Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метионин - γ-лиаза Citrobacter freundii: очистка, кристаллизация, физико-химические и каталитические параметры природного и рекомбинантного типов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Метионин - γ-лиаза Citrobacter freundii: очистка, кристаллизация, физико-химические и каталитические параметры природного и рекомбинантного типов"

На правах рукописи

Мамаева Дарья Валерьевна

Метионин — у-лиаза Citrobacter freundii: очистка, кристаллизация, физико-химические и каталитические параметры природного и рекомбинантного типов

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2008

Работа выполнена в лаборатории химических основ биокатализа Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А Энгельгардта РАН.

Научный руководитель :

доктор химических наук Т.В. Демидкина

Официальные оппоненты:

член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор С.Н. Кочетков доктор химических наук Т.В. Ратанова

Ведущая организация: Химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится 2008 г. в О О на заседании

диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им.В.А Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан « лм »

СЦ Я 2008)

Ученый секретарь диссертационного Кандидат химических наук

.М.Крицын

Актуальность темы Ферменты, содержащие в качестве кофактора пиридоксаль-5'-фосфат, играют первостепенную роль в азотистом обмене Они катализируют разнообразные реакции превращений аминокислот трансаминирование, рацемизацию, а- и ß-декарбоксилирование, ретро-альдольное расщепление, ß- и у-элиминирование и замещение Центральная роль пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов в метаболизме аминокислот и аминов определяет актуальность исследования механизмов их действия и регуляции их генов

Метионин - у-лиаза (КФ 44 111) - пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый фермент, катализирующий реакцию у-элиминирования L-метионина с

образованием метилмеркаптана, аммония и а-кетобутирата |Нз+ - ^

-- CH3SH + NH4

о О

К настоящему времени фермент был идентифицирован практически лишь в анаэробных микроорганизмах Многие из этих микроорганизмов являются патогенами, в том числе бактерии, вызывающие бутулизм (Clostridium botulinum), колиты (Clostridium difficile), разрушение зубов (бактерии рода Porphyromonas), заболевания десен (Treponema denticola) и послеоперационные инфекции (бактерии рода Bacteroides) Кроме того, этот фермент был недавно идентифицирован в двух патогенных одноклеточных эукариотах, в Entamoeba histolytica и в Trichomonas vaginalis

Наличие фермента в перечисленных выше патогенных бактериях и одноклеточных эукариотах и возможность его присутствия в других патогенах указывают на то, что метионин - у-лиаза является перспективной биохимической мишенью для создания новых лекарственных препаратов против ряда анаэробных бактериальных и эукариотических патогенов Нужно отметить, что в настоящее время в мировой практике возрастает интерес к применению метионин - у-лиазы в терапии - в основном, в терапии раковых опухолей, а также при болезни Паркинсона, атеросклерозе, старении и др

Метионин - у-лиаза является малоизученным ферментом - данные о ее физико-химических характеристиках и механизме реакции у-элиминирования L-метионина весьма ограничены Всестороннее изучение физико-химических характеристик фермента и механизма его действия необходимо для создания эффективного препарата фермента для онкотерапии, а также для рационального дизайна ингибиторов и суицидальных субстратов метионин - у-лиазы, которые могли бы использоваться в качестве лекарственных препаратов

Цели в задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование каталитических параметров метионин - у-лиазы Citrobacter freundn и получение кристаллов фермента, пригодных для рентгеноструктурного анализа.

В работе были поставлены следующие задачи 1) разработка метода получения гомогенного препарата метионин - у-лиазы Citrobacter freundn, 2) клонирование и секвенирование гена фермента и создание штамма-суперпродуцента, 3) определение стационарных каталитических параметров фермента, 4) поиск условий выращивания кристаллов метионин - у-лиазы, пригодных для рентгеноструктурных исследований

Научная новизна и практическая ценность работы. Ген, кодирующий метионин - у-лиазу, впервые идентифицирован в семействе Enterobacteriaceae Разработан метод выделения фермента, позволяющий получать гомогенные препараты метионин - у-лиазы из клеток С freundn и рекомбинантного фермента, экспрессированного в клетках Е coli Определены параметры стационарной кинетики фермента в реакциях a,ß- и а,у-элиминирования Разработаны условия получения кристаллов фермента, пригодных для рентгеноструктурного анализа, что позволило определить пространственную структуру холофермента с разрешением 1,9 Ä

Апробация работы. Материалы работы были представлены на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (г Пущино, Россия, 2000 г), на международной конференции "Биокатализ-2000" (МГУ им М В Ломоносова, июнь 2000 г), на третьем международном симпозиуме "Витамин В6 и карбонильный катализ" (Саутхемптон, Великобритания, апрель 2002 г), на III

съезде Биохимического общества РАН (г Санкт-Петербург, июнь 2002 г) и на первом Европейском конгрессе микробиологов (Любляна, Словения, июнь-июль 2003 г)

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах, включает 22 рисунка, 13 таблиц и содержит 181 ссылку на литературные источники Диссертация включает введение, обзор литературы, методы исследования, результаты работы и их обсуждение, выводы и список литературы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Метод очистки метионин — у-лиазы Citrobacter freundii

Разработанный нами метод очистки метионин - у-лиазы из клеток С freundii приведен в таблице 1 Метод дает возможность получить фермент с высокой степенью чистоты с использованием двух стадий хроматографии и тепловой обработки Использованный метод выделения позволял повышать чистоту препарата фермента в 22-26 раз Удельная активность полученного препарата составляла 10 ед/мг при выходе общей активности 21-24 %

Таблица 1. Очистка метионин - у-лиазы из 30 г клеток С freundii

Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, ед Удельная активность, ед/мг Выход активности^ Степень очистки

Клеточный экстракт 414,0 189,0 0,46 100 1

Осаждение нуклеиновых кислот 409,0 188,0 0,46 99 1

Тепловая обработка 129,0 184,0 1,43 97 3

Ионообменная хроматография 27,0 122,0 4,5 65 10

Гель-фильтрация 4,0 40,0 10,0 21 22

2. Клонирование гена megL Citrobacter freundu

Для скрининга фрагмента ДНК, содержащего ген, кодирующий метионин -у-лиазу, в качестве праймеров были использованы следующие олигонуклеотиды 1) комплементарный, вырожденный олигонуклеотид NV]r - (5-ACITAYAARTTYAAYACICARATHGT-326 п н, где Y - С,Т, R - A,G, Н - А,С,Т, I - A,G,C,T), составленный на основе N-концевой аминокислотной последовательности фермента С freundu MSDCRTYGFNTQIV, 2) вырожденный реверс-праймер A„lr - (5'-GGRTTIGCIGGIGTYTCRAARTA-3'), составленный на основе выравнивания аминокислотных последовательностей метионин - у-лиазы из нескольких источников и соответствующий консервативной области Туг155-Рго163 аминокислотной последовательности метионин-у-лиазы Р putida

Эти два праймера были использованы для ПЦР-амплификации 5'-фрагмента гена megL После разделения фрагментов ДНК в агарозном геле полосу ДНК размером около 500 п н изолировали из геля и использовали для клонирования в векторе pUC18 по тупым концам Лигирующей смесью трансформировали клетки Е coli TG1 В результате было получено несколько клонов, содержащих гибридные плазмиды с фрагментом ДНК размером около 500 п н. Определение нуклеотидных последовательностей этих фрагментов показало, что один из них гомологичен 5'-фрагменту гена, кодирующего метионин - у-лиазу Р putida На основе полученной нуклеотидной последовательности синтезировали праймеры Ndlr (5'-GAGCCTTCTACAGGCGCGGGTAG-3') и Nrev (5 '-GATATACACTACTTTGGTTT CCGG-3'), комплементарные 5'-концевому участку гена и нуклеотидам 442-465 в нуклеотидной последовательности 5'-конца гена megL, которая была определена на предыдущем этапе

С целью создания клона, содержащего полную последовательность гена megL, была сконструирована библиотека, содержащая ЕсоШ-, ВатШ- и Xhol-фрагменты хромосомы С freundn в векторе pUC18 В результате трансформации этими гибридными плазмидами клеток штамма TG1 было получено несколько тысяч клонов Проведение ПЦР-амплификации с праймерами Ndlr и Nrev с последующей идентификацией фрагмента ДНК размером около 500 п н, позволило

отобрать клон, содержащий гибридную плазмиду с £соЮ-фрагментом, несущую ген megL, обозначенную как pUCmgl Размер встроенного фрагмента ДНК С freundu составлял примерно 3000 п н

3. Нуклеотидная последовательность .ЕсоШ-фрагмента С. freundii

В нуклеотидной последовательности £eoRI - фрагмента ДНК С freundu размером 3000 п н расположены две открытые рамки считывания первая содержит 1194 нуклеотида, начинается с инициирующего ко дона ATG в позиции 1 и заканчивается кодоном-терминатором TGA в позиции 1195, вторая рамка стартует с кодона ATG в позиции 1315 Первая рамка кодирует полипептид из 398 аминокислотных остатков Согласно проведенному анализу белковых последовательностей базы данных NCBI этот полипептид был идентифицирован как метионин - у-лиаза В нуклеотидной последовательности после гена megL расположен инвертированный повтор (28 пн), а на расстоянии 82 пн от инвертированного повтора расположен кодон-инициатор ATG второй рамки протяженностью 1296 нуклеотидов, кодирующей полипегггид из 432 аминокислотных остатков Анализ белковых последовательностей базы данных NCBI показал, что этот полипептид относится к семейству пермеаз, так как высоко гомологичен (около 90% идентичных аминокислотных остатков) пермеазам Е coli и S Entérica Ген С freundu, кодирующий этот белок, был назван aap Нуклеотидная последовательность была помещена в GenBank [AY204910]

4. Синтез метионин - у-лиазы в клетках Е coli и очистка рекомбинантного фермента

Для получения супер-продуцента метионин - у-лиазы ген megL С freundu был клонирован в вектор рЕТ-15Ь по сайтам Ncol и ВатШ Клетки BL21(DE3) были трансформированы лигазной смесью После чего был отобран клон, содержащий гибридную плазмиду pETmgl Сконструированный таким образом суперпродуцент синтезировал до 20% метионин - у-лиазы в расчете на суммарный белок

Процедура очистки метионин -гибридные плазмиды с геном megL, была такой же, что и при выделении метионин - у-лиазы из клеток С. /геипсШ, лишь стадия тепловой обработки была опущена. В результате был получен препарат метионин — у-лиазы с удельной активностью 11,0 ед/мг, при выходе общей активности 54%. Электрофоретическая подвижность фермента совпадала с таковой для природного фермента (рис. 1).

