматического фрагмента.

Элиминирование ароматического фрагмента формально можно рассматривать как протекающее по механизму электрофильного замещения в ароматическом ряду и включающее две ладии - присоединение протона к С1'-атому фенольного кольца, приводящее к таутомернзацин фенольного фрагмента в циклогексадиеноновый и последующее элиминирование с регенерацией ароматической системы кольца в уходящей группе (рис.1). Необходимой электронной предпосылкой протекания этой стадии является наличие способной к кислотной диссоциации зкеигруппы в положении 4' ароматического кольца, что усиливает нухлеофильность С1 "-атома фенольного кольца.

Таблица 2

Конкурентное ннгибированне тирозин - фенол-лиазы аналогами

L-тирозина и обмен Счх-лрогона в D20 в этих аналогах

Соединение К,мМ обмена протона, % от основной реакции

Ь-фенндаланнн 0.75 60

Ь^тршпофан 1.2 25

З-иод-Ьтирозин 0.3 80

О-метил-Ь-тирозин 4.7 65

метиловый эфир Ь-тирозина 6.3

метиловый эфир Ь-фенилаланина U.0

метиловый эфир Ь^фиптофана 2.9 -

Ь-тирозинамнд >50 отсутствует

Ьтрипгофанамцд >2.6 отсутствует

Ь-фсиилаладинамид отсутствует

3-{4'-гкдроксифенил) пропионовая кислота 1.25 -

тирамнн слабое ингибирование

тршпамин слабое ингибирование

р-фенилэтиламин слабое ингибирование

Ь-л-тирооин* 0.27 -

Ь-о-тирозин * 0.34 -

•литературные данные

Из литературных данных известно, что м-тирозии и о ^тирозин являются конкурентным ингибиторами фермента и образуют хиноидный промежуточный комплекс при взаимодействии ферментам. Невозможность протекания стадии элиминирования фенольного кольца в случае < тирозина с чисто химической точки зрения объяснить нельзя, поскольку для него, в отличие от л тирозина, электронные предпосылки для осуществления сопряженного процесса, приводящего таугомеризации фенольного фрагмента с последующим его отщеплением, также благоприятны, к

• случае и-тирозина. Можно предположить, что диссоциация ОН-группы я ходе ферментативной 1КЦНИ осуществляется под действием определенной, строго фиксированной в пространстве нкциональной группы фермента. При изменении расположения ОН-группы в ароматическом к субстрата ее взаимодействие с этим акцептором становится невозможным, что является кным фактором контроля субстратной специфичности тирозин - фенол-лиазы (9,11).

Исследование кинетических параметров разложения 3-фтортирознна и его ¡терированного в а-положении аналога под действием тирозин - фенол-лиазы (9, 11, 13) сазало, что при переходе от тирозина к 3-фтортирозину наблюдается лишь небольшое дедпение ферментативной реакции, а изотопный эффект при этом остается • пределах значений /ко =2.3), характерных для реакций, проходящих с разрывом или образованием С-Н-связей. В шчие от 3-фтортирознна, 3-иодтирозин не подвергался ферментативному р-элиминнрованию, в 030 проходил эффективный обмен его а-протона (табл.2). Таким образом, при замене в го&ении 3 ароматического ядра фтора на иод элиминирование ароматического фрагмента ловится невозможным. Это явление не может быть связано с электронным влиянием иода, горое практически не отличается от электронного влияния фтора. Единственным возможным ■ясненнем наблюдаемого эффекта является стеричсский эффект иода. Стадия протонирования >матнческого кольца (образование циклогексадиенонового татутомера V, рис. 1) сопровождается ленением гибридизации С1 '-атома, что приводит к переориентации фенольного фрагмента в гивном центре. На Этой стадии, вероятно, и происходит отбор субстратов по стсричсским раметрам, т.е. по соответствию размера уходящего фрагмента размеру соответствующего 1рмана" в активном центре фермента.

* Таким образом, исследование взаимодействия фермента с рядом аминокислот позволило гановнтъ ряд факторов, определяющих эффективность и специфичность связывания субстратов:

1) В связывании субстрата в активном центре тирозин - фенол-лиазы участвуют дрофобные и электростатические взаимодействия и специфическое взаимодействие боковой цепи Зстрата, Ь-тирозина, приводящее к повышению эффективности его связывания с ферментом.

Взаимодействие п-гидроксильной группы субстрата с основной группой активного центра и водит к повышению эффективности связывания Ь-гирознна по сравнению с его близкими алогами - аминокислотами (фенилалаиин, триптофан), имеющими сравнимый с субстратом раметр гидрофобности боковой цепи. Наличие карбоксильной труппы в молекуле субстрата тяется необходимым фактором, обеспечивающим как его эффективное связывание, так и щмальную для протекания стадии отрыва С-а-протона ориентацию; в связывании рбоксильной труппы участвует кислотная группа активного центра с рК 8.4;

2) Субстратна» специфичность тирозин - фенол-лназы контролируется на стада элиминирования ароматического фрагмента двумя факторами: расположением группы активное центра, акцептирующей протон от ОН-группы феиольного кольца и соответствием размер уходящей группы размеру активного центра.

П.2. Влияние моновалентных катионов на тирозин - фенол-лиазу.

В настоящее время известно более шестидесяти ферментов, для функционирования которы необходимы моновалентные катионы. Структурные данные о связывании ферментам моновалентных катионов стали доступны только в последнее время, причем значительно количество этих данных получено для пиридоксаль-Р-зависимых ферментов.

Мы исследовали влияние моноваленгных катионов на кинетические и спектрально характеристики тирозин - фенол-лиазы из С. гМегтееНш.

10

\ * Я 1'

а'

** П т г

1 1 "« т

" ш цои цм 8,0» 0,/

не

по я,м.

Рис. 4 (а). Влияние моновалектных катионов на активность тирозин - фенол-лиазы: 1 - ШЛК.=0-1Э мМ)> 2 - К* (К,=3.57 мМ), 3 - ЛЬ* (К.=7.14 мМ), 4 - Се* (К.=62.5 мМ), 3 - 1л+, 6 -

Рис. 4 (б). Зависимость между ионным радиусом катионов-активаторов н величиной V« реакция р-эдимянирования тирозина.

11.2.1. Влияние моновалентных катионов на активность фермента.

Влияние катионов 1л\ Ыа*, К*, ЯЬ\ Се*, ЫН<* на реакцию р-элимикирования Ь-тирози* представлено на рис.4а,б (14). Фермент в отсутствие моновалентных катионов проявля< активность в пределах 10-12 % в сравнении с активностью в присутствии К+. Катионы К*, ЛЬ Сэ\ ИНч* активируют фермент, 1л* не влияет на ферментативную активность, Иа* ингибирует е Активация является неконкурентной, т.е. моноваленгные катионы увеличивают значение \ш ферментативной реакции, ие влияя на Ки Ь-тирозина. Между значением V,»« в реакции |

1_I

тминировання Ь-тирознна для катионов-активаторов и их ионным радиусом наблюдалась кнейная зависимость за исключением катиона для которого активация была гораздо выше, :м это следовало ожидать, принимая во внимание его ионный радиус.

Анализ ннгнбировання реакции Д-элнминирования катионом N3' показал, что Иа* является жкурентным ингибитором по отношению к субстрату (1^=50 мМ) и ингибитором смешанного та по отношению к К* (К;=72 мМ). При исследовании ннгнбировання реакции -элиминирования Ь-тирозина в системе с двумя конкурентными ингибиторами - катионом 1Яа* и -адалином (15) нами установлено, что Ыа* и Ь-аланнн являются взаимонезавнеимыми энкурентными ингибиторами.

Таким образом, нз данных кинетического анализа следовало, что как катионы активаторы, ис и катион-ингибитор Ыа* связываются в участке, отличном от центра связывания субстрата.

П.2.2. Влияние моновалентных кятнонов иа спектральные характеристики

Мы исследовали влияние моновалентных катионов на спектры поглощения и кругового нхроизма (КД) фермента при pH 8.0, т.е., в pH-оптимуме действия фермента н влияние оновалентных катионов на спектры поглощения и кругового дихроизма фермент-ингибиторного омплекса с Ь-аланнном (14,15), рис. 5а,б,

тирозин - фенол-лназы.

JA-IS'7

«

SOJnt

Рве. 5. Влияние мояовалекпшх хатионо» на спектры поглощения (з) к КД (б) тирозин - фенол-лназы: 1 - холоферменг, 2 • холофермент + Na*; 3 • хояофермент + Rb*; 4 - холофермент +NH,*.

В спектрах поглощения н и кругового дихроизма холофермента в отсутстви моноваленгных катионов наблюдаются две полосы (X, и Х2), соответствующие двум таутомера» внутреннего основания Шиффа - кетоенамину и енолимину (рис. 6) с соотношение« интеисивностей полос Оч/Хг , равным 1.06. Эти полосы обладают положительным знаком 1 кругового дихроизма с отношением ннтенснвностей полос, равным 1.0. Все исследовании катионы влияют на спектры поглощения и КД холофермента, увеличивая количество кстоснамии (интенсивность полосы и уменьшая количество енолимнна (интенсивность полосы X}. Отношение интенсивносгей (при концентрации катиона 0.1 М) для ЬГ, Ка\ Сэ*, К4 в спектрах поглощения составило соответственно 1.09, 1.16, 1.23, 1.34,1.57, 1.7; в спектра КД это отношение равнялось 1.6,2.3,3.5,5.0,5.8,8.1.

