Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

α , β-элиминирование тирозина, катализируемое тирозин-фенол-лиазой

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Барболина, Мария Викторовна

Введение

I. Обзор литературы. Исследования мутантных форм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов

1. Пиридоксаль-5"-фосфат в роли катализатора

2. Изучение мутантных форм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов, полученных методом сайт-направленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, ответственных за макромолекулярную организацию белковой глобулы

3. Исследования мутантных форм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов, полученных методом сайт-направленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, ответственных за связывание кофактора

4. Изучение мутантных форм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов, полученных методом сайт-направленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, ответственных за связывание субстрата

5. Исследования мутантных форм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов, полученных методом сайт-направленного мутагенеза, с заменами аминокислотных остатков, принимающих участие в катализе

6. Изучение мутантных форм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов, полученных методом сайт-направленного мутагенеза, обладающих изменённой реакционной и/или субстратной специфичностью

7. Влияние мутаций, введённых методом сайт-направленного мутагенеза, на поведение белков 53 II. Изучение реакции а,(3-элиминирования тирозина, катализируемой тирозин-фенол-лиазой

1. Введение.

2. Взаимодействие тирозин - фенол-лиазы с аналогами субстрата L-тирозина

3. Роль остатка серина 51 в механизме действия тирозин - фенол-лиазы

4. Роль остатка аспарагина 185 в механизме действия тирозин - фенол-лиазы

5. Роль остатка треонина 124 в механизме действия тирозин - фенол-лиазы

6. Выводы

III. Методы исследования.

1. Выделение одноцепочечной ДНК

2. Проведение сайт-направленного мутагенеза

3. Получение компетентных клеток E.coli TGI

4. Трансформация, компетентных клеток E.coli TGI

5. Выделение двухцепочечной (плазмидной ) ДНК для секвенирования

6. Секвенирование плазмидной ДНК.

7. Получение компетентных клеток E.coli SVS

8. Трансформация плазмидных ДНК в компетентные клетки E.coli SVS

9. Выращивание бактериальных масс, выделение, очистка и характеристика ферментов.

10. Определение белка.

11. Определение чистоты выделенных ферментов.

12. Определение спектров поглощения и кругового дихроизма.

13. Кинетические исследования

14. Синтез изотопномеченых производных 3-F-L-Tyr

Введение Диссертация по биологии, на тему "α , β-элиминирование тирозина, катализируемое тирозин-фенол-лиазой"

Метаболизм аминокислот, один из важнейших процессов, протекающих в клетке, происходит с участием ниридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов. Пиридоксаль-5'-фосфат (ПЛФ) участвует в качестве кофактора в реакциях трансаминирования, а,(5- и ауу-элиминирования, |3- и у-замещения, рацемизации, декарбоксилирования различных аминокислот-субстратов. Обеспечение реакционной и субстратной специфичности каждого отдельного ПЛФ-зависимого фермента осуществляется его белковой частью. Исследования механизмов действия пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов вносят большой вклад в понимание закономерностей, обеспечивающих эффективность связывания субстратов и специфичность ферментативных реакций. Результаты исследования механизма действия ПЛФ-зависимых ферментов интересны также и для применения в биотехнологии, медицине.

Целью настоящей работы явилось изучение реакции а,|3-элиминирования тирозина, катализируемой пиридоксаль-5'-фосфат-зависимым ферментом тирозин - фенол-лиазой (ТФЛ), с помощью сайт-направленного мутагенеза и ингибиторного анализа.

В результате исследований установлена роль остатков активного центра 8ег51, ТИг124 и Азп185 в механизме действия фермента. Показано, что плоское строение а-карбоксильной группы субстрата стабилизирует хиноидный интермедиат, и её связывание в активном центре контролируется одной кислотной группой белка. Полученные результаты использованы для построения детального постадийного механизма реакции а,|3-элиминирования.

Глава I. Обзор литературы. Исследования мутантиых форм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов. 1. Пиридоксальфосфат в роли катализатора.

Семейство витамина В6 включает пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин. В тканях животных и получаемых из них продуктов витамин В6 содержится в основном в виде пиридоксаля, пиридоксамина и их фосфорных эфиров (1).

Альдегидная труппа обратимо реагирует с аминокислотами с образованием оснований

1 но СНО; I I ' ' \ Ч—' / \ .

Протон образует хелатное кольцо и способствует плоскостной конформации , шиффова основания.

Наличие -ОН-группы по \ (^у ' О I/ \| соседству с -СНО-группой 'с;1 ---------------------------

•осфатная "ручка"

По СН3 повышает каталитическую активность.

Сильный электроноакцептор, придает молекуле свойство ка тализа тора.

Рис.1. Структура пиридоксаль-5'-фосфата.

Фосфорный эфир альдегидной формы витамина В6, пиридоксаль-5'фосфат (ПЛФ), является необходимым коферментом для многих ферментов, катализирующих различные превращения аминокислот и аминов.

Связанный с белком пиридоксальфосфат катализирует следующие реакции: а,Р-элиминирование, Р,у-элиминирование, (3-, у-замещение, трансаминирование, декарбоксилирование, рацемизацию, альдольное расщепление. Следует отметить, что ПЛФ способен катализировать эти реакции в растворе, правда, гораздо медленнее.

Во всех ПЛФ-зависимых ферментах кофактор связывается с белком посредством образования основания Шиффа с е-КНг-группой остатка лизина.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Барболина, Мария Викторовна

6. Выводы.

1) Исследовано взаимодействие тирозин-фенол-лиазы с 3-(4-гидроксифенил)-нропионовой, 1-амино-2-{4-гидроксифенил)-этилфосфиновой и I-амино-2-(4-гидроксифенш1)-этилфосфоновой кислотами; установлено, что плоское строение карбоксильной группы субстрата способствует относительному увеличению скорости отрыва С-ос-протона субстрата по сравнению со скоростью репротонирования хиноидного интермедиата; связывание карбоксильной труппы контролируется группой белка со значением рКа .8.4.

2) Методом сайт-направленного мутагенеза получены мутантные формы ТФЛ с заменами остатков активного центра серина 51 и треонина 124 <8ег51А1а, 8ег51Суз и ТЬг124А»р ТФЛ).

3) Установлено, что остаток 8ег51, вероятно, участвует в обеспечении стадии отрыва С-а-протона субстрата из внешнего альдимина. Водородная связь между боковыми группами остатков Туз257 и 8ег51 обеспечивает оптимальное для отрыва С-а-протона положение е-аминогруппы остатка Ьуз257.

4) Показано, что водородная связь, образуемая остатком Авп185 и V-гидроксильной группой кофактора, стабилизирует хиноидный и кето-хиноидный интермедиаты,

5) Установлено, что остаток Т1гг124 является одной из групп, обеспечивающих субстратную специфичность тирозин-фенол-лиазы и обеспечивает оптимальную для эффективного протекания реакции элиминирования конформацию хиноидного и кетохиноидного интермедиатов.

HI. Методы исследования 1. Выделение однодепочечнои ДНК.

