Исследование роли глутатиона в ответе Escherichia coli на действие различных оксидантов

Музыка, Надежда Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование роли глутатиона в ответе Escherichia coli на действие различных оксидантов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли глутатиона в ответе Escherichia coli на действие различных оксидантов"

На правах рукописи

РГБ ОД

* С,- ? "0

МУЗЫКА Надежда Геннадьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ГЛУТАТИОНА В ОТВЕТЕ ЕЯСНЕМСНМ СОХ/НА ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ОКСИДАНТОВ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата . биологических наук

Пермь - 2000

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Ур РАН, г. Пермь

Научный руководитель доктор биологических наук Октябрьский О.Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ременнкков В.Г. доктор медицинских наук, профессор Кузяев Р.З.

Ведущая организация Институт микробиологии РАН, г. Москва

Защита состоится "30" ноября 2000 г. в 12.00 часов на заседай диссертационного совета Д 200.46.01 в Институте экологии и генети микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологи* генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан " " октября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Ившина И.1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Образование активных форм кислорода (АФК) в эоцессе нормального аэробного метаболизма клеток всех типов и широкий спектр изиологических эффектов АФК объясняют неослабевающий интерес к ;естороннему изучению их действия на живые организмы. Встреча внутри нанизма хозяина с макрофагами - еще одна ситуация, в которой бактерии эдвергаются воздействию активных форм кислорода. Установлено, что АФК <азывают на клетки всех тапов токсическое и мутагенное действие, вызывая шслительные повреждения ДНК, белков и мембранных липидов (Fair, Kogoma, )91). С окислительным стрессом связываются такие важные процессы как гарение, апоптоз, мутагенез и иммунитет (Дильман, 1986; Halliwell, Gutteridge, )90, Пескин, Столяров, 1994; Hochinan, 1997).

Бактерии Escherichia coli, как и другие энтеробакгерии, обладают несколькими ■тотемами защиты от окислительного повреждения, вызываемого деислием АФК. ак, в ответ на обработку перекисью водорода у Е. coli индуцируется синтез около 3 белков, включая каталазу-гидропероксидазу HPI, которая является активным гструктором Н202 (Christman etal., 1985).

Среди нерешенных вопросов, связанных с ответом бактерий на окислительный гресс, и в частности, на действие ЩО2, остается неясной роль глутатиона. лгутатион является главным низкомолекулярным _ тиолом у многих эамотрицательных бактерий, включая Е. coli (Fahey et al., 1978). По сравнению с ругими бактериями клетки Е. coli примечательны тем, что содержат около 10 мМ зутатиона, что близко к уровню, наблюдаемому в клетках животны ■; (Kosower, osower, 1978; Romero, Canada, 1991). Известно, что в клетках животных глутатион вляется важным компонентом клеточной защиты от окислительного повреждения, ызываемого Н2О2, и обработка клеток этим оксидантом сопровождается снижением ровня восстановленного глутатиона (GSH) и его окислением (Meister, Anderson, 983). Для бактерий данные о роли глутатиона в защите от действия АФК менее

определенны. Так, было сообщено, что мутанты Е. coli, дефицитные по синте глутатиона, проявляют такую же устойчивость к действию Н2О2 и некотор! другим оксидантам, как и клетки родительского типа (Apontoweil, Berends, 197: Owens, Hartman, 1986). Более того, в некоторых ситуациях такие мутанты проявля даже большую устойчивость к действию Н202, чем клетки дикого типа (Imlay, Lii 1987). Было обнаружено также, что обработка перекисью водорода не влияет уровень глутатиона у Е. coli (Greenberg, Demple, 1986) или даже приводит увеличению его уровня (Smimova, Oktyabrsky, 1994).

В то же время рядом авторов сообщалось, что клетки Е. coli, лишенн каталазы, имеют такую же чувствительность к обработке Н2О2, как и клетки дикс типа (Greenberg, Demple, 1986). Таким образом, сложилась парадоксальь ситуация, при которой для защиты Е. coli от действия Н2Ог оказывается не нужн ни одна из главных антаоксидантных систем клетки. В совокупности анаг научной литературы показывает, что данные о роли глутатиона в ответе бактер Е. coli на окислительный стресс немногочисленны и носят противоречив: характер. В этой связи выяснение роли глутатиона во время окислительного стрес и механизмов взаимодействия двух антиоксидантных систем, кэталазы глутатиона, является актуальной задачей.

Основная цель настоящего исследования - изучение роли глутатиона отклике бактерий Е. coli на окислительный стресс, вызванный обработкой растут клеток различными оксидантами.

Основные задачи:

1. Изучить действие перекиси водорода и генератора 02" менадиона на та! параметры растущих клеток Е. coli, как удельная скорость роста, внутриклеточн уровни тиолов и калия, а также редокс-статус глутатиона.

2. Сравнить уровень устойчивости клеток Е. coli, дефицитных по синт< глутатиона и клеток с нормальным уровнем глутатиона к окислительному стрес вызванному обработкой бактерий Н202, менадионом, кумен гидропероксидом также сульфгидрильным реагентом N-этилмалеимидом (NEM).

3. Исследовать влияние каталазы HPI на уровни низкомолекулярных тиолов и шия при действии Н2О2 и менадиона на клетки Е. coli.

4. Провести сравнительное исследование действия проникающего (Н2О2) и ^проникающего (K4[Fe(CN)6]) оксидантов на растущие клетки Е. coli.

Научная новизна и практическое значение. Показано, что обработка 1стущих клеток Е. coli дикого типа низкими и умеренными дозами Н2О2 не ызывает снижения уровня непротеиновых тиолов. Обнаружена обратная связь ежду количеством SH-групп в белках и уровнями низкомолекулярных тиолов JMT) и калия при действии низкими и умеренными дозами Н2О2.

Исследовано действие Н2Ог и менадиона на уровень и редокс-статус глутатиона клетках Е. coli. Обработка Н2О2 не влияет на уровень общего глутатиона, в то ремя как уровень окисленного глутатиона значительно снижается, следствием чего вляется повышение редокс-статуса глутатиона. Обработка клеток Е. coli енадионом вызывает истощение пула общего глутатиона, увеличение содержания кисленного глутатиона и понижение редокс-статуса глутатиона.

. Выявлена взаимосвязь между каталазной активностью и уровнем непро-еиновых тиолов в клетках Е. coli. Показано, что в клетках Е. coli, дефицитных по атапазе HPI, обработка Н2О2 приводит к снижению уровней небелковых тиолов и алия.

Показано, что обработка Е. coli феррицианидом калия приводит к снижению ровня внутриклеточных НМТ; эта изменения уровня НМТ были противоположны ем, которые наблюдали при обработке клеток перекисью водорода.

Выявленные закономерности между изменениями уровней белковых и ебелковых тиолов и калия дополняют накопленные к настоящему времени данные механизме адаптации клеток Е. coli к окислительному стрессу. Установление едокс-статуса глутатиона во время окислительного стресса не только определяет оль глутатиона как антиоксиданта, но и способствуют более полному пониманию го значения для жизнедеятельности бактерий. Полученные данные о взаимосвязи [ежду активностью каталазы и уровнем низкомолекулярных тиолов расширяют ¡редставления о механизме защиты Е. coli, от окислительного стресса и могут быть

использованы при создании лекарственных препаратов против патогеннь микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обработка растущих клеток Е. coli дикого типа Н202 не влияет на урове! НМТ; клетки Е. coli, имеющие низкий уровень глутатиона имеют такую я чувствительность к действию Н202, как и клетки с нормальным уровнем глутатион;

2. Существует взаимосвязь между каталазной и глутатаонов( антиоксидантными системами: действие Н202 на клетки Е. coli, дефицитные i каталазе-гидропероксидазе I (HPI), приводит к падению уровня общего глутатиок повышению количества GSSG и снижению соотношения GSH:GSSG; у штамме дефицитных по синтезу глутатиона, заметно возрастает активность каталазы HPI.

3. Каталаза HPI играет доминирующую роль в разложении экзогенн< перекиси водорода растущими клетками Е. coli.

А. Роль глутатиона в ответе на обработку растущих клеток Е. а непроникающим оксидаптом феррицианидом отлична от той, которую он играет ответе на действие проникающего оксиданта Н202. Полученные данш свидетельствуют в пользу участия глутатиона в восстановлении феррициани клетками Е. coli.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложе] на молодежной конференции УрО РАН (Екатеринбург, 1996; 1998); Международн конференции «Микробное биоразнообразие: состояние, стратегия сохранен! экологические проблемы» (Пермь, 1996); II съезде Биохимического общества Р^ (Пущино, 1997), Международной конференции «Проблемы загрязнен окружающей среды ICEP' 98» (Москва, 1998); Региональной конференции молод ученых ИЭГМ-ПГУ (Пермь, 1999). По теме диссертации опубликовано 14 печати работ. .

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на странш печатного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 6 таблицами; состоит из в: дения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, заключения

толов. Список литературы включает 195 наименований работ отечественных и рубежных авторов.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики гсроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований, проводимых по ме 2.28.9.3 «Изучение неспецифического отклика и адаптивной реакции бактерий L различные стрессовые воздействия». Тема утверждена Президиумом РАН, № гос. тистрации 01.9.10055305. Представленные ■ исследования были выполнены при -шансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты : 95-04-11182 и 98-04-49053).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили штаммы бактерий Е. coli\ Е. coliKXl (получен I Института биохимии и физиологии микроорганизмов, г. Пущино); ABl 157 :олучен из Coli Genetic Stock Center (CGSÇ), США); 821 (имеет мутацию gshA2 в :не, контролирующем синтез глутатиона; получен из CGSC); TTG10 (имеет утацию gshA20::Tnl0km в гене, контролирующем синтез глутатиона; получен от зоф. Demple В., Гарвардский университет, США); MPI 80 (получен от проф. Dewen Р., университет Манитоба, Канада); UM202 (имеет мутацию katG17::TnlO в :не, контролирующем синтез каталазы HPI; получен от проф. Loewen P.); RK4936 [меет слияние katG-lacZ промотора гена, контролирующего синтез каталазы HPI со руктурным геном ß-галактозидазы; получен от д-ра Storz G., Национальный icrmyr здоровья, США).

Бактерии Е. coli К12 выращивали на минеральной среде М9 с добавлением □окозы (2 г/л) (Miller, 1972); для остальных штаммов Е. coli в среду дополнительно эбавляли казаминовые кислоты (2 г/л) и тиамин (10 мкг/мл). Клетки Е. coli /льтивировали при 37°С в ячейках, продуваемых воздухом или в колбах на качалке 50 об/мин). За ростом бактерий следили по изменению поглощения при 670 нм, ¡меряемому на фотометре КФК-3. Обработку Е. coli оксидантами проводили в

середине лог-фазы роста, когда оптическая плотность4 культуры составлял 0.3 - 0.5 г сухих клеток на литр. Для получения плотной среды в жидку! питательную среду добавляли агар (15 г/л) («Sigma»).

Чувствительность бактерий к действию оксидантов определяли по измененш удельной скорости роста культуры и диаметру зоны ингибирования роста Е. coli н плотной среде.

Определение низкомолекулярных и белковых тиолов проводили с реагенто] Эллмана (Sedlak, Lindsay, 1968). Для определения концентрации оСщего (GSH GSSG) и окисленного (GSSG) глутатиона использовали глутатаонредуктазу (Tietzi 1969). Активность глутатион^-траисферазы определяли спектрофотометричесю применяя коэффициент поглощения продукта реакции GSH и CDNB (Iizuka et al 1989). Активность глутатионредукгазы определяли, измеряя убыль НАДФ] (Scrutton et al., 1987). Активность ß-галактозидазы в клетках Е. coli измеряли п методу Миллера (Miller, 1972). Каталазную акшвность клеток Е. coli определял спектрофотометрическим методом (Beers, Sizer, 1952). Для определения акгивност НАДФН.менадион-диафоразы использовали метод, примененный ранее да определения активности НАДФН:паракват-диафоразы (Liochev, Fndovich, 1994 Феррицианидредуктазную активность клеток Е. coli определяли, измерз поглощение окисленного феррицианида при 420 нм (Crane et al., 1985 Концентрацию менадиона определяли, измеряя поглощение продую взаимодействия менадиона и меркаптоэтанола при 420 нм. Концентрацию калия клетках определяли на пламенном фотометре по методу Мешу, Kepes (1982 концентрацию белка - по методу Lowry et al. (1951).

Используемые для обработки клеток Е. coli менадион, кумен гидроперокси, NEM, гексацианоферрат (феррицианид) калия и теллурит калия были получены с фирмы «Sigma», перекись водорода - от «Реахим» (х. ч).

Повторность всех экспериментов составляет не менее трех раз. Статистическу обработку полученных данных проводили, вычисляя стандартную ошибку доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинам оценивали согласно t-критерию Стьюдента, различия считались значимыми пр

i <0.05. Результаты анализировали с помощью пакета программ Microsoft Excell версия 7.0 для Windows) и Statistics.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие Н2О2 на растущие клетки Escherichia coli

В ответ на окислительный стресс, вызванный действием перекиси водорода, в летках Е. coli индуцируются несколько защитных систем, в том числе ферменты, >азрушающие Н2Ог и ферменты репарации ДНК (Fair, Kogoma, 1991). Важным фактором, обуславливающим ответ бактерий на действие перекиси водорода, [вляется доза оксиданта. Было показано, что адаптивные реакции, вызываемые у 1. coli низкими дозами Н2О2, существенно отличаются от таковых при действии ¡ысокими дозами этого оксиданта (Imlay, Linn, 1987). Так, обработка Е. coli низкой юзой Н202 повышает устойчивость клеток к действию летальных доз Н202 (Dempie, ialbrook, 1983). Этот адаптивный ответ связан с индуцированным синтезом

юлыиого числа белков, часть из которых, включая каталазу-гидропероксидазу I

(

HPI) и глутатаонредуктазу, находится под контролем гена oxyR (Christman et iL, 1989). _ -

Обработка растущих клеток дикого типа Е. coli К12 2 - 25 мМ Н202 шгйбировала их рост и этот эффект прямо зависел от дозы оксиданта. В то же »ремя не обнаружено прямой связи между концентрацией Н202 й ее влиянием на /ровень внутриклеточных низкомолекулярных тиолов (НМТ) (рис. 1). Эти )езультаты являются неожиданными, поскольку обработка клеток эукариот Н202 ¡ызывает снижение уровня НМТ, которое прямо зависит от дозы перекиси водорода Kosower, Kosower, 1978). 1

Важным параметром, определяющим у Е. coli активность клеточных ферментов i экспрессию большой группы генов, является редокс-состояние их тиоловых групп Javor, 1989). Ранее было показано, что обработка клеток Е. coli дикого типа низкой

=d 4

Время, мин

Рис.1. Действие Н202 на уровень внутриклеточных низкомолекулярных тиолов в растущих клетках Е. coli К12. Обозначения: 1 - контроль (без обработки Н2О2); 2 -2 мМ Н202; 3 - 11мМ Н202; 4-25 мМ Н202.

