Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль тиоловых редокс-систем при действии экстремальных температур и антибиотиков у Escherichia coli

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль тиоловых редокс-систем при действии экстремальных температур и антибиотиков у Escherichia coli"

На правах рукописи

ЛЕПЕХИНА Елена Владимировна

РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС-СИСТЕМ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР И АНТИБИОТИКОВ У ESCHERICHIA COLI

03.02.03 Микробиология

2 У ЯНВ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь-2014 005558304

005558304

Работа выполнена в Лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь.

Научный руководитель

доктор биологических наук Смирнова Галина Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Немцева Наталия Вячеславовна

доктор медицинских наук, начальник отдела препаратов бактериотерапии филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» Несчнсляев Валерий Александрович

Ведущая организация: ФГБУН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2)

Защита состоится «26» февраля 2015 г. в «1200» часов на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 2809211.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.cd.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

Автореферат диссертации разослан » ¿^/<^£5^^-2015 г.

Ученый секретарь диссертационного гппртя

кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкое распространение штаммов патогенных микроорганизмов, устойчивых к лечебным препаратам, привело к резкому снижению эффективности терапии инфекционных болезней. Поиск новых антибиотиков требует более глубоких исследований адаптационных реакций клетки на вызванный антибактериальными препаратами стресс с целью обнаружения новых внутриклеточных мишеней. Наряду с этим все большее внимание уделяется исследованию условий, модифицирующих действие антибиотиков.

В последнее время в научной литературе разгорелась дискуссия, касающаяся механизмов бактерицидного действия антибиотиков. М.А. Kohanski и ряд других исследователей представили доказательства в пользу того, что наряду с влиянием на специфические молекулярные мишени бактерицидные антибиотики стимулируют образование активных форм кислорода (АФК) и развитие окислительного стресса, который является общим механизмом убивания бактерий (Kohanski et al., 2007, Kohanski et al., 2008, Yeom et al., 2010, Foti et al., 2012). Эти сообщения вызвали широкий резонанс, поскольку могли дать толчок к поиску новых путей повышения эффективности антибактериальных препаратов. Однако позже появились публикации, опровергающие эту гипотезу и указывающие на то, что активные формы кислорода не участвуют в гибели клеток, вызванной антибиотиками (Liu and Imlay, 2013, Keren et al., 2013). В недавней работе J.J. Collins с соавторами (Dwyer et al., 2014) вновь выступили в поддержку своей гипотезы о вкладе редокс-стресса в механизм убивания бактерий при действии антибиотиков. В качестве аргументов приводятся результаты экспериментов, указывающие на повышение внутриклеточной концентрации пероксида водорода и экспрессии антиоксидантных генов при воздействии антибиотиками. Было также показано, что сверхэкспрессия каталазы или фермента репарации ДНК (MutS) и предобработка антиоксидантами (глутатион, аскорбат) снижают летальность, свидетельствуя о вкладе АФК в убивание бактерий антибиотиками.

Ранее было обнаружено, что у бактерий резкие изменения температуры культивирования сопровождаются окислительным стрессом, и в поддержании нормальной жизнедеятельности бактерий в этих условиях существенную роль играют тиоловые редокс-системы (Lee et al., 1983, Benov and Fridovich, 1995, Смирнова с соавт., 2001, Smirnova et al., 2007). Внутриклеточные тиоловые редокс-системы у бактерий Escherichia coli включают системы глутатиона (GSH, глутатионредуктаза и глутаредоксины) и тиоредоксина (тиоредоксины и тиоредоксинредуктаза). Эти редокс-системы обеспечивают поддержание восстановленного состояния SH-групп в различных белках, многие из которых являются важными ферментами, сенсорными или регуляторными факторами, и прямо или косвенно участвуют в ответе на окислительный стресс (Октябрьский, Смирнова, 2007).

Следовательно, если окислительный стресс действительно включен в механизм индуцированной антибиотиками клеточной смерти, дефекты тиоловых редокс-систем, связанные с мутациями, также как изменения редокс-статуса клеток при температурных стрессах, должны существенным образом влиять на чувствительность бактерий к антибиотикам.

Цель настоящей работы - изучение роли тиоловых редокс-систем при действии экстремальных температур и антибиотиков у Escherichia coli.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние мутаций по основным компонентам тиоловых редокс-систем на рост, способность к биопленкообразованию, редокс-статус клетки, активность антиоксидантных ферментов и экспрессию антиоксидантных генов при оптимальной температуре роста бактерий и при температурных стрессах.

2. Исследовать влияние мутаций по генам, кодирующим основные компоненты тиоловых редокс-систем, на устойчивость Е. coli к антибиотикам различной природы при оптимальной температуре роста и в комбинации с действием экстремальных температур.

3. Изучить влияние искусственных изменений уровней тиолов в культуральной среде и в клетках (за счет внесения в среду глутатиона, его предшественников и SH-реагентов) на адаптацию бактерий к антибиотикам.

Научная новизна

Впервые для исследования влияния изменений редокс-статуса на антибиотикорезистентность бактерий Е. coli использован изогенный ряд мутантов по тиоловым редокс-системам с широким спектром антиоксидантных свойств.

Впервые установлено, что зависимость чувствительности бактерий к антибиотикам от температуры в диапазоне от 20°С до 46°С имеет вид V-образной кривой с максимумом чувствительности при 44°С для ципрофлоксацина и 40°С для ампициллина и стрептомицина. В культурах дикого типа и большинства мутантов вид кривой не зависел от природы антибиотика и был тесно связан с изменением скорости роста бактерий при разных температурах культивирования. Максимум чувствительности бактерий к антибиотикам соответствовал области температур, в которой наблюдались наибольшие скорости роста.

