Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь между Eh, низкомолекулярными тиолами и внутриклеточным пулом калия и ее роль в отклике бактерий на стрессы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь между Eh, низкомолекулярными тиолами и внутриклеточным пулом калия и ее роль в отклике бактерий на стрессы"

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУК

На правах рукописи

ОКТЯБРЬСКИЙ ОЛЕГ НИКОЛАЕВИЧ

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ЕИ, НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ТИОЛАМИ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫМ ПУЛОМ КАЛИЯ И ЕЁ РОЛЬ В ОТКЛИКЕ БАКТЕРИЙ НА СТРЕССЫ

03.00.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск 1995

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук И.А.Волчегорский доктор медицинский наук Н.А.Глотов доктор биологических наук В.С.Мархасин

Ведущая организация: Иститут микробиологии РАН

. уз

Защита состоится " " декабря 1995 г. в ^ час, на заседании специализированного совета Д-084.04.01 при Челябинском медицинском институте (454092 г. Челябинск, ул. Воровского, 64)

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Челябинского государственного медицинского института

Диссертация разослана " ^" ноября 1995 г.

Ученый секретарь специализированого совета профессор

Л.В.Кривохижина

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Общая характеристика работы:...................2

Глава 1. Материалы и методы................................................7

Глава 2. Eh, внутри- и внеклеточные тиолы к внутриклеточные пулы калия при стрессе голода.........10

2.1. Изменения Eh при стрессе голода.................10

2.2. Роль экстраклеточных тиолов в генерации

скачка Eh у E.colt и B.subtilis.................15

2.3. Внутриклеточные пулы тиолов и К+............... 19

Глава 3. Эффекты, связанные с изменениями ДРН и ее

компонентов.....................................20

3.1. Эффект искусственного изменения ДРН............. 20

3.2. Роль изменений в генерации скачка ни При стрессе голода..................................28

Глава 4. Отклик coli на тепловой шок.................,.32

Глава 5. Отклик E.coii На осмотический шок...............34

5.1. Eh и внеклеточные тиолы.........................34

5.2. Внутриклеточные тиолы и К+..................... .3?

5.3. Эффекты, связанные с действием бетаина..........40

Глава 6. Действие УФ-света и перекиси водорода...........47

Глава 7. Восстановление феррицианида клетками е.coït.....52

Глава 8. Закисление цитоплазмы у z.coit и s, typhimuri-uw.

снижает мутагенный эффект м~метил-и-нитро-

N-нитрозогуанидина..................... • • .......63

Глава 9, Модуляция экспрессии генов aidB и sulA при изменении внутриклеточного рН и уровней

небелковых тиолов..............................................67

Заключение.................................................74

Выводы.....................................................83

Список публикаций по теме диссертации......................85

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Слезинке за ростом и развитием микроорганизмов в современной биотехнологии и научном эксперименте включает в себя измерение и регистрацию параметров, характеризующих состояние микробных культур. К числу таких.параметров относится и окислительно-восстановительный потенциал (ОВП, редокс-потенциал, Несмотря на длительную историю изучения

еь в микробных культурах и его широкое использование, причины, вызывающие изменение Eh, не всегда ясны. Более углубленное изучение ситуаций, сопровождающихся изменением и механизмов, ответственных за такие изменения, позволит шире и осмысленнее использовать слежение за этим параметром б практике и эксперименте.

Анализ работ, рассмотренных в монографиях и обзорах Работ-новой И.Л. (1957), Хьювита (Hewitt, 1950), Джекоба (Jacob, 1970), показывает, что лучше изучены те ситуации, в которых главной причиной изменения Eh микробных культур было изменение pH среды или содержания таких редокс-активных газов как 02, Hj, С02. Менее изучена природа других эндогенных редокс-аген-тов, которые могут выделяться в среду и изменять Другой

важный вопрос, требующий изучения, касается механизмов, посредством которых Eh среды влияет на метаболизм микроорганизмов.

Мало изучены вопросы, касающиеся внутриклеточного Eh (Е|\) и внутриклеточных редокс-агентов, определяющих его значение. Важная роль в определении внутриклеточной редокс-ситуации может принадлежать низкомолекулярным тиолам и, в частности, трипептиду глутатиону (езЮ. У многих грамотрицательных бактерий внутриклеточная концентрация bsh колеблется в пределах 0.5-10 мМ и составляет не менее 95$ внутриклеточного пула низкомолекулярных ТИОЛОВ (Fahey et al-, 1978Ï. ЕСЛИ информация О роли глутатиона В клетках ЖИВОТНЫХ достаточно обширна (Meister, Anderson, 1983), то работ, посвященных изучению его функ-

ций у микрорганизмов, гораздо меньше. И хотя известно, что глутатион может выступать как восстанавливающий агент и де-токсикант, коэнзим и интермедиат в биосинтетических реакциях и транспорте веществ <Penn inekк, Jaspers, 1982) существует мнение о том, что главная функция глутатиона все еще неизвестна.

В последние годы опубликованы работы, указывающие на участие G3H в регуляции IC-ВЫХОДНЫХ каналов у Escherichia. coli (lieury, Kepes, 1982; Meury, Robin, 1990). Несомненно, ЧТО изучение роли gsh в этом процессе привлечет в ближайшее время внимание исследователей, поскольку хорошо известна исключительно важная роль трансмембранной циркуляции К+ в поддержании ГОМеОСТаза Внутриклеточного pH И ОСМОадаПТаЦИИ (Epstein, 1986; Kroll, Booth, 1931, 1983).

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования яв-лялялось изучение изменений редокс-потенциала (Eh) в культурах бактерий и факторов, ответственных за измененения Eh, а также изменений внутриклеточных пулов К+ и низкомолекулярных тиолов при различных переходных процессах для решения задач, связанных с проведением фундаментальных работ и управляемым культивированием микроорганизмов в биотехнологии.

Для достижения указанной целя были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения еь в чистых и смешанных культурах бактерий при разного рода стрессах;

2. Изучить влияние параметров среды (pH, содержание кислорода, ионный состав) и физиологического состояния клеток на изменения Eh при стрессах;

3. Исследовать вклад эндогенных редоке-активных веществ в изменения при отклике бактерий на стрессы;

4. Произвести синхронные измерения внутриклеточных пулов К, низкомолекулярных тиолов и sH~rpynn в белках при отклике на стрессы бактерий Escherichia coli;

5. Изучить влияние изменений внутриклеточных пулов низкомо-

пекулярных тиолов и внутриклеточного pH на экспрессию некоторых генов, участвующих В отклике Escherichia coli на стрессы.

Научная новизна. V бактерий Escherichia coli, Serratia таг-csscens, Bacillus subiilis j,| Bacillus nvegaterixim. обнаружены скачки Eh, при переходе клеток в стационарную фазу вследствие исчерпания источников углерода и энергии или аммония. Показано, что эти скачки Eh являются следствием увеличения количества тиолов с наружной стороны клеток.

Скачкообразное падение Eh, связанное с увеличением количества тиолов с наружной стороны клеток, обнаружено также у растущих Е-сои при обработках, ведущих к закислению цитоплазмы, при тепловом шоке, при окислительном стрессе, при воздействии ингибиторами белкового синтеза, при облучении растущих клеток высокими дозами УФ-света (2S0-4Q0 нм).

Повышение Eh, связанное со снижением количества зкстракле-точных тиолов, обнаружено при гиперосмотическом шоке е.соИ и при обработке клеток проникающим основанием тетрафенилфосфони-ем.

Выявлено два противоположных типа отклика внутриклеточных низкомолекулярных тиолов СНМТ) на стрессы. Понижение уровня низкомолекулярных тиолов, как первая реакция на воздействие, наблюдалось при закислении цитоплазмы ацетатом натрия, при действии непроникающего оксиданта феррицианида. при обработке бетаином клеток, растущих при повышенной осмолярност-и среды и повышенном pH среды или цитоплазмы. Повышение уровня внутриклеточных низкомолекулярных тиолов наблюдалось в ответ на щелочной шифт среды, облучение клеток ближним УФ-светом, действие Н20г.

Обнаружена корреляция между изменениями внутриклеточных уровней низкомолекулярных тиолов и калия на начальной Фазе отклика е. сои на стрессы.

Показано, что ген aidBt относящийся к семейству генов, откликающихся на обработку Е.сси алкилирующими соединениями, мо-

жет быть так»® индуцирован закислением цитоплазмы.

Установлено, что осмопротектор бетаин стимулирует рост, ускоряет выход К+ в среду и снижает внутриклеточный пул низкомолекулярных тиолов в клетках е.сои, растущих при повышенном рН среды или цитоплазмы. Бетаин также ускоряет снижение внутриклеточного пула низкомолекулярных тиолов в клетках, растущих при повышенной осмолярности среды.

Научно-практическое значение. Полученные в работе результаты позволят шире использовать непрерывное измерение окислительно-восстановительного потенциала в биотехнологии и в научно-исследовательской работе для оценки физиологического состояния бактерий и изучения отклика бактерий на стрессы.

Особый интерес представляет возможность обнаружения контаминации производственных и лабораторных культур посторонней микрофлорой посредством непрерывного слежения за

Полученные в работе результаты открывают возможность направленно изменять внутриклеточные уровни низкомолекулярных тиолов, используя этот прием для модуляции активности некоторых стрессовых генов а также для защиты клеток от повреждающего действия алкилирующих соединений.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Всесоюзном семинаре "Закономерности роста микроорганизмов" (Пущино, 1983); Всесоюзной конференции "Генетика и Физиология микроорганизмов - перспективных объектов генной инженерии" (Пущино, 1984); VII съезде ВМО (Алма-ата, 1985); IV Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов" (Пущино, 1986); Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск, 1987); Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов" (Пущино, 1987); Всесоюзном совещании "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино, 1988); Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989); Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов"( Пущино, 1989); международном симпозиуме

"Проблемы токсикологии и прикладной экологии" (Москва-Пермь, 1991); 21 Международной конференции EEMS по мутагенам и канцерогенам в окружающей среде (Прага, 1991); Международной конференции "Проблемы токсикологии и эпидемиологии" (Москва" -Пермь,1993); Международной конференции Environmental Pollution, IСЕР 95, St.Petersburg, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42- работы, из них 11 статей в журналах РАН, 8 статей в международных журналах, 1 изобретение, 7 статей в сборниках научных трудов и 15 тезисов.

Благодарности. Особую благодарность автор выражает к.б.н, Г.В. Смирновой, за поддержку и плодотворное сотрудничество на всех этапах данной работы.

хАвтор выражает благодарность проф. P.A. Пшеничнову за внимание и поддержку при проведении эспериментов, описанных в Главах 2 и 4.

Автор выражает благодарность чл.-корр. РАН профессору В. А. Черешневу за поддержку и помощь в работе в качестве научного консультанта.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории физиолог™ микроорганизмов, лаборатории химического мутагенеза ИЗГМ УрО РАН и лаборатории популяционной генетики ИЭРЖ УрО РАН, принимавшим участие в выполнении различных этапов данной работы.

Автор признателен д-ру М. Волкерту (США), д-ру К.Хиггинсу (Англия) и д-ру Т.Ниношибе (Япония) за любезное предоставление штаммов бактерий.

Цитируемая литература

1- Работнова И.Л., Роль физико-химических условий (pH и гн2) б жизнедеятельности микроорганизмов, 1957, АН СССР, М, с. 275.

2. Epstein W., FEMS Microbial. Rev., 1986, 39, p. 73-78.

3. Fahsy R.C., Brown M.C., Adams W.B. et al., J. Bactsriol. 197S, 133, p. 1126-1129.

4. Hewitt L.F., Oxidation-reduction potentials in bacteriology and biochemistry, 1950, Levingstone Ltd., Edinburh,

p. 215.

5. Jacob H.E. , Redox potenial, in Methods in Microbiology, V.2, 1970, p. 91-123.

6. Kroll R.G., Booth J.R., Bioehem. J.,19S1, 198, p. 691-69B.

7. Kroll R.G., Booth J.R., Biochein. J.,1983, 216, p. 709-716.

8. Meister A., Anderson M.E., Ann. Rev. Bioehem., 1983, 52, p. 711-760.

9. Meury J., Kepes A., EMBQ J., 1982, 1(3), p. 329-323.

10. Meury J., Robin A. , Arch. Microbiol., 1990, 154, p. 475-482.

11. Penninekx, Jaspers, Bull. Inst. Pasteur, 19S2, 80, p. 291-301.

Штаммы к условия культивитования. В экспериментах использовались следующие штаммы балтерий: Escherichia coli К12. M17, AS-1, B/r WP2, ABil57, Н.Б101, (НвСУЩИЙ ПЛаЗМИДУ pBr322), СР78, СР79, MV1563, MV1571. MV1601, DM4000, 821, 854, AN120, AN180, СН1366, Serratia marcesc&ns ВКМ-851, Bacillus s'ubtilis ВКМ-423, Вас il lus tnegate-rixm BKM-512, Salmonella typhimu-ri tun TA1535.

Бактерии выращивали на аппаратах Анкум-2 в Ферментерах с рабочими объемами 50-100 и 1000 мл. Необходимые уровни содержания кислорода поддерло-шали принудительной продувкой среды стерильным воздухом. Анаэробные условия создавали продувкой ферментера аргоном. Контроль парциального давления кислорода <р02> вели полярографическим способом с помощью мембранного датчика и измерителя рОа. Значение pH раствора устанавливали и

поддерживали на нужном уровне автоматически путем подачи в ферментер hci или NaOH. Измерение окислительно-восстановительного потенциала среды (редокс-потенциала, Eh> проводили непосредственно в ферментере гладким платиновым электродом ЭВГМ и вспомогательным хлорсеребряным электродом ЭВЛ^МЗ с помощью высокоомного преобразователя П205. Непрерывное измерение оптической плотности производили при помощи датчика оптической плотности Д0П-1М.

В качестве основной питательной среды использовалась солевая среда MS (Miiier, 1972). В качестве источников углерода и энергии использовали глюкозу, лактозу или глицерин. При культивировании ауксотрофных штаммов в среду М9 вносили либо необходимые аминокислоты, либо белковый гидролизат.

альную установку, состоящую из миниферментера с рабочим объемом 75 мл и проточной кюветы с кварцевым окном. Для облучения использовали источник широковолнового УФ-света. UVA и части спектра (290-380 нм> выделяли с помощью абсорбционного светофильтра. Мощность излучения после фильтра - 2,3 ы/и .

лов О*) проводили при помощи проникающих ионов тетрафенилфос-фония, ТФФ+, концентрация которых в клеточной суспензии измерялась при помощи селективного к ТФФ+ электрода (Гринюс с со-авт., I960) в термостатируемой и аэрируемой ячейке.

Количество белковых и небелковых 5н-ГРУПп измеряли по методу Sedlak, Lindsay, (1968). Для определения ВНуТрИКЛеТОЧНЫХ тиолов пробы отбирали путем центрифугирования при 10 тыс.об./-мин. i2 мин,), и хранили в жидком азоте до определения. Для анализа клетки разрушали ультразвуком при +4°С. Количество sh_ групп определяли по методу Эллмана (Eiiman., 1959). в предварительных опытах было обнаружено, что пул экстраклеточных низкомолекулярных тиолов очень лабилен и его величина быстро изменяется при изменении условий инкубации и в процессе подготовки образцов для анализа, поэтом:' для определения зкстракле-

точных тиолов, в том числе и г-лутатиона, пробы отбирали при помощи специально сконструированного для этой цели устройства, которое позволяло отбирать образцы прямо из ферментера, используя быструю Фильтрацию через мембранный фильтр.

Восстановленный и окисленный глутатион (Gsh, ssss) измеряли по методу Rietze (1969), с указанной выше модификацией.

Белок определяли по методу Лоури dowry et si., i95i).

Содержание внутриклеточного к' определяли на пламенном фотометре по методу Ileury, Kepes (1981). Образцы КУЛЬТУР быстро фильтровали через мембранный фильтр и отмывали раствором Naci с осмолярностью на 200 мМ выше, чем в экспериментальной среде.

Определение ^-галактозидазной активности выполняли по методу, описанному Миллером (Miller, 1972).

Феррииианид-редуктазная активность определялась спектрофо-тометрически по изменению поглощения при 420 нм образцов, из которых клетки извлекались быстрой фильтрацией через мембранный Фильтр, а также потенциометрическим способом (Hsdjipetrov

L.P., Gray-Young Т., Lilly И.О.,1966).

Мутагенная активность м-метил-^'-нитро-и-ниттозогуанидина <МННГ> определяли ПО числу his (S.typhimurixm) и trp (Г. со-1£) ревертантов, отнесенных к числу жизнеспособных клеток (Ames, McCann, Yamasaki,1975). Бактерии ВЫраИИВаЛИ На Чашках, содержащих агар с пептоном или глюкозо-солевой агар. До высева на чашки клетки инкубировали с мутагеном не менее чем 40 мин. при 37°С.

Количество жизнеспособных клеток определяли путем подсчета колоний, выросших на агаре с пептоном.

Цитируемая литература

i- Гринюс Л.Л., Даугелавичюс Р.Ю., Алькимавичюс Г.А.» Биохимия

1980, 45, с. 1609-1918.

2. Ames B.N., McCann a., Yamasaki Е., Mutât.Res. 1975, 31,

p. 347-363.

3. ElIman G.L., Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82, p. 70-77.

4. Hadjipetrov L.P., Gray-Young T., Lilly H.D., J.Gen. Microbiol., 1966, 45, p. 479-488.

5. Lowry G. , Rosebrough N., Randall R. , J. Biol. Chem.., 1951, 193, 265-275.

6. Meury J., Kepss A., Eur.J. Biochem., 1981, 119, p. 165-170.

7. Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory, NY.

S. Pedersen K., FEMS Microbiol. Letters, 1980, 12, p. 365-367.

9. Sedlak J., Lindsay R.H. , Anal.Biochem., 1968, 23, p.192-203.

10 Tietze F., Anal. Biochem., 1969, 27, p. 502-522.

Глава 2. ВНУТРИ- И ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ТИ0ЛЫ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПУЛЬ' КАЛИЯ ПРИ СТРЕССЕ ГОЛОМ.

2.1. Изменения ей при стрессе голода-

При слежении за изменениями окислительно-восстановительного потенциала (еь) в аэробных культурах е.соы были обнаружены скачки еь в область отрицательных значений, не связанные прямо с изменениями рН и парциального давления кислорода (р02) в среде. Эти скачки еь регистрировались при остановке роста бактерий вследствие исчерпания в среде глюкозы, лактозы или глицерина в том случае, когда каждый из них был лимитирующим субстратом и единственным источником углерода и энергии, а источником азота был аммоний (Рис. 1-3). Такой же скачок ей регистрировался при остановке роста, вызванной исчерпанием в среде аммония как единственного источника азота. Наиболее подробно был изучен переходный процесс при исчерпании в культуре е.сои глюкозы. Изменения ей в этой ситуации характеризуются следующими признаками.