у-лиазы из клеток Е. coli, содержащих

- 200 kDa

116 kDa

- 97 kDa

- 66 kDa

- 45 kDa

- 31 kDa 21.5 kDa

1 2 3

Рис. 1. SDS-ПААГ рекомбинантного (1) и природного (2) ферментов метионин-у-лиазы; маркеры молекулярных масс (3).

5. Параметры стационарной кинетики метионин - у-лиазы C.freundii

Определенные для природного и рекомбинантного фермента параметры стационарной кинетики реакций а,р- и а,у-элиминирования приведены в таблице 2. Кинетические параметры природного и рекомбинантного ферментов оказались близки.

В таблице 3 приведено сравнение параметров стационарной кинетики для рекомбинантных ферментов (rMGL) C.freundii, P. putida, Т. vaginalis и E.histolytica.

Для природного субстрата L-метионина значения Км для метионин - у-лиазы С. freundii (0,7 мМ) оказались близки величинам Км для ферментов P. putida (0,90 мМ), Т. vaginalis (rMGLl, 0,65мМ) и Е. histolytica (rMGLl, 0,94 мМ).

Величины kcat реакции а,у-элиминирования L-метионина для фермента С. freundii (6,2 с"1) и Т. vaginalis (rMGLl, 7,43с'1) практически совпали. Для ферментов Е. histolytica (rMGLl и rMGL2) и Т. vaginalis (rMGL2) значения этого параметра также близки между собой (0,26 с"1, 0,31 с'1 и 0,48 с"1, соответственно). В то же время, для фермента P. putida характерно заметно более высокое значение параметра (48,6 с"1).

Таблица 2 Параметры стационарной кинетики реакций а,у- и а,Р-элиминирования

Природный фермент Рекомбинантный фермент

Субстрат ^саь Км> кса/Км, Км, кса/Км,

с"1 мМ М-1 с1 8-1 мМ М"1 с"1

Ь-метионин 6,5 ±0,12 0,7 ± 0,05 9,3 х 103 6,2 ± 0,42 0,7 ±0,11 8,9 х 103

ВЬ-гомоцистеин 5,1 ±0,16 1,1 ±0,13 6,02x103 8,51 ±0,41 0,97 ±0,15 8,8x103

Ь-этионин 6,2 ± 0,28 0,56 ± 0,09 1,1 х 104 6,78 ± 0,02 0,54 ±0,01 1,3 х 104

Ь-цистеин 2,2 ±0,13 0,18 ±0,02 1,2 х 104 2,3 ± 0,09 0,16 ±0,02 1,4 х 104

8-метил-Ь-цистеин 5,97 ± 0,08 0,61 ± 0,02 9,8 х 103 4,6 ± 0,29 0,71 ±0,11 6,5 х 103

8-этил-Ь-цистеин 5,56 ±0,11 0,27 ± 0,02 2,06 х 104 5,03 ±0,16 0,17 ±0,02 2,96 х 104

Б-бензил-Ь-цистеин 10,9 ±0,17 0,19 ± 0,01 5,7 х 104 8,16 ±0,23 0,18 ±0,02 4,5 х 104

Таблица 3. Параметры стационарной кинетики для реакций а,у- и а,Р-злиминирования, катализируемых метионин - у-

лиазой из разных источников

Субстрат С freundu, Р putida, Т vaginalis, Т vaginalis, Е histolytica, Е histolytica,

rMGL rMGL rMGLl* rMGL2* rMGLl* rMGL2*

^cats K-Mj ^cat> К.м> kcat> Км> kcab К.м> kcafo Км, k-cab Км,

с-' мМ с-1 мМ с1 мМ с-1 мМ с"1 мМ с1 мМ

L-метионин 6,2 0,7 48,6 0,90 7,43 0,65 0,48 10,6 0,26 0,94 0,31 1,9

DL-гомоцистеин 8,51 0,97 - - 264 12,2 91,4 37,7 0,69 3,4 0,94 1,87

L-этионин 6,78 0,54 33,4 0,27 - - - - - - - -

L-цистеин 2,33 0,16 - - 4,3 8,5 0,76 22,3 - - 0,89 2,3

Б-мегил-Ь-цистеин 4,6 0,71 5,53 0,40 - - - - - - - -

в-этил-Ь-цистеин 5,03 0,17 5,79 0,48 - - - - - - - -

*) Рассчитано на основании литературных данных для молекулярной массы субъединицы белка, равной 43 Ша

Наибольшее различие в кинетических параметрах реакции а,у-элиминирования имеет место для rMGL С freundu и rMGLl Т vaginalis, когда субстратом является L-гомоцистеин Значения kcat для rMGLl Т vaginalis значительно выше по сравнению с таковыми для метионин - у-лиазы С freundu, а сродство к гомоцистеину у rMGLl Т vaginalis значительно ниже, чем у метионин -у-лиазы С freundu

Для ферментов Е histolytica (rMGLl и rMGL2) сродство к DL-гомоцистеину ниже в 2-3 раза по сравнению с ферментом С freundu, и константа скорости на порядок меньше

В случае, когда субстратом является L-этионин, при близких значениях Км для ферментов С freundu и Р putida (0,54 мМ и 0,27 мМ) значение kcat для Р putida в пять раз выше

Параметры реакции а,|3-элиминирования L-цистеина для С freundu отличаются от таковых для Т vaginalis и Е histolytica Значения ксй для реакции а,Р-элиминирования L-цистеина для ферментов rMGL2 Т vaginalis и rMGL2 Е histolytica практически совпадают (0,76 с"1 и 0,89 с"1), в то время как значения Км отличаются на порядок (22,3 мМ и 2,3 мМ) Каталитические параметры реакций а,(5-элиминирования S-метил- и S-этилцистеина для метионин — у-лиазы С freundu и Р putida оказались достаточно близкими

Имеющиеся в настоящее время данные о субстратной и реакционной специфичности метионин - у-лиазы из различных источников весьма ограничены и для объяснения различий в их специфичности и эффективности катализа необходимы дальнейшие исследования

6. Спектральные характеристики фермента

Спектры поглощения холофермента метионин - у-лиазы С freundu регистрировали при рН 6,0, рН 7,0 и рН 8,0 При переходе от рН 8,0 к рН 7,0 и 6,0 не было отмечено существенных изменений в спектре поглощения фермента Поэтому в дальнейшем анализировали спектры поглощения при рН 6,0 и рН 8,0

Схема 1. Схема ионных и таутомерных форм внутреннего альдимина ПЛФ с аминокислотами в интервале значений рН 6-8

Схема возможных ионных и таутомерных равновесий альдиминов пиридоксаль-5'-фосфата (ПЛФ) с аминокислотами в рассматриваемом интервале значений рН приведена на схеме 1 Альдимины ПЛФ в этом интервале рН могут существовать в двух ионных формах катионной (А, таутомеры I, II) и нейтральной (В, таутомеры III, IV, V), переход между которыми сопровождается

изменением спектров поглощения, а рКа этого перехода равняется ~ 6,26,4 для модельных соединений

Спектр поглощения Рис. 2. Спектр поглощения холофермента

(1,8x10'5 М) в 0,1 М калий-фосфатном буфере,

холофермента метионин - у-лиазы

в области 300-500 нм имеет вид, типичный для альдиминов ПЛФ с амино-

ю

кислотами с мажорной характерной полосой в области 420 нм (рис. 2). Отсутствие рН-зависимости спектра поглощения холофермента позволило нам предположить, что внутренний альдимин метионин - у-лиазы в области исследованных значений рН находится в одной ионной форме, а таутомерный состав ее незначительно изменяется.

Для определения ионного состояния внутреннего альдимина метионин - у-лиазы С. },геипсШ к.физ-мат.н. II.П. Бажулиной было проведено разложение спектров поглощения холофермента, снятых при рН 6,0 и рН 8,0, на полосы, соответствующие отдельным

электронным переходам таутомеров как катионой (А), так и нейтральной (В) форм альдиминов с использованием логнормального представления полос поглощения.

Основным критерием

корректности используемой

модели для описания

разлагаемого спектра было соответствие количества

найденных таутомеров и конформеров количеству

связанного в ферменте ПЛФ.

Рис. 3. Разложение спектров поглощения (а)

и кругового дихроизма (б) внутреннего

альдимина метионин - у-лиазы (рН 8,0) на

полосы отдельных электронных переходов:

точки - экспериментальные данные, жирные

Вторым критерием было либо линии - расчетные данные, тонкие линии -

, , полосы, соответствующие отдельным

совпадение, либо близость 3

электронным переходам. Обозначение

параметров экспериментальных стюуктуп как на схеме 1.