Впервые показано, что мутации по компонентам тиоловых редокс-систем существенным образом влияют на чувствительность бактерий к антибиотикам. Характер влияния зависел от природы мутации, вида антибиотика и температуры культивирования и в значительной мере определялся скоростью роста бактерий.

Впервые установлено, что мутации по компонентам тиоловых редокс-систем модифицируют способность бактерий к образованию биопленок, изменяя интенсивность биопленкообразования, его зависимость от температуры и устойчивость к антибиотикам.

Теоретическое и практическое значение работы

С использованием мутантов по компонентам тиоловых редокс-систем и экзогенных добавок, модулирующих редокс-статус клетки, получены новые данные о роли изменений редокс-статуса в устойчивости Е. coli к антибиотикам. Эти данные вносят вклад в понимание механизмов убивания бактерий антибиотиками и могут быть использованы для повышения эффективности антибактериальных препаратов.

Исследование комбинированного действия антибиотиков и различных ростовых температур позволило определить температурную зону максимальной чувствительности бактерий к антибиотикам с различными внутриклеточными мишенями.

Большой теоретический и практический интерес представляет обнаружение влияния тиоловых редокс-систем на формирование биопленок, чрезвычайная устойчивость которых к повреждающим факторам внешней среды и антибиотикам составляет существенную медицинскую и техническую проблему.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Используемые в работе мутанты Е. coli по компонентам тиоловых редокс-систем имеют резко выраженные различия в содержании глутатиона, уровне индукции антиоксидантных генов и ферментов и устойчивости к пероксидному стрессу.

2. Модуляция редокс-статуса клеток вследствие мутаций по компонентам тиоловых редокс-систем или путем искусственных добавок тиолов и SH-реагентов приводит к изменениям антибиотикорезистентности, характер которых в значительной мере определяется изменениями скорости роста бактерий.

3. Комбинированное действие экстремальных температур и антибиотиков способствует повышению антибиотикорезистентности всех изученных штаммов Е. coli, что, по-видимому, связано со снижением скорости роста в условиях температурного стресса.

4. Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем модифицируют способность бактерий к образованию биопленок, изменяя интенсивность биопленкообразования, его зависимость от температуры и устойчивость к антибиотикам.

Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на Региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых, «Химия, экология, биотехнология» (Пермь, 2013) и VII Всероссийском Конгрессе молодых биологов «Симбиоз-Россия-2014» (Екатеринбург, 2014).

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 140 страницах печатного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 13 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, трех глав собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 216 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора

Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды» (номер госрегистрации 01201353249). Исследования поддержаны грантом Программы МКБ Президиума РАН №12-П-4-1013 «Роль изменений редокс-статуса среды и периплазмы во внутри- и межклеточной сигнализации при стрессах у бактерий» и грантом РФФИ-Урал №1304-96039 «Роль тиоловых редокс-систем при комбинированном действии экстремальных температур и антибиотиков у бактерий Escherichia coli».

Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы. При выполнении исследований использовалась библиотека делеционных мутантов Escherichia coli (Keio collection) по генам gshA (первый фермент синтеза глутатиона, JW2663), gor (глутатионредуктаза, JW3467), trxA (тиоредоксин I, JW5856), trxB (тиоредоксинредуктаза, JW0871), grxA, grxB (глутаредоксины А и В, JW0833 и JW1051, соответственно) и их родительский штамм (BW25113). Кроме того использовались двойные мутанты gshAtrxA и gortrxB и штаммы, содержащие одновременно соответствующие мутации и слияния промоторов генов katG и sod А со структурным геном lacZ, кодирующем ß-галактозидазу, сконструированные в Лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН.

Среды и условия культивирования.

Бактерии Е. coli выращивали на минимальной среде М9 (Miller, 1972) с добавлением 0,15% глюкозы и антибиотиков, к которым был устойчив исследуемый штамм (канамицин или ампициллин). В необходимых случаях использовалась также среда LB.

После центрифугирования клетки из ночной культуры ресуспендировали в 100 мл свежей среды до значения оптической плотности при 600 нм 0,1 и далее выращивали при 37°С в колбах объемом 250 мл в термостагируемом орбитальном шейкере (Россия) при частоте вращения 150 об/мин. В середине логарифмической фазы (ODeoo = 0,5) бактерии обрабатывали сублетальными концентрациями исследуемых антибиотиков (ципрофлоксацин, ампициллин, стрептомицин) и в течение двух часов следили за ростом по изменению ODöoo. В экспериментах с комбинированным действием экстремальных температур и антибиотиков температурный стресс производили за 1 час до добавления антибиотика.

Определение устойчивости бактерий к стрессовым воздействиям. Удельную скорость роста культуры (ц) рассчитывали по формуле:

H=(lnODt2-lnODti)/t2-ti, где ODt2 и ODn — оптические плотности культуры в моменты времени ti и ti, соответственно, измеренные при длине волны 600 нм.

Колониеобразующую способность определяли через 0, 30, 60 и 120 мин после добавления антибиотика или начала температурного стресса методом высева на Чащки Петри с LB-агаром по стандартной методике (Методы общей бактериологии, 1983).

Минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков определяли методом серийных разведений на среде LB и в минимальной среде М9 с добавлением 0,15% глюкозы.

Способность бактерий к образованию биопленок исследовали в 96-луночных полистирольных планшетах с использованием микропланшетного спектрофотометра xMark Bio-Rad (США). Для приготовления клеточной суспензии бактерии из ночной культуры центрифугировали и ресуспендировали в 5 мл среды М9 (0,4% глюкозы) с добавлением 0,2% казаминовых кислот и тиамина (10 мкг/мл) до значения оптической плотности ODeoo = 0,1. Интенсивность

биопленкообразования оценивали по степени окрашивания биопленок генцианвиолетом (Naves et al., 2008).

