Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие Citrobacter freundii метионин - γ-лиазы с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие Citrobacter freundii метионин - γ-лиазы с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле"

На правах рукописи

4843736

Морозова Елена Андреевна

Взаимодействие Citrobacterfreumlii метионин - у-лиазы с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

[1 4 ьГ. г ¿и il

Москва-2011

4843736

Работа выполнена в Лаборатории химических основ биокатализа Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Т.В. Демидкина

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Е.С. Громова

кандидат химических наук А.Р. Хомутов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

^ „Ор2о//ъ /г-

Защита состоится « ' ' <--''' в на заседании диссертационного

совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан «

^//ар 7?У

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат химических наук

. Крицын

Актуальность темы. Пиридоксаль-5'-фосфат-зависимые ферменты обладают уникальной способностью катализировать широкий спектр реакций в метаболизме аминокислот. На сегодняшний день известно более чем 140 различных ферментов, имеющих в качестве кофактора пиридоксаль-5 '-фосфат. Эти ферменты участвуют в синтезе, превращениях и деградации аминокислот и биогенных аминов, а также в синтезе тетрапиррольных соединений и метаболизме аминосахаров. Свидетельством их ключевой значимости в метаболизме биологически активных соединений является то, что пиридоксаль-5'-фосфат-зависимые ферменты используются в качестве мишеней при разработке лекарственных средств.

Пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый метаболизм серосодержащих аминокислот играет важную роль в живой клетке. S-Аденозилметионин, синтезируемый из метионина, является одним из важнейших биорегуляторов. Он служит предшественником в биосинтезе полиаминов, спермина и спермидина, которые участвуют в процессах клеточного деления и донором метальных групп в различных реакциях их переноса. В частности, метилирование РНК необходимо для обеспечения процесса трансляции. В эукариотических клетках метилирование ДНК играет важную роль в таких процессах как транскрипция генов, конденсация хроматина, эмбриональное развитие. Метионин также является предшественником в синтезе пропионил-СоА, образующийся из которого сукцинил-СоА участвует в цикле Кребса, являющимся одним из основных процессов клеточного метаболизма.

Пиридоксапь-5'-фосфат-зависимая метионин - у-лиаза - фермент, участвующий в метаболизме серосодержащих аминокислот, который катализирует реакцию расщепления метионина с образованием метилмеркаптана, аммиака и а-кетобутирата. Наличие метионин - у-лиазы в патогенах - бактериях и одноклеточных эукариотах и отсутствие ее в клетках животных и человека обусловливает перспективность использования этого фермента в качестве биохимической мишени для создания новых антипатогенных лекарственных препаратов. Дизайн препаратов, ингибирующих фермент, требует знания структурно-функциональных аспектов механизма его действия.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось изучение механизма реакции у-элиминирования L-метионина, катализируемой пиридоксаль-5'-фосфат-зависимой метионин - у-лиазой Citrobacter freundii. В работе решались следующие задачи: 1) определение стационарных кинетических параметров взаимодействия метионин - у-лиазы с рядом аминокислот -субстратов и потенциальных ингибиторов и исследование вклада стадий обмена С-а- и С-ß-протонов ингибиторов в ферментативную реакцию; 2) получение кристаллов

3

холофермента, дающих высокое рентгенографическое разрешение; 3) спектральная идентификация интермедиатов, образуемых ферментом с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Исследование кинетических параметров взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами в растворе позволило предположить скорость-лимитирующую стадию реакции у-элнминирования L-метионина. Получены кристаллы холофермента, дающие разрешение 1,35 А. Впервые для пиридоксапь-5'-фосфат-зависимых ферментов

основание Шиффа пиридоксаль-5'-фосфата с аммиаком идентифицировано в кристаллах, полученных в присутствии сульфата аммония. Показано, что кристаллы холофермента каталитически компетентны и их комплексы с аминокислотами могут быть использованы для определения пространственных структур трех интермедиатов реакции у-элиминирования.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международной конференции «Vitamins, Coenzymes, and Biofactors» (Авайи, Япония, 2005 г.), на международной конференции «Biocatalysis - 2007: fundamentals and applications» (Москва - Санкт-Петербург, Россия, июнь 2007 г.), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.) и на международной конференции «Perspectives en Enzymologie» (Сант-Мало, Франция, июль 2008 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах,

включает рисунка, таблиц и содержит ссылок на литературные

источники. Диссертация состоит из глав: введение, обзор литературы, результаты работы и их обсуждение, методы исследования, выводы и список литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Метионин - у-лиаза (МГЛ, КФ 4.4.1.11) - пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый фермент, катализирующий реакцию у-элиминирования L-метионина с образованием метилмеркаптана, аммиака и а-кетобутирата. Фермент также катализирует реакцию ß-элиминирования цистеина и его S-алкилзамещенных производных, а также реакции у- и ß-замещения L-метионина, L-цистеина и их аналогов. Объектом данного исследования являлась МГЛ из Citrobacter freundii. Фермент представляет собой гомотетрамер, каждая субъединица которого имеет молекулярную массу 43 кДа и связывает одну молекулу пиридоксапь-5'-фосфата.

Химический механизм реакции у-элиминирования L-метионина представлен на схеме 1. В активном центре фермента кофактор, ковалентно связанный с в-аминогруппой остатка лизина, образует так называемый «внутренний альдимин» (основание Шиффа).

При взаимодействии с субстратом в результате реакции трансальдимшшроваиия образуется «внешний альдимин» (I). Отрыв протона от С-а-атома, протежирование С4'-атома кофермента и отрыв протона от С-Р-атома приводит к образованию енамина (IV). Далее происходит элиминирование метантиола, образование Р,у-ненасыщенного кетимипа (V) с последующим превращением его в аминокротонат (VI). Атака аминокротоната е-аминогруппой лизииа активного центра фермента приводит к его дезамииированшо, регенерации внутреннего альдимина и высвобождению а-иминомаслянной кислоты, которая затем подвергается неферментативному гидролизу с образованием а-кетобутирата и аммиака.

СООН

МГЛ

СОО

ин

Г

Р1.Р

внешний альдимин (I) ^та\~420 нм

СН3"

соо

ин

г

Р1-Р

а-аминокротонат (VI)

СН3'

СОО

ИН _-

{ "-

Р1.Р

хиноидный интермедиат (II) Хт..~500 нм

СОО

N11 _

С т

(3,у-ненасыщенный кетимин (V)

СОО

N11

СН3'

Р1Р

кетиминный интермедиат (III)

,СОО

СНзЭН

N11

Р1.Р

енамин (IV)

^•тах~320 НМ

СН;

СОО

+ ЫН4 + МГЛ

Схема 1. Механизм реакции а,у-элиминирования, катализируемой МГЛ.

Благодаря наличию кофермента, пиридоксаль-5'-фосфат-зависимые ферменты обладают уникальными спектральными свойствами, позволяющими идентифицировать отдельные интермедиаты ферментативной реакции. До сих пор кинетические и

5

спектральные данные для пиридоксаль-5'-фосфат-зависимой ферментативной реакции у-элиминирования весьма ограничены. Изучение взаимодействия фермента с аминокислотами в растворе и кристалле, а также подбор условий для получения кристаллических комплексов фермента с субстратами и ингибиторами, моделирующих интермедиа™ реакции у-элиминирования, внесет вклад в изучение механизма реакции у-элиминирования и позволит, в дальнейшем, применить полученные знания для рационального дизайна антипатогенных препаратов.

1. Взаимодействие МГЛ с субстратами и ингибиторами в растворе.

Полученные нами кинетические параметры реакции у-элиминирования РяДа субстратов приведены в таблице 1. Сопоставление величин Кт, приведенных в таблице, показывает, что, во-первых, атом серы вносит существенный вклад в эффективное связывание субстратов, а его окисление до сульфоновой или сульфоксидной групп заметно ухудшает связывание соответствующих аналогов метионина. Во-вторых, величины ка\ для субстратов, не требующих катализа на стадии элиминирования заместителя в у-положении, и для Ь-винилглицина, для которого эта стадия отсутствует, оказались меньше, чем величины ксл для Ь-метионина и ОЬ-гомоцистеина. Это позволяет предположить, что стадия элиминирования у-заместителя не является скорость-лимитирующей стадией ферментативной реакции.

Таблица 1. Кинетические параметры реакций у-элиминирования, катализируемой

С./геипсШ МГЛ.

Субстрат С./геипсШ МГЛ

ксл (с'1) Кт (мМ)

Ь-метионин 6,2±0,42 0,7±0,11

ОЬ-гомоцистеин 8,51±0,41 0,97±0,15

ОЬ-гомосерин 0,52±0,017 56,5±6,5

О-ацетил-ОЬ-гомосерин 2,1±0,053 5,82±0,36

Ь-метионинсульфон 2,09±0,14 4,02±0,59

Ь-метионинсульфоксид 2,52±0,002 6,21±0,84

Ь-винилглицин 1,9±0,043 6,7±0,66

Поскольку образование внешнего альдимина (схема 1, структура I) является общей стадией для разнообразных реакций, катализируемых пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами, аминокислоты, как правило, являются конкурентными ингибиторами этих ферментов и исследование их взаимодействий с ферментами позволяет выявлять закономерности, обеспечивающие эффективность связывания аминокислот с

6

пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами, выявить химические и кинетические характеристики отдельных стадий ферментативных реакций. Мы изучили ингибирование реакции у-элиминирования метионина рядом аминокислот - глицином, Г-апанином, Ь-а-аминомасляной кислотой, Ь-норвалином и Ь-норлейцином. Все аминокислоты оказались конкурентными ингибиторами МГЛ. В таблице 2 приведены полученпые константы конкурентного ингибирования. Рентгеноструктурныи анализ МГЛ показал, что активный центр фермента содержит значительное количество гидрофобных остатков. В согласии с этим, для аминокислот с неразветвленной боковой цепыо в ряду Ь-сс-аминомасляная кислота, Ь-норвалин, Ь-норлейцин с увеличением количества метиленовых групп в аминокислотах наблюдается улучшение связывания.

Таблица 2. Кинетические параметры изотопного обмена а- и (3- протонов Ь-аминокислот.