полос поглощения с параметрами соответствующих полос для модельных альдиминов. Анализ данных, полученных для разложений по двум моделям.

показал, что в случае катионной модели количество ПЛФ, связанного в ферменте, соответствует суммарному количеству найденных таутомеров и конформеров (ЕС,=1,00+0,02) Для нейтральной модели наблюдалось значительное расхождение (ЕС,=1,3 3+0,04) Следовательно, адекватной моделью для описания внутреннего альдимина метионин - у-лиазы является катионная модель

На рис 3 приведено разложение спектров поглощения и кругового дихроизма при рН 8,0 с использованием этой модели Экспериментально полученные параметры доминирующей полосы с Хтах= 424 нм были следующие энергия электронного перехода, Е = 2,92 эВ, волновое число, V = (23,56±0,02)х10"3 см"1, коэффициент молярного поглощения, е = (10,53±0,04)х10"3 М"'см"', полуширина, У? = (3,53±0,01)х10"3 см"1, асимметрия, р=1,57±0,01 Эти параметры совпали с соответствующими параметрами для полосы поглощения структуры II (кетимин) модельных соединений и параметрами полосы поглощения кетимина холофермента тирозин - фенол-лиазы С ]геипйп

Разложение спектров показало, что, помимо кетимина (структура И, схема 2), находящегося в таутомерном равновесии с енолимином (структура I, схема 2), для удовлетворительного описания спектра холофермента необходимо было ввести в модель структуру, поглощающую в области 310-335 нм В случае модельных альдиминов пиридоксаль-5'-фосфата с аминокислотами такой структурой может быть конформер с полностью выведенной из сопряжения альдиминной группой, т е конформер, у которого альдиминная группа находится в плоскости, перпендикулярной плоскости пиридинового цикла Для катионной формы (А, схема 2) такой структурой может быть конформер таутомера II (обозначен II*) с разорванной внутримолекулярной водородной связью

В таблице 4 представлено процентное содержание таутомеров и конформера внутреннего альдимина метионин-у-лиазы Таблица 4. Усредненное содержание различных форм внутреннего альдимина в

спектрах поглощения и кругового дихроизма

рН Кетимин, % Енолимин, % Конформер

формы II, %

6,0 или 8,0 62 ±10 22 ±2 14 ±7

Совокупность полученных данных позволяет уверенно заключить, что внутренний альдимин метионин-у-лиазы в области значений рН 6,0-8,0 существует в одной ионной форме, в которой преобладающим является таутомер II (оба гетероатома протонированы, а гидроксильная группа депротонирована и связана водородной связью с атомом азота альдиминной группы). Это предполагает, что величина рКа пиридинового атома в холоферменте должна быть не ниже 9,0 в то время как для модельных альдиминов эта величина не превышает 7.

В трехмерной структуре холофермента метионин - у-лиазы боковая карбоксильная группа остатка Asp 185 расположена на расстоянии водородной связи от пиридинового атома азота кофермента. Вероятно, высокое значение рКа пиридинового атома азота в холоферменте по сравнению с величиной рКа для альдиминов пиридоксаль-5'-фосфата в растворе объясняется наличием водородной связи и электростатического взаимодействия с остатком Aspl85 (рис. 4).

Рис. 4. Фрагмент активного центра метионин - у-лиазы С. /геипсШ.

7. рН-аависимость параметров стационарной кинетики реакции а,у-элиминирования Ь-метионина

рН-зависимость параметров к^, и кса1/Км реакции а,у-элиминирования Ь-метионина исследовалась в интервале значенияй рН 6 - 9 (таблица 5, рис. 5).

Таблица 5. рН-зависимость параметров стационарной кинетики реакции а,у-элиминирования Ь-метионина.

рН ксаь С Км, мМ к^/Км, мМ"'с"'

6,0 1,36±0,041 3,6±0,24 0,38

6,5 2,71 ±0,024 2,04±0,041 1,33

7,0 4,83±0,096 1,7±0,085 2,84

7,5 6,98±0,056 0,79±0,016 8,84

8.0 6,5±0,13 0,61±0,049 10.66

8,5 6,05±0,157 0,51±0,044 11,86

9,0 5,88±0,118 0,68±0,054 8,65

рН-зависимость параметра кса[/Км (1о§У/К) для реакции а,у-элиминирования Ь-метионина имеет колоколообразный вид с рН-оптимумом 8,3 и двумя (кислотным и щелочным) значениями рКа1 и рКа2 равными 7,63 ±0,11 и 8,99 ±0,23. рН-зависимость параметра кса1 (1о§У) имеет одно кислотное значение рКа равное 6,59 ± 0,06 (рис. 5).

Поскольку в спектре поглощения фермента в области рН 6,0-8,0 не обнаружено изменений, указывающих на возможность диссоциации

протона кофермента, кислотное значение рКа1 следует отнести к рКа группы белка. При этом мы полагаем, что в фермент-субстратном комплексе рКа этой группы равняется 6,59 (зависимость кса, от рН), а в

Рис.

5.

РН

рН-зависимость

параметров

свободном ферменте эта группа, стационарной кинетики реакции а,у-

элиминирования Ь-метионина.

вероятно, имеет рКа=7,63

(зависимость к^/Км от рН) Эта группа фермента должна быть депротонирована для реакции а,у-элиминирования Ь-метионина Основное значение рК^, присутствующее в профиле рН-зависимости к£а./Км (8,99), формально можно отнести к рКа а-аминогруппы Ь-метионина

На основании полученных данных может быть построена кинетическая схема реакции (схема 2), предполагающая, что фермент связывает цвитгерионную форму субстрата и для протекания реакции необходимо депротонирование определенной группы фермента

рКа=8,99 . г+ 8Н 8 + Н"

рКа=7,63

БН

Е ЕБН -Е + Р

+Н+ +Н+|1 рКа=б,59

8Н >' ЕН Е8Н2

Схема 2. Кинетическая схема реакции а,у-элиминирования Ь-метионина

8. Кинетические изотопные эффекты в реакции а,у-элиминирования

Определение изотопных эффектов отрыва протонов от а- и р-атомов углерода Ь-метионина и изотопного эффекта растворителя было проведено с целью установления скорость-лимитирующей стадии реакции ферментативного расщепления Ь-метионина

Сравнение начальных скоростей реакций а,у-элиминирования Ь-метионина с использованием дейтерированных субстратов было проведено вблизи кислотного и основного значений рКа, определенных в рН-профиле реакции расщепления Ь-метионина (рис 5) В таблицах 6 и 7 приведены данные кинетического изотопного эффекта отрыва протонов от а- и р-атомов углерода Ь-метионина при разных значениях рН Наблюдаемые эффекты были невелики, и мы не нашли заметного влияния рН на их величины Небольшие изотопные эффекты и отсутствие их изменения при понижении или повышении рН следует рассматривать, исходя из

теоретического рассмотрения рН-зависимости кинетических изотопных эффектов, как данные в пользу того, что скорости других стадий ферментативной реакции сопоставимы со скоростями стадий отрыва протонов от а- и р-атомов углерода или стадии, следующие за стадиями отрыва протонов от а- и р-атомов углерода Ь-метионина, являются более медленными

Найденные величины изотопного эффекта растворителя в реакции а,у-элиминирования Ь-метионина (табл 8) оказались заметно выше

Таблица 6. рН-зависимость изотопного эффекта отрыва протона от а-атома углерода Ь-метионина

рН Оу Ь)у/к

6,0 1,66 ±0,08 1,80 + 0,13

6,5 1,22 ± 0,02 2,00 + 0,18

7,0 1,20 ±0,11 2,08 ±0,14

7,5 1,18 + 0,12 1,74 ±0,19

8,0 1,08 + 0,05 1,64 ± 0,04

8,5 1,29± 0,01 1,18 ±0,12

I 7. рН-зависимость изотопного эффекта отрыва протона от

углерода Ь-метионина

рН Оу

7,0 1,24 ±0,12 1,28 ± 0,21

7,5 1,14 ±0,14 1,44 ± 0,23

8,0 1,04 + 0,07 1,52± 0,26

Таблица 8. рН-зависимость изотопного эффекта растворителя в реакции а,у-

эчиминирования Ь-метионина

рВ Оу Оу/к

7,0 1,91 ± 0,29 2,98 ± 0,69

7,5 2,84 ± 0,29 3,49 ± 0,79

8,0 1,83 ± 0,07 3,91 ±0,38

Механизм реакции а,у-элиминирования Ь-метионина, катализируемой Ь-метионин-у-лиазой, представлен на схеме 3

УП

н н

НзСЭ.. X. ,С02

&

Схема 3. Механизм реакции а,у-элиминирования Ь-метионина, катализируемой метионин-у-лиазой

В рамках химической схемы реакции а,у-элиминирования L-метионина (схема 3), влияние растворителя может быть связано либо со стадией образования кетимина V, либо со стадией превращения винил-глицинового интермедиата VIII в а-аминокротонат X, либо со стадией элиминирования метилтиольной группы, если эта стадия требует общекислотного катализа Анализируя изотопный эффект растворителя, мы принимали во внимание литературные данные, полученные для триптофан - индол-лиазы Е coli, показывающие, что в реакции а,¡5-элиминирования стадия элиминирования метилтиольной группы S-метил-Ь-цистеина не чувствительна к изотопному эффекту растворителя Можно предположить, что для метионин - у-лиазы стадия элиминирования метилтиольной группы также не является чувствительной к изотопному эффекту растворителя Таким образом, наблюдаемые изотопные эффекты растворителя, скорее всего, связаны со стадией протонирования а-хиноидного интермедиата (схема 3, стадия IV —> V) и превращения винил-глицинового интермедиата VIII в а-аминокротонат X, и эти стадии могут рассматриваться как скорость-лимитирующие

9 Поиск условий получения кристаллов фермента, пригодных для рентгеноструктурного анализа

Первичный поиск условий кристаллизации метионин - у -лиазы С freundii проводили с использованием набора «Crystal Screen 2» Дальнейшую оптимизацию условий кристаллизации осуществляли путем варьирования составов осаждающих растворов и концентрации фермента

Для получения кристаллов метионин - у-лиазы С freundii использовали препараты рекомбинантного фермента с концентрациями 10 и 20 мг/мл Оптимизацию условий проводили в трех буферных системах в 0,1М МЕС буфере рН 6,5, в 50мМ Трис-HCl буфере рН 8,5, в 50мМ калий-фосфатном буфере рН 7,2, с добавлением хлорида калия и сульфата аммония в различных концентрациях В качестве осадителей использовали полиэтилен гликоль (ПЭГ) 6000, полиэтилен гликоль монометиловый эфир (ПЭГ MME) 5000 и ПЭГ ММЭ 2000

Образование кристаллов фермента кубической либо призматической формы

наблюдали в течение недели в Трис-HCl и МЕС буферах с добавлением сульфата аммония и с использованием в качестве осадителя ПЭГ ММЭ 5000 и ПЭГ ММЭ 2000.