Таким образом, моновалентные катионы сдвигают таутомерное равновесие в холофермент

в сторону активного таутомерг

лул лу*

каковым, вероятно, являете

кетимин.

В случае фермет

ингибитор кого комплекса с I

аланином, моновалеитны

катионы увеличиваю

СН3 интенсивность полос!

поглощения и круговог )„, 420 км '/.2,335 им

дихроизма с максимумом пр

(кетоенакин) (еншошин)

Рис. 6. Таугомериые формы "внугрешкго" алъдимина тирозин - фенол- нм> принадлежаще

лиазы.. хииоидиому ннтермадиату, т.е

моновалентные катион]

увеличивают степень лабилизации С-а-протрна во внешнем альдиминс. При этом наблюдаете линейная корреляция между величиной максимальной скорости реакции и увеличение] количества кстимина и количеством кетимина и хиноидного комплекса. Следовательно, активны! таутомером внутреннего Шиффа, вступающим в реакцию с субстратом, является кстоснамии.

Таблица 3

Значение факторы анизотропии ( А/А )х10^ для холофсрмскта и фермент-ингибиторного комплекса с Ь-аланнном

к» мМ V макс, мкМ мин'1 Катион (ДА/А )х 10* 420 им (ДА/А)х10- 6 497 нм

- - и 1.2 1.21

50' - Ш 1.47 1.23

625 5.18 Сз 2.0 1.31

0.714 6.85 ЙЬ 5.41 1.40

0.357 8.20 К 6.25 1.48

0.013 9.62 N11, 8.33 1.48

1 Величина К|В реакции р-элиминнрования Ь-тнрозина

Величины V,«« определяли при концентрациях: 0.1 М К\ КЬ\ Св+; 0.01 М N11,*.

Данные о влиянии монокалентных катионов на каталитические и спектральные параметры ;олофермеита и фермент-ингибиторного комплекса представлены также в таблице 3. Увеличение фактора анизотропии полос поглощения кегосиамина н хинондного промежуточного соединения юд действием катионов коррелирует с увеличением скорости ферментативной реакции под мшянием катионов. Следовательно, активирующее влияние катионов как на холофермент так и на [вермекг-ннгибкгорныб комплекс должно быть связано с конформационными изменениями, тронеходящими при их связывании. Характер этих изменений стало возможным предложить на хнове данных рентгевоструктурного анализа и это будет обсуждено ниже.

113. Трансамииирование - побочная реакция, катализируемая тирозин - фенол-лиазой.

Многие пиридоксаль-Р-зависниые ферменты наряду с "нормальной" реакцией катализируют реакцию побочного трансаминкровання, т.е. перенос аминогруппы субстратной 1м иноки слога на кофермент с образованием пиридоксамин фосфата (пиридоксамин-Р).

Мы исследовали наличие реакции побочного трансамииирования у тирозин - фенол-лиазы цля субстратов фермента - Ь-тирозина, Ь-серина и конкурентных ингибиторов - Ь-аланииа, Ь-фенилаланнна, Ь-а<-тирозина (16,17,18).

Для обнаружения и доказательства трансаминирования исследованы следующие критерии: инактивация фермента в ходе инкубации с субстратами и ингибиторами, изучение во времени спектров поглощения и КД фермент-ингибитор них комплексов и хроматографический анализ продуктов реакции фермента с субстратами и ингибиторами с целью идентификации пиридоксамин-Р и кегокислот.

11.3.1. Инактивация тирозин - фенол-лназы при инкубации с субстратами и конкурентными ингибиторами.

Характерной чертой побочного трансаминирования пиридоксаль-Р-зависимых

Рис. 7. Инактивация холофериеша при ферментов является их инактивация при инкубации с субстратами (а) в

ингибиторами (6): 1 - тирозин; инкубации с субстратами и ингибиторами. У

2 - серии; 3 - аланюг, большинства ферментов, не являющихся 4 - фенкдалакин; 5-м- тирозин.

Стрелкой показано добавление трансаминазами, пиридоксамин-Р гораздо пирнаоксаль-Р. _ „

слабее связан с белком, чем пиридоксаль-Р.

Образующийся при диссоциации апоферменг может быть реактивирован добавлением избытка

пиридоксаль-Р. На рис. 7(а,б) показано что при инкубации холофермента с субстратами и

ингибиторами наблюдалась инактивация, полностью обратимая при добавлении

пиридоксаль-Р.

11.3.2. Спектры поглощения и кругового дихроизма фермект-иигибиторных комплексов.

В спектрах поглощения и кругового дихроизма комплексов тирозин • фенол-лиазы с квазисубстратами имеется характерный для хиноидных промежуточных производных пнридоксаль-Р-зависимых ферментов пик с Хщ, 497 нм (рис. 8а,б). Во время инкубации происходит уменьшение интенсивности полосы поглощения и кругового дихроизма с при 497 нм. В спектре поглощения одновременно происходит увеличение интенсивности полосы поглощения с ^ 335 нм, не обладающей дихроизмом.

При добавлении избытка пиридоксаль-Р происходит восстановление исходного спектра, затем карта!« его изменения во времени повторяется с дальнейшим ростом интенсивнсти полосы поглощения с . X»« 335 нм. Эти изменения указывают на образование в реакционной смеси пиридоксамин-Р. При инкубации апофер мента с кегосислотами - фенилпнруватом, л-оксифеннлпируватом, пируватом в присутствии пиридоксамин-Р нам не удалось спектрально обнаружить образование холофермента, которое свидетельствовало бы об обращении реакции трансамннировання. Попытка обнаружить образование пиридоксаль-Р в этой системе по его способности активировать апофермент также не показала обращения реакции трансамннировання.

А

065

07

ДАЮ"1

¿00 500 НИ

Рис. 8. Изменение спектров поглощения (в) и кругового дкхрокзш (б) фермогг-ингмбйтонсго комплекса с Ь-фенипдланнном: 1- холофермол;

2 - холофермент + фенишишшн;

3 - инкубация 2.5 часа.

И.3_3. Хроматограф ичеосое исследование продуктов реахцин.

При траисамииировании аминокислот (тирозина, л-тирозина, феннлаланина и аланина) продуктами реакции являются пиридоксамин-Р н соответствующие кегокислоты: л-оксифенилпируват, р-оксипируват, мчженфеннлпируват, р-фенилпнруват н пирувзт. Для идентификации этих продуктов мы использовали хроматографию на бумаге и ВЭЖХ. Пиридоксамин-Р был идентифицирован разделением реакционных смесей

хроматографией на бумаге после инкубации фермента со всеми указанными аминокислотами. Кетокислоты (за исключением пировиноградной кислоты и р-окенфенилпирувата) идентифицировали,

разделяя реакционные смеси ВЭЖХ в сравнении с ВЭЖХ соответствующих стандартов. Пнровиноградную кислоту идентифицировали с помощью

лактатдегидрогензы, м-оксифенилпируват не был идентифицирован. На рис. 9 (а, б) приведен разделение продуктов реакции после инкубации тирозин - фенол-лиазы с Ь-ссрином (а) и I. феннлаланином (б).

0Л5

2 1

-А

Метюл,% 50

№

1$

20

Метанол, %

0.05

Рис.9(а). Хроматография продуктов Рис.9(б). Хроматография продухгоа

реакции тирозин - фенал-лидш с рсакцки тирозин - фенол-лиазы с

сершкис 1 - пируваг, фенилаланююн:

2 - Р-огсюшруаат; 1 - пиридокшош - Р.

3 - пирвдоксаыин - Р; 2 - фенилаяанин; А - (шрндоксаль-Р. 3 - фенклпнруват.

Таблица 4

Кинетические параметры реакций ^-элиминирования и трансаминирования

Субстраты, р-элнминнрование трансаминирование

ингибиторы к., К;, к,„\Км, к„ к»*!»', к„ДКм,

мМ мМ е"' М-1 с1 мМ с' М"1 с1

Тирозин 0.24 2 в.ЗхЮ3

л-Ткрозин 0.24 0.94 2.69 2.86

Серии 34 0.35 10.3 51 1.0 2х 10'2

Фениладанин 0.« 4.15 0.8 0.19

Алании 13* 6.1 1.53 0.25

*в реакции р-элиминирования Ь-серина

Кинетические параметры побочного трансаминирования в сравнении с параметрам реакции р-элиминирования приведены в табл. 4. Мы не смогли определить кинетически

параметры трансаминирования для Ь-тирозина ввиду чсрезвычайно низкой скорости этой реакции и низкой растворимости Ь-тнрозина.

Отношение величин к,„ р-элиминирования и трансаминирования сернна свидетельствует, что трансаминирование "плохого" субстрата происходит со скоростью, близкой к скорости основной реакции. Это явление - "хуже субстрат - быстрее побочное трансаминирование" - было отмечено при изучении реакции побочного трансаминирования у глутамзтдекарбоксилазы.

Величины кт трансаминирования для всех использованных аминокислот практически совпадают. Вероятно, для этих субстратов имеется одна и та же скорость-лимитирующая стадия реакции трансаминирования, следующая за стадией образования хиноидного промежуточного производного, в то время как для реакции Р-элиминирования отрыв ос-протона является екорость-лимнтирующей стадией.

Мы определили скорость трансаминирования в присутствии различных моновалентных катионов (15), табл. 5.