Аминокислота Кх (Кт = Кр), мМ ¿об, С а-КИЭ Кол-во обмениваемых а- и Р-протонов

а-Н р-н

глицин 49 20,2 - 1;-

Ь-аланин 3,4 2,71 2,63 1,43 1;3

Ь-сс-аминомасляная 8,3 4,52 3,04 1 1;2

кислота

Ь-норвалин 4,7 20,6 1М 0,95 1;2

Ь-норлейцин 0,6 41,8 4,74 1,45 1;2

2-[2Н]-Ь-аланин 3,4 - 1,84 -; 2

2-[2Н]- Ых- 8,3 - 3,04 -; 2

аминомасляная

кислота

2-[2Н]-Ь-норвалин 4,7 - 11,7 -; 2

2-[2Н]-Ь-норлейцин 0,6 - 3,26 2

2. Кинетика обмена а- и ^-протонов конкурентных ингибиторов, катализируемого

МГЛ.

Известно, что, действуя на субстраты или конкурентные ингибиторы в 020, МГЛ способна катализировать изотопный обмен их а- и (5-протонов на дейтроны. Этот факт согласуется с описанным выше механизмом действия фермента (схема 1), предполагающим обратимый отрыв а- и Р-протонов, связанных в активном центре аминокислот, на определенных каталитических стадиях. Используя метод 'Н ЯМР, для

7

ряда ингибиторов с линейной боковой цепью мы провели анализ интегральных кривых изотопного обмена как а-, так и (3-протонов, катализируемого МГЛ. Обмен а-протонов рассматривался на примере как обычных аминокислот, так и их монодейтерированных аналогов, полученных нами ферментативным методом с использованием пиридоксаль-5'-фосфат-зависимой триптофан - индол-лиазы (КФ 4.1.99.1). Таким путем мы могли, сопоставляя полученные результаты, оценить кинетический изотопный эффект (КИЭ) от введения дейтрона в а-положение на реакцию обмена (3-протонов, а также исключить влияние меняющегося по ходу реакции содержания дейтерия в а-положении на скорость обмена [3-протонов. Мы установили, что во всех рассматривавшихся случаях при обмене как а-, так и Р-протонов параметр 1п([8]о/([8]о-[Р]), где ([Э]о - исходная концентрация аминокислоты; [Р] - концентрация продукта изотопного обмена), меняется прямо пропорционально времени реакции вплоть до 80-85%-ной степени обмена (рис. 1).

И. 1.5

2 1

^ 0,5 I—9-

/

¿С_

время, мин. <А>

Рис. 1. Зависимость изменения параметра 1п([8]о/([8]о-[Р]) от времени для Ь-аланина и Ь-норлейцина. Кривая (1) - рассчитано для С-а- и С-Р-протонов Ь-аланина и С-Р-протонов 2-[2Н]-Ь-аланина (рисунки А, Б, В, соответственно); кривая (2) - рассчитано для С-а-, С-Р-протонов Ь-норлейцина и для С-Р-протонов 2-[2Н]-Ь-норлейцина (рисунки А, Б, В,

соответственно).

Этот результат позволяет сделать заключение, что для рассматриваемых реакций изотопного обмена, протекающих в условиях ингибирования продуктом, реализуется соотношение (1):

Km = Kv (1),

где Кт - константа Михаэлиса,

Kf - константа ингибирования продуктом, характеризующая связывание фермента с продуктом изотопного обмена.

В таблице 2 представлены значения кинетических параметров для реакций изотопного обмена, рассчитанные из наклонов соответствующих временных зависимостей (рис. 1) в соответствии с уравнением (2):

ln([S]o/([S]o-[P])) = МЕ]о' t IKM+ (ISlo/Kp)) (2)

Полученные результаты не дают оснований говорить о сколько-нибудь заметной

стереоселективности при обмене ß-протонов для рассматривавшихся аминокислот. Этот

факт представляется достаточно неожиданным, учитывая хиральные свойства активного

центра и ограничение свободного вращения вокруг связи Ca-Cß в структуре IV (схема 1),

являющейся ключевой при обмене ß-протонов.

В рамках предполагаемого механизма действия МГЛ необходимым и достаточным

условием для изотопного обмена а-протона является обратимое образование хиноидного

интермедиата (схема 1, структура II), предполагающее депротонирование внешнего

апьдимина (схема 1, структура I), изотопный обмен в каталитической группе - акцепторе

и последующее присоединение дейтрона к С-а-атому. При таком механизме обмена ß-

протоны, в принципе, не затрагиваются. С другой стороны, для обеспечения подвижности

ß-протонов необходимо образование структуры III, предполагающее депротонирование С-

а-атома аминокислоты и протонирование С4' -атома кофермента. Такой процесс также

обратим и может происходить как постадийно (с образованием промежуточного

хиноидного интермедиата), так и по согласованному механизму в одну стадию. Поскольку

кислотно-основкая(ые) группа(ы), участвующая(ие) в указанном взаимопревращении

структур I и III, способны к изотопному обмену с растворителем, обмен ß-протонов

неизбежно должен сопровоясдаться также и обменом а-протона. Как видно из таблицы 2,

скорости обмена а- и ß-протонов в случае L-a-аминомасляной кислоты достаточно

близки, а в случае L-аланина практически равны. Представляется вероятным, что

изотопный обмен a-протона в случае этих аминокислот в значительной степени связан

именно с взаимопревращением структур I и III. При переходе к L-норвапину и L-

норлейцину удлинение боковой цепи сопровождается ускорением обмена a-протона по

9

сравнению с (3-протонами, что может рассматриваться как свидетельство возрастания вклада простейшего механизма обмена а-протона (исключительно через хиноидный интермедиат), не затрагивающего р-протоны.

Значения величин кинетического изотопного эффекта, обусловленного заменой протона в а-положении на дейтрон, на скорости обмена Р-протонов невелики (табл. 2), а в случае Ь-а-аминомасляной кислоты и Ь-норвалина отсутствуют вовсе. На основании этого можно заключить, что вклад стадий, предполагающих отрыв а-протона, в суммарный энергетический барьер реакции обмена Р-протонов не является определяющим, хотя и заметным в случае Ъ-аланина и Ь-норлейцина.

3. Установление химического состояния пиридоксаль-5'-фосфата в двух пространственных структурах МГЛ.

Кристаллы холофермента МГЛ были получены нами методом «висячей капли» при 30° в двух условиях: о использованием в качестве осадителя монометилового эфира полиэтилеигликоля 2000 и с добавлением сульфата аммония в качестве второго осадителя. С использованием этих кристаллов были решены, совместно с Институтом белка РАН, две пространственные структуры с разрешением 1,35А (11ггее =17,7%) и 1,65 А (ЯгГее= 23,2%) соответственно (структуры А и Б).

(а) (б)

Рис. 2. Пространственная организация фермента, (а) - Гомотетрамер (структура А), (б) -наложение субъединиц структуры А (серый цвет) и структуры Б (черный цвет). В овале показан подвижный М-концевой домен полипептидной цепи.

Эти пространственные структуры имели существенные различия. В гомотетрамере структуры А (кристаллы выращены в отсутствие сульфата аммония) (рис. 2а) активный центр МГЛ находится в глубокой полости, сформированной аминокислотными остатками двух соседних мономеров. Кофермепт ковалентпо связан с е-аминогруппой Ьуз210. Альдиминная связь образует торсионный угол х=30° с плоскостью кофактора (атомы СЗ-С4-С4'-К4').

На рисунке 26 приведено наложение субъединиц (структуры А и Б). В двух структурах сохраняется общий ход полипептидной цепи и высокая подвижность Ы-концевого домена (рис. 26). Главное отличие структуры Б от структуры А заключается в отсутствии ковалентной связи между коферментом и остатком Ьуэ210 и необычной для пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов конформацией альдиминной связи, когда торсионный угол % составляет 102° (рис. 3).

Рис. 3. Наложение активных центров структур А и Б (серый и черный цвет, соответственно).

Разрыв связи во внутреннем альдимине, наблюдаемый в этой структуре, может возникать в результате:

1. Гидролиза внутреннего апьдимина.

2. Реакции трансальдиминирования между внутренним альдимином и аминами, присутствующими в кристаллизационной среде, такие как аммиак и трис(гидроксиметил)аминометан.

3. Разрушения альдиминной связи под воздействием рентгеновского излучения.

4. Реакции побочного трансаминирования с образованием пиридоксамин-5'-фоефата из-за присутствия неизвестной аминокислоты в кристаллизационной среде.

В первом случае пиридоксаль-5'-фосфат должен быть связан в активном центре нековалентно - ситуация, не характерная для пиридоксапь-5'-фосфат-зависимых ферментов. Следует также отметить, что дифракционные данные для обоих типов кристаллов собирались на одной и той же линии излучения при одинаковом времени экспозиции кристаллов. Поэтому влияние рентгеновского излучения на альдиминную связь мы считаем маловероятным.

Для идентификации химического состояния кофермента в структурах А и Б в совместной работе с университетом г. Парма нами были записаны спектры поглощения линейно поляризованного света в двух перпендикулярных направлениях (направление Ем -вдоль длины орторомбического кристалла, направление Ет - вдоль ширины кристалла) для обоих типов кристаллов МГЛ и проведено логнормальное разложение спектров (рис. 4).

Параметры полученных полос представлены в таблицах 3, 4. Разложение спектров поглощения кристалла (структура А) показало, что спектр внутреннего альдимина описывается смесью катионной и нейтральной форм кетимина с преобладанием первой (рис. 5, структуры 2 и 5, соответственно). Кроме основных двух форм, в спектре присутствуют минорные структуры - структура с полосой поглощения с в области 324 им, параметры которой соответствуют биполярному иону с альдиминной связью, полностью выведенной из сопряжения с я-электронами кольца пиридоксаль-5'-фосфата, и конформеры структур 2 и 5 с альдиминной связью, также полностью выведенной из сопряжения с л-электронами кольца кофермента (рис. 4, структуры З1, 21, 51, соответственно). Ранее мы установили, что в растворе, в отличие от кристаллов, основными формами внутреннего альдимина являются два таутомера его катионной формы - кетимин и енолимин.

Длина волны, им Длина волны, им

(а) (б)

Рис. 4. Разложение спектров линейно поляризованного света в двух перпендикулярных направлениях (Ем и Ет) для кристаллов МГЛ, выращенных в отсутствие (а) и присутствии (б) сульфата аммония.