Пригодные для съемки кристаллы были получены с использованием препарата метионин - у-лиазы с концентрацией 20 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 8,5, содержащем 0,5 мМ ПЛФ и 0,2 мМ ДТТ. В качестве осаждающего раствора использовали 35-37% ПЭГ ММЭ 2000, в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 8,5 содержащем 200 мМ сульфата аммония, 0,2 мМ ПЛФ и 25 мМ ДТТ. Кубические кристаллы появлялись через неделю и достигали размера 0,3 мм в течение двух недель (рис. 6).

Кристаллы принадлежали к пространственной группе 1222, с параметрами элементарной ячейки а = 56,35 А, Ь = 121,83 А, с = 127,16 А, и содержали одну субъединицу в ассиметричной части ячейки.

Пространственная структура фермента была решена методом молекулярного замещения с использованием трехмерной структуры метионин - у-лиазы Р. ри11с1а в качестве модели, уточнена при разрешении 1,9 А и депонирована в Международный Банк Белковых Структур - (РБВ код 1у41).

Рис. 6. Кристаллы метионин - у-лиазы С. freundii.

Выводы

1 Разработан метод очистки метионин - у-лиазы из клеток С freund.ii

2 Определена нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомы С р-еиМп, содержащая ген, кодирующий метионин - у-лиазу Для суперпродукции метионин - у-лиазы сконструирована гибридная плазмида рЕТ-ггщ! Рекомбинатный фермент получен в гомогенном виде

3 Определены кинетические параметры реакций а,у- и а,Р-элиминирования ряда субстратов для эндогенного и рекомбинантного ферментов Установлены заметные различия полученных параметров кса1 и Км от аналогичных параметров для метионин - у-лиазы из других источников

4 Проанализированы спектры поглощения и кругового дихроизма холофермента Показано, что внутренний альдимин метионин - у-лиазы в области значений рН 6,0-8,0 существует в одной ионной форме, в которой преобладающим является таутомер кетимина

5 Исследована рН-зависимость реакции а,у-элиминирования Ь-метионина и предложена кинетическая схема реакции Данные трех типов кинетических изотопных эффектов реакции а,у-элиминирования Ь-метионина показали, что стадии отрыва протонов от а- и р-атомов углерода не являются скорость-лимитирующими

6 Подобраны условия для получения кристаллов метионин - у-лиазы С р-еиМи, пригодных для рентгеноструктурного анализа Получены кристаллы, позволившие определить пространственную структуру холофермента с разрешением 1,9 А

Список публикаций по теме диссертации

1 Manukhov IV, Demidkina Т V, Mamaeva D V, Rastorguev S M and Zavilgelsky G В Citrobacter freundn methionine y-lyase (megL) and putative amino acid permease (aap) genes, complete cds, 2003, Gene bank accession number AY204910

2 Revtovich S V, Mamaeva D V, Morozova E A, Nikulin A D , Nikonov S V, Garber M В , Demidkina T V Crystal Sructure of Citrobacter freundn L-methionme-lyase, 2004, PDB код 1Y41

3 Manukhov IV, Mamaeva DV, Rastorguev SM, Faleev NG, Morozova EA, Demidkina T V, Zavilgelsky G В A gene encodmg L-methiomne y-lyase is present in Enterobacteriaceae family genomes identification and characterization of Citrobacter freundu L-methionme y-lyase J Bactenol, 2005, v 187(11), p. 3889-3893

4 Mamaeva D V, Morozova E A, Nikulin A D, Revtovich S V, Nikonov S V , Garber M В , Demidkina T V Structure of Citrobacter freundn L-methiomne y-lyase Acta Cryst, 2005, F61, p 546-549

5 Манухов И В , Мамаева Д В , Морозова Е А, Расторгуев С M, Фалеев H Г, Демидкина ТВ Завильгельский Г Б L-Метионин - у-лиаза Citrobacter freundu клонирование гена и кинетические параметры фермента Биохимия (Москва), 2006, т 71(4), с 361-369

Материалы работы, опубликованные в виде тезисов сообщений на конференциях

1 Мамаева Д В, Барболина М В, Демидкина Т В L-метионин - у-лиаза Citrobacter freundn метод очистки и некоторые свойства Тезисы школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, Россия, 2000, т2, с 250

2 Mamaeva D V , Barbolma М V, Demidkma Т V Purification and some properties of L-methionine y-lyase from Citrobacter freundii International conference "Biocatalysis-2000 Fundamentals and applications" Moscow (Russia), June 10-15, 2000, book of abstracts, p 122

3 Mamaeva D V , Faleev N G, Demidkina T V Purification and some properties of L-methionine y-lyase from Citrobacter freundii The 5-th International Engelhardt Conference on Molecular Biology June 21-26,2001, Moscow (Russia), posters session

4 Mamaeva D V, Faleev N G & Demidkma T V Purification and some properties of L-methionme y-lyase from Citrobacter freundii The 3nd International Symposium on Vitamin B6, PQQ, Carbonyl Catalysis and Quinoprotems Book of abstracts, p 46 April 14- 19,2002, University of Southampton, UK

5 Мамаева Д В , Фалеев H Г, Демидкина Т В Выделение и свойства L-метионин -у-лиазы из Citrobacter freundii III съезд биохимического общества РАН Тезисы научных докладов, с 592,26 июня - 1 июля 2002, Санкт-Петербург, Россия

6 Manukhov IV, Rastorguev S М, Zavilgelsky G В , Mamaeva D V, Demidkma T V Gene cloning and characterization of Citrobacter freundii L-methionme y-lyase 1st Congress of European of Microbiologists Poster session Slovenia, Ljubljana, Cankarjevdom, June 29 - July 3,2003

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 1299г Подписано к печати 29 01 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ 027 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Мамаева, Дарья Валерьевна

Введение.

Список обозначений и сокращений:.

Обзор литературы. Метионин - у-лиаза. Механизм катализируемых реакций, структура и применение в медицине.

1. Химические основы многообразия реакций, катализируемых пиридоксаль-5'-фосфат зависимыми ферментами.:.г.

2. Метионин — у-лиаза: реакционная специфичность и многообразие источников.

3: Механизм реакций а,у-элиминирования и у-замегцения, катализируемых метионин -у-лиазой и другими ПЛФ-зависимыми ферментами, принадлежащими к у-семейству. „

4. Кристаллическая структура метионин - у-лиазы.

5. Применение метионин - у-лиазы в медицине.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метионин - γ-лиаза Citrobacter freundii: очистка, кристаллизация, физико-химические и каталитические параметры природного и рекомбинантного типов"

Ферменты, содержащие в качестве кофактора пиридоксаль-5'-фосфат, играют первостепенную роль в азотистом обмене. Они катализируют разнообразные реакции превращений аминокислот -трансаминирование, рацемизацию, а- и Р-декарбоксилирование, ретро-альдольное расщепление, (3- и у-элиминирование и замещение. Центральная роль пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов в метаболизме аминокислот и аминов определяет актуальность исследования механизмов их действия и регуляции их генов.

Метионин - у-лиаза (КФ 4.4.1.11) пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый фермент, катализирующий реакцию а,у-элиминирования L-метионина (или его производных) с образованием а-кетобутирата, метантиола и аммиака: о о

Фермент также катализирует реакцию у-замещения L-метионина и его аналогов, а также реакции а,|3-элиминирования и р-замещения L-цистеина и его аналогов.

В последнее десятилетие, в основном благодаря развитию методов рентгеноструктурного анализа и быстрой кинетики, установлены детальные механизмы действия и пространственные структуры для многих пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферментов, в первую очередь принадлежащих к классу трансфераз. Значительные успехи достигнуты и в структурных исследованиях

3-элиминирующих и Р-замещающих лиаз. Однако механизм пиридоксаль-5'-фосфат-зависимой реакции у-элиминирования аминокислот является одним из наименее изученных.

Изучение структуры и механизма действия метионин — у-лиазы позволит получить новые важные данные о механизме реакции у-элиминирования и. закономерностях взаимоотношения структура-функция, обеспечивающих специфичность и эффективность разнообразных превращений аминокислот при участии одного кофактора.

К настоящему времени ген, кодирующий метионин - у-лиазу, был найден в большом количестве секвенированных геномов микроорганизмов, в том числе и в некоторых патогенных. Фермент был также найден в патогенных эукариотах Trichomonas vaginalis и Entamoeba hystolytica. Однако этот ген не найден у млекопитающих. Поэтому ингибиторы метионин - у-лиазы могут быть новыми эффективными антипатогенными средствами.