1) Амплитуда и продолжительность скачка еь зависят от штамма СРис.2). Так продолжительность фазы падения Е'п в культуре

Время, час.

Рис. 1. Рост в периодической культуре с добавлением

субстрата и динамика ЕЬ и р02 при отсутствии принудительной аэрации.

1 - оптическая плотность, 2 - р02, Э - еь. Один из скачков ЕЪ показан на рис. 2 в развернутом масштабе. Стрелками показаны моменты добавления глюкозы.

Eh, мВ

Время, мин.

Рис. 2. Изменения Eh при остановке роста coli Kl2 (1), AS-i (2) и М17 (3) вследствие исчерпания глюкозы. Сплошные линии показывают изменение Eh при остановке роста без последующего добавления глюкозы, пунктирные -с добавлением глюкозы в моменты, указанные стрелками.

ЕЙ, мВ

Рис. 3. Изменения еь в культуре E-cc.li К12 при измерении редокс-потвнциала двумя электродами, один из которых был отделен от среды мембранным фильтром.

1 - оптическая плотность культура, 2 - ел, измеренный открытым электродом, 3 - ЕЙ, изморенный закрытым электродом. Стрелки показывают моменты добавления глюкозы.

1 —» 0,5 1.0 1,5

Время, час,

Рис. 4. Зависимость изменений Eh при остановке роста coLi от концентрации К4" в среде. 1 - Изменение оптической плотности при росте с. со и с 1СГ2 - 10"4 M К+ в среде. 2 - То же с 2x10"® M К+ в среде. 3 - изменения Eh при 10"2 - 10~4 M К+ в среде. 4 - то же при 2*10~6 M К+ в среде. Аэробные условия, pH 7. Стрелками показаны моменты добавления глюкозы.

E. coli К12 в среднем ОКОЛО 25 мин., у е- coli Ml 7 и AS-1 .10-12 шн. Продолжительность фазы повышения eh у е. сои к12 составляла 150 мин., у е. coli Mi7 и fts-i - 40-60 мин. Амплитуда скачка варьировала от 40 до 140 мБ. масимальное значение, зарегистрированное нами для е. coli k12 _ 150 ¡¿в.

2) Увеличение редокс-активности в момент скачка связано как с поверхностью клеток, тзя и с появлением в среде редокс-ак-тивннх веществ (Рис. 3).

3) Амплитуда скачка Eh зависит от свойств клеточной поверхности, она прямо пропорциональна количеству клеток у R-форм и мало зависит от плотности культуры у 3-форм е. coi i.

4) Амплитуда скачка Eh резко падает при снижении концентрации К+ в среде ниже 2хю мкМ (Рис. 4). Снижение концентрации Ca-1"2 и Na+ до следовых количеств не влияло на способность клеток Е-сои к генерации скачка Eh.

При диаукеийном росте е. coi i на смеси глюкозы и лактозы наблюдали два последовательных скачка Eh, исчерпание глюкозы сопровождалось падением Eh- повышение ен происходило при возобновлении роста на лактозе.

Скачок Eh при исчерпании в среде глюкозы или другого источника углерода и энергии не наблюдался в культурах ауксотофных штаммов е.сои. растущих на сложных средах, содержащих мясо-пептонный бульон или протеиновые гидролизаты. Однако, если ауксотрофные штаммы выращивались на среде м<? с добавлением лишь необходимых аминокислот, то при исчерпании в среде той из аминокислот, которая находилась в ограниченном количестве, также наблюдался скачок Eh. Такой же скачок Eh наблюдался при воздействии на растущие клетки ингибиторов синтеза белка или валина (Раздел 5.1 и рис. 22).

Особый интерес представляет поведение Eh в смешанных культурах е. coi i М-17 и s. marsesasns. При совместном культивировании е. coli и s.marcescens При каждой остановке роста, связанной с исчерпанием глюкозы, наблюдали не понижение Eh, как в ЧИСТОЙ культуре S.marcescens, а ПОВЫШвНИе Eh (Рис. 5,5)- Это

Время, час.

Рис. 5. Параметры переходного процесса в аэробных КУЛЬТУРаХ ^.татсеанепа.

1 - рН, 2 - р02, 3 - еь. Сплошными линиями и штрихами показаны два варианта изменений параметров. Рамка вверху показывает продолжительность роста на глюкозе после добавления ее в моменты, указанные стрелками.

Рис. 6. Параметры переходного процесса в смешанной популяции е. coi i и S.mm-cescens (9:1). Обозначения те же, что и на рис. 5.

явление, которое мы условно назвали инверсией скачка еи> наблюдалось даже В том случае, когда ДОЛЯ клеток 5-мгсегеепз в смешанной культуре составляла менее 1,С. На основе обнаруженного явления предложен способ раннего обнаружения контаминации производственных культур (Авт. свид. 1472507, 1987г.).

У ГраМПОЛОЖИТбЛЬНЫХ бактерий В.зиЫ а г5 и В. тееат^ит также наблюдался характерный скачок в область отрицательных значений при исчерпании в среде глюкозы в том случае, если она была лимитирующим и единственным источником углерода и энергии (Рис. 7,8). Отличительной чертой скачка у грамположительных бактерий в этой ситуации является отсутствие спонтанной обратимости. При остановке роста клеток 5-вследствие исчерпания аммония наблюдали обратимый скачок ^. Если МН4С1 добавляли в среда1 через 1.5-2.0 часа после остановки роста, то через 10-25 минут после начала роста регистрировали два скачка еь, следующих друг за другом с интервалом в 20-40 минут и амплитудой 10-20 мВ (Рис. 8). Так как одновременно с этими скачками еь, наблюдали заметное снижение скорости роста и потребления кислорода, мы предполагаем, что после периода голодания по источнику азота клетки в. $иъ>ли5 приобретали способность к синхронному делению. Возможно, что деление клеток это еще одна ситуация, в которой регистрируется скачок редоке- потенциала в культурах бактерий.

2.2. Роль экстраклеточных тиолов в генерации скачка ен птэд стрессе голода у Е-сои и в. зиытз,

Какова физико-химическая природа скачков редокс-потенциала в культурах исследованных бактерий? Наши исследования показали, что экстраклеточные тиолы играют существенную роль в генерации скачка Е|" при стрессе голода в аэробных культурах Е-ссИ и в. &иышз. Об этом свидетельствуют приведенные ниже данные.

При снижении концентрации сульфата в среде (< 0.1 мМ) скачок еь в область отрицательных значений при стрессе голода не

20 40 60

Бремя, мин.

Рис. 7. Параметры переходного процесса в культуре В.1ги?£а1ег1\т1 При исчерпании глюкозы в среде.

1 - оптическая плотность, 2 - рН, 3 - ЕЬ, 4 - рОа. Стрелка показывает момент добавления глюкозы.

ЕЬ, мВ -50

-75

-100

-125

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Время, час.

Рис. 8. Параметры переходного процесса в культуре в.вчькиг ПрИ исчерпании в среде аммония.

1 - оптическая плотность, 2 - рН, 3 - р02. 4 - еь. Стрелка показывает момент добавления аммония.

наблюдался. Добавление SH-реагентов (N-эт-илмалеимида (nem), п-хлормеркурибензоата СпХЫБ) или дитионитробензоата (ДТНБ) в концентрациях 0.1-1.0 мМ на любой фазе скачка Eh вызывало возвращение Eh к исходному уровню (Рис. 9).

Обнаружена тесная корреляция между изменениями Eh и количеством доступных SH~rpynn с наружной стороны клеток при исчерпании В культуре E-col i и S.subtílis ГЛЮКОЗЫ ИЛИ 01ММОНИЯ (Рис. 9). Как указывалось выше, переход культур Е.сои и в. subtiiis в стационарную фазу сопровождается скачком Eh при рН среды 6.0, 7.0 и 8.0. Добавление ДТНБ приводило к снятию скачка при любом рН среды, в том числе и при рН 8.0. Поскольку дГНЕ при рН 8.0 действует как непроникающий в клетку SH_pea~ гент (Fonyo, 1978), это свидетельствует о том, что именно увеличение уровня экстраклеточных тиолов вызывает скачок

В других опытах измеряли количество sn-соединений как в среде (в Фильратах), так и в цельной культуре. Тесная корреляция между изменениями Eh в момент скачка и количеством трупп наблюдалась как в фильтратах, так и в культурах Е-coi i и в. subtiiis. рйличество тиолов в фильтратах составляло 63,? от их содержания в пробах с клетками.

Известно, что глутатион составляет около 95$ общего количества внутриклеточных низкомолекулярных тиолов у E.coli (Fa-hey, et ai., 1978). Измерение экстраклеточного глутатиона показало, что вне клетки восстановленный глутатион (gsh) составляет 20% от общего количества глутатиона (gsh+sssg), в момент скачка количество gsh увеличивалось на 41$> (0.24 мкг/мл), тогда как количество окисленного глутатиона (gssg) уменьшалось на 20 %. Соотношение gsh;gssg с наружной стороны клеток Е- сои в момент скачка Eh увеличивалось на 74,€ (Табл. 1). Eho для gsh равен -230 мВ (рН 7.0). В наших опытах добавление 0.25 мкг/мл GSH к среде М9 без бактерий вызывало такое же падение Eh как и при стрессе голода в культуре е.сои. в совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что gsh вносит вклад в наблюдаемые изменения Eh При стрессе голода в аэробных культурах e.coií.

| Рост | 120

-1501_

I_1

ЗОнин

Рис. 9. Изменения ЕЬ и доступных 2Н_групп в культуре (а)

и в. «чьии* (о) При рн„ 8 при остановке роста вследствие исчерпания глюкозы (а) или аммония (б). 1 - ЕЬ, 2 _ количество БН-групп в культуре. Стрелки показывают моыёнт добавления М0~* М ЯГНБ (а) или 2*10~э М ин.С! (б), рамки показывают моменты прекращения и возобновления роста.

е £

сс гЬлВ 0,8

00

■¡00 -300

Рис. 10. Переходный процесс в культуре клеток ^-сои от роста в аэробных условиях к росту в анаэробных условиях.

1 - содержание БН-групп в среде (ось ординат), 2 - оптическая плотность, 3 - ЕЙ. Стрелкой показан момент начала продувки среды аргоном.

Переход E-coit к анаэробному росту сопровождается преходящим снижением уровня экстраклеточных тиолов (Рис. Í0). Ранее сообщащалось, что уровень внутриклеточных тиолов при переходе Е-col i к анаэробному РОСТУ также ПЗДаеТ (Loewen, 1979).

Таблица 1. Экстраклеточный статус глутатиона у е.coi i

Условия

Рост Стационар- Осмотический шок

ная Фаза

0.3 М NaCl 0.6 М WaCl

gsh gssg

gsh+gsss gsh:gssg

0.17+0.03 0.74+0.06 0.91+0.06 O .23

О.24+0.02 О.60+0.03 0.84+0.02 0.4

0.12+0.04 О.5S+0.02 О.70+0.04 0.21

О.03+0.009 0.31+0.05 0.34+0.06 0.04

* - содержание экстраклеточного глутатиона выражено в мкг/мл

2.3. Внутриклеточные пулы тиолов и К~*~.

В аэробных культурах Е-сои К12 скачок ЕН и повышение количества небелковых 5и-групп с наружной стороны клеток при исчерпании глюкозы сопровождались снижением уровня внутриклеточного К+ на 25;? от исходного уровня. Через 25 мин, после остановки роста падение уровня К+ сменялось преходящим увеличением пула К+ и уровня небелковых тиолов. Изменения этих двух параметров происходили синхронно и хорошо коррелировали друг с другом. Уровень белковых тиолов изменялся синхронно с измене-

нияыи двух выше указанных параметров, но противоположным образом, т.е. повышение белковых тиолов происходило тогда, когда наблюдалось снижение пулов К+ и небелковых тиолов (Рис.11).

Цитируемая литература

1. Fonyo A.J., Bioenerg., Biomembr., 1978, 10, p. 171-194.

2. Fahey R.C., Brown M.C., fidams Ы.Б., et al., J. Bacterial., 1978, 133, p. 1126-1129.

3. Laewen P.C., Can. J. Biochem., 1979, 57, p. 107-111.

Глава 3. ЭФФЕКТ ИЗМЕНЕНИЙ АДН НА Eh. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ

ЗЛ.ЭФбект искусственного изменения ¿ДН.

Данные, накопленные на первом этапе исследований, позволили сделать предположение, что наблюдаемые наш скачки Eh являются неспецифическим сигналом "тревоги", генерируемом бактериями в ответ на критические для их жизнедеятельности ситуации. Было предположено, что скач°к Eh связан с изменениями параметра, играющего важную роль в жизнедеятельности бактерий и отклике на изменения в окружающей среде. Среди прочих на роль такого регулятора выдвигалась трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода (Д£Н) (F'adan, Schuldiner, 1937; Скулачев, 1989).

В описываемых ниже экспериментах исследовалась роль ДРН и составляющих ее компонентов: трансмембранной разности концентраций ионов водорода (АрН) и трансмембранной разности электрических потенциалов (ДФ) (Mitchell, 1966; Harold, 1977; Ску-лачев, 1989) в генерации скачка Eh.

В работе (Kaiimi et ai., 1931) <5ыл0 показано, что обработка E.ccii в протонофором ДНФ в высоких концентрациях (10 мМ) индуцирует такой же скачок Eh как и при стрессе голода. Эти дан-

Рис. 11. Уровни внутриклеточных белковых и небелковых —'-групп и К"*" при стрессе голода и последующем осмотическом шоке СО.З М ИаС1). о - БН-группы в белках, о - небелкогуе СН--группы, * - внутриклеточный калий.

Рис. 12. Действие разобщителей на ЕЬ и внутриклеточный уровень К+ в растущих клетках соИ К12. 0.02 мМ ХКФ или 10 мМ ДНФ были добавлены в растуэую культуру в момент,указанный первой стрелкой. КЕМ добавлен в момент, указанный второй стрелкой. За 40 мин.до добавления разобщителей клетки были обработаны 20 мМ ЭДГА. ЕЬ после обработки ХКФ -сплоиная линия без символов, ей после обработки ДНФ - пунктирная линия, • - К+ после обработки ХКФ, о - К* после обработки ДНФ.

ныв авторы рассматривали как доказательство того, что диссипация ЛРН является причиной индукции скачка Eh при стрессе голода у e.coii в, Действительно, и в наших опытах ДНФ в высоких концентрациях вызывал скачок ей в область отрицательных значений у Е-coit К12 (Рис. 12). Однако точно такое же изменение еь ДНФ вызывал в среде М9 без бактерий. Более корректные данные о роли ЛДН в индукции скачка ей можно получить, используя другой протонофор м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон (ХКФ), не обладающий в действующих концентрациях залетной редокс-активностью. Б наших опытах ХКФ (20 мкМ) при рН среды СрН0) 7.0 индуцировал скачок еь (Рис.13). Заметных изменений рНе и р02, которые могли бы вызвать снижение еь при действии ХКФ не наблюдалось. В среде с рН 7.5- 7.6 изменения Eh в ответ на добавление ХКФ отсутствовали. При рНо 8.0 обработка ХКФ культуры е.сои приводила к повышению еь.

Важным результатом в этой серии опытов было обнаружение скачка редокс-потенциала при обработке E.coii ацетатом натрия. При добавлении в растущую культуру E.coii при Рн среды равном 7.0 и ниже слабой проникающей кислоты ацетата (или пропионата) в виде солей натрия наблюдали такой же скачок Eh, как и при стрессе голода (Рис. 14). Изменения Ehf индуцированные ацетатом, можно было обратить, обрабатывая клетки сульфгидрильными реагентами или проникающим катионом тетрафенилфосфонием (ТФФ+). При рН культуры равном или больше 7,5 изменения еь в ответ на введение ацетата не наблюдались.

Обработка клеток тетрафенилфосфонием (0.1-1 мМ) при всех испытанных значениях рН (6.0, 7.0 и 8.0) вызывала повышение редокс-потенциала в растущей и стационарной культурах е.coi i (Рис. 13). Добавление 50 мМ ацетата на любой фазе скачка еь, вызванного ТФФ+, приводило к возвращению значения еь к исходному уровню. Все описанные выше изменения Eh Не были связаны с изменениями рН в культуре и лишь частично были связаны с изменениями р02.

Обработка клеток ионофором валиномицином, селективным для

Рис. 13. Действие И® (2*10 М) (а) и ТФФ+ (1*10"'' М) (б) на растущие клетки сон.

1 - биомасса, 2 - еъ, з - р02, "4 - рН, ХКФ и ТФФ+ добавляли в культуру в моменты, указанные стрелками вверху рисунка. Пунктиром показано:

(а) изменение' ЕЪ после добавления 1-1 (Г М ДГНБ (двойная стрелка) или

(б) 50 мМ ацетата.

30 мин

рОг.'/с

Рис. 14. Изменение ЕЬ и количества доступных £н-групп в растущей культуре г.со'' при обработке клеток 50 мМ ацетата натрия при рН0 7. 1 - биомасса, 2 - ЕЙ, з - количество доступных вн-групп в среде, 4 - р02, 5 - рН. Пунктиром показано изменение ЕЛ после добавления 1*10"* М ПНЕ.

или ингибитором г -АТРазы -дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) не вызывала заметных изменений Eh в растущей культуре Е-со it. Все использованные вещества (кроме ДНФ) в среде МЭ без бактерий не проявляли заметной редокс-активностк.

Известно, что клетки е. coi i в широком диапазоне рН среды поддерживают внутриклеточный рН (pHt) в узких пределах (7.57.8) (Padan, Ziibsrstein, 1981). Известно также, что у е.сои при кислых значениях рН среды ацетат, как и другие слабые проникающие кислоты, в концентрациях выше 10 мМ снижает ДрН, вызывает подкисление цитоплазмы И повышение Д* (Bakker, Mangerich, 1783). При рНо 7.5-7.8 у е. coi i ЛрН близка к 0 и вся ДДН представлена разностью электрических потенциалов (Hamilton, 1975). в этих условиях ацетат не влияет на величину ДрН и не изменяет внутриклеточный рН. При рНй 8.0 дрН направлена так, что препятствует входу ацетата в клетку в количестве, достаточном для изменения внутриклеточного рН и Протонофор ХКФ при рН0 7.0 вызывает частичное или полное снятие АрН и и, соответственно, подкисление цитоплазмы. При рН 7.5 обработка клеток протонофором приводит к устранению Д*. но также как ацетат ХКФ в этих условиях не изменяет внутриклеточный рН. Из этих же соображений следует озаедать, что при рН0 8.0 ХКФ вызовет повышение рН цитоплазмы. Вход Т§Ф+ в применяемых нами высоких концентрациях при всех значениях рНс облегчает выброс протонов протонными помпами в среду и вызывает повышение рН^.