Параметры полученных полос представлены в таблицах 3, 4. Разложение спектров поглощения кристалла (структура А) показало, что спектр внутреннего альдимина описывается смесью катиокной и нейтральной форм кетимина с преобладанием первой (рис. 5, структуры 2 и 5, соответственно). Кроме основных двух форм, в спектре присутствуют минорные структуры - структура с полосой поглощения с в области 324 нм, параметры которой соответствуют биполярному иону с альдиминной связью, полностью выведенной из сопряжения с я-электронами кольца пиридоксаль-5'-фосфата, и конформеры структур 2 и 5 с альдиминной связью, также полностью выведенной из сопряжения с я-электронами кольца кофермента (рис. 4, структуры З1, 21, 5х, соответственно). Ранее мы установили, что в растворе, в отличие от кристаллов, основными формами внутреннего альдимина являются два таутомера его катионной формы - кетимин и енолимин.

Таблица 3. Параметры полос поглощения линейно поляризованного света в кристалле МГЛ (структура А). Энергия электронного перехода, Е\ волновое число, v; длина волны, А,; интенсивность полосы, /; полуширина, Щ асимметрия, р.

Направление vxlO

Структуры Е (еУ) X (нм) I р

поляризации (см ) (см )

* 2,54 20,46 488,8 0,003 2,93 1,27

2 2,92 23,55 424,6 0,679 3,53 1,60

5 2,95 23,83 419,6 0,139 4,02 1,56

3 3,51 28,34 352,9 0,017 3,65 1,45

Направление 1 3,63 29,26 341,8 0,056 3,68 1,23

Ем 4 3,71 29,95 333,9 0,051 3,70 1,22

21 3,79 30,57 327,1 0,046 3,47 1,29

З1 3,82 30,84 324,2 0,033 3,51 1,36

51 3,96 31,92 313,3 0,050 3,62 1,42

** 4,36 35,20 284,1 0,486 5,00 1,05

* 2,54 20,46 488,8 0,006 2,93 1,27

5 2,95 23,83 419,6 0,139 4,02 1,56

Направление 3 3,51 28,34 352,9 0,017 3,65 1,45

в 4 3,71 29,95 333,9 0,051 3,70 1,22

^т З1 3,82 30,84 324,2 0,033 3,51 1,36

51 3,96 31,92 313,3 0,050 3,62 1,42

** 4,38 35,30 283,3 0,324 4,20 1,05

*, ** Полосы представляют собой смесь интермедиатов или экспериментальная информация об этих полосах недостаточна.

Таблица 4. Параметры полос поглощения линейно поляризованного света в кристалле МГЛ (структура Б). Энергия электронного перехода, Е\ волновое число, V; длина волны, X; интенсивность полосы,/; полуширина, IV; асимметрия, р.

Направление поляризации Структуры £(еУ) ух 10"3 (см"1) X (нм) / IV х Ю-3 (см"1) Р

* 2,56 20,66 484,0 0,018 3,03 1,27

2 2,92 23,58 424,1 0,336 3,53 1,58

5 2,95 23,78 420,5 0,107 4,12 1,56

3,28 26,46 377,9 0,050 3,87 1,37

3 3,50 28,24 354,1 0,101 3,65 1,45

Направление 1 3,63 29,26 341,8 0,080 3,68 1,23

Ем 4 3,70 29,85 335,0 0,094 3,70 1,22

1' 3,74 30,15 331,7 0,597 3,52 1,56

21 3,80 30,65 326,3 0,135 3,49 1,32

З1 3,96 31,92 313,3 0,113 3,62 1,42

51 ** 4,39 35,40 282,5 0,757 4,90 1,05

* 2,56 20,66 484,0 0,025 3,03 1,27

5 2,95 23,78 420,5 0,107 4,12 1,56

5а 3,28 26,46 377,9 0,050 3,87 1,37

Направление' р 3 4 3,50 3,70 28,24 29,85 354,1 335,0 0,101 0,094 3,65 3,70 1,45 1,22

V 3,74 30,15 331,7 0,118 3,52 1,56

З1 3,81 30,74 325,3 0,094 3,51 1,36

51 3,96 31,92 313,3 0,113 3,62 1,42

** 4,39 35,40 282,5 0,671 4,90 1,09

*, ** Полосы представляют собой смесь интермедиатов или экспериментальная информация об этих полосах недостаточна.

-Н

2 5

Рис. 5. Катионная (2) и нейтральная (5) форма внутреннего альдимина МГЛ в кристалле.

В спектре кристалла (структура Б) кроме полос поглощения, характерных для структуры А (таблица 3), присутствует интенсивная полоса с А-тач в области 332 нм. Параметры этой полосы, такие как положение, полуширина, асимметрия, позволяли отнести ее или к основанию Шиффа с аммиаком с альдиминной связью, выведенной из сопряжения с тс-электронами кольца пиридоксаль-5'-фосфата, или к пиридоксамин-5'-фосфату - продукту реакции побочного трансаминирования. Расчеты показывают, что в последнем случае в растворе сульфата аммония, используемого для кристаллизации, нереально наличие количества примесной аминокислоты, необходимого для образования такого количества пиридоксамин-5'-фосфата, которое рассчитывается из спектров поглощения. Мы полагаем, что структуру Б следует интерпретировать как основание Шиффа пиридоксаль-5'-фосфата с аммиаком (рис. 6).

К210

2.95__.о.

I89—т--~"

G88— NH' 2.91

D185

N160

Рис. 6. Пиридоксаль-5'-фосфат-связывающий центр в структуре Б.

4. Спектральные характеристики комплексов фермента с аминокислотами в растворе и кристалле.

В спектрах поглощения комплексов МГЛ с глицином, L-аланином и L-норвалином в растворе наблюдается уменьшение интенсивности полосы поглощения с в области 420 нм и увеличение интенсивности полосы поглощения с в области 320-340 им (рис. 7а). Полосу поглощения с А^х в области 420 нм в спектрах следует отнести к поглощению внешнего альдимина, поскольку в комплексах происходит обмен С-а- и C-ß-протонов на дейтроны. Эта полоса обладает положительным знаком кругового дихроизма для всех исследуемых комплексов аминокислот (рис. 7а). Факторы анизотропии этой полосы в комплексах отличаются от фактора анизотропии аналогичной полосы в холоферменте, что также свидетельствует о принадлежности этой полосы к внешнему альдимину. Заметная разница интенсивности полос поглощения внешних альдиминов с в области 420 нм в трех комплексах может быть связана с тем, что равновесие между внешним альдимином и образовавшимися интермедиатами в комплексах различно и, кроме этого, существует вероятность различия в ионном составе внешних альдиминов. Увеличение интенсивности полосы поглощения с ^тах в области 320-340 нм можно отнести к присутствию в равновесной смеси интермедиатов, имеющих тетраэдрнческий С4'-атом пиридоксаль-5'-фосфата. Для глицина и L-аланина таким интермедиатом должен быть кетиминный интермедиат III, для L-норвалина - как интермедиат III, так и енамин IV (схема 1). Помимо интермедиатов, в этой области также должен поглощать и возможный для внешних альдиминов енольный таутомер.

Спектры комплексов в кристалле оказались практически идентичны спектрам комплексов в растворе. На рисунке 76 приведены спектры поглощения линейно поляризованного света для комплекса холофермента МГЛ с глицином в кристалле, снятые в двух перпендикулярных направлениях. В спектрах комплекса фермента с глицином также наблюдается уменьшение интенсивности полосы поглощения с XmaN в области 421 нм. При связывании глицина поляризационное отношение (отношение интенсивностей полос поглощения света с Х^т- в области 421 нм в двух перпендикулярных направлениях) уменьшается (рис. 76), что говорит о том, что или дипольные моменты перехода во внешнем и внутреннем альдиминах имеют разную ориентацию или что кольцо пиридоксапь-5'-фосфата реориентируется при образовании внешнего альдимина.

300 350 400 450 500 550

300 350 400 450 500 550 600

Длина волны,нм

Длина волны, нм

(а)

(б)

Рис. 7. (а) - Спектры поглощения (А) и кругового дихроизма (Б) холофермента (сплошная линия) и его комплексов с глицином (длинный пунктир), Ь-апанином (короткий пунктир) и Ь-норвалином (точки), (б) - Спектры поглощения линейно поляризованного света (А) и поляризационное отношение (ПО) для холофермента (сплошная линия) и комплекса фермента с глицином (пунктирная линия) в кристалле, снятые в двух направлениях (Ем и Ет).

Спектры поглощения комплекса фермента с Ь-метионином в кристалле (рис. 86) и в растворе (рис. 8а) имеют одинаковый характер, и наиболее заметным отличием от спектров фермент-ингибиторных комплексов является наличие двух хромофоров, поглощающих в области 440 - 480 нм, полосы поглощения которых в растворе обладают положительными знаками кругового дихроизма (рис. 8а, (Б)). Спектры поглощения комплекса МГЛ с Ь-винилглицином в растворе и кристалле оказались практически идентичными спектрам комплекса с Ь-метионином (спектры не приводятся). Для этого субстрата отсутствует стадия элиминирования у-заместителя, следовательно, его комплекс следует отнести к а-аминокротонату (схема 1). Поэтому мы полагаем, что полосы поглощения в области 440-480 нм принадлежат интермедиату(ам) реакции у-

элиминирования, образующем(им)ся на стадиях ферментативной реакции, следующих за стадией образования енамина. В спектрах поглощения линейно поляризованного света в кристалле присутствует полоса поглощения в области 330 нм, интенсивность которой возрастает в направлении Ет. В этой области может поглощать как (3,у-ненасыщенный кетимин (V) (схема 1), так и енольный таутомер аминокротоната.

350 400 450 500 Длина волны, нм

(а)

300 350 400 450 500 550 600 Длина волны, нм

(б)

Рис. 8. (а) - Спектры поглощения (А) и кругового дихроизма (Б) холофермента (сплошная линия) и его комплекса с Ь-метионином (длинный пунктир), (б) - Спектры поглощения линейно поляризованного света, снятые в двух направлениях (Ем и Ет, соответственно) и поляризационное отношение (ПО) для комплекса фермента с Ь-метионином в кристалле.

Поляризационное отношение уменьшается с увеличением концентрации Ь-метионина (рис. 86, верхняя панель) до практически независимого от длины волны числа 2. Это говорит о том, что наблюдаемые полосы поглощения связаны с электронными переходами с очень близкими направлениями дипольных моментов.

Методом спектрофотометрического титрования кристаллов МГЛ растворами субстратов с разной концентрацией были определены константы диссоциации фермент-субстратных комплексов для L-метионина и L-винилглиципа, равные 2,3 и 26 мМ, соответственно (рис. 86, вставка). Эти значения оказалось примерно в 3 раза выше, чем величины Кт, наблюдаемые для этих комплексов в растворе (0,7 и 6,7 мМ, соответственно). Одинаковый характер спектров фермент-субстратных комплексов в растворе и кристалле говорит о том, что в кристаллическом состоянии МГЛ каталитически компетентна.