В 70-х годах стала известна абсолютная потребность многих раковых клеток в метионине и в последнее время появляется все больше исследований, связанных с применением метионин — у-лиазы как противоопухолевого агента. Показано, что введение метионин — у-лиазы (как белкового препарата, так и в составе ретро- и аденовирусного векторов) в опухолевые клетки приводит к их гибели. В раковых клетках в присутствии метионин - у-лиазы наблюдалось значительное снижение уровня метилированной геномной ДНК, коррелировавшее с замедлением роста клеток.

Впервые метионин — у-лиаза была получена в гомогенном виде сравнительно недавно - в 1977 г. из клеток Pseudomonas putida. К настоящему времени очищена метионин — у-лиаза нескольких источников (Pseudomonas putida, Pseudomonas ovalis, Aeromonas, Brevibacterium lines, Trichomonas vaginalis, Pseudomonas taetrolens и Citrobacter freundii), однако данные о физико-химических и каталитических свойствах этих ферментов весьма ограничены.

В связи с перспективностью использования метионин - у-лиазы в медицине целесообразно всесторонне исследовать ферменты, выделенные из различных источников.

Целью данной работы являлось исследование физико-химических и каталитических параметров метионин — у-лиазы Citrobacter freundii.

В работе были поставлены следующие задачи:

1)разработка метода получения гомогенного препарата метионин - у-лиазы Citrobacter freundii,

2) клонирование и секвенирование гена фермента и создание штамма-суперпродуцента,

3) определение стационарных каталитических параметров фермента,

4) поиск условий выращивания кристаллов метионин - у-лиазы, пригодных для рентгеноструктурных исследований.

Список обозначений и сокращений

АГТ - Об-алкилгуанидин-ДНК алкилтрансфераза, ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидразин, ДТТ - дитиотреитол,

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтил целлюлоза, ЛДГ - лактатдегидрогиназа тип II из мышцы кролика, ПААГ - полиакриламидный гель, ПЛФ - пиридоксаль-5'-фосфат,

ПЭГ ММЕ— полиэтилен гликоль монометиловый эфир,

5-10 ТГФ - N5-N10-метилен-тетрагидрофолат

ФМСФ - фенилметил-сульфонилфторид,

ХЭНМ - хлорэтилнитрозомочевина,

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота,

LB-среда - Lauria-Bertani среда,

NADH - никотинамид аденин динуклеотид фосфат, восстановленная форма, rMGL - метионин - у-лиаза, рекомбинантный фермент.

Обзор литературы

Метионин - у-лиаза. Механизм катализируемых реакций, структура и применение в медицине

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мамаева, Дарья Валерьевна

Выводы

1. Разработан метод очистки метионин — у-лиазы из клеток Citrobacter freundii.

2. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомы Citrobacter freundii, содержащая ген, кодирующий метионин — у-лиазу. Для суперпродукции метионин — у-лиазы Citrobacter freundii сконструирована гибридная плазмида pET-mgl. Рекомбинатный фермент получен в гомогенном виде.

3. Определены кинетические параметры реакций а,у- и ос, (3-элиминирования ряда субстратов для эндогенного и рекомбинантного ферментов. Установлены заметные различия полученных параметров kcat и Км от аналогичных параметров для метионин — у-лиазы из других источников.

4. Изучены спектры поглощения и кругового дихроизма холофермента. Показано, что внутренний альдимин метионин — у-лиазы в области значений рН 6,0-8,0 существует в одной ионной форме, в которой преобладающим является таутомер кетимина.

5. Исследована рН-зависимость реакции а,у-элиминирования L-метионина и предложена кинетическая схема реакции. Данные трех типов кинетических изотопных эффектов реакции а,у-элиминирования L-метионина показали, что стадии отрыва протонов от а- и |3-атомов углерода не являются скорость-лимитирующими.

6. Подобраны условия получения кристаллов метионин - у-лиазы Citrobacter freundii, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Получены кристаллы, позволившие определить пространственную структуру холофермента с разрешением 1,9 А.

Настоящая работа финансово поддержана грантами Российского Фонда фундаментальных исследований (№ 99-0449251, 02-04-48010), грантом Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ-1800.2003.4.

Автор приносит благодарность д.х.н. Т.В. Демидкиной за научное руководство; член-кор. РАН, проф. А.Г.Габибову за участие в обсуждении результатов; к.х.н. A.M. Крицыну за участие в обсуждении результатов; к.х.н. Н.Г. Фалееву за участие в работе, обсуждении результатов и синтез [а- HJ-L-метионина; [сс,Р,Р- Н3]-Ь-метионина; проф. Г.Б. Завильгельскому, к.б.н. И. Манухову, к.б.н. С. Расторгуеву за участие в работе по клонированию фермента; проф. М.Б.Гарбер, к.б.н. А.Д. Никулину, к.х.н. С.В.Ревтович,* к.б.н. С.В.Никонову за активное участие в расшифровке кристаллической структуры фермента; к.ф.м.н. Н.П.Бажулиной за обработку и обсуждение спектральных данных; проф. Н.С.Андреевой за помощь в подготовке текста диссертации; Н.И.Синицыной и к.х.н. Л.Н.Закомырдиной за участие в работе; к.х.н. М.В.Барболиной за участие в работе по клонированию и в обсуждении результатов; к.х.н. В.В.Куликовой за критическое чтение рукописи и помощь в подготовке текста диссертации; к.х.н. А.М.Никитину за критические замечания и помощь в получении фотографий кристаллов фермента; сотрудникам лаборатории химических основ биокатализа и всем сотрудникам ИМБ РАН за помощь в работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Мамаева, Дарья Валерьевна, Москва

1. Gyorgy P. The history of vitamin B6. I/The American journal of clinical nutrition, 1956, v.4, 4, p.313-317.

2. Umbreit W.W. and Gunsalus I.C. The function of pyridoxine derivatives: arginine and glutamic acid decarboxylases. IIJ Biol Chem, 1945, v. 159, p.333-341.

3. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. М., Мир, 1980, т.2, с.75.

4. John R.A. Pyridoxal phosphate-dependent enzymes. Review. IIBiochimica et Biophysica Acta, 1995, v.1248, 2, p.81-96.

5. Брауиштейи A.E., Шемякин M.M. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. //Биохимия, 1953, т. 18, с. 393-411.

6. Metzler, D.E., Ikawa, М., and Snell; Е.Е., Transamination of Pyridoxamine and Amino Acids with Glyoxylic Acid. //J.Amer.Chem.Soc., 1954, 76, 644-648.

7. Clausen Т., Laber B. and Messerschmidt A. Mode of action of cystathionine (3-lyase. //Biol. Chem., 1997, v. 378, p. 321-326.

8. Dunathan H.C. Conformation and reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. UProc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966, 55, 712-716.

9. Eliot A.C. & Kirsch J.F. Pyridoxal phosphate enzymes: mechanistic, structural, and evolutionary considerations. HAnnu. Rev. Biochem., 2004, v.73, p.383-415.

10. Ivanov V.I. & Karpeisky M.Ya. Dynamic three-dimensional model for enzymic transamination. //Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1969, 32, 21-53.

11. Enzyme Nomenclature, Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Acad. Press, 2002.

12. Tanaka H., Esaki N., Soda K. A versatile bacterial enzyme: L-methionine y-lyase. //Enzyme Microb. Technol., 1985, v. 7, p.530-537.

13. Tanaka H., Esaki N., Soda K. Synthesis of optically active sulfur and selenium amino acids with microbial enzymes. HAppl. Biochem. Biotechnol. 1985, 11 71-82.

14. Alexander F.W., Sandmeier E., Mehta P.K., Christen P. Evolutionary relationships among pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes: regio-specific a, P and y-families. //Eur. J. Biochem., 1994, v. 219, p. 953-960.

15. Kreis W., Hession C. Isolation and purification of L-methionine-alpha-deamino-mercaptomethane-lyase (L-methioninase) from Clostridium sporogenes. //Cancer Res 1973, 33, 1862-1865

16. Лукина В.И., Березов Т.Т., Занин В.А. Штамм Pseudomonas taetrolens ВКМВ-904 продуцент фермента метиониназы: Авторское свидетельство 967077, 1982.

17. Nakayama Т., Esaki N., Lee W.J., Tanaka I., Tanaka H., Soda К., Purification and properties of L-methionine y-lyase from Aeromonas sp. l/Agric. Biol. Chem., 1984, v. 48, p. 2367-2369.

18. Esaki N., Soda K. L-methionine gamma-lyase from Pseudomonas putida and Aeromonas. //Methods Enzymol., 1987, v. 143, p. 459-465.

19. Kobayashi Т., Hakamada Y., Adachi S., Hitomi J., Yoshimatsu Т., Koike K., Kawai S. and Ito S. Purification and properties of an alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. KSM-K16 HAppl. Microbiol. Biotechnol., 1995, v. 43 (3), p. 473-481.

20. Faleev N.G., Troitskaya M.V., Paskonova E.A., Saporovskaya M.B., Belikov V.M. L-Methionine y-lyase in Citrobacter intermedius cells: Stereochemical requirements with respect to the tiol structure. //Enzyme Microb. Technol., 1996, v. 19, p. 590-593.

21. Tanaka H., Esaki N., Soda K. Properties of L-methionine gamma-lyase from Pseudomonas ovalis. //Biochemistry, 1977, v. 16, p. 100106.

22. Dias В., Weimer B. Purification and characterization of L-methionine y-lyase from Brevibacterium lines B12. HAppl. Environ. Microbiol., 1998, v. 64 (9), p. 3327-3331.