Если сравнить данные по изменению ей б культуре е.соИ при введении ацетата, ХКФ и ТФФ+ с их эффектами на компоненты ДмН, то можно сделать вывод, что изменения Eh в культуре наблюдались тогда, когда эти вещества вызывали изменения внутриклеточного рН, при этом подкисление цитоплазмы сопровождается снижением Eh, а подцелачивание цитоплазмы способствует повышению Eh. Мы отдаем предпочтение изменениям ДрН в индукции изменений Eh перед Д*, т.к. при рН0 7.5-7.6, когда Д#Н представлена только мембранным потенциалом, ее устранение не вызывает заметных изменений Eh.

Введение реагентов на зн~группу на любой Фазе скачка Eh, вызванного ХКФ, приводило к повышению Eh до исходного значения (Рис. 13). N-этилмалеимид (nem) после ДНФ не обращал действия разобщителя на ей (Рис- 12). Таким образом, причина изменения Eh при обработке клеток ХКФ и ДНФ разная. В первом случае снижение Eh вызвано увеличением числа зн-ГруПп с наружной стороны клеток, во-втором - это результат прямого взаимодействия между разобщителем и платин°вым электродом.

С точки зрения электрохимии, скачок Eh, индуцируемый ацетатом (или ХКФ), и скачок Eh при стрессе голода имеют одинаковую природу, в обоих случаях причиной изменения Eh является взаимодействие платинового электрода с тиолами. Об этом свидетельствуют приведенные выше данные, а также тесная корреляция между изменениями Eh в культуре е. сои после воздействия ацетатом и количеством зн~групп с наружной стороны клеток (Рис. 14). Предварительное добавление в культуру е.сои реагентов на зн--группу (nem, пХМБ или ДТНБ) в концентрациях 0.1-1.0 мМ предотвращало индукцию скачка Eh ацетатом. Добавление этих реагентов на любой фазе скачка Eh приводило к возвращению значения Eh к исходному уровню (Рис. 14). С другой стороны следует отметить, что ТФФ+ и wem оказывали одинаковое действие на Eh (Рис. 13,14). Обработка клеток зн-реагентами после воздействия ТФФ+ не вызывала заметных изменений еь. Это свидетельствует о том, что защелачивание цитоплазмы приводит к уменьшению количества зн-трупп с наружной стороны клеток.

Обработка растущих клеток е. coi i 5Q мМ ацетата при pHö ниже 7.0 вызывала снижение уровня внутриклеточных небелковых тиолов и повышение уровня внутриклеточного К+ (К^ХРис. 15). Таким образом, закисление цитоплазмы у е.сои ацетатом вызывает повышение уровня внеклеточных тиолов и снижение уровня внутри-клеточныых небелковых тиолов, обнаруживается также обратная корреляция между изменениями уровня К* и количеством внутриклеточных небелковых тиолов.

Переход клеток е.coi i к анаэробному росту еще один пример,

acbl'att

Время, нин.

Рио. 15, Действие ацетата натрия на растущие клетки Е соИ. Л - удельная скорость роста, а - £Н-группы в белках, о - небелковые бн--группы. • - внутриклеточный калий.

Время, мин.

Рис. 16. Щелочной шиФт в растущих клетках E.coií К12. рН увеличивали от 7 до 8.3 в течение 5 мин. путем добавления NaOH в момент, указанный стрелкой. Обозначения те же, что на рис, 15.

указывавший на возможность существования связи между внутриклеточным рН и уровнем небелковых тиолов. Известно, что такой переход сопровождается снижением пула внутриклеточного gsh (Loewen, 1979). Известно также, что клетки, растущие в анаэробных условиях, имеют более низкий рН^, чем те, которые растут В аэробных условиях (Navon et al., 1977, Пучков И ДР., 1987).

Чтобы исследовать эффект защелачивания цитоплазмы на внутриклеточные пулы 1С и тиолов, клетки е.сои подвергали щелочному шифту. Известно, что у е. coi i резкое повышение рН среды приводит к преходящему увеличению рН цитоплазмы (Ziiberstein et ai., 1984). Сразу после щелочного шифта наблюдалось быстрое увеличение внутриклеточной концентрации К+, через 5 минут уровень К* резко падал почти до исходного уровня (Рис. 16). Уровень внутриклеточных небелковых тиолов после шифта увеличивался вдвое по сравнениию с контролем. Увеличение количества sh--групп в белках наблюдалось только через 2.5 часа после шифта.

Щелочной шифт среды вызывает преходящее увеличение рН цитоплазмы. Чтобы исследовать действие длительного защелачивания цитоплазмы, клетки E.cont растущие при рН0 8,3, обрабатывали проникающим основанием метиламином (100 мМ). В этих условиях наблюдался быстрый выход К"1" и увеличение уровня небелковых тиолов с последующим падением.

Какова причина изменений уровней внутриклеточных небелко-еых тколов при изменении внутриклеточного рН? Известно, что у Е-coi i около 95% внутриклеточных небелковых тиолов составляет глутатион (GSH). Внутриклеточный уровень gsh у этой бактерии 'заВИСИТ, ГЛаВНЫМ образом, ОТ еГО биосинтеза novo (Alonso-Moraga et al., 19S7). in vitro активность Ферментов биосинтеза bsh увеличивается почти линейно при увеличении рН с 7.0 до 8.0 (fipontoweii, Bersnds, 1975). Этот диапазон рН располагается в пределах физиологических значений pl^ у е.соИ (padar. et al., 1981).

В совокупности, приведенные выше данные свидетельствуют о

том, что в аэробных условиях, искусственно изменяя рН цитоплазмы клеток е.соил можно вызвать изменения уровня внутриклеточных небелковых тиолов таким образом, что закисление цитоплазмы приводит к снижению количества тиолов, а защелачива-ние цитоплазмы - к повышению их количества. Одновременно в клетках прототрофных штаммов Е-соИ искусственное изменение рН цитоплазмы вызывает изменение количества тиолов с наружной стороны клеток таким образом, что закисление цитоплазмы приводит к увеличению уровня экстраклеточных тиолов, а защелачива-ние цитоплазмы к снижению их количества. Измерительная система с платиновым электродом, регистрирует эти события как изменения редокс-потенциала (ЕЮ в бактериальной культуре.

Следует отметить, что при определенных условиях изменения трансмембранной разности электрических потенциалов О*) могут вносить вклад в изменения уровня внеклеточных тиолов при обработках, изменяющих ДРН. Так при обработке е.сои ацетатом при рН ниже 7.0 происходит не только снижение рЪ\, но и одновременно повышение лф, т.е. увеличение отрицательного заряда с внутренней стороны мембраны (Ваккег, МапдеггсЬ, 1983). Это должно способствовать увеличению экскреции ббн Из клетки в среду, т.к. при физиологических условиях молекула глутатиона несет отрицательный заряд. Однако следует иметь в виду, что снимаемое падение ей наблюдалось и при обработке клеток протонофором ХКФ (при рНй ниже 7.0), понижающего и и Другие аргументы в пользу участия внутриклеточного рН в тиол--зависимых изменениях еь приведены ниже в разделе 3.2,

3.2. Роль изменений АДН в генерации скачка ей при

Нами установлено, что амплитуда скачка ей (деь) при переходе клеток в стационарную фазу вследствие исчерпания глюкозы зависит от рН среды таким образом, что значение минимально при рН среды 7.4-7.5, т.е. в условиях, когда внутриклеточный РН близок к рН среды ОрНЮ) (райап е., 211ьеге^в1п, 19В1).

При снижении и повышении рН0 от этой точки Деь возрастал (Рис. 17). В другом опыте было установлено, что скачок Eh при исчерпании в среде глюкозы отсутствует, если клетки предварительно обработаны протонофором ХКФ, т.е. в условиях, когда значение ДРН близко к О (Рис. 18).

Была проверена возможная роль трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода (ДДН) и составляющих ее компонентов в индукции скачка ей при стрессе голода. В момент исчерпания глюкозы в культуре B.subttits одновременно со скачком Eh регистрировали падение Д* со 167 мВ до 127 мВ. Добавление глюкозы быстро восстанавливало исходное значение мембранного потенциала. Грамицидин полностью снимал мембранный потенциал. В культуре е.сои в этой же ситуации регистрировали повышение Дф . Таким образом, при исчерпании в среде глюкозы у двух разных видов бактерий регистрировали одинаковую реакцию платинового электрода (падение еь) и противоположные изменения мембранного потенциала. Зто свидетельствует против роли в индукции скачка Eh при стрессе голода. Если и существует связь между скачком Eh и компонентами ДДН, то следует отдать предпочтение ЛрН, точнее, изменениям внутриклеточного pH. В пользу этого свидетельствуют следующие данные:

- в среде без глюкозы клетки Е.сои. имеют более низкое значение рН^, Чем КЛеТКИ, растущие С ГЛЮКОЗОЙ (Kroll, Booth, 1931);

- параметры скачка Eh у е.соИ при стрессе голода и при закис-лении цитоплазмы ацетатом идентичны (Рис. 2,4,14);

- скачок Eh у E.coii при стрессе голода можно обратить, обрабатывая клетки ТФФ+, но не ацетатом.

- Переход клеток B.m&gateriw& в стадию споруляции сопровождается существенным снижением внутриклеточного pH (Magiii et ai., 1994). Как известно, стресс голода является одним из факторов, способствующих спорообразованию у бацилл.

Рис. 17. Изменения редокс-потенциала в периодической культуре г.соИ с добавлением субстрата при изменении рН среды с 8.0 до 7.1. 1 - оптическая плотность. 2 - рН, 3 - ЕЬ. Стрелками на линии I показаны моменты добавления глюкозы. Штриховая линия - изменения ЕЬ после добавления БН-реагентов. а - добавление НЕМ.

Гл«ша+| - | + | - | +

Рис. 18. Действие ХКФ на изменения ЕЬ в периодической культуре сои при исчерпании в среде глюкозы.

1.3 - оптическая плотность, 2,4 - ЕЬ. 1,2 - в культуру предварительно добавлен ХКФ, 3,4 - контроль (без добавления ХКФ) Стрелками на линиях

2.4 показаны моменты добавления глюкозы.

Цитируемая литература

1. Пучков Е.О., Пинчукова В.А., Зинченко B.II. и др., Биохимия, 1937, Т. 52(3), с.452-458.

2. Скулачев В.П., Энергетика биологических мембран, 1989, Москва, Наука, 564 с.

3. Alonso-Moraga A., Eocanegra ft., Torres Л. 11. et al., Mol. Cell. Bicchem., 1987, 73, p. 61-69.

4. Apontoweil P., Berends W., Biochim. Biophys. Acta, 1975, .399, p. 1-9.

5. Bakker E.P., In Vectorial reactions in electron and ion transsport( 1981, Else\'ier N-H., Amsterdam, 1981,

p. 315-318.

6. Bakker E.P., Mangerich Ы.Е., Biochim. Biophys. Acta, 1983, 730, p. 379-386.

7. Hamilton W.A., Adv. Microb, Physiol., 1975, 12, p. 1-53.

8. Harold F.M., Ann. Rev. Microbiol., 1977, 31, p. 181-203.

9. Kalimi G.H., Henriquss B.M., Pereira L., J. Exp, Biol., 1981, 19, p, 808-811.

10 К roll R.S.. Booth I.R., Вiochem. J., 1981, 198, p. 691-693.

11. Loewen P.C., Can. J. Biochem., 1979, 57, p. 107-111.

12. Magiii N.G., Cowan A.E., Koppel D.E., J. Bacterial., 1994, 176, p. 2252-2253.

13. Mitchell P., Biol. Rev., 1966, 41, p. 445-502.

14. Navon S., Ogawa S., Shulman R.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1977, 74, p. 888-891.

15. Padan E., Zilberstein D., Schuldinsr S., Biochim. Biophys. Acta, 1981, 650, p. 151-156.

16. Padan E., Schuldiner S., J.Membr.Biol, 1987, 95, p.189-198.

17. Rhoads D.B., Waters F.B., Epstein W., J. Gen.Physiol., 1976, 67, p. 325-341.

18. Zilberstein D.» Agmon V., Schuldiner S. et al., J. Bacterial. , 1984, 158, p. 246-252.

Глада 4-1. ОТКЛИК Е.сои НА ТЕПЛОВОЙ ЛЮК.

После подробного изучения изменений Е|"> при стрессе голода представляло интерес изучить поведение Eh в других ситуациях, являющихся экстремальными для бактериальных клеток. Одна из таких ситуаций - тепловой шок.

При повышении температуры в среде с растущими клетками E.coii от 37°с и выше в момент достижения 46" наблюдается замедление роста, сопровождающееся характерным скачком Eh в область отрицательных значений (Рис. 19). Анализ параметров культуры показал, что этот скачок Eh прямо не связан с изменениями р02 и pH в среде. В стационарной культуре е. coli при повышении температуры от 37" и выше скачок Eh при 46° отсутствует, заметное снижение Eh наблюдали только при 55° (Рис. 20).

Скачок Eh при тепловом шоке растущих клеток Е-соИ связан с увеличением количества зн-ГруПп с наружной стороны клеток. SH-реагенты, добавленные на любой фазе скачка, вызывали быстрое возвращение Ef1 к базовому уровню, предобработка клеток NEM или пХМБ предотвращала генерацию скачка. Скачок £h сопровождался существенным увеличением внутриклеточного пула калия.

Обращает внимание схожее поведение растущих клеток при тепловом шоке и при обработке ацетатом. В обоих случаях наблюдали увеличение количества внеклеточных тиолов и внутриклеточного пула К+.

Возможно, что изменения наблюдаемых параметров у Е-сои При тепловом шоке связаны с процессами, протекающий при повреждении цитоплазматической мембраны. Известно, что цитоплавмати-ческие мембраны е.соч, взятые из логарифмической и стационарной фаз, существенно различаются по химическому составу, и это заметно сказывается на их физических свойствах и, в частности, на изменении проницаемости при тепловом шоке (Hiro_ shi, 1982). Это может служить одной из причин различного поведения Eh при температурном шоке в стационарной и растущей культурах Е-сои. Скачкообразный характер изменений еь в рас-

Eh, мВ 40 ,

го 40 60 во Время, мин.

Рис. 19. Действие теплового шока на

col i К12 в логарифмической Фазе роста.

1 - Eh, 2 - р02, 3 - оптическая плотность, 4 - температура.

Eh, мВ

Время, мин.

Рис. 20. Действие теплового шока на с.coi i К12 в стационарной фазе. Обозначения те же, что и на рис. 19.

тущих клетках е.сои позволяет предположить, что в данной ситуации изменение Eh сопряжено со структурной перестройкой мембран, носящей характер кооперативного перехода из одного конформационного состояния в другое (Конев, Волотовский, 1977). Такая структурная перестройка может иметь плейотропный эффект и приводить к изменению разности электрохимических потенциалов ионов водорода. Происходящее при этом закисление цитоплазмы может индуцировать увеличение уровня внеклеточныых тиолов и, соответственно, скачок ей (Глава 3). Клетки £-eoiit находящиеся в стационарной фазе, уже имеют пониженный pH цитоплазмы (Kroii, Booth, 1981), поэтому при тепловом шоке они не генерируют скачок Eh. Такова, возможно, другая причина различной реакции на тепловой шок клеток, находящихся в разных фазах роста.

Повышение К* при тепловом шоке, свидетельствует о том, что диссипации ионных градиентов при этом не происходит, клетки, вероятно, сохраняют контроль над К+-выходными каналами.

Щтируемая литература

1. Конев С.Б., Болотовский К.Д., Биомембраны, Рига, Зинатне, 1977, с. 42-47.

2. Hiroshi S., Biochim. Biophys. Acta, 19B2, 69i, p. 161-170.

3. Kroll R.6., Booth I.R. Biochem. J., 1981, 19S, p. 691-69S.

5.1. и внеклеточные тиолы.

В главе 2 было показано, что скачок еп при стрессе голода можно обратить обработкой клеток сульфгидрильными реагентами или проникающим катионом ТФФ+. Позднее было обнаружено, что такой же эффект вызывает гиперосмотический шок. В этих опытах

увеличение осмотического давления среды вызывалось добавлением 0.1-0.44 М сахарозы или 0.3-0.5 М Nací при значениях рН среды 6.0, 7.0 и 8.0. Эффект увеличения осмотического давления на Eh мало зависел от природы и концентрации осмотического агента и от рН среды (Рис. 21).

Ацетат натрия, добавленный после осмотического шока, вызывал снижение редокс-потенциала при рН 6.0 и 7.0. Такой же эффект на Eh оказывали осмопротектанты бетаин и пролин. Добавление этих веществ после осмотического шока снижало редокс-по-тенциал в нерастущей культуре £-сои, nem обращал эффект ацетата и осмопротектантов (Рис. 21а). Обработка ацетатом натрия после осмотического шока при рН 8.0 не приводила к снижению Eh, наоборот, наблюдали небольшое повышение еь (Рис- 216)- Осмотический шок приводил также к реверсии скачка если этот скачок был вызван обработкой растущих клеток ацетатом натрия или ингибиторами белкового синтеза хлорамфениколом (25 мкг/мл) и тетрациклином (15 мкг/мл) или валином (3.4 мМ) (Рис. 22). Добавление последнего вещества останавливает рост, вызывая изолейциновое голодание. Во всех этих ситуациях осмотический шок и NE|y| действовали одинаково. Анализ изменяй рН и рО, в культуре E.coii при всех указанных выше обработках показал, что изменения этих параметров не вносят решающего вклада в изменения Все испытанные вещества сами по себе не оказывали заметного влияния на потенциал платинового электрода.

При гипоосмотическом шоке е.coi i наблюдали такой же снимаемый nem скачок El"! в область отрицательных значений (ден=45мВ) как при стрессе голода, обработке ацетатом или ингибиторами белкового синтеза. Добавление nem до введения клеток в ячейку предотвращало любые изменения

Следующие данные свидетельствуют об участии тиолов и, в частности, глутатиона в изменениях Eh при осмотическом шоке.

1. Гиперосмотический шок обращает скачок Eh при стрессе голода, при обработке ацетатом и ингибиторами синтеза белка таким же образом, как и тиоловые реагенты. Любые изменения

Рис. 21. Изменения редокс-потенциала и содержания кислорода у соИ: а) ПРц исчерпании глюкозы и последующем добавлении 0.3 ИаС1 Сили 0.15 М сахарозы), 50 мМ ацетата натрия (или 1 мМ бетаина) и 0.1 мМ НЕ" при рН 7. 1 - ЕЬ, 2 - р02. (б) то ли при рН 8. Стрелки показывают моменты исчерагния глюкоза и добавления реагентов. — изменения ЕЬ после добавления НЕМ.

Время, мин.

Рис.22. Действие 0.44 М сахарозы на растущие клетки с. coli (pH 7), предварительно обработанные Ca) 50 мМ ацетата натрия или (б) 25 мкг/мл хлорамфеникола.