Таблица 5

Влияние моновалеклшх катионов на величину к*» в реакциях Р-элиминирования Ь-тирозяна и трансаминирования Ь-аланииа

Р-элиминировзние трансаминирование

Катион с"1 к«*, с1

- 0.08 3.49 хЮ"3

и* 0.81 5.1 хЮ"3

Ыа' 0.10 2.38 хЮ3

Сз+ 1.32 2.21 хЮ3

яь* 1.53 1.70*10°

к* 2.04 1.53 хЮ1

2.32 1.27 х! О'3

Моновалентные катионы - активаторы реакции р-эли минирования ингибнровали реакцию побочного трансаминирования. Соотношение скоростей основной реакции и реакции побочного трансаминирования с химической точки зрения должно определяться распределением отрицательного заряда в карбаниоае (резонансная форма • хннонд, рис. 1, V) между С-а- и С-4'-атомами. Распределение этого заряда в карбанионе, согласно данным квантово-хнмнческях расчетов зависит от ближайшего белкового окружения. Вероятно, коиформация ахтивного центра на стадии хиноидного промежуточного производного в присутствии К*отличается от его конформации в присутствии Ка\ Возможно, подобное влияние моновалентных катионов на

соотношение скоростей основной реакции и реакции побочного трансаминирования существует и для других пиридоксаль-Р-зависимых ферментов.

III. Кристаллизация и структурные исследования тирозин - фенол-лиазы.

Современные исследования механизма действия ферментов должны базироваться на данных рекггеиострупурного анализа. Не смотря на большой прогресс в техническом обеспечении рскгеновских исследований, получение пригодных для рснгеиоструктурного анализа кристаллов белков остается одним из узких мест в решении трехмерной структуры любого белка. Вторым узким местом в решении струкур белков является получение изоморфных тяжелоатомных производных для полученных кристаллов. Эта. проблемы были успешно решены нами для тирозин -фенол-лиазы.

Ш.1. Получение кристаллов апофермента и холоферментя.

Поиск условий получения кристаллов фермента, пригодных для рентгенострукгуркого анализа, был начат с использованием в качестве осадителсй сульфата аммония, 2-метнл-2,4-пситаиднола и полиэтиленгликоля 6000 (19). Из растворов сульфата аммония (1.3 М) были получены кристаллы призматической формы (0.3x0.3x0.$ мм3), имевшие дифракционное поле до разрешения 2.7 А. Из растворов полиэтиленгликоля получены кристаллы, имевшие дифракционное поле до разрешения 5 А, кристаллизация из растворов 2-метил-2,4-пснтандиола не привела к получению пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов. Для кристаллов, полученных из растворов сульфата аммония, был начат поиск тяжслоатомных изоморфных производных (20) и одновременно проведен поиск оптимальных условий кристаллизации фермента из растворов сульфата аммония. Поиск провешили для апофермента, так как в процессе работы с тирозин - фенол-лиазой мы выяснили, что высокая концентрация сульфата аммония приводит к частичной диссоциации кофермента.

В ходе разработки условий получеши кристаллов апофермента из растворов сульфата аммония были получены трубчатые кристаллы апофермента. Их электронно-микроскопическое исследование, проведенное в ИК РАН позволило построить модель тирозин • фенол-лиазы с разрешением 20 А. (21, 22). В реконструированной модели (точность 5 А) можно выделить два примерно равных удлиненных домена, которые, ках мы предположили, должны соответствовать парам субьединнц белка. Размеры молекулы составили 80x80x50 А'.

Для оптимизации условий получения кристаллов, пригодных для реигеноструктурного анализа, мы применили градиент рН раствора белка от рН 7.0 до рН 6.0. Крупные кристаллы

алофермента (1.0x1.0x0.6 мм5) были получены из растворов сульфата аммония при применении как градиента осадителя так и градиента pH (7). Кристаллы принадлежали к пространственной группе P2i2|2 с параметрами элементарной ячейки а=75.5 , Ь=138.4 А, с=94.1 А, содержали две субьединицы в независимой части элементарной ячейки и имели дифракционное поле с разрешением до 2.5 А при сьемке на рентгеновской трубке с вращающимся анодом (СиК. излучение). Кристаллы изоморфных тяжелоатомных производных получали настаиванием кристаллов алофсрмента в растворах тяжелоатомных соединений. В процессе поиска было испробовано более сорока соединений. Поиск изоморфных тяжелоатомных производных оказался наиболее трудоемким и длительным этапом в определении пространственной структуры алофермента. Всего для четырех из сорока опробованных тхжслоагомных соединений изменения параметров ячейки и дифракционного поля были а допустимых пределах. Кристаллы белка были подвержены значительному радиационному разрушению. Дифракционные данные для нативного белка и четырех тяжелоатомных производных позволило решить пространственную структуру тирозин • фенол-лназы с разрешением 4.5 А (23). Была установлена форма молекулы, взаимное расположение субьединиц в тстрамере и доменная структура субьединиц фермента (24-27); размеры молекулы совпали с размерами, определенными при элестроняомикроскопическом исследовании трубчатых кристаллов.

Съемка дифракционных данных с использованием синхротронного излучения на пучке накопителя DORIS (Европейская лаборатория молекулярной биологии Гамбург) с длиной волны 0.96 А позволила решить проблему радиационной неустойчивости кристаллов и, как результат, пространственная модель алофермента была уточнена при разрешении 2.3 А с использованием определенной нами аминогаслотной последовательности белка (7,28).

Кристаллизацию алофермента и холофермеита тирозин - фенол-лиазы из Erwinia herblcola также проводили методом свободной диффузии. В качестве осадитслен использовали растворы NaCl, KCl и (NH^SO.,. Кристаллы холофермеита получены из 1.6-2.0 М раствора (NHifeSO* кристаллы алофермента - из 3.6-3.8 М раствора KCl (3). Кристаллы асах ало- так и холофермеита имели форму гексагональных пирамид и принадлежали к пространственной группе Р6}22.

Пространственная модель алофермента тирозин - фенол-лиазы из С. freundii была использована для решения структуры холофермеита методом молекулярного замещения, уточненная атомная модель холофермеита использовалась для определения трехмерной структры алофермента. Трехмерные модели холо- и алофермента уточнены с разрешением 2.4 А и 2.7 А соответственно (29).

Ш.2. Четвертичная структура тирозин - фенол-лиазы.

Молекула тирозин - фенол-лиазы состоит из четырех субьединиц, расположенных в вершинах тетраэдра с симметрией Ьг — 222. На рис. 10 представлено схематическое изображение тетрамера.

Каждая субьединица состоит из двух доменов • большого в малого. Большой домен может быть описан эллипсоидом вращения с полуосями 15x30x30 А. Малый домен имеет сферическую форму с радиусом около 15 А. Кристаллографическая двойная ось (0) вертикальна. Тетрамер тирозин -фенол-лиазы следут рассматривать как состоящий из двух димеров а^', связанных нехристаллографическими осями второго порядка К и Р. Контакты между двумя димерами

образованы за счет контактов И-концевых участков полипепгндных цепей субьединиц, связанных молекуляриой осью Я и гидрофобного кластера в центре молекулы. N. концсвыс участки (остатки 1-18) переплетены между собой и образуют антипараллельную р-сгруктуру.

Гидрофобный кластер образован двенадцатью остатками метионина, по три остатка из каждой из четырех субьединиц (М56, М64, М65) и четырьмя остатками триптофана ( \У61), по одному из каждой из субьединиц. Ядро кластера состоит из четырех остатков М65, атомы серы которых лежат в углах тетраэдра с гранями около 5 А. Следующий слой кластера образован четырьмя индольными кольцами остатков \У61. Верх и низ кластера образуют остатки М56 и М64. Остатки ¥/61, М64 и < М65 находятся в а-спирали (аЗ, рис. 11) большого домена. Четыре а-спирали (по одной из четырех субьединиц) окружают кластер и защищают его от растворителя. Наиболее слабые взаимодействия имеются между субьединицами, связанными молекулярной осью Р, для них контакт осуществляется только за счет гидрофобного кластера. Контакты между субьединицами, связанными молекулярной осью К, помимо контактов в кластере, включают и контакты Л-концевых ручек. Контакты между субьединицами каталитического днмера включают области ^ активного и катион-связывакицего центров и будут обсуждены ниже.

-т

€ \ к!

Рис. 10. Доменная архитектура н межЕубьсдиюгише контакт в тетрамере. Болыиве я малые домсиы обозначены как Ь ■ Б. Каталитический центр помечен буквой С. Гидрофобный кластер показан в виде эллипсоида ■ исктре молекулы.

Рис. 11. Топологическая диаграмм* суОьедккикы. Крупами обозначены а-спирали, (1-лжта обозначены квадратами.

1113. Вторичная, третичная структура и доменное строение субьеднниц. Ход полипептидной цепи в субьединице фермента характеризуете» высокой степенью упорядоченности. Около 34 % аминокислотных остатков организованы в а-спнралк, примерно 17 % остатков находятся в (3-слоях и около 16 % остатков входят в состав р-поворогных участков. Каждая субьединица содержит 15 а-спиралей и 14 Р-слоев. В каждая субьединице можно выделить три основных структурных элемента: большой н малый домены и >1-концевой участок. На рис. 11 представлена топология хода полипептидной цепи в субьединице, ленточная модель субьединхцы представлена на рис. 12

Малый домен включает остатки 20-48 и 333-456 (34% аминокислотных остатков). Он образован четырехцепочечным ангипараллельным р-слоем (цепочки а'-ё'), в который входит С-концевой участок псишпешкдной цели. Все а-спирали малого домена находятся на внешней (по отношению к растворителю) стороне р-лнета.