о4-

S t-

110

100

10 15 Н202, мМ

Рис.2. Зависимость уровней калия, низкомолекулярных (НМТ) и белковых тиолов от концентрации Н202 в растущих клетках Е. coli Kl 2. Обозначения: 1 -калий, 2 - белковые тиолы, 3 - НМТ.

озой Н202 (0.9 мМ) вызывает снижение уровня белковых тиолов (Смирнова и др., 997): В настоящей работе обнаружена обратная зависимость между иутрикл сточными уровнями низкомолекулярных и белковых таолов в клетках '. coli К12 (рис. 2).

Одной из мишеней токсичного действия Н202 на клетки является клеточная ембрана, следствием чего может быть ингибирование мембранного транспорта, 'читывая важную роль глутатиона в регуляции калиевых выходных каналов Vieury, Kepes, 1982), было исследовано влияние Н202 на внутриклеточный уровень алия. Нами была обнаружена прямая связь между изменениями внутриклеточных ровней калия и белковых тиолов и обратная связь между уровнями калия и НМТ, оторая прослеживалась во всем диапазоне исследуемых концентраций Н202 DHC. 2). Снижение внутриклеточной концентрации калия может быть вызвано или осредством прямого активирования таол-чувствительных центров калиевых ыходных каналов или опосредованно, через изменения редокс-состояния изкомолекулярных тиолов, а именно, глутатиона. Другой причиной снижения онцентрации калия в клетках Е. coli может быть ингибирование калиевых входных истем (Meury, Robin, 1990). Для установления истинной причины изменегаш ровня внутриклеточного калия, вызываемого действием Н202, необходимо более .етальное исследование влияния глутатиона на акшвность калиевых каналов.

Известно, что в растущих клетках Е. coli активным деструктором Н202 служит аталаза HPI, кодируемая геном kaiG (Loewen, 1992). Для того чтобы выяснить, аким образом дефицит HPI влкяет на внутриклеточные уровни тиолов и калия, зучали действие Н202 на клетки Е. coli, дефицитаые по синтезу каталазы HPI katG). В нашей работе установлено, что клетки' katG' имеют пониженный уровень [МТ, который еще больше снижается при обработке этих клеток 10 мМ Н202.

Более подробно было исследовано влияние перекиси водорода на редокс-остояние низкомолекулярных тиолов, главным из которых у Е. coli является лутатион (Fahey et al., 1978). В результате реакции Н202 и восстановленного лутатиона (GSH) последний переходит в окисленную форму (GSSG), поэтому гожно было ожидать, что при повышении внутриклеточной концентрации Н202

будет изменяться и соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона (GSH:GSSG). Именно так обстоит дело в клетках эукариот (Kosower, Kosower, 1978).

Однако, обработка клеток katG+ 10 мМ Н202 не влияла на уровень общего глутатиона (GSH + GSSG), но вызывала значительное снижение уровня окисленного глутатиона, вследствие чего соотношение GSH:GSSG возрастало в 3 раза (рис. 3). После обработки клеток katG' 10 мМ Н202 было обнаружено увеличение уровня окисленного глутатиона в 2 раза и заметное снижение соотношения GSH:GSSG (рис. 3). Эти данные позволяют предположить о существовании взаимосвязи между уровнем глутатиона и активностью каталазы HPI у Е. coli.

Обработка клеток родительского типа 10 мМ Н202 вызывала незначительное повышение активности глутатионредуктазы (табл. 1), катализирующей восстановление GSSG при участии НАДФН (Asnis, 1955). Не обнаружено статистически значимых изменений в активности глутатион-5-трансферазы после ■ обработки клеток родительского типа 10 мМ Н202 (табл. 1). В то же вреш активность каталазы после такой обработай увеличивалась более чем в два разг (табл. 1). Возрастание каталазной активности в ответ на обработку растущих клето* Е. coli Н202 было описано ранее другими авторами, и связано непосредственно с индукцией гена katG как части отклика бактерий на окислительный стресс (Loewen 1992). Мутация в гене katG не влияла существенно на активност! глутатионредуктазы у Е. coli.

Полученные в нашей работе данные указывают на то, что в растущих клетка: Е. coli основная роль в деструкции Н202 принадлежит каталазе HPI. Об эток свидетельствует значительное увеличение уровня индукции гена katG в ответ н; обработку клеток Е. coli дикого типа Н202 (Farr et al., 1988; эта работа). Возможно что основная роль GSH в этой ситуации связана с другой его известной функцией восстановлением дисульфидных связей в белках. Из-за высокой концентрации GSI активность каталазы HPI устанавливается на уровне более низком, чи максимальный уровень, но достаточном для эффективной деструкции перекис

i « н s

Ë 3 Ç о

4 о

2 о и ю

5 п>

гнГ л ю й g »

О й ю S «

0,15 .0,1 0,05 0

Время, мин

Рис. 3. Действие Н2О2 на уровень общего и окисленного глугатиона и юотношение GSH:GSSG в клетках Е. coli ABl 157 и UM202. Обозначения. 1, 2 -\В1157; 3, 4 - UM202; 1,3- контроль (без обработки Н202); 2, 4 - 10 мМ Н202.

юдорода. В итоге достигается компромисс, когда обе системы функционируют на /ровне, достаточном для успешной защиты клеток от оксиданта. В условиях, когда

фовень СБН по тем или иным причинам понижен, активность каталазы НР1 ювышается и, соответственно, снижается количество молекул Н2О2, достигающих внутриклеточных мишеней. В обратной ситуации, когда в растущих клетках тонижена активность каталазы, можно ожидать, что в цитоплазме повысится <онцентрация Н202. Увеличение концентрации внутриклеточной Н202 будет

Табл. 1. Действие перекиси водорода и менадиона на активность глутатионредуктазы (GOR), глутатион-5-трансферазы (GST) и каталазы в растущих клетках Е. coli ABl 157.

Условия опыта Активность ферментов ,

GOR нмоль/мг-мин GST нмоль/мг-мин Катал аза мкмоль/мг-мин

Контроль 64 ±5 0.339 ± 0.026 ,1.8 ±0.2

0.5 мМ менадиона 87 ±6 (1.4)* 0.129 ± 0.020 (0.4)* 49 ±8 (27.2)*

Контроль 67 ±5 0.368 ± 0.042 2.4 ±0.3

10 мМ Н202 71 ±6(1.1)* 0.39110.034 (1.1)* 5.4 ±0.6 (2.3)*

* показатель индукции.

способствовать снижению уровня общего глутатиона и окислению GSH. В свою

очередь, это приведет к повышению активности биосинтеза глутатиона для того,

чтобы компенсировать убыль GSH, расходуемого на восстановление Н2О2.

Снижению уровня восстановленного глутатиона может способствовать также то,

что в ответ на обработку Н202 значительного повышения активности

глутатионредуктазы в клетках katG' не происходит, и убыль восстановленного

глутатиона не компенсируется за счет увеличения скорости восстановления GSSG.

В пользу выдвигаемого нами предположения свидетельствуют следующие факты.

Во-первых, было сообщено, что в аэробных условиях в активно растущих клетках

Е. coli katG' концентрация эндогенной Н202 выше, чем в клетках katG* (Gonzalez-

Flecha, Demple, 1997). Во-вторых, во время аэробного роста клеток Е. coli katG

происходит снижение уровня общего глутатиона и повышение уровня окисленного

глутатиона (эта работа). Обработка Н202 клеток katG вызывает еще (эолее заметное снижение уровня восстановленного глутатиона и увеличение уровня GSSG. В-третьих, ранее было показано, что в клетках katG' скорость биосинтеза GSH заметно выше, чем в клетках katG* (Alonso-Moraga et ai, 1987). В-четвертых, уровень индуцируемой Н202 каталазной активности в ^/¡'дефицитных клетках значительно

ыше, чем в клетках gsh~ (эта работа). Кроме того, было установлено, что двойные утанты Е. coli, katG' gsti имеют повышенную чувствительность к обработке Н2О2 Vlonso-Moraga et al., 1987). Отсутствие снижения уровня глутатиона в клетках икого типа Е. coli при обработке клеток Н202 показывает, что благодаря наличию ыгсокоактивной каталазы HPI внутриклеточный глутатион защищен от воздействия i02.

В совокупности, полученные нами данные о влиянии Н202 на внутриклеточные ровни глутатиона и калия, и активность каталазы HPI у Е. coli можно представить в яде схемы (рис. 4).

К - выходные каналы

fSH:GSSG

лутатион-гдуктаза

gor «

Н-,0,

oxyR

<---- Каталаза HPI

katG

Рис. 4. Предполагаемая схема влияния Н202 на уровни глутатиона и калия в 1стущих клетках Е. coli.

Повышение концентрации внутриклеточной Н202 вызывает активирование ;лка OxyR, что приводит к увеличению экспрессии генов katG и gor и ютветственно, повышению активности ферментов каталазы HPI и [утатионредуктазы. Активация каталазы HPI приводит к увеличению скорости гструкции Н2О2. Активность глутатионредуктазы повышается хотя и

незначительно, но достаточно для того, чтобы предотвратить снижение уровня GSH, При действии Н2О2 на Е. со/; katG' активность каталазы HPI отсутствует, поэтому повышение концентрации Н202 в цитоплазме приводит к снижению уровня восстановленного глутатиона. Перекись водорода может влиять на уровень внутриклеточного калия прямо через воздействие на редокс-чувствительные калий-выходные каналы или опосредованно, через изменение соотношения GSH:GSSG.

Действие менадиона на растущие клетки Escherichia coli

Обработка клеток Е. coli дикого типа 0.5 мМ менадиона вызывала заметное снижение пула общего глутатиона и соотношения GSH:GSSG (рис. 5). Снижение внутриклеточной концентрации GSH может быть вызвано несколькими причинами Известно, что в бесклеточной системе в результате взаимодействия GSH i менадиона образуются GSSG, конъюгат GSH и менадиона, Н202 и 02" (Ross et al. 1985; Dimonte et al., 1984). Возможно, что падение уровня общего глутатиона i клетках Е. coli, обработанных менадионом, может быть следствием прямогс окисления GSH в GSSG с последующим выбросом окисленного глутатиона наружу.

В клетках эукариот внутриклеточный метаболизм менадиона наряду < образованием 02" приводит также к накоплению Н202 (Hassan, Fridovich, 1979) Поэтому еще один путь, ведущий к повышению уровня GSSG в клетках Е. coli обработанных менадионом, может быть связан с прямым окислением GSI перекисью водорода, образованной при дисмутации 02". В пользу этог< предположения свидетельствует увеличите каталазной активности при обработке менадионом клеток Е. coli дикого тапа (табл. 1). Образование конъюгата GSH менадион - еще один возможный путь, ведущий к снижению уровня общеп глутатиона. Образование коньюгата может происходить как нефепментативньв путем, так и при участии глутатион-5-трансфераз (менадион является субстрате» для этих ферментов) (Meister, Anderson, 1983; Ross et al., 1985). Следует однако учитывать, что в ответ на обработку клеток Е. coli менадионом наблюдалос] снижение активности глутатион-5-трансферазы (табл. 1). Тем не менее,

ю -ï; p

ОД

g I d 111

20 15 10 5 0

сл

с/з

S о

« VO

S л

0,4

0,2

О сл сл О

X сл

400 200 0

Время, мин

Рис.5. Действие 0.5 мМ менадиона на уровень общего и окисленного лутатиона и соотношение GSH:GSSG в клетках Е. coli ABl 157. Обозначения: 1 -:онтроль; 2 - 0.5 мМ менадиона.

лутати о н-б'-тр ан с ф ер азы могут принимать участие в снижении уровня общего лутатиона, поскольку менадион не полностью ингибирует активность GST.

Наконец, еще одна из возможных причин снижения уровня общего глутатиона южет быть связана с изменением баланса между его синтезом и деградацией. Так, у i coli активность глутатионсинтетазы ингибируётся окисленным глутатионом Apontoweil, Berends, 1975а). Поскольку, как показано в нашей работе, обработка i1. coli менадионом приводит к заметному возрастанию уровня внутриклеточного 5SSG, то этот путь не может быть исключен.

Роль глутатиона в устойчивости клеток Escherichia coli к окислительному стрессу

На следующем этапе работы была исследована чувствительность к действию Н202 и адаптивный отклик на обработку Н202 растущих клеток Е. coli, дефицитных по синтезу глутатиона. Известно, что если на растущие клетки Е. coli подействовать низкой дозой Н202, то они становятся менее чувствительными к действию летальных доз Н202 (Demple, Haibrook, 1983). Такая адаптивная реакция связана с индуцированным синтезом антиоксидантных ферментов (в частности, каталазы HPI), как части ответа на окислительный стресс (Christman et al., 1985; Farr et ai, 1988).

В наших условиях в опытах без предварительной обработки оксидантом клетки Е. coli 821 (gsh') и ABl 157 (gsh+) проявляли одинаковую чувствительность к действию 5-10 мМ Н202. Однако gi/j-дефицитные клетки, адаптированные к окислительному стрессу, были менее чувствительны к действию Н202 по сравнению с клетками дикого типа (рис. 6). Эти данные согласуются с выводами авторов, использующих в своей работе другие штаммы Е. coli, о том, что присутствие внутриклеточного глутатиона не обязательно для защиты Е. coli от действия Н20; (Greenberg, Demple, 1986).

Ранее было установлено, что обработка низкими дозами генераторов 02 индуцирует у микроорганизмов адаптивный отклик, т.е. повышает их устойчивосп к последующей обработке сублетальными дозами этих агентов (Farr et al., 1985. 1992; Lee et al., 1995; Jamieson et al, 1996). В наших условиях растущие клеткг Е. coli 821 были более устойчивы к обработке 0.2-0.5 мМ менадиона, чем клеи» родительского типа. В то же время чувствительность к менадиону клеток JTG10 также дефицитных по синтезу глутатиона, не отличалась от чувствителыгоеп клеток родительского типа ABl 157. Предобработка 0.05 мМ менадиона клето! ABl 157 и JTG10 значительно повышала их устойчивость к последующему действии 0.35 мМ менадиона, в то же время в клетках 821 эффект адаптации отсутствовал Эти данные позволяют заключить, что при росте-в жидкой культуре чувствитель-

10 15

Н202, мМ

Рис. 6. Действие Н202 на рост Е. coli. Обозначения: 1,2- ABl 137; 3, 4 - 821; !, 4 - клетки предварительно обработаны 0.1 мМ Н202.