при осмотическом шоке отсутствовали, если клетки предварительно обрабатывали NEM-

2. Определение общего количества внеклеточных зн-групп показало, что после гиперосмотического шока их уровень снижался на 20%.

3. Введение в среду М9 с нерастущими клетками е.сои о.З М Nací снижало уровень экстраклеточного gsh и соотношение GSH:GSSG вдвое. Более СИЛЬНЫЙ осмотический ШОК (0.6 М NaCl) приводил к снижению количества gsh в восемь раз и соотношения gshsgssg в 10 раз. Количество окисленного глутатиона изменялось незначительно (Табл. 1).

5.2. Внутриклеточные тиолы и ЬС.

Ранее было показано, что у е. coit При гиперосмотическом шоке происходит увеличение количества внутриклеточного К1" (Epstein, 1986) И НИЗКОМОЛекулЯРНЫХ ТИ0Л0В, ВКЛЮЧаЯ SSH (Munro et ai., 1972; McLaggan et ai., 1990). Однако измерения этих параметров были выполнены в разных условиях и на разных штаммах, одни авторы измеряли К*. другие - уровни тиолов. Представляло интерес измерить синхронно на одном и том же штамме и в строго определеннных физиологических состояниях изменения этих параметров .

Осмотический шок, вызванный добавлением 0.3-0.6 М в

нерастущую культуру coli Kl2, вызывал преходящее увеличение внутриклеточного К4", небелковых и белковых тиолов (Рис. 11). Изменения двух первых параметров хорошо коррелируют друг с другом. Отклик К?" на осмотический шок по Бремени опережает отклик небелковых тиолов. Через 1 час после введения Natu уровни небелковых тиолов и К"1" устанавливались на уровне, близком 'к начальным значениям.

Осмотический шок в аэробно растущих клетках приводил к преходящему увеличению внутриклеточного К+ и тиолов (Рис. 23). Данные ранних исследований свидетельствовали о том, что увеличение внутриклеточного К+ в ответ на осмотический шок носит

ИиС1

I

Рис. 83 Гиперосмотический ток (06 М КаС1) б растущих клетках Е-со1с К12. й - удельная скорость роста, □ _ БН-группы в белках, о - небелковые Эн--группы, • - внутриклеточный калий.

Сахарова

Время, мин.

Рис. 24. Анаэробиоз и ДЦКД модифицируют действие осмотического тока на внутриклеточный пул КТ В момент, указанный стрелкой в растущую культуру добавили 0.44 М сахарозы. • " аэробно растущие клетки, л - аэробно растущие клетки перед осмотическим шоком обработаны 0.5 мМ ДЦКД, о - анаэробно растущие клетки, анаэробный рост не менее 1 часа.

постоянный характер. Наши данные согласуются с более поздники иследованиями, которые показывают, что увеличение К+ в этой ситуации носит преходящий характер (Chcnka, i9S9).

Преходящий характер повышения внутриклеточного К+ мы наблюдали такие при осмотическом шоке клеток, растущих в анаэробных условиях. Сам по себе переход растущих клеток E-сои от аэробного роста к анаэробному также вызывал увеличение К*. Такое возрастание внутриклеточного пула калия наблюдали и ранее (Puchk ov, et al.л 1982). 3 наших экспериментах это возрастание было преходящим и через 50 мин. после начала продувки среды аргоном уровень внутриклеточного К+ снижался до уровня, близкого к начальному. Если через Í час после роста в анаэробных условиях клетки е.со а подвергали осмотическому току, то наблюдалось временное увеличение внутриклеточного К+, которое было в 3 раза выше, чем при осмотическом шоке аэробно растущих клеток (Рис. 24). В количественном отношении такой же отклик на повышение осмотического давления наблюдали и у аэробно растущих клеток Е- сои, предварительно обработанных ингибитором АТРазы дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД). Однако в последнем случае увеличение внутриклеточного К"1" в ответ на осмотический шок носило необратимый характер (Fue. 24). Сама по себе обработка клеток ДЦКД в среде М9 с глюкозой не вызывала, значительных изменений К*".

Одной из возможных причин изменения изучаемых нами параметров бактерий Е.сои при осмотическом шоке может быть защелачи-чивание цитоплазмы. Следующие данные свидетельствуют в пользу этого предположения•

1. Известно, что осмотический шок приводит к постоянному ИЛИ преходящему повышению рН цитоплазмы У E.coli (Castle et

al., 1986; Dinnbier et al., 1988).

2. Добавление ацетата в культуру е. coi i При рН0 ниже 7.0 вызывает зачисление цитоплазмы (Bakker, Mangerich, 1982). Мы показали, что добавление ацетата после осмотического шока при рН ниже 7.0 устраняет те изменения которые индуцировал

осмотический шок (Рис. 21а). При рН0 выше 8.0 трансмембранный градиент протонов направлен наружу и препятствует входу ацетата в количествах, достаточных для закисления цитоплазмы. В этом случае обработка культуры 50 мМ ацетата натрия после сахарозы или Nací не оказывает существенного влияния на еь (Рис. 216).

3. Осмотический шок, в свою очередь,обращает изменения Eh, которые были вызваны закислением цитоплазмы или исчерпанием в среде глюкозы. Известно,что клетки, coíi, инкубированные без глюкозы, имеют более низкое значение pHt (Krou, Booth, i9si>.

4. Осмотический шок и повышение pH¿ (Гл. 3) оказывали одинаковое воздействие на внутриклеточные уровни К+ и небелковых тиолов.

Известно, что добавление бетаина при высоком осмотическом давлении среды стимулирует рост бактерий (Chonka, 1989). Однако при более подробном изучении действия бетаина было обнаружено, что первой реакцией клеток е.сои aeii57, растущих при повышенной осмолярности среды, на добавление бетаина является ингибирование роста (Meury, i9SB). Этот эффект наблюдался и в наших опытах с е.сои К12 (Рис." 25).

Как уже указывалось выше, клетки, растущие при повышенном осмотическом давлении, содержат повышенные количества тиолов. В наших опытах было обнаружен еще один эффект бетаина, его добавление в культуру е.соЫ, растущую при повышенной осмолярности, приводит к падению уровня небелковых тиолов (Рис. 25).

Ранее было сообщено, что добавление бетаина к клеткам со-1£, растущим в среде с повышенной осмолярностью, приводит к выходу К+ в среду, если осмопротектор был добавлен в культуру через 10-15 мин. после осмотического шока (Dinnbier et al., 1988). б опытах Мьюри обработка е. coi i бетаином через 2 часа после осмотического шока не оказывала никакого действия на К*

Бетаин

40 60 80 100 120 Время, мин.

Рис, 25 Действие 1 мМ бетаина на клетки Е.сои {{}2, растущие в среде с высокой осмолярностью. Клетки росли в аэробных условиях, в среде М9 с глюкозой и О.в М МаС1. Бетаин был добавлен чао спустя после осмотического шока. Внутриклеточный ГО внутриклеточные небелковые тиолы С"1,0), удельная скорость роста О.Д). Открытые символы - без бетаина, закрытые -- с бетаином.

ЗгрН 7-8,3 Бетаин

20 40 60 80 100 120 Время, мин

рис. 26. Действие 1 мМ бетаина на клетки е. cait К12, растущие при рН 8.2. Перед добавлением ботакна клетки росли в аэробных условиях в среде М9 с глюкозой при щелочном рН не менее 1 часа.

(Meury, 19S8). в наших опытах добавление бетаина в культуру через í час после осмотического шока приводило к ускорению выхода К+ из клеток. Анализ наших данных о кинетике выхода К1" из клеток в присутствии бетаина и без него (Рис. 23, 25) и данных упомянутых выше авторов, показывает, что никакого противоречия между результатами разных авторов нет. В определенных условиях клетки Е- со11, инкубируемые в среде с повышенной осмоляр-ностъю, проявляют способность возвращать в среду существенную часть К+, аккумулированного ими на первой стадии осмотического шока. В клетках, необработанных бетаином, это длится около двух часов, бетаин в 10-20 раз ускоряет этот процесс.

В наших опытах было обнаружено, что бетаин, вещество, известное ранее по своему положительному эффекту на клетки, растущие при повышенном осмотическом давлении, оказывает такое »в действие на клетки, растущие в среде с нормальной осмоляр-ностью, но при повышенном рН. Бетаин оказывал выраженный эффект на все измеряемые параметры таких культур СРис. 26). Скорость роста бактерий Е-coi i, растущих при рН 8.2, сразу после добавления бетаина падала и через 20 мин. увеличивалась до уровня более высокого, чем тот, который наблюдался при рН 7.0. Час спустя, скорость роста восстанавливалась до уровня, наблюдаемого при росте в среде с рН 7.0. После добавления бетаина уровень внутриклеточного К+ и небелковых тиолов падал. Выход К+ начинался сразу после добавления бетаина, тогда как снижен-ние уровня небелковых тиолов начиналось через 20 мин. после добавления бетаина. Такой же эффект бетаин оказывал на клетки, растущие при щелочном рН в присутствии слабого проникающего основания метиламина. В этих условиях цктоплазматический рН заметно сдвигается в область щелочных значений. Обработка таких клеток бетаином вызывала дополнительный выход К+ из клеток и снижала уровень небелковых тиолов на 45$. Скорость выхода К+ была выше, чем скорость падения уровня небелковых тиолов. Обработка бетаином вызывала преходящее снижение скорости роста, после чего бактерии росли со скоростью в два раза выше, чем до

добавления бетаина. Бетаин не оказывал заметного эффекта на клетки, растущие в среде М9 при рН 7.0.

Ген рг°и у Е-соы кодирует осмотически индушбельную транспортную систему для глицин бетаина (Chonka, 1989). Экспрессия proU репрессируется экзогенным ГЛИЦИН бетаином (Sutherland et ai., 1936j. Б наших опытах изменение в цитоплаэмати-ческом рН оказывало выраженный эффект на экспрессию Ргои у E.coii, растущих в среде с высокой осмолярностью.

Для оценки экспрессии гена (,ro'J был использован штамм е. со_ It СН1366, несущий слияние гена lacZ с геном praU (Sutherland et ai.r 1986). Этот химерный оперон был получен путем мутагенеза с помощью производных бактериофага у которых на одном, из концов молекулы ДНК расположен ген i^cz, лишенный сигналов инициации транскрипции. В результате встраивания такого транс-позона в структурный ген в правильной ориентации образуется соответствующий мутант, в котором синтез продукта гена iac2 (Фермент tf-галактоэидаза) регулируется транскрипционными сигналами, обеспечивающими экспрессию структурного гена, в данном случае prov. Уровень 0-галактозидэаной активности в таких штаммах отражает уровень экспрессии соответствующего структурного гена.

Клетки E.coii СН1366, несущие генное слияние proV-iaczt обрабатывали ацетатом натрия (10-50 мМ) в среде с рН 6.8. При этих условиях ацетат (10 мМ) вызывал такое же ингибирование экспрессии proU, как и 1 мМ бетаина (Табл. 2). Но ацетат, в отличие от бетаина, не стимулировал рост бактерий в среде с повышенной осмолярностью. 10 мМ ацетата и 1 мМ бетаина, добавленные одновременно оказывали аддитивный эффект на экспрессию ргси^ но ацетат в этом случае устранял стимулирующий эффект бетаина на клеточный рост. Обработка Е.соы сшзйб, инкубируемых в среде с высокой осмолярностью, 10 мкМ вызывала такое же ингибирование экспрессии ргои, как и обработка бетаином или ацетатом. в этих условиях снижал скорость роста клеток на 22%. Эти данные покаеывают, что для стимуляции

роста cal* в среде с повышенной осмолярностью одного снижения количества зн~групп или эакисления цитоплазмы недостаточно, Одна иа возможных причин отсутствия положительного эффекта ацетата на клетки, растущие при повышенной осмолярности, может быть связана с его неспособностью открывать lC-выходные каналы, Б наших опытах обработка ацетатом клеток Е-coli, растущих при повышенном осмотическом давлении и рН ниже 7,0, вызывала не выход К1", а наоборот его дополнительный вход.

Какова причина одинакового отклика на бетаин бактерий, растущих при повышенном осмотическом давлении и при повышенном рН среды? Общее свойство таких клеток - постоянное или преходящее защелачивание цитоплазмы (Bakker, Mangerieh, 1983? 2i1bersbe-

in et si., 1984; Dinnbier et al.. 1988) и повышенное КОЛИЧеСТ" BO внутриклеточных небелковых ТИОЛОВ (Munro et al., 1972; McLaggan et al., 1972; РИс.' 23, 26). ВОЗМОЖНО, ЧТО ЭТО И ЯВЛЯ" ется причиной одинакового отклика на бетаин клеток, подвергшихся действию двух различных стрессов. Не исключено, что защелачивание цитоплазмы и повышенный уровень небелковых тколов в числе других факторов обеспечивают компетенцию клеток E.coit к восприятию бетаина при росте в среде с высокой осмолярностью. Сравнительный анализ кинетики изменения двух параметров показывает, что снижение пула внутриклеточных небелковых тиолов бетаином является вторичным процессом по отношению к выход-' К? Возможна следующая последовательность событий. Аккумуляция бетаина вызывает активацию К+ выхода (Bekker et al., 1987; Dinnbier et al., 1988). ВЫХОД КаЛИЯ, СТИМУЛИРУвМЫЙ ббТ8-ином, может снижать внутриклеточный рН через К+/1Г" антипорт. Снижение уровня внутриклеточных небелковых тиолов, в свою очередь, может быть результатом снижения скорости синтеза ззк при более низких значениях рН; (Глава 3.1.). Первоначальное ингибирование роста сразу после добавления бетаина (меигу, 199В; рис. 25, 26) может быть следствием резких изменений рН цитоплазмы. Известно, что клетки E.caii чувствительны даже к

небольшим изменениям внутриклеточного рН (Booth, 1985). Выше

Таблица 2. Действие бетаина, ацетата натрия и ы~этнлмалеимида на экспрессию гена ргои у е.coli снз.зб&.

Удельная скорость ^-талалтозидазная Состав роста активность

среды -

h 1 Единицы

Миллера

Г19 1. ,14 + 0 .03 211 124 + 9 13

М9 + 0,3 М NaCl 0. S4 + 0 .03 .100 953 + 55 100

М9 +■ 0.3 М NaCl 0. ,83 + 0 .07 154 771 + 84 81

+ lmM бетаина

И 9 + 0.3 М NaCl 0 . ,42 + 0 .06. 78 791 -1- 52 83

+ 10 мкМ "ЕМ

М9 + 0.3 М NaCl 0. ,55 н- 0 .05 102 739 - 58 78

+ 10 мМ ацетата'

М9 + 0,3 М NaCl 0. .32 0 .03 59 ¿12 +■ О "Г 64

+ 50 мМ ацетата

М9 + 0.3 М MaC'i 0, ■ s6 -f- 0 . 05 104 561 + 30 59

+ 1 мМ бетаина мМ ацетата

было показало, что бетаин, так же как ацетат снижает Eh в не-растущих клетках Е-соИ, подвергнутых осмотическому пюкгу. Это является еще одним доказательством того, что один из эффектов бетаина может быть связан с закислением цитоплазмы. Ацетат и nem имитировали эффект бетаина на экспрессию proiit что также указывает на то, что небелковые тиолы и (или) внутриклеточный pH могут вносить вклад в отклик Е.соИ на бетаин. Исключительные свойства бетаина как осмопротектора могут быть связали как с его известной способностью поддерживать клеточный тургор и

активировать выход К\ так и, возможно, с его способностью изменять тиоловый статус внутри и снаружи клетки к снижать рНь до значений, оптимальных для роста Е-соИ в среде с высокой осмолярностью.

Штируемая литература

Apontoweil P., Beredns W., Biochim. Biophys. Acta, 1975, 399, p. 1-9.

2. Bakker E.P., Mangerich W.E., Biochim, Biophys. Acta, 1983, 730, p. 379-386.

3. Bakker E.P.. Booth I.R., Dinnbier U. et al., J.Bacterid., 1987, 169, p. 3743-3749.

4. Booth I., Microbiol. Rev., 1985, 49, p. 339-378.

5. Castle A.M., Hacnab, Shulman R.G., J. Biol. Chero., 1986, 261, p. 7797-7806.

6. Chonka L.N., Microbiol. Rev., 1989, 53, p. 121-147.

7. Dinnbier U., Limpinsel E,, Schmid R. et al., Arch, Microbiol . , 1988, 150, p, 348-357.

S. Epstein W., FEMS Microbiol. Rev., 1936, 39, p. 73-78.

9. Kroll R.B., Booth I.R.. Biochera. J., 1981, 198, p.691-696.

10. McLaggan D., Logan T.H., Lynn et al,. J. Bacterial., 1990, 172, p. 3631-3636.

11. Meury J.,Arch. Microbiol., 19SS, 149, p. 232-239.

12. Meury J,r Kepes A., EM80 J,, 1982, 1, p. 339-343.

13. Meury J,, Robin A,, Arch. Microbiol.,, 1990, 154, p. 475-482.

14. Munro (3.F. , Hercules «., Morgan J. et al . , J. Biol. Cham., 1972, 247, p. 3631-3636.

15. Puchkov E.G., Pinchukova I.A., Kosarev N.V., FEMS Microbiol. Lett., 1982, 13, p. 225-228.

16. Sutherland L., Cairney J.. Elmore M.J. et al«, J. Baeteri-ol. 1986, 168, p. 805-814,

17. Zilberstein D„, ftgmort V., Sehuldiner S., j. Bacteriol., 1984, 158. p. 246-252.

Глава 6, ДЕЙСТВИЕ УФ-СВЕТА И ПЕРЕКИСИ ВОЛРРОЯА.

Солнечный свет - один из Факторов окружающей среды, который может вызывать значительный стресс у микроорганизмов. Достигающее земной поверхности солнечное излучение включает ближний (320-400 нм) и средний УФ-свет (290-320 нм). Излучение в этом диапазоне вызывает летальный и мутагенный эффекты, ингибирова-ние роста и изменение проницаемости клеточной мембраны (Jagger, 19S3). Нарушение мембранной проницаемости при облучении ближним УФ-светом может вызывать окислительное повреждение. Предполагают, что механизм такого окислительного повреждения включает поглощение света эндогенными молекулами, их возбуждение, реакцию с кислородом с образованием его активных Форм, которые и являются первичными повреждающими агентами (Kramer,

Ames, 1987; Leven st al., 1990). ВерОЯТНО, ЭТО СЛУЖИТ ОДНОЙ ИЗ

главных причин большого сходства в действии на клетки микроорганизмов ближнего УФ-света и окислительного стресса, вызываемого перекисью водорода. Описываемые ниже эксперименты были предприняты с целью изучить эффекты этих двух различных окислительных факторов на исследуемые нами параметры культуры

Е. col i .