Основу большого домена составляет семицелочечный р-слой с направленностью цепочек з-ц +-+++++. В него входит остатки 57310 (56% всех аминокислотных остатков). Шесть цепочек р-слоя параллельны друг другу, цепочка 8 антипараллельна остальным. а-Спирали 3,4,б,7»8'9,П расположены со стороныи Э-лисга, обращенной к растворителю. а-Спнралн 5 и 10 находятся на стороне р-слоя, обращенной к Р-слою малого домена.

Междоменная полость образована аминокислотными остатками 45-56 и 311-332. В Рис.12. Лагточка» модель суйьеджмцы.

ней расположена самая длинная спираль an, содержащая 20 аминокислот. Остаток Lys 257, связывающий кофермект, расположен в петле, соединяющей g и f цепи большого домена и обращенной к большому домену соседней субьединицы каталитического димера.

III. 4. Пространственная структура холофермента и локализация центра связывания моновалентного катиона в пространственной структуре холофериента.

Трехмерная структура холофермеига была определена а) с использованием дифрационных данных, полученных для кристаллов апофермента тирозин -фенол-лназы из Citrobacter freundii, вымоченных в стабилизирующих растворах, содержащих пирцдоксаль-Р, трехмерная структура уточнена при разрешении 2.5 А (30); б) пространственная структура холофериента тирозин -фенол-лиазы из £ herbicola решена методом молекулярного замещения с использованием кристаллов холофермеига, полученных из растворов сульфата аммония и трехмерной модели апофермента тирозин • фенол-лиазы из С. freundii; структура уточнена при разрешении 2.7 А (29).

Полость активного центра в каждой из субьединнц образована боковыми группами остатков Т49, D50, S5I и G52, находящимися в петле, соединяющей большой и малый домены; остатками Q98, G99, R100, N1S5, D214, А215, Т216, R217, S254, G255, К256 и K2S7 большого домена, остатками Н343 н R404 малого домена и остатками Y7I и Е286, находящимися в большом домене кристаллографически симметричной субьединицы.

Arg10p,-£

Arg 100 -^ .

Рис. 13. Стереоизображение цоггр» спгцпини» пнриджсаль-Р.

Стереоизображение кофермент-связывающего центра представлено на рис. 13. Он находится в большом домене каждой из четырех субьединнц тетрамера. Альдегидная группа

пиридоксаль-Р образует альдиминную связь с е-аминогруппой остатка лизина активного центра (К257). Кислород З'-окснгруппы образует солевой мостик/водородную связь с боковой группой остатка 11217. Плоскость альдиминной связи и З'-оксигруппа имеют цис-конформацню. Атом азота пиридинового кольца пиридоксаль-Р образует водородную связь/солевой мостик с боковой группой остатка 0214. Атомы кислорода фосфатной группы образуют водородные связи с боковыми атомами и атомами основной цепи остатков ШОО, 8254, 099, ОЬЫ98 и двумя молекулами воды. Одна из этих молекул воды образует водородные связи с оксигруппами остатков У71 и У291, входящими в состав большого домена соседней субьединицы каталитического днмера. Ароматическое кольцо остатка КПЗ прикрывает кофермент со стороны растворителя. Пиридиновое кольцо кофермента вступает в стэкинг- взаимодействие с ароматическим кольцом остатка П23, плоскость которого находится под углом 30° к плоскости кольца кофермента.

Наложение трехмерной структуры апофермента на структуру холофермеита показало, что связывание кофермента приводит к компактизацнн структуры за счет движения малого домена в каждой из субьединиц к большому домену; среднеквадратичное смещение Счх-атомов малого домена при этом сотавляет 1.5 А (29).

Для локализации центра связывания моноваленгных катионов в трехмерной структуре мы настаивали кристаллы апофермента с хлоридами калия и цезия, перекося кристаллы из растворов сульфата аммония в растворы монометилового эфира полизтиленгликоля 5000, содержащего катионы КС! и СвС!. При этом стабилизирующие растворы содержали также и пиридоксаль-Р, что

Рис. 14. Стереоюобрюгеиие центра связывания катиона Са* « одной (А) т субьединиц каталстпеского (АВ) днмера.

позволило локализовать центр связывания моновалскгиых катионов в структуре холофермента.

Место связывания катиона в трехмерной структуре холофермента тирозин - фенол-лиазы было определено по разностным картам электронной плотности, полученным для кристаллов холофермента, содержавших и К* (30). В каждой из четырех субьединиц тетрамера найден один центр связывания моновалеитного катиона. Моноваленгный катион связывается в полости между двумя субьединицами каталитического димера. На рис 14 представлено связывание катиона в отдельной субьединице. Координационное число катиона равняется семи. В каждой из субьединиц лигандами являются атомы кислорода основных цепей остатков 052 и N262, три молекулы всмы и атомы кислорода основной и боковой цепей остатка £69, принадлежащего соседней субьединице в каталитичском димере. Лнганды не образуют правильную геометрическую структуру, а расположены вокруг катиона произвольно. Самый короткий контакт образуется с атомом кислорода боковой группы остатка Е69, принадлежащим соседней субьединице каталитического димера. В координации катиона участвуют остатки, принадлежащие к различным элементам структуры субьсдиннцы: остаток 052 находится в области (р-поворот), соединяющей большой и малый домены; остаток N262 находится в большом домене. Расстояние от катиона до ближайшего атома кофермента (0Р2) составляет около 8А, до атома N1 пирцдоксаль-Р - около 15.5 А; до атома С4* альдимика - 11.5 А. Расстояние между двумя катионами в каталитическом димере составляет 17.7 А. Помимо прямых контактов с аминокислотными остатками - лигандами, катион, через цепочки водородных связей, вовлечен во взаимодействие с остатками К256 и фосфатной группой пиридокскль-Р. Остаток К256, предшествующий в полипептидной цепи кофермснг-связывающему остатку К257, образует водородную связь С молекулой воды - лигандом катиона. Кроме того, атом азота боковой группы К256 образует водородную связь с атомом кислорода второй молекулы воды, находящейся в активном центре и эта молекула, в свою очередь, связана водородной связью с одним из атомов кислорода фосфатной ручки кофермента.

Характер координации моновалентного катиона, найденный в тирозин - фенол-лиаэе, позволяет сделать некоторые предположения о структурных основах влияния моновалентных катонов на тирозин - фенол-лиазу. Поскольку в связывании катиона в каждой из субьединиц каталитического димера участвуют обе субьединицы, моновалентный катион может обеспечивать такую взаимную ориентацию субьединиц в каталитическом димере, которая оптимальна для катализа. Остаток в52 находится в петле, соединяющей большой и малый домены. Замена катиона-активатора К* на катион-ингибтор N4* может приводить к нарушению оптимальной для катализа ориентации доменов в субьединице. Катион опосредованно связан с фосфатной группой

кофсрмента, поэтому замена катиона К* на 14а* или ЬГ, имеющие меньший ионный радиус, может приводить к изменению имеющейся в связывании кофермента сети водородных связей и влиять таким образом на ориентацию кофермента. Изменение координационной сферы при переходе от К* к Иа* или и* может влиять на кокформацию остатков активного центра К256 и У71 (последний в полилептидной цепи отстоит на два остатка от 069), что, а свою очередь, может изменять информацию и других остатков активного центра.

Исследования роли моновалентных катионов а пирндоксаль-Р-зависимом катализе начали развиваться недавно. Для понимания этой проблемы необходимы новые биохимические н структурные данные.

Ш.5. Кристаллизация и структурные исследования фермент-икгнбнториых комплексов тирозин - фенол-лиазы.

Для моделирования структуры ферменг-субстратаых комплексов на стадиях комплекса Михаэлиса и внешнего альдимина получены кристаллы комплексов холофермснта с 3-(4'-гидроксифешш)пропионовой кислотой и К-(5'-фосфопиридоксил)-1^гарозииом. Первый комплекс можно рассматривать как модель комплекса Михаэлиса. Второе соединение при связывании с апоферментом может моделировать стадию внешнего альдимина.

III.5.1. Кристаллы комплекса тирозин - фенол-лиазы из С. ГгеишШ с 3-(4'-гндрокснфенш])лролноновсй кислотой были получены методом свободной диффузии паров осадителя в раствор белка. В качестве осадителя использовали растворы монометилового эфира полиэтиленглкколя 5000 в присутствии хлоридов К или Сб. Кристаллы имели призматическую форму, как и кристаллы апофермента, принадлежали к той же пространственной группе (Р2|2|2),

Рис. 15. Стереоизображение евхиывания ЗЧ4'-гидроа:сифенил)проаио1ЮвоЯ кислоты в активном центре. Осгти аминокислот, принадлежащие соседней с^бдединицс каталитического димера, помечены звездочкой.

имели параметры элементарной ячейки з=135.07 А, Ь=143.91 А, с=59.80 А и содержали две субьединицы в независимой части элементарной ячейки (12).