Подвижность бактерий определяли по методике, описанной ранее (Pittman et al., 2002).

Внутри- и внеклеточную концентрацию глутатиона определяли спектрофотометрически высокочувствительным циклическим методом с глутатионредуктазой (Tietze, 1969) в последовательности, описанной ранее (Smirnova et ai, 2000).

Уровень дисульфидов в белках измеряли спектрофотометрическим методом как описано Chen et al., 2008.

Определение концентрации перекиси водорода осуществляли с использованием высокочувствительного флуоресцентного метода (Seaver and Imlay, 2001).

Определение активности каталаз проводили спектрофотометрическим методом (Visick and Clark, 1997). Каталазную активность определяли по убыли известной концентрации Н2О2 за 1 минуту при 240 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC (Япония). Расчет активности проводили по формуле:

(1000 х ДА240 /мин) / (43,6 х мг белка/мл реакционной смеси) Концентрацию белка в супернатанте определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Определение экспрессии антиоксидантных генов проводили по измерению активности ß-галактозидазы в клетках репортерных штаммов Е. coli, несущих слияния гена lacZ с промоторами исследуемых генов, по методу Миллера (Miller, 1972).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика бактерий Escherichia coli, мутантных по тиоловым редокс-системам. Определение ростовых характеристик штаммов Е. coli, несущих мутации по компонентам тиоловых редокс-систем, показало, что мутанты gor, grxA, trxA, trxB и gortrxB росли с более низкой, а мутант gshA - с более высокой удельной скоростью, чем клетки родительского штамма (Табл.1). Двойные мутанты и мутант, лишенный глутатиона (gshA), демонстрировали пониженную выживаемость на твердом агаре. Исследованные мутанты имели существенные различия в содержании внутри- и внеклеточного глутатиона и дисульфидов в белках. Наибольшие уровни внеклеточного глутатиона (GSHout) наблюдались в мутантах, дефицитных по обеим оксидоредуктазам (штаммы gor и gortrxB). Во всех штаммах, за исключением gshA, уровень дисульфидов в белках был от 2 до 12,7 раз выше, чем в клетках дикого типа, что свидетельствует о наличии дисульфидного стресса. За исключением gshA, gshAtrxA и gortrxB, все мутанты накапливали больше перекиси водорода в среде, чем родительский штамм.

Кроме gshA мутанта, все исследуемые штаммы, особенно двойные мутанты gshAtrxA, gortrxB, имели более высокие показатели по таким параметрам как активность каталаз HPI и HPII, экспрессия katGr.lacZ и устойчивость к пероксидному стрессу по сравнению с бактериями родительского штамма (Рис. 1, 2, 3). Наблюдалась сильная прямая корреляция между устойчивостью мутантов к пероксиду и активностью каталаз HPI и HPII и экспрессией katGr.lacZ (г = 0,93, 0,95 и 0,83, соответственно).

Таблица I.

Физиолого-биохимические свойства мутантов Е. coli по тиоловым редокс-

системам

Штаммы ц, ч"1 Survival, % GSHout, мкМ/ODioo GSHin, mkM/ODöoo S-SproL mkM/ODöoo H2O2, MKM

BW25113 (wt) 0,61±0,01 (1) 100±2,5 1,43 ±0,13 (1,0) 6,49 ± 0,43 (1,0) 0,71±0,09 0,32±0,02 (1,0)

JW2663 (gshA) 0,7±0,01* (1,15) 83±2* 0 0 0,75±0,11 (1,06) 0,24±0,03 (0,73)

JW3467 (gor) 0,54±0,01* (0,89) 96±4 2,78 ±0,35* (1,94) 7,07 ± 0,37 (1,09) 5,4±0,55* (7,6) 0,58±0,03* (1,76)

JW0833 (grxA) 0,57±0,01* (0,93) 91±6 2,23 ±0,25* (1,56) 7,36 ± 0,63 (1,13) 1,45±0,23* (2,04) 0,42±0,03* (1,27)

JW1051 (grxB) 0,58±0,01 (0,95) 109±7 1,71 ±0,08 (1,2) 7,14 ±0,43 (1,1) 4,55±0,58* (6,4) 0,46±0,03* (1,39)

JW5856 (trxA) 0,53±0,01* (0,87) 105±3 1,27 ±0,05 (0,89) 4,78 ±0,18* (0,74) 5,6±0,4* (7,9) 0,51 ±0,04* (1,55)

JW0871 (trxB) 0,56±0,01* (0,92) 107±4 1,98 ±0,15* (1,38) 6,47 ± 0,42 (1,0) 6,05±0,6* (8,5) 0,42±0,03* (1,27)

NM3655 (gshAtrxA) 0,63±0,01 (1,03) 66±2* 0 0 9,0±1,0* (12,7) 0,07±0,01* (0,24)

NM3761 (gor/rxB) 0,52±0,01* (0,85) 85±2* 4,83 ±0,14* (3,38) 9,12 ±0,43* (1,41) 6,2±0,62* (8,7) 0,36±0,06 (1,09)

В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. 100% выживаемости соответствует числу КОЕ в штамме дикого типа при 00боо=0,5. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (Р<0,05).

□ HPI шнри

* » * * * •« . FDg . ITte, F^a. FTBS, Ivffl.

4 / / ^ # / / / *

Рис.1. Активность гидропероксидаз HPI и HPII у мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам (в мкМ/минхмг белка).

2000 _ 1800 s 1600 5 1400

У 1200 | 1000 <j 800 | 600 | 400

I 200

о

Рис.2. Экспрессия гена katG у мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам (в ед. Миллера).