Облучение клеток е.со а К12, растущих в аэробных условиях на среде М9, ближним ультрафиолетом (290-380 нм, 2,3 w/м') приводило к временному повышению редокс-потенциала культуры (Рис. 27). Не обнаружено участия SH-rpynn в наблюдаемых изменениях Eh. Слежение за содержанием кислорода в среде показало, что облучение клеток ближним ультрафиолетом приводит к ингиби-рованию дыхания и, соответственно, к повышению парциального давления кисло}»да в среде. Возможно, что это и является главной причиной повышения еь в данной ситуации. После облучения растущих клеток е. coi i ближним УФ~светом наблюдали почти двухкратное снижение удельной скорости роста, снижение внутриклеточного пула К+ и увеличение внутриклеточного уровня небелко-

Time, rniu

Яис. 27. Действие ближнего и среднего УФ-света (290-380 нм) на растущие клетки Г • - Внутриклеточный К+, уровень внутриклеточных белковых и небелковых С") тиолов, й - удельная скорость роста (а1).

Рис. 28. Действие 0.9 МдЧ Нг0г на растущие клетки Стрелка показывает момент

добавления Н202-

вых тиолов. Уровень белковых тиолов увеличивался через 30 мин. после начала облучения (Рис. 27).

Облучение растущих клеток е.coi i УФ-еветом в широком диапазоне волн (230-400 нм, 4.7 w/м"), включающем ближний, средний и дальний УФ-свет, вызывало снижение редокс-потенциала в культуре E.caii 0 область отрицательных значений. Наблюдаемые изменения Eh ке были связаны с изменениями рН и р02 и являлись следствием изменения количества зн-трупп с наружной стороны клеток. Прямые измерения глутатиона в экстраклеточной жидкости показали, что после облучения широкополосным УФ-светом количество GSH с наружной стороны клеток увеличивалось на 40$*. Облучение ближним и широкополосным УФ-светом нерастущих культур E.coii К12, инкубируемых в среде МЭ без глюкозы, не приводило к существенным изменениям

Введение в растущую культуру E.coii q.q ^ jy^ приводило к скачку еь в область положительных значений (Рис. 28). Эксперименты показали, что повышение Eh после добавления перекиси водорода связано с ее действием на платиновый электрод и наблюдается как в среде с бактериями, так и без них. Н202 является активным редокс-агентом с положительным по отношению к платиновому электрода редокс-потенциалом. Быстрое снижение в область отрицательных значений наблюдалось только в среде МЭ с бактериями и связано с деструкцией Н202 клетками е. со и. При действии более высоких концентраций Н202 (10 мМ и выше) изменения Eh носили более сложный характер. Вначале наблюдали такой же скачок Eh в область положительных значений как и при действии небольших концентраций Н202. Но после снижения Eh д0 базового значения снижение Eh продолжалось далее в область отрицательных значений и затем наблюдали такой же скачок как при облучении клеток широкополосным УФ-светом или при стрессе голода. Изменения еь на этой Фазе можно было предотвратить обработкой клеток SH-реагентами. Таким образом, при действии больших концентраций Н202 на растущие клетки е.соИ% изменения ния наблюдаемые на первой стадии (повышение Eh и возврат к

базовому уровню), являются следствием взаимодействия платинового электрода с Н20г, тогда как изменение Eh на второй стадии после полной деструкции перекиси водорода связаны с увеличением количества зн_групп с наружной стороны клеток.

Обработка растущих клеток е.соИ о.9 мМ Н202 вызывала снижение скорости роста бактерий вдвое, снижение уровня внутриклеточного К+ и повышение количества небелковых и белковых sH-rpynn (Рис. 28). Таким образом, изменение указанных выше параметров при облучении клеток ближним УФ-светом и обработка Нг02 носили одинаковый характер, наблюдалось снижение уровня KÎ и повышение уровня тиолов.

Выход К+ ранее наблюдался в клетках розы после экспозиции к УФ-свету (Huerta, Murphy, 1939). Предполагается, что в индукции выхода К+ участвуют активные виды кислорода. Возможно, что это справедливо и для е. coi i t поскольку обработка клеток Н20г ведет к такому же снижению пула К+, как и при облучении ближним УФ-светом.

Ранее не сообщалось об изменении уровней внутриклеточных белковых и небелковых тиолов при облучении е. coi i ближним УФ~ -светом и обработке Н20г. Увеличение уровня глутатиона после обработки Е-сои в низкими концентрациям оксидантов 8-гидро-хинолина и т-бутилпероксида наблюдали Ромеро и Канада (Romero, canada, 1991). Сообщалось также об увеличении уровня внутриклеточных ТИОЛОВ У Histoplasma capsulatum g 0ТВвТ На МЯГКИЙ окислительный стресс (Leith, Hazen, 1986). Механизм увеличения уровня небелковых тиолов может включать экспрессию глутатион-редуктазы, которая поддерживает gsh в восстановленном состоянии. У SaiíroDn&i la typhímurivm. глутатион-редуктаза находится под контролем регуляторного гена °>;ук, активируемого Н202 (chrietman et ai., 1985), Участвуют ли Ферменты биосинтеза gsh в отклике Е-сои на окислительный стресс в настоящее время неизвестно, хотя имеются косвенные данные в пользу этого предположения (ñlonso-Maraga et al., 1987).

Какую роль может играть увеличение содержания небелковых

тиолов у в. сои ПрИ экспозиции к Н202? В клетках животных gsh играет ключевую роль в деструкции Н202 и органических гидроперекисей в реакциях, катализируемых глутатион-пероксидазой и глутатион-3-трансФеразой (Reed, eeatiy, 1980), Hoyi'-^öii активности обоих ферментов отсутствуют, поэтому предполагается, что GSH у е. сои Не функционирует как антиоксидант и что его основная роль при действии оксидантов - поддержание зн~групп белков в восстановленном СОСТОЯНИИ (Sundquist, Fahev, 1989). К этому следует добавить, что данные о влиянии gsh На выживаемость клеток в. сои, обработанных оксидантатами, противоречивы (Gretenberg, Demple, 1986; Romero, Canada, 1991), Наблюдаемое нами увеличение небелковых тиолов (главным из которых у е.сои является GSH) после обработки оксидантами свидетельствуют в пользу того, что GSH может играть какую-то роль при окислительном стрессе. Одна из ролей При окислительном стрессе, вызываемом обработкой Н202 или облучением ближним УФ-еветом, может быть связана с регуляцией К+-выходных каналов, которые как предполагается могут контролироваться редоке-состоянием глутатиона (Meury, Robin, 1990). Одновременные изменения в уровнях внутриклеклеточных небелковых тиолов и К* после обработки оксидантами указывает на такую возможность (Рис. 27,28). Такой механизм может действовать и в клетках других организмов. Например, изменение уровня внутриклеточного esH оказывает значительное действие на выход К+ при облучении УФ-светом клеток роз (Huerta, Murphy, 19S9),

Увеличение количества тиолов с наружной стороны клеток после облучения широкополосным УФ-светом и обработки высокими дозами Н202 через (ди)тиол-дисульфидный обмен может способствовать поддержанию в восстановленном состоянии 5Н~групп белков, расположенных с наружной строны клеток.

Цитируемая литература

1. Alcnso-Moraga ft., Bocanegra Л., Torres J.И. et al . , Hoi. Cell. Biochem.,1987, 73, p. 61-68.

2. Christman M.F., Morgan R.W., Jacobson F,S. et al., Cell, 1985, 41, p. 753-762.

3. Sreenberg J.Т., Qemple В., J. Bacterid. , 1986, 16S, p. 1026-1029.

4. Huerta A.J., Murphy Т.Н., Plant Cell Environ., 19S9, 12, p. 825-830.

5. dagger J., Photochem. Fhatobiol. Rev., 19S3, 7, p. 1-73.

6. Kramer S.F., Ames B.N., J. Bacterid., 1987, 169, p.2259-2266.

7. Lelth K.M., Hazen K.C., Abstracts, Ann. Meeting American Sac. Microbiology, 1986, p. 410.

3. Leven S., Hsimberger ft., Eisenstark A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, 171, p. 1224-1223.

9. Meury J., Robin A., Arch. Microbiol., 1990, 154. p. 475-482.

10. Reed D.J., Beatty P.M., Rev. Biochero. Toxicol.,19S0, 2, p. 2.13-241.

1.1. Romero M.J.PI., Canada А.Т., Curr. Microbiol., 1991, 23, p. 85-38.

12. Sundquist A.R., Fahey R.C., J.Mol. Evol., 1939, 29, p.429-435.

EaaBfr 7- ВОССТАНОВЛЕНИЕ ФЕРРШИАНИЛА КЛЕТКАМИ е. сои.

Способность к восстановлению непроникающего оксиданта Фер-рицианида C^eCN, гексацианоферрат) проявляют клетки животных, растений И бактерий (crane et al., 19S5; Dahse et al., 1939), Было показано, что восстановление PeCN клетками эукариот сопровождается эакислением внеклеточной среды, деполяризацией

мембранного электрического потенциала и быстрым вытеканием К+. Однако мало известно о природе компонентов, участвующих в процессе восстановления Fscn и 0 функциях этого процесса (Bianfait, Luttge, 1<?вз). Наименее изучено восстановление феррицианида бактериями. Было предположено, что E.coii имеет систему трансмембранного -транспорта электронов, которая и осуществляет восстановление fbCN с наружной стороны клетки, однако образования АТр при восстановлении FeCN не было обнаружено (Hadjipetrou et ai., 1966), Предполагалось также, что экспорт тиолов из клетки не может принимать участия в восстановлении f&cn (crane et ai., 1981). Учитывая, что многие штаммы coli и S. typhimurium ЭКСКреТИРУЮТ GSH Б ОКрУЖаЮЩУЮ СРвДУ (Owenst Hartman. 1986), ц чт0 B3H может восстанавливать FeCN даже неферментативным путем, представляло интерес проверить возможность участия gsh в восстановлении феррицианида клетками E.coii. Другая цель описываемых ниже опытов: изучить изменения внутриклеточного пула Кт при восстановлении FecN и сравнить действие проникающего (Н20г) и непроникающего (FeCN) оксидан-тов на исследуемые нами параметры..

Добавление ресм (0.5-1.0 мМ) к растущим E.coii К12 вызывало снижение скорости роста бактерий при аэробных условиях до 55£, а при анаэробных - до 40# от контрольного уровня (Табл. 3). Скорость роста возвращалась к первоначальному уровню как только весь Fecn восстанавливался.

При аэробных и анаэробных условиях скорость восстановления FeCN клетками Е-colt «12 на минимальной среде с глюкозой была 0.071 наномолей/мин./107 клеток и 0.102 наномоля/мин./10' клеток соответственно. Эти данные близки к тем, которые были доложены для е. coii AN704, находящихся в ранней лаг-фазе (сгап® st al., 1981).

Клетки E.coii 821, дефицитные по биосинтезу глутатиона и растущие на среде М9 с глюкозой и необходимыми аминокислотами, восстанавливали FsCN со скоростью в 10 раз меньшей, чем клетки

дикого типа. Феррицианид не восстанавливался клетками, если аминокислоты не были добавлены в ростовую среду. Наиболее высокая скорость восстановления феррицианида этими клетками (0,036 нМ/мик./Ю' клеток) наблюдалась при их росте на среде М9 с глюкозой, необходимыми аминокислотами и пептоном (0,2$). В клетках Е-coli инкубируемых на среде с глюкозой в отсутствие сульфата как единственного источника серы, Ферри-цианидредуктазная активность (ФРА) была на 50% ниже, чем у клеток, растущих в присутствии сульфата.

Некоторые данные, полученные в этих опытах свидетельствуют о том, что редокс-система, восстанавливающая Fe-cn, отличается от дыхательной редокс-системы у е.сои, конечным акцептором электронов в которой является кислород. Хорошо известно, что в аэробных условиях (в отсутствие FaCNj, когда функционирует последняя из названных выше систем, добавление глюкозы в культуру резко активирует дыхание и, соответственно, потребление кислорода. Для функционирования редокс-системы, восстанавливающей Fbcn, наличие экзогенных источников энергии, до известной степени, было не обязательно. Клетки, инкубируемые в аэробных условиях без экзогенного источника углерода и энергии (среда М9 без глюкозы), восстанавливали fscn с такой ке скоростью, как и клетки, инкубируемые с глюкозой. Добавление глюкозы к таким клеткам не изменяло скорости восстановления fbcn. И только в клетках, инкубируемых без глюкозы в течение 48 часов, скорость восстановления f^cn была в два раза ниже, чем в клетках, растущих на среде М9 с глюкозой (Табл. 3). Добавление глюкозы к таким клеткам приводило к двухкратному увеличению скорости восстановления феррицианида. Не замечено выраженной конкуренции между двумя редокс-системами. Так при анаэробных условиях, включение аэрации не влияло на скорость восстановления FeCN. с другой стороны, добавление феррицианида в аэробную культуру E.coii приводило лишь к временному снижению потребления кислорода. Его потребление восстанавливалось до первоначального уровня через 15 мин. после добавления окси-

данта, хотя donee половины FeCN еще находилось в окисленной форме и его восстановление продолжалось.

Обработка клеток е. coi i феррицианидом вызывала двухкратное снижение внутриклеточного уровня небелковых тиолов как в растущих, так и в нерастущих клетках, инкубируемых без глюкозы в течение 24 часов (Табл. 3). В клетках, инкубируемых без глюкозы в течение 48 часов, внутриклеточный уровень небелковых тиолов составлял 50$ от уровня тиолов в клетках, растущих на среде МЭ с глюкозой. Обработка таких клеток f<*cn приводила к снижению уровня небелковых тиолов на 26;?, тогда как уровень белковых sH-rpynn повышался на 2Ь%.

Восстановление 0.5-1.0 M FeCN клетками е.сои в аэробных условиях приводило к снижению внутриклеточного пула К+ на \Ъ% (Рис. 29). В клетках, инкубируемых без глюкозы, уровень К* после обработки Реем не изменялся.

Как было показано выше, увеличение осмотического давления в среде культивирования е.coi i приводит к повышению внутриклеточного пула К1" и небелковых тиолов. В описываемой ниже серии экспериментов клетки coli, не обработанные FeCN, откликались на гиперосмотический шок, вызываемый добавлением 0.6 M Nacif преходящим увеличением внутриклеточного К+ на 50$. Через 10 мин. концентрация К"*" в этих клетках снижалась, но все еще превышала первоначальный уровень на 20,%. В клетках, предварительно обработанных Феррицианидом, внутриклеточный пул калия увеличивался после осмотического шока на 80S и через 20 мин. снижался до первоначального уровня (Рис. 29).

Клетки, которые не были обработаны FeCN, откликались на гиперосмотический шок преходящим увеличением внутриклеточных тиолов на 33$, тогда как в клетках, обработанных FeCN, их уровень увеличивался на 22%. Скорость восстановления Fgcn клетками е.coi i после добавления M flaC1 в среду увеличивалась вдвое (Рис. 29).

йнгибирование роста клеток, обработанных перед осмотическим

Рис. 29. Действие Феррицианида (1 мМ) и осмотического шока СО.6 М NaCi) на г.coii ¡(12. • - внутриклеточный К+, ° - небелковые SH-группы. о _ белковые SH-группы. Д - концентрация FeCN, — Eh.

Рис. 30. Действие еульфгидвипьных реагентов на восстановление ферри-цианкда клетками е.соч, 1 - 1 мМ пХМБ добавлен до обработки клеток феррицианидом, 2-1 мМ пХМБ добавлен через 7 мин. после обработки клеток Феррицианидом. в момент, указанный стрелкой,

3 - 0.5 мМ mem добавлено перед обработкой клеток феррицианидом.

4 - контроль.

Таблица 3. Эффект условий культивирования на скорость восстановления феррицианида, уровни внутриклеточных небе лковых тиолов и скорость роста сои.

Условия Скорость вое- Небелковые Удельная

становления вн-группы, скорость

Реем, (нМ/мин./ мкМ/г сух. роста,-

10* клеток клеток час-1

—Fe СМ +FeC Н -FeCN +FeCN

Бактерии росли с глюкозой:

а) аэробно 0.071+0.013 12.4+0.-3 7.13+0.58 0.64 0.35

б) анаэробно 0.102+0.05 не опр. не опр. 0.41 0.17

Перед обработкой клетки инкубировались без глюкозы:

а) 24 часа 0.08 +0.014 15.8+0.57 8.2+0.13

б) 48 часов 0.036+0,009 5.8 +0.36 4.3+0.49

шоком FeCN, продолжалось в два раза дольше, чем в культурах, необработанных FeCN. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что предобработка Феррицианидом модифицирует отклик Е- сои на осмотический шок. Ранее было высказано предположение о том, что глутатион может играть важную роль в осмоадаптации E.coli (McLaggan et al-, 1990). ВОЗМОЖНО, ЧТО наблюдаемое В наших опыытах увеличение времени осмоадаптации у клеток, обра-

ботанных FeCN, связано с понижением уровня ШТ.

Обработка е.соИ сульфгидрильными реагентами пХМБ или nem ингибировала Феррицианид-редунтазную активность при добавлении реагентов до или после обработки клеток оксидантом (Рис. 30). Ингибитор иС-ятРазы ДЦКД но влиял на ФРА. Е.сои, растущие с глюкозой в аэробных условиях, закисляют среду, экскретируя ацетат, лактат и сукцинат. Добавление FsCn к таким клеткам приводит к заметному увеличению скорости закисления (Рис. 31). Б аэрируемой культуре, инкубируемой в среде М9 без глюкозы, значение pH не изменяется. Восстановление FeCN в такой культуре сопровождалось снижением pH. В среде МЗ без клеток восстановление Феррицианида природным редуктантом глуатионом также сопровождалось закислением среды (Рис.32).

Следующие данные указывают на возможность участия низкомолекулярных тиолов, в частности GSH, в восстановлении непрони-никающего оксиданта феррицианида.

1. Низкая ФРА у клеток E.coit 821, дефицитных по биосинтезу gsh. Известно, что клетки этого штамма не экскретируют ßSH в Среду (Owens, Hartman, 1986).

2. йнгибированке ФРА сульфгидрильными реагентами.

3. Снижение ФРА в клетках, голодающих по сульфату,

4. Увеличение ФРА в клетках, подвергнутых осмотическому шоку, для которых характерно повышенное количество ssh.

5. Падение уровня небелковых тиолов в клетках, восстанавливающих FeCN.

Возможность участия SSH в восстановлении феррицианида подтверждается также данными о его экскреции в среду как клетками Других штаммов так И другими бактериями (Owens, Hart-

man, 1986). Низкий редоке-потенциал ssh достаточен для того, чтобы быть донором в феррицианид-редуктазной реакции. Бзн быстро реагирует с феррицианидом даже без участия ферментов"

Как и в эукариотических клетках восстановление FeCN клетками Е-сои сопровождается закислением среды. Среди гипотез,

PeCH

Рис. 31. Изменения рН при восстановлении Феррициаккда: (.1) - Клетки е- ca¡í К12 росли не среда с глшсзой; (2) - клетки инкубкро&йлись бег глюкозы, пунктиром показано изменение рН в культуре, необработанной Феррицианидом. Стрелки покг&ывайт момент добавления ^есгд. Среда содержала фосфатный буфер, разведенный в 10 раз.