Пространственная структура комплекса определена в лаборатории структурных исследований белков университета г. Йорк (Великобритания) методом молекулярного замещения, в качестве модели использовали пространственную модель холофермекта. Модель комплекса была уточнена при разрешении 2.5 А (12, 31). На рис. 15 показано связывание 3-{4'-гидроксифеиил)пропионовой кислоты в активном центре фермента. Карбоксильная группа ингибитора связывается в активном центре, образуя водородную связь /солевой мостик с боковой цепью остатка Я404. Выше обсуждалось что связывание ингибитора контролируется группой фермента с рК=8.4. Очевидно, что это значение рК остатка {{404. Гидрофобный харман

субсграт-связывающего центра образован боковыми группами остатков, принадлежащих к двум субьединицам (А и В) каталитического димера: К448, Р449 (А), У283 (А), М288(В), М379 (А), Р123 (А), "6 (А)

Расстояние от С-а атома квазнсубстрата до С-4' атома пирндоксаль-Р составляет 4.3 А и его геометрия такова, что а-амияогрупла, если вписать ее в структуру, может образовать внешний альдимин с альдегидной группой коферменга. Боковая аминогруппа лизина активного центра (К257) находится на расстоянии 4.6 А от атома водорода С-а-атома ингибитора. Это позволило нам предположить, что остаток лизина активного центра является основанием, акцептирующий С-а-протои во внешнем альднмнне. Остаток У71, принадлежащий соседней субьсдишше, находится на расстоянии 3.1 А от СГ атома фенольного кольца ингибитора. Как обсуждалось выше, элиминирование фенольного фрагмента проходит стадию его таугомеризащш в цнклогексадиенон, при этом прогон присоединяется в положение С Г. Структурные данные позволили нам предположить, что остаток У71 может рассматриваться как кандидат на роль кислотного остатка, отдающего прогон С1 '-атому фенольного радикала перед его элиминированием. Результаты исследования мутаитной формы У7№ будут обсуждены ниже.

Таутомеризация фенольного фрагмента в цнклогсксадиеноиовый должна проходить при участии основной группы белка с рК £ 8.2, абстрагирующей протон фенольного гидроксила. В. трехмерной структуре комплекса на расстоянии 4.1 А от фенольного гидроксила ингибитора находится атом азота гуанцдиновой группы остатока аргинина 381. В ближайшем окружении фенольной оксигруппы, помимо остатка Я381, находятся боковые труппы остатков Т124, М288 и РА448, т.е. боковая группа остатка Ю81 находится в довольно гидрофобном окружении. На расстоянии 4.1 А от гунидиновой группы 11381 находится боковая заряженная группа остатка 11404. Таким образом, ближайшее окружение остатка 11381 может приводить к понижению рК

этого остатка. Мы предположили, что остаток R381 может участвовать в катализе на стадии элиминирования фенол ьного фрагмента в качестве основной группы, акцептирующей прогон от фенольного гндрокенла. Результаты исследования мутанта ых форм, содержащих замены остатка R381, будут обсуждены ниже.

III.S.2. Кристаллы комплекса тирозин - фенол-лнвзы с ?Ц5'-фосфопиридокснл)-Ь-тирознном получали сокрнсталлизацией апофермента тирозин - фенол-лиазы из £ herbicola с N-(5' -фосфопиридоксил)-Ь-ттфозииом. В качестве осадителя использовали 18-23% раствор монометипового эфира полиэтиленгликоля 5000, содержавшего 1.1-1.2 М KCl. Орторомбическне кристаллы комплекса (пространственная группа Р2|2121) имели параметры элементарной ячейки а—111.8 А, b= 158.3 А, с=202.4 А и содержали две молекулы (восемь субьединиц) в независимой части элементарной ячейки (3).

Пространственная структура комплекса была решена методом молекулярного замещения с использованием в качестве модели координат холофермента тирозин - фенол-лиазы из F.. herbicola. Структура была уточнена при разрешении 2.0 А (29). Эта работа была выполнена в Институте кристаллография РАН совместно с лабораторией структурных исследований белков Университета г. Йорк (Великобритания).

дюкра, помечен звездочкой.

В независимой части элементарной ячейки присутствуют два тетрамера. Для дальнейшего обсуждения они обозначены как АВСО и ЕРбН и состоят из каталитических димеров АВ и Сй в одной молекуле и ЕР и ОН во второй молекуле. В каждой молекуле квазнсубстрат присутствует в двух конформациях. Кон формация его в субьединице В (Н) отличается от конформацни в

остальных трех субьединицах тетрамера. Эти конформации далее будут именоваться как 1 и П соответственно. На рис. 16 представлено стереоизображение комплекса в субьединице В (Н). Плоскость фенольного кольца ингибитора в конформации I практически перпендикулярна плоскости пиридинового фрагмента. В конформации Q угол между ними составляет 23.2°. Такое различие обусловлено различием торсионных углов C4'-N-C-a в двух конформадиях. Для отрыва протона от С-а атома связь С-а-Н во внешнем альднмине тирозин - фенол-лиазы должна быть перпендикулярна указанной плоскости. Этому требованию удовлетворяет кон формация I квазисубстрата, в конформации П связь C-«l-H располагается под углом 22° к плоскости кольца кофермента. Далее рассматриваются данные для конформации I.

Карбоксильная труппа квазисубстрата, как и в случае комплекса з 3-(4'-гидроксифснил)пропионовой кислотой, фиксирована за счет солевого мостика с остатком R404. . Плоскость пиридинового кольца кофермента повернута на 22.5° вокруг связи С5-С5' в сторону выхода из активного центра по сравнению со своим положением в холоферменте. При этом в комплексе образуется новая водородная связь между кислородом З'-ОН группы кофермента и амкдной труппой остатка N185. В структуре хииоидного комплекса тирозин - фенол-лиазы (неопубликованные данные) ориентация пиридинового кольца кофермента совпадает с его ориентацией в комплексе с N-(5 '-фосфопиридоксил^-Ь^гирозином.

Таким образом, для тирозин - фенол-лиазы, как и для асоартатаминогрансферазы, образование внешнего альдимнна сопровождается реориентацией кофермента в основном за счет вращения вокруг связи С5-С5'.

Боковая группа остатка лизина (К257) активного центра в комплексе находится на расстоянии водородной связи от гцдроксильной группы остатка S51, расстояние Е-аминогруппы остатка К257 от С-а-атома квазисубстрата составляет 2.81 А; t-аминогрупла К257 расположена над С-а-Н протоном N-{5 '-фосфопиридоксил)-1^гирозина. Можно полагать, что ^-аминогруппа К257 является основанием, акцептирующим С-а-протон во внешнем альдимине.

Оксигруппа остатка Y71 находится на расстоянии 3.09 А от атома СГ фенольного кольца. Гидроксильная группа квазисубстрата располагается между боковыми группами остатков R381 и Т124, расстояние между ней и атомом азота остатка R381 составляет 4.86 А. Гидрофобный карман активного центра образован остатками, описанными для комплекса тирозин - фенол-лиазы с 3-(4'-гидрок£ифенил)пропноноаой кислотой.

Четвертичная структура тетрамера в целом соответствует структуре тетрамера холофермекга. Субьединица В (Н) отличается от субьединиц ACO (EFG) относительным расположением большого и малого доменов по сравнению с их расположением в холоферменте, в

субьсдиннцах ACO их расположение совпадает с расположением в холофсрменге. В субьедннице В смешение G-a-атомов малого домена по направлению к большому по сравнению с их относительным расположением в холофсрменте составляет 3 А. Это приводит к изоляции активного центра от растворителя. В комплексе тирозин - фенол-лиазы с 3-(4'-пцфоксифенил)пропноковой кислотой мы не наблюдали захрытой конформации субьединиц. Сближение малого и большого доменов в комплексе тирозин - фенсш-лиазы с N-{5'-фосфопиридоксил>-Ь-тирозином наблюдается только для двух (В и Н) субьединиц из восьми, присутствующих в элементарной ячейке кристалла. В кристаллической решетке наиболее близкие контакты образуются именно малыми доменами субьединиц В и Н. Таким образом, найденная в них закрытая конформация может быть следствием кристаллической упаковки молекул а не образованием фермент-ингибиторного комплекса. Для выяснения этого вопроса необходимо получить кристаллы комплекса с другой кристаллической упаковкой молекул.

В целом структура фермент-квазисубстратного комплекса в конформации I может рассматриваться как удовлетворяющая стреохимичоским требованиям модель внешнего альдимина тирозин - фенол-лиазы.

Сравнение пространственных структур пиридоксаль-Р-завнсимых ферментов, проведенное в главе "Литературный обзор", показало, что малые домены различны во всех пространственных структурах пиридоксаль-Р-завнсимых ферментов. Анализ субсграт-связывающего участка а двух фермент-ингибиторных комплексах тирозин - фенол-лиазы показывает, что большинство участков, образующих гидрофобный харман для субстрата (F448, F449, М379, F36) а также остаток R404, связывающий карбоксильную группу субстрата и остаток R381, взаимодействующий с оксигруппой тирозина, расположены в малом домене. Малый домен, таким образом,. можно назвать субстратсвязывающим. Это объясняет различие в пространственной организации малых доменов тирозин - фенол-лиазы н аспартатаминотрансферазы. Можно ожидать, что, по мерс появления данных о структурах пнрндоксаль-Р-зависимых ферментов, малый домен будет классифицирован как субстратсвязывакнций для всех ферментов этого семейства.