23. Yoshimura M., Nakano Y., Yamashita Y., Oho Т., Saito Т., Koga T. Formation of methyl mercaptan from L-methionine by Porphyromonas gingivalis. //Infect. Immun. 2000, v. 68, p. 6912-6916.

24. Yoshimura M., Nakano Y., Fukamachi H., Koga T. 3-Chloro-DL-alanine resistance by L-methionine-alpha-deamino-gamma-mercaptomethane-lyase activity. IIFEBS Lett., 2002, v. 523(1-3), p. 119-122.

25. Takami H., Takaki Y., Uchiyama I. Genome sequence of Oceanobacillus iheyensis isolated from the Iheya Ridge and its unexpected adaptive capabilities to extreme environments. //Nucleic Acids Res., 2002, v. 30 (18), p. 3927-3935.

26. Tokoro M., Asai Т., Kobayashi S., Takeuchi Т., and Nozaki T. Identification and characterization of two isoenzymes of methionine y-lyase from Entamoeba histolytica. IIJ. Biol. Chem., 2003, v. 278, p. 42717-42727.

27. Daraselia N., Dernovoy D., Tian Y., Borodovsky M., Tatusov R., Tatusova T. Reannotation of Shewanella oneidensis genome. HOMICS, 2003, v. 7 (2), p. 171-175.

28. Brettin T.S., Bruce D., Challacombe J.F., Gilna P., Han C., Hill K., Hitchcock P., Jackson P., Keim P., Longmire J., Lucas S., Okinaka R., Richardson P., Rubin E. and Tice H. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP085976.

29. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP603484.

30. Giovannoni S.J., Cho J.-C., Ferriera S., Johnson J., Kravitz S., Halpern A., Remington K., Beeson K., Tran В., Rogers Y.-H., Friedman R. and Venter J.C. //Direct Submission, Proteins, ACCESSION YP458784.

31. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION ZP00606108.

32. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter J.C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP525366.

33. Copeland A., Lucas- S., Lapidus A., Barry K., Detter J.C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP484072.

34. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION ZP00587584.

35. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION ZP01435953.

36. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter C., Glavina i Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP563524.

37. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP750060.

38. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter J.C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP738587.

39. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter J.C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P: //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION ZP00815415.

40. Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter C., Glavina Т., Hammon N., Israni S., Pitluck S. and Richardson P. //Direct Submission, ENTREZ, Proteins, ACCESSION YP614731.

41. Fukamachi H., Nakano Y., Okano S., Shibata Y., Abiko Y., Yamashita Y. High production of methyl mercaptan by L-methionine-alpha-deamino-gamma-mercaptomethane lyase from Treponema denticola. /1Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, v. 331(1), p. 127131.i

42. Esaki N., Suzuki Т., Tanaka H., Soda K., Rando R.R. Deamination and gamma-addition reactions of vinylglycine by L-methionine gamma-lyase. //FEBS Lett., 1977, v. 84 (2), p. 309-312.

43. Johnston M., Jankowski D., Marcotte P., Tanaka H., Esaki N., Soda K. and Walsh Ch. Suicide inactivation of bacterial cystathionine y-synthase and methionine y-lyase during processing of propargylglycine. //Biochemistry, 1979, v. 18, p. 4690-4701.

44. Johnston M., Raines R, Chang M., Esaki N., Soda K., Walsh C. Mechanistic studies on reactions of bacterial methionine gamma-lyase with olefinic amino acids. //Biochemistry, 1981, v. 20 (15), p. 43254333.

45. Esaki N., Nakayama Т., Sawada S., Tanaka H., Soda K. !H NMR studies of substrate hydrogen exchange reactions catalyzed by L-methionine gamma-lyase. //Biochemistry, 1985, v. 24 (15), p. 38573862.

46. Inoue H., Inagaki K., Adachi N., Tamura Т., Esaki N., Soda K. and Tanaka H. Role of Tyrosine 114 of L-methionine y-lyase from Pseudomonas putida. UBiosci. Biotechnol. Biochem., 2000, v. 64 (11), p. 2336-2343.

47. Christen P., Mehta P.K. From cofactor to enzymes. The molecular evolution of pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes. Review. HChem Rec., 2001, v. 1 (6), p. 436-447.

48. Johnston M., Marcotte P., Donovan J., Walsh C. Mechanistic studies with vinylglycine and beta-haloaminobutyrates as substrates for cystathionine gamma-synthetase from Salmonella typhimurium. IIBiochemistry, 1979, v. 18, p. 1729-1738.

49. Guggenheim S. and Flavin M. Cystathionine gamma-synthase from Salmonella. //J. Biol. Chem., 1971, v. 246, p. 3562-3568.

50. Silverman R.B., Abeles R.H. Mechanism of inactivation of gamma-cystathionase by beta, beta, beta trifluoroalanine. 11 Biochemistry, 1977, v. 16 (25), p. 5515-5520.

51. Lockwood B.C. and Coombs G.H. Purification and characterization of methionine y-lyase from Trichomonas vaginalis. 11 Biochem. J., 1991, v. 279, p. 675-682.

52. Tanaka H., Esaki N., Yamamoto Т., Soda K. Purification and properties of methioninase from Pseudomonas ovalis. IIFEBS Letters, 1976, v. 66, p.307-311.

53. Flavin M. and Guggenheim S., in Yamada K., Katunuma N. and Wada H. (Editors), Symposium on pyridoxal enzymes, Maruzen Company, Ltd., Tokyo, 1968, p.89.

54. Davis L., and Metzler D.E. Pyridoxal-linked elimination and replacement reactions. In: The Enzymes (3rd Ed.) Ed. Boyer P.D., Wiley and Sons, N.Y., 1972, v. 3, p. 33-74.

55. Kallen R.G., Korpela Т., Martell A.E. Matsushima Y., Metzler C.M., Metzler D.E. Morozov Y.V., Ralston I.M., Savin F.A., Torchinsky Y.M. & Ueno H. The Transaminases, New York, Wiley, 1985, p. 37-105.

56. Karube Y. and Matsushima Y. A model for an intermediate in pyridoxal catalyzed gamma-elimination and gamma-replacement reactions of amino acids. IIJ. Am. Chem. Soc., 1977, v. 99, p. 13561358. •

57. Metzler D.E., Harris C.M., Johnston R.J., Siano D.B. & Thomson J.A. Spectra of 3-hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria. ПBiochemistry, 1973, v. 12, p. 5377-5392.

58. Walsh C. Enzymatic Reaction Mechanism; Freeman, San Francisco, 1979, p. 777-827.

59. Posner B.I. & Flavin M. Cystathionine-synthase. The nature of intramolecular proton shifts in the elimination reaction. IIJ. Biol. Chem., 1972, v. 247, p. 6412-6419.

60. Jansonius J.N. Structure, evolution and action of vitamin B6-dependent enzymes. //Curr. Opin. Struct. Biol., 1998, v. 8(6), p. 75969. Review.

61. Grishin N.V., Phillips M.A., Goldsmith E.J. Modeling of the spatial structure of eukaryotic ornithine decarboxylases. //Protein Sci., 1995, v. 4(7), p. 1291-1304.

62. Qu K., Martin D.L., Lawrence C.E. Motifs and structural fold of the cofactor binding site of human glutamate decarboxylase. //Protein ScL, 1998, v. 7(5), p. 1092-1105.

63. Revtovich S.V., Mamaeva D.V., Morozova E.A., Nikulin A.D., Nikonov S.V., Garber M.B., Demidkina T.V. Crystal Sructure of Citrobacter freundii L-methionine-lyase, 2004, PDB: 1Y4I.

64. Sato D., Yamagata W., Kamei K., Nozaki Т., Harada S. Expression, purification and crystallization of L-methionine gamma-lyase 2 from Entamoeba histolytica. IIActa Crystallograph. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 2006, v. 62, p. 1034-1036.

65. Clausen Т., Huber R., Laber В., Pohlenz H., and Messerchmidt A Crystal structure of pyridoxal 5'-phosphate dependent cystathionine (3-lyase from E.Coli at 1.83 A. IIJ. Mol. Biol., 1996, v. 262, p. 202 -224.

66. Kack H., Sandmark J., Gibson K., Schneider G., Lindqvist Y. Crystal structure of diaminopelargonic acid synthase: evolutionaryrelationships between pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes. //J. Mol. Biol., 1999, v. 291(4), p. 857-876.

67. Mamaeva D.V., Morozova E.A., Nikulin A.D., Revtovich S.V., Nikonov S.V., Garber M.B., and Demidkina T.V. Structure of Citrobacter freundii L-methionine gammarlyase. HActa Crystallograph. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 2005, v. 61, p.546.549.

68. Tanaka H., Yamada H., Esaki N., Soda K. Selective determination of L-methionine and L-cysteine with bacterial L-methionine y-lyase and antitumor activity of the enzyme. IIJ. Appl. Biochem., 1980, v. 2, p. 439-444.

69. Fung K.W., Kuan S.S., Sung H.Y., Guilbault G.G. Methionine selective enzyme electrode. 11 Anal. Chem., 1979, v. 51, p. 2319-2324.

70. Yoshimura M., Nakano Y., Koga T. L-Methionine-gamma-lyase, as a target to inhibit malodorous bacterial growth by trifluoromethionine. 11 Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, v.292(4), p. 964-968.

71. Nakano Y., Yoshimura M., Koga T. Methyl mercaptan production by periodontal bacteria. Hint. Dent. J., 2002, v. 3, p. 217-220.

72. Arfi K., Amarita F., Spinnler H.E., Bonnarme P. Catabolism of volatile sulfur compounds precursors by Brevibacterium linens and Geotrichum candidum, two microorganisms of the cheese ecosystem. IIJ Biotechnol., 2003, v. 105(3), p. 245-253.