FeCH GSK GEH

Рис. Ü'itniCJiteHwe ixwVBOprt, OB.Ü.«.'(i«Htíe С ЮСьТаНОЬЛенИиИ ií«rpp:Ui№J-i¡U!.- !*)!yi-írrw>HCM_ E twf'HpyeMCÍÍ CPWl*,

Со?да - фосфатиьй ov'K'i1 1:1".

предложенных для объяснения этого феномена, можно выделить три (Dahse et ai., 1989), Согласно первой, у эукариот восстановление FeCN осуществляет редокс-система, которая действует одновременно как редокс Н^-помпа, подобно той, которая Функцио-онирует в мембранах бактерий и митохондрий. По другой гипотеэе предполагается, что система, восстанавливающая FeCN, переносит через мембрану только электроны, тогда как протоны зкскре-тируютея мембранной АТРааой, действующей как протоннный насос. Б обоих случаях предполагается, что трансмембранные векторные реакции, являющиеся источниками протонов, приводят к закисле-нию экстраклеточного раствора. По третьей гипотезе предполагается, что система, восстанавливающая феррицианид, переносит только электроны, а экстраклеточное закисление является результатом конверсии "сильного" трехвалентного аниона Феррициа-нида в "сильный" четырехвалентный анион ферроцианида (Suem et al., 1988). Согласно SID концепции - 5trong-iDn concent-

ration difference) увеличение концентрации сильных анионов по сравнению с сильными катионами приводит к зачислению среды (Stewart, 1983). Такое поведение наблюдалось при восстановлении f-'eCN дифенилкарбазидом в бесклеточкой среде. В нашей работе показано, что восстановление feCN природным редуктантом BSH в бесклеточной среде также приводит к закислению среды (Рис. З2). Это может указывать на то, что закисление среды, наблюдаемое при восстановлении Fecw клетками f.coli может быть вызвано взаимодействием оксиданта с глутатионон снаружи клетки.

Наблюдаемое в опытах снижение пула внутриклеточного калия может быть результатом действия оксиданта на К+-выходные каналы. Как указывалось выше, предполагается, что эти каналы контролируются редскс-состоянием глутатиона (»eury, Robin, 1990). FeCN может вызыьать выход К+ либо опосредованно путем изменения в редокс-состоянии esH по обе стороны цитоплазматической мембраны, либо путем окисления экстраклеточных редокс-чувствк-тельных сайтов в этих каналах. Сейчас нет данных о существовании таких сайтов у £-сои, поэтому на сегодняшний день первое

предположение предпочтительнее.

В клетках E.ccut инкубируемых без глюкозы, К+-выходные каналы закрыты (Меигу, Керев, 1982), ВОЗМОЖНО, ЭТИМ ОбьЯСНЯеТСЯ отсутствие потери К+ в таких клетках после добавления FeCN.

Предполагается- что у эукариот восстановление Реем выполняется системой, которая включена в регуляцию клеточного роста, транспорта питательных веществ и нормального Функционирования клеточных мембран (Crane et al., 1985: Dahee st al., 1939; Bienfait, Luttge, 1988). Ранее 0ЫЛО предположено, ЧТО SSH,

экскретируемый клетками е.сои в среду, может защищать клетки ОТ тяжелых металлов И других ТОКСИЧНЫХ агентов (Owens, Hartman, 1986), Мы предполагаем, что редокс-система с'участием gsh может также вносить вклад в генерацию электрического тока бактериями в биоэлектрохимических батареях, особенно, в отсутствие искусственных проникающих медиаторов (Allen, 1972). Можно предположить также, что одной из основных функций такой системы может быть регуляция транспортных систем путем поддержания SH-групп транспортных систем по обе стороны цитоплазма-тической мембраны в необходимом для данной ситуации редокс-состоянии.

Интересно сравнить действие проникающего (Н202) и непроникающего (FeCN) оксидантов. В обоих случаях наблюдалось ингиби-рование роста, выход части калия в среду и повышение количества SH-групп в белка;»:, но в первом случае наблюдали повышение уровня внутриклеточных небелковых тиолов, а во втором - их снижение.. Одно из возможных объяснений может быть связано с тем, что при действии Н202 основную роль в деструкции оксидан-та у E.coii играет каталаза (Loewen, i984), Во втором случае главная роль может принадлежать глутатиону.

В биотехнологии и зспериментальной практике воздействие на е. coii проникающим и непроникающими оксидантами может быть использовано как прием, позволяющий модулировать внутриклеточную концентрацию низкомолекулярных тиолов у е.сои. в некоторых

ситуациях этот прием может быть предпочтительнее, чем традици-оные приемы с использованием 5н-реагентов типа мем как более "мягкий".

Цитируемая литература

1. Allen M.J., In Methods in Microbiology, Vol. 6B, 1972, Academic Press, L., 1972, p. 247-283.

2. Bienfait F., LBttgs U., Plant Physiol. Biochem.f 1938, 26, p. 665-671.

3. Crane F.L., Sun I.L., In Biomedical and clinical aspects of coenzyme G, Vol. 3, Amsterdam, 1931, p. 183-1904. Crane F.L., Sun I.L., Clark et al., Biochim. Biophys.

Acta, 1985, 811, p. 233-264.

5. Dahse I,, Bernstein M. , МБНег E. et al . , Biochem. Physiol. Pflanяen, 1989, IBS, p. 145-180.

3. Epstein W.5 FEMS Microbiol.' Rev., 1986, 39, p. 73-78.

9. Buern J., Uj Irich-Eberius C.I., In Plasma issrabrane oxido-reductases in control of animal and plant growth, 1988, NATO ASI Series A. V. 157, Plenum, N.Y., p. 253-262.

10. Hadjipetrou L.P., Bray - Young Т., Lilly M.D., J.Gen. Microbiol. , 1966, 45, p. 479-4B8.

11. Loewen P., J. Bacterial,, 1984, 157, p. 622-626.

12. McLaggan D. , Logan 7.M., Lynn D.G. et al., J. Bacterioi., 1990, 172, p. 3631-3636.

13. Meury J., Kepes A., EMBO J., 1982, i, p. 339-343.

14. Meury J., Robin A,, Arch. Microbiol., 1990, 154, p. 475-482.

15. Munro 6.F., Hercules K., Morgan et al , , J. Biol. Chem., 1972, 247, p. 1272-1280.

16. Owens R.A., Hartman P.E., J. Bacterioi., 1986, 168, p.109-114.

17. Stewart P.A., Can. u. Physiol. Pharmacol., 1983, 61, p. 1444-1461.

Глава S, ЗАКИСЛЕНИЕ ЦИТОПЛАЗМЫ У е. сои и s.typhimurium СНИЖАЕТ МУТАГЕННЫЙ ЭФФЕКТ н-мтЛ-М:НЖРО-м-НИТРОЗОГУA^WA •

Было показано, что у энтеробактерий экстраклеточный глута~ тион, добавленный искусственно в среду, может оказывать защитный эффект против токсического и мутагенного действия экзогенных веществ, включая алкилирувщий агент ы-метил-м-нитро-м~ -нитрозогуанидин (МННГ). Подсказывалось, что такой -защитный механизм против мутагенов мог бы действовать и в естественных условиях, поскольку было показано, что ряд штаммов в.соИ и s. typhiima-ivm. экскретируют значительные количества GSH в среду (cwens, Hartman, 195ба,ь). Однако ситуация не так проста, кал это кажется на первый взляд, т.к. внутри клетки тиолы могут обладать обратным эффектом, они активируют некоторые мутагены, включая МННГ (Lawiey, Thatcher, 1970). Как было показано выше» у в.сои при закислении цитоплазмы повышается уровень внеклеточных небелковых тиолов, тогда как уровень внутриклеточных небелковых тиолов снижается (Глава 3). Учитывая роль тиолов в модификации мутагенного действия алкилирующих агентов, представляло интерес исследовать отклик бактерий E.coli и S. typhimuri-am на деЙСТВИе МКНГ ПРИ ИЗМ6Н6НИИ рН цитоплазмы.

Закисление цитоплазмы E.coli в/г trp перед обработкой клеток МННГ снизало его мутагенный эффект почти до спонтанного уровня. Закисление цитоплазмы в этих опытах достигалось обработкой клеток солями слабых проникающих кислот ацетатом натрия (50 мМ) или пропионатом натрия (50 мМ) при рН0 6,3, (Рис. 33). Когда внутриклеточный рН увеличивали обработкой клеток, растущих при рН 8.1, слабым проникающим основанием метиламином (80 мМ), мутагенная активность МННГ не изменялась. Мутагенный эффект МННГ не изменялся также, если обработке МННГ предшествовал щелочной шифт среды от 6.0 до 8.1. Предварительная обработка клеток typhiruxiriain. ТД1535 ацетатом при рН 6.9 не влкя-

1000

600

а 400

200

2 3 4 5 6 7 Ш1Г мкг/мл ■

9 10

Рис. 33. Действие предобработки ацетатом или пропионатом натрия на МНИ -индуцируемый мутагенез в клетках

Е.соИ В/г ггр~.

■ - действие МННГ без добавок, * - за 20 мин. до обработки клеток мутагеном в среду добавлен ацетат натрия или пропионат натрия С*). Клетки росли в среде М9 с 2 г/л глюкозы. рН в.9.

20 40 60 ВО 100 Время, мин.

Рис. 34. Анаэробиоа и обработка ацетат« натрия стимулируют экспрессию гена а^Е в клетках Е-соа МУ1563.

д - количество внутриклеточных БН-г; * " индукция Я-галактозидазной активности, выраженная в единицах Милл« п, ■ - бактерии обработаны ацетатом при аэробных условиях, Д, А -анаэробно растущие клетки. • ~ контроль, аэробно растущие клетки.

ла на мутагенный эффект МННГ. Снижение частоты мутаций на два порядка у этих бактерий наблюдалось, если предварительная обработка ацетатом (50 мЮ производилась при рНй 5.5. Увеличение pH цитоплазмы обработкой метиламином при рН0 8 Л не оказывало существенного влияния на мутагенность МННГ.

Зачисление цитоплазмы вызывало преходящее снижение уровня небелковых sh-групп в клетках Е-соИ в/г trp . 33 целом, кинетика изменений количества внутриклеточных тиолов у е.coli в/г trp и E.coii к12 была одинаковой- Однако клетки е.соИ в/г trp , как и другие ауксотрофные штаммы е.соИ, в отличие от прототрофных штаммов не увеличивали уровень внеклеточных тиолов и не генерировали скачок Eh в ответ на обработку ацетатом.

Каким образом закисление цитоплазмы и снижение уровня небелковых тиолов может защищать клетки от мутагенного действия МННГ? Известно, что vitro наибольшей способностью к метилированию ДНК и индукции мутаций обладает не МННГ, а его интер-медиаты. Образованию таких генотоксичных интермедиатов способствует нейтральный pH и присутствие тиолов, включая gsh. Так падение pH в среде инкубации от 7.79 до 6.95 увеличивало стабильность МННГ в 4-5 раз. Добавление цистеина к раствору МННГ в концентрациях, обычно присутствующих в клетках, ускоря-ряло деградацию МННГ более, чем в 200 раз и значительно увеличивало скорость метилирования ДНК. В оытах in ^ivo было показано, что степень метилирования ДНК в клетках животных зависит от содержания тиолов (Lawley, Thatcher, 1970). Мутантные клетки s- typhi murium и E.coii c пониженным КОЛИЧвСТВОМ GSH иЫЛИ более устойчивы к ряду алкилирующих соединений, включая МННГ

(Sedgwick, Robins, 19Б0; Mohn et al., 1985; Owens, Hartman, 1986a), Возможно, что наиболее благоприятная ситуация для защиты клеток от алкилирующих соединений, включая МННГ, создается тогда, когда содержание небелковых тиолов понижено внутри клетки И повышено снаружи (Kerklaan et al., 1985s Owens, Hartman , 1936a).

Учитывая приведенные выше данные, ясна природа защитного

действия закисления цитоплазмы у е.соИ. Оба процесса, снижение рН цитоплазмы и вызванное им снижение уровня внутриклеточных небелковых тиолов, ингибируют образование активных ин-термедиатов МШ1Г внутри клеток. Б клетках е.соИ дикого типа увеличение уровня в среде, вызванное зачислением цитоплазмы, может активировать детоксикацию МННГ на "дальних рубе-

Й10.Л .

у Е.сои защитный эффект ацетата против действия МННГ наблюдался при более ВЫСОКИХ рН, чем У typh.iнa^ri■uлlф Принимая во внимание, что изменение во внутриклеточном рН при действии слабых кислот зависит в определенной степени от рН среда и от действия механизмов поддержания гомеостаза, мы предполагаем, что у 1урьлтиг1\ш при рн среды 6.9 ацетат не вызывает изменений рН.ь, достаточных для индукции отклика. Такие изменения у этих бактерий могут иметь место при более низком значении ДрН. Действительно, клетки 1урпХташга-шп. физиологически более устойчивы к изменениям внутриклеточного рН, вызываемым длительным закислением рН среды, чшЕ-со1£ (Н1скеу, Hiгs^lfield, 1990).

Изученная ситуация, в которой снижение мутагенного действия МННГ вызывалось закиспением цитоплазмы> может показаться искусственной. Однако эта модель может быть полезной для изучения и понимания реальных ситуаций, возникающих при действии алкилирующих агентов, подобных МННГ. Данные других исследователей и наши данные позволяют предположить, что когда внутриклеточный рН и уровни небелковых тиолов внутри и снаружи меняются под действием внешних или внутренних Факторов, то можно ожидать, что мутагенные и токсические эффекты соединений, чья активность зависит от указанных выше параметров, могут также изменяться. Данные об изменениях внутриклеточного рН и уровней тиолов при стрессах и нормальных Физиологических состояниях в клетках различных типов показывают, что такие ситуации случаются весьма часто.

Цитируемая литература

1. Hiekey E.W,, Hirshfield I.N., fippl. Enviror». Microbiol., 1990, 56, p. 1039-1045.

2. Kerl; 1aan P.R.M., Zoetemelk C.E.H., Mohn Q.R., Biochem. Pharmacol. , .1985, 34, p. 2151-2156.

3. Lawiey P.D., Thatcher СЛ., Biochen. 0., 1970, 116, p.693-707.

4. Mohn G-, de Knijff Р., Baars A., Mutation Res., 1988, .Ii, p. 25-31.

5. Owens R.A., Hartman P.E., Environ. Hutagen., 1986a, 8, p .659-673.

6. Owens R.A., Hartman P.E., J. Bacteriol. 1986b, 109, p.109-114.

7. Sedgwick В.. P.obins Р., Mol. t3en. Senst,, 1980, 130, p. 85-90.

Глава 9. МОДУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ at<n* и suu при ИЗМЕШНКИ

X тиолов.

Ранее было показало, что при действии на е. coi i небольших доз алкилирующего соединения н-метил-м -нитро~м~нитрозогуани-дина (МННГ) наблюдается индуцибельнкй ОТКЛИК (Samson, Cairns, 1977). Отклик сопровождался увеличением выживаемости и снижением выхода мутаций после обработки высокими дозами МННГ. Этот репарационный процесс был назван адаптивным откликом (¿egga et ai., 1977). Адаптивный отклик являлся результатом увеличения экспрессии четырех генов: регуляторного гена ada> а так»® генов aifcM. aihB и aids. Наименее изучена роль и Функция aiciß гена. Было показано, что этот ген обладает уникальным свойством, он может индуцироваться как алкилирующим агентом аега-за-висимым образом, так и «de-независимым образом при переходе

клеток К анаэробиозу (Voikert et al., 1989а).

Поскольку известно, что клетки, растущие в анаэробных условиях, имеют более низкий рН, чем растущие в аэробных условиях, было интересно исследовать влияние изменений внутриклеточного рН на экспрессию гена aide. Далее если, как было показано выше, снижение pHt защищает клетки от действия МННГ, представляло интерес выяснить не происходит ли этот процесс с участием ¿"^-контролируемых генов.

Для оценки экспрессии генов были использованы штаммы Е- со-li, несуще слияние гена IclcZ с указанными выше генами адаптивного ОТКЛИКа (Voikert et ai., 1936).

Б наших опытах было обнаружено, что закисление цитоплазмы E.coii KV1563 raidB-iacZï ацетатом натрия (50 мм) при рН 6.8 вызывало почти двухкратное увеличение экспрессии гена aidB (Рис. 34). Этот эффект наблюдался в аэрирумой культуре без обработки МННГ. Повышение уровня экспрессии aidB наблюдалось уже через 15 мин. после обработки клеток ацетатом и сохранялось в течение 90 мин. наблюдения. Уровень экспрессии aidB, индуцируемый ацетатом, был близок к тому, который наблюдался при анаэробном росте в отсутствие МННГ (Voikert et ai., 1989«, рис. 34), но был более низким, чем в клетках, обработанных алкилирующим агентом (voikert et ai.,1989b). при тех же условиях обработка клеток Е. col i Л»'1571 (alkA-iacZ) и ^'1601 (aiks-iacz> не изменяла уровня экспрессии этих генов. Поскольку эти гены находятся под контролем гена ada, регулятор-ного гена адаптивного отклика, можно сделать вывод, что индукция гена aiciB закислением цитоплазмы, возможно, является ««^-независимым процессом. Добавление ацетата натрия снижало скорость роста всех испытанных штаммов в два pesa и не отмечено значительных отличий в скорости роста этих штаммов при действии ацетата. Щелочной шишт не индуцировал гены адаптивного отклика alkB ут aidB, g КЛеТКаХ E.coli С0 СЛИЯНИЕМ alkA-iacZ щелочной шифт вызывал увеличение /*-галактозидазной активности на 70%,

14 закислоние цитоплазмы, и анаэробиоз снижали уровень непротеиновых SH-групп У E.coli MV1563 (nidB-lacZ) (Рис. 34). Такое же снижение в уровнях 05Н и общего количества низкомолекулярных тиолов в анаэробных условиях наблюдали и ранее в других штаммах E.coli (Fahey et ai., 197S; Loswen, 1979). Искусственное снижение уровня зн-групп при обработке wem (0.2 мМ) вызывало увеличение экспрессии гена aidB в 1.6 раза через 90 мин. после обработки (Рис. 36), не влияя на экспрессию остальных генов адаптивного отклика.