Время, мин

—■—gshfi —*—trxA —I— (лев —л—gshAtrxA —•— gortr/B

Рис. 3. Удельная скорость роста мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам при пероксидном стрессе (2 мМ).

Таким образом, использованные в работе изогенные мутанты по тиоловым редокс-системам демонстрируют широкий спектр антиоксидантных свойств и являются удобной моделью для изучения роли окислительного стресса при температурных стрессах и действии антибиотиков.

Роль тиоловых редокс-систем в ответе бактерий Escherichia coli на температурные стрессы. При быстром изменении ростовой температуры до 20°С или 46°С наблюдалось значительное ингибирование роста у всех изученных штаммов (Рис. 4). При изменении температуры культивирования в большинстве случаев наблюдалась тенденция к увеличению выживаемости при снижении температуры до 20°С и к ее уменьшению при 46°С (Рис. 4). Наличие мутаций gshAtrxA и gortrxB приводило к снижению выживаемости по сравнению с диким типом при всех ростовых температурах. Мутант trxA был более устойчив, чем родитель, при 46°С.

и

Я wt OgshA а дог ОдгхА ШдгхВ OtrxA mtrxB □ gshAtrxA Я gortrxB

ukL

20°c 37 "с 40°c 46°c

20°c 37°c 40°c

Рис. 4. Удельная скорость роста (А) и выживаемость (Б) мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам через час после начала воздействия различными температурами.

Ранее было показано, что температурные стрессы у бактерий Е. coli, сопровождаются явлениями, характерными для окислительного стресса, и их антиоксидантные системы вносят вклад в устойчивость клеток к температурным воздействиям. Было отмечено, что резистентность к тепловому и холодовому шоку определяется разными компонентами антиоксидантной защиты (Aldsworth et al., 1999, Phadtare and Inouye, 2004, Smirnova et al., 2007, Gunasekera et al., 2008).

Только у двойных мутантов переход от 37°С к 20°С сопровождался обратимым повышением продукции Н2О2, что наиболее резко было выражено в штамме gortrxB, где концентрация пероксида водорода возрастала в 2 раза (Рис. 5). Тепловой стресс от 37°С до 46°С приводил к увеличению концентрации Н2О2 в средеу мутантов gshA, grxA и grxB в 1,4 - 2,4 раза (Рис. 5). В противоположность этому, оба двойных мутанта в этих условиях демонстрировали значительное снижение накопления Н2О2 в среде. При 37°С все тиоловые мутанты (кроме gshA и trxA) имели более высокую активность каталазы HPI и повышенный уровень экспрессии кодирующего этот фермент гена katG (Рис. 6). Холодовой стресс сопровождался значительным возрастанием экспрессии katG у двойных мутантов, что согласуется с увеличением у них продукции I I2O2 в этих условиях. При тепловом стрессе наблюдалось снижение экспрессии гена katG у мутантов gor, grxA, grxB относительно их уровня при 37°С (Рис. 6). При температуре 37°С двойные мутанты и мутанты по обоим глутаредоксинам проявляли пониженный уровень экспрессии гена sodA, кодирующего Мп-супероксиддисмутазу, по сравнению с клетками дикого типа (Рис. 6). Холодовой стресс приводил к повышению, а тепловой стресс — к понижению экспрессии sodA у всех изученных штаммов относительно уровня экспрессии при оптимальной температуре. При этом мутанты gshAtrxA, gortrxB, grxA, grxB и trxA демонстрировали пониженный уровень экспрессии sodA по сравнению с диким типом при обоих температурных стрессах.

В целом, анализ данных о продукции Н2О2 и экспрессии антиоксидантных генов показывает, что производство оксидантов может увеличиваться при изменении температуры культивирования в обе стороны от оптимума, при этом антиоксидантная защита возрастает при холодовом стрессе и снижается при тепловом стрессе. Это согласуется с общей тенденцией к повышению выживаемости исследованных штаммов при 20°С и ее снижением при 46°С относительно оптимальной температуры 37°С.

Рис. 5. Продукция пероксида водорода у мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам при холодовом шоке 20°С и тепловом шоке 46°С.

экспрессия sodA::lacZ

Рис. 6. Экспрессия антиоксидантных генов katG и sodA у мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам через час экспозиции к экстремальным температурам (в ед. Миллера).

Роль тиоловых редокс-систем в ответе бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков. Мутанты по компонентам тиоловых редокс систем по-разному влияли на направление и степень изменений чувствительности бактерий Е. coli к антибиотикам (Рис. 7). Характер влияния зависел от типа мутации и антибиотика. Большинство мутантов были более устойчивы ко всем тестируемым антибиотикам, чем клетки родительского штамма. Штаммы, несущие мутации по генам gor, grxB и trxB демонстрировали повышенную устойчивость ко всем антибиотикам. В противоположность этому, двойной мутант gshAtrxA был более чувствителен во всех случаях. Штамм, дефектный по тиоредоксину 1 был полностью устойчив к ампициллину, но не к другим антибиотикам. В этих же условиях штамм Е. coli JW2663 (gshA) был более чувствителен к ципрофлоксацину и ампициллину, но более устойчив к стрептомицину, чем клетки родительского штамма.

Время, мин Время, мин Время, мин

Рис. 7. Выживаемость мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам в течение двух часов экспозиции к ципрофлоксацину (3 мкг/мл), ампициллину (10 мкг/мл) и стрептомицину (30 мкг/мл) при 37°С.

В целом, полученные данные больше согласуются с гипотезой о влиянии конкретных компонентов клеточных редокс-систем на уровне специфических мишеней для каждого антибиотика, чем с их участием в защите от индуцированного антибиотиками окислительного стресса.