5. Взаимодействие МГЛ с L-циклосерином.

Известно, что циклосерин является природным ингибитором пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов, причем некоторые ферменты он ингибирует необратимо. Представлялось интересным изучить его взаимодействие с МГЛ, поскольку комплекс L-циклосерина с ферментом может моделировать один из интермедиатов ферментативной реакции. В отличие от исследуемых аминокислот с неразветвленной боковой цепью, L-циклосерин оказался ингибитором смешанного типа реакции у-элиминирования L-метионина МГЛ-ой с высоким сродством к ферменту (значение К, 0,068 мМ оказалось на порядок меньше, чем Кт для L-метионина). В спектрах комплекса фермента с L-циклосерином, как в растворе, так и в кристалле, наблюдается уменьшение интенсивности полосы поглощения с Атм в области 421 им, сопровождающееся образованием интенсивной полосы поглощения с А^ в области 330 нм (рис. 9а и 96).

Эта полоса может быть отнесена к кетимину (схема 1, структура III), к енольному таутомеру внешнего альдимина, а также к 3-гидроксиизоксазольному производному ПМФ.

Смешанный характер ингибирования реакции у-элиминирования, показанный для L-циклосерина, предполагает, что ингибитор связывается как со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом.

300 350 400 450 500 550

300 350 400 450 500 550

Длина волны, нм

Длина волны, нм

(а)

(б)

Рис. 9. (а) - Спектры поглощения холофермента (сплошная линия) и его комплекса с Ь-циклосерином в растворе (пунктирная линия), (б) - Спектры поглощения линейно

поляризованного света, снятые в двух направлениях (Ем и Ет) для холофермента (сплошная линия) и его комплекса с Ь-циклосерином (пунктирная линия) в кристалле.

Методом вымачивания кристаллов холофермента в растворе Ь-циклосерина нами был получен комплекс МГЛ с этой аминокислотой и определена пространственная структура комплекса (разрешение 1,60 А, Яггее=13,68%).

На рисунке 10 показано наложение фрагментов активных центров холофермента и его комплекса с Ь-циклосерином. В активном центре Ь-циклосерин связывается с коферментом ковалентно. Мы не обнаружили дополнительного связывания еще одной молекулы Ь-циклосерина с ферментом (на поверхности белка или в активном центре). Возможно, конформационные изменения, происходящие при конкуренции Ь-метионина и Ь-циклосерина в растворе, дают возможность Ь-циклосерину связываться еще в одном месте. Комплекс с Ь-циклосерином для рентгеноструктурного анализа был получен в отсутствие конкуренции субстрата и ингибитора.

Рис. 10. Наложение фрагментов активных центров холофермента (показано черным) и его комплекса с Ь-циклосерином (показано серым).

выводы.

1. Определены константы скоростей катализируемого МГЛ обмена С-а- и С-Р-протонов ряда ингибиторов на дейтерий и кинетический изотопный эффект дейтериевой метки в С-а-положешш ингибиторов на скорости обмена их С-Р-протонов. Не обнаружено стереоселективности при обмене С-Р-протонов и заметного изотопного эффекта дейтерия в С-а-положении на скорость обмена С-р-протонов.

2. Данные стационарной кинетики реакции у-элиминирования ряда субстратов, содержащих различные уходящие группы, спектральные характеристики фермент-субстратных комплексов и данные о скоростях обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов фермента позволяют предположить, что скорость-лимитирующей стадией реакции у-элиминирования является стадия дезаминирования аминокротоната.

3. Получены кристаллы холофермента МГЛ, дающие разрешение 1,35 Â. Определены ионный и таутомерный составы «внутреннего» апьдимина в кристаллическом состоянии.

4. Внешний альдимин (основание Шиффа пиридоксаль-5'-фосфата с аммиаком) идентифицирован в кристаллах холофермента метионин - у-лиазы, полученных в присутствии сульфата аммония.

5. Исследовано взаимодействие МГЛ с субстратами и ингибиторами в кристаллическом состоянии. Показано, что кристаллы МГЛ каталитически компетентны.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Морозова, Е.А., Бажулина, Н.П., Ануфриева, Н.В., Ткачев, Я.В., Стрельцов, С.А., Тимофеев, В.П., Фалеев, Н.Г., Демидкина, Т.В. Кинетические и спектральные параметры взаимодействия Citrobacter freundii метионин - у-лиазы с аминокислотами. (2010), Биохимия, т. 75,10,1435-1445.

2. Ronda, L., Bazhulina, N.P., Morozova, Е.А., Revtovich, S.V., Chekhov, V.O., Nikulin. A.D., Demidkina, T.V., Mozzarelli, A. Exploring methionine y-Iyase structure-function relationship via microspectrophotometry and X-ray crystallography. (2010), Biochim. Biophys. Acta, принята в печать, электронный вариант опубликован на сайте журнала.

3. Nikulin, A., Revtovich, S., Morozova, Е., Nevskaya, N., Nikonov, S., Garber, M., Demidkina, T. High-resolution structure of methionine y-lyase from Citrobacter freundii. (2008), Acta Crystallography Section D, D64, 211-218.

4. Манухов, И.В., Мамаева, Д.В., Морозова, E.A., Расторгуев, С.M., Фалеев, Н.Г., Демидкина, Т.В., Завильгельский, Г.Б. L-Метионин - у-лиаза Citrobacter freundii:

клонирование гена и кинетические параметры фермента. (2006), Биохимия, т. 71, 4, 454463.

5. Mamaeva, D.V., Morozova, Е.А., Nikulin, A.D., Revtovich, S.V., Nikonov, S.V., Garber, M.B., and Demidkina, T.V. Structure of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase. (2005), Acta Cryst., F61,546-549.

Материалы работы, опубликованные в виде тезисов сообщений на конференциях:

1. I.V. Manukhov, D.V. Mamaeva, S.V. Revtovich, A.D. Nikulin, E.A. Morozova, N.G. Faleev, G.B. Zavilgelsky, T.V. Demidkina, A gene encoding L-methionine y-lyase is present in Enterobacteriaceae family genomes. Identification and characterization of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase, Book of abstracts, International Interdisciplinary Conference on Vitamins, Coenzymes, and Biofactors, Awaji, Japan, L15M, 2005.

2. A.D. Nikulin, E.A. Morozova, S.V. Revtovich, S.V. Nikonov, M.B. Garber and T.V. Demidkina, High resolution structures of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase, Book of abstracts, International conference Biocatalysis - 2007: fundamentals and applications, Moscow - St. Petersburg, P28, 2007.

3. E.A. Morozova, V.V. Kulikova, N.P. Bazhulina, and T.V. Demidkina, L-Methionine y-lyase Citrobacter freundii: kinetic and spectral properties, Book of abstracts, International conference Biocatalysis - 2007: fundamentals and applications, Moscow - St. Petersburg, PI 13, 2007.

4. E.A. Морозова, А.Д. Никулин, C.B. Ревтович, Д.В. Мамаева, Н.П. Бажулина, H.A. Невская, J1. Ронда, М.Б. Гарбер, А. Моццарелли, С.В. Никонов, Т.В. Демидкина, Пиридоксаль-5'-фосфат-зависимая метионин - у-лиаза: взаимодействие с аминокислотами в растворе и кристалле, Сборник тезисов, IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 38, 2008.

5. А. Nikulin, S. Revtovich, Е. Morozova, N. Nevskaya, М. Garber, S. Nikonov, Т. Demidkina, L-methionine y-lyase: structural studies of potential drug target, Trends in enzymology ("Perspectives en Enzymologie"), Palais du Grand Large - Saint-Malo, France, 2-5 July 2008.

Заказ №45/03/2011 Подписано в печать 09.03.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Морозова, Елена Андреевна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Пиридоксаль-5'- фосфат зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот, как мишени для рационального дизайна новых лекарственных средств.

1. Химические основы многообразия реакций, катализируемых ПЛФ-зависимыми ферментами.

1.2. Механизм реакций, катализируемых ПЛФ-зависимыми лиазами.

1.3. Механизмы ингибирования ПЛФ-зависимыми ферментов.

1.3.1. Нековалентная инактивация.

1.3.2. Активированные нуклеофилы.

1.3.3. Активированные электрофилы.

1.3.4. Проблема специфичности потенциальных ингибиторов.

2. ПЛФ-зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот.

2.1. Сравнительный анализ хода полипептидной цепи в молекулах ПЛФ-зависимых ферментов, участвующих в метаболизме метионина и цистеина.

3. Ферменты метаболизма серосодержащих аминокислот — новая мишень для лекарственных средств.

3.1. Цистатионин-у-синтаза.

3.2. Цистатионин-р-лиаза.

3.3. Цистатионин-у-лиаза.

3.4. Цистализин.

3.5. Цистатионин-р-синтаза.

3.6. О-Ацетил серии—сульфогидро л аза.

3.7. Метионин-у-лиаза.

3.7.1. Структурные различия между бактериальной МГЛ и человеческой ЦГЛ.

3.7.2. МГЛ как потенциальная мишень для антимикробных агентов.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Введение.

2.2. Кинетические параметры взаимодействия МГЛ с субстратами и ингибиторами.

2.3. Кинетика обмена а- и Р-протонов конкурентных ингибиторов МГЛ.

2.4. Установление химии ПЛФ в двух пространственных структурах МГЛ.

2.5. Спектральные характеристики комплексов фермента с аминокислотами в растворе и кристалле.

2.6. Взаимодействие МГЛ с Ь-циклосерином.

ВЫВОДЫ.

III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Выращивание бактериальной массы, выделение и очистка фермента.

3.2. Определение концентрации белка.

3.3. Определение активности фермента.

3.4. Определение чистоты выделенного фермента.

3.5. Получение 2-[2Н]-аминокислот.

3.6. Кинетические исследования.

3.7. Спектральные исследования фермента.

3.8. Кристаллизация МГЛ.