Представляло интерес сравнить индукцию ««^-регулируемых генов с индукцией генов sos-ответа. Этот ответ индуцируется УФ--облучением и большим числом ДНК-повреждаюших агентов (Walker, 19S4). ранее было показано, что увеличение pHt при щелочном шиФте Е-сои ведет к увеличению экспрессии гена принад-

лежащего к SOS-семейству (Schuldiner et al., 1936). Другой ген ЭТОГО семейства suM CsfiA> иНДУШРУеТСЯ H20z (Sosrüch et al,. 1989; Васильева C.B. с соавт., 1991)- Восстанавливающий агент дитиотреитол (ДГТ) увеличивает экспрессию ключевого гена

ЗОЗ-о^вета гвсА (Claycanp st al., 1990).

В этих опытах использовали клетки E.coli dm4000, несущие слияние suiA-iacz (chaudhury, Smith, 19ВЭ). Увеличение активности /з-галактозидазы в этих клетках наблюдали при щелочном шиФте, после обработки тиосалициловой кислотой и Н202, В противоположность oidB не индуцировался этими агентами. Не было отклика su и На обработку ацетатом и (Табл. 4). Щелочной шифт вызывал увеличение в уровнях небелковых тиолов у

E.coli DM4000 (РИС. 35).

Возмогло, что индукция вызываемая закислением цито-

плазмы, опосредуется изменением в тиоловом статусе. Известно, что у E.coit большое число генов тиол-чувствительны fJavor, 1989). Ген возможно, один из генов, которые, наоборот,

чувствительны к снижению уровня восстановленных тиолов. С другой стороны обнаружена группа генов, индуцируемых снижением

Рис. 35 Эффект щелочного шифта на Е-со и

Ш4000 (аа!А-1апг).

А - количество внутриклеточных БН-групп, ж - индукция ^-галактози-дааной активности при щелочном шифте,

• " контроль. При щелочном шифте рН среды увеличивался добавлением ЫаОН от 7 до в течение 5 мин.

Рис, 36. Действие 0.2 NEM На индукцию гена aidE и 1 м.М тиосалициловой кислоты на индукцию гена sulA.

ф - [.coli MV1563, г., ж _ Е. coli DM4000, о, л _ обработанные клетки, *. - контроль.

внутриклеточного рН < "-Хопсгеивкз. е! э.1., 19В7). в настоящее время трудно отличить эффект р!^ от влияния тиолового статуса на индукцию поскольку существует взаимосвязь между этими

двумя параметрами (ВаЬкег, мапдвгхсн, 1982, Глава 3). Учитывая кинетику отклика на закисление цитоплазмы и меи, следует

предпочесть первый из этих Факторов, поскольку реакция на закисление цитоплазмы была более быстрой, чем на обработку

Таблица 4. Индукция гонов ^^и л гтр^ различных обработках.

Обработка

Гены ацетат кем щелочной тиосалици- Н,02

натрия °.2 нмфт ловая кис- 0.9

50 мМ мМ лота, 1 мМ мМ

aidB sulA

Недавно в группе д-ра Волкерта из Массачусеттского университета получены новые данные о регуляции гена aidB. Авторы использовали предложенный нами способ активации гена <^idB посредством обработки растущих клеток е.coi i ацетатом натрия при рН ниже 6.8. (Landini et al., 1994, Volkert et al.. 1994). Наиболее важным результатом этой работы было обнаружение того факта, что ген aidB находится под контрэлем сложной системы, существенной частью которой является ген batF. функции этого гена в последнее время интенсивно изучались в разных группах исследователей и было выясненено, что он является регуяяторным

геном системы, ответственной sa Функционирование клетки при стрессе голода и вхождении в стационарную фазу. Особый инте~ рес для нас представляют данные о том, что в определенных условиях hatf может быть индуцирован обработкой клеток слабыми Проникающими кислотами (Shelhorn, Stcnes, 1992), На рисунке 37 показаны два пути индукции гена ^¿¿в. Первый путь (а) связан со специфической ««^-зависимой индукцией этого гена при адаптивном отклике е.coït на действие небольших количеств алкили~ рующих агентов. Второй путь (б) связан с неспецифической batf--зависимой индукцией при закислении цитоплазмы и, возможно, при действии больших концентраций МННГ. Известно, что МННГ может действовать как агент, реагирующий с тиолами (Owens,

Hartman, 1986), ПОЭТОМУ, ВОЗМОЖНО, ЧТО ДеЙСТВуЯ В боЛЬШИХ ДОзах, он таг"»® как NEM будет вызывать закислекие цитоплазмы, активируя К+ДГ~ антипорт (Bakker, Mangerich,1982).

j—a-► Алкилировакие

МННГ

ДНК I

aidB

j

—> Реакция -► Снижение pHt-" ^atr-1

с тиолами и тиолового

статуса

Слабые проникающие кислоты

Рис. 37. Пути индукции а1с1В гена.

Сравнивая поведение генов и э^ы следует отметить, что а) оба гена откликаются на обработки, вызывающие изменения рН.ь или тиолового статуса; б) е£сШ к откликаются на действие этих обработок противоположным образом. Известно, что адаптив-

ный отклик и sos-ответ взаимодействуют определенным образом и это взаимодействие носит скорее негативный характер (Defais et ai- 1980; Васильева и др., 1991>■ Возможно, что описываемый выше Феномен как-то связан с интерференцией между адаптивным откликом и 3°£>-ответом.

цитируемая литература

1- Васильева С,В., йекандарова К.А., Махова Е.В., Генетика, 1991, 27 (5), 809-819.

2. Bäkker Е.Р., Msngerich W.E., FEBS Lett., 1982, 140, p. 177-180.

3. CIayeamp U.S., Ho K.-K., DeRose С., Mutat. Res., 1990, 235, p. 101—109.

4. Defais M. , Jegqo P., Samson L. et al., Mol. Gen. Genet., 1980, 177, p. 653-659.

5. Fahev B.C., Brown W.C., Adams Ы.В. et al., J. Bacterial., 1973, 133, p. 1126-1129.

6. Soar 1 ich О.P., Qui Harriet P., Hofnung 14. , J . Bacteriol., 19S9, 171, p. 6141-6147.

7. Javor G.T., J. Bacteriol. , 19B9, 171, p. 56.07-5613.

8. Jeggo P., J. Bacteriol., 1979, 139, p. 783-791.

9. Loewen P.C., Can. J. Biochem., 1979, 57, p. 107-111.

10. Owens R.A., Hartman P.E., Environ. Mutagen,, 1986, S, p, 659-673.

11. Samson L., Cairns L., Nature, 1972, 267. p. 281-283.

12. Schul diner S,} ftgmor V., Brandsna J. et al.» J. Bacteriol., 1986, 168, p. 936-939.

13 Shell horn H.E., Stones V.L., J. Bacterial., 1992, 174, p. 4769-4776.

.1.4 Volkert H.R., Nguyen D.C., Beard K.C., Genetics, .1986, 112, p. 11-26.

15. Volkert M.R., Hajec L.I., Nguyen O.C., 3. Bacteriol.,

1989a, 171, p. 1196-1.19B.

16. Vol kart M.R., 8«tely F.H-, Hajec L.R. , Mutât. Res., 1939b, 217, p. 109-115.

17. Landini P., Ha jec L.I., Vclkiart M.R.,J. Bacterid., i<?94 , 176, 6583-6589.

18. Volkert M.R., Hajec L.I., Matijsevic Z., Fang F.C., Prinea R,, -J. Bacteriol,, 1994 , 176, 763S-7645,

19. Walker B.C., Microbiol. Rev., 1984» 48, p. 60-93.

20. ' 1 cnchew&ki 0.1, , Gonzalez T.N., Bartolosiew F.ri. et al., J. Bacterial., 1987, 169, p.3001-3006.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассмотренный вше цикл исследований начался с обнаружения скачка редокс-потенциала в культурах грамотрицательных бактерий Escherichia colt {,<17, растущих на синтетической среде, при исчерпании в среде глюкозы как единственного источника углерода и энергии. Основной причиной, по которой этот феномен привлек наше внимание, было отсутствие прямой связи между наблюдаемыми изменениями и изменениями рН и содержания кислорода, т.е. фактора;®, которые, как известно, весьма существенно влияют на редокс-потенциал в бактериальных культурах (Работно-ва, 1957; Jacob» 1970). Дальнейшие исследования позволили, во-первых, подробно описать влияние физико-химических параметров среды и свойств клеток е.соИ на параметры скачка при стрессе голода, во-вторых, обнаружить такого рода скачки в культурах грамположительных бактерий Б. subi i lis и В. megatercumt в-третьих, обнаружить другие ситуации, в которых такой скачок генерируется (тепловой шок, окислительный стресс, облучение УФ-све-том). Были также обнаружены ситуации, в которых наблюдали не снижение Eh, а его повышение (осмотический шок, обработка ТФФ ). Исследования показали, что наиболее существенный вклад в изменения еь б этих ситуациях у прототрофных штаммов е.соИ

и B.sMotiiis вносят изменения уровней внеклеточных тиолов как растворенных в культуральной жидкости, так и ассоциированных с наружной поверхностью клетки. Эти данные имеют особое значение, т.к. считается, что идентификация конкретных физико-химических Факторов (других, чем рН и р02), ответственных за изменения Eh в таких сложных многокомпонентных системах как бактериальные культуры, является трудной, а порой неразрешимой задачей (Harrison, 1972). ЕыЯВЛвНИб роли тиолов и, В частности, глутатиона в наблюдаемых изменениях £h является одним из немногих примеров решения указанной выше проблемы. Следует отметить, что в аэрируемых культурах ауксотрофных штаммов £.coit% растущих на синтетических средах с добавлением аминокислот или пептона, интерпретация изменений Eh при стрессах не вызывает затруднений, т.к. они почти целиком связаны с изменениями р02.

Если изменения внеклеточных тиолов при стрессах были обнаружены только в культурах прототрофных вггаммов, то изменения внутриклеточных тиолов наблюдались и в прототрофных и в ауксотрофных штаммах. Как и в случае с внеклеточными тиолами (и еь) различаются два противоположных типа отклика внутриклеточных низкомолекулярных тиолов. Понижение уровня низкомолекулярных тиолов, как первая реакция на воздействие, наблюдалось при за-кислении цитоплазмы ацетатом натрия, при действии непроникающего оксиданта феррицианида, при обработке осмопротектором бетаином клеток, растущих при повышенной осмолярности среды и повышенном рН среда или цитоплазмы. Учитывая данные Лоевена, к этому списку следует добавить переход клеток к анаэробному

РОСТУ И ИСЧерПаНИе В среде аММОНИЯ (Loewen, 1979).

Повышение уровня внутриклеточных низкомолекулярных тиолов наблюдалось в ответ на щелочной вифг среды, облучение клеток близким УФ-светом, действие проникающего оксиданта Н202. Подтверждены также данные о повышении уровня глутатиона при осмотическом шоке, сообщенные ранее другими авторами (Munro et al,. 1972; McLaggan et al., 1990; Раздел 5.2)- РёакЦИЯ ТИОЛОВ на стресс голода, вызываемый исчерпанием глюкозы в среде, за-

висит от плотности бактериальной культуры. При высокой плот-кости исчерпание глюкозы приводит к повышению уровня низкомолекулярных ТИОЛОВ, при НИЗКОЙ - к снижению ИХ уровня (Loewen, 1979; Глава I).

Возможность изменений уровней внутри- и внеклеточных низкомолекулярных тиолов (и еь) путем изменения внутриклеточного pH и известные данные об изменениях р}^ при стрессах у Е-саЫ позволяют предполагать, что изменения рН^ могут играть определенную роль в изменениях указанных выше трех параметров при стрессах.

Если в случае с внеклеточными тиолами Си Eh) и внутриклеточными низкомолекулярными тиолами отмечены два противоположных типа отклика на стресс, то увеличение количества зн-групп в белках как первая реакция на воздействие наблюдалось при всех изученных стрессах. Учитывая весьма общий характер метода измерения SH-rpynn в белках, было бы преждевременно делать вывод о том, что увеличение количества SH-групп в белках является универсальной реакцией клеток на любой стресс. Мошо лишь ограничиться предположением, что наблюдаемый эффект связан либо с увеличением активности тиол-транс®ераз, которые катализируют БЗН-зависимое восстановление дис-ульфидных связей в белках (Sundquist, Fshey, 1939), либо тем, что синтезируемые в ответ на воздействие стрессовые белки имеют повышенное количество sHTpynn.

Данные других исследователей в совокупности с данными представленными в этой работе позволяют предположить, что изменение внутриклеточного пула калия на первой стадии отклика на стресс является универсальной реакцией. Повышение уровня как реакцию E.coii На стресс наблюдали при гиперосмотическом (Epstein, 1986) и тепловом шоках (Глава 4), при повышении pH среды (Рис. 16), закислении цитоплазмы (Рис, 15) и переходе к анаэробному росту (Puchkov et а1., 1982, Глава 5). Снижение уровня наблюдали при стрессе голода (Kaliini et al., 1981;

i Ко.осмотическое j Шшлеша...срейы....;

i

К -выходные ■................каналы........

aSH+BBSo , GSH/eSSG

-р т

редокс-актйвные вещества, тяжелые металлы| алкилирующие

активность Ферментов

метаболизм глутатиона

энергетическимi статус клетки ¡

KVn^-обмен .й.ащ.йш.ш'......

рН. (Д^Н, ДФ)

т

рН0, протоно-"

форы,слабые кислоты и основания..............

ис. 38, Предполагаемая взаимосвязь между внутриклеточным рН, рансмембранными потоками К"1" и уровнями внутри- и внеклеточных изкомолекулярных тиолов у Е. col i.

зйствии редокс-активных агентов, тяжелых металлов и апки-чрующих агентов экзогенной и эндогенной природы. Эти факторы эгут изменять рИ^, действуя прямо на "существенные" тиояовые эуппы и дисульфидные связи в ионных каналах и переносчиках та опосредованно через изменение в концентрации и редокс-сос->янии низкомолекулярных тиолов и дисульфидов.- В некоторых

Рис.11)> облучении ближним иу~Светом (Рис. 27), действии н2°г (Рис. 28) и непроникающего оксиданта Феррицианида (Рис. 29). Следует обратить внимание, что в последних 4-х ситуациях полного выхода калия из клеток не наблюдалось. Как правило, внутриклеточный пул калия уменьшался на 15-201.

Обнаружение корреляции между изменениями внутриклеточных уровней К+ и низкомолекулярных тиолов, особенно на первой фазе отклика на ряд стрессов - еще один результат рассмотренных в этой работе исследований.

Какое значение для Физиологии клетки могут иметь наблюдаемые при переходных процессах изменения внутриклеточного калия, редокс-потенциала и уровней ниэкомолеклярных тиолов?

Б нашей группе было предположено, что внутриклеточный рК, трансмембранные ионные потоки и внутриклеточные уровни низкомолекулярных тиолов (и внеклеточные уровни тиолов для клеток прототрофных штаммов) взаимосвязаны (Рис.38). Согласно гипотезе, Факторы, прямо или косвенно изменяющие рН: , вызывают такие изменения метаболизма, которые ведут к изменениям уровней низкомолекулярных тиолов (БМТ) внутри, а в ряде случаев и снаружи клетки. Предполагается, что закисление цитоплазмы вызывает снижение уровня ШТ внутри клетки и повышение - снаружи. Заще-лачивание цитоплазмы вызывает противоложный эффект. Постулируемая связь между величиной р1\ и уровнями ШТ обеспечивается наличием рН-чувствительных ферментов, осуществляющих метаболизм, редокс-превращения и транспорт тиолов через цитоплазма-тическую мембрану. Взаимосвязь рассматриваемых параметров предполагает, что факторы, изменяющие уровни НМТ внутри и снаружи клетки, будут вызывать соответствующие изменения внутриклеточного рН за счет измененения скорости и направления трансмембранных потоков ионов (в первую очередь К"1"), сопряженных с движением протонов, вследствие присутствия редокс--чувствительных элементов в каналах и переносчиках. Это может иметь место в случае аэробно-анаэробных переходов, при

случаях клетки могут изменять по обе стороны цитоплазмати-ческой мембраны сами через изменение в соотношении низкомолекулярные тиолы/дисульфиды.

Указанные выше изменения pHt и редоке-статуса КМТ могут не только влиять друг на друга, но и изменять активность различных функциональных компонентов клетки. Прямое влияние изменений рН на энзиматическую активность известно. Неоднократно указывалось, что модуляция тиол/дисульфидного соотношения in viva {.южет быть сопряжена с метаболической регуляцией Ферментов В Процессе ТИОЛ-ДИСУЛЬфИДНОГО Обмена (Ziegler, 1985) и, что соотношение Rsh/rssr может выполнять роль биологического "третичного мессенджера" (Gilbert, 19В2). в работе (Roth et ai., 1983) указывается на возможность существования взаимосвязи между внутриклеточным рН и редокс-состоянием цитоплазмы в метаболическом контроле реакций "стимул-отклик" в клетках зукариот и приведены данные об участии редокс-пары gsh/ esse в сопряжении этих реакций.

Робиллард к Конингс показали, что механизм ДРН зависимых изменений в активности трех различных транспортных систем у е.сои представляет собой редоке-реакции, включающую дитиол-дисульфидную взакмоконверсию (Robillard, Koninge, 1982). Допускается, что в определенных условиях в интактных клетках такого рода реакции могут протекать с участием gsh или тиоредок-сина (Koninge, Poo1 man,1987;. Показано наличие большого числа тиолчувствительных генов у E-caii, ответственных за синтез стрессовых белков (Javor, 19S9).

Результаты зкпериментов, описанных в этой работе, и ряд данных других авторов могут расматриваться как аргументы в пользу предложенной гипотезы. В первую очередь, это представленные в работе данные о модуляции уровней НМТ при изменении внутриклеточного рН. Наблюдаемые в этих опытах изменения уровней НМТ хорошо согласуются с данными о рН-профилях ферментов биосинтеза gsh. активность которых - является определяющей В реГУЛЯЦИИ УРОВНЯ ВНУТрИКЛеТОЧНОГО ГЛУТаТИОНа (Apontoweil,

Berends, 1975; ftlor,so-Moraga et al., 1987).

Далее, нет сомнения в том, что у Е-соИ действительно происходят изменения внутриклеточных уровней GSH при разного рода переходных, состояниях. Изменения уровня bsh в свою очередь сопровождаются изменениями соотношения gsh/gssg. Было сообщено, что у е. coli падение внутриклеточного уровня esw на 2Ь% сопровождается снижением соотношения gsh/gssg в 2,7 раза (ftionso--Moraga et al. , 1987). В ПерИОДИЧвСКОЙ КУЛЬТУРв бактерий S-faecal is в процессе роста изменения уровня ssh сопровождаются изменением соотношения gsh/gssg в пределах, достаточных для влияния на активность неорганической пирофосфатазы (Lahtí, su_ апраз, 1982). Следует обратить внимание на роль других ШТ. Лоевен сообщил, что значительные количества смешанного дисульфида коэнзим А-глутатиона (Coftsse) образуются при переходе Е.сои в анаэробиоз, при стрессе голода вследствие исчерпания глюкозы или аммония, при обработке кем, фторидом и ингибиторами синтеза белка- ln vitro этот дисульфид ингибировал активность PHK-Полимеразы (Loewen, 19?'S; Bees, Loewen , 1979) .