юсть клеток Е. coli к действию менадиона не зависит от уровня внутриклеточного "лутатиона. Различие в устойчивости Е. coli 821 и JTG10 к оксидангам может быть ;вязано с тем, что в клетках первого штамма, кроме мутации в локусе gshA могут 5ыть мутации в других локусах. Штамм 821 был выделен в результате селекщш <леток ABl 157, обработанных Ы-метил-ЬГ-нитро-Н-шпрозогуанидином 'Apontoweil, Berends, 1975b), в то время как штамм Е. coli JTG10 был получен совершенно другим способом, а именно, в результате трансдукции мутации %shA::TnlOkm в ABl 157 с помощью бактериофага PI (Greenberg, Demple, 1986). В последнем случае вероятность появления других мутаций резко снижается.

Дальнейшие исследования показали, что более высокая устойчивость к эбработке м'енадионом клеток Е. coli 821 не связана с пониженной скоростью его поглощения. Однако уровень активности НАДФН:менадион-диафоразы, катализирующей перенос электронов от менадиона па 02 с образованием 02" (Fridovich, 1983), в клетках Е. coli 821 был в 4 раза ниже, чем в клетках родительского типа и почти в 3 раза ниже, чем в клетках Е. coli JTG10. Можно предположить, что дополнительные мутации (или мутация) в клетках Е. coli 821, приводящие к снижению менадион-диафоразной активности, могут способствовать

более медленному восстановлению менадиона и соответственно, понижение стационарных концентраций реактивных форм кислорода до более низких уровне{ при которых антиоксидантные системы клетки успешно нейтрализуют их. В польз этого предположения свидетельствует тот факт, что базовый уровень активност каталазы в клетках 821 был в 1.5 раза ниже, чем в клетках родительского тип ABl 157 (табл. 2). Пониженная катал азная активность в клетках 821 может быт следствием более низкого уровня Н202, образующейся в результате дисмутаци супероксид аниона, что в свою очередь может быть следствием более низко скорости метаболизма менадиона. Исходя из вышеизложенного, можно заключит что штамм Е. coli 821 может быть полезным для изучения метаболизма менадиона Е. coli и механизмов, определяющих устойчивость клеток к этому оксиданту. другой стороны, при изучении роли глутатиона в окислительном стресс использование штамма JTG10 является более предпочтительным.

Обработка Н202 вызывала увеличение каталазной активности как в клеткг ABl 157, так и 821, однако, уровень индукции фермента в клетках 821 был в 2.2 ра: выше, чем в ABl 157 (табл. 2).

Табл. 2. Действие 1 мМ Н202 на каталазную активность (мкмоль/мгмин) в

растущих клетках Е. coli AB 1157 и 821.

Штамм Перед обработкой Н202 После обработки Н202

ABl 157 (gsh*) 1.43 ±0.17 16.4 ±2.0 (11.5)*

821 (gsh') 0.97 ± 0.21 24.3 ±4.0 (25.1)*

* показатель индукции.

Как при действии менадиона, так и при действии Н202 на агаризованной сре, не было обнаружено достоверных различий в чувствительности между клет^ gsh' и Выявленные отличия в действии менадиона на жидкой и твердой сред могут быть связаны с тем, что в последнем случае благодаря замедленной диффуз) оксиданта в агаре может развиваться адаптивный ответ клеток' и соответствен! повышаться их устойчивость к оксиданту.

В совокупности, полученные результаты указывают на то, что в растущих тетках Е. coli внутриклеточный глугатион не играет существенной роли в 1еструкции перекиси водорода. Это согласуется с данными других авторов о пгоростепенной роли глутатиона во время окислительного стресса, вызванного )бработкой Е. coli Н202 (Greenberg, Demple, 1986).

Известно, что в клетках эукариот глутатион играет ключевую роль в защите от тсического действия Н202 и органических перекисей в реакциях, катализируемых ■лутатионпероксидазой (Grant et al., 1996; Reed, Beatty, 1990). В клетках E. coli не обнаружено глутатионпероксидазной активности, возможно, поэтому глутатион в )тих клетках не играет роли классического антиоксиданта. Одной из функций -лутатиона у Е. coli может быть защита против окисления белков посредством эеакций тиол-дисульфидного обмена между GSH и белковыми SH-группами. Эти эеакции могут происходить как при участии тиолтрансфераз, так и при «посредственном взаимодействии глутатиона и дисульфида (Kosower, Kosowcr, 1983; Meister, Anderson, 1983). Роль глутатиона во время окислительного стресса, зызванного обработкой Е. coli Н202, может быть связана с его влиянием на истинность ферментов и экспрессию генов, которые имеют редокс-чувствительные 5Н-группы (Javor, 1989). Так, у Е. coli регуляторный белок OxyR, участвующий в <онтроле отклика на Н202-стресс, имеет БН^группы, существенные для его функций pemple, 1991). При окислении Этих групп OxyR активирует гены, находящиеся под гго контролем (Storz et al., 1990). Возможно, чгго именно через нот механизм -лутатион осуществляет свое негативное влияние на активность каталазы HPI.

Сравнительная характеристика действия на клетки Escherichia coli проникающего и непроникающего оксидантов

Сравнение действия проникающего (Н202) и непроникающего К4 [Fe(CN)r„ феррицианид) оксидантов на растущие клетки Е. coli показало, что оба 1гента вызывают снижение концентрации внутриклеточного калия и возрастание фовня белковых тиолов (табл. 3). Существенное различие в действии двух жсидантов состояло в том, что обработка клеток 1 мМ феррицианида вызывала

снижение уровня низкомолекулярных тиолов, в то время как при действии 0.9 мМ перекиси водорода он заметно возрастал (табл. 3).

Табл. 3. Действие проникающего (Н202) и непроникающего (К4[Ре(СН)6])

оксидантов на растущие клетки Е. соИ К12.

Параметры . , ,. Оксиданты -''

0.9 мМН202 1 MMK4[Fe(CN)6]

Контроль + Н202 Контроль + (K4[Fe(CN)6])

Удельная скорость роста, час"1 0.64 ±0.05 0.36 ±0.03 (56)* 0.64 ±0.05 0.35 + 0.03 (55)*

Внутриклеточный калий, мМ 175 + 10 150 ±8 (86)* 198+12.0 168 ± 10 (85)*

Небелковые тиолы, мкмоль/г абс. с. в. 8.0 ±1.0 13.0 ± 2.0 (163)* 11.0 ±0.7 6.5 ±0.5 (59)*

Белковые тиолы, мкмоль/г абс. с. в. 28.0 ± 2.0 33.0 + 2.0 (118)* 24.0 + 2.0 30.0 ±3.0 (125)*

* процент по отношению к контролю.

Чувствительность клеток, дефицитных по синтезу глутатиона, к действию 1, 5 i 10 мМ феррицианида незначительно отличалась от той, которую наблюдали ] клетках родительского типа. Однако, феррицианидредуктазная активность был; выше в клетках с нормальным уровнем глутатиона, и разница возрастала -увеличением концентрации феррицианида (рис. 7).

В то же время, в отношении каталазной активности наблюдалась обратна зависимость. Уровень индуцированной Н202 каталазной активности в клетках Е. coi 821 была в 2.2 раза выше, чем в ABl 157 (табл. 2). Обработка 1-10 мМ феррицианид не влияла на экспрессию гена katG, кодирующего синтез каталазы HPI, в то врем как обработка Е. coli 1 мМ Н202 индуцировала увеличение активности katG-lacZ 6.4 раза.

4 3

IL 4

О 2 4 6 8 10 K4[Fe(CN)6l, мМ

Рис.7. Феррицианидредуктазная активность (нмоль/мин-107 клеток) растущих ток Е. coli (А). 1 - ABl 157 (gsh+); 2 - 821 (gsli). УдеЛьная скорость роста (Б) ток Е. coli ABU 57 (3, 4) и 821 (5, 6); 3, 5 - контроль; 4, 6 - K4[Fe(CN)6].

Одно из объяснений противоположных изменений уровня глутатиона при :йствии на Е. coli Н202 и феррицианида может быть связано с его различной ролью отклике на действие этими оксидантами. Полученные нами результаты мдетельствуют о том, что "в растущих клетках Е. coli прямое участие GSH в вложении Н202 незначительно и основная роль в деструкции оксиданта )инадлежит каталазе HPI (см. выше). Отсутствие индукции каталазы HPI в ответ на ¡работку клеток феррицианидом может указывать на ^несущественную роль пгалазы HPI в отклике Е. coli на действие феррицианида. Результаты, полученные в ой работе, позволяют предположить, что в растущих клетках Е. coli глутатион эжет играть существенную роль в восстановлении феррицианида. В пользу этого зедположения свидетельствуют следующие факты. Во-первых, низкий сислительно-восстановительный потенциал GSH (Ео = - 0.23 В) является

достаточным для того, чтобы глутатион мог выступать донором электронов реакции восстановления феррицианида. In vitro восстановленный глутатион быст восстанавливает феррицианид даже без участия ферментов. Во-вторых, на] показано, что в ответ на обработку клеток Е. coli фсррицианидом наблюдает снижение пула внутриклеточного глутатиона. В-третьих, в нашей работе показа также, что скорость восстановления феррицианида gs/2-дефицитными клетками бь: значительно ниже, чем скорость его восстановления клетками gsh+, Кроме то ранее было сообщено, что добавление в среду реагентов, связывающих свобода SH-группы, приводит к ингибированию восстановления феррицианида у Е. с (Oktyabrsky ei а/., 1993).

Действие теллурита калия на клетки Escherichia coli

Малоизученным остается вопрос о роли глутатиона в отклике клеток Е. coli обработку теллуритом калия (К2ТеОз). Токсичное действие теллурита кш связывают с его способностью окислять внутриклеточное содержимое (Turner et 1995).

В наших условиях обработка клеток Е. coli дикого типа 0.01 мМ К2Т< вызывала снижение уровня общего глутатиона, подобно тому, как это наблюдал при действии на Е. coli феррицианидом. Следует однако, отметить, что, в отличие последнего, анионы теллурита проникают через плазматическую мембрану, восстанавливаются в менее токсичный элементный теллур (Turner et al., 1994).

В настоящее время природа восстановителя анионов теллурита у Е. coli установлена. Полученные нами данные дополняют те, которые были представл« ч ранее (Turner et al. 1994,1995) и свидетельствуют о том, что глутатион может npj или косвенно принимать участие в восстановлении теллурита. Помимо евязываш теллуритом, глутатион может также участвовать в защите клеток против К2Т опосредованно. Так, было сообщено, что у Е. coli белки, имеющие высо! специфичность по отношению к теллуриту, имеют редокс-чувствительные ; группы, существенные для их активности (Turner et al., 1994). Восстановлен! глутатион может принимать участие в защите SH-грутш в этих белках.

ВЫВОДЫ

1. Растущие клетки Е. coli JTG10 с мутацией в гене gshA, приводящей к фициту по синтезу глутатиона, проявляют такую же устойчивость к перекиси дорода, менадиону, кумен гидропероксиду и N-этилмалеимиду, как и клетки дительского типа ABl 157.

2. При действии Н2О2 на бактерии Е. coli дикого типа в концентрациях, медляющих рост клеток, не отмечено снижения внутриклеточных уровней [зкомолекулярных тиолов и глутатиона. Обработка растущих клеток менадионом 1ИВОДИТ к падению уровня общего глутатиона, повышению количества исленного глутатиона (GSSG) и снижению соотношения GSH:GSSG.

3. Обнаружена взаимосвязь между каталазной и глутатионовой системами: йствие Н202 на клетки Е. coli, дефицитные по каталазе-гидропероксидазе I (HPI) )иводит к падению уровня общего глутатиона, повышению количества GSSG и ижению соотношения GSH:GSSG; у штаммов, дефицитных по синтезу утатиона, заметно возрастает активность каталазы HPI. Каталаза HPI играет ¡минирующую роль в защите растущих клеток Е. coli от окислительного стресса, тайного действием перекиси водорода.

4. Во время первой фазы отклика Е. coli на действие Н202 прослеживается >ямая связь между изменениями уровней белковых тиолов и калия и обратная ;язь между изменениями уровней низкомолекулярных тиолов и калия.

5. Обнаружено повышение устойчивости к менадиону у растущих клеток Е. coli '.1, что связано с пониженной активностью НАДФН.менадион-диафоразы.

6. Роль глутатиона в ответе на обработку растущих клеток Е. coli ¡проникающим оксидантом феррицианидом отлична от той, которую он играет в вете на действие проникающего оксиданта Н2Ог. Полученные данные идетельствуют в пользу участия глутатиона в восстановлении феррицианида [етками Е. coli.

7. Обработка Е. coli теллуритом калия приводит к снижению уровня [утриклеточного глутатиона, что указывает на возможное "участие глутатиона в ^становлении теллурита.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н. Изменения внутриклеточного щ глутатиона, активности глутатион-редуктазы и каталазы при окислительном стре< Escherichia coli II Материалы молодежной конференции Уро РАН «Проблемы обц и прикладной экологии». Екатеринбург: Екатеринбург, 1996. С.145-147.

2. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко' М.Н. Взаимосвязь ме» внутриклеточными уровнями непротеиновых тиолов и активностью каталазы глутатионредуктазы при обработке клеток Escherichia coli перекисью водородг Тезисы докладов международной конференции «Микробное разнообразие». Пер] 1996. С. 103.

3. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Октябрьский О.Н. Перекись водор( модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia col Тезисы докладов 2-го съезда Биохимического общества РАН. Пущино, 1997. Ч. С. 359-360.

4. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н., Октябрьский О.Н. Отю Escherichia coli на действие проникающего и непроникающего оксидантов Биохимия. 1997. Т.62. №5. С.563-569.

5. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н., Октябрьский О.Н. Переи водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escheric coli II Микробиология. 1998. Т.67.№5. С.594-600.

6. Музыка Н. Г. Соломенный А. П. В детоксикации теллурита калия у бакте| принимает участие глутатион // «Современные проблемы популяционн исторической и прикладной экологии». Материалы конференции молодых учеш экологов Уральского региона, 21-24 апреля 1998 г. Екатеринбург: Екатеринб} 1998. С.189-193.