3.9. Микроспектрофотометрические исследования кристаллов МГЛ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие Citrobacter freundii метионин - γ-лиазы с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле"

Пиридоксаль-5'-фосфат является одной из активных форм витамина Вб, который способствует нормальному функционированию мозга, образованию клеток крови, поддерживает химический баланс в организме, принимает участие в метаболизме углеводов, белков и липидов. В середине сороковых годов впервые было показано, что ПЛФ является кофактором ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот [1]. С этого времени ПЛФ-зависимые ферменты становятся предметом активного изучения. Этот интерес объясняется уникальной способностью ферментов данного класса катализировать широкий спектр реакций в метаболизме аминокислот. На сегодняшний день известно более чем 140 различных ферментов, имеющих в качестве кофактора ПЛФ. ПЛФ-зависимые ферменты не только участвуют в синтезе, взаимных превращениях и деградации аминокислот и биогенных аминов, они также играют большую роль в синтезе тетрапиррольных соединений и метаболизме аминосахаров. Результатом их ключевой значимости в метаболизме биологически активных соединений является то, что некоторые из ПЛФ-зависимых ферментов широко используются в качестве мишеней для лекарственных средств [2,3].

ПЛФ-зависимая метионин-у-лиаза (МГЛ, К.Ф. 4.4.1.11) катализирует у-элиминирование L-метионина с образованием метантиола, а-кетобутирата и аммиака. МГЛ была найдена во многих бактериях и одноклеточных эукариотах, в том числе и патогенных, таких как Clostridium sporogenes, Treponema denticola, Phorphyromonas gingivalis, Entamoeba hystolytica, Trichomonas vaginalis. Отсутствие фермента в клетках млекопитающих указывает на то, что МГЛ представляет значительный интерес в связи с возможностью использования его в качестве биохимической мишени для рационального дизайна антипатогенных лекарственных средств.

МГЛ - один из наименее изученных ПЛФ-зависимых ферментов. Впервые она была выделена и частично очищена из Pseudomonas putida японскими исследователями в 1977г. Немногочисленные данные о реакционной и субстратной специфичности МГЛ получены для фермента из Р. putida, Т. vaginalis и Citrobacter freundii.

Целью данной работы являлось изучение механизма реакции у-элиминирования L-метионина, катализируемой ПЛФ-зависимой МГЛ С. freundii. В работе решались следующие задачи: 1) определение стационарных кинетических параметров взаимодействия МГЛ с рядом аминокислот -субстратов и потенциальных ингибиторов и исследование вклада стадий обмена С-а- и С-р-протонов ингибиторов в ферментативную реакцию; 2) получение кристаллов холофермента, дающих высокое рентгенографическое разрешение; 3) спектральная идентификация интермедиатов, образуемых ферментом с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле.

I. ПЛФ-зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот, как мишени для рационального дизайна новых лекарственных средств

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Морозова, Елена Андреевна

выводы.

1. Определены константы скоростей катализируемого метионин — у-лиазой обмена С-а- и С-Р-протонов ряда ингибиторов на дейтерий и кинетический изотопный эффект дейтериевой метки в С-а-положении ингибиторов на скорости обмена их С-Р-протонов. Не обнаружено стереоселективности при обмене С-Р-протонов и заметного изотопного эффекта дейтерия в С-а-положении на скорость обмена С-р-протонов.

2. Данные стационарной кинетики реакции у-элиминирования ряда субстратов, содержащих различные уходящие группы, спектральные характеристики фермент-субстратных комплексов и данные о скоростях обмена С-а- и С-р-протонов ингибиторов фермента позволяют предположить, что скорость-лимитирующей стадией реакции у-элиминирования является стадия дезаминирования аминокротоната.

3. Получены кристаллы холофермента метионин - у-лиазы, дающие разрешение 1,35 А. Определены ионный и таутомерный составы внутреннего альдимина в кристаллическом состоянии.

4. Внешний альдимин (основание Шиффа ПЛФ с аммиаком) идентифицирован в кристаллах холофермента метионин — у-лиазы, полученных в присутствии сульфата аммония.

5. Исследовано взаимодействие метионин - у-лиазы с субстратами и ингибиторами в кристаллическом состоянии. Показано, что кристаллы метионин - у-лиазы каталитически компетентны.

III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Выращивание бактериальной массы, выделение и очистка фермента

Клетки E.coli BL21 (DE3), содержащие ген МГЛ из С. freundii в плазмиде pET-mgl, выращивали в колбах объемом 2 л, содержащих 1 л «индуцирующей» среды (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,012% MgS04, 0,05% глицерина, 0,005% глюкозы, 0,02% лактозы, 0,033% сульфата аммония, 0,068% КН2РО4, 0, 07% ]МагНР04), с добавлением 0,01% ампицилина. Выращивание клеток проводили при 37° с перемешиванием (180 об/мин) 24 часа. Клетки собирали центрифугированием в течение 30 минут при 12000 об/мин. при 4° и хранили при -80°. Из 1 л среды получали в среднем около 3 г клеточной массы.

Клетки суспендировали в 0,1 М калий-фосфатном буфере, pH 8,0, содержащим 0,1 мМ ПЛФ, 1мМ ЭДТА, 5мМ дитиотреитол и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (15-20 кГц) при охлаждение в течение 4-5 минут. До и после разрушения клеток к суспензии добавляли раствор фенилметансульфонилфторида до конечной концентрации 0,001 М. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 30 минут при 18000 об/мин.

Осаждение нуклеиновых кислот в клеточном экстракте проводили при комнатной температуре протаминсульфатом из расчета 0,14 мг на 1 мг белка. Суспензию центрифугировали в течение 20 минут при 15000 об/мин, осадок отбрасывали. Полученный раствор белка наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,1 М калий-фосфатном буфером, pH 8,0, содержащим 0,1 мМ ПЛФ, 1мМ ЭДТА, 5мМ дитиотреитол. Фермент элюировали ступенчатым градиентом хлористого калия в буфере того же состава, изменяя концентрацию хлористого калия от 0,1 М до 0,ЗМ. Активные фракции фермента собирали и концентрировали на ячейках для концентрирования Vivaspin 2 (30,000 MWCO) фирмы «VIVASCIENCE». Концентрированный раствор фермента (20-30 мг/мл) наносили на колонку с супердексом S-200, уравновешенную 0,1 М калий-фосфатном буфером, pH 8,0, содержащим 0,1 мМ ПЛФ, 1мМ ЭДТА, 5мМ дитиотреитол. Фермент элюировали тем же буфером. После хроматографии очищенный белок хранили при -20°С.

3.2. Определение концентрации белка

Определение концентрации белка в процессе очистки проводили по методу Лоури, с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта [130]. Концентрацию чистого фермента определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение при 278 нм и используя коэффициент поглощения 0,1% раствора МГЛ, рассчитанный, исходя из определения концентрации препаратов по методу Лоури [130] и соответствующих значений поглощения при 278 нм, равный 0,8.

3.3. Определение активности фермента

Активность МГЛ в процессе очистки определяли, используя в качестве субстрата S-этил-Ь-цистеин, измеряя скорость образования пирувата в сопряженной реакции с лактатдегидрогеназой по снижению поглощения NADH при 340 нм (Ав= 6220 М-1см-1) при 30°. Реакционная смесь содержала 100 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8,0), 0,1 мМ ПЛФ, 5 мМ дитиотреитол, 0,2 мМ NADIi, 10 единиц лактатдегидрогеназы и 2,5 мМ S-этил-Ь-цистеин. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1,0 мкМ/мин пирувата.

3.4. Определение чистоты выделенного фермента

Чистоту полученного препарата проверяли при помощи Ds-Na-ПААГ-электрофореза по методу Лэммли [131]. В качестве стандарта использовали смесь белков с известным молекулярным весом фирмы «Sigma». Препараты фермента 95% чистоты имели удельную активность 12 ед/мг.

3.5. Получение 2-[2Н]-аминокислот л

2-[ Н]-Аминокислоты были получены из соответствующих недейтерированных аналогов ферментативным методом, используя триптофан-индол-лиазу по методике, описанной ранее [132].

3.6. Кинетические исследования

При определении кинетических параметров реакции у-элиминирования реакционные смеси содержали 100 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8,0), 0,1 мМ ПЛФ, 1мМ ЭДТА, 5мМ дитиотреитол и варьируемые количества субстратов. Скорость ферментативной реакции определяли по скорости образования а-кетобутирата с помощью динитрофенилгидразина [133]. Реакцию инициировали добавлением 1-5 мкг фермента. Смесь инкубировали 15 мин при 30°, останавливали реакцию добавлением трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 12,5% (m/V).

Исследование ингибирования реакции у-элиминирования L-метионина различными аминокислотами исследовали в условиях, описанных выше.

Кинетику реакций обмена С-а- и С-Р-протонов ингибиторов на дейтерий, катализируемые МГЛ, исследовали методом спектроскопии ЯМР 'Н. Реакционная смесь содержала 0,05 М калий-фосфатный буфер, pD 7,6, 2 мг/мл соответствующего ингибитора в 0,5 мл D2O. Реакция инициировалась добавлением 0,01 мл раствора фермента (0,5 мг/мл) к реакционной смеси при 37°. Спектры ЯМР 1Н записывали на спектрометре Bruker AMXIII-400 с рабочей частотой 400 МГц. С помощью специально разработанной программы автоматизации производили запись серии спектров через определенные интервалы времени. Сигналы а- и p-протонов интегрировали с помощью модифицированной программы автоматизации «enzkin», входящей в состав XWIN-NMR программ.

Принимая Кт равным К\ для конкурентного ингибирования реакции с L-метионином и определив соотношение [S]o/([S]o-[P]o) из спектра ЯМР скорость дейтерообмена рассчитывали из интегральной зависимости степени превращения субстрата от времени с учетом ингибирования продуктом [134] с использованием уравнения:

Vmax= (iCm+[S]0)/t * ln([S]o/([S]o-[P]), где [S]o - концентрация ингибитора, [Р] - концентрация продукта, t-время инкубации.

Параметры стационарной кинетики - константу Михаэлиса (Кт) и константу скорости (&cat) - определяли, применяя программу нелинейных квадратов Enzfitter (Elsevier Biosoft) [135], с использованием уравнения Михаэлиса - Ментен:

V= itcat[E]o[S]/(^m+[S]), где [S] - концентрация субстрата, [Е]о — концентрация фермента. В расчетах использовали величину молекулярной массы субъединицы фермента, равную 43 кДа.

Значения констант ингибирования (К{) определяли, применяя программу Enzfitter (Elsevier Biosoft) [134], с использованием уравнения:

V=Vmax[S]/(^m(l + [I]/^i) + [S]), где [I] - концентрация ингибитора. Данные обрабатывали в координатах Диксона [136].