IV. Исследование мутянтных форм тирозин - фенол-лиазы.

Определение пространственных структур холофермепта и фермент-ингибитор ных комплексов позволило нам применить метод сайт-направленного мутагенеза для исследования роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фермента. Нами были получены н исследованы мутантные формы, содержащие замены остатков тирозина 71 и аргинина 381.

Мы получили н исследовали мутантную форму тирозин - фенол-лиазы, содержащую замену остатка У71 на фенилаланин (32). Стационарные кинетические параметры мутантной формы представлены в табл. 6.

Таблица 6

Стационарные кинетические параметры фермента дикого типа и мутантной формы У71Р

фермент дикого типа мутантный фермент

Субстрат кт с1" К-, мМ ЮК» М'1 с' к», с'1 к., мМ к*«\ Кш М"1 с'1

тирозин 3.5 0.20 1.8x10* <1.3x10'5

Б-этил-цистеин 3.9 6.6 5.9х10г глхю-1 0.30 0.72

в-метил-цисгеин 0.9 3.4 2.8x10* 3.8x10"* 0.52 0.72

5-бензил-цистеин 0.5 0.2 2.7x10* 1.2x10" 0.05 2.4

БОРС* 5.1 0.10 4.6Х104 0.25 0.16 1.6x10*

Р-хлор-аланин 0.7 2.0 3.5x102 0.053 3,2 16.4

О-бензоил, серии 8.3 2.9 гэхю5 0.15 0.8 1.9Х103

•БОРС - 5 -о-нитрофенил-Ь-цистеии

Мутантная форма практически неактивна в реакции р-элимяннрования [.-тирозина, скорость реакции в этом случае понижена в 10' раз по сравнению с диким типом. Для Б-алкилцисгеииов величины ко, и Км понижены по сравнению с диким типом в 105-104 и ЮМО3 раз соответственно. При этом величина Км для этих субстратов понижалась (улучшалась) приблизительно на порядок по сравнению с ферментом дикого типа. В случае субстратов, содержавших хорошую уходящую группу в р-положении - р-хлораланнна, Б-о-ннтрофенид-Ь-цистсина, 0-бснэоил-Ь<срина, скорость реакции составляла 2-7% по сравнению со скоростями для фермента дикого типа, а параметр к„/Км понижался в 16^30 раз. Спектры поглощения и кругового дихроизма мутанта свидетельствовали о том, что замена остатка тирозина на фенилаланин не приводила к изменению конформации кофермент-связывающего центра. Мутантный фермент образовывал хиноидный комплекс при взаимодействии с Ь-тирознном, Ь-фенилалакином и Б-алкилцнетеинами (рис. 17). Исследование пред стационарной кинетики образования хинондного

Рис. 17. Спестры поглощения комллега ыупвпжго фермента с $-этмл-Ыдкгеином, сюшс с интервалом в 0.5 минут. Первый акхтр сип через 0.5 кинут после смешивания фермагта и субстрата.

комплекса для ряда аминокислот показало, что этот процесс описывается двумя экспонентами - быстрой, имевшей низкую амплитуду н медленной, амплитуда которой была в 70 раз выше амплитуды быстой фазы. Для обеих фаз зависимость скорости от концентрации Ь-фснилаланнна и 5-метнлцистенна имела гиперболический характер. Оба процесса описывались уравнениям скорости реакции первого порядка:

1Л = ЦЩК,+Ь) +к,(1),

где кг - константа скорости отрыва С-а-протона, к, - константа скорости возврата С-а-протона. Константы скорости быстрой фазы не зависела от концентрации кофермента, константы скорости медленной фазы увеличивалась с увеличением концентрации пирццоксаль-Р. Амплитуда быстой фазы увеличивалась с увеличением концентрации пиридоксаль-Р, амплитуда медленной фазы уменьшалась с увеличением концентрации пиридоксаль-Р. Данные прсдстапионлрной кинетики образования хинондного ингермедиата представлены в табл. 7. Мы смогли определить константы скорости быстрой фазы для Ь-фенилаланииа и для Б-метилцистси на, для остальных субстратов это было невозможно ввиду высоких скоростей и низких значений амплитуд. Дм этих субстратов в табл. 7 приведены константы скорости медленной фазы, которые совпадали для всех субстратов.

МБ] РЬР

Е-Р1Л? Т, ЕСТ

к-1 Л 8

к4[РЬР] к^

к5(РЬР1

кз

Е<5

Таблица 7

Пред стационарные кинетические параметры фермента дикого типа и мутантной формы У7\?

Аминокислота фермент дикого типа мутантная форма

к* мМ кг, с"1 К, с1 К* мМ кг, с1 К с1

3-фтор-тирозин 0.8 140 6.9 1.9 3.0с 8.8x104

[а-2Н]-3-фтортирозин 0.3 23 9.5 1.9 2.9Х10"3 9.1x1а4

З-этилцистеин 4.9- 59 3.9 10.3 3.1х104 1.5х103

Б-метил-цистеин 21.6 28 1.4 29.0 12.6 0.7

й-мстил-цистеии, медленная фаза 6.9 1.3x10° 9.6x10-*

Б-бензил-цистеин 1.8 41 4.2 0.5 1.5x10"' 6.7Х10-4

фенилаланин 17.4 13 5.1 20.5 10 1.0

фенилаланин, медленная фаза 3.0 4.0Х10! 1.7х105

Константы скорости быстрой фазы кг к к, для Ь-фенилаланина и 5-метилцнстсина совпадали с константами скорости отрыва кг и возврата к, С-а-протона для фермента дикого типа и превышали величину кт. (табл. 6) реакции ^-элиминирования всех субстратов. Быструю стадию, таким образом, следует отнести к стадии образования хиноидного интермедиата.

Взаимодействие мутантной формы с ингибиторами и субстратами может быть описано схемой I. Этот процесс включает пять стадий, следовательно, описывается четырьмя временами релаксации. Два времени релаксации, связанные со связыванием субстрата, как мы полагаем, являются слишком быстрыми н не прявляются в эксперименте. Быстрая фаза отражает релаксацию между внешним альдимином Е(РЬР)3 и хиноидным производным Совпадение констант скорости и констант диссоциации быстой фазы в реакции с Ь-фенилаланином н З-метнлцнстеином для фермента дикого .типа и для мутантной формы свидетельствует о том, что замена остатка У71 не влияет на стадии связывания субстрата и образования хиноидного производного. Медленная фаза должна отражать релаксацию между апоферментом и холоферментом и между субстратом, : связанным с холоферментом и субстратом, связанным с апоферментом.

Используя для скорости реакции уравнение

1Л = 1ч[РЬР]к2/(5 +к2) + 1с4к,) + к5[РЬР]8/(8+к2) + +к.58/(1+кэ/к.,)5 -Ис|

и данные о зависимости скоростей медленной фазы от концентрации 5- метнл-Ь-цистеина, мы получили, что величина К^ для РЬР в отсутствие субстрата составляет 117 тМ, в его присутствии -43 шМ. Определенная ранее нами методом спектрофотометр ического титрования константа диссоциации кофермента составила 5.8x10"' М (5). То есть, мутация приводит к ухудшению константы связывания кофермента на три порядка по сравнению с диким типом. Соотношение констант скорости отрыва прогона, кг для 3-фтортирозииа его дейтсрированного аналога (табл .6) практически равно единице. Это предполагает, что скорость-лимнтирукхцей стадией для медленной фазы в образовании хиновдного интермедиата не является отрыв а-протона. Константы скорости для медленной фазы в для всех субстратов зависали от концентрации пиридоксаль-Р. Следовательно, медленная стадия должна включать стадию связывания кофермента. Поскольку констаты скорости хак для медленной стадии и так и для стадии отрыва протона в реакции в-алкилцистеинов значительно превышали значения величин к«, для этих субстратов, следует полагать, что скорость-лимнгтируюшей стадией для мутантной формы является является стадия элиминирования уходящей группы и остаток У71 принимает участие в обеспечении этой стадии.

В случае аспартатаминотрансферазы остаток тирозина 70 не участвует в катализе, а принимает участие в связывании кофермента. Полученные нами результаты свидетельствуют, что структурно консервативные остатки пнрндоксаль-Р-зависимых ферментов могут иметь различные функции. Возможная роль остатка тирозина 71 в механизме действия тирозин - фенол-лиазы будет обсуждена ниже.

Вторым остатком, для которого были получены мутангные формы, был выбран остаток аргинина 381. В пространственных структурах комплекса тирозин - фенол-лиазы с 3-(4'-гидроксифенил)пропионовой кислотой и с N-(5 '-фосфопиридокснл)-Ь-тирозином, как обсуждалось выше, этот остаток является единственной группой вблизи от гидроксильной группы фенольного кольца ингибиторов, потенциально могущей являться основной группой, акцептирующей протон от л-гидроксильной группы субстрата на стадии элиминирования ароматического фрагмента.

Для исследования роли остатка Я381 мы получили н исследовали мутантные формы, содержащие замену аргинина 381 на алаиин, валин и изоленцин (12). Спектры поглощения и кругового дихроизма мутантных холоферментов несущественно отличались от спектров

холофсрмекта дикого типа, т.е., мутации не влияют на конформацию активного центра. Стационарные параметры взаимодействия мутантных форм с рядом аминокислот приведены в табл. 8.