7. Музыка Н.Г. Изменение содержания глутатиона в клетках Escherichia i прй действии Н202 // Сборник тезисов региональной конференции молодых учег ИЭГМ-ПГУ. Пермь, 1999. С.93-94.

8. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н., Красных Т.А., Октябрьский 1. Устойчивость к окислительному стрессу у штаммов Escherichia coli, рицитных по синтезу глутатиона // Биохимия. 1999. Т. 64. № 10. С. 22-28.

9. Smirnova G. V., Oktyabrsky О. N., Musyca N.G., Glukhovchenko M.N. ;rrelation between intracellular levels of nonproteine thiols and catalase activity owing treatment of growing Escherichia coli with hydrogen peroxide // In: /ironmental Pollution. Proceedings of the 1995 International Conference of /ironmental Pollution (ISEP 95). St. Petersburg. Edited by P. Reed, J. Kinross. Napier iversity, 1995. P. 66-70.

10. Smirnova G. V., Octyabrsky O. N., Musica N.G. Near-ultraviolet radiation and Irogen peroxide modulate intracellular levels of potassium and thiols in Escherichia i II The International Conference of Environmental Pollution (ISEP 95). St.Peterburg, >5. P. 14.

11. Mu7.yka N ., Solomennyi A. Glutathione is involved in the reduction of potassium urite in an Acinetobacter calcoaceticus and Escherichia coli // Abstracts of :rnational Conference of Environmental Pollution (ISEP 98). Moscow, 12-17 >tember 1998. P. 66.

12. Smirnova G. V., MuzykaN.G., Oktyabrsky O.N. The role of antioxidant ymes in response of Escherichia coli to osmotic upshift. // FEMS Microbiology ers, 2000, Vol. 186(2), P. 209-213.

13. Smirnova G. V., Muzyka N.G., Glukhovchenko M.N., Krasnykh T. A., yabrsky O. N. Role of oxyR and katG genes in the regulation of intracellular thiol and assium levels in Escherichia coli under oxidative stress // Abstracts of International iference of Environmental Pollution (ISEP 98). Moscow, 12-17 September 1998. >72.

14. Smirnova G. V., Muzyka N.G., Glukhovchenko M.N., Oktyabrsky O. N. Effects menadione and hydrogen peroxide on glutathione status in growing Escherichia coli II eRad. Biol. Med. 2000. Vol. 28. P. 1009-1016.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Музыка, Надежда Геннадьевна

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Реакция Escherichia coli на окислительный стресс: краткий обзор.

1.1. Окислительный стресс и токсичность активных форм кислорода

1.2. Окислительные повреждения и их репарация.

1.3. Ответ Escherichia coli на действие Н2О2.

1.4. Ответ Escherichia coli на действие веществ, генерирующих супероксид анион.

Глава 2. Роль глутатиона в жизнедеятельности бактерий.

2.1. Распространение глутатиона и его метаболизм.

2.1.1. Биосинтез глутатиона и его деградация.

2.1.2. Глутатионредуктаза.

2.1.3. у-Глутамилтранспептидаза

2.1.4. Глутатион-б'-трансфераза

2.2. Клеточные функции глутатиона.

2.3. Роль глутатиона в ответе бактерий на действие оксидантов и других токсических соединений.

Глава 3. Объекты и методы исследований.

3.1. Бактериальные штаммы.

3.2. Питательная среда и условия культивирования.

3.3. Определение содержания белковых и небелковых тиолов.

3.4. Определение содержания внутриклеточного глутатиона.

3.5. Определение активности глутатионредуктазы.

3.6. Определение активности глутатион-5-трансферазы.

3.7. Определение активности каталазы.

3.8. Определение активности Р-галактозидазы.

3.9. Определение феррицианидредуктазной активности.

3.10. Определение менадион-диафоразной активности.

3.11. Определение содержания менадиона в среде.

3.12. Определение содержания ионов калия в клетке.

3.13. Определение содержания белка.

3.14. Статистическая обработка данных.

Глава 4. Действие Н2О2 на растущие клетки Escherichia coli.;.

4.1. Содержание белковых и небелковых тиолов и уровень калия в клетках Escherichia coli Kl2.

4.2. Содержание белковых и небелковых тиолов и уровень калия в клетках Escherichia coli, дефицитных по каталазе HPI.

4.3. Уровень общего глутатиона и соотношение GSH:GSSG в клетках Escherichia coli, дефицитных по каталазе HPI.

4.4. Активность антиоксидантных ферментов.

Глава 5. Действие менадиона на растущие клетки Escherichia coli.

Глава 6. Роль глутатиона в устойчивости клеток Escherichia coli к окислительному стрессу.

6.1. Окислительный стресс при действии Н2О2.

6.2. Окислительный стресс при действии менадиона.

6.3. Уровень менадиона в растущей культуре Escherichia coli.

6.4. Действие менадиона на активность НАДФН:диафоразы.

6.5. Чувствительность к менадиону, кумен гидропероксиду и

N-этилмалеимиду клеток Escherichia coli, растущих на твердой среде.

Глава 7. Сравнительная характеристика действия проникающего и непроникающего оксидантов на растущие клетки Escherichia coli.

7.1. Действие Н2Ог и феррицианида на клетки Escherichia coli.

7.2. Действие теллурита калия на клетки Escherichia coli.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли глутатиона в ответе Escherichia coli на действие различных оксидантов"

Актуальность проблемы. Образование активных форм кислорода (АФК) в процессе нормального аэробного метаболизма клеток всех типов и широкий спектр физиологических эффектов АФК объясняют неослабевающий интерес к всестороннему изучению их действия на живые организмы. Источниками АФК могут быть также химические вещества. Встреча внутри организма хозяина с макрофагами - еще одна ситуация, в которой бактерии подвергаются воздействию активных форм кислорода. Установлено, что АФК оказывают на клетки всех типов токсическое и мутагенное действие, вызывая окислительные повреждения ДНК, белков и мембранных липидов (Farr, Kogoma, 1991).

Бактерии Escherichia coli, как и другие энтеробактерии, обладают несколькими системами защиты от окислительного повреждения, вызываемого действием АФК. Так, в ответ на обработку перекисью водорода у Е. coli индуцируется синтез около 30 белков, включая каталазу-гидропероксидазу HPI, которая является активным деструктором Н2О2 (Christman et al., 1985).

Среди нерешенных вопросов, связанных с ответом бактерий на окислительный стресс, и в частности, на действие Н2О2, остается неясной роль глу-татиона. Глутатион является главным низкомолекулярным тиолом у многих грамотрицательных бактерий, включая Е. coli (Fahey et al., 19/ 6). По сравнению с другими бактериями клетки Е. coli примечательны тем, что имеют уровень общего глутатиона (GSH + GSSG) (около 10 мМ), близкий к тому, который наблюдается в клетках животных (Kosower, Kosower, 1978). Известно, что в клетках животных глутатион является важным компонентом клеточной защиты от окислительного повреждения, вызываемого Н202, и обработка клеток этим оксидантом сопровождается снижением уровня восстановленного глутатиона (GSH) и его окислением (Meister, Anderson, 1983). Для бактерий данные о роли глутатиона в защите от действия АФК менее определенны. Были опубликованы данные о том, что мутанты Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, проявляют такую же устойчивость к действию Н2О2 и некоторым другим оксидантам, как и клетки родительского типа (Apontoweil, Berends, 1975b; Owens, Hartman, 1986). Более того, в некоторых ситуациях такие мутанты проявляли даже большую устойчивость к действию Н202, чем клетки дикого типа (Greenberg, Demple, 1986; Imlay, Linn, 1987; Romero, Cañada, 1991). Было обнаружено также, что обработка перекисью водорода не влияет на уровень общего глутатиона у Е. coli (Greenberg, Demple, 1986) или даже приводит к увеличению его уровня (Smirnova, Oktyabrsky, 1994).

В то же время в некоторых случаях было обнаружено, что клетки Е. coli, лишенные каталазы HPI, имеют такую же чувствительность к обработке Н2О2, как и клетки дикого типа (Greenberg, Demple, 1986). Таким образом, сложилась парадоксальная ситуация, при которой для защиты Е. coli от действия Н202 оказывается не нужной ни одна из главных антиоксидантных систем клетки. В то же время было установлено, что двойные мутанты Е. coli, дефицитные по глутатиону и каталазе, оказываются сверхчувствительными к обработке Н2О2 (Alonso-Moraga et al., 1987). В совокупности анализ научной литературы показывает, что данные о роли глутатиона в ответе бактерий Е. coli на окислительный стресс (О.С.) немногочисленны и носят противоречивый характер. Также немногочисленны данные о взаимодействии в клетках двух антиоксидантных систем, каталазы и глутатиона. В этой связи выяснение роли глутатиона во время окислительного стресса и механизмов взаимодействия антиоксидантных систем является актуальной задачей. Определение роли глутатиона в защите бактерий от окислительного стресса способствует более полному пониманию его значения для жизнедеятельности бактерий и позволяет продвинуться в понимании механизмов клеточной защиты от окислительного стресса.

Основная цель настоящего исследования - изучение роли глутатиона в отклике бактерий Е. coli на окислительный стресс, вызванный обработкой растущих клеток различными оксидантами.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить действие перекиси водорода и генератора 02~ менадиона на такие параметры растущих клеток Е. coli, как удельная скорость роста, внутриклеточные уровни тиолов и калия, а также редокс-статус глутатиона.

2. Сравнить уровень устойчивости клеток Е. coli, дефицитных по синтезу глутатиона и клеток с нормальным уровнем глутатиона к окислительному стрессу, вызванному обработкой бактерий Н202, менадионом, кумен гидро-пероксидом, а также сульфгидрильным реагентом N-этилмалеимидом (NEM).

3. Исследовать влияние каталазы HPI на внутриклеточные уровни тиолов и калия при действии на Н202 и менадиона на клетки Е. coli.

4. Провести сравнительное исследование действия проникающего (Н2О2) и непроникающего (K4[Fe(CN)6]) оксидантов на растущие клетки Е. coli.

Научная новизна и практическое значение. В результате исследований получены данные об изменении удельной скорости роста, уровней калия, белковых и небелковых тиолов в клетках Е. coli при действии Н202. Показано, что обработка растущих клеток Е. coli дикого типа низкими и умеренными дозами Н202 не вызывает значительного снижения уровня непротеиновых тиолов. Обнаружена обратная связь между количеством SH-групп в белках и уровнями низкомолекулярных тиолов (НМТ) и калия при действии низкими и умеренными дозами Н2О2.

Исследовано действие Н202 и менадиона на уровень и редокс-статус глутатиона у Е. coli. Обработка Н202 не влияет на уровень общего глутатиона, в то время как уровень окисленного глутатиона значительно снижается. Обработка клеток Е. coli менадионом вызывает истощение пула общего глутатиона и увеличение содержания окисленного глутатиона. Внутриклеточный ре-докс-статус глутатиона при действии Н2О2 и менадионом изменяется в противоположных направлениях: обработка Н2О2 приводит к повышению редокс-статуса глутатиона, а обработка менадионом к его понижению.

Выявлена взаимосвязь между каталазной активностью и уровнем непротеиновых тиолов. Показано, что в клетках Е. coli, дефицитных по каталазе HPI, обработка Н2О2 приводит к снижению уровней небелковых тиолов и калия.

Показано, что обработка Е. coli феррицианидом калия приводит к снижению уровня внутриклеточных НМТ; эти изменения уровня НМТ были противоположны тем, которые наблюдали при обработке клеток перекисью водорода.

Выявленные закономерности между изменениями уровней белковых и небелковых тиолов и калия дополняют накопленные к настоящему времени данные о механизме адаптации клеток Е. coli к О.С. Установление редокс-статуса глутатиона во время О.С. не только определяет роль глутатиона как антиоксиданта, но и способствуют более полному пониманию его значения для жизнедеятельности бактерий. Полученные данные о взаимосвязи между активностью каталазы и уровнем НМТ расширяют представления о механизме защиты Е. coli от ОС. и могут быть использованы при создании лекарственных препаратов против патогенных микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обработка растущих клеток Е. coli дикого типа Н2Ог не влияет на уровень НМТ; клетки Е. coli, имеющие низкий уровень глутатиона, обладают такой же чувствительностью к действию Н2О2, как и клетки с нормальным уровнем глутатиона.

2. Существует взаимосвязь между каталазной и глутатионовой антиок-сидантными системами: действие Н2О2 на клетки Е. coli, дефицитные по каталазе-гидропероксидазе I (HPI), приводит к падению уровня общего глутатиона, повышению количества GSSG и снижению соотношения GSH:GSSG; у штаммов, дефицитных по синтезу глутатиона, заметно возрастает активность каталазы HPI.

3. Каталаза HPI играет доминирующую роль в разложении экзогенной перекиси водорода растущими клетками Е. coli.

4. Роль глутатиона в ответе на обработку растущих клеток Е. coli непроникающим оксидантом феррицианидом отлична от той, которую он играет в ответе на действие проникающего оксиданта Н2О2. Полученные данные свидетельствуют в пользу участия глутатиона в восстановлении феррицианида клетками Е. coli.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на молодежной конференции Уро РАН «Проблемы общей и прикладной экологии» (Екатеринбург, 1996); Международной конференции «Микробное биоразнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996); II съезде Биохимического общества РАН (Пу-щино, 1997); Конференции молодых ученых-экологов Уральского региона ■ «Современные проблемы популяционной, исторической и прикладной экологии» (Екатеринбург, 1998); Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды ICEP' 98» (Москва, 1998); Региональной конференции молодых ученых ИЭГМ-ПГУ (Пермь, 1999). По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах печатного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 6 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Список литературы включает 195 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Музыка, Надежда Геннадьевна

выводы

1. Растущие клетки Е. coli JTG10 с мутацией в гене gshA, приводящей к дефициту по глутатиону, проявляют такую же устойчивость к перекиси водорода, менадиону, кумен гидропероксиду и N-этилмалеимиду, как и клетки родительского типа ABl 157.

2. При действии Н202 на бактерии Е. coli дикого типа в концентрациях, замедляющих рост клеток, не отмечено снижения внутриклеточных уровней низкомолекулярных тиолов и глутатиона. Обработка растущих клеток менадионом приводит к падению уровня общего глутатиона, повышению количества окисленного глутатиона (GSSG) и снижению соотношения GSH:GSSG.