Статистический анализ не выявил значимой корреляции между чувствительностью мутантов ко всем трем антибиотикам и их устойчивостью к пероксидному стрессу. В то же время показаны высокие обратные корреляции между удельной скоростью роста бактерий в момент добавления антибиотика и устойчивостью к ципрофлоксацину и ампициллину (г = - 0,93, и г = - 0,8, соответственно, Р<0,05). Наблюдалась также высокая прямая корреляция между выживаемостью бактерий в присутствии ципрофлоксацина и уровнем внутри- и внеклеточного глутатиона (г = 0,82 и 0,92, Р<0,05). Наличие этой корреляции и повышенная чувствительность gshA мутанта к ципрофлоксацину и ампициллину обусловили необходимость изучения влияния искусственной модуляции уровня GSH на антибиотикорезистентность при помощи экзогенных добавок.

В качестве таких добавок использовали восстановленный и окисленный глутатион, цистин, цистеин, валин и N-этилмалеимид (NEM). Цистеин является лимитирующим предшественником в биосинтезе GSH. Добавление валина в среду М9 ингибирует синтез белка у Е. coli, что увеличивает пул свободного цистеина в цитоплазме и, в конечном счете, приводит к повышению уровня GSH. NEM вызывает обратный эффект, снижая уровень GSH в цитоплазме.

Добавление GSH в среду М9 за 15 минут до антибиотиков не оказывало влияния на бактерицидное действие ципрофлоксацина, значительно защищало от действия стрептомицина и усиливало эффект ампициллина (Табл. 2). При культивировании на среде LB (без добавок), бактерии Е. coli росли в 2,6 раза быстрее и были на 2-3 порядка более чувствительны ко всем антибиотикам, чем на среде М9 (Табл. 2). В этих условиях предобработка клеток GSH повышала устойчивость к антибиотикам от 50 до 16000 раз. Защитное действие оказывал также окисленный глутатион, указывая на то, что влияние глутатиона не зависело от его редокс-свойств (Табл. 2). Следует отметить, что предобработка Е. coli GSH и GSSG в среде LB значительно снижала скорость роста бактерий в отличие от среды М9, где этот эффект отсутствовал.

Предобработка Е. coli BW25113 (wt) цистеином, цистином, валином и NEM на среде М9 снижала скорость роста и, в той или иной мере, защищала бактерии от всех исследованных антибиотиков (Табл. 3). Протекторное действие не было связано с окислительно-восстановительными свойствами или способностью изменять уровень глутатиона, поскольку аналогичный эффект наблюдали у gshA мутанта (Табл. 3). Более того, предобработка клеток Е. coli цистеином и цистином, которые усиливают гибель клеток при пероксидном стрессе по механизму Фентона (Park and Imlay, 2003, Смирнова с соавт., 2005), способствовала снижению чувствительности ко всем антибиотикам на среде М9 (Табл. 3), указывая на отсутствие типичного окислительного стресса в этих условиях.

Как и в случае с мутантами по тиоловым редокс-системам, были выявлены тесные обратные корреляции между чувствительностью к ципрофлоксацину и ампициллину, с одной стороны, и скоростью роста после предобработки различными соединениями, с другой (г = - 0,985 и - 0,89, соответственно, Р<0,01).

Таблица 2.

Влияние предобработки бактерий Е. соП В\\^25113 глутатионом на рост и устойчивость к антибиотикам

Среда М91 LB2

Добавки Контроль3 GSH Контроль GSH GSSG

Число колониеобразующих единиц через 60 минут после добавления антибиотика к предобработанным клеткам (КОЕ,'Ю5/мл)

Ципрофлоксацин 22,5±2,1 22,5±1,7 0,4±0,2 39,6±9,6 3,5±0,5

Ампициллин 1730±130 311±33 6,9±0,9 391±116 39,7± 11,4

Стрептомицин 422±7 2720±130 0,2±0,02 3190±30 3990±220

Удельная скорость роста в отсутствии добавления антибиотика (ц. ч

0,5±0,02 0,5±0,02 1,3±0,03 0,4±0,01 0,75±0,04

1 - ЮмМ GSH добавляли за 15 минут до обработки антибиотиком.

2 - ЮмМ GSH или 5мМ GSSG добавляли за 15 минут до обработки антибиотиком.

3 - без предобработки.

3 мкг/мл ципрофлокеацина, 10 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл стрептомицина добавляли при OD6oo = 0,5.

Таблица 3.

Влияние экзогенных соединений, изменяющих уровень глутатиона. на рост и устойчивость бактерий Е. coli к антибиотикам

Добавки_ Контроль1 Цистеин ] Цистин NEM__j Валин___

__" " BW25113 (wt)_

Число колониеобразующих единиц через 60 минут после добавления антибиотика к _ предобработанным клеткам (КОЕ,»ЮУмл)

Ципрофлоксацин 22,5±2,1 45,2±0,5 43,6±1,9 873±33 384±54

Ампициллин 1730±130 3210±160 3400±220 2200±340 3880±540

Стрептомицин 422±7 5370±340 5480±220 2090±380 5540±80

Удельная скорость роста в отсутствии добавления антибиотика (ц, ч- )

0,5±0,02 0,3±0,01 0,3±0,01 -0,1±0,03 0,15±0,01

JW2663 (gshA)

Число колониеобразующих единиц через 60 минут после добавления антибиотика к предобработанным клеткам (КОЕ,-Ю5/мл)

Ципрофлоксацин 15,3±2,1 65,4±0,8 17,7±0,7 647±87 303±23

Ампициллин 1046±4 3610±160 3370±170 2770±6 2950±60

Стрептомицин 920±10 4640±160 2280±150 3710±280 4570±100

Удельная скорость роста в отсутствии добавления антибиотика (ц, ч1)

0,55±0,02 0,12±0,02 0,36±0,01 0,01 ±0,02 0,11±0,01

1 - без предобработки.