Таблица 8

Стационарные кинетические параметры мутантных форм с заменой остатка аргинина 381

Субстрат днхий тип Ю81А- 113811 Я381У

к» с'1 кга/К. М-'с1 с"' М-'с"' с"1 к.„/К. М'с-1 к» с" кюй/Км М'с'

ЭОРС 9.7 3.6x10 4 " 2.1 3.1x10 4 0.46 2х104 9.7 1.0x10 5

тирозин 2.2 8.0x10 ] 2x10"* 0.48 1х10'5 1x10'3 1х10'5 Ш0"3

й-мстил-цистенн 0.9 2.8x10 з ЗхШ2 2.5x10 3 0.2 1.2x10 2 0.67 1.3x10 4

5-этил-цистснн 1.7 7.4x10 2х10'3 2.4x10 3 0.19 24 0.61 6.1x10 з

О-бензоил серии 3.9 3.3x10 з . 1Х10"1 3.2x10 3 0.68 2.7x10 1 2.5 7.8x10 3

Р-хлор аланин 3.0 1.8x10 э 2.5x10 2 8.6x10 4 0.76 4.5x10 } 0.84 2.7x10 3 ,

Мутантныс формы Я381У, Ю8Н не катализируют реакцию р-элиминирования Ьтирозииа, для мутантной формы ВД81А величина к«« на четыре порядка ниже величины кс* фермента дикого типа. В случае субстратов, содержащих в р-положении хорошую уходящую группу - Б-о-нитрофенил-Ь-цисгениа, Д-хлораланина, О-бенэоил-Ь-серина, величины к^, и кем /Км для мутантных форм были сопоставимы с соответствующими параметрами фермента дикого типа. Мутантныс ферменты катализировали расщепление $-алкилцнстеинов (табл.8). Ингибиторы фермента дикого типа конкурентно ингибировали мутантныс формы К381А и 113811 и константы ингнбирования для мутантной формы были сопоставимы с константами для дикого типа. Дня мутантной формы 11381А была исследована рН-зависнмосгь реакции р-элиминировання Ь-тирозина. Скорость рсаккцнн незначительно уменьшалась с понижением рН от рН 8.36 до рН 6.60 (табл.9).

Таблица 9

Влияние рН на активность мутантных ферментов

рН Я381А фермент дикого типа

М' с'1 к»., с1 М'1 с"1

6.60 2.3x10* 0.46 3.5 6.53x10'

7.70 2.0x10'* 0.46 3.5 4.56хЮ3

8.36 б.ОхЮ4 1.8 3.5 1.3x10"*

Из литературных данных известно, что для фермента дикого типа в рН-профиле км/Км имеются две основные группы с рК в районе 7.)?. Это предполагает 200-кратное уменьшение параметра к„Жм при переходе от рН 8.36 к рН 6.60; отсутствие зависимости скорости реакции от величины рН для мутантных ферментов свидетельствовало о том, что остаток Ю81 является одной из основных групп, лроявляющхся в рН-профиле ферметна дикого типа.

Спектрокинегическме исследования комплексов мутантных форм с Ьтирозином (рис. 18) показали, что мутантные формы были способны катализировать отрыв С-а-протона у природного субстрата. Константа скорости образования хинондного интермедиата для трех мутантных форм (70 с'1) были близки к константе скорости отрыва С-а-протона для фермента дикого типа.

Совокупность полученных данных свидетельствовала о том, что остаток ИЗ 81 принимает участие в обеспечении стадии элиминирования ароматического фрагмента.

у

-4.1 0.« 0.1 0.4 9Л 6.4 0.? О К 0 9

Рис. 18. Изменения в полосе поглощения хинондеюго юггерыедизта 500ни) при вэаимодйсгвии фермента дикого типа (сплошная линия) и муштгных форм Я381А (точки к таре) и Ю811 (тире). На оси абсцисс указано время в секундах.

1,-Туг ♦ Е

^ "\N-Ly8257

И.Р

Р1Р

ОН

СНзСОСООШ,*

Р1Р

* :ЫЧ.у«257

Рис. 19.

+ /:М-Агв381

/Л

Р1Р

Химический механизм реакции р-элимкнировання Ьтирозииа, основанный на полученных нами результатах, представлен на рис. 19. Внутренний альдимин в холоферменте образован остатком лизина 2£7. Образование внешнего альдимина субстрата сопровождается высвобождением этого остатка. Основанием, отрывающим С-а-протон во внешнем альдимнке, вероятнее всего, является £-аминогруппа лизина 257. Для образования циклогсксадиенонового таутомера фенола перед его элиминированием, необходим катализ как основной группой (акцептирование протона фенольного гидроксила) так к кислотной группой (протонорованис СГ-атома фенольного кольца). Общин кислотный катализ осуществляется гндрокскльной группой остатка тирозина 71, которая переносит протон а С1 '-положение фенольного фрагмента. Основной группой, способствующей диссоциации протона фенольного гидроксила. является остаток аргиниа 381. Эгогг же остаток может отдавать проток фенольной группе после ее отщепления. Частичный перенос протона С-а-протона к уходящему фенольному фрагменту, показанный для фермента,

может быть объяснен тем, что протоннрованная (после отрыва С-а-протона ) е-аминогруппа лизина 257 может отдать его остатку тирозина 71. Тогда во время следующего каталитического акта этот протон частично перейдет в положение С Г фенольного кольца. Представленная схема удовлетворительно объясняет имеющиеся данные о механизме действия тирозин - фенол-лиазы.

ВЫВОДЫ

I. Исследованы физнко-хнмнческне характеристики тирозин - фенол- лназы:

1) Определены: молекулярная масса, количество субьединиц, N- н С-концсвые аминокислоты,

изоэлектрическая точка белка. Показано, что в тетрамерной молекуле субьединицы химически

f

идентичны и каталитически компетентны.

2) Ген тирозин - фенол-лиазы из С. freunäii клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli; аминокислотная последовательность белка определена, по структуре кДНК и подтверждена определением аминокислотных последовательностей пептидов бромцианового гидролизата белка.

положение 257 в аминокислотной последовательности фермента.

II. Исследованы каталитические характеристики фермента: 1) Иссследовано влияние моновалеигных катионов на каталитические и спектральные характеристики фермента.

Установлено, что моновалентные катионы являются неконкурентными активаторами тирозин -фенол-лиазы. Показано, что моновалентные катионы влияют на соотношение скоростей основной и побочной реакций, катализируемых ферментом и таугомерное равновесие кетоенамин-енолимии "внутреннего" альдимина холофермента.

2} Показано, что тирозин - фенол-лиаза вступает в реакцию побочного трансаминнрованих н определены кинетические параметры этой реакции для рада субстратов и ингибиторов.

3) Исследовано взаимодействие фермента с рядом субстратов и ингибиторов. Установлен вклад отдельных фрагментов L-тирозина в эффективность его связывания.

III. Установлены принципы пространственной организации молекулы фермента:

1) Найдены условия получения кристаллов апофермента и холофермента тирозин - фенол-лиазы из С. freundii и Erwinia herbicola, пригодных для рештеноструктурного анализа.

2) Пространственные структуры ало- и холофермента тирозин - фенол-лиазы из С. frrundii определены и уточнены при разрешении 2.3А и 2.5А при участии диссертанта.

3) ГТространсгвенные структуры ало- и холофермента тирозин - фенол-лиазы из £ herbicola определены и уточнены при разрешении 2.3А и 2.5А при участии диссертанта.

Установлено, что тетрамер фермента организован из двух каталитических димеров, в каждом из которых активные центры образованы остатками обеих субьеднниц. Идентифицированы аминокислотные остатки фермента, принимающие участие в связывании кофермста, субстрата, моновалентного катиона-активатора, в субьединичных взаимодействиях.

ГУ. Установлены структурные закономерности механизма действия фермента:

1) Найдены условия получения кристаллов ферменг-ннтнбиторных комплексов тирозин - фенол-лиазы с 3-(4'-гидроксифенил)пропионовой кислотой и >Нпиридоксил-5'-фосфат)-Ь-тнрозино«, моделирующих элементарные стадии реакции ^-элиминирования.

2) Пространственные структуры фермент-ннгибиторных комплексов тирозин - фенол-лиазы с 3-{4'-гидроксифенил)пропионовой кислотой и Ы-(гтрвдоксил-У-фосфат)-Ь-тирозином определены и уточнены при разрешении 2.7А и 2.0 А соответственно при участии диссертанта.

3) Анализ пространственных структур позволил идентифицировать аминокислотные остатки фермента - возможные кандидаты на роль каталитических остатков.

4) Получены и исследованы мутантные формы фермента, содержащие замены остатков Туг71 н Axg3Sl. Установлено, что эти остатки принимают участие в обеспечении стадии элиминирования фенола в реакции ß-элиминирования L-тирознна, катализируемой тирозин - фенол-лиазой.

V. На основании полученных результатов предложен механизм реакции ß-алиминировання, катализируемой тирозин - фенол-лназой.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фалеев, Н.Г., Садовникова, М.С., Антонова, Т.В., Демидкнна, Т.В., Филина, Г.С., Беликов, В.М. Штамм бактерий Citrobacter intermedias - продуцент тирозин - фенол-лиазы. Авторское свидетельство N 1441780, 1989, Москва.

2. Демидкииа, Т.В., Мягких, И.В., Фалеев, Н.Г., Беликов, В.М. Выделение н некоторые свойства тирозин - фенол-лиазы нз Citrobacter intermedias. Биохимия, 1984, т. 49, с. 32-36.