Клетки E.coli TGI {К12, A(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F'traD36, proA+B+, lac Iq, lacZAM15), трансформированные плазмидой pTZTPL (29), несущей ген ТФЛ дикого типа, рассевали на чашку Петри с Луриа-Бертани агаром и 0,01% ампициллином. Клетки растили в течение ночи при 37°С. Свежевыращенные клетки использовали для выделения одноцепочечной ДНК по методике (139). Одиночную колонию с чашки Петри помещали в 50-миллилитровую колбу, содержащую 7 мл среды 2xYT и 10 мкл М13К07 фага-хэлпера (Promega), инкубировали при 37°С 45 мин. с сильным перемешиванием (300 об/мин) на вращающейся ллатформе. Затем добавляли канамицин из расчёта 50 мкл/мл и растили при 37°С в течение ночи с перемешиванием со скоростью 250 об/мин Клетки отделяли центрифугированием в течение 10 мин. при 7000 об/мин. К 5 мл супернатанта добавляли 1 мл раствора, содержащего 20% полиэтиленгликоль (ПЭГ)-8000 и 2,5 M NaCl. Смесь инкубировали 30 мин при 5°С. Образовавшийся осадок фаговых частиц собирали центрифугированием в течение 10 мин при скорости 7000 об/мин. Супернатант удаляли, осадок суспендировали в 250 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, pH 8,0 и 1 мМ ЭДТА, pH 8,0). Для освобождения от клеток, которые могли сопутствовать ДНК на протяжении выделения, центрифугировали раствор в течение 5 мин. при 12000 об/мин, осадок отбрасывали. К раствору добавляли 250 мкл фенола, насыщенного IM трис-HCl, рН8,0, тщательно перемешивали и разделяли водную и органическую фазы центрифугированием в течение 5 мин при 12000 об/мин. Отбирали 200 мкл верхней фазы и экстрагировали остатки фенола добавлением 200 мкл хлороформа, отбирали 180 мкл верхней фазы и осаждали

ДНК, добавляя 20 мкл 2,5 М Na(CH3COO)2 и 400 мкл С2Н5ОН и выдерживая 30 мин. при Т=-20°С. Собирали одноцепочечную ДНК центрифугированием в течение 5 мин. при 12000 об/мин. Осадок промывали 70% С2Н5ОН и суспендировали в 50 мкл буфера ТЕ. Концентрацию одноцепочечной ДНК оценивали, принимая во внимание, что поглощение при длине волны 260 нм, равное 1, отвечает 40 мкг/мл одноцепочечной ДНК.

2, Проведение сайт-направленого мутагенеза^ Для получения желаемых мутантных форм Thrl24Asp, Ser51Ala, Ser51Cys ТФЛ использовались следующие синтетические олигонуклеотиды с заменами нуклеотидов в соответствующих кодонах: 1) для введения замены Ser51 Ala - 5'-CCTGCTGACAGACGCTGGCACTAACGC-3'; 2) для введения замены Ser51Cys - 5'-GCTGACAGAC7Y?TGGCACTAACG-3'; 3) для введения замены Thrl24Asp - 5'-GGAATATGTATTTC&4TACTACCCGTTATC-3'.

Мутантные формы Asnl 85А1а и Thrl 24А1а были любезно предоставлены для исследований д.х.н. Т.В. Демидкиной (ИМБ, РАН) и проф. П.Д. Голлником (Государственный Университет шт. Нью-Йорк в Баффало, США).

Для проведения сайт-направленного мутагенеза пользовались набором фирмы Amersham, разработанном на основе метода Экштейна (140). Для проведения реакций, приводящих к получению ДНК, содержащей требуюмую замену, в тонкостенной пластиковой пробирке типа Eppendorf объёмом 0,25 мл смешивали: 2 мкл одноцепочечной ДНК с геном тирозин - фенол-лиазы дикого типа с концентрацией 1 мкг/мкл, 1 мкл соответствующего требуемой мутации фосфорилированного олигонуклеотида с концентрацией 1,6 пмоль/мкл, 1 мкл буфера А, содержащего 1,4 М MOPS, pH 8,0 и 1,4 М NaCl и 5 мкл воды.

Для комплементарного спаривания олигонуклеотида с ДНК смесь выдерживали 3 мин. при 70°С, затем 30 мин при 37°С, далее переносили в ёмкость со льдом.

Достраивание дочерней цепи и лигирование проводили в следующих условиях: к реакционной смеси добавляли 10 мкл смеси dNTP №1 (составлена из 1,01 мМ dATP, dGTP, dTTP, серозамещённого аналога дезоксицитозинтрифосфата dCTPaS, 2,02 мМ АТР и 20 мМ MgCb), 2,5 ферментативные единицы Т4 ДНК-лигазы, 0,8 ферментативных единиц Т7 ДНК-полимеразы. Реакционную смесь выдерживали 10 мин. при комнатной температуре, 30 мин при 30°С и 15 мин при 70°С.

Удаление не прореагировавшей одноцепочечной ДНК проводили под действием Т5-экзонуклеазы: к реакционной смеси добавляли 50 мкл буфера Б, содержащего 70 мМ трис, pH 8,0, 10 мМ MgCl2, 45 мМ NaCl, 2000 ферментативных единиц Т5-экзонуклеазы, инкубировали 30 мин при 37°С, инактивировали фермент 15 мин при 70°С.

Одноцепочечный разрыв в кольцевую двухцепочечную ДНК вводили при помощи рестриктазы Neil. Дочерний слой двухцепочечной ДНК, содержащий dCTPaS, не подвергается действию Nci I. К реакционной смеси добавляли 5 мкл буфера В, содержащего 700 мМ трис, pH 8,0, 360 мкМ ЭДТУ, 200 мМ дитиотрейитола и 5 ферментативных единиц рестриктазы Nci I. Инкубировали 90 мин при 37°С.

Разрушение матричной цепи ДНК проводили, добавляя к реакционной меси 20 мкл буфера Г, содержащего 250 мМ трис, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 500 мкМ ЭДТУ, 160 ферментативных единиц экзонуклеазы III. Инкубировали 30 мин при 37°С, инактивировали 15 мин. при 70°С.

Достраивание комплементарного слоя ДНК и лигирование проводили с использованием смеси dNTP №2, содержащей 1,25 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 мМ ATP и 25 мМ MgCh. К реакционной смеси добавляли 20 мкл смеси dNTP №2, 3,5 ферментативные единицы ДНК-полимеразы I, 2,5 ферментативные единицы ДНК-лигазы фага Т4 и выдерживали 60 мин при 37°С.

За прохождением всех стадий процесса следили, нанося на 1% агарозный гель, содержащий 0,05% этидиум бромида, аликвоты, отбираемые из реакционной смеси на каждом этапе.

3. Получение компетентных клеток E.coli TG1.

Из музея клетки E.coliTGl рассевали на чашку Петри с Лурия-Бертани агаром, растили ночь при 37°С. Свежую колонию клеток E.coliTGl инокулировали в 50 мл среды Лурия-Бертани, растили в течение ночи при 37°С с перемешиванием на вращающейся платформе со скоростью 250 об/мин. 4 мл выросшей культуры инокулировали в 400 мл среды Лурия-Бертани, содержащейся в двухлитровой колбе. Растили клетки при 37°С с перемешиванием со скоростью 250 об/мин до значения оптической плотности при длине волны 600 нм, равного 0,375. Затем культуру помещали в пробирки по 50 мл, выдерживали во льду 10 мин., собирали клетки центрифугированием в течение 7 мин. при скорости 3000 об/мин, при 4°С. Супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали, добавляя 10 мл охлаждённого во льду раствора, содержащего 60 мМ СаСЬ, 15% глицерин, 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-1М'-этансульфон-кислота), pH 7,0. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин. при 2500 об/мин, при 4°С. Осадки вновь суспендировали в 10 мл СаСЬ-раствора, выдерживали суспензию во льду в течение 30 мин. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин. при 2500 об/мин. Осадки ресуспендировали в 2 мл СаСЬ-раствора. Полученные компетентные клетки Е. coli TGI разделяли на аликвоты по 100 мкл и использовали сразу для трансформации, либо хранили при температуре -70°С. На всех стадиях клетки находились либо во льду, либо при температуре 4°С, использовавшиеся растворы были предварительно охлаждены до температуры 4°С.