2мМ цистеина, 1мМ цистина, 0,1мМ или 0,02мМ ЫЕМ, 0,5 мг/мл валина добавляли за 15 минут до обработки антибиотиком. Концентрация ЫЕМ для gshA мутанта была в пять раз ниже, чем у родительского штамма, поскольку высокое содержание ЫЕМ убивало клетки gshA мутанта.

3 мкг/мл ципрофлокеацина, 10 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл стрептомицина добавляли при

СЮбоо = 0,5.

Комбинированное действие антибиотиков и температурных стрессов.

Зависимость устойчивости бактерий родительского типа (BW25113) к антибиотикам от температуры имеет вид V-образной кривой с максимумом чувствительности при 44°С для ципрофлоксацина и 40°С для ампициллина и стрептомицина, т.е. в области оптимальных ростовых температур и, соответственно, наиболее высоких скоростей роста (Рис. 9). Для BW25113 вид кривой не зависел существенно от природы антибиотика. Обнаружена обратная связь между выживаемостью бактерий при разных температурах и значением удельной скорости роста (р.) перед добавлением антибиотика. Коэффициенты корреляции между р. и log КОЕ составляли -0,96 для ципрофлоксацина, -0,94 для ампициллина и -0,90 для стрептомицина.

Рис. 9. Влияние температуры культивирования на удельную скорость роста и

чувствительность Е. coli BW25113 к ципрофлоксацину, ампициллину и стрептомицину.

0 -1-1-1-1-1-1- о

20 24 30 37 40 44 46 температура, °С

Общий У-образный вид зависимости чувствительности бактерий к антибиотикам от температуры сохранялся у мутантов по компонентам тиоловых редокс-систем, однако наблюдались изменения, связанные с видом мутации и типом антибиотика (Рис. 10). В случае ампициллина и тепловой и холодовой стресс почти полностью предотвращали гибель бактерий, связанную с действием антибиотика. Такой же эффект наблюдался при обработке клеток стрептомицином в условиях холодового стресса. При тепловом стрессе, наряду с общим повышением выживаемости относительно той, которая наблюдалась при 37°С, менялся профиль зависимости устойчивости к стрептомицину от вида мутации, в частности, возрастала чувствительность мутантов, лишенных глутатиона и глутаредоксина 1. 11ри воздействии ципрофлоксацина в условиях холодового стресса все штаммы становились менее устойчивыми относительно родительского. При тепловом стрессе сильнее всего возрастала чувствительность к ципрофлоксацину у мутанта, лишенного тиоредоксинредуктазы. У двойных мутантов максимум чувствительности к ципрофлоксацину наблюдался при более низкой температуре, чем у бактерий дикого типа (37°С вместо 44°С).

ципрофлоксацин, Змкг/мл

Рис. 10. Выживаемость мутантов Е. coli по тиоловым редокс-

системам в присутствии антибиотиков при

температурных стрессах.

ампициллин, 10 мкг/мл

□ gshA

□ gor

□ дгхА »grxB

□ trxA

□ gshAtrxA и gortrxB

стрептомицин, 30 мкг/мл

■ wt

□ gshA и gor

□ дгхА шдгхВ В trxA я trxB

в gshAtrxA ш gortrxB

Роль тиоловых редокс-систем в биопленкообразовании у бактерий Е coli при температурных стрессах и действии антибиотиков. Одной из важнейших стратегий выживания бактерий при неблагоприятных условиях является способность к образованию биопленок (Mah et ai, 2003, Николаев и Плакунов, 2007). Мы исследовали способность к биопленкообразованию мутантов по компонентам тиоловых редокс-систем в диапазоне температур 20°С - 46°С (Рис. 11). Было установлено, что при 24°С и 44°С, то есть вблизи границ температурного диапазона роста Е. coli, у клеток родительского штамма резко возрастает способность к биопленкообразованию. Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем значительно влияли на зависимость биопленкообразования от температуры, вплоть до изменения характера зависимости на противоположную родительскому штамму у двойного мутанта gshAtrxA (Рис. IIA). Отсутствие глутатиона в gshA мутантах существенно снижало биопленкообразование при всех тестированных температурах. Мутанты по генам gor, trxA, grxA и grxB проявляли повышенную способность к биопленкообразованию в диапазоне температур 30°С-40°С, но утрачивали характерные для родителя максимумы при 24°С и 44°С (Рис. 11Б).

gshAtrxA

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Температура, °С

- «- ■ дог --к - дгхА х дгхв ■■■*■ trxA • gortrxB

Рис. 11. Удельное биопленкообразование мутантов Е. coli по тиоловым редокс-системам диапазоне температур 20°С-46°С.

CD о

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

Температура, °С

Внесение в среду соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, модулировало биопленкообразование в культуре дикого типа. Кверцетин и танин стимулировали, а глутатион ингибировал этот процесс (Рис. 12).

Ранее было показано, что в аэробных условиях полифенолы таннин и кверцетин способны к аутоокислению с образованием Н2О2. Присутствие этих соединений в культуральной среде приводило к повышению экспрессии OxyR-контролируемого гена katG, кодирующего каталазу HPI (Smirnova et al., 2009, Samoilova et al., 2014). Под контролем транскрипционного регулятора OxyR, отвечающего на пероксидный стресс, находится также малая регуляторная РНК OxyS (Altuvia et al., 1997). Недавно было сообщено, что OxyS снижает экспрессию генов flhDC, ингибируя тем самым продукцию флагелл и подвижность бактерий и стимулируя процесс формирования биопленок (De Lay and Gottesman 2012). Кроме эффекта на подвижность, OxyS оказывает непрямое ингибирующее влияние на

уровень RpoS (Zhang et al., 1998), регулирующего экспрессию многих генов, вовлеченных в биопленкообразование. Более того, Ag43. большой протеин наружной мембраны, который необходим для формирования биопленок на различных поверхностях, также регулируется OxyR (van der Woude and Henderson, 2008).