3.7. Спектральные исследования фермента

Спектры поглощения холофермента и его комплексов с субстратами и ингибиторами в растворе регистрировали при 25° на спектрофотометре Сагу-50 («Varían», США). Спектры кругового дихроизма снимали на дихрографе Mark III («Yobin-Yvon», Франция) и портативном дихрометре СКД-2 (Институт спектроскопии РАН, г. Троицк, МО). Концентрация фермента составляла 1-2 мг/мл. Концентрации субстратов и ингибиторов в пробах имели значения, на один порядок превышающие величины Кт (K¡) для исследуемых аминокислот. Спектры записывали в 100 мМ калий-фосфатном буфере, рН 8,0.

Содержание ПЛФ в препарате фермента определяли в 0,1 M NaOH по методу Петерсона и Собера [137], используя значение молярного коэффициента поглощения ПЛФ при 390 нм, равное 6600 М~1см1 .

3.8. Кристаллизация МГЛ

Кристаллы МГЛ были получены с использованием метода висячей капли при 30°С. Капли содержали 1,5 мкл раствора фермента с концентрацией 20 мг/мл, диализованного против 50 мМ буфера Tris-HCl, рН 8,5, содержащего 0,5 мМ ПЛФ, 0,2 мМ дитиотреитол, и 1,5 мкл осаждающего раствора (35 - 37% PEG MME 2000, 50 мМ Tris-HCl, рН 8,5, 0,2 мМ ПЛФ, 25 мМ дитиотреитол) в присутствии или отсутствии 200 мМ сульфата аммония в качестве осадителя. Капли помещались на силиконированных покровных стеклах и уравновешивались против 1 мл того же осаждающего раствора. Кристаллы ромбической формы появлялись через неделю и достигали размеров 0,3-0,4 мм в течение двух недель.

Перед сбором дифракционных данных кристаллы переносили в крио-раствор (37% PEG MME 2000, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 0,2 мМ ПЛФ, 25 мМ дитиотреитол и 200 мМ сульфата аммония (для кристаллов выращенных в его присутствии)) и замораживали в жидком азоте.

Данные были собраны от одного монокристалла на синхротронном пучке РХ BW7B накопительного кольца DORIS на станции DESY (EMBL, Гамбург, Германия), для измерения интенсивностей отражений использовался MAR 345 мм детектор, данные обрабатывались с помощью XDS-программы [138]. Кристаллы принадлежали к пространственной группе 1222, с параметрами элементарной ячейки а=56,45 Â, b=122,80 Â, с=127,92 Â (для кристаллов, выращенных в отсутствие сульфата аммония) и а=56,69 Â, Ь= 122,80 Â, с=128,04 À (для кристаллов, выращенных в присутствии сульфата аммония).

Структуры были определены методом молекулярного замещения с помощью программного комплекса PHENIX [139]. В качестве исходной модели была использована ранее определенная нами структура МГЛ из С. freundii с разрешением 1.85 À (PDB ID 1Y4I). Структуры были депонированы в банк данных белковых структур (PDB ID 3MKJ, 2RFV).

Комплекс с L-циклосерином был получен настаиванием кристаллов холофермента МГЛ, выращенных в отсутствие сульфата аммония, в крио-растворе, содержащим 40 мМ L-циклосерина в течение 7 минут. Данные собирались и обрабатывались по схеме описанной выше. Кристаллы принадлежали к пространственной группе 1222, с параметрами элементарной ячейки а=56,27 Â, b=122,89 À, с=126,61 Â. Координаты комплекса МГЛ с L-циклосерином не депонированы в банк данных белковых структур.

3.9. Микроспектрофотометрические исследования кристаллов МГЛ

Кристаллы для микроспектрофотометрии были выращены в условиях, описанных выше в присутствии (отсутствие) сульфата аммония. Спектры поглощения поляризационного света регистрировались на микроспектрофотометре Zeiss МРМОЗ UV-vis, оборудованном объективами

10-и кратного увеличения [140,141]. Для получения линейно поляризованного света параллельного направлению энкстинции в кристалле, был использован поляризатор Глена-Томпсона. Для правильной ориентации кристалла использовался второй поляризатор. Интенсивность поглощения вдоль перпендикулярных направлений варьировалась в зависимости от ориентации

78 дипольного момента перехода электронов хромофоров в пределах асимметрической кристаллической решетки [142]. Отношение поглощения как функции длины волны называется поляризационным отношением. Измерения проводились при температуре 20°. Кристаллы суспендировались в стабилизирующем растворе того же состава, что и кристаллизационная среда с увеличением содержания PEG MME 2000 до 40%. Спектры поглощения были преобразованы с использованием логнормальных кривых [143;144;145] по описанной ранее процедуре [146; 147].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Морозова, Елена Андреевна, Москва

1. Heyl, D., Luz, E., Harris, S.A., Folkers, К. Phosphates of the vitamin B6 group. The structure of codecarboxylase. (1951) J. Am. Chem. Soc., 73, 3430-3433.

2. Robertson, J.G. Mechanistic basis of enzyme-targeted drugs (2005) Biochemistry, 44, 5561-5571.

3. Olivard, J., Mctzler, D.E., Snell, E.E. Catalytic Racemization of Amino Acids by Pyridoxal and Metal Salts (1952) J.Biol. Chem., 199, 669-674

4. Metzler, D.E., Snell, E.E. Some transamination reactions involving vitamin-B6 (1952) J.Am.Chem.Soc., 74, 979-983.

5. Браунштейн A. E., Шемякин M. M. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми ферментами. (1953). Биохимия, 18, 393—411.

6. Metzler, D.E., Ikawa, М., Snell, E.E. A general mechanism for vitamin B6 -catalyzed reactions (1954) J.Am. Chem. Soc., 74, 648-652.

7. Snell, E.E. Pyridoxal phosphate in nonenzymic and enzymic reactions. In Transaminases, Christen, P., Metzler, D.E., Eds.; Wiley-Interscience: New York, 1985, 19-30.

8. Eliot, A.C., Kirsh, J.F. Pyridoxal phosphate enzymes: mechanistic, structural, and evolutionary considerations (2004) Annu.Rev.Biochem., 73, 383-415.

9. John, R.A. Pyridoxal phosphate-dependent enzymes (1995) BBA, 1248, 8196.

10. Soda, K., Yoshimura, Т., Esaki, N. Stereospecificity for the hydrogen transfer of pyridoxal enzyme reactions (2001) Chem.Rec., 1, 373-384.

11. Hayashi, H. Pyridoxal enzymes: mechanistic diversity and uniformity (1995) J. Biochem (Tokyo), 118, 463-473.

12. Jansonoius, J.N. Structure, evolution and action of vitamin B6-dependent enzymes. (1998) Curr.Opin.Struct.Biol., 8, 759-769.

13. Dunathan H.C. Conformation and reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. (1966) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 712-716.

14. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. М., Мир, 1980, т.2, с.75.

15. Ivanov, V.I., Karpeisky, M.Ya. Dynamic three-dimensional model for enzymic transamination (1969) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 32, 21-53.

16. Capitani, G., McCarthy, D.L., Gut, H., Grutter, M.G., Kirsch, J.F. Apple ACC Synthase in. Complex with the Inhibitor L-aminoethoxyvinylglycine: Evidence for a Ketimine Intermediate. (2002). J.Biol.Chem., 277, 49735-49742.

17. Fu, M., Nikolic, D., Van Breemen, R.B., Silverman, R.B. Mechanism of inactivation of y-aminobutyric acid aminotransferase by (S)-4-amino-4,5-dihydro-2-thiophenecarboxylic acid. (1999) J.Am.Chem.Soc., 121, 77517759.

18. Christen, P., Metzler, D.E., eds. (1985) Transaminases, New York: Wiley.

19. Likos, J.J., Ueno, H., Feldhaus, R.W., Metzler, D.E. A novel reaction of the coenzyme of glutamate decarboxylase with L-serine O-sulfate. (1982) Biochemistry, 21, 4377-4386.

20. Kishore, G.M. Mechanism-based inactivation of bacterial kynureninase by betasubstituted amino acids. (1984) J.Biol. Chem., 259, 10669-10674.

21. Rando, R.R. Irreversible inhibition of aspartate aminotransferase by 2-amino-3-butenoic acid. (1974) Biochemistry, 13, 3859-3863.

22. Abels, R.H., Walsh, C.T. Acetylenic-Enzyme inactivators: inactivation of y-cystathionase in vitro and in vivo by propargylglycine (1973) J.Am.Chem.Soc. 95, 6124-6125.

23. Nanavati, S.M., Silverman, R.B. Mechanisms of inactivation of y-aminobutyric acid aminotransferase by the antiepilepsy drug y-vinyl GAB A (Vigabatrin). (1991) J.Am.Chem.Soc., 113, 9341-9349.

24. Miles, E.W. A new type of pyridoxal-P enzyme catalyzed reaction: the conversion of P, y-unsaturated amino acids to saturated a-keto acids by tryptophan synthase. (1975) Biochem.Biophys.Res.Commun., 66, 94-102.

25. Jung, M.J., Seiler, N. Enzyme-activated irreversible inhibitors of L-ornithine:2-oxoacid aminotransferase. (1978) J.Biol.Chem., 253, 7431-7439.

26. Munford, J.P., Cannon, D.J. Vigabatrin. (1994) Epilepsia, 35, 25-28.

27. Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools (1997) Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882.

28. Nicholas, K.B., Nicholas H.B. Jr., Deerfield, D.W. II. GeneDoc: analysis and visualization of genetic variation. (1997), EMBNEW.NEWS, 4, 14.

29. Yamagata, S. O-Acetylhomoserine thiolase of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe: partial purification, characterization, and its probable role in homocysteine biosynthesis. (1984) J. Biochem., 96, 15111523.

30. Ozaki, H., Shiio, I. Methionine biosynthesis in Brevibacterium flavum: properties and essential role of O-acetylhomoserine sulfhydrylase. (1982) J. Biochem., 91, 1163-1171.

31. Umbarger, H.E. Amino acid biosynthesis and its regulation. (1978) ,Annu.Rev. Biochem., 47, 532-606.

32. Giovanelli, J., Mudd, S.H., Datko, A.H. Sulfur amino acids in plants. In The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise, Stumpf, P.K., Conn, E.E., Eds.; Academic Press:New York, 1980, 5, 453-505.

33. Guggenheim, S., Flavin, M. Cystathionine y-synthase. A pyridoxal phosphate enzyme catalyzing rapid exchanges of P- and a-hydrogen atoms in amino acids. (1969) J.Biol.Chem., 244, 6217-6227.