4. Трансформация компетентных клеток Е. coli TGI.

Смешивали 100 мкл реакционной смеси, полученной после реакций мутагенеза, с 200 мкл компетентных клеток Е. coli TGI, инкубировали смесь во льду в течение 30 мин. Затем подвергали смесь тепловому шоку в течение 2 мин. при температуре 42°С. Добавляли 1 мл среды Лурия-Бертани и инкубировали клетки 1 час при температуре 37°С с перемешиванием 200 об/мин. Рассевали на чашки Петри с Лурия-Бертани агаром и 0,01 % ампициллином 100 мкл клеток. Клетки растили в течение ночи при температуре 37°С. Колонии, содержащие плазмиды, вырастали в среде с ампициллином, так как плазмида несёт ген устойчивости к ампициллину.

Использовалось два контроля: 1) компетентные клетки E.coli TGI были трансформированы плазмидой pTZTPL; 2) к компетентным клеткам не добавляли двухцепочечной ДНК. В первом случае обнаруживали рост колоний на среде с ампициллином, во втором случае роста колоний не происходило.

В опытных чашках Петри были обнаружены колонии, их рост был обусловлен наличием в клетках плазмид. Отбор клонов, несущих плазмиды с желаемыми мутациями, производился секвенированием гена ТФЛ в области мутации. Для секвенирования были отобраны по 6 клонов для каждой предполагаемой мутантной формы, из этих клонов были выделены плазмиды и использованы в качестве матрицы для секвенирования.

5. Выделение двухцепочечной (плазмидной) ДНК для секвенирования.

ДНК выделяли, руководствуясь "усовершенствованной методикой выделения плазмидной ДНК, методом лизиса щёлочью" (141). С чашек Петри, на которых вырастали колонии после трансформации, отбирали по шесть отдельных колоний клеток. Выращивали клетки в 3 мл Лурия-Бертани среды с добавлением 0,01% ампициллина в 15x1,5 см2 пробирке в течение 16 часов при температуре 37°С с перемешиванием 250 об/мин. Клетки собирали центрифугированием в течение 20 сек при скорости 12000 об/мин. Клетки суспендировали в 120 мкл охлаждённого во льду раствора, состоящего из 50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-НС1, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0. Добавляли 240 мкл свежеприготовленного лизирующего буфера, состоящего из 0,2 М ИаОН, 1% додецилсульфата натрия (ДСН), выдерживали (2-5 мин) до тех пор, пока раствор не становился прозрачным. Клеточные мембраны и сопутствующие нерастворимые частицы осаждали, добавляя 360 мкл охлаждённого во льду 4М СНзСООК, затем отбрасывали центрифугированием в течение 5 мин. при 12000 об/мин. К 660 мкл супернатанта добавляли 330 мкл изопропанола, осадок отделяли центрифугированием в течение 3 мин при максимальной скорости на микроцентрифуге. Осадок суспендировали в 200 мкл буфера ТЕ с добавлением 20 мкг/мл РНК-азы А, выдерживали 30 мин при температуре 37°С. К смеси добавляли 100 мкл 40% раствора ПЭГ-8000 в 30 мМ М§С12, перемешивали и центрифугировали 5 мин при 12000об/мин. Осадок промывали 1 мл 70% С2Н5ОН, подсушивали на воздухе и растворяли в 100 мкл ТЕ. Выделенные таким образом плазмиды использовались далее для секвенирования. Концентрацию растворов плазмид оценивали, нанося аликвоты на 1% агарозный гель, содержащий этидиум бромид в концентрации 0,5 мг/мл. Выделеные плазмиды использовали для секвенирования.

6. Секвенирование плазмидной ДНК.

Плазмиды секвенировали по методу Сэнгера (142) с использованием набора фирмы АтегвЬаш в области желаемых мутаций используя следующие синтетические олигонуклеотиды: 1) для обнаружения замен 8ег51А1а и 8ег51Суз использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 771789 гена (29); 2) для обнаружения замены ТЬг124Азр был использован олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 874-893. В реакции брали по 3 мг плазмидной ДНК в объёме 8 мкл, добавляли 2 мкл 1,0 М ИаОН и 1 мкл соответствующего олигонуклеотида в концентрации 2 пмоль/мкл, смешивали, инкубировали 10 мин при температуре 37°С. Затем смесь охлаждали во льду и добавляли 2 мкл 1,0 М НС1 и 2 мкл буфера, содержащего 1,0 М трис-НС1, рН

7.5, 100 мМ 1У^С12, 250 мМ ИаСЬ Инкубировали для «отжига» праймера 10 мин. при температуре 37°С, затем охлаждали во льду. К смеси добавляли 1 мкл 1,0 М дитиотрейитола, 2 мкл разбавленного в пять раз раствора для реакции включения радиоактивного изотопа в ДНК (7,5 мкМ 7-деазо-сЮТР, 7,5 мкМ с!СТР, 7,5 мкМ (1ТТР), 0,5 мкл [сх-33Р]с1АТР (5 мкКюри). Смесь перемешивали и добавляли 2 мкл раствора секвеназы и неорганической пирофосфатазы в 20 мМ трис-НС1, рН 7,5, 2 мМ дитиотрейтола, 0,1 мМ ЭДТА и 50% глицерине. Инкубировали 3 мин. при комнатной температуре. Далее по 4,5 мкл из реакционной смеси добавляли для начала реакции терминации в пробирки, содержащие по 2,5 мкл смесей "СУ'А'У'Т'У'С", инкубировали 5 мин. при температуре 37 °С. Смесь "С' содержала 80 мкМ 7-деазосЮТР, 80 мкМ аАТР, 80 мкМ астр, 80 мкМ аттр, 8 мкМ ёсЮТР, 40 мМ трис-НС1, рН

7.6, 50 мМ КаС1. Смесь "А" содержала 80 мкМ 7-деазосЮТР, 80 мкМ ёАТР, 80 мкМ dCTP, 80 мкМ dTTP, 8 мкМ ddATP, 40 мМ трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ NaCl. Смесь "Т" содержала 80 мкМ 7-flea3odGTP, 80 мкМ dATP, 80 мкМ dCTP, 80 мкМ dTTP, 8 мкМ ddTTP, 40 мМ трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ NaCl. Смесь "С" содержала 80 мкМ 7-fleasodGTP, 80 мкМ dATP, 80 мкМ dCTP, 80 мкМ dTTP, 8 мкМ ddCTP, 40 мМ трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ NaCl. Останавливали реакции добавлением 4 мкл раствора, состоящего из 95% формамида, М ЭДТУ, 0,05% бромфенолового синего, 0,05% ксиленцианола FF.