3. Обнаружена взаимосвязь между каталазной и глутатионовой антиоксидантными системами: действие Н202 на клетки Е. coli, дефицитные по каталазе-гидропероксидазе I (HPI), приводит к падению уровня общего глутатиона, повышению количества GSSG и снижению соотношения GSH:GSSG; у штаммов, дефицитных по синтезу глутатиона, заметно возрастает активность каталазы HPI. Катал аза HPI играет1 доминирующую роль в защите растущих клеток Е. coli от окислительного стресса, вызванного действием перекиси водорода.

4. Во время первой фазы отклика Е. coli на действие Н202 прослеживается прямая связь между изменениями уровней белковых тиолов и калия и обратная связь между изменениями уровней низкомолекулярных тиолов и калия.

5. Обнаружено повышение устойчивости к менадиону у растущих клеток Е. coli 821, что связано с пониженной активностью НАДФН:менади-он-диафоразы.

6. Роль глутатиона в ответе на обработку растущих клеток Е. coli непроникающим оксидантом (K4[Fe(CN)6] отлична от той, которую он играет в ответе на действие проникающего оксиданта Н202. Полученные данные

117 свидетельствуют в пользу участия глутатиона в восстановлении ферри-цианида клетками Е. coli.

7. Обработка Е. coli теллуритом калия приводит к снижению уровня внутриклеточного глутатиона, что указывает на возможное участие глутатиона в восстановлении теллурита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные, представленные в этой работе, показывают, что обработка растущих клеток Е. coli Kl 2 2 - 25 мМ Н202, ингибирующей рост бактерий, не снижала внутриклеточный уровень низкомолекулярных тиолов (рис. 9 - 12). Обработка клеток 2 мМ Н202 даже вызывала увеличение уровня низкомолекулярных тиолов в 1.4 раза (рис. 12). Более того, как только весь или большая часть оксиданта была разрушена и клетки возобновляли рост, уровень НМТ повышался. Незначительное снижение уровня НМТ наблюдались только при действии очень высоких доз Н202 (25 мМ) (рис. 12). Эти данные согласуются с более ранними сообщениями, в которых также наблюдали увеличение уровня НМТ в ответ на обработку Е. coli низкой дозой Н202 (Smirnova, Oktyabrsky, 1994).

Результаты, полученные в опытах с katG мутантами, свидетельствуют о том, что ген oxyR может принимать участие в регуляции внутриклеточных уровней НМТ в растущих клетках Е. coli, обработанных перекисью водорода. Эта регуляция может осуществляться не только путем прямого контроля экспрессии генов, чьи продукты участвуют в метаболизме GSH (например, глутатионредуктазы), но и косвенно через регуляцию активности каталазы HPI, находящейся под контролем oxyR. Дефицит каталазы HP; о растущих клетках oxyR' и katG' должен приводить к повышению концентрации оксиданта в цитоплазме и, соответственно к окислению GSH.

Как и у S. typhimurium, в клетках Е. coli активность глутатионредуктазы, участвующей в восстановлении окисленного глутатиона, контролируется геном oxyR. Однако в настоящей работе показано, что активность глутатионредуктазы в ответ на обработку Е. coli Н202 возрастает незначительно, и только в узком диапазоне концентраций оксиданта, так как этот фермент не активируется при действии перекиси водорода в концентрациях выше 5 мМ. Возможно, что в растущих клетках Е. coli активность глутатионредуктазы играет второстепенную роль в поддержании уровня восстановленного глутатиона. Это согласуется с более ранними сообщениями, в которых было показано, что основную роль в поддержании внутриклеточного пула восстановленного глутатиона в нерастущих Е. coli играет биосинтез GSH de novo (Alonso-Moraga et al., 1987).

Полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что в растущих клетках Е. coli основная роль в деструкции экзогенной Н2О2 принадлежит каталазе-гидропероксидазе I (HPI). Отсутствие снижения GSH в клетках дикого типа и незначительное возрастание активности глутатион-редуктазы при обработке клеток Н202 указывают на второстепенную роль глутатиона в разрушении перекиси водорода. Эти данные свидетельствуют в пользу ранее высказанного предположения о том, что глутатион, представляющий у Е. coli основную часть НМТ, не участвует в разрушении экзогенной Н2О2 (Greenberg, Demple, 1986).

Это подтверждается и результатами, полученными в экспериментах с gsh' мутантами, чувствительность которых к обработке Н202 не отличалась от чувствительности клеток gsh+ (рис. 20). Клетки Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, имели также нормальную чувствительность к действию других оксидантов, менадиона и кумен гидропероксида (рис. 24).

В клетках животных глутатион играет важную роль в защите от токсического действия Н202 и органических перекисей в реакциях, катализируемых глутатионпероксидазой (Reed, Beatty, 1990). У бактерий Е. coli не обнаружено глутатионпероксидазной активности, возможно, поэтому глутатион в этих клетках не играет роли классического антиоксиданта (Greenberg, Demple, 1986).

В совокупности эти данные указывают на какую-то другую роль глутатиона в защите Е. coli против действия этими агентами, не связанную прямо с участием в деструкции перекиси водорода.

Одна из возможных ролей глутатиона при окислительном стрессе, вызванном действием Н2О2, может быть связана с его влиянием на активность ферментов и экспрессию генов, которые имеют редокс-чувствительные SH-группы. Было сообщено, что обработка клеток Е. coli тиоглицерином активирует большую группу генов, которые были определены как тиол-чувствительные гены (Javor, 1989). Многие из этих тиол-чувствительных генов включены в отклик Е. coli на различные стрессы. Учитывая данные, полученные в этой работе, представляется возможным, что увеличение уровня НМТ, индуцированное перекисью водорода, может влиять на экспрессию стрессовых генов, чья активность зависит от редокс-состояния цитоплазмы.

Другой возможной функций глутатиона у бактерий Е. coli может быть защита против окисления белков посредством реакций тиол-дисульфидного обмена между GSH и белковыми SH-группами (Javor, 1989). Одним из результатов этой работы было обнаружение положительной связи между уровнями низкомолекулярных и белковых тиолов при ответе на окислительный стресс растущих клеток Е. coli (рис. 13). Возможно, это может иметь какое-то отношение к роли глутатиона, как протектора белковых SH-rpynn.

У клеток Е. coli регуляторный белок OxyR, участвующий в контроле отклика на Н202-стресс, имеет редокс-чувствительные SH-группы, существенные для его функций (Demple, 1991). При изменении редокс-состояния одной из этих SH-групп в сторону -S-S-, белок OxyR активирует гены, находящиеся под его контролем (Storz et al., 1990). Можно ожидать, что изменения уровня общего глутатиона и соотношения GSH:GSSG будут влиять на активность белка OxyR и активность регулируемых им генов. Действительно, было сообщено, что инактивирование окисленного OxyR происходит при участии глутаредоксина и восстановленного глутатиона (Zheng ei al., 1998). В наших опытах предобработка клеток Е. coli непроникающим оксидантом гексацианоферратом калия, снижающим уровень общего глутатиона, способствовала повышению экспрессии гена katG (рис. 27), активность которого регулируется белком OxyR. Кроме того, каталазная активность в клетках gsh~, обработанных Н2О2, была в 2.2 раза выше, чем в gsh+ (табл. 6).

Вместе эти данные могут свидетельствовать о непрямой роли глутатиона в окислительном стрессе, вызванном действием экзогенной перекиси водорода на растущие клетки Е. coli. В этой ситуации глутатион может действовать как один из компонентов регуляторных систем, а не как классический анти-оксидант.

Полученные результаты позволяют объяснить один из парадоксов в поведении Е. coli при окислительном стрессе. Было показано ранее (Green-berg, Demple, 1986) и подтверждено в нашей работе, что выживаемость клеток gsh', обработанных Н202, не отличается от выживаемости gsh+. Из этих данных был сделан вывод о том, что глутатион не участвует в защите клеток Ё. coli от токсического действия Н2О2. С другой стороны, было сообщено, что выживаемость клеток katG', обработанных высокими дозами Н2О2, не отличается от выживаемости katG+ (Imlay, Linn, 1986). Создалась парадоксальная ситуация: при отклике Е. coli на действие перекиси водорода ни одна из двух основных систем, участвующих в разрушении Н2О2, не нужна.

Предложенная сотрудниками лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН гипотеза исходит из того, что в растущих клетках Е. coli дикого типа основной вклад в разрушение Н202 вносит ката-лаза HPI. В то же время, глутатион выполняет некоторую важную функцию, не связанную прямо с участием в разрушении Н2О2. Из-за высокой концентрации внутриклеточного глутатиона активность каталазы HPI устанавливается на уровне более низком, чем максимальный уровень, но достаточном для эффективной деструкции перекиси водорода. В итоге достигается компромисс, когда обе системы функционируют на уровне, достаточном для успешной защиты клеток от оксиданта.

В условиях, когда уровень GSH по тем или иным причинам понижен, активность каталазы HPI повышается и, соответственно, снижается количество молекул Н2О2, достигающих внутриклеточных мишеней. В обратной ситуации, когда в растущих клетках понижена активность каталазы, можно ожидать, что в цитоплазме повысится концентрация Н202. "Увеличение концентрации внутриклеточной Н202 будет способствовать снижению уровня общего глутатиона и окислению GSH. В свою очередь, это приведет к повышению активности биосинтеза глутатиона для того, чтобы компенсировать убыль GSH, расходуемого на восстановление Н202. Снижению уровня восстановленного глутатиона может способствовать также то, что в ответ на обработку Н202 значительного повышения активности глутатионредуктазы в клетках katG' не происходит и убыль восстановленного глутатиона не компенсируется за счет увеличения скорости восстановления GSSG. В пользу выдвигаемого нами предположения свидетельствуют следующие факты. Во-первых, было сообщено, что во время аэробного метаболизма в активно растущих клетках Е. coli katG' концентрация эндогенной Н202 выше, чем в клетках katG* (Gonzalez-Flecha, Demple, 1997). Во-вторых, в настоящей работе во время аэробного роста клеток Е. coli katG' наблюдали снижение уровня общего глутатиона и повышение уровня окисленного глутатиона. Обработка Н2О2 клеток katG' вызывала еще большее снижение уровня общего глутатиона и увеличение уровня окисленного глутатиона. В-третьих, было установлено, что в клетках katG' скорость биосинтеза GSH заметно выше, чем в клетках katG+ (Alonso-Moraga et al., 1987). В-четвертых, уровень индуцируемой Н2Ог каталазной активности в ^/г-дефицитных клетках был в 2.2 раза ниже, чем в клетках gsh+ (эта работа). Кроме того, было показано, что двойные мутанты Е. coli, katG' gsh', имели повышенную чувствительность к обработке Н2О2 (Alonso-Moraga et al., 1987). Отсутствие снижения уровня глутатиона в клетках дикого типа Е. coli при обработке клеток Н2О2 показывает, что благодаря наличию высокоактивной периплазматической каталазы HPI внутриклеточный глутатион защищен от воздействия Н2Ог.

Одним из важных последствий изменения внутриклеточного редокс-состояния НМТ при обработке Е. coli Н2О2 является изменение в клетках концентрации ионов калия. Обнаружена положительная связь между изменениями уровней К+ и белковых тиолов и обратная связь между уровнями К+ и НМТ.

Концентрация калия в клетках Е. coli регулируется К+-входными и К+-выходными системами. В поглощении калия у Е. coli участвуют системы Kdp, TrkA, TrkF, из которых наиболее полно изучена система Kdp. Многокомпонентная система Kdp включает в себя белки, которые функционируют как сенсоры, улавливающие концентрацию К+ в среде, и белки, которые транспортируют К+ через мембрану. Отток К+ из клеток регулируется системой, кодируемой генами kef A, kefB (Epstein, 1986). Было сообщено, что на активность К+-выходных каналов влияет редокс-статус клеточного содержимого (Meury, Robin, 1990). Важную роль в регуляции этих каналов играет внутриклеточный GSH (Meury, Kepes, 1982; Elmore et al., 1990).

Наблюдаемое снижение концентрации К+ у Е. coli может быть вызвано изменением активности К+-выходных каналов во время обработки Н2О2. Перекись водорода может вызывать отток К+ из клеток или посредством прямого активирования тиол-чувствительных центров калиевых выходных каналов или опосредованно, через изменения соотношения GSH:GSSG. Другой причиной снижения концентрации внутриклеточного К+.может быть ингибирование калиевых входных систем. Так, снижение активности К+-входных систем наблюдали при инкубирования клеток Е. coli на среде без глюкозы (Meury, Kepes, 1982). Для установления причины снижения уровня внутриклеточного К+ во время окислительного стресса требуется более подробное исследование. Полученные данные можно обобщить в виде схемы действия Н202 на внутриклеточные уровни калия и низкомолекулярных ти-олов (рис. 28).

Обзор литературных данных показывает, что при стрессах, вызываемых различными факторами, в частности, гиперосмотическом шоке, стрессе голода, изменении pH среды в поведении клеток обнаруживаются некоторые одинаковые реакции. К числу таких реакций относятся изменения уровней внутриклеточных тиолов и калия у Е. coli (Oktyabrsky, Smirnova, 1993; Smir-nova, Oktyabrsky, 1995). Концентрация внутриклеточного K+ играет важную роль в регуляции внутриклеточного pH (Booth, 1985). В нашей работе были представлены данные, указывающие на корреляцию между уровнями НМТ и калия на первой стадии отклика Е. coli на окислительный стресс, вызванный обработкой клеток Н202. Полученные данные позволяют дополнить список стрессов, при которых такая связь наблюдается.

Учитывая, что у Е. coli трансмембранные потоки ионов калия и протонов взаимосвязаны (Booth, 1985), следует ожидать, что движение калия при обработке клеток перекисью водорода будет сопровождаться и изменениями трансмембранного градиента протонов (AjiH). Действительно, было доложено, что обработка перекисью водорода приводит к ингибированию мембранного транспорта, зависящего от (ДрН) (Farr et al, 1988).