73. Bonnarme P., Lapadatescu C., Yvon M., Spinnler H.E. L-methionine degradation potentialities of cheese-ripeningmicroorganisms. IIJ Dairy Res., 2001, v. 68(4), p. 663-674.

74. Amarita F., Requena Т., Taborda G., Amigo L., Pelaez C. Lactobacillus casei and Lactobacillus plantarum initiate catabolism of methionine by transamination. IIAppl Microbiol., 2001, v. 90(6), p. 971-978.

75. Bonnarme P., Psoni L., Spinnler H.E. Diversity of L-methionine catabolism pathways in cheese-ripening bacteria. IIAppl Environ Microbiol., 2000, v. 66(12), p. 5514-5517.

76. Dias В., Weimer B. Conversion of methionine to thiols by lactococci, lactotiacilli, and- brevibacteria. IIAppl Environ Microbiol., 1998, v. 64(9), p. 3320-3326.

77. Weimer В., Seefeldt K., Dias B. Sulfur metabolism in bacteria associated3 with cheese. Review. IIAntonie Van Leeuwenhoek., 1999, v. 76(1-4), p. 247-261.

78. Hoffman R.M. Methioninase: A therapeutic for diseases, related-to altered-methionine metabolism and transmethylation: cancer, heart disease, obesity, aging, and Parkinson's disease. Ulluman Cell, 1 997, v. 10, p. 69-80.

79. Cellarier E., Durando X., Vasson M.P., Farges M.C., Demiden A., Maurizis J.C., Madelmont J:C. and Chollet P. 11 Cancer Treat Rev., 2003, v. 29, p. 489-499.

80. Jones P.A. Death and methylation. //Nature, 2001, v. 409, p. 141144.

81. Breillout F., Antoine E., Poupon M.F. Methionine dependency of malignant tumors: a possible approach for therapy. IIJ Natl Cancer Inst., 1990, v. 82, p. 1628-1632.

82. Hoffman R.M. Altered methionine metabolism and transmethylation in cancer. IIAnticancer Res., 1985, v. 5, p. 1-30.

83. Kokkinakis D.M., Hoffman R.M. Frenkel E.P., et al. Synergy between methionine stress and chemotherapy in the treatment of brain tumor xenografts in athymic mice. 11 Cancer Res., 2001, v. 61, p. 40174023.

84. Poirson-Bichat F., Goncalves RA, Miccoli L., Dutrillaux В., Poupon MF. Methionine depletion enhances the antitumoral efficacy of cytotoxic agents in drug-resistant human tumor xenografts. HClin. Cancer Res., 2000, v. 6, p. 643-653.

85. Guo HY, Herrera H., Groce A., Hoffman RM, Expression of the biochemical defect of methionine dependence in fresh patient tumors in primary histoculture. 11 Cancer Res., 1993, v. 53, p. 2479-2483.

86. Halpern B.C., Clark B.R., Hardy D.N., Halpern R.M., Smith R.A. The effect of remplacement of methionine by homocysteine on survival of malignant and normal adult mammalian cells in culture. I/Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, v. 71, p. 1 133-1 136.

87. Stern P.H., Hoffman R.M. Enhanced in vitro selective toxicity of chemotherapeutic agents for human cancer cells based on a metabolic defect. HJ. Natl. Cancer Inst., 1986, v. 76, p. 629-639.

88. Hoffman R.M. Methionine dependence in cancer cells A review. Illn Vitro, 1982, v. 18, p. 421-428.

89. Kreis W., Baker A., Ryan V., Bertasso A. Effect of nutritional and enzymatic methionine deprivation upon human normal and malignant cells in tissue culture. I/Cancer Res., 1980, v. 40, p. 634641.

90. Mecham J.O., Rowitch D., Wallace C.D. Stern P.H., Hoffman R.M. The methabolic defect of methionine dependence occurs frequently in human tumor cell lines. //Biochem Biophys Res Commun, 1983, v. 117, p.429-434.

91. Ashe H., Clark BR, Chu F., et al. N5-methyltetrahydrofolate: homocisteine methyltransferase activity in extracts from normal, malignant and embryonic tissue culture cells. IIBiochem Biophys Res Commun., 1974, v. 57, p. 417-425.

92. Poirier L.A., Wilson M.J. The elevated requirement for methionine by transformed rat liver epithelial cells in vitro. IIAnn N Y Acad Sci., 1980, v. 349, p. 283-293.

93. Kenyon S.H., Waterfield C.J., Timbrell J.A., Nicolaou A. Methionine synthase activity and sulphur amino acid levels in the rat liver tumor cells HTC and Phi-1. IIBiochem Pharmacol., 2000, v. 63, p. 381-391.

94. Judde J.G., Ellis M., Frost P. Biochemical analysis of the role of transmethylation in the methionine dependence of tumor- cells. //Cancer Res., 1989, v. 49, p. 4859-4865.

95. Liteplo R.G., Hipwell S.E., Rosenblatt D.S., Sillaots S., Lue-Shing H. Changes in cobalamin metabolism are associated with the altered methionine auxotrophy of highly growth autonomous human melanoma cells. HJ Cell Physiol, 1991, v. 149, p. 332-338.

96. Fiskerstrand Т., Christensen В., Tysnes O.B., Ueland P.M., Refsum H. Development and reversion of methionine dependence in a human glioma cell line: relation to homocysteine remethylation and cobalamin status. HCancer Res., 1994, v. 54, p. 4899-4906.

97. Jacobsen S.J., North J.A., Rao N.A., Mangum J.H. 5-Methyltetrahydrofolate: synthesis and utilization in normal and SV40transformed BHK-21 cells. UBiochem Biophys Res Commun, 1977, v. 76, p. 46-53.

98. Frosst P., Blom H.J., Milos R., et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylentetrahydrofolate reductase. //Nat Genet, 1995, v. 10, p. 111113.

99. Van der Put N.M., Gabreels F., Stevens E.M., et al. A second common mutation in the methylentetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects? //Am J Hum Genet, 1998, v. 62, p. 1044-1051.

100. Bergstrom M., Ericson K., Hagenfeldt L., et al. PET study of methionine accumulation in glioma and normal brain tissue: competition with branched chain amino acids. HJ Comput Assist Tomogr, 1987, v. 11, p. 208-213.

101. Zingg J.M., Jones P.A., Genetic and epigenetic aspects of DNA methylation on genome expression, evolution, mutation and carcinogenesis. //Carcinogenesis, 1997, v. 18, p. 869-882.

102. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R., Vertino P.M., Issa J.P. Alterations in DNA methylation: a fundemental aspect of neoplasia. HAdv Cancer Res., 1998, v. 72, p. 141-196.

103. Dumontet C., Roch A.M., Quash G. Methionine dependence of tumor cells: programmed cell survival? //Oncol Res., 1996, v. 8, p. 469-471.

104. Fitchen J.H., Riscoe M.K., Dana B.W., Lawrence H.J., Ferro A.J. Methylthioadenosine phosphorylase deficiency in human leukemias and solid tumors. //Cancer Res., 1986, v. 46, p. 5409-5412.

105. Nobori Т., Szinai I., Amox D., et al. Methylthioadenosine phosphorylase deficiency in human non-small cell lung cancers. //Cancer Res., 1993, v. 53, p. 1098-1101.

106. Traweek S.T., Riscoe M.K., Ferro A.J., Braziel R.M., Magenis R.E., Fitchen J.H. Methylthioadenosine phosphorilase deficiency in acute leukemia: pathologic, cytogenetic, and clinical features. IIBlood, 1988, v. 71, p. 1568-1573.

107. Nobori Т., Karras J.G., Delia Ragione F., Waltz T.A., Chen P.P., Carson D.A. Absence of methylthyoadenosine phosphorylase in human gliomas. UCancer Res., 1991, v. 51, p. 3193-3197.

108. Ogier G., Chantepie J., Deshayes C., et al. Contribution of 4-methylthio-2-oxobutanoate and its transaminase to the growth of methionine-dependent cells in culture. Effect of transaminase inhibitors. 11 Biochem Pharmacol,. 1993, v. 45, p. 1631-1644.

109. Tang В., Li Y.N., Kruger W.D. Defects in methylthioadenosine phosphorylase are associated with but not responsible for methionine-dependent tumor cell growth. UCancer Res., 2000, v. 60, p. 55435547.

110. Kreis W., Hession C. Biological effects of enzymatic deprivationof L-methionine in cell culture and an experimental tumor. UCancer

111. Res., 1973, v. 33, p. 1866-1869.

112. Tan Y., Xu M., Guo H., Sun X., Kubota Т., Hoffman RM. Anticancer efficacy of methioninase in vivo. //Anticancer Res., 1996, v. 16, p. 3931-3936.

113. Hori H., Takabayashi K., Orvis L., Carson DA, Nobori Т., Gene cloning and characterization of Pseudomonas putida L-methionine alpha-deamino-gamma-mercaptomethane-lyase. UCancer Res., 1996, v. 56, p. 2116-2122.

114. Tan Y., Zavala Sr.J., Xu M., Zavala Jr.J, Hoffman RM. Serum methionine depletion without side effects by methioninase in metastatic breast cancer patients. 11 Anticancer Res., 1996, v. 16, p. 3937-3942.

115. Tan Y., Zavala Sr.J., Han Q., et al. Recombinant methioninase infusion reduces the biochemical endpoint of serum methionine with minimal toxity in high-stage cancer patients. 11 Anticancer Res., 1997, v. 17, p. 3857-3860.