3. Pletnev, S.V., Isupov, M.N., Dauter, Z... Wilson, K.S., Falcev, N.G., Harutyunyan, E.H. and Demidkina, T.V. Purification and crystals of tyrosine phenol-lyase from Erwinia herbicola. Biochemistry and Molecular Biology International, 1996, v. 38, p. 37-42.

4. Faleev, N.G., Spirina, S.N., Ivoilov, V.S., Demidkina, T.V, and Phillips, R.S. The catalytic mechanism of tyrosine phenol-lyasc from Erwinia herbicola: the effect of substrate structure on pH-dcpendence of kinetic parameters in the reactions with ring-substituted tyrosines. Z. Naturforsch., 1996, v. 5 le, p. 363-370.

5. Казаков, В.К., Мягких, И.В., Тарусина, И.И., Демндкина, Т.В. Идентичность субьединиц тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedius. Биохимия, 1987, т. 52, с. 11319-1323.

6. Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V. Structural and catalytic properties of Citrobacter intermedius tyrosine phenol-Iyase. In: Biochemistry of Vitamine B6. Basel/ Switzerland, Birkhauser Verlag, 1987, p.221-225.

7. Antson, A.A., Demidkina, T.V., Gollnick, P., Dauter, Z... Von Tersh, R.L., Long, J., Bereznoy, S.N., Phillips, R.S., Harutyunyan, E.H., and Wilson, K.S. Three dimensional structure of tyrosine-phenol-lyasc. Biodsm., 1993, v. 32, p. 4195-4206.

8. Antson, A.A., Demidkina, T.V., Gollnick, P., Dauter, Z.,. Von tersh, R.L., Long, J., Bereznoy, S.N., Phillips, R.S., Harutyunyan, E.H., and Wilson, K..S. Three dimensional structure of tyrosine phcnol-lyase. GenBank, 1993, accession Number L10821.

9. Фалеев, Н.Г., Рувкнов С Б., Бахмутов, В.И., С Б., Демндкина, Т.В., Мягких, И.В., Беликов, В Ы. Субстратная специфичность тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedius. Электронный и сгсрнческий контроль на стадии отщепления ароматического фрагмента. Мол. Биол., 1987, т. 21, с. 1636-1644.

10. Фалеев, Н.Г., Рувинов, С.Б., Бахмутов, В.И., С.Б., Демндкина, Т.В., Мягких, И.В., Беликов, В.М. Ззаимодействие тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedius с аминокислотами и их пронзводнымифактроы, определяющие эффективность связывания. Мол. Биол., 1988, т. 22, с. 371381.

11. Faleev, N.G., Ruvinov, S.B., Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V., Gololobov, M.Yu., Bakhmutov, V.l., Belikov, V.M. Tyrosine phcnol-lyase from Citrobacter intermedius. Factors controlling substrate specificity. Eur J. Biochem, 1988, v. 177, p. 395-401.

12. Sundararaju, В., Antson, A. A, Phillips, R. S. Demidkina, Т. V., Barbolina, M. V. , Gollnick, P. Dodson, G. G., and Wilson, K. S. The crystal structure of Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyase cornpfexed with 3-<4'-hydroxypheayl)propionic acid, together with site-directed mutagenesis and kinetic analysis, demonstrates that Arginine-381 is required for substrate specificity, Biochemistry, 1997, v. 36, p. 6502-6510.

13. Faleev, N.G., Ruvinov, S.B., Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V.GoloIobov, M.Yu., Bakhmutov, V.l., Belikov, V.M. The substrate specificity of tyrosine phenol-lyase during the different stages of enzymatic process. In: Biochemistry of Vitamine B6, Basel/ Switzerland, Birkhauser Verlag, 1987, p. 21J-220.

14. Мягких, И.В. и Демндкина, T.B. Влияние моновалентных катионов на физико-химические и кат?гитическис свойства тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedius. Мол. Биол., 1985, т. 19, с. 67 "-578.

15. Demidiana, T.V., Myagkikh, I.V. The activity and reaction specificity of tyrosine phcnol-lyasc regulated by monovalent cations. Biocbimie, 1989, v. 71, p. 565-571.

16. Демидкииа, T.B., Мягких, И.В., Ажаев, A.B., Браунппейн, A.B. Трансаминнпование - побочная реакция, катализируемая тирозин - фенол-лиаэой из Citrobacter intermedins. Мол. Бисл., т. 20, с. 1053-1061.

17. Dcmidkina, T.V., Myagkikh, I.V., Azaycv, A.V. Transamination catalysed by tyrosine pbeooHyasc from Citrobacter intermedins. EurJ. Biocbem., 1987, v. 170, p. 311-316.

18. Дрмидхина, T.B., Мягких, И.В. Структурно-функциональные исследования тирозин - фенол-лиазы. Биохимия, 1989, т. 54, с. 745-750.

19. Демндаина, Т.В., Мягких, И.В., Малаахкеаич, ВН., Арупонян, Э.Г. Кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное исследование тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedins. Кристаллография, 1988, т. 33, с. 1292-1293.

20. Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V., Antson, A.A., Hanityunyan, E.G. Crystallization and crystal data on tyrosine pbenol-lyase. FEBS Lett., 1988, v. 232, p. 381-382.

21. Шерман, М.Б., Антсон, А А, Орлова. Б.В., Зограф, O.H., Демндаина, T.B. Электронная спектроскопия тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedins. Докл. АН СССР, 1990. т. 312, с.1256-1258.

22. Antson, A.A., Demidkiaa, T.V, Zograf, O.N., Oriova, E.V., Harutyunyan, EÄ and Sbetraan, M.B. Crystallization of tyrosine phcnol-Iyase from Citrobacter intetmedius. Electron microscopy of tubes. In: Enzymers dependent on pyridoxal phosphate and other cailxxiyl compounds, Oxford. Pergamon Press,

p. 301-303.

23. Антсон, A.A., Строксрытов, Б.В., Муршудои, ГЛ., Демидкииа, Т.В., Фогельман, Н.К., Пасхина, О.Г., Хеннинг, М., Некрасов, Ю.В., Попов, А.Н., Рубинский, С-В., Арупонян, Э.Г. Пространственная структура тирозин - фенол-лназы с разрешением 4.5 А. Кристаллография, 1992, т. 37. с. 82-89.

24. Antson, АЛ., Srtokopytov, B.V.,. Murshudov, G.N, Isupov, M.N., Harutyunyan, E.H., Demidkina, T.V., Vassylycv, D.G., Dauter,Z.,. Тепу, H. and Wilson, K.S. The polypeptide chain fold in tyrosine phenol-lyase, a pyridoxal-5 '-phosphate dependent enzyme. FEBS Lett., 1992, v. 302, p. 256-260.

25. Antson, A.A., Strokopytov, B.V., Dcmidkina, T.V., Nekrasov, Yu.V., Harutyunyan, E.G. X-ray structure investigation of tyrosine phenoHyasc. Acta Cryst, 1990, v. A46 (Suppl), p. C-132.

26. Harutyunyan, E.G., Antson, A.A., Denndkina, T.V., Obmolova, G.A., Tcplyakov, A.I., Schnakerz, К., Wähler, G., Gabibov, A.G., Chendiick, G.V., Wilson. KS., Dauter, Z. X-ray structure investigation of

some pyridoxal-cgntaining enzymes. In: Enzymcrs dependent on pyridoxal phosphate and other carbocyl compounds, Oxford, Pergamon Press, p. 125-127.

27. Demidkina, T.V., Antsoo, A.A., Вегепюу, S.N., Wilson, K. S., and Hawtyunyan, E.H Active site region and intersubunit contacts in three dimensional structure of tyrosine phenol-lyase. In: Modem Enzymology: Problems and Trends, New York, Nova Science Publishers, 1994, p. 111-116.

28. Antsoo, A.A., Demidkina, T.V., Dauter, Z., Harutyunyan, E.G., Wilson, K.S. Three dimensional structure of tyrosine phenol-lyase. Protein Data Bank, 1993, file ltpl.pdb.

29. Плетнев, C.B., Ангсон, A.A., Синнцина, Н.И., футер, 3., Исупов, М.Н., Хурс, Н.И., Фалеев, Н.Г., Внльсон, К.С., Додсон, Г.Г., Демидкина, Т.В., Арутюнян, Э.Г. Кристаллографическое исследование тирозин • фенол-лиазы из Erwinia herbicola. Кристаллография, 1997, т. 42,

с. 877-888.

30. Antson, АА. Dodsor, G.G., Wilson, KS., Pletocv, S.V., Harutyunyan, E.H., and Demidkina, T.V. Crystallographic studies of tyrosine phenol-lyase. In: Biochemistry of Vitamin B6 and PQQ, Basel/Switzerland, Birkhauser Verlag, 1994. p. 187-191.

31. Antson, A A., Demidkina, T.V., Wilson. K.S. Tyrosine phenol-lyase from Citrobacter freundii со—piex with 3-(4'-hydroxyphenyl)propionic acid, pyridoxal-5'-phosphate and Cs* ion. Protein Data Bsei, 1997, file 2tpl.pdb.

32. Chen, H.Y., Demidkina, T.V. and Phillips, R.S. Site-directed mutagenesis of tyrosine-71 to phenylalanine in Citrobacterfreundii tyrosine phenol-lyase: evidence for dual roles of tyrosine-71 as a general acid catalyst in the reaction mechanism and in со factor binding. Biocbem., 1995, v. 34,

p. i2276-12283.