34. Clausen, T., Huber, R., Prade, L., Wahl, M.C., Messerschmidt, A. Crystal structure of Escherichia coli cystathionine y-synthase at 1.5 A resolution. (1998) EMBO J., 17, 6827-6838.

35. Steegborn, C., Messerschmidt, A., Laber, B., Streber, W., Huber, R., Clausen, T. The crystal structure of cystathionine y-synthase from Nicotiana tabacum reveals its substrate and reaction specificity. (1999) J.Mol.Biol., 290, 983-986.

36. Washtein, W., Abeles, R.H. Mechanism of inactivation of y-cystathionase by the acetylenic substrate analogue propargylglycine (1977) Biochemistry, 16, 2485-2491.

37. Jonston, M., Jankowski, D., Marcotte, P., Tanaka, H., Esaki, N., Soda, K., Walsh, C. Suicide inactivation of bacterial cystathionine y-synthase and methionine y-lyase during processing of propargylglycine. (1979) Biochemistry, 18, 4690-4701.

38. Datko, A.H., Mudd, S.H. Methionine biosynthesis in Lemna: inhibitor studies. (1982) Plant Physiol., 69, 1070-1076.

39. Turano, F.J., Wilson, K.G. Evaluation of acute toxitity of selected compounds in higher plants using cell culture. (1985) In Vitro, 21, 135-139

40. Steegborn, C., Laber, B., Messerschmidt, A., Huber, R., Clausen, T. Crystal structures of cystathionine y-synthase inhibitor complexes rationalize the increased affinity of a novel inhibitor. (2001) J.Mol. Biol., 311, 789-801.

41. Laber, B., Clausen, T., Huber, R., Messerschmidt, A., Enger, U., Muller-Fahrnow, A., Pohlenz, H.D. Cloning, purification, and crystallization of Escherichia coli cystathionine P-lyase (1996) FEBS Lett., 379,94-96.

42. Ejim, L.J., D'Costa, V.M., Elowe, N.H., Loredo-Osti, J.C., Malo, D., Wright, G.D. Cystathionine P-lyase is important for virulence of Salmonella enterica serovar Typhimuriam. (2004) Infect.Immun., 72, 3310-3314.

43. Gentry-Weeks, C.R., Spokes, J., Thompson, J. P-Cystathionase from Bordetella avium. Role(s) of lysine 214 and cysteine residues in activity and cytotoxicity (1995) J.Biol.Chem., 270, 7695-7702.

44. Ravanel, S., Job, D., Douce, R. The purification and characterization of cystathionine P-lyase from Arabidopsis thaliana overexpressed in Escherichia coli. (1996) Biochem.J., 320, 383-392.

45. Staton, A.L., Mazelis, M. The C-S lyases of higher plants: homogeneous (3-cystathionase of spinach leaves. (1991) Arch.Biochem. Biophys., 290, 46-50.

46. Parston, C., Saint-Girons, I., Cohen, G.N. Enzyme specialization during the evolution of amino-acid biosynthetic pathways. (1987) Microbiol.Sci., 4, 258-262.

47. Clausen, T., Huber, R., Laber, B., Pohlenz, H.D., Messerschmidt, A. Crystal structure of the pyridoxal-5'-phosphate dependent cystathionine P-lyase from Escherichia coli at 1.83 A. (1996) J.Mol.Biol., 262, 202-224.

48. Breitinger, U., Clausen, T., Ehlert, S., Huber, R., Laber, R., Schmidt, F., Pohl, E., Messerschmidt, A. The three-dimensional structure of cystathionine P-lyase from Arabidopsis and its substrate specificity. (2001) Plant Physiol., 126, 631-642.

49. Silverman, R.B., Abeles, R.H. Inactivation of pyridoxal phosphate dependent enzymes by mono- and polyhaloalanines. (1976) Biochemistry, 15, 4718-4723.

50. Clausen, T., Huber, R., Messerschmidt, A., Phlenz, H.D., Laber, B. Slow-binding inhibition of Escherichia coli cystathionine p-lyase by L-aminoethoxyvinylglycine: a kinetic and X-ray study. (1997) Biochemistry, 36, 12633-12643.

51. Owens, L.D., Guggenheim, S., Hilton, J.L. Rhizobiumsynthesized phytotoxin: an inhibitor of P-cystathionase in Salmonella typhimurium. (1968) BBA, 158, 219-225.

52. Giovanelli, J., Owens, L.D., Mudd, S.H. In vivo inactivation by rhizobitoxine and role of the enzyme in methionine biosynthesis in corn seedlings. (1973) Plant Physiol., 51, 492-503.

53. Rando, R.R. Mechanisms of action of naturally occurring irreversible enzyme inhibitors (1975) Acc.Chem. Res., 8, 281-288.

54. Minamisawa, K., Fukai, K., Asami, T. Rhizobitoxine inhibition of hydrogenase synthesis in free-living Bradyrhizobium japonicam. (1990) J.Bacteriol., 172, 4505-4509.

55. Uren, J.R., Ragin, R., Chaykovsky, M. Modulation of cysteine metabolism in mice-effects of propargylglycine and L-cysteine-degrading enzymes (1978) Biochem.Pharmacol., 27, 2870-2814.

56. Chu, L., Burgum, A., Kolodrubetz, D., Holt, S.C. The 45-kilodalton-hemolysin gene from Treponema denticola encodes a novel hemolysin homologous to aminotransferase. (1995) Infect. Immun., 63, 4448-4455.

57. Chu, L., Ebersole, J.L., Kurzban, G.P., Holt, S.C. Cystalysin, a 46-kDa L-cysteinedesulfhydrase from Treponema denticola: biochemical and biophysical characterization. (1999) Clin. Infect. Dis., 28, 442-450.

58. Krupka, H.I., Huber, R., Holt, S.C., Clausen, T. Crystal structure of cystalysin from Treponema denticola: a pyridoxal 5'-phosphate-dependent protein acting as a haemolytic enzyme. (2000) EMBO J., 19, 3 168-3 178.

59. Bertoldi, M., Cellini, B., Clausen, T., Voltattorni, C.B. Spectroscopic and kinetic analyses reveal the pyridoxal 50 -phosphate binding mode and the catalytic features of Treponema denticola cystalysin. (2002) Biochemistry, 41, 9153-9164.

60. Cellini, B., Bertoldi, M., Montioli, R., Borri Voltattorni, C. Probing the role of Tyr 64 of Treponema denticola cystalysin by site-directed mutagenesis and kinetic studies (2005) Biochemistry, 44, 13970-13980.

61. Bertoldi, M., Cellini, B., Paiardini, A., Di Salvo, M., Borri Voltattorni, C. Treponema denticola cystalysin exhibits significant alanine racemase activity accompanied by transamination: mechanistic implications.2003) Biochem. J., 371, 473-483.

62. Cellini, B., Bertoldi, M., Paiardini, A., D'Aguanno, S, Voltattorni, C.B. Site-directed mutagenesis provides insight into racemization and transamination of alanine catalyzed by Treponema denticola cystalysin.2004) J. Biol. Chem., 279, 36898-36905.

63. Cellini, B., Bertoldi, M., Borri Voltattorni, C. Treponema denticola cystalysin catalyzes P-desulfination of L-cysteine sulfinic acid and p-decarboxylation of L-aspartate and oxalacetate. (2003) FEBS Lett., 554, 306-310.

64. Taoka, S., Ohja, S., Shan, X., Kruger, W.D., Banerjee, R. Evidence for heme-mediated redox regulation of human cystathionine P-synthase activity, (1998) J.Biol. Chem., 273, 25179-25184.

65. Meier, M., Janosik, M., Kery, V., Kraus, J.P., Burkhard, P. Structure of human cystathionine P-synthase: A unique pyridoxal 5'-phosphate dependent hemeprotein. (2001) EMBO J., 20, 3910-3916.

66. Frank, N., Kery, V., Maclean, K.N., Kraus, J.P. Solvent accessible cysteines in human CBS: The role of Cysteine 431 in AdoMet binding. (2006) Biochemistry, 45, 11021-11029.

67. Hajjar, K.A. Homocysteine: a sulphurous fire. (2001) J. Clin. Invest., 107, 663-664.

68. Qu, K., Chen, C.P., Halliwell, B., Moore, P.K., Wong, P.T. Hydrogen sulfide is a mediator of cerebral ischemic damage. (2006) Stroke, 37, 889893.

69. Rabeh, W.M., Cook, P.F. Structure and mechanism of O-acetylserine sulfhydrylase. (2004) J.Biol.Chem., 279, 26803-26806.

70. Kredich, N.M., Becker, M.A., Tomkins, G.M. Purification and characterization of cysteine synthetase, a bifunctional protein complex from Salmonella typhimurium. (1969) J. Biol. Chem., 244, 2428-2439.

71. Mino, K., Yamanoue, T., Esaky, N., Matsuyama, A., Nakanishi, K. Effects of bienzyme complex formation of cysteine synthetase from Escherichia coli on some properties and kinetics (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1628-1640.

72. Droux, M., Ruffet, M.L., Douce, R., Job, D. Interactions between serine acetyl transferase and O-acetylserine(thiol) lyase in higher plants: structural and kinetic properties of the free and bound enzymes. (1998) Eur. J. Biochem./FEBS, 255, 235-245.

73. Cook, P.F., Wedding, R.T. Initial kinetic characterization of the multienzyme complex, cysteine synthetase. (1977) Arch. Biochem. Biophys., 178, 293-302.

74. Mino, K., Yamanoue, T., Eisaki, N., Matsuyama, A., Nakanishi, K. Purification and characterization of serine acetyltransferase from Escherichia coli partially truncated at the C-terminal region. (1999) Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 168-179.

75. Burkhard, P., Rao, G.S., Hohenester, E., Schnackerz, K.D., Cook, P.E., Jansonius, J.N. Three-dimensional Structure of O-acetylserine Sulfhydrylase from Salmonella typhimurium. (1998) J. Mol. Biol., 283, 121133.

76. Burkhard, P., Tai, C.H., Jansonius, J.N., Cook, P.F. Identification of an allosteric anion-binding site on O-acetylserine sulfhydrylase: structure of the enzyme with chloride bound. (2000) J. Mol. Biol., 303, 279-286.

77. Burkhard, P., Tai, C.H., Ristroph, C.M., Cook, P.F., Jansonius, J.N. Ligand binding induces a large conformational change in O-acetylserine sulfhydrylase from Salmonella typhimurium. (1999) J. Mol. Biol., 291, 941953.