Таким образом, стимуляция биопленкообразования в присутствии кверцетина или таннина может быть связана с окислительным стрессом, возникающим в результате накопления АФК при их аутоокислении. и индукцией антиоксидантных генов, особенно тех, которые принадлежат к OxyR регулону. Если кверцетин и таннин стимулируют образование биопленок за счет своего прооксидантного действия, то GSH может ингибировать этот процесс благодаря антиоксидантным свойствам.

Рассмотренный механизм может действовать и в случае с мутантами. Все мутанты, у которых наблюдалась стимуляция образования биопленок при температуре 37°С (gor, trxA, gshAtrxA, gortrxB, grxA и grxB), имели высокий уровень дисульфидов в белках, повышенную экспрессию гена katG и активность каталазы НР1 (Табл.1, Рис.1). Они также проявляли пониженную по сравнению с родительским штаммом подвижность в полужидком агаре. Можно предположить, что дисульфидный стресс и экспрессия OxyR-регулона могут вносить вклад в стимуляцию биопленкообразования и у мутантов по тиоловым редокс-системам.

В культурах дикого типа ципрофлоксацин и стрептомицин значительно снижали валовый уровень биопленок, но не влияли на удельное биопленкообразование (SBF), рассчитанное на единицу биомассы в планктоне. Ампициллин практически полностью подавлял SBF (Рис. 13). В отличие от родительского штамма, обработка ампициллином мутантов по генам gor, grxB, gshAtrxA и gortrxB значительно повышала их способность к биопленкообразованию, причем наблюдалась высокая прямая зависимость между SBF в присутствии ампициллина и уровнем дисульфидов в белках. В отличие от ампициллина, мутации по компонентам тиоловых редокс-систем мало влияли на биопленкообразование в присутствии ципрофлоксацина и ингибировали его при обработке стрептомицином (Рис. 13).

1 мм 5 |jm

Концентрация

Рис. 12. Способность к биопленкообразованию у родительского штамма Е. coli в присутствии глутатиона, кверцетина и таннина.

0,35 0,30 0,25

u. °.2°

m

<" 0,15

0,10 0,05 0,00

□ без антибиотика

□ 3 мкг/мл ципрофлоксацина Ы10 мкг/мл ампициллина

□ 30 мкг/мл стрептомицина

i

Рис. 13. Способность к биопленкообразованию у бактерий родительского штамма Е. coli и мутантов по генам gor, grxB, gshAtrxA, gortrxB при 37°C в присутствии антибиотиков.

дгхВ

gshAtrxA gortrxB

Интересно, что если при низких температурах в штамме дикого типа ампициллин подавлял биопленкообразование по сравнению с необработанными антибиотиком клетками, то при высоких температурах (40-44°С), наблюдалась стимуляция этого процесса (Рис. 14). Ципрофлоксацин усиливал биопленкообразование при низких температурах и при 46°С, а стрептомицин - в области низких температур и при 44°С.

30 37 40 температура, °С

Рис 14. Способность к биопленкообразованию у родительского штамма Е. coli в диапазоне температур 20°С-46°С.

Таким образом, изменение редокс-ситуации в клетке, вызванное мутациями и температурой, по-разному влияло на биопленкообразование в присутствии антибиотиков с разными внутриклеточными мишенями. Это указывает на то, что каждый из антибиотиков может иметь специфический механизм стимуляции или ингибирования этого процесса.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что используемые в работе одиночные и двойные мутанты Е. coli по компонентам тиоловых редокс-систем демонстрируют широкий спектр антиоксидантной активности (экспрессия антиоксидантных генов, активность каталаз, уровень глутатиона) и различную устойчивость к пероксидному стрессу. Это делает их удобной моделью для изучения влияния указанных параметров при ответе бактерий на действие антибиотиков и температурные стрессы.

2. Установлено, что мутации по тиоловым редокс-системам значительно модулируют продукцию перекиси водорода и активность антиоксидантных генов katG и sodA при тепловом и холодовом стрессах и существенно изменяют устойчивость Е. coli к этим стрессам.

3. Показано, что мутации по компонентам тиоловых редокс-систем по-разному влияют на направление и степень изменений чувствительности бактерий Е. coli к антибиотикам с разными внутриклеточными мишенями. Характер влияния зависит от вида антибиотика и, в значительной мере, определяется скоростью роста бактерий перед его добавлением. Не выявлена связь между чувствительностью Е. coli к антибиотикам и устойчивостью бактерий к пероксидному стрессу.

4. Установлено, что предобработка родительских бактерий и мутанта, дефицитного по синтезу глутатиона, тиолами и SH-реагентами, значительно изменяет чувствительность к антибиотикам. Выживаемость бактерий в этих условиях не зависит от изменений редокс-статуса и коррелирует с изменением скорости роста бактерий, индуцированным экзогенными добавками.

5. При комбинированном действии температурных стрессов и антибиотиков для Е. coli родительского штамма и большинства мутантов выявлена характерная V-образная кривая зависимости выживаемости от ростовой температуры с максимумом чувствительности при 44°С для ципрофлоксацина и 40°С для ампициллина и стрептомицина, т.е. в области температур, соответствующих наиболее высоким скоростям роста.

6. Установлено, что мутации по компонентам тиоловых редокс-систем значительно изменяют интенсивность биопленкообразования и его зависимость от температуры. У всех мутантов, за исключением gshA и trxB, биопленкообразование повышается в области оптимальных ростовых температур. При комбинированном действии антибиотиков и температурных стрессов интенсивность биопленкообразования зависит от типа антибиотика.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Лепехина Е.В. Влияние температурных стрессов на действие ципрофлоксацина в культурах Escherichia coli / E.B. Лепехина, Г.В. Смирнова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 4/1 (38). - С. 38.