Другая часть исследований была связана с изучением влияния генератора супероксидого аниона менадиона на уровень и редокс-состояние глутатиона. В то время как обработка Н202 клеток Е. coli не снижала уровень общего глутатиона и даже приводила к повышению соотношения GSH:GSSG, обработка бактерий менадионом вызывала заметное снижение аула общего глутатиона и снижение соотношения GSH:GSSG. Снижение внутриклеточной концентрации GSH может быть вызвано несколькими причинами. Было показано, что в бесклеточной системе продуктами взаимодействия GSH и менадиона являются GSSG, конъюгат GSH и менадиона, Н2О2 и 02~ (Ross et al., 1985). Одной из причин падения уровня общего глутатиона может

К - выходные

-> К каналы А

GSH: GSSG н2о2 Л

HPI А V

Глутатион-редуктаза gor г oxyR

-> katG

Рис. 28. Предполагаемая схема влияния Н202 на уровни глутатиона и калия в растущих клетках Е. coli. Повышение концентрации внутриклеточной Н202 вызывает активирование белка OxyR, что приводит к увеличению экспрессии генов katG и gor и соответственно, повышению активности ферментов каталазы HPI и глутатионредуктазы. Активация каталазы HPI приводит к увеличению скорости деструкции Н202. Активность глутатиона повышается хотя и незначительно, но достаточно для того, чтобы предотвратить снижение уровня GSH. При действии Н202 на Е. coli katG' активность каталазы HPI отсутствует, поэтому повышение концентрации Н202 в цитоплазме приводит к снижению уровня восстановленного глутатиона. Перекись водорода может влиять на уровень внутриклеточного калия прямо через воздействие на редокс-чувствительные калий-выходные кана-лы или опосредованно, через изменение соотношения GSH : GSSG. быть прямое окисление GSH менадионом (Di Monte et al, 1984) с последующим выбросом GSSG наружу клетки. В клетках эукариот выброс окисленного глутатиона в среду является одним из важных механизмов избавления клеток от окисленного глутатиона (Kosower, Kosower, 1978). Следует отметить, что окисленный глутатион способен взаимодействовать с SH-группами в белках, изменять их свойства, и тем самым оказывать вредное воздействие на клетки. Вероятно, поэтому клетки эукариот не накапливают значительной концентрации внутриклеточного GSSG и избавляются от его избытка, выбрасывая в среду (Kosower, Kosower, 1978). В нашей работе в ответ на обработку Е. coli менадионом происходило увеличение концентрации внутриклеточного GSSG, однако, концентрация окисленного глутатиона все же была слишком мала, чтобы можно было объяснить убыль GSH его переходом в GSSG. Для того, чтобы выяснить происходит ли у Е. coli удаление окисленного глутатиона в среду требуются дополнительные исследования.

Известно, что внутриклеточный метаболизм менадиона наряду с образованием 02" приводит также к формированию Н202 (Hassan, Fridovich, 1979). Поэтому еще один путь, ведущий к повышению уровня GSSG в клетках Е. coli, обработанных менадионом, может быть связан с прямым окислением GSH перекисью водорода, образованной при дисмутации 02". В пользу этого свидетельствует увеличение каталазной активности при обработке менадионом клеток Е. coli дикого типа (табл. 3).

Другой причиной снижения пула GSH может быть образование конъюгата GSH-менадион (Dimonte et al., 1984; Ross et al., 1985). Образование этого продукта может происходить как при участии глутатион-S-трансфераз (менадион является субстратом для этого фермента), так и прямо, без участия фермента (Meister, Anderson, 1983; Ross et al., 1985). Однако, в ответ на обработку клеток Е. coli менадионом наблюдали снижение активности глутатион-^-трансферазы (табл. 3). И все же, по нашему мнению, GST может принимать участие в снижении уровня общего глутатиона вследствие образования конъюгата GSH и менадиона, поскольку менадион не полностью ингибирует активность GST. Менадион может ингибировать активность глутатион-^-трансферазы как прямо, так и опосредованно. Было сообщено, что О2", образуемый при восстановлении менадиона, способен высвобождать из железосодержащих кластеров некоторых белков ионы Fe (Flint et al., 1993). У E. coli ионы восстановленного железа оказывают ингибирующее действие на активность глутати-он-Я-трансферазы (Iizuka et al., 1989).

Еще одна из возможных причин снижения уровня общего глутатиона может быть связана с изменением баланса между его синтезом и деградацией. Так, у Е. coli активность у-глутатионсинтетазы ингибируется окисленным глутатионом (Apontoweil, Berends, 1975а). В этой работе показано, что обработка Е. coli менадионом приводит к заметному возрастанию уровня внутриклеточного GSSG, который, в свою очередь, действуя на у-глутатионсинтетазу, может ингибировать синтез GSH.

Другим результатом представленной работы является обнаружение повышенной устойчивости клеток Е. coli 821, дефицитных по биосинтезу глутатиона, к действию некоторых оксидантов (рис. 24). Поскольку клетки другого штамма Е. coli JTG10, также дефицитные по синтезу глутатиона, имели такую же чувствительность к действию этих агентов, как и клетки родительского типа, можно заключить, что более высокая устойчивость Е. coli 821 не связана с дефицитом глутатиона. Различие в устойчивости Е. coli 821 и JTG10 к оксидантам может быть связано с тем, что в клетках первого штамма, кроме мутации в локусе gshA могут быть мутации в других локусах. Штамм 821 был выделен в результате селекции клеток ABl 157, обработанных И-метил-К'-нитро-М-нитрозогуанидином (Apontoweil, Berends, 1975b). Штамм Е. coli JTG10 был получен совершенно другим способом, а именно, в результате трансдукции мутации gshA::TnlOkm в ABl 157 с помощью бактериофага PI (Greenberg, Demple, 1986). В последнем случае вероятность появления других мутаций резко снижается.

Причина повышенной устойчивости Е. coli 821 к менадиону может быть связана с низким уровнем активности НАДФН:менадион-диафоразы, которая катализирует перенос электронов от менадиона на 02 с образованием 02" (Fridovich, 1983). Пониженный уровень НАДФН:менадион-диафоразы может способствовать более медленному восстановлению менадиона и соответственно, понижению стационарных концентраций реактивных форм кислорода до более низких уровней, при которых антиоксидантные системы клетки успешно нейтрализуют их. В пользу этого предположения свидетельствует то, что базовый уровень активности каталазы в клетках 821 был в 1.5 раза ниже, чем в клетках родительского типа ABl 157. Пониженная каталазная активность в клетках 821 может быть следствием более низкого уровня Н202, образующейся в результате дисмутации супероксид аниона, что в свою очередь может быть следствием более низкой скорости метаболизма менадиона. Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что штамм Е. coli 821 может быть полезным для изучения метаболизма менадиона у Е. coli и механизмов, определяющих устойчивость клеток к этому оксиданту. С другой стороны, при изучении роли глутатиона в окислительном стрессе использование штамма JTG10 является более предпочтительным.

Одно из объяснений противоположных изменений уровня НМТ при действии на Е. coli Н202 и K4[Fe(CN)6] может быть связано с различной ролью глутатиона в отклике на действие этих оксидантов. Выше было представлено, что в растущих клетках Е. coli прямое участие GSH в разложении Н202 незначительно и основная роль принадлежит каталазе HPI, активность которой значительно возрастает после обработки клеток Н202. Об этом свидетельствуют отсутствие существенной разницы в ингиби-ровании скорости роста перекисью водорода у gsh+ и gsh" клеток и повышение внутриклеточного уровня небелковых тиолов у клеток дикого типа в ответ на обработку перекисью водорода.

В клетках растений причиной снижения уровня GSH при обработке K4[Fe(CN)6] может быть его прямое или косвенное участие в восстановлении феррицианида при выходе GSH из клеток (Patison et al., 1987). Это предположение может быть справедливо и для Е. coli. Известно, что скорость восстановления K4[Fe(CN)6] у эукариот зависит от концентрации НАДФН (Crane et al., 1985). Возможной причиной снижения уровня GSH при восстановлении Е. coli феррицианида может быть снижение пула НАДФН, способного поддерживать феррицианидредуктазную реакцию и в то же время участвовать в восстановлении окисленного глутатиона, катализируемом глутатионредуктазой (Asnis, 1955). Накапливающийся в аэробных условиях окисленный глутатион может экскретироваться наружу клетки или подвергаться разложению при участии у-глутамилтранспептидазы, имеющей более высокую гидролазную активность по отношению к окисленному глу-татиону (GSSG), чем к восстановленному (GSH) (Suzuki et al., 1986а).

В пользу участия глутатиона в восстановлении феррицианида клетками Е. coli свидетельствуют следующие данные. Во-первых, низкий окислительно-восстановительный потенциал GSH (Ео' = - 0.23 В) является достаточным для того, чтобы глутатион мог выступать донором электронов в реакции восстановления феррицианида. Восстановленный глутатион может реагировать с феррицианидом без участия ферментов. Во-вторых, в ответ на обработку клеток Е. coli K4[Fe(CN)6] происходило снижение пула внутриклеточного глутатиона. В-третьих, скорость восстановления феррицианида gsh-дефицитными клетками была заметно ниже, чем скорость его восстановления клетками gsh+. Кроме того, ранее было показано, что добавление в среду реагентов, связывающих свободные SH-группы, приводит к ингиби-рованию восстановления K4[Fe(CN)6] у Е. coli (Oktyabrsky et al., 1993). Таким образом, роль глутатиона во время окислительного стресса, вызванного обработкой Е. coli K4[Fe(CN)6], существенно отличается от той, которую глутатион играет при действии Н202.

Действие на клетки Е. coli теллурита калия вызывало снижение концентрации общего глутатиона, аналогичное тому, которое наблюдали при действии K4[Fe(CN)6]. В отличие от последнего, анионы теллурита проникают внутрь клетки, где восстанавливаются в менее токсичный элементарный теллур (Turner et al, 1994). Токсичное действие теллурита для клеток связывают с его способностью окислять внутриклеточное содержимое (Turner et al, 1995). В настоящее время нет полной ясности в механизме восстановления анионов теллурита у Е. coli. Полученные в данной работе данные свидетельствуют о том, что глутатион может прямо или косвенно принимать участие в восстановлении теллурита. На эту возможность указывает: 1) Окислительно-восстановительный потенциал восстановленного глутатиона позволяет ему выступать в роли восстановителя теллурита. Взаимодействие GSH с теллуритом in vitro приводит к восстановлению последнего и может происходить неферментативно. 2) Восстановление клетками Е. coli теллурита сопровождалось снижением пула внутриклеточного глутатиона (эта работа). Кроме того, было сообщено, что обработка клеток Е. coli теллуритом вызывает окисление внутриклеточных тиолов (Turner et al, 1999). 3) Клетки Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, имели повышенную чувствительность к обработке теллуритом калия (Turner et al, 1995). Добавление в среду диэтилмалеата, понижающего уровень внутриклеточных тиолов, увеличивала чувствительность к теллуриту клеток Е. coli дикого типа (Turner et al, 1995). Кроме того, было показано, чээ скорость восстановления теллурита у бактерий A. calcoaceticus прямо зависит от концентрации внутриклеточных тиолов (Соломенный, 1998).

Помимо участия в восстановлении теллурита, глутатион может также принимать участие в защите клеток против К2ТеОз опосредованно. Было сообщено, что у Е. coli белки, имеющие высокую специфичность по отно

115 шению к теллуриту, имеют редокс-чувствительные SH-группы, существенные для их активности (Turner et al., 1994). Восстановленный глутатион может принимать участие в защите SH-групп в этих белках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Музыка, Надежда Геннадьевна, Пермь

1. Васильева С.В., Искандарова К.А., Махова Е.В. Оксидативный и SOS-ответы в Escherichia coli и их интерференция // Генетика. 1991. Т.27. С.809-819.к

2. Дильман В.М. Большие биологические часы // Москва: «Знание». 1986. 256 С.

3. Методы общей бактериологи. Т. 1 // Москва: Мир. 1983. 536 С.

4. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении // Успехи соврем, биол. 1997. Т. 117. Вып. 2. С.155-171.

5. Островский Д.Н. Окислительный стресс у бактерий // 53 Баховское чтение. Инст. Биохим. Баха. Моск. Биохим. Общ. РАН. 17 марта 1997, Москва. 1997. 23С.

6. Пескин А.В., Столяров С.Д. Окислительный стресс как критерий оценки окружающей среды // Серия биологич. 1994. № 4. С.588-595.

7. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Изменение количества SH-соединений в культурах Escherichia coli и Bacillus subtilis II Микробиология. 1990. Т.59. Вып.З. С.387-393.

8. Соломенный А.П. Трансформация оксианионов теллура фосфатакку-мулирующей бактерией Acinetobacter calcoaceticus II Автореф. Кандидат. Диссер. Пермь. 1998.

9. Allocati N., Aceto A., Cellini L., Masulli M., Dragani В., Petruzzelli R., Di Ilio C. Effect of anaerobic environment on the glutathione^ transferase isoenzymatic pattern in Proteus mirabilis I I FEMS Lett. 1997. Vol.147. P. 157-162.

10. Apontoweil P., Berends W. Glutathione biosynthesis in Escherichia coli Kl2: properties of the enzymes and regulation // Biochim. Biophys. Acta. 1975a. Vol.399. P.l-9.

11. Apontoweil P., Berends W. Isolation and initial characterization of gluta-thione-deficient mutants of Escherichia coli Kl2 // Biochim. Biophys. Acta. 1975b. Vol.399. P.10-22.

12. Area P., Garcia P., Hardisson C., Suarez J.E. Purification and study of a bacterial glutathione S-transferase // FEBS Lett. 1990. Vol.263. P.77-79.

13. Arscott L.D., Drake D.M., Williams J.C.H. Inactivation-reactivation of two-electron reduced Escherichia coli glutathione reductase involving a dimermonomer equilibrium // Biochem. 1989. Vol.28. P.3591-3598.

14. Asnis R.E. A glutathione reductase from Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1955. Vol.213. P.77-85.

15. Aukerman S.L., Brundrett R.B., Hartman P.E. Detoxification of nitrosamides and nitrosocarbamates in blood plasma and tissue homogenates // Environ. Mutagen. 1984. Vol.6. P.835-849.

16. Babior B.M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes // New. Engl. J. Med. 1978. Vol.298. P.656.

17. Basaga H.S. Biochemical aspects of free radicals // Biochem. Cell. Biol. 1990. Vol.68. P.989-998.

18. Becker-Hapak M., Eisenstark A. Role of rpoS in the regulation of glutathione oxidoreductase (gor) in Escherichia coli //FEMS Lett. 1995. VqL134. P.39-44.

19. Beers R.F., Sizer I.W. A spectrophotometry method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase // J. Biol. Chem. 1952. Vol.195. P.133-140.

20. Bellomo G. Oxidative stress mechanisms of cytotoxicity // Chem. Scripta 27A. 1987. P.l 17-120.

21. Berglin E.H., Edlund M.-B. K., Nyberg G.K., Carlsson J. Potentiation by L-cysteine of the bactericidal effect of hydrogen peroxide in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1982. Vol.152. P.81-88.