Образцы прогревали 2 мин при 75°С непосредственно перед нанесением на 6% полиакриламидный гель (ПААГ) (соотношение акриламида к бисакриламиду составляло 5,7:0,3). Для приготовления 6% ПААГ смешивали 5,7 г акриламида, 0,3 г бисакриламида, 42 г мочевины, 45 мл дистиллированной воды, 10 мл ЮхТВЕ (из расчёта 108 г трис, 35 г борной кислоты и 9,3 г ЭДТАКаг на 1 литр раствора), 30 мкл TEMED и 700 мкл 10% персульфата аммония. Перед нанесением образцов на гель в течение 1 часа проводили пре-электрофорез 6% ПААГ при напряжении 1500 В. Затем наносили по 3 мкл образцов в каждую лунку в порядке "G","A","T","C". Электрофорез проводили при тех же условиях, что и пре-электрофорез, до тех пор, пока бромфеноловый синий, содержащийся в образцах, не выходил из геля в буфер. Для проведения электрофореза использовали 1 л буфера lxTBE. После проведения электрофореза гель, «пришитый» к стеклу с использованием Bind-Silane (LKB), выдерживали в 20% С2Н5ОН, высушивали полностью и экспонировали в течение ночи с рентгеновской плёнкой. Затем плёнку проявляли, фиксировали, сушили. Далее определяли последовательность ДНК, сопоставляли её с последовательностью ДНК для гена ТФЛ дикого типа (29). Все секвенированные плазмиды (по две из шести выделенных) содержали желаемые замены. Для экспрессии и выделения желаемых мутантных форм ферментов плазмиды трансформировали в компетентные клетки штамма Е. coli SVS370.

7. Получение компетентных клеток Е. coli SVS370 для трансформации.

В 1 л среды Лурия-Бертани с 0,005% канамицином ннокулировали 10 мл свежевыращенной культуры клеток Е. coli SVS370. Растили при температуре 37°С с перемешиванием со скоростью 250 об/мин до значения поглощения при длине волны 600 нм, равного 0,7. Выдерживали затем колбу с выросшими клетками 30 мин во льду, собирали клетки центрифугированием в течение 5 мин. при скорости 4000 об/мин при температуре 4°С. Суспендировали осадок в 1 л охлаждённого во льду раствора 1 мМ HEPES, pH 7,0, центрифугировали, как на стадии сбора клеток. Затем суспендировали в 0,5 л 1 мМ HEPES, pH 7,0, центрифугировали, как на стадии сбора клеток. Снова суспендировали в 20 мл 10% глицерина, затем центрифугировали, как на стадии сбора клеток. Суспендировали клетки в 3 мл 10% глицерина, полученные компетентные клетки делили на аликвоты по 50 мкл и замораживали для хранения при температуре -70°С. На всех стадиях клетки находились либо во льду, либо при температуре 4°С, использовавшиеся растворы были предварительно охлаждены до температуры 4°С.

8. Трансформация плазмидных ДНК в компетентные клетки Е. coli

SVS370.

Для электропорации 50 мкл клеток оттаивали при комнатной температуре и переносили в ёмкость со льдом, добавляли 1 мкл раствора плазмидной ДНК с желаемой заменой (концентрация ДНК « 50 нг/мкл). На приборе Gene Pulser (Bio-Rad) устанавливали параметры 25 мкФ, 2,5 кВ, 200 П. Смесь клеток и ДНК помещали в кювету шириной 0,2 см для электропорации. Кювету помещали в прибор и подвергали клетки электропорации. Сразу после электропорации добавляли 1 мл среды Лурия-Бертани к трансформированным клеткам, растили 1 час при температуре 37°С в пробирке размером 1,5x15 см2 с перемешиванием со скоростью 225 об/мин. Рассевали 50 мкл клеток на чашки Петри с Лурия-Бертани агаром с 0,01% ампициллином и 0,005% канамицином, растили в течение ночи при температуре 37°С. Отбирали несколько выросших колоний и замузеивали в 50% глицерине.

9. Выращивание бактериальных масс, выделение, очистка и характеристика ферментов.

Выращивание клеток Е. coli SVS370, содержащих плазмиду с геном фермента дикого типа или мутантов, проводили в колбах на 2 л с помещённым в них 1л питательной среды Лурия-Бертани (1% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl). Отбор клеток осуществлялся добавлением в питательную среду 0,01% ампицилина и 0,005% канамицина благодаря наличию гена устойчивости к ампицилину в плазмиде и гену устойчивости к канамицину в геноме штамма Е. coli SVS370. Выращивание клеток проводили в течение 24 часов при 37°С с перемешиванием 160-180 об/мин. Клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин. при 5000 об/мин при t=+4 °С (стандартно с 1 литра среды получалось 5-7 г биомассы). Клетки разрушали ультразвуком (15-20 Гц) при охлаждении (t=5*10 °С) по 1 мин 5-6 раз. Нуклеиновые кислоты в клеточном экстракте осаждали добавлением 2% раствора протаминсульфата в количестве 1/5 от объёма раствора. После центрифугирования осадок отбрасывали, а белки, находящиеся в растворе, высаливали до 65% насыщении раствора белка сульфатом аммония.

Все операции выделения ферментов проводились при комнатной температуре, при этом инактивации препаратов не наблюдалось. Хранение белковых фракций на всех стадиях очистки осуществлялось при +4°С, очищенные препараты хранили в растворах, содержащих 65% насыщения (КН4)2804 при t=-480C

Дальнейшая очистка ферментов проводилась с использованием гидрофобной хроматографии на октил-сефарозе СЬ-4В и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Для выделения ферментов на стадиях получения клеточного экстракта, осаждения нуклеиновых кислот и высаливания использовался 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 7,0, содержащий 10~4М пиридоксальфосфат, 10"3М дитиотрейитол, 10"4М ЭДТА (буфер А). Для проведения гидрофобной хроматографии на октил-сефарозе использовался буфер А, содержащий 25% насыщения (N114)2804. Для проведения ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе использовался буфер трис-НС1, рН 8,0, в концентрациях 0,05 и 0,1 М.

Диализ белковых растворов до и после проведения ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осуществлялся в диализных мешках или на ячейках Сеп1:псоп-30 фирмы Аппсоп.

10. Определение белка.

Определение белка в процессе выделения проводилось по методу Лоури (142); для определения белка в клеточном экстракте также использовался спектрофотометрический метод, основанный на соотношении: Сбелка =1,55*А28о - 0,76*Агбо- На хроматографических стадиях (после осаждения нуклеиновых кислот) для определения концентрации белка использовали- коэффициент экстинции 1% раствора ТФЛ, равный 8,37 при длине волны 278 нм (144).

11. Определение чистоты выделенных ферментов.

Чистоту ферментов проверяли несколькими способами: 1) определением удельной активности; 2) снятием спектра поглощения холофермента; 3) электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Для определения удельной активности в процессе выделения ферментов использовался синтетический субстрат - S-о-нитрофенил-Ь-цистеин (SOPC). Скорость реакции определяли по уменьшению оптической плотности на А,=370 нм (s=1860 М^хсм"1) (27). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое расщепляет 1 мкмоль SOPC за 1 мин. при 30°С в 0,05 М калий-фосфатном буфере, pH 8,0.

Как одну из характеристик чистоты фермента дикого типа использовали соотношение А280/А425, равное пяти, где Агво - характеризует количество белка, А425 - характеризует основание Шиффа, образующееся при взаимодействии -СНО-группы ПЛФ с s-NEh-rpynnofi Lys257.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методу Лэммли (144), на дорожки наносили по 5-ПО мкг белка; в качестве стандарта использовали смесь белков известного молекулярного веса фирмы Bio-Rad, либо очищенную тирозин-фенол-лиазу.

12. Спектры поглощения и кругового дихроизма фермента дикого типа и мутантных форм.