2. Samoylova Z. Médical plant extracts сап variously modify biofilm formation in Escherichia coli / Z. Samoylova, N. Muzyka, E. Lepekhina, O. Oktyabrsky, G. Smirnova II Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology. - 2014. - V. 105. - P. 709-722.

Публикации в других журналах и сборниках

1. Лепехина Е.В. Влияние температурных стрессов на устойчивость бактерий Е. coli к ципрофлоксацину / Е.В. Лепехина // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика-наука XXI века». - Уфа - 2011. - Т. 1. - №2. - С. 69-70.

2. Лепехина Е.В. Адаптация мутантов бактерий Escherichia coli по тиоловым редокс-системам к экстремальным температурам / Е.В. Лепехина, Н.Г. Музыка, Г.В. Смирнова // Материалы II Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации». -Екатеринбург.-2012.-С. 155-157.

3. Лепехина Е.В. Изучение роли тиоловых редокс-систем при комбинированном действии температурных стрессов и ципрофлоксацина у бактерий Escherichia coli (Электронный ресурс) / Е.В. Лепехина // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». - Москва. - 2012. - С. 1-2. - Режим доступа: http://lomonosov-msu.ru/rus/event/800/

4. Лепехина Е.В. Изучение роли тиоловых редокс-систем при комбинированном действии температурных стрессов и ципрофлоксацина у бактерий Escherichia coli / Е.В. Лепехина// Тезисы 16 международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2012. - С. 124-125.

5. Лепехина Е.В. Роль тиоловых редокс-систем в адаптации бактерий Escherichia coli к экстремальным температурам / Е.В. Лепехина, Н.Г. Музыка, Г.В. Смирнова // Тезисы докладов XIV Региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Химия, экология, биотехнология-2012». - Пермь. -2012.-С. 35-36.

6. Лепехина Е.В. Изучение способности к биопленкообразованию у бактерий Escherichia coli при комбинированном действии теплового шока и антибиотиков / Е.В. Лепехина // Тезисы докладов XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» секция «Биология». -Москва.-2013.-С. 199-200.

7. Лепехина Е.В. Влияние rpoS, relA и gshA мутаций на формирование биопленок в культурах Escherichia coli при тепловом стрессе / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова // Тезисы докладов 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино. - 2013. - С. 213.

8. Лепехина Е.В. Влияние антибиотиков на биопленкообразование бактерий Escherichia coli при тепловом стрессе / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова // Тезисы докладов XV Региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Химия, экология, биотехнология». - Пермь. - 2013 . - С. 47-48.

9. Лепехина Е.В. Изучение способности к биопленкообразованию у бактерий Escherichia coli при комбинированном действии температурных стрессов и антибиотиков / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова // Тезисы докладов VI Всероссийского с международным участием Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013». - Иркутск. - 2013. - С. 90-91.

10. Лепехина Е.В. Формирование биопленок в культурах Escherichia coli, имеющих rpoS, relA и gshA мутации, при температурных стрессах / Е.В. Лепехина,

Г.В. Смирнова // Тезисы докладов IX Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». -Москва.-2013.-С. 87-88.

11. Лепехина Е.В. Влияние тиоловых редокс-систем на накопление биомассы в планктоне и биопленках бактерий Escherichia coli при различных температурах культивирования / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский // Сборник статей пятой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». - Санкт-Петербург. - 2013. - Т.2. - С. 119-121.

12. Лепехина Е.В. Способность тиоловых редокс-систем модифицировать накопление биомассы в планктоне и биопленках бактерий Escherichia coli при температурных стрессах / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова // Тезисы докладов XVI Региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых, «Химия, экология, биотехнология». - Пермь. - 2014. - С. 45-47.

13. Лепехина Е.В. Адаптация мутантов бактерий Escherichia coli по тиоловым редокс-системам к комбинированному действию экстремальных температур и антибиотиков / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова // Тезисы докладов 18-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». - Пущино. - 2014. - С. 265.

14. Lepekhina E.V. Biofilm formation capacity in combined action of different temperatures and antibiotics on bacteria Escherichia coli / E.V. Lepekhina, G.V. Smirnova// Abstracts of the 4th Edition of International Scientific Conference «Future is ours». - Chisinau, the Republic of Moldova. - 2014. - P. 18.

15. Лепехина Е.В. Биопленкообразование бактерий Escherichia coli при комбинированном действии температурных стрессов и антибиотиков (Электронный ресурс) / Е.В. Лепехина // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2014». Москва. - 2014. - С. 1-2. Режим доступа: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2014/2468/2200_16471_lecc68.pdf

16. Лепехина Е.В. Роль тиоловых редокс-систем при действии антибиотиков на бактерии Escherichia coli в условиях температурных стрессов / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова // Материалы VII Всероссийского Конгресса молодых биологов «Симбиоз-Россия 2014». - Екатеринбург.-2014.-С. 126-128.

17. Лепехина Е.В. Действие антибиотиков на бактерии Е. coli, мутантные по тиоловым редокс-системам, при температурных стрессах / Е.В. Лепехина, Г.В. Смирнова // Ежемесячный научный журнал «EDUCATIO». Новосибирск. - 2014. -№4. - С. 74-75.

ЛЕПЕХИНА Елена Владимировна

РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС-СИСТЕМ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР И АНТИБИОТИКОВ

У ESCHERICHIA COLI

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 25.12.2014. Формат 60x90/16. Усл.печ.л. 1. Тираж 120 экз. Заказ Набор компьютерный

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13