22. Beyer W., Imlay J., Fridovich I. Superoxide dismutases // Progr. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 1991. Vol.40. P.221-253.

23. Bol D.K., Yasbin R.E. Characterization of an inducible oxidative stress system in Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P.3503-3506.

24. Booth I.R. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria I I Microbiol. Rev. 1985. Vol.79. P.359-378.

25. Bothwell T.H., Charlton R.W. A general approach to the problems of iron deficiency and iron overload in the population at large // Semin. Gematol. 1982. Vol.19. P.54-67.

26. Brigelius R. Mixed disulfides: biological functions and increase in oxidative stress // In: Sies H. (Ed.) Oxidative stress. London: Acad. Press, 1985. P.243-272.

27. Byrd S., Reines D., Doetsch P.W. Effects of oxidative DNA damage on transcription by RNA polymerases // Free Radic. Biol. Med. 1990. Vol.9 (Suppl.). P. 1-47.

28. Carlioz A., Touati D. Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life? // EMBO J. 1986. Vol.5. P.623-630.

29. Carlsson J., Granberg G.P.D., Nyrberg G.K., Edlund M.-B.K. Bactericidal effect of cysteine exposed to atmospheric oxygen // Appl. Environ. Microbiol. 1979. Vol.37. P.383-390.

30. Chance B., Sies H., Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs // Physiol. Rev. 1979. Vol.59. P.527-605.

31. Cheng H.M., Aronson A.I., Holt S.C. Role of glutathione in the morphogenesis of the bacterial spore coat // J. Bacteriol. 1973. Yol.l 13. P.1135-1143.

32. Chesney J.A., Eaton J.W., Mahoney J.R. Bacterial glutathione: a sacrificial defense against chlorine compounds // J. Bacteriol. 1996. Vol.178. P.2131-2135.

33. Christman M.F., Morgan R.W., Jacobson F.S., Ames B.N. Positive control of a regulon for defenses against oxidative stress and some that shock proteins in Salmonella typhimurium II Cell. 1985. Vol.41. P.753-762.

34. Cohen G., Hochstein P. Glutathione peroxidase: the primary agent for the elimination of hydrogen peroxide in erythrocytes // Biochem 1963. Vol.2. P.1420.

35. Cooper R.A., Anderson A. The formation and catabolism of methylglyoxal during glycolysis in Escherichia coli IIFEBS Lett. 1970. Vol.11. P.273-276.

36. Crane F.L., Sun I.L., Clark M.G., Grebig C., Low H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development // Biochim. Biophys. Acta 1985. Vol.811. P.233-264.

37. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals // J. Biol. Chem. 1987. Vol.262. P.9902-9907.

38. Davies K.J.A., Lin S.W. Degradation of oxidatively denatured proteins in Escherichia coli II Free. Radic. Biol. Med. 1988. Vol.5. P.215-223.

39. De Ray-Paylhade J. Nouvelles recherches physiologiques sur la substance organique hydrogenant le soufre a froid // J. Compt. Acad. Sci. (Paris). 1888. Vol.107. P.43-44.

40. Demple B. Regulation of bacterial oxidative stress genes // Annu. Rev. Genet. 1991. Vol.25. P.315-337.

41. Demple B., Halbrook J. Inducible repair of oxidative DNA damage in Escherichia coli II Nature (London). 1983. Vol.304. P.466-468.

42. Demple B., Halbrook J., Linn S. Escherichia coli xthA mutants are hypersensitive to hydrogen peroxide // J. Bacteriol. 1983. Vol.153. P.1079-1082.

43. Demple B., Linn S. 5,6-Saturated thymine lesions in DNA: production by UV light and hydrogen peroxide //Nucl. Acids Res. 1982. Vol.10. P.3781-3789.

44. Di Ilio C., Aceto A., Piccolomini R., Allocati N., Faraone A., Bucciarelli T., Barra D., Federici G. Purification and characterization of a novel glutathione transferase from Serratia marcescens II Biochim. Biophys. Acta 1991. Vol.107. P.141-146.

45. Di Monte D., Ross D., Bellomo G., Eklôw L., Orrenius S. Alterations in intracellular thiol homeostasis during the methabolism of menadione by isolated rat hepatocytes // Arch. Biochem. Biophys. 1984. Vol.235. P.334-342.

46. Duwat P., Ehrlich S.D., Gruss A. The recA gene of Lactococcus lactis: characterization and involvement in oxidative and thermal stress // Mol. Microbiol. 1995. Vol. 17. P.l 121-1131.

47. Eisenstark A. Bacterial genes involved in response to near-ultraviolet radiation // Adv. Genet. 1989. Vol.26 P.99-147.

48. Elmore M.G., Lamb A.J., Ritchie G.Y., Douglas R.M., Munro A., Gajewska

49. A., Booth I.R. Activation of potassium efflux from Escherichia coli by glutathione metabolites // Mol. Microbiol. 1990. Vol.4. P.405-412.

50. Epstein W. Osmoregulation by potassium transport in Escherichia coli II FEMS Microbiol. Rev. 1986. Vol. 39. P. 73-78.

51. Eriksson S., Askelôf P., Axelsson K., Carlberg I., Guthenberg C., Mannervik

52. B. Resolution of glutathione-linked enzymes in rat liver and evaluation of their contribution to disulfide reduction via thiol-disulfide interchange // Acta Chem. Scandinav. 1974.Vol. 28. P.922-930.

53. Fahey R.C., Brown W.C., Adams W.B., Worsham M.B. Occurrence of glutathione in bacteria // J. Bacteriol. 1978. Vol.133. P.l 126-1129.

54. Fanton J.C., Ward P.A. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukocyte dependent inflammatory reactions // Am. J. Pathol. 1982. Vol.107. P.397-418.

55. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium II Microbiol. Rev. 1991.Vol.55. P.561-585.

56. Farr S.B., Natvig D.O., Kogoma T. Toxicity and mutagenicity of plumbagin and the induction of a possible new DNA repair pathway in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1985. Vol.164. P. 1309-1316.

57. Farr S.B., Touati D., Kogoma T. Effects of oxygen stress on membrane functions in Escherichia coli: role of HPI catalase // J. Bacteriol. 1988. Vol.170. P.1837-1842.

58. Fenton H.J.H., Jackson H. The oxidation of polyhydric alcohols in the presence of iron II J. Chem. Soc. Trans. 1899. Vol.75. P. 1-11.

59. Flint D.H., Tuminello J.H., Emptage M.H. The inactivation of Fe-S cluster containing hydrolyases by superoxide // J. Biol. Chem. 1993. Vol.268. P.22369-22376.

60. Fridovich I. Superoxide radical: an endogenous radical // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1983. Vol.23. P.239-257.

61. Fridovich I. The biology of oxygen radicals // Science 1978. Vol.201. P.875-880.

62. Fuchs J.A., Warner H.R. Isolation of an Escherichia coli mutant deficient in glutathione synthesis // J. Bacteriol. 1975. Vol.124. P.140-148.

63. Ghe A.M., Stefanelli C., Tsintiki P., Veschi G. Influence of some metal ions on oxidation of NADH and on formation of the superoxide anion radical 02"' during enzymatic catalysis by EC 1.2.3.2 xanthine oxidase // Talanta. 1985. Vol. 32. P.359-362.

64. Giddings T.H., Wolk P., Shomer-Ilan A. Metabolism of sulfur compounds by whole filaments and heterocysts of Anabaena variabilis // J. Bacteriol. 1981. Vol.146. P.1067-1074.

65. Goff S.A., Goldberg A.L. Production of abnormal proteins in Escherichia coli stimulates transcription of Ion and other heat shock genes // Cell. 1985. Vol.41. P.587-595.

66. Gonzalez-Flecha B., Demple B. Homeostatic regulation of intracellular hydrogen peroxide concentration in aerobically growing Escherichia coli II J. Bacteriol. 1997. Vol.179. P.382-388.

67. Graf E., Empson K., Eaton J. Phytic acid a natural antioxidant // J. Biol. Chem. 1987. Vol.262. P.l 1647-11650.

68. Grant C.M., Maclver F.H., Dawes I.W. Glutathione is an essential metabolite required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cere-visiae II Cur. Genet. 1996. Vol.29. P.511-515.

69. Greenberg J.T., Demple B. A global response induced in Escherichia coli by redox-cycling agents overlaps with that induced by peroxide stress // J. Bacteriol. 1989. Vol.171. P.3933-3939.

70. Greenberg J.T., Demple B. Glutathione in Escherichia coli is dispensable for resistance to H2O2 and gamma radiation // J. Bacteriol. 1986. Vol.168. P. 1026-1029.

71. Greenberg J.T., Demple B. Overproduction of peroxide-scavenging enzymes in Escherichia coli suppresses spontaneous mutagenesis and sensitivity to redox-cycling agents in oxyR mutants I IEMBO J. 1988. Vol.7. P.2611-2617.

72. Greenberg J.T., Monach P., Chou J.H., Josephy P.D., Demple B. Positive control of a global antioxidant defense regulon activated by superoxidegenerating agents in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. Vol.87. P.6181-6185.

73. Greer S., Perham R.N. Glutathione reductase from Escherichia coli: cloning and sequence analysis of the gene and relationship to other flavoprotein disulfide oxidoreductases // Biochem. 1986. Vol.25. P.2736-2742.

74. Gulick A.M., Fahl G.E. Forced evolution of glutathione ¿»-transferase to create a more efficient drug detoxification enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. Vol.92. P.8140-8144.

75. Gushima H., Miya T., Murata K., Kimura A. Purification and characterization of glutathione synthetase from Escherichia coli B // J. Appl. Biochem. 1983. Vol.5. P.210-218.

76. Gushima H., Yasda S., Soeda E., Yokata M., Kondo M., Kimura A. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli glutathione synthetase gsh-II II Nucl. Acid. Res. 1984. Vol.12. P.9299-9307.

77. Halliwell B. Oxidants and human disease: some new concepts // FASEB J. 1987. Vol.1. P.358.

78. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview // Methods Enzymol. 1990. Vol.186. P.1-85.

79. Harington A.A., Kallio R.E. Oxidation of methanol and formaldehyde by Pseudomonas methanica II Can. J. Microbiol. 1969. Vol.6. P. 1-7.

80. Hassan H.M., Fridovich I. Intracellular production of superoxide radical and of hydrogen peroxide by redox active compounds // Arch. Biochem. Biophys. 1979. Vol.196. P.385-395.

81. Hibberd K.A., Berget P.B., Warner H.R., Fuchs J.A. Role of glutathione in reversing the deleterious effects of a thiol-oxidizing agent in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1978. Vol.133. P.l 150-1155.

82. Hochman A. Programmed cell death in prokaryotes // Critical Rev. Microbiol. 1997. Vol.23. P.207-214.

83. Holmgren A. Glutathione-dependent synthesis of deoxyribonucleotides // J. Biol. Chem. 1979. Vol.254. P.3661-3669.

84. Iizuka M., Inoue Y., Murata K., Kimura A. Purification and some properties of glutathione ^-transferase from Escherichia coli B // J. Bacteriol. 1989. Vol.171. P.6039-6042.

85. Imlay J.A., Linn S. Mutagenesis and stress responses induced in Escherichia coli by hydrogen peroxide // J. Bacteriol. 1987. Vol.169. P.2967-2976.

86. Imlay J.A., Fridovich I. DNA damage by hydrogen peroxide though the Fenton reaction in vivo and in vitro II Science. 1991. Vol.240. P,640-642.

87. Imlay J.A., Linn S. Bimodal pattern of killing of DNA-repair defective or anoxically grown Escherichia coli by hydrogen peroxide // J. Bacteriol. 1986. Vol.166. P.519-527.

88. Imlay J.A., Linn S. DNA damage and oxygen radical toxicity // Science. 1988. Vol.240. P.1302-1302.

89. Jakoby W.B., Habig W.H. Glutathione transferases // Biochem. Pharmacol. Toxicol. Enzimatic Basis Detoxicat. Bjacoby W. (Ed.). New York: Acad. Press, 1980. Vol.II. P.63-94.

90. Jamieson D.J. Saccharomyces cerevisiae has distinct adaptive responses to both hydrogen peroxide and menadione // J. Bacteriol. 1992. Vol.174. P.6678-6681.

91. Jamieson D.J. The effect of oxidative stress on Saccharomyces cerevisiae II Rev. article. Redox report. 1995. Vol.1. P.89-95.

92. Jamieson D.J., Stephen D.W.S., Tirriere E.C. Analysis of the adaptive oxidative stress response of Candida albicans //FEMS Let. 1996. Vol. 138. P.83-88.

93. Javor G. Thiol-sensitive genes of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1989. Vol.171. P.5607-5613.

94. Kaplowitz N. Physiological significance of glutathione S-transferases // Am. J. Physiol. 1980. 239: G 439-G 444.

95. Kappus H. Lipid peroxidation: mechanisms, analysis, enzymology and biological relevance. 1985 // In: Oxidative stress. Sies H. (Ed.). New York, Acad. Press. P.273-310.

96. Keyer K., Gort A.S., Imlay J.A. Superoxide and the production of oxidative DNA damage // J. Bacteriol. 1995. Vol.177. P.6782-6790.

97. Kogoma T.S., Farr S.B., Joyce K.M., Natvig D.O. Isolation of gene fusions (soir.lacZ) inducible by oxidative stress in Escherichia coli II Proc. Narl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol.85. P.4799-4803.

98. Kosower N.S., Kosower E.M. The glutathione status of cells // Int. Rev. Cytol. 1978. Vol.54. P.109-160.

99. Lathi R., Suonpaa M. Role of glutathione in the regulation of inorganic pyrophosphatase activity in Streptococcus faecalis II J. Gen. Microbiol. 1982. Vol.128. P.1023-1026.

100. Lee J., Dawes I.W., Roe J.-H. Adaptive response of Schizosaccharomyces pombe to hydrogen peroxide and menadione // Microbiol. 1995. Vol.141. P.3127-3132.

101. Leisinger T., Bader R., Hermann R., Schmid-Appert M., Yuilleumier S. Microbes, enzymes and genes involved in dichloromethane utilization // Bio-degradat. 1994. Vol.5. P.237-248.

102. Lesko S.A., Lorentzen R.J., Ts'o P.O.P. Role of superoxide in deoxyribonucleic acid strand sciccion//Biochem. 1980. Vol.19. P.3023.