Из сказанного выше следует, что изменения уровня gsh и, соответственно, соотношения gsh/qssg, ПрИ стрессах, в том числе и при изменении внутриклеточного pH могут существенно влиять на редоке-ситуацию в бактериальной клетке.

Е.сои обладает сложной системой циркуляции К+ через цито-плааматическу» мембрану (Kreil. Booth, i9si, i9S3), Эта циркуляция осуществляется несколькими входными системами и функционирующими независимо от них К+~выходными канала!ли. Показано, что активность этих каналов может контролироваться редокс-сос-тоянием клеток и глутатион играет важную роль в этом процессе (Meury, Kepes, 1932; Meury, Robin, 1990). Аминокислотная последовательность продукта гена kefс, являющегося важным компонентом IC-выходной системы Kef с, имеет сходство с глутатион-утилизирующими энзимами (Munro et al., 1991). С другой СТОРОНЫ, известно, что существует взаимосвязь между скоростью и

направлением трансмембранных потоков К+ и внутриклеточным рК. К+ играет исключительно важную роль в поддержании гомеостаза внутриклеточного рН (Кго11, Воо^, 1983).

Накопленные к настоящему времени данные указывают на то, что при стрессах, вызываемых разными факторами, в поведении бактерий обнаруживаются некоторые одинаковые реакции. С другой стороны, известно множество случаев кросс - протекции. когда под воздействием какого-либо достаточно специфического фактора индуцируется устойчивость к неблагоприятным воздействиям другого рода. Приведем лишь примеры, в которых кросс-реакции проявляются при изменении рН среды или внутриклеточного рН. Рост е.сои при кислых значениях рН среды ведет к увеличению устойчивости к УФ-облучению, независящей от индукции зоз_Системы Сбооавоп, яомьигу, 1991), тогда как шифт рН0 в область щелочных значений ведет к экспрессии гена находящегося под контролем 303-системы (ЗеИиКПпег ^ З.1., 1986). Кислотный шфт у е.сои индуцирует ряд белков, среди которых белки теплового шока, белки, индуцируемые повышением осмолярности среда

ИЛИ анаэробиозом. <Неус1е М-, Рог 1а Пег Н, . 1990). ВОЗМОЖНО,

что, будучи факторами неспецифической природы, изменения

уровней ШТ и соотношения тиолы/дисульфиды и, неразрывно связанные с этим изменения внутриклеточного рН, могут вносить вклад в кросс-реакции при отклике бактерий на стрессы.

Взаимосвязанные реакции, определяющие направление ионных потоков, внутриклеточный рН и соотношение низкомолекулярные тиолы/дисульфиды, могут составлять существенную часть сенсорного и исполнительного механизмов, реагирующих на изменения параметров среды и клетки. На первой стадии отклика такой механизм может выступать как неспецифическая конститутивная система быстрого реагирования, не требующая синтеза белков поио.

Цитируемая литература

1. Работнова К.Л., Роль физико-химических Факторов (pH и гнг) в жизнедеятельности 1957,Москва, АН СССР.

2. Alonso-Moraga A., Bocanegra ft., Torres J.M., Lopes-Ba-rea J., Pueyo С., Mol. Cell Вiосhem., 1987, 73, p. 61-68.

3. Apontoweil P., Berends W., Biochim. Biophys. ficta, 1775, 399, p. 1-9,

4. Bees Ы.С., Loewen P., Can. u. Biochem., 1979, 57, p. 336-345.

5. Epstein W., FEMS Microbiol.Rev., 19S6, 39, p. 73-7B.

6. Gilbert H.F,, J. Biol. Chem., 1932, 257(20), p. 12086-12091.

7. Goodson, Rowbury, J. ftppl. Bacterial., 1991, 70, p. 177-180.

8. Harrison D.E.P., J. ftppl. Chsm., 1972, 22, p. 417-440.

9. Heyde K., Portalier R. , FEMS Microbiol. Lett., 1990, 69, p, 19-26.

10 Jacob H.E., Redox potential. In Methods in Microbiology, 1970, V.2, P- 91-123.

11. Javor G.T., Л. Bacterid., 19B9, 171, p. 5607-5613.

12. Kalimi G., Henriques B.M.A., Peraira L., Indian. J. Exp. Biol., 1961, 19, p. SOS-ail.

13. Konings W.N., Poolman В., in Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms, 19B7, ASH, Washington, (Torriani-Gcrii et al.,),p. 197-204.

14. Kroll R.G., Booth I.R., Biochem. J., 1981, 198, p. 691-698.

15. Kroll R.G., Booth I.R., Biochem. J., 19S3, 216, p. 709-716,

16. Lahti R.5 Suonpaa M., J.Gen. Microbiol1932,128, p.1023-1026.

17. Loewen P., Can. J. Biochem., 197S, 56, p. 753-759.

18. Loc-wen p., Can ad. J. Biochem. , 1979, 57. p. 107-111.

19. McLaggan D., Logan T.M., Lynn et al-, J. Bacterial., .1.990, 172. p. 3631-3636.

20 Meury J.., Kepes A., EMBC J., 1982, 1, 339-343.

21. Meury J., Robin A., Arch. Microbiol., 1990, 154, p. 475-482.

22. Munro S.F., Hercules K., Morgan J. et aX., J. Biol. Chera.. 1972, 24?, p. 3631-3636,

23. KcLaggan 0., Logan T.M., Lynn O.G., Epstein W., J. Bacteriol . , 1990, .172, p. 3631-363.6.

24. Munro A.M., Ritchie B.Y,, Lamb A.J., Douglas R.M., Booth I.R., Molecular Microbiology, 1991, 5(3),

p. 607-616.

25. Pucbkov B.C., Pinchukova V.A., Kosarev N.V., FEMS Microbiol. Lett.. 1982, 13, p. 225-223.

26. Robillard G.T., Konings W.N., Eur. J. Biochem., 1982, 127, p. 597-604.

27. Roth Z., Chayen N., Dikstein S., Int. Rev. Cytol., 1933, 85, p. 39-61.

23. Schuldiner S., Agmort V,, Brandsma J., Cohen fi., Friedman E., Padan E., J- Bacteriol., 1986, 16S, p.. 936-939.

29. Ziegler D.M., Ann. Rev, Biochem., 1985, 54. p. 305-329.

ВЫВОДЫ

1. В культурах грамотрицательных бактерий Escherichia coli

И Serratia marcegc&ns и ГраМПОЛОЖИТвЛЬНЫХ баКТврИЙ Bacillus sub til is и Bacillus msgateri-um. обнаружены СКаЧКИ РвДОКС-ПОТвН-циала в область отрицательных значений при переходе клеток в стационарную фазу вследствие исчерпания в среде источников углерода и энергии или аммония. Эти скачки Eh прямо не связаны

с изменения®! рН и содержания кислорода в среде. Наибольший вклад в изменение Eh при стрессе голода вносит изменение уровня внеклеточных тиолов, как растворенных в культуральной жидкости, так и ассоциированных с клеточной поверхностью.

2. Скачкообразное падение Eh, связанное с увеличением количества тиолов с наружной стороны клеток, обнаружено также в растущих культурах: Escherichia cali При обработках, В6ДУЩИХ К закислению цитоплазмы, при тепловом и гипоосмотическом шоке, при окислительном стрессе, при воздействии ингибиторами белкового синтеза и облучении растущих клеток высокими дозами УФ--света (230-400 нм).

3. Повышение еь, связанное со снижением количества внеклеточных ТИОЛОВ, обнаружено при гиперосмотическом шоке Escherichia сои и при обработке клеток проникающим катионом тетра-фенилфосфония.

4. Выявлено два противоположных типа отклика внутриклеточных низкомолекулярных тиолов (НМТ) на стрессы. Понижение уровня низко-молекулярных тиолов, как первая реакция на воздействие, наблюдалось при закислении цитоплазмы ацетатом натрия, при действии непроникающего оксиданта феррицианида, при обработке бетаином клеток, растущих при повышенной осмолярности среды и повышенном рН среды или цитоплазмы. Повышение уровня внутриклеточных низкомолекулярных тиолов наблюдалось в ответ на щелочной шифт среды, облучение клеток ближним УФ-светом и действие Н20а.

5. Обнаружена корреляция между изменениями внутриклеточных уровней низкомолекулярных тиолов и калия на начальной фазе отклика е.соа на стрессы.

6. Показано, что обработка растущих клеток ацетатом натрия при рн среды 6.S (£■ coii) и 5,5 (s. typhimwc-ivm) снижает мутагенное действие алкилирующего соединения м-метил-и-нитро-и--нитрозогуанидина (МННГ).

7. Показано, что ген относящийся к семейству генов,

откликающихся на обработку е.сои алкилирующими соединениями, может быть также индуцирован закислением цитоплазмы.

8. Установлено, что осмопротектор бетаин стимулирует рост, ускоряет выход К+ в среду и снижает внутриклеточный пул низкомолекулярных тиолов & клетках coli, растущих при повышенном pH среды или цитоплазмы. Бетаин также ускоряет снижение внутриклеточного пула низкомолекулярных тиолов в клетках, растущих при повышенной осмолярности среды. Закислеше цитоплазмы и обработка клеток SH-реагентами снижают экспрессию осмочувстви-тельного гена prout продукт которого участвует в транспорте бетаина.

9. Получены данные, свидетельствующие об участии глутатиона в восстановлении непроникающего оксиданта феррицианида.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1- Октябрьский О.Н., Пшеничное P.A., Ткаченко А. Г., Зеленин E.H., Смирнова Г.В, Изменение окислительно - восстановительного ПОТеКЦИала ПРИ ССТаНОВК« роста Escherichia, coli. Микробиология, 1981, т.50, в.З, с.467-470.

2. Октябрьский О.Н., Пшеничное P.A. Изменения редокси-потен-циала и р02 при тепловом шоке Escherichia coli. МИКРОБИОЛОГИЯ. 1982, т.51, в.З, с.515-517.

з- Октябрьский О.Н., Зеленин E.H., Смирнова Г.В. Изменения редокс-потенциала при переходных процессах в чистых и смешанных культурах Escherichia coli „ Serratia marces-cans. Биофизика, 1984, т.29, в.2, с.294-297.

4. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., Зеленин E.H. Динамика ре-докс-потенциала в культуре е.сои в режиме периодического

культиви-рования. Биофизика, 1984, т.29, в.5, с.831-834,

5- Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Периодические культуры Es~ chsrichia сои с добавлением субстрата при различных условиях аэрации. Микробиология, 1984, т.53, в.5, с.738-743. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Влияние ацетата на рост Escherichia coli в аЭробНЫХ И анаэробных УСЛОВИЯХ.

Микробиология, 1985,т.54, в.2, с.252-256.

7. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Изменения редокс-потенциа-ла в культурах в. s-ubttiis и их связь с электрическими параметрами клеток. Биофизика, 1986, т.31, в.З, с.459-463.

8. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Зависимость изменений редокс-потенциала среды при остановке роста бактерий от характера клеточной поверхности. Известия АН СССР, серия

биологическая, 1986, № 4, с.616-620.

Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Влияние активности первичных протонных помп на рост е. coi i в присутствии ацетата. Микробиология, 1988, т.577, В.4, с.554-561.

iO- Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Изменение редокс-потенциала и количества доступных s-4~rpynn в культурах в. coi i и B.subtiiis при переходных процессах. Биохимия, 1988, т.53, в. 12, с.2042-2049.

Ii. Oktyabrsky Q.N., Smirnova S.V. Dynamics of redox potential in bacterial cultures growing in media containing diffe_ rent sources of carbon, energy and nitrogen. Acts Biotech-nológica, 1989, v.9, p.203-209.

Í2, Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Изменение количества 5И-соединений в культурах е.сои и в.зиытв При переходе в стационарную Фазу. Микробиология, 1990, т.57, в.З, с.387-393.

13. Oktyabrsky O.N. Golyasnaya N.V., Smirnova S.V., Demakov V.A., Posokhina N.Kh., Kholstova T.A. Acidification of Escherichia coli and Salmonella typhimurivi& cytoplasm reduced the mutagenic effect of N-methyl-N -nitro-

N-nitroeoguanidine. Mutation Research, 1993, v.293. p. 197-204.

14. Oktyabrsky Q.N., Smirncva S.V. Changes in intracellular potassium and thiol levels in Escherichia coli ¡<12 under various stresses. Biochemistry and Molecular Biology International, 1993, V.30, Mo 2, p.377-383.

15. Oktyabrsky O.N,, Smirnova S.V. Ferricyanide reduction by Escherichia coli cells; probable contribution of low molecular weight thiols. Bios1ectrochemistry and Bioenergetics, .1993, 32, p. 267-275.

16. Oktyabrsky O.N., Smirnova G.V. Changes in redox potential of Escherichia coli culture and in extracellular glutathione status under osmotic shock. Bioelectrochemist-rу and Bioenergetics, 1993, 32, p.237-294.

17. Smirnova S.V., Oktyabrsky O.N., Moshonkina E.V., Zakirova N.V. Induction of the alkylation-inducible aidB gene of Escherichia coli by cytoplasmic acidification and N-ethylmaleimide. Mutation Research, 1994, V.314, p.51-54».

IS. Smirnova G.V., Oktyabrsky O.N. Near—ultraviolet radiation and hydrogen peroxide modulate intracellular levels of potassium and thiols in Escherichia coli. Current Microbiology, 1994, У.27, p.77-79.

19. Smirnova G.V., Oktyabrsky O.N. Betaine modulates intracellular thiol *nd potassium levels in Escherichia, coli in medium with high osfiiolarity and alkaline pH. Arch, Microbiol., 1995, 163, p.76-78.

20. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Авторское свидетельство на изобретение: "Способ определения контаминации производственных бактериальных культур". S 1472507''от 15.12.1988.

Статьи в научных сборниках:

21. Октябрьский О.Н., Пшеничное P.A. Изменение окислительно-восстановительного потенциала при остановке роста клеток е.cotít сб. науч. трудов "Факторы развития бактериальных популяций", Свердловск, 1980, с.14-18.

22. Октябрьский O.K., Смирнова Г.В. Изменения редокс-потенциа-ла среды у Е- cclпри росте на различных источниках углерода и энергии. Сб. науч. трудов " Экология и популяцион-ная генетика микроорганизмов", Свердловск, 1987, с.76-78.

23- Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Изменения редокс-потенциа-ла в культурах е.сои на фоне лимитации по hgso^. Сб, науч. трудов "Экология и популяционная генетика микроорганизмов", Свердловск, 1987, с.76-78.

24. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Зависимость величины окислительно-восстановительного потенциала в культурах е.соИ

и в. subtil is от изменения компонентов электрохимического градиента протонов. Сб. научных трудов "Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций", Свердловск, 1990, с.13-17.

25. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Вклад различных энергодаю-щих систем при росте Е-coi i 3 культурах с подпиткой. Сб. научных трудов "Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций", Свердловск, 1990, с.13-17.

26. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Интерпретация физиологической сущности скачков редоке-потенциала в культурах бактерий. Сб. научных трудов "Физиология и биохимия микроорганизмов". Екатеринбург, 1992, с.1-11.

27- Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Предполагаемая роль низкомолекулярных тиолов в определении электрохимических свойств микроорганизмов. Сб. научных трудов "Физиология и биохимия микроорганизмов". Екатеринбург, 1992, с.12-17.

Тезисы:

28■ Октябрьский О.Н. Редокс-потенциал как индикатор переходных состояний у бактерий. Тезисы докл. VI! съезда ВМО, Алма-Ата, 1985, т.2, с,109.

29. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.Б. Редокс-потенциал как индикатор Физиологического состояния бактерий в культуре с добавлением субстрата. Тезисы докл. 4 Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов", Пущине, 1986, с.40.

30. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Контроль параметров среды для получения высокоурожайных культур в режиме с подпиткой. Тезисы докл. 4 Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов", Пущино, 1966, с.140.

sí. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-потенциал как индикатор переходных процессов в культурах бактерий. Тезисы докл. конференции "Биофизика микробных популяций", СО АН СССР, Красноярск, 1987, с.139.

32. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Ингибирование роста

i¿ в высокоурожайной культуре с подпиткой. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов". Пущино, 1989, с.82-83.

33. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Предполагаемая роль внутриклеточного рН и редокс-состояния низкомолекулярных тиолов в регуляции метаболизма бактерий. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма", Пущино. 1989, с.130.

34- Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Влияние изменений внутриклеточного рН на рост- культуры £-<=oit. Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма", Пущино, 1989, с.131.

зз. Новикова Л.Н., Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Изменение редокс-потенциала в культуре кишечной палочки при ингиби-ровании синтеза белка. Тезисы докл. международного симпо-

зиума "Проблемы токсикология и прикладной экологии", Ленинград, 1991, с.243

36. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Изменения редокс-потенциала и уровня низкоыолекулярных тиолов в культурах бактерий при разного рода стрессах. Тезисы докл. международного симпозиума "Проблемы токсикологии и прикладной экологии", Ленинград, 1991, с,244.

37. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н- Реакция редокс-потенциала в культуре кишечной палочки на облучение ближним и дальним УФ. Тезисы докл. международного симпозиума "Проблемы токсикологии и прикладной экологии". Ленинград, 1991, с.244.

38. Golyasnaya f-J.V. , Smirnova S.V.. Demakov V.fi. , Oktyabrsky O.N. Cytoplasm acidification in Escherichia coli B/r reduced the mutagenic effect MNNS. 21 finn, meeting of EEMS or: Environ, mutagens-cancirogsns, Abstract Books, Prague, 1991, P—1-17.

Мошонкина E.B., Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Модификация океидантом гексацианоферратом отклика е.соИ на ультрафиолетовое излучение. Тезисы докл. конференции "Проблемы токсикологии и эпидемиологии", 1993, Пермь, с.205-206. Политов К.Б., Октябрьский О.Н., Ямангулова Л.З. Изменение состояния суперспирализации ДНК Escherichia сои При заще~ лачивании среды и понижении внутриклеточного pH. Тезисы докл. конференции "Проблемы токсикологии и эпидемиологии", 1993, Пермь, с.209-210.

41. Smirnova G.V., Oktyabrsky O.N., Musica N.B. Near—ultraviolet radiation and hydrogen peroxide modulate intracellular levels of potassium and thiols in Escherichia coli. Tha 1995 International conference Environmental Pollution

(ICEP 95), St.Petersburg, 1995, 44.

42. Oktyabrsky D.N., Smirnova В.У. Ferricyanide reduction by Escherichia coli cells. The 1995 International conference Environmental Pollution (ICEP 95), St.Petersburg, 1995,63.

Техническая редакция "Пермского медицинского журнала" Тираж 100 экз.