78. Huang, B., Vetting, M.W., Roderick, S.L. The active site of O-acetylserine sulfhydrylase is the anchor point for bienzyme complex formation with serine acetyltransferase. (2005) J. Bacteriol., 187, 32013205.

79. Claus, M.T., Zocher, G.E., Maier, T.H.P., Schulz, G.E. Structure of the O-acetylserine sulfhydrylase isoenzyme CysM from Escherichia coli. (2005) Biochemistry, 44, 8620-8626.

80. Tai, C.H., Burkhard, P., Gani, D., Jenn, T., Johnson, C., Cook, P.F. Characterization of the allosteric anion-binding site of O-acetylserine sulfhydrylase. (2001) Biochemistry, 40, 7446-7452.

81. Mozzarelli, A., Bettati, S., Pucci, A.M., Burkhard, P., Cook, P.F. Catalytic competence of O-acetylserine sulfhydrylase in the crystal probed polarized absorption microspectrophotometry. (1998) J. Mol. Biol., 283, 135-146.

82. Hirase, K., Molin, W.T. Characterization of cysteine synthase in Echinochloa crus-galli L and its inhibition by substrate analogues (2001) Pest.Biochem.Phys., 69, 189-197.

83. Hirase, K., Molin, W.T. Effect of inhibitors of pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes on cysteine synthase in Echinochloa crus-galli L. (2001) Pest.Biochem.Phys., 70, 180-188.

84. Warrilow, A.G.S., Hawkesford, M.J. Modulation of cyanoalanine synthase and O-acetylserine (thiol) lyases A and B activity by P-substituted alanyl and anion inhibitors. (2002) J. Exp. Bot., 368, 439-445.

85. Westrop, G.D., Goodall, G., Mottram, J.C., Coombs, G.H. Cysteine biosynthesis in Trichomonas vaginalis involves cysteine synthase utilizing o-phosphoserine. (2006) J. Biol. Chem., 281, 25062-25075.

86. Lockwood, B.C., Coombs, G.H. Purification and characterization of methionine y-lyase from Trichomonas vaginalis. (1991) Biochem.J., 279, 675-682.

87. Soda, K. Microbial sulfur amino acids: an overview. (1987) Methods Enzymol., 143, 453-459.

88. Finegold, S.M., Wexler, H.M. Present studies of therapy for anaerobic infections. (1996) Clin.Infect.Dis., 23, S9-14.

89. Goyer A, Collakova E, Shachar-Hill Y, Hanson AD. Functional characterization of a methionine y-lyase in Arabidopsis and its implicationin an alternative to the reverse trans-sulfuration pathway. (2007) Plant Cell Physiol., 48(2), 232-242.

90. Goodall, G., Mottram, J.C., Coombs, G.H., Laptom, A.J. (2000) PDB-Entry, 1E5E.

91. Goodall, G., Mottram, J.C., Coombs, G.H., Lapthorn, A.J. (2000) PDB-Entry, 1E5F.

92. Sato, D., Yamagata, W., Kamei, K., Nozaki, Т., Harada, S. Expression, purification and crystallization of L-methionine y-lyasc 2 from Entamoeba histolytica. (2006) Acta Cryst., F62, 1034-1036.

93. Mamaeva, D.V., Morozova, E.A., Nikulin, A.D., Revtovich, S.V., Nikonov, S.V., Garber, M.B., Demidkina, T.V. Structure of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase. (2005) Acta Cryst., F61, 546-549.

94. Coombs, G.H., Mottram, J.C. Trifluoromethionine, a prodrug designed against methionine y-lyase-containing pathogens, has efficacy in vitro and in vivo against Trichomonas vaginalis. (2001) Antimicrob. Agents Chemother., 45, 1743-1745.

95. Tanaka, H., Esaki, N., Soda, K. A versatile bacterial enzyme: L-methionine y-lyase. (1985) Enzyme Microb. Technol., 7, 530-537.

96. Tanaka, H., Esaki, N., Soda, K. (1977) Biochemistry., 16, 100-106.

97. Tokoro, M., Asai, Т., Kobayashi, S., Takeuchi, Т., and Nozaki, T. Identification and characterization of two isoenzymes of methionine y-lyase from Entamoeba histolytica. (2003) J. Biol. Chem. 279, 42717-42727.

98. Манухов И.В., Мамаева Д. В., Морозова Е.А., Расторгуев С. М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В., Завильгельский Г.Б. L-метионин- у-лиаза Citrobacter freundii: клонирование гена и кинетические параметры фермента. (2006) Биохимия, 71, 454-463.

99. Esaki, N., Nakayama, Т., Sawada, S., Tanaka, H., Soda, К. 1H NMR studies of substrate hydrogen exchange reactions catalyzed by L-methionine y-lyase. (1985) Biochemistry, 24 (15), 3857-3862.

100. Inoue, H., Inagaki, K., Adachi, N., Tamura, Т., Esaki, N., Soda, K., Tanaka, H. Role of Tyrosine 114 of L-methionine y-lyase from Pseudomonas putida. (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (11), 2336-2343.

101. Фалеев Н.Г., Рувинов С.Б., Бахмутов В.И., Демидкина Т.В., Мягких И.В., Беликов В.М. (1987) Мол. биол., 21, 1636-1643.

102. Anatoly, P.D., Raimond, B.G.R., Alexander, N.P., Anastassios, S.P., Strain relief at the active site of phosphoserine aminotransferase induced by radiation damage. (2005) Protein Sci., 14, 1498-1507.

103. Bazhulina, N.P., Morozov, Yu.V., Papisova, A.I., Demidkina, T.V. Pyridoxal 5'-phosphate Schiff base in Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyasc. Ionic and tautomeric equilibria. (2000) Eur.J.Biochem., 267, 18301836.

104. Davis, L., Metzler, D. Pyridoxal-linked elimination and replacement reactions. (1972) in: Boyer, P.D. (Ed). The Enzymes, vol. 7, Wiley and Sons, NY, 33-74.

105. Johnston, M., Raines, R., Chang, M., Esaki, N., Soda, K., Walsh, C. (1981) Biochemistry, 20, 4325-4333.

106. Yamagata, S., Yasugahira, Т., Okuda, Y., Iwama, T. (2003), J. Biochem., 134, 607-613.

107. Schnackers, K.D., Ehrlich, J.H., Giesemann, W., Reed, T.A. (1979) Biochemistry, 18, 3557-3563.

108. M. L. Svensson and S. Gatenbeck, The pathway of D-cycloserine biosynthesis in Streptomyces garyphalus. (1982) Arch. Microbiol., 131,129131.

109. G. T. Olson, M. Fu, S. Lau, K. L. Rinehart and R. B. Silverman, An aromatization mechanism of inactivation of y-aminobutyric acid aminotransferase for the antibiotic L-cycloserine. (1998) J. Am. Chern. Soc., 120, 2256-2267.

110. R. R. Rando, On the mechanism of action of antibiotics which act as irreversible enzyme inhibitors. (1975) Biochem. Pharmacol, 24, 1153-1160.

111. T. D. Fenn, T. Holyoak, G. F. Stamper and D. Ringe, Effect of a Y265F Mutant on the Transamination Based Cycloserine Inactivation of Alanine Racemase. (2005) Biochemistry, 44, 5317-5327.

112. H. Ikushiro, Н. Hayashi and H. Kagamiyama Reactions of serine palmitoyltrasferase with serine and molecular mechanisms of the actions of serine derivatives as inhibitors. (2004) Biochemistry, 43, 1082-1092.

113. Malashkevich, V.N., Strop, P., Keller, J.W., Jansonius, J.N., Toney, M.D. Crystal structures of dialkylglycine decarboxylase inhibitor complexes. (1999) J.Mol.Biol., 294, 193-200.

114. Lowry, О. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265275.

115. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. (1970) Nature, 227, 680-685.

116. Friedemann, Т. E., Haugen, G. E. The determination of keto acids in blood and urine. (1943) J. Biol. Chem., 177, 415-442.

117. Березин А.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. (1976) М., МГУ, с. 168.

118. Cleland W. Statistical analysis of enzyme kinetic data. (1979) Methods. Enzymol., 63, 103-138.

119. Dixon, M. The determination of enzyme inhibitor constants. (1953) Biochem. J., 55, 170-171.

120. Peterson, E.A., and Sober, H.A. Preparation of crystalline phosphorylated derivatives of vitamin B6. (1954) J. Am. Chem. Soc., 76, 169-175.

121. Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. (1993) J.Appl. Cryst., 26, 795-800.

122. A. Mozzarelli, G.L. Rossi, Protein function in the crystal. (1996) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 25, 343-365.

123. A.R. Pearson, A. Mozzarelli, G.L. Rossi, Microspectrophotometry for structural enzymology, (2004) Curr. Opin. Struct. Biol., 14, 656-662.

124. J. Hofrichter, W.A. Eaton, Linear dichroism of biological chromophores. (1976) Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 51 1-560.

125. C.M. Metzler, D.E. Metzler, Quantitativa description of absorption spectra of pyridoxal phosphate-dependent enzyme using logonormal distribution curves. (1987) Anal. Biochem., 166, 313-327.

126. D.E. Metzler, C.M. Harris, R.J. Johnson, D.B. Saino, J.A. Thomson, Spectra of 3-hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria. (1973) Biochemistry, 12, 5377-5392.

127. D.B. Siano, D.E. Metzler, Band shapes of the electronic spectra of complex molecules. (1969) J.Chem. Phys., 51, 1856-1861.

128. Y.V. Morozov, N.P. Bazhulina, V.A. Bokovoi, V.O. Chekhov, Principles of dissociation of complex spectra of biological active substances into bands corresponding to separate electron transitions, (1987) Biofizikan (Russian), 32, 699-715.

129. Y.V. Morozov, V.A. Bokovoi, Physical bases for spectroscopy deconvolution, (1989) Zhurnal Fizicheskoi Khimii (Russian), 63, 662-668.1. БЛАГОДАРНОСТИ

130. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю, Татьяне Викторовне Демидкиной, за чуткое руководство и внимание к моей работе, за ценные советы и рекомендации, сделанные в процессе подготовки диссертации.

131. Приношу свою глубокую благодарность Наталье Павловне Бажулиной, за помощь в совместной работе и обсуждении полученных результатов; Николаю Григорьевичу Фалееву за ценные советы в интерпретации полученных данных.

132. Благодарю всех сотрудников лаборатории химических основ биокатализа за дружескую обстановку, мудрые советы и помощь.

133. Отдельно хочу поблагодарить моих родителей и друзей за понимание, терпение и поддержку.