116. Tan Y., Sun X., Xu M., An Z., Tan X., Han Q., Miljkovic D.A., Yang M., Hoffman R.M. Polyethilene glycol conjugation of recombinant methioninase for cancer therapy. UProtein Expr. Purif., 1998, v. 12 (1), p. 45-52.

117. Miki K., Xu M., Gupta A., Ba Y., Tan Y., Al-Rafaie W., Bouvet M., Makuuchi M., Moossa A.R., Hoffman R.M. Methioninase cancer gene therapy with selenomethionine as suicide prodrug substrate. UCancer Res., 2001, v. 61, p.6805-6810.

118. Peters G.J., Backus H.H., Freemantle S., et al. Induction of thymidylate synthase as a 5-fluorouracil resistance mechanism. IIBiochim. Biophys. Acta, 2002, v. 1587, p. 194-205.

119. Thomas D.M., Zalcberg J.R. 5-Fluorouracil: a pharmacological paradigm in the use of cytotoxics. HClin Exp Pharmacol Physiol., 1998, v. 25, p. 887-895.

120. Yoshioka Т., Wada Т., Uchida N., et al. Anticancer efficacy in vivo and in vitro, synergy with 5-fluorouracil, and safety of recombinant methioninase. //Cancer Res., 1998, v. 58, p. 2583-2587.

121. Machover D., Zittoun J., Broet P., et al. Cytotoxic synergism of methioninase in combination with 5-fluorouracil and folinic acid. //Biochem Pharmacol., 2001, v. ,61, p. 867-876.

122. Gou H., Lishko V.K., Herrera H., Groce A., Kubota Т., Hoffman R.M. Therapeutic tumor-specific cell cycle block induced by methionine starvation in vivo. //Cancer Res., 1993, v. 53, p. 56765679.

123. Goseki N., Yamazaki S., Endo M., et al. Antitumor effect of methionine-depleting total parental nutrition with doxorubicin administration on Yoshida sarcoma-bearing rats. //Cancer, 1992, v. 69, p. 1865-1872.

124. Kokkinakis D.M., von Wronski M.A., Vuong Т.Н., Brent T.P., Schold Jr.S.C. Regulation of Об-methylguanine-DNAmethyltransferase by methionine in human tumour cells J/Br.

125. J.Cancer, 1997, v. 75, p. 779-788.

126. Tan Y., Sun X., Xu M., et al. Efficacy of recombinant methioninase in combination with cisplatin on human colon tumors in nude mice. HClin. Cancer Res., 1999, v. 5, p. 2157-2163.

127. Hoshiya Y., Kubota Т., Matsuzaki S.W., Kitajima M., Hoffman R.M. Methionine starvation modulates the efficacy of cisplatin on human breast cancer in nude mice. //Anticancer Res., 1996, v. 16, p. 3515-3517.

128. Technique de Chromatographie adaptees a la Purification des Proteines et des Macromolecules Biologiques. Formation GE Healthcare & CNRS, Montpellier, 2006.

129. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. Под ред. ак. А.С.Спирина, Москва, «Высшая школа», 1996, 334 с.

130. Лукина В.И. Физико-химические и энзимологические свойства L-метионин у-лиазы из Pseudomonas taetrolens: Автореф. дис. на соискание ученой степени канд.биол.наук. М.: Российский университет дружбы народов, 1992.

131. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Изд. иностранной литературы, Москва, 1961, с. 40.

132. Nakayama Т., Esaki N., Sugie К., Beresov Т.Т., Tanaka Н., and Soda К. Purification of bacterial L-methionine y-lyase. 11 Anal. Biochem. , 1984, v. 138, p. 421-424.

133. Tanaka H., Esaki N., Yamamoto T. and Soda K. Purification and properties of methioninase from Pseudomonas ovalis. IIFEBS Lett., 1976, v. 66 (2), p. 307-31 1.

134. Ito S., Nakamura Т., Eguchi Y. Purification and characterization of methioninase from Pseudomonas putida. //J. Biochemistry (Tokyo), 1976, v. 79, p. 1263 1272.

135. Скоупс P. Методы очистки белка. M., Мир, 1985.

136. Tanaka Н., Esaki N., Soda К. Bacterial L-methionine y-lyase: characterization and application. //Sulfur Amino Acids: Biochemical and Clinical Aspects, Alan R. Liss, Inc., 150 Fifth Avenue, New York, NY10011, 1983, p.365-377.

137. Inoe H., Inagaki K., Sugimoto M., Esaki N., Soda K. & Tanaka H. Structural analysis of the L-methionine gamma-lyase gene from Pseudomonas putida. //J.Biochem., 1995, v. 117, p. 1120-1125.

138. Goodal G., Mottram J.C., Coombs G.H., and Laptom A.J. PDB-Entry 1E5E, 2000.

139. Bazhulina N.P., Morozov Yu.V., Papisova A.I., Demidkina T.V. Pyridoxal 5'-phosphate Schiff base in Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyase : ionic and tautomeric equilibria. // EJB, 2000, v. 267, p. 1830-1836.

140. Bazhulina N.P., Bokovoi V.A., Morozov Yu.V., Fiodorova L.I. & Chekhov V.O. Spectroscopic behavior of pyridoxal 5'-phosphate amino acid aldimines. Tautomer and isomer equilibria. //Molekulyarnaya Biologiya (in Russian), 1991, v. 25, p. 546-555.

141. Metzler C.M., Viswanath R. & Metzler D.E. Equilibria and absorption spectra of tryptophanase. //J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 9374-9381.

142. Ph. & Metzler D.E., eds), Wiley-Interscience, NY, USA, 1985, p. 37108.

143. Aitken S.M., and Kirsch J.F. Kinetics of the yeast cystathionine beta-synthase forward and reverse reactions: continuous assays and the equilibrium constant for the reaction. 11 Biochemistry, 2003, v. 42, p. 571-578.

144. A itken S.M., Kim D.H., and Kirsch J.F. Escherichia coli cystathionine gamma-synthase does not obey ping-pong kinetics. Novel continuous assays for the elimination and substitution reactions. //Biochemistry, 2003, v. 42, p. 11297-11306.

145. Cook P.F., and Cleland W.W. pH variation of isotope effects in enzyme-catalyzed reactions. 1. Isotope- and pH-dependent steps the same. //Biochemitry, 1981, v. 20, p. 1797-1805.

146. Sambrook J., Fritsch E.F.& Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

147. Sanger F., Nicklen S. & Coulsen A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. UProc. Natl. Acad. Sci. USA., 1977, v. 74, p. 5463-5467.

148. Расторгуев C.M., Завильгельский Г.Б. //Генетика, 2003, т. 39, с. 218-224.

149. Fridemann Т.Е., Haugen G.E. The determination of keto acids in blood and urine. IIJ. Biol. Chem., 1943, v. 177(2), p. 415-442.

150. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. М., Мир, 1980.

151. Cleland W. Statistical analysis of enzyme kinetic data. //Methods Enzymol., 1979, v. 63, p. 103-138.

152. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. IIJ. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.

153. Peterson E.A., Sober H.A. Preparation of crystalline phosphorylated derivatives of Vitamin B6. HJ. Amer. Chem. Soc., 1954, v. 76,p 169-175.

154. Metzler D.E., Harris C.M., Johnson R.J. & Siano D.B. Spectra of 3-hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria. //Biochemistry, 1973, v. 12, p. 5377-5392.

155. Glasoe P.V., Long F.A. //J. Phys. Chem. 1960, v. 64, p. 188-194.

156. Список публикаций по теме диссертации

157. Manukhov I.V., Demidkina T.V., Mamaeva D.V., Rastorguev S.M. and Zavilgelsky G.B. Citrobacter freundii methionine y-lyase (megL) and putative amino acid permease (aap) genes, complete cds, 2003, Gene bank accession number: AY204910.

158. Mamaeva D.V., Morozova E.A., Nikulin A.D., Revtovich S.V., Nikonov S.V., Garber M.B., Demidkina T.V. Structure of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase. Acta Cryst., 2005, F61, p. 546-549.

159. Манухов И.В., Мамаева Д.В., Морозова Е.А., Расторгуев С.М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В. Завильгельский Г.Б. L-Метионин у-лиаза Citrobacter freundii'. клонирование гена и кинетические параметры фермента. Биохимия (Москва), 2006, т. 71(4), с. 454463.

160. Revtovich S.V., Mamaeva D.V., Morozova Е.А., Nikulin A.D., Nikonov S.V., Garber M.B., Demidkina T.V. Crystal Sructure of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase, 2004, PDB: 1Y4I.

161. Материалы работы, опубликованные в виде тезисов сообщенийна конференциях

162. Мамаева Д.В., Барболина М.В., Демидкина Т.В. L-метионин у-лиаза Citrobacter freundii-. метод очистки и некоторые свойства. Тезисы школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, Россия, 2000, т.2, с. 250.

163. Mamaeva D.V., Faleev N.G., Demidkina T.V. Purification and some properties of L-methionine y-lyase from Citrobacter freundii. The 5-th International Engelhardt Conference on molecular biology. June 2126, 2001, Moscow (Russia), posters session.

164. Мамаева Д.В., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В. Выделение и свойства L-метионин — у-лиазы из Citrobacter freundii. Ill съезд биохимического общества РАН. Тезисы научных докладов, с. 592, 26 июня — 1 июля 2002, Санкт-Петербург, Россия.

165. Manukhov I.V., Rastorguev S.M., Zavilgelsky G.B., Mamaeva D.V., Demidkina T.V. Gene cloning and characterization of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase. 1st Congress of European of

166. Microbiologists. Poster session. Slovenia, Ljubljana, Cankarjevdom, June 29 July 3, 2003.к