Спектры поглощения холоферментов и комплексов холоферментов с ингибиторами снимали в диапазоне длин волн от 250 до 550 нм на спектрофотометре фирмы Beckman, модель DU-70 и на спектрофотометре фирмы Сагу, модель 300; при концентрации холоферментов l-s-1,5 мг/мл.

Спектры кругового дихроизма снимались в диапазоне от 300 до 550 нм на дихрографе Jobin-Ivon, Mark-Ill; при концентрации холоферментов 2+3 мг/мл.

Холоферменты получали, инкубируя препараты белков с 20-кратным молярным избытком ПЛФ при комнатной температуре в течение 30 мин. Перед снятием спектров избыток ПЛФ удаляли диализом. Определение концентрации ПЛФ в препаратах холофермента проводили по методу Питерсона и Собера (146).

Спектры поглощения и кругового дихроизма снимали в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 8,0, приготовленном на деионизованной воде и предварительно профильтрованном для уменьшения фонового рассеяния. Аминокислоты при снятии спектров ферментных комплексов с ингибиторами содержались в концентрациях, равных ЮхКь где К; - константа ингибирования.

13. Кинетические исследования.

Определение кинетических параметров реакции а,{3-элиминирования всех субстратов кроме SOPC проводилось в сопряжённой системе с лактатдегидрогеназой, следя за уменьшением оптической плотности NADH при Х=340 нм (в=6220 М^хс*1) при 25°С. Реакционные смеси в объёме 1 мл содержали 50 мМ калий-фосфатного буфера , рН 8.0, 50 мкМ ПЛФ, 0.2 мМ NADH, 5 ферментативных единиц ЛДГ, различные концентрации субстратов. Реакции инициировались добавлением ТФЛ. Определение кинетических параметров а,р-элиминирования SOPC проводилось при 25°С в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 50 мкМ ПЛФ, различные концентрации SOPC и необходимое количество ТФЛ.

Ингибирующий эффект L-фенилаланина, L-метионина и L-тирозина на фермент дикого типа и его мутантные формы определялся с использованием L-тирозина и SOPC, как субстратов, при тех же условиях реакции, в которых проводили определение кинетических параметров а,р-элиминирования L-тирозина.

Реакции изотопного обмена с фенилаланином и метионином проводили в 50 мМ калий-фосфатном буфере в присутствии 0,1 М ПЛФ в объёме 0,4 мл. Значение рН раствора, измеренное потенциометрически со стеклянным электродом, составляло 8,2, что соответствует р Н=8,6 (147). Концентрации аминокислот в реакциях составляли ЮхК;, где К; - значение константы ингибирования аминокислоты. Реакционные смеси содержали 7-ь4 мг ТФЛ. Пробы из реакциоонной смеси отбирали через 1, 2, 3, 5, 7 часов, фермент инактивировали, выдерживая отобранные пробы при 90°С в течение 5 мин. Содержание реакционной смеси анализировали методом !Н ЯМР. Соотношение дейтерированного и недейтерированного продукта рассчитывали исходя из относительных интегральных интенсивностей сигналов а-протона и протонов Р-СНг-группы.

Расчет кинетических параметров констант скорости (ккат) и констант Михаэлиса (Км) проводили по программе ENZFITTER (Elsevier) (148) с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен:

V=KKaT[Eo][S]/(A'm+[S]), где [Ео]-концентрация фермента, {^-концентрация субстрата.

Расчет значений констант ингибирования (Kj) проводили по программе ENZFITTER (Elsevier) с использованием уравнения:

V=Vmex[S]/{Km(l + [I]/Ki) + [S]}, где [1]-концентрация ингибитора.

Расчет кинетических изотопных эффектов проводили по программе ENZFITTER (Elsevier) с использованием уравнения: v=Vmax[S]/{Km(l+DVKI)+[S](l+VI)}, где УК1=У/К(изотопный эффект)-1, У1=У(изотопный эффект)-1, D-содержание дейтерия.

14. Синтез изотопномеченых производных З-фтор-Ь-тирозина.

Исходным веществом для получения изотопномеченых производных являлся З-фтор-Ь-тирозин, синтезированный Н.Г. Фалеевым (Институт пищевых веществ, РАН).

3-фтор-Ь-[а-2Н]-тирозин получали энзиматическим синтезом в 2НгО по методу (149). Триптофан - индол-лиазу выделяли из клеток E.coli SVS370, несущих плазмиду с геном фермента дикого типа (150). Триптофан - индол-лиазу выделяли по той же методике, что и тирозин - фенол-лиазу, выделение проводили вплоть до стадии осаждения белка сульфатом аммония, хроматографической очистки фермента не проводили. Реакционная смесь для полоучения изотопномеченого 3-фтор-тирозина содержала 40 мг З-F-L-Tyr в 50 мМ калий-фосфатного буфера в присутствии 0,1 М ПЛФ в объёме 20 мл в 2НгО. Значение pH раствора, измеренное потенциометрически со стеклянным электродом, составляло 8,2, что соответствует р Н=8,6 (146). Для получения -тирозина в реакцию добавляли 30 ферментативных единиц триптофан-индол-лиазы и проводили реакцию в течение 20 часов при комнатной температуре. Далее фермент инактивировали, выдерживая реакционную смесь 5 мин при 95°С, денатурированный фермент удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 12000 об/мин и/или ультрафильтрацией через ячейку СепЫсопЗО. Раствор упаравали на роторном испарителе, затем перекристаллизовывали из воды. Конечный выход вещества составлял 50%.

3-фтор-Ь-[Р,Р-2Н2]-тирозин получали согласно методу (137). 2-Фторфенол в количестве 2 ммоль и 30 ферментативных единиц тирозин-фенол-лиазы, выделенной по методике, описанной ранее, добавляли в 20 мл реакционной смеси, состоящей из 50 мМ калий-фосфатного буфера в 2НгО в присутствии 0,1 М ПЛФ. Значение рН раствора, измеренное потенциометрически со стеклянным электродом, составляло 8,2, что соответствует р2Н=8,6 (147). Смесь инкубировали при перемешивании в течение 20 часов при комнатной температуре. Удаление фермента из реакционной смеси и выделение продукта было проведено, как описано ранее для 3-фтор-Ь-[а-2Н]-тирозина. Продукт реакции 3-фтор-Ь-[а,р,р-2Нз]-тирозин был получен с выходом 40% (0,26 ммоль). Этот продукт затем растворяли в 20 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 8,0 в воде, добавляли 20 ферментативных единиц триптофан-индол-лиазы и инкубировали с перемешиванием в течение 18 часов при 30°С. Выделение продукта реакции 3-фтор-Ь-[Р,Р-2Н2]-тирозин продукта было проведено, как описано ранее для 3-фтор-Ь-[а-2Н]-тирозина.

Содержание дейтерия в синтезированных производных З-фтор-Ь-тирозина проверяли методом ЛМР. По результатам этого исследования 3-фтор-Ь-[а- Н]-тирозин содержал 99% дейтерия в а-положении аминокислоты, 3-фтор-Ь-[Р,Р-2Н2]-тирозин содержал 89% дейтерия в Р-положении аминокислоты, а в а-положении содержалось не более 2% дейтерия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Барболина, Мария Викторовна, Москва

1.2 использованная литература (124)

2. Мецлер Д. Пиридоксальфосфат. В кн.: Биохимия. М., "Мир, 1980, т. 2, с. 209-232.

3. Demidkina T.V., Myagkikh I.V. The activity and reaction specificity of tyrosine phenol-lyase regulated by monovalent cations. Biochemie, 1989, v. 71, p. 565-571.

4. Yanofsky C., Crawford T.P. Tryptophan synthetase. In The Enzymes, 3rd Ed., Academic Press, New York, 1972, Vol. 7, p.1-31.

5. Hyde C.C., Ahmed S.A., Padlan E.A., Miles E.W., Davies D.R. Three-dimensional structure of the tryptophan syntase a^Pamultienzyme complex from Salmonella typhimurium. J.Biol.Chem., 1988, v. 263, p. 17857-17871.

6. Ruvinov S.B., Ahmed A., McPhie P., Miles E.W. Monovalent cations partially repair a conformational defect in a mutant tryptophan synthase a2p2complex (P-E109A). J.Biol.Chem., 1995, 270(29), p. 17333-17338.

7. Banik U., Zhu D., Chock P.В., Miles E.W. The tryptophan synthase ot2p2complex: kinetic studies with a mutant enzyme (PK87T) to provide evidence for allosteric activation by an aminoacrylate intermediate. Biochemistry, 1995, v. 37, p. 12704-12711.

8. Schlichting I., Yang X., Miles E.W., Kim A.Y., Anderson K.S. Structural and kinetic analysis of a channel-impaired mutant of tryptophan synthase. J. Biol.Chem., 1994, v. 269(43), p.26591-26593.

9. Jagath J.R., Sharma B., Bhaskar B., Datta A., Rao N.A., Savithri H.S. Importance of the amino terminus in maintenance of oligomeric structure of sheep liver cytosolic serine hydroxymethyltransferase. Eur. J. Biochem., 1997, v. 247, p. 372-379.

10. Jagath J.R., Rao N.A., Savithry H.S. Role of Arg-401 of cytosolic serine hydroxymethyltransferase in subunit assembly and interaction with the substrate carboxy groop. Biochem. J., 1997, v. 327, p.877-882.

11. Talvar R., Jagath J.R., Datta A., Prakash V., Savithry H.S., Rao N.A. The role of lysine-256 in the structure and function of sheep liver recombinant serine hydroxymethyltransferase. Acta Biochimica Polonica, 1997, v. 44, N 4, p.679-688.

12. Renwuck S.B., Snell K., Baumann U. The crystal structure of human cytosolic serine hydroxymethyltransferase: a target for cancer chemotherapy. Structure, 1998, v. 6(9), p. 1105-16.

13. Krishna Rao J.V., Jagath, J.R., Sharma, B., Appaji Rao N., Savithri, H.S. Asp-89: a critical residue in maintaining the oligomeric structure of sheep liver cytosolic serine hydroxymethyltransferase. Biochem.J., 1999, v. 1(343), p. 257-63.

14. Yu Y.B., Adams D.O., Yang S.F. 1-Aminocyclopropanecarboxylate synthase, a key enzyme in ethylene biosynthesis. Arch. Biochem. Biophys., 1979, v. 198(1), p. 280-286.

15. Tarun A.S., Theologis A. Complementation analysis of mutants of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase reveals the enzyme is a dimer with shared active sites. J. Biol.Chem., 1998, v. 273(20), p. 1250912514.

16. Jordan P.M In Biosynthesis of Tetrapyrroles. Elsevier, Amsterdam, 1991, p. 1-66.

17. Ferreira G.C., Dailey H.A. Expression of mammalian 5-aminolevulinate synthase in Escherichia coli. Overproduction, purification, and characterization. J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 584-590.

18. Gong J., Ferreira G.C. Aminolevulinate synthase: functionally important residues at a glycine loop, a putative pyridoxal phosphate cofactor-binding site. Biochemistry, 1995, v. 34, p. 1678-1685.

19. Tan D., Ferreira G.C. Active site of 5-aminolevulinate synthase resides at the subunit interface. Evidence from in vivo heterodimer formation. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 8934-8941.

20. Kumagai H., Matsui H., Ohgishi H., Ogata K., Yamada H., Ueno T., Fukami H. Synthesis of 3,4-hydroxyphenyl-L-alanine from L-tyrosine and pyrocatechol by crystalline beta-tyrosinase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1969, v. 34, p. 266-70.

21. Kumagai H., Kashima N., Yamada H. Racemization of D- or L-alanine by crystalline tyrosine phenol-lyase from Escherichia coli. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1970, v. 39(5), p. 796-801.

22. Demidkina T.V., Myagkikh I.V., Azhayev A.V. Transamination catalysed by tyrosine phenol-lyase from Citrobacter intermedins. Eur.J.Biochem.,1987, v. 170, p. 311-316.

23. Kumagai H., Yamada H., Matsui H., Ohgishi H., Ogata K. Tyrosine phenol-lyase. Purification, crystallization and properties. J.Biol.Chem., 1970, v. 250, 1661.

24. Phillips R.S. Reactions of O-acyl-L-serines with tryptophanase, tyrosine phenol-lyase and tryptophan synthase. Arch.Biochem.Biophys., 1987, v. 256(1), p. 302-10.

25. Kumagai H., Utagawa T., Yamada H. Studies of tyrosine phenol-lyase.

26. Modification of essential histidil residues by diethylpyrocarbonate. J.»

27. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 1661-1667.

28. Antson A.A., Demidkina T.V., Gollnick P., Dauter Z., Von Tersch R.L., Long J., Berezhnoy S.N., Phillips R.S., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. Three-dimensional structure of tyrosine phenol-lyase. Biochemistry, 1993, v. 32, p. 4195-4206.

29. Chen H., Gollnick P., Phillips R.S. Site-directed mutagenesis of His343-»Ala in Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyase. Eur. J. Biochem., 1995, v. 229, p. 540-549.

30. Sandmeier E., Hale T.I., Christen P. Multiple evolutionary origin of pyridoxal 5'-phosphate dependent amino acid decarboxylases. Eur. J. Biochem., 1994, v. 221, 997-1002.

31. Tramonti A., Biase D.D., Giartosio A., Bossa F., John R.A. The roles of His-167 and His-275 in the reaction catalysed by glutamate decarboxylase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1998, v. 273(4), p. 1939-1945.

32. Gentry-Weeks C.R., Spokes T., Thompson J. P-Cystathionase from Bordetella avium. J. Biol. Chem., 1995, v. 270(13), p. 7695-7702.

33. Churchich J.E., Moses U. 4-Aminobutirate aminotransferase. The presence of none equivalent binding sites. J. Biol. Chem., 1981, v. 256, p. 1101-1104.

34. Kim Y.T., Song Y.H., Churchich J.E. Recombinant brain 4-aminobutirate aminotransferases overexpression, purification, and identification of Lys-330 at the active site. BBA, 1997, v. 1337, p. 248-256.

35. Nishino J., Hayashi H., Ishii S., Kagamiyama H. An anomalous side reaction of the Lys303 mutant aromatic L-amino acid decarboxylation unravels the role of the residue in catalysis. J. Biochem., 1997, v. 121, p. 604-611.

36. Swanson T., Brooks H.B., Osterman A.L., O'Leary M.O., Phillips M.A. Carbon-13 isotope effect studies of Trypanosoma brucei ornithine decarboxylase. Biochemistry, 1998, v. 37, p. 14943-14947.

37. Vacca R.A., Christen P., Malashkevich V.N., Jansonius J.N., Sandmeier E. Substiution of apolar residues in the active site of aspartate aminotransferase by histidine. Eur. J. Biochem., 1995, v. 227, p. 481487.

38. Tan D., Barber M.J., Ferreira G.C. The role of tyrosine 121 in cofactor binding of 5-aminolevulinate synthase. Prot. Sci., 1998, v. 7, p. 12081213.

39. Ro H., Hong S., Seo H., Yoshimura T., Esaki N., Soda K., Kim H., Sung M. Site-directed mutagenesis of the amino acid residues in P-strandIII Val30-Val36. of D -amino acid aminotransferase of Bacillus sp. YM-1. FEBS Lett., 1996, v. 398, p. 141-145.

40. Pucci M.J., Thanassi J.A., Ho H.T., Falk P.J., Dougherty T.J. Staphylococcus haemolyticus contains two D-glutamic acid biosynthetic activieties, a glutamate racemase and a D-amino acid transaminase. J. Bacteriol., 1995, v. 177, p. 336-342.

41. Kirsch J.F., Eichele G., Ford G.C., Vincent M.G., Jansonius J.N. Mechanism of aspartate aminotransferase action. J. Mol. Biol., 1984, v. 174, p. 497-525.

42. Toney M.D., Hohenester E., Keller J.W., Jansonius J.N. Structural and mechanistic analysis of two refined crystal structures of the pyridoxalphosphate-dependent enzyme dialkylglycine decarboxylase. J. Mol. Biol., 1995, v. 245(2), p. 151-179.

43. Momany C., Ghosh R., Hackert M.L. Structural; motifs for pyridoxal-5'-phosphate binding in decarboxylases: an analysis based on the crystal structure of the Lactobacillus 30a ornithine decarboxylase. Prot. Sci., 1995, v. 4, p. 849-854.

44. Davis R.H., Morris D.R., Coffino P. Sequestered end products and enzyme regulation: the case of ornithine decarboxylase. Microbiol. Rev., 1992, v. 56, p. 280-290.

45. Kilpelainen P.T., Hietala O.A. Mutation of aspartate-233 to valine in mouse ornithine decarboxylase reduces enzyme activity. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1998, v. 30(7), p. 803-809.

46. Voltattorni B.C., Minelli A., Dominici P. Interaction of aromatic amino acids in D and L forms with 3,4-dihydroxyphenylalanine decarboxylase from pig kidney. Biochemistry, 1983, v. 22, p. 2249-2254.

47. Maras B., Dominici P., Barra D., Bossa F., Yoltattorni B.C. Pig kidney dopa decarboxylase. Primary structure and relationships to other amino acid decarboxylases. Eur. J. Biochem., 1991, v. 201, p. 385-391.

48. Dominici P., Moore P.S., Castellani S., Bertolldi M., Voltattorni C.B. Mutation of cysteine 111 in Dopa decarboxylase leads to active site perturbation. Prot. Sci., 1997, v. 6, p. 2007-2015.

49. Snell E.E. Tryptophanase: structure, catalytic activities, and mechanism of action. In Adv. Enzymol., 1975, v. 42, p. 287-333.

50. Erez T., Phillips R.S., Parola A.H. Pyridoxal phosphate binding to wild type, W330F, and C298S mutants of Escherichia coli apotryptophanase: unravelling the cold inactivation. FEBS Lett. 1998, v. 433, p. 279-282.

51. Phillips R.S., Gollnick P.D. Evidence that cysteine 298 is in the active site of tryptophan indole-lyase. J.Biol.Chem., 1989, v. 264(18), p. 1062710632.

52. Phillips R.S., Gollnick P.D. The environment of Trp-248 and Thr-330 in tryptophan indole-lyase from Escherichia coli. FEBS Lett., 1990, v. 268(1), p. 213-216.

53. Momany C., Erust S., Ghosh R., Chang N.-L., Hackert M.L. Crystallographic structure of PLP-dependent ornithine decarboxylase from Lactobacillus 30a with 3,0 A resolution. J.Mol.Biol., 1995, v. 252, p. 643-655.

54. Vaaler G.L., Snell E.E. Pyridoxal 5'-phosphate dependent histidine decarboxylase: overproduction, purification, biosynthesis of soluble site-directed mutant proteins, and replacement of conserved residues. Biochemistry, 1989, v. 28(18), p. 7306-7313.

55. Jagath J.R., Sharma B., Rao N.A., Savithri H.S. (1997) The role of His-134, -147, and -150 residues in subunit assembly, cofactor binding, and catalysis of sheep liver cytosolic serine hydroxymethyltransferase. J. Biol. Chem. 272(39), p. 24355-24362.

56. Delle Fratte S., Iurescia S., Angelaccio S., Bossa F., Schirch V. The function of arginine 363 as the substrate carboxyl-binding site in Escherichia coli serine hydroxymethyltransferase. Eur. J. Biochem., 1994, v. 225, p. 395-401.

57. Cronin C.N., Kirsch J.F. Role of arginine-292 in the substrate speificity of aspartate aminotransferase as examined by site-directed mutagenesis. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 4572-4579.

58. Anderson K.S., Miles E.W., Johnson K.A. Serine modulates substrate channeling in tryptophan synthase. A novel intersubunit triggering mechanism. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 8020-8033.

59. Metzler D.E., Longenecker J.B., Snell E.E. The reversible catalytic cleavage of hydroxyamino acids by pyridoxal and metal salts. J. Am. Chem. Soc., 1954, v. 76, p. 639-644.

60. Shaw J.P., Petsko G.A., Ringe D. Determination of the structure of alanine racemase from Bacillus stearothermophilus at 1,9A resolution. Biochemistry, 1997, v. 36, p. 1329-1342.

61. Jhee K.-H., Yang L.-H., Ahmed S.A., McPhie p., Rowlett R., Miles E.W. Mutation of an active site residue of tryptophan synthase (ß-serine377) alters cofactor chemistry. J. Biol. Chem., 1998, v. 273(19), p. 1141711422.

62. Торчинский Ю.М. Роль серосодержащих групп в ферментах и других белках. В кн. Сера в белках. И. "Наука", 1977, с. 168-203.

63. Tanaka Н., Esaki N., Soda К. A versatile bacterial enzyme: L-Methionine y-lyase. Enzyme Microb. Technol., 1985, v. 7, p. 530-537.

64. Tanaka H., Esaki N., Soda K. Properties of L-methionine gamma-lyase from Pseudomonas ovalis. Biochemistry, 1977, v. 16(1), p. 100-106.

65. Kredich N.M., Tomkins G.M. The enzymatic synthesis of L-cysteine in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem., 1966, v. 241(21), p. 4955-4965.

66. Kishimoto K., Yoshimura T., Esaki N., Sugio S., Manning J.M., Soda K. Role of leucine 201 of thermostable D-amino acid aminotransferase from a thermophile, Bacillus sp. YM-1. J. Biochem., 1995, v. 117, p.691-696.

67. Yano T., Mizuno T., Kagamiyama H. A hydrogen-Bonding Network Modulating Enzyme Function: Asparagine-194 and Tyrosine-225 of Escherichia coli Astartate Aminotransferase. Biochemistry, 1993, v. 32, 1810-1815.

68. Talwar R., Jagath J.R., Rao N.A., Savithri H.S. His230 of serine hydroxymethyltransferase acilitates the proton abstraction step in catalysis. Eur. J. Biochem., 2000, v. 267, N5, p. 1441-1446.

69. Sugio S., Petsko G.A., Manning J.M., Soda K., Ringe D. Crystal structure of a D-amino acid aminotransferase: how the protein controls stereoselectivity. Biochemistry, 1995, v. 34, p. 9661-9669.

70. Antson A.A., Dodson G.G., Wilson K.S., Pletnev S.V., Harutyunyan E.G., Demidkina T.V. Crystallographic studies of tyrosine phenol-lyase. In Biochemistry of Bitamin B6 and PQQ, Birkhäuser Verlag Basel, Switserland, 1994, p. 187-191.

71. Sundararaju B., Antson A.A., Phillips R.S., Demidkina T.V.,

72. Toney M.D., Kirsch J.F. Lysine 256 in aspartate aminotransferase: enforcer of the Circe effect for amino acid substrates and general-basecatalyst for the 1,3-prototropic shift. Biochemistry, 1993, v. 32, p. 1471 -1479.

73. Watanabe A., Yoshimura T., Mukami B., Esaki N. Tyrosine 265 of alanine racemase serves as a base abstracting alpha-hydrogen from L-alanine: the counterpart residue to lysine 39 specific to D-alanine. J.Biochem. (Tokyo), 1999, v. 126, N 4, p. 781-786.

74. Martinez del Pozo A., Van Ophem P.W., Ringe D., Petsko G., Soda K., Manning J.M. Interaction of pyridoxal 5'-phosphate with tryptophan-139 at the subunit interaction of dimeric D-amino acid transaminase. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 2112-2116.

75. Graber R., Kasper P., Malashkevich V.N., Sandmeier E., Berger P., Gehring H., Jansonius J.N., Christen P. Changing the reaction specificityof a pyridoxal 5'-phosphate-dependent enzyme. Eur. J. Biochem., 1995, v. 232, p. 686-690.

76. Jager J., Moser M., Sauder U., Jansonius J.N. Crystal structures of Escherichia coli aspartate aminotransferase in two conformations. Comparison of an unliganded open and two liganded closed forms. J. Mol. Biol., 1994, v. 239, p. 285-305.

77. Okamoto A., Hoguchi T., Hirotsu K., Kuramitsu S., Kagamiyama H. X-ray crystallographic study of pyridoxal 5'-phosphate-type aspartate aminotransferases from Escherichia coli in open and closed form. J. Biochem., 1994, v. 116, p. 95-107.

78. Mehta P.K., Hale T.I., Christen P. Aminotransrerases: demonstration of homology and division into evolutionary subgroups. Eur J. Biochem., 1993, v. 214, p. 549-561.

79. Alexander F.W., Sandmeier E., Mehta P.K., Christen P. Evolutionary relationships among pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes. Regio-specific a,P, and y-families. Eur J. Biochem., 1994, v. 219, p. 953-960.

80. Creighton T.E. In Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freemah and Company, New York, 1993, p. 172-176.

81. Mouratou B., Kasper P., Gehring H., Christen P. Conversion of tyrosine phenol-lyase to dicarboxylic amino acid beta-lyase, an enzyme not found in nature. J. Biol. Chem., 1999, v. 274, N 3, p.1320-1325.

82. Giannattasio S., Marra E., Vacca R.A., Iannace G., Quagliariello E. Import of mutant forms of mitochondrial aspartate aminotransferase into isolated mitochondria. Arch. Biochem. Biophys., 1992, v. 298, p. 532537.

83. Gekko K., Tamura Y., Ohmae E., Hayashi H., Kagamiyama H., Ueno H. A large compressibility change of protein induced by a single amino acid substitution. Prot. Sci., 1996, v. 5, p. 542-545.

84. Gentry-Weeks C.R., Keith J.M., Thompson J. Toxicity of Bordetella avium beta-cystathionase toward MC3T3-E1 osteogenic cells. J. Biol. Chem., 1993, v. 268(10), p. 7298-7314.

85. Cavallini D., De Marco C., Mondovi В., Mori B.G. Enzymologia, 1960, v. 22, p. 161-173.

86. Dunathan Н.С. Stereochemical aspects of pyridoxal phosphate catalysis. In Adv. Enzymol., 1971, v. 35, p. 79-134.

87. Faleev N.G., Lyubarev A.E., Martinkova N.S., Belikov V.M. Mechanism and stereochemistry of oc,ß-elimination of L-tyrosine catalysed by tyrosine phenol-lyase. Enzyme Microb. Technol., 1983, v. 5, p. 219-224.

88. Palcic M.M., Shen S.-J., Schleicher E., Kumagai H., Sawada S., Yamada H., Floss H.G. Stereochemistry and mechanism of reactions catalysed by tyrosine phenol-lyase from Escherichia intermedia. Z. Naturforch., 1987, v. 42, N 4, p. 307-318.

89. Braunshtein A.E. Amino group transfer. In The Enzymes, 3rd Ed., Academic Press, New York, 1973, v. 9., p. 379-481.

90. Bazhulina N.P., Morozov Yu.V, Papisova A.I., Demidkina T.V. Pyridoxal 5"-phosphate Schiff base in Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyase. Eur. J. Biochem., 2000, v. 267, N 6, p. 1830-1836.

91. Siano D.B., Metzler D.E. Band shapes of the electronic spectra of complex molecules. J. Chem. Phys., 1969, v. 51, 1856-1861.

92. Metzler D.E., Harris C.M., Johnson R.J., Siano D.B. Spectra of 3-hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria. Biochemistry, 1973, v. 12(26), p. 5377-5392.

93. Metzler С.M., Metzler D.E. Quantitative description of absorption spectra of a pyridoxal phosphate-dependent enzyme using lognormal distribution curves. Anal. Biochem., 1987, v. 166, p. 313-327.

94. Faleev N.G., Ruvinov S.B., Demidkina T.V., Myagkikh I.V., Gololobov M.Yu., Bakhmutov V.l., Belikov V.M. Tyrosine phenol-lyase from Citrobacter intermedins. Eur. J. Biochem., 1988, v. 177, p. 395401.

95. Frômmel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy. J. Theor. Biol., 1984, v. Ill, p. 247-260.

96. Nagasawa T., Utagawa T., Goto J., Kim C.-J., Tani Y., Kumagai H., Yamada H. Syntheses of L-tyrosine-related amino acids by tyrosine phenol-lyase of Citrobacter intermedins. Eur. J. Biochem., 1981, v. 117, p. 33-40.

97. Sambruk J., Frisch E.F., Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, 1989.

98. Taylor J.W., Ott J., Eckstein F. The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified Dna. Nucl. Acids res., 1985, v. 13, p. 87648785.

99. Zhou A., Jiang X., Xu X. Improved alkaline lysis method for rapid isolation of plasmid DNA. Biotechniques, 1997, v. 24(4), p. 592-594.

100. Sanger F.S., Niklen S., Maniatis T. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, p. 54635467.

101. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.

102. Muro T., Nakatani H., Hiromi K., Kumagai H., Yamada H. Elementary processes in the interaction of tyrosine phenol-lyase with inhibitors and substrate. J. Biochem. (Tokyo), 1978, v. 84, N 3, p. 633-640.

103. Laemmli U., Cleavage of structural proteins during the assembly ofthe head bacteriophage T4. Nature, 1970, v. 227, p.680-685.157

104. Peterson E.A., Sober H.A. Preparation of crystalline phosphorylated derivatives of vitamin Bö- J.Am.Chem.Soc., 1954, v. 76, p. 169.

105. Glasoe P.Y., Long F.A. J. Phys. Chem., 1960, v. 64, p. 188-194.

106. Cleland W.W. Statistical analysis of enzyme kinetic data. Methods Enzymol., 1979, v. 63, p. 103-138.