103. Link E.M. The mechanism of pH-dependent hydrogen peroxide cytotoxicity in vitro II Arch. Biochem. Biophys. 1988. Vol.265. P.362-372.

104. Liochev S.I., Fridovich I. Paraquat diaphorases in Escherichia coli II Free Radic. Biol. Med. 1994. Vol.16. P.555-559.

105. Liu R.M., Shi M.M., Guilivi C., Forman H.J. Quinones increase gamma-gluta-myl transpeptidase expression by multiple mechanisms in rat lung epithelial cells // Amer. J. Physiol.-Lung Cell. Mol. Physiol. 1998. Vol.18. L330-336.

106. Liu S., Dixon K. Induction of mutagenic DNA damage by chromium (VI) and glutathione // Environ. Mol. Mutagen. 1996. Vol.28. P.71-79.11 l.Loewen P. Levels of glutathione in Escherichia coli II Can. J. Biochem. 1979. Vol.57. P.107-111.

107. Loewen P.C. Levels of coenzyme A-glutathione mixed disulfide in Escherichia coli II Can. J. Biochem. 1978. Vol.56. P.753-759.

108. Loewen P.C. Regulation of bacterial catalase synthesis // Mol. Biol. Free Radic. Scaveng. Syst. Cold Spring Laboratory Press. 1992. P.97-115.

109. Loewen P.C., Switala J., Triggs-Raine B.L. Catalases HPI and HPII in Escherichia coli are induced independently // Arch. Biochem. Biophys. 1985. Vol.243. P. 144-149.

110. Lopez-Barea J., Barcena J.A. Redox control of glutathione and thioredoxin reductase // In: Plasm. Membr. Oxidoreduct. Control Anim. Plant Growth. Proc. NATO Adw. Res. Worthshop. Cordowa, March 21-25. 1988. New York-London.

111. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.263-275.

112. Mandell G.L. Catalase, superoxide dismutase and virulence of Staphylococcus aureus II J. Clin. Invest. 1975. Vol.55. P.561-566.

113. Margison G.P., O'Connor P.J. Nucleic acid modification by iV-nitroso compounds // In: Chemical Carcinogens and DNA. Grover P.L. (Ed.). Boca Raton F.L.: CRC Press. 1979. Vol.I. P.l 11-159.

114. Mata A.M., Pinto M.C., Lopez-Barea J. Purification by affinity chromatography of glutathione reductase (EC 1.6.4.2) from Escherichia coli and characterization of such enzyme // Z. Naturforsch 39C. 1984. P.908-915.

115. McCormick J.P., Fischer R.J., Pachlatko J.P., Eisenstark A. Characterization of a cell lethal product from the photooxidation of tryptophan: hydrogen peroxide // Science 1976. Vol.191. P.468-469.

116. Mead J. Free radical mechanisms of lipid damage and consequences for cellular membranes // In: Free radicals in biology. Pryor W.A. (Ed.). New York: Acad. Press, 1976. P.51-68.

117. Meister A. On the cycles of glutathione metabolism and transport // Curr. Top. Cell Regul. 1981. Vol.18. P.21-58.

118. Meister A., Anderson M.E. Glutathion // Annu. Rev. Biochem. 1983. Vol.52. P.711-760.

119. Meury J., Kepes A. Glutathione and the gated potassium channels of Escherichia coli// EMBO J. 1982. Vol.1. P.339-343.

120. Meury J., Robin A. Glutathione-gated K+ channels of Escherichia coli carry out K+ efflux controlled by redox state of the cells // Arch. Microbiol. 1990. Vol.154. P.475-482.

121. Milbauer R., Grossowitz N. y-Glutamyl transfer reactions in bacteria // J. Gen. Microbiol. 1965. Vol.41. P. 185-194.

122. Miller J.H. Experiments in molecular genetics // Cold Spring Harbor. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972.

123. Mooze E.D. Association of glutathione synthetase deficiency and diminished amino acid transport in yeast // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. Vol.90. P.1221-1228.

124. Murata K., Tani K., Kato J., Chibata I. Excretion of glutathione by methylgly-oxal-resistant Escherichia coli 111. Gen. Microbiol. 1980. Vol.120. P.545-547.

125. Nakayama R., Kumagai H., Tochikura T. Leakage of glutathione from bacterial cells caused by inhibition of y-glutamyltranspeptidase //Appl. Environ. Microbiol. 1984. Vol.47. P.653-657.

126. Nathan C.F. Secretory products of macrophages // J. Clin. Invest. 1987. Vol.79. P.319-326.

127. Newton G.L., Fahey R.C., Cohen G., Aharonowitz Y. Low-molecular weight thiols in Streptomyces and their potential role as antioxidants // J. Bacteriol. 1993. Vol.175. P.2734-2742.

128. Newton G.L., Javor B. y-Glutamylcysteine and thiosulfate are the major low-molecular-weight thiols in halobacteria // J. Bacteriol. 1985. Vol.161. P.438-441.

129. Noctor G., Arisi A.- C.M., Jouanin L., Kunert K.J., Rennenberg H., Foyer C.H. Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants // J. Exp. Bot. 1998. Vol.49. P.623-647.

130. Owens R.A., Hartman P.E. Export of glutathione and other sulfur-containing compounds in Salmonella typhimurium and Escherichia coli II Environ. Mutagen. 1985. Vol.7 (Suppl. 3). P.47.

131. Owens R.A., Hartman P.E. Glutathione: a protective agent in Salmonella typhimurium and Escherichia coli as measured by mutagenicity and by growth delay assays // Environ. Mutagen. 1986. Vol.8. P.659-673.

132. Patison S., Nelson M., Barr R., Crane F.L. The effect of diamide and buthionine sulfoximine of glutathione pools and transmembrane electron transport by cultured carrot cells // Proc. Ind. Acad. Sci. 1987. Vol.97. P. 115-119.

133. Penninckx M.J., Jaspers C.J. On the role of glutathione in microorganisms // Bull. Inst. Pasteur. 1982. Vol.80. P.291-301.

134. Pizzaro R.A. UV-A oxidative damage modified by environmental conditions in Escherichia coli II Int. J. Radiat. Biol. 1995. Vol.68. P.293-299.

135. Plummer J.L., Smith B.R., Sies H., Bend J.R. Chemical depletion of glutathione in vivo II Meth. Enzimol. 1981. Vol.77. P.50.

136. Poole L.B. Flavin-dependent alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium. 2. Cystine disulfides involved in catalysis of percxide reduction // Biochem. 1996. Vol.35. P.65-75.

137. Pryor W. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes and reactions // Annu. Rev. Physiol. 1986. Vol.48. P.657-667.

138. Racker E. The mechanism of action of glyoxalase // J. Biol. Chem. 1951. Vol.190. P.685-692.

139. Ramasarma T. H202 has a role in cellular regulation // Indian J. Biochem. Biophys. 1990. Vol. 127. P.269-274.

140. Rannug U., Sundvall A., Ramel S. The mutagenic effect of 1,2-dichloroethane on Salmonella typhimurium. I. Activation through conjugation with glutathione in vivo // Chem.-Biol. Interact. 1978. Vol.20. P.l.

141. Rao N., Komberg A. Inorganic polyphosphate supports resistance and survival of stationary phase Escherichia coli II J. Bacteriol. 1996. Vol.178. P.1394-1400.

142. Reed D.J., Beatty P.W. Biosynthesis and regulation of glutathione: toxicological implications //Rev. Biochem. Toxicol. 1980. Vol.2. P.213-241.

143. Romero M.J.M., Canada A.T. The evaluation of Escherichia coli as a model for oxidant stress in mammalian hepatocytes: role of glutathione // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1991. Vol.111. P.485-495.

144. Rose Z.B., Racker E. Formaldehyde dehydrogenase from backer's yeast // J. Biol. Chem. 1962. Vol.237. P.3279-3283.

145. Ross D., Thor H., Orrenius S., Moldeus P. Interaction of menadione (2-me-thyl-l,4-naphthoquinone) with glutathione // Chem. Biol. Interact. 1985. Vol.55. P.177-184.

146. Sak B.D., Eisenstark A., Touati D. Exonuclease III and the catalase hydroperoxidase II in Escherichia coli are both regulated by the karF gene product // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. Vol.86. P.3271-3275.

147. Sakuda S., Zhou Z.-Y., Yamada Y. Structure of novel disulfide of 2-(N-acetylcysteinyl)amino-2-deoxy-a-D-glucopyranosyl- myo-inositol produced by Streptomyces sp. // Biotech. Biochem. 1994. Vol.58. P.1347-1348.

148. Scrutton N.S., Berry A., Perham R.N. Purification and characterization of glutathione reductase encoded by a cloned and over-expressed gene in Escherichia coli II Biochem. J. 1987. Vol.245. P. 875-880.

149. Sedlak J., Lindsay R. // Estimation of total protein-bound, and nonprotein sulf-hydryl groups in tissue with Ellman reagent // Anal. Biochem. 1968. Vol.25. P. 192-205.

150. Shigenaga M.K., Ames B.N. Assays for 8-hydroxy-2-deoxyguanosine: a bio-marker of in vivo oxidative DNA damage // Free Rad. Biol. Med. 1991. Vol.10. P.211.

151. Sies H. Biochemistry of oxidative stress // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986. Vol.25. P.1058-1071.

152. Slater A.F.G., Stefan C., Nobel I., Diels J., Van den Dobbelsteen A., Orrenius S. Intracellular redox changes during apoptosis // Death Differentiat. 1996. Vol.3. P.57-62.

153. Smirnova G.V., Oktyabrsky O.N. Betaine modulates intracellular thiol and potassium levels in Escherichia coli in medium with high osmolarity and alkaline pH // Arch. Microbiol. 1995. Vol.163. P.76-78.

154. Smirnova G.V., Oktyabrsky O.N. Near-ultraviolet radiation and hydrogen peroxide modulate intracellular levels of potassium and thiols in Escherichia coli II Curr. Microbiol. 1994. Vol.28. P.77-79.

155. Spear T., Aust S.D. Effects of glutathione on Fenton reagent-dependent radical production and DNA oxidation // Arch. Biochem. Biophys. 1995. Vol.234. P. 111-116.

156. Srivastava S.K., Awasthi Y.C., Beutler E. Useful agents for the study of glutathione metabolism in erythrocytes. Organic hydroperoxides // Biochem. J. 1974. Vol.139. P.289-29.

157. Stephen D.W.S., Jamieson D.J. Glutathione is an important antioxidant molecule in the yeast Saccharomyces cerevisiae 11 FEMS Lett. 1996. Vol.141. P.207-212.

158. Storz G., Tartaglia L.A., Ames B.N. Transcriptional regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation of oxidation // Sci. 1990. Vol.248. P. 189-194.

159. Storz G., Toledano M. Regulation of bacterial gene expression in response to oxidative stress // Meth. Enzymol. Part B. 1994. Vol.236. P. 196-207.

160. Suzuki H., Kumagai H., Echigo T., Tochikura T. DNA sequence of the Escherichia coli K12 y-glutamyltranspeptidase gene, ggt II J. Bacteriol. 1989. Vol.171. P.5169-5172.

161. Suzuki H., Kumagai H., Tochikura T. Isolation, genetic mapping and characterization of Escherichia coli Kl 2 mutants lacking y-glutamyl-transpeptidase //J. Bacteriol. 1987. Vol.169. P.3926-3931.

162. Suzuki H., Kumagai H., Tochikura T. y-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K12: purification and properties // J. Bacteriol. 1986a. Vol.168. P.1325-1331.

163. Suzuki H., Kumagai H., Tochikura T. y-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K12: formation and localization // J. Bacteriol. 1986b. Vol.168. P.1332-1335.

164. Tabor H., Tabor C.W. The complete conversion of spermidine to a peptide derivative in Escherichia coli II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. Vol.41. P.232-238.

165. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Application to mammalian blood and other tissues // Anal. Biochem. 1969. V.27. P. 502-522.

166. Tsaneva I.R., Weiss B. soxR, a locus governing a superoxide response regulon in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1990. Vol.172. P.4197-4205.

167. Tsuchida S. Glutathione transferases // In: Encyclopaedia of Cancer. San Diego: Acad. Press, 1997. Vol.11. P.733-743.

168. Tuggle C.K., Fuchs J.A. Glutathione reductase is not required for maintenance of reduced glutathione in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1985. Vol.162. P.448-450.

169. Turner R.J., Weiner J.H., Taylor D.E. Utility of plasmid borne tellurite resistance determinants for the bio-recovery of tellurium // Microbiol. 1994. Vol.2. P.221-225.

170. Turner R.J., Weiner J.H., Taylor D.E. The tellurite-resistance determinants tehAtehB and klaAklaBtelB have different biochemical requirements // Microbiol. 1995. Vol.141. P.3133-3140.

171. Turner R.J., Weiner J.H., Taylor D.E. Tellurite-mediated thiol oxidation in Escherichia coli II Microbiol. 1999. Vol.145. P.2549-2557.

172. Tyrrell R.M. A common pathway for protection of bacteria against damage by solar UVA (334, 365 nm) and an oxidizing agent (H202) // Mutat. Res. 1985. Vol.145. P.129-136.

173. VanBogelen R.A., Kelley P.M., Neidhardt F.C. Differential induction of heat shock, SOS and oxidative stress regulons and accumulation of nucleotides in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1987. Vol.169. P.26-32.

174. Vuilleumier S. Bacterial glutathione ^-transferases: what are they good for? // J. Bacteriol. 1997. Vol.179. P.1431-1441.

175. Walker G. Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 1984. Vol. 48. P. 60-93.136

176. Walkup L.K.B, Kogoma T. Escherichia coli proteins inducible by oxidative stress mediated by the superoxide radical // J. Bacteriol. 1989. Vol.171. P.1476-1484.

177. Wang J.H. On the detailed mechanism of a new type of catalase-like action // J. Am. Chem. Soc. 1955. Vol.77. P.4715-4719.

178. Wu J., Weiss B. Two divergently transcribed genes, soxR and soxS, control a superoxide response regulon in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1991. Vol.173. P.2864-2871.

179. Zablotowicz R.M., Hoagland R.E., Locke M.A., Hickey W.J. Glutathione S-transferase activity and metabolism of glutathione conjugates by rhizosphere bacteria//Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol.61. P.1054-1060.

180. Zheng M., Aslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation // Science. 1998. Vol. 279. P. 1718-1721.

Информация о работе

Музыка, Надежда Геннадьевна
кандидата биологических наук
Пермь, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Исследование роли глутатиона в ответе Escherichia coli на действие различных оксидантов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы