Роль антиоксидантных систем в ответе бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола

Торхова, Оксана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль антиоксидантных систем в ответе бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль антиоксидантных систем в ответе бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола"

На правах рукописи

ТОРХОВА Оксана Александровна

РОЛЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ В ОТВЕТЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICH1A COLI НА ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ И АЦЕТАМИДОФЕНОЛА

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь-2004

Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор биологических наук Октябрьский О.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Соловых Г.Н.

доктор биологических наук, профессор Карпунина Т.И.

Ведущая организация: Институт микробиологии РАН, Москва

Защита состоится часов на заседании

диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (3422)44 67 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан

«АР»

феКьал*

и 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, чл.-корр. РАН,лХ

Ившина И.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В природной среде пребывание бактерий в условиях, оптимальных для размножения, является скорее исключением, чем правилом. Бактерии постоянно подвергаются воздействию разного рода стрессов, которые могут быть следствием резких изменений параметров окружающей среды. К их числу относится окислительный стресс. В обычных условиях уровень активных форм кислорода (АФК), способных повреждать практически все молекулярные компоненты клеток (белки, нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны), поддерживается на безопасном уровне благодаря активности антиоксидантных систем. В определенных условиях уровень оксидантов может превышать способности антиоксидантных систем к их детоксикации, следствием чего будет снижение активности клеток, вплоть до полной гибели. Бактерии конститутивно синтезируют антиоксидантные ферменты, а также обладают механизмами адаптивного ответа, благодаря которым предварительное действие малых доз оксидантов вызывает повышенную устойчивость к последующему действию больших доз. Ключевыми регуляторами адаптивных ответов у бактерий Escherichia coli являются транскрипционные факторы SoxRS и OxyR (и регуляторные гены soxRS и oxyR), которые индуцируют согласованную экспрессию групп генов (регулонов) в ответ на действие супероксидного аниона (О^) и перекиси водорода (НгОг), соответственно (Storz, Imlay, 1999; Pomposiello, Demple, 2002).

Причиной повышения АФК выше критического уровня может быть воздействие экзогенных оксидантов, таких как перекись водорода (Н2О2) или генераторы супероксидного аниона (О2") (паракват, менадион и др.). Одним из главных внутриклеточных источников АФК может быть дыхательная цепь, продуцирующая их, как побочные продукты в процессе аэробного метаболизма (Imlay, Fridovich, 1991; Gonzalez-Flecha, Demple, 1995). Повышение концентрации АФК до уровня, вызывающего окислительный стресс, может происходить в результате нарушения нормального метаболизма при экстремальных воздействиях. Изучение роли антиоксидантных систем и их активности у бактерий при различных воздействиях, не связанных с прямым действием экзогенных оксидантов, находится в начальной стадии. Роль антиоксидантных систем при воздействии на бактерии лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков - одна из мало изученных проблем в этой области. Хотя потенциальное участие антиоксидантных систем в устойчивости к антибиотикам и другим лекарственным препаратам в настоящее время не вызывает сомнений, остается много нереп Так

СПетерЛгрг,. J

» wo'

известно, что обработка бактерий Е coli рядом антибиотиков и лекарственных препаратов приводит к индукции гена sodA, кодирующего супероксиддисмутазу А, в то же время роль других компонентов антиоксидантной защиты изучена недостаточно. Нет ясности в вопросе о роли в устойчивости бактерий к антибиотикам и лекарственным препаратам такого важного антиоксиданта как глутатион, играющего в эукариотических клетках ключевую роль в защите от оксидантов и ксенобиотиков. Мало данных о влиянии такого широко распространенного препарата как ацетамидофенол (парацетамол) на активность антиоксидантных систем и их роль при действии этого препарата на бактерии. В совокупности анализ научной литературы показывает, что данные о роли этих систем в ответе бактерий Е. coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола немногочисленны и противоречивы. В этой связи выявление роли антиоксидантных систем на действие антибиотиков и ацетамидофенола является актуальной задачей.

Цель настоящего исследования - изучение роли антиоксидантных систем в ответе растущих бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков, обладающих разным механизмом действия, и ацетамидофенола.

Основные задачи исследований:

1. Используя штаммы со слияниями генов, кодирующих компоненты антиоксидантных систем с геном /?-галактозидазы, изучить влияние грамицидина, хлорамфеникола, рифамгащина и ацетамидофенола на экспрессию антиоксидантных генов.

2. Изучить влияние антибиотиков и ацетамидофенола на внутри- и внеклеточный статус глутатиона.

3. Используя штаммы Е. coli, несущие мутации в генах, кодирующих компоненты антиоксидантных систем, изучить роль этих систем в устойчивости бактерий к антибиотикам и ацетамидофенолу.

4. Исследовать влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных антибиотиками и ацетамидофенолом.

5. Исследовать комбинированное действие антибиотиков и ацетамидофенола на рост Е. coli.

ацетамидофенол приводит к снижению концентрации внутриклеточного глутатиона и к одновременному его повышению вне клеток. В то же время, обработка рифампицином вызывает повышение уровня внутриклеточного глутатиона при одновременном снижении внеклеточного глутатиона. Таким образом, показано, что антибиотики с разным механизмом действия способны влиять на концентрацию глутатиона внутри и снаружи клетки. Обнаружена существенная роль глутатиона в устойчивости к грамицидину, рифампицину и ацетамидофенолу. Показано, что обработка бактерий грамицидином и ацетамидофенолом приводит к изменениям в активности антиоксидантных систем, характерным для окислительного стресса. Обнаружено, что при совместном действии исследуемых антибиотиков с ацетамидофенолом ингибирующее действие этих соединений на рост носит аддитивный характер.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в этой работе данные расширяют представление о роли антиоксидантных систем в жизнедеятельности микроорганизмов и понимание механизмов, контролирующих адаптацию бактерий к различным стрессам, в том числе, к действию антибиотиков и других лекарственных веществ. Ацетамидофенол является основой популярных и широко применяемых в терапии лекарств (парацетамола, панадола, солпадеина и т.п.) Данные о действии ацетамидофенола на бактерии, а также комбинированного действия ацетамидофенола и антибиотков могут иметь практическое значение, поскольку затрагивают актуальные проблемы медицины и экологии микроорганизмов, связанные с воздействием антибиотиков и других лекарственных препаратов на нормальную микрофлору кишечника. Известно, что неконтролируемое применение антибиотиков и других лекарственных веществ часто приводит к побочным эффектам, связанным с подавлением нормальной микрофлоры и дисбактериозам. Наши исследования свидетельствуют о том, что одновременное применение ацетамидофенола и антибиотиков может потенциально усиливать их ингибирующее действие на рост и развитие Е. coli, являющейся представителем нормальной микрофлоры человека и животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Глутатион вносит вклад в защиту растущих бактерий Escherichia coli от грамицидина, рифампицина и ацетамидофенола.

2. Действие на клетки Е. coli грамицидина, рифамшщина и ацетамидофенола приводит к изменениям, характерным для окислительного стресса.

3. Обнаруживается выраженное сходство в действии грамицидина и ацетамидофенола на растущие клетки Е. coli.

4. При комбинированном действии ингибирующее действие ацетамидофенола и испытуемых антибиотиков на рост и накопление биомассы носит аддитивный характер.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 6-й и 7-й Пущинских школах - конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2002 и 2003 годы; на Межрегиональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии". Пермь, 2002 г.; Междисциплинарной конференции с международным участием "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека ("НБИТТ-21"), Петрозаводск, 2003.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 162 страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и 37 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 265 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение неспецифического отклика и адаптивных реакций клеток на различные стрессовые воздействия" (индекс приоритетного направления 4.1.13, номер госрегистрации 01910055305). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 01-04-48129 и № 03-04-49137.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы. Объектом исследования служили штаммы бактерий Escherichia colt

1. АВ1157 (дикий тип). Получен из Coli Genetic Stock Center (CGSC, США); 2. JTG10 (как AB1157, но несет мутацию gshA в гене, контролирующем синтез глутатиона). 3. BGF611 (как АВ1157, но несет имеет мутацию katG в гене, контролирующем синтез каталазы HPI). 4. GC4468 (дикий тип). 5. QC909 (как GC4468, но несет мутации sodAsodB, в генах, контролирующих синтез супероксиддисмутаз А и В). Штаммы 2-5 получены от проф. В. Demple, США. 6. SH646 (дикий тип). Получен от проф. Н. Suzuki, Япония. 7. SH641 (как SH646, но несет мутацию ggt в гене, контролирующем синтез у-глутамилтранспептидазы. Получен от проф. Н. Suzuki, Япония. 8. QC772, несет слияние

sodA::lacZ. Получен от проф. D. Touati, Франция. 9. TN521, (несет слияние soxS::!acZ; получен от проф. В. Demple, США), 10. МВ1417, несет слияние gorr.lacZ. Получен от проф. A. Eisenstark, США. 11-12. Штаммы MN23, несущий слияние katG::lacZ и MN33, несущий слияние katEr.lacZ сконструированы в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов ИЭГМ к.б.н. Музыка Н.Г., путем переноса плазмиды pRSkatEl6 из штамма AI1326 в АВ1157 и плазмиды рКТЮЗЗ из штамма RK4936 в штамм АВ1157, соответственно. 13. N9086 несет слияние sodA::lacZ. Получен от проф. К. Martin, США).

Условия культивирования. Клетки Е. coli выращивали на минеральной среде М9 (рН 7.0) следующего состава (г/л): Na2SO4' 12Н2О - 15.13; КН2РО4 - 3; NH4CI - 1; NaCl -0.5; MgSO4 7НгО - 0.246; СаСЬ - 0.011 с добавлением 4 г/л глюкозы, 0.2 % казаминовых кислот и тиамина (10 мкг/мл) (Miller, 1972). Там, где это было необходимо, в ночную культуру добавляли соответствующий антибиотик (25 мкг/мл). Бактерии Е. coli переносили с агарового косяка в стерильные флаконы, содержащие 100 мл среды, и культивировали в термостате при 37°С в течение 18-20 часов. 20 мл этой культуры переносили в 100 мл свежей среды такого же состава, и далее использовали для экспериментов. В зависимости от варианта опыта бактерии выращивали в аэробных или в микроаэрофильных условиях. В первом случае клетки Е. coli культивировали в колбах на установке для выращивания микроорганизмов УВМТ 12-250 при 37°С и 150 об/мин. Для создания микроаэрофильных условий бактерии культивировали в термостате без перемешивания. Предварительные измерения показали, что в этих условиях парциальное давление кислорода в среде падает до очень низких значений даже при невысо.<их плотностях биомассы. За ростом бактерий следили по изменению поглощения при 670 нм, измеряемому на фотометре КФК-3 (толщина кюветы 5 мм). Действие на бактерии антибиотиками и ацетамидофеполом проводили в середипе логарифмической фазы роста, когда плотность культуры составляла 0.3-0.4 г сухих клеток на литр.

Внутри- и внеклеточные уровни восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона определяли спектрофотометрически (Tietze, 1969) в последовательности, описанной ранее (Smimova et al., 2000). Содержание внутриклеточного калия определяли на пламенном фотометре по методу Мешу, Kepes (1982). Выживаемость клеток определяли на чашках Петри с использованием верхнего агара. Активность /?-галактозидазы в клетках Е. coli, несущих слияние промотора соответствующего гена с геном lacZ, измеряли по методу Миллера (Miller, 1972).

Обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excell (версия 7.0 для Windows) и Statistica 5.5A, вычисляя среднее значение,

стандартную ошибку и доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали согласно критерию Стьюдента, различия считались значимыми прир < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследований нами были выбраны три антибиотика, с хорошо изученными свойствами и обладающих разным механизмом действия. Грамицидин известен как мембранотрошшй агент, хлорамфеникол подавляет синтез белка на уровне рибосом, а рифампицин блокирует синтез белка на уровне транскрипции. Ацетамидофенол (парацетамол) выбран нами как соединение, являющееся, с одной стороны, основой для широко используемых лекарственных препаратов, а с другой — обладающее оксидантным действием на клетки эукариот. Действие ацетамидофенола на бактерии мало изучено.

Действие грамицидина. Одним из главных признаков окислительного стресса у бактерий является повышение уровня экспрессии антиоксидантных генов. В наших экспериментах действие на аэробно растущие клетки Е. coli грамицидина приводило х заметному повышению экспрессии трех антиоксидантных генов: sodA, soxS и gor. Грамицидин S в концентрации 10 мкг/мл оказывал выраженное и статистически достоверное действие на экспрессию гена sodA, в этом случае активность /?-галактозидазы в штамме Е. coli QC772, несущем слияние sodAr.lacZ, увеличивалась в 2 раза по сравнению с необработанными клетками. При действии 5 и 20 мкг/мл грамицидина S наблюдали увеличение экспрессии sodA в 1.1 и 1.9 раза, соответственно (рис. 1). Ген sodA у Е. coli кодирует супероксиддисмутазу SodA, которая играет ключевую роль в защите клеток от супероксидного стресса. sodA находится под контролем нескольких регуляторных генов, в том числе, двухгенной системы soxRS, контролирующей ответ на супероксидный стресс, а также генной системы marRAB, активация которой связана с устойчивостью бактерий к ряду антибиотиков (Pomposiello, Demple, 2002). В наших экспериментах грамицидин индуцировал экспрессию гена soxS, о чем свидетельствовало повышение активности у5-галактозидазы в клетках Е. coli TN521, несущих слияние soxS-:lacZ, на 29 % (р < 0.05).

Окисленный глутатион у Е. coli восстанавливается посредством NADPH-зависимой глутатионоксидоредуктазы (GOR), кодируемой геном gor. Обработка клеток Е. coli МВ1417, несущих слияние gor::lacZ, грамицидином вызывала повышение активности /лгалактозидазы на 57 % (рис. 1). Повышение экспрессии одновременно обоих генов

(sodA и soxS) свидетельствует о том, что в данном случае в качестве основного оксиданта, образующегося при действии грамицидина на клетки Е coh, может выступать супероксидный анион, но повышение экспрессии gor, находящегося под контролем гена oxyR, индуцируемого перекисью водорода, указывает на возможный вклад этого оксиданта.

Вместе с тестом на экспрессию антиоксидантных генов исследование поведения мутантов, дефицитных по активности антиоксидантных генов, дает дополнительную информацию о наличии признаков окислительного стресса у бактерий. Если в определенных условиях такие мутанты растут хуже, чем клетки дикого типа, то это может свидетельствовать о наличии признаков окислительного стресса в данной ситуации. Мы обнаружили, что из испытанных штаммов наибольшей чувствительностью к грамицидину обладали мутанты Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, и мутанты, дефицитные по супероксиддисмутазам А и В (рис.2).

В клетках эукариот снижение внутриклеточного глутатиона считается следствием окислительного стресса и его надежным индикатором. В нашей работе впервые показано, что обработка клеток грамицидином приводит к заметному изменению внутри- и внеклеточного статуса глутатиона. Наблюдалось снижение внутриклеточного уровня восстановленного глутатиона (08Ы) и соотношения 08Ы:0880 внутри клеток и

повышение уровня внеклеточного глутатиона. Сравнение изменений внутри- и внеклеточного глутатиона показало (табл. 1,2), что одной из причин снижения уровня глутатиона внутри клетки может быть экспорт глутатиона во внеклеточную среду. Прямое взаимодействие GSH с оксидантами может также вносить некоторый вклад в наблюдаемое нами снижение внутриклеточного глутатиона при действии грамицидина. В совокупности данные об изменениях уровня и редокс-статуса внутри- и внеклеточного глутатиона, поведении штаммов, дефицитных по синтезу глутатиона, и экспрессии гена gor указывают на важную роль глутатиона в защите Е. coli от действия грамицидина Оказывая положительное влияние на устойчивость Е. coli к грамицидину, глутатион может играть несколько взаимосвязанных ролей, выступая одновременно как антиоксидант, редокс-регулятор и компонент системы регуляции ионного баланса.

Вероятнее всего, признаки окислительного стресса при действии грамицидина могут быть следствием косвенного действия этого антибиотика, так как сам грамицидин, учитывая его свойства, не может служить в качестве оксиданта прямого действия. Известно, что основное действие грамицидина на Е. coli, связано с изменением проницаемости мембранных структур вследствие образования каналов для К+, Na+ и Н*. При этом происходит нарушение трансмембранных ионных потоков, о чем свидетельствует потеря части внутриклеточного калия (Katsu et al., 1986 и наша работа), изменения во внутриклеточном рН и электрическом мембранном потенциале (Katsu et al, 1986; Скулачев, 1989). Изменения свойств цитошгазматической мембраны при воздействии грамицидина как мембранотропного агента могут быть одной из причин повышенной продукции АФК. Возможно, что одним из первичных событий является иницируемый грамицидином выход части глутатиона в среду, что приводит к снижению антиоксидантного потенциала внутри клетки и повышению уровня АФК.

Суммируя приведенные выше данные, можно сделать вывод о наличии признаков окислительного стресса при действии грамицидина на растущие аэробно клетки Е. coli. В первую очередь, в пользу этого свидетельствует повышение экспрессии антиоксидантных генов в ответ на обработку клеток грамицидином и повышенная чувствительность к грамицидину мутантов по антиоксидантным генам. Дополнительным доказательством, в пользу наличия окислительного стресса при действии грамицидина служит также снижение уровня внутриклеточного глутатиона.

В наших условиях аэробно растущие клетки были более чувствительны к действию грамицидина (10 и 15 мкг/мл) при 42°С, чем при 37°С. Примечательно, что эукариотические клетки показывают также более высокую чувствительность к факторам,

вызывающим окислительный стресс, при повышенных температурах. Более того, считается, что одной из главных причин гибели аэробно растущих клеток разных типов (как эукариот, так и бактерий) при повышенных температурах является окислительный стресс (Lee et al. 1983; Freeman et al, 1990). Повышенная чувствительность аэробно растущих клеток Е. coli, к грамицидину при 42°С также может быть связана с окислительным стрессом.

Таблица 1.

Изменение внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSII,„) у Е. coli при действии антибиотиков и ацетамидофенола.

Время, мин Контроль Грамицидин S Хлорамфеникол Рифампицин Ацетамидо-фенол

0 19.2 ±0.8 17.5 ±1.3 18.0 ±0.59 19.0± 1.1 16.7 ±1.7

30 20.4 ±1.2 12.8 ±0.5 21.1 ±0.8 21.0 ±1.9 10.5 ±1.9

60 20.5 ± 0.8 12.0 ±1.5 21.7 ±0.4 24.2 ± 1.7 10.0 ±0.9

Примечание: концентрация GSHm выражена в мкмоль/г сух. клеток.

Таблица 2.

Изменение внеклеточного восстановленного глутатиона (С8Ноие) у Е. сой при действии антибиотиков и ацетамидофенола.

Время, мин Контроль Грамицидин S Хлорамфеникол Рифампицин Ацетамидо-фенол

0 8.5 ± 0.4 9.8 ±0.9 7.6 ±0.3 8.5 ± 0.5 8.4 ±0.5

20 8.6 ±0.4 13.7 ±0.7 7.3 ± 0.2 5.4 ± 0.5 9.5 ± 0.5

40 8.4 ±0.4 16.5 ± 1.2 7.8 ±0.3 4.8 ±0.4 9.9 ±0.5

60 8.5 ± 0.6 17.0 ±0.9 8.4 ±0.7 4.1 ±0.5 11.3 ±0.3

80 8.5 ± 0.7 16.4 ± 1.1 8.7 ±0.8 4.9 ± 0.7 10.8 ±0.6

Примечание: концентрация GSH0„t выражена в мкмоль/г сух. клеток.

Действие хлорамфеникола. Анализ изменений измеряемых нами параметров показывает, что, в отличие от грамицидина, действие на клетки Е. coli хлорамфеникола не приводила к появлению выраженных признаков окислительного стресса. В то же время, обработка этим антибиотиком заметно индуцировала экспрессию sodArJacZ^wa. 3), но не soxS. Один из путей активации sodA находится под контролем транскрипционного активатора МагА, играющего важную роль в устойчивости бактерий к антибиотикам, в том числе, и к хлорамфениколу (DeGroote et al, 1997). Возможно, наблюдаемое нами повышение экспрессии sodA может быть следствием активации МагА.

Наибольшее влияние на устойчивость к хлорамфениколу оказывала потеря активности двух супероксиддисмутаз А и В. Действие на аэробно растущие клетки Е. coli АВ1157 хлорамфеникола не приводило к существенным изменениям в статусе внутри- и внеклеточного глутатиона (табл. 1,2).

Действие рифампицина. Анализ изменений измеряемых нами параметров показывает, что обработка клеток Е. coli рифампицином приводила к появлению признаков окислительного стресса, хотя и выраженных в умеренной степени. К их числу относятся: более высокая чувствительность к этому антибиотику мутантов Е. coli,

дефицитных по синтезу каталазы-гидропероксидазы НР1 и синтезу глутатиона (рис. 4) и повышение экспрессии гена кодирующего супероксиддисмутазу А. Экспрессия в ответ на обработку рифампицином обнаруживалась и в мутанте таг ", что свидетельствует о том, что такое повышение было следствием увеличения уровня АФК (рис. 5).

Обнаружено также увеличение уровня внутриклеточного глутатиона и повышение соотношения GSH,„"GSSGm при одновременном снижении внеклеточного глутатиона (табл. 1,2). Учитывая, что мутанты, дефицитные по синтезу глутатиона, менее устойчивы к действию рифампицина, чем клетки родительского типа, можно предположить, что глутатион играет определенную роль в адаптации бактерий Е coli к действию

рифампицина, а изменения его статуса при действии этого антибиотика являются частью такого адаптивного ответа.

Действие ацетамидофенола. Ранее было показано, что токсическое действие ацетамидофенола' на клетки печени животных при его передозировке связывается с окислительными повреждениями гепатоцитов. Наши результаты свидетельствуют о том, что действие на аэробно растущие клетки К coli ацетамидофенола также может приводить к окислительному стрессу. На это указывает одновременное увеличение экспрессии sodA и soxS (рис. 6). То, что такое повышение экспрессии этих генов может быть связано с увеличением внутриклеточного уровня АФК, а именно супероксидного аниона, подтверждается снижением содержания глутатиона внутри клеток и соотношения GSHin:GSSGjn (табл. 1). Как было показано ранее, такое снижение может быть результатом превышения внутриклеточного уровня АФК (Smirnova et al., 2000). В то же время, следует иметь в виду, что ацетамидофенол может индуцировать транскрипцию marRAB оперона, (Cohen et al., 1993) и через этот путь также индуцировать экспрессию sodA. Нами показано также, что аэробные культуры К coli более чувствительны к действию ацетамидофенола при 42°С, чем при 37°С, и это является еще одним косвенным признаком окислительного стресса при действии этого соединения.

Наши данные указывают также на то, что в действии ацетамидофенола на клетки эукариот и бактерий есть общие черты: в том и другом случае отмечаются признаки окислительного стресса, в том числе, падение уровня внутриклеточного глутатиона В клетках обоих типов присутствие глутатиона сообщает клеткам большую устойчивость к ацетамидофенолу.

В таблице 3 суммированы основные результаты исследований. Наибольшее число показателей, которые подверглись существенным изменениям (8 из 11), выявлено при действии грамицидина и ацетамидофенола. Обнаруживается также большое сходство в действии этих веществ: 6 параметров изменялись в одинаковом направлении. К ним относятся снижение концентрации внутриклеточного глутатиона, повышение экспрессии генов sodA и soxS, повышенная чувствительность мутантов, дефицитных по глутатиону, снижение внутриклеточного уровня калия и повышение концентрации внеклеточного глутатиона. Из них четыре первых могут быть отнесены к признакам окислительного стресса или к функциям антиоксидантных систем. Примечательно, что действие обоих соединений приводило к падению уровня внутриклеточного глутатиона и сочеталось с повышенной чувствительностью мутантов по синтезу глутатиона к обработке этими соединениями.

Рис. 6. Влияние ацетамидофенола на экспрессию слияния soxS::lacZ в растущих клетках Е. coli TN521. 1 - контроль (необработанные клетки); 2 - клетки обработаны ацетамидофенолом в концентрации 7.5 мкг/мл. Активность /?-галактозидазы выражена в единицах Миллера.

Это еще раз подчеркивает важную роль глутатиона в устойчивости к грамицидину и ацетамидофенолу.

Хлорамфеникол и рифампицин оказывали меньшее воздействие на исследуемые параметры, изменялись 7 параметров из 11 у рифампицина и 4 из 11 - у хлорамфеникола. Примечательно, что единственный параметр, который изменялся при действии всех испытуемых веществ в одном направлении это экспрессия гена sodA. Все испытанные вещества в той или иной степени стимулировали экспрессию этого гена.

Известно, что глутатион может участвовать в регуляции внутриклеточного уровня калия, посредством контроля над К+-выходными каналами. Данные, представленные в таблице 3 указывают на отсутствие выраженной корреляции между статусом внутриклеточного глутатиона и уровнем калия при действии испытуемых веществ. Возможно, что это связано с разными путями воздействия этих веществ на внутриклеточный пул калия. Так грамицидин как мембранотропный агент оказывает прямое действие на трансмембранные потоки калия, а остальные вещества - косвенное. Кроме того, возможно, нужны более высокие дозы испытуемых веществ, чтобы вызвать значительные изменения статуса глутатиона и, соответственно, внутриклеточного калия.

Сводные результаты исследований.

Таблица 3.

Испытуемое Соединение ОЭНщ ОвНоЩ Экспрессия генов Чувствительность мутантов К ю

¡о<М 50X5 каЮ ЫЕ £0Г gsh' $ШВГ ксОСГ

Грамицидин - + + + 0 0 + + + 0 но -

Хторамфеникол 0 0 + 0 - - 0 0 - 0 0 0

Рифампицин + - + 0 0 0 + + 0 + 0 -

Ацетамидофенол - + + + - - 0 + 0 0 0 -

Примечание: "+" увеличение параметра в ответ на действие испытуемого соединения (повышение уровня глутатиона или калия, экспрессии гена, чувствительности к действию испытуемого соединения); снижение параметра; "О" отсутствие изменений параметра; "но" не определяли

Комбинированное действие ацетамидофенола и антибиотиков. Из

литературных данных известно, что ацетамидофенол может индуцировать экспрессию marRAB регулона, что потенциально должно увеличивать устойчивость к другим применяемым нами соединениям (хлорамфениколу и рифампицину). Однако анализ ростовых параметров при комбинированном действии ацетамидофенола и антибиотиков свидетельствует об аддитивном характере их совместного действия. В наибольшей степени это выражено при совместном действии ацетамидофенола и грамицидина (рис. 7) или рифамтщина и в наименьшей - при действии ацетамидофенола и хлорамфеникола (рис. 8). Принято считать, что при аддитивном действии испытуемые соединения воздействуют на разные мишени. Это должно быть справедливо и в нашем случае, поскольку главные мишени, определяющие бактериостатическое и бактерицидное действие исследуемых веществ, также сильно различаются. Грамицидин является мембранотропным антибиотиком, хлорамфеникол ингибирует синтез белка на уровне рибосом, а рифампицин—синтез РНК на уровне РНК-полимеразы.

Наши исследования свидетельствуют о том, что одновременное применение ацетамидофенола и антибиотиков может потенциально усиливать их ингибирующее действие на рост и развитие Е. coli, являющейся представителем нормальной микрофлоры человека и животных. В то же время, учитывая условия наших экспериментов, применяемые антибиотики и действующие дозы, следует признать, что наши исследования совместного действия ацетамидофенола и антибиотков представляют лишь приближенную модель и требуются более детальные исследования этого явления.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что действие на растущие аэробно бактерий Escherichia coli грамицидина приводит к изменениям, характерным для окислительного стресса. Об этом свидетельствуют снижение уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSH) и соотношения GSH:GSSG, повышение экспрессии антиоксидантных генов sodA, soxS и gor, а также повышение чувствительности к грамицидину мутантов, дефицитных по синтезу GSH и супероксиддисмутаз SodA и SodB.

2. Выявлено, что действие на аэробно растущие бактерии Escherichia coli ацетамидофенола также приводит к изменениям, характерным для окислительного стресса: снижению уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSH) и соотношения GSHm:GSSGm, повышению экспрессии антиоксидантных генов sodA и soxS и повышению чувствительности к ацетамидофенолу мутантов, дефицитных по синтезу GSH.

3. Не выявлено существенных изменений в статусе глутатиона и экспрессии гена gor при действии на клетки Escherichia coli хлорамфениколом. Отмечено повышение устойчивости к хлорамфениколу мутантов, дефицитных по синтезу супероксиддисмутаз SodA и SodB.

4. Показано, что действие на клетки рифампицина приводит к повышению уровня внутриклеточного глутатиона и экспрессии гена sodA. Отмечено повышение чувствительности к рифампищшу мутантов, дефицитных по синтезу GSH и каталазы-гидропероксидазы Н И.

5. Обнаруживается выраженное сходство в действии грамицидина и ацетамидофенола: при обработке бактерий этими соединениями шесть исследуемых параметров

изменялись в одинаковом направлении. Полученные данные указывают на важную роль глутатиона в устойчивости к грамицидину и ацетамидофенолу.

6. При комбинированной действии ингибирующее действие ацетамидофенола и испытуемых антибиотиков на рост и накопление биомассы носит аддитивный характер.

Список работ, опубликанных по теме диссертации

1. Торхова ОА, Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. Статус и роль глутатиона при нарушении ионного баланса и рН гомеостаза у Escherichia coli //Микробиология. - 2003. Т. 72.-N. 5. С. 1-7.

2. Торхова О.А. Окислительный стресс при действии грамицидина на клетки Escherichia coli //Биология - наука XXI века: Матер. 6-й Пущинской школы - конф. мол. ученых. -Пущино, 2002. - С. 336.

3. Торхова ОА Влияние условий аэрации и температуры на рост бактерий Escherichia coli, обработанных антибактериальными веществами с разным спектром действия //Тезисы докладов Межрегиональной конф. мол. ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии". Пермь, 2002. - С. 67-68.

4. Торхова ОА Влияние антибактериальных веществ на антиоксидантные системы бактерий Escherichia coli //Биология - наука XXI века. Матер. 7-й Пущинской школы — конф. мол. ученых - Пущино, 2003. - С. 382.

5. Торхова ОА действие антибактериалных веществ на клетки Escherichia coli, адаптированные к окислительному стрессу //Матер. Междисциплинарной конференции с Междунар. участием "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека". - Петрозаводск, 2003. - С. 40.

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99

Подписано в печать 28.01.2004. Набор компьютерный Формат 60X100/16 Усл. печ. л. 1,25 Заказ № 26/2004 Тираж 100 экз.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614000, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к.Ш, т.(3422) 198-033

. 38 77

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Торхова, Оксана Александровна

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Ответ бактерий Escherichia coli на окислительный стресс.

1.1. Реактивные формы кислорода и их токсическое действие на клетки.

1.2. Компоненты антиоксидантной защиты.

1.3. Регуляция ответа Е. coli на окислительный стресс.

1.3.1. Ответ на действие перекиси водорода, роль OxyR регулона.

1.3.2. Ответ на действие генераторов супероксид аниона, роль SoxRS регулона.

1.3.3. Роль Gs регулона в защите клеток от окислительного стресса.

1.4. Глутатион и его роль в жизнедеятельности Е. coli.

• 1.4.1. Ферменты метаболизма глутатиона.

1.5. Роль калия у бактерий Е. coli.

Глава 2. Антибактериальные вещества.

2.1. Общие особенности антибактериальных препаратов.

2.2. Классификация антибактериальных препаратов.

2.3. - Краткая характеристика применяемых в работе антибактериальных веществ.

2.3.1. Хлорамфеникол (левомицетин).

2.3.2. Рифампицин.

2.3.3. Грамицидины.

2.3.4. Ацетамидофенол.

2.4. Антибиотикоустойчивость, взаимосвязь транскрипционных активаторов МагА и SoxS.

Глава 3. Объекты и методы исследования.

3.1. Бактериальные штаммы.

3.2. Питательная среда и условия культивирования.

3.3. Определение содержания общего и наружного окисленного глутатиона.

3.4. Определение GSSG внутри клетки.

3.5. Определение активности/?-галактозидазы.

3.6. Определение концентрации внутриклеточного калия.

3.7. Влияние условий аэрации и температуры на рост бактерий Е. coli, обработанных антибактериальными веществами с разным спектром действия.

3.8. Методика определения выживаемости клеток с использованием верхнего агара.

3.9. Статистическая обработка данных.

Глава 4. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Е. coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола.

4.1. Грамицидин.

4.1.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных грамицидином.

4.1.2. Влияние грамицидина на рост£. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах.

4.1.3. Влияние грамицидина S на экспрессию антиоксидантных генов

4.1.4. Влияние грамицидина на статус глутатиона.

4.2. Хлорамфеникол.

4.2.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных хлорамфениколом.

4.2.2. Влияние хлорамфеникола на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах.

4.2.3. Влияние хлорамфеникола на экспрессию антиоксидантных генов.

4.2.4. Влияние хлорамфеникола на статус глутатиона и уровень внутриклеточного калия.

4.3. Рифампицин.

4.3.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных рифампицином.

4.3.2. Влияние рифампицина на рост£. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах.

4.3.3. Влияние рифампицина на активность антиоксидантных систем.

4.3.4. Влияние рифампицина на статус глутатиона и уровень внутриклеточного калия.

4.4. Ацетамидофенол.

4.4.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных ацетамидофенолом.

4.4.2. Влияние ацетамидофенола на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах.

4.4.3. Влияние ацетамидофенола на экспрессию антиоксидантных генов.

4.4.4. Влияние ацетамидофенола на статус клеточного глутатиона и внутриклеточный калий.

Глава 5. Комбинированное действие ацетамидофенола и антибиотиков на растущие клетки Е. coli.

5.1. Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий

Е. coli, обработанных грамицидином.

5.2. Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий

Е. coli, обработанных хлорамфениколом.

5.3. Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий

Е. coli, обработанных рифампицином.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль антиоксидантных систем в ответе бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола"

Актуальность проблемы. В природной среде пребывание бактерий в условиях, оптимальных для размножения, является скорее исключением, чем правилом. Бактерии постоянно подвергаются воздействию разного рода стрессов, которые могут быть следствием резких изменений параметров окружающей среды. К их числу относится окислительный стресс. В обычных условиях уровень активных форм кислорода (АФК), способных повреждать практически все молекулярные компоненты клеток (белки, нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны), поддерживается на безопасном уровне благодаря активности антиоксидантных систем. В определенных условиях уровень оксидантов может превышать способности антиоксидантных систем к их детоксикации, следствием чего будет снижение активности клеток, вплоть до полной гибели. Бактерии конститутивно синтезируют антиоксидантные ферменты, а также обладают механизмами адаптивного ответа, благодаря которым предварительное действие малых доз оксидантов вызывает повышенную устойчивость к последующему действию больших доз. Ключевыми регуляторами адаптивных ответов у бактерий Escherichia coli являются транскрипционные факторы SoxRS и OxyR (и регуляторные гены soxRS и охуЯ), которые индуцируют согласованную экспрессию групп генов (регулонов) в ответ на действие супероксидного аниона (О2') и перекиси водорода (Н202), соответственно (Storz, Imlay, 1999; Pomposiello, Demple, 2002).

Причиной повышения АФК выше критического уровня может быть воздействие экзогенных оксидантов, таких как перекись водорода (Н2О2) 1 или генераторы супероксидного аниона (02") (паракват, менадион и др.). Одним из главных внутриклеточных источников АФК может быть дыхательная цепь, продуцирующая их, как побочные продукты в процессе аэробного метаболизма (Imlay, Fridovich, 1991; Gonzalez-Flecha, Demple, 1995). Повышение концентрации АФК до уровня, вызывающего окислительный стресс, может происходить в результате нарушения нормального метаболизма при экстремальных воздействиях. Изучение роли антиоксидантных систем и их активности у бактерий при различных воздействиях, не связанных с прямым действием экзогенных оксидантов, находится в начальной стадии. Роль антиоксидантных систем при воздействии на бактерии лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков - одна из мало изученных проблем в этой области. Хотя потенциальное участие антиоксидантных систем в устойчивости к антибиотикам и другим лекарственным препаратам в настоящее время не вызывает сомнений, остается много нерешенных проблем в этой области. Так известно, что обработка бактерий Е. coli рядом антибиотиков и лекарственных препаратов приводит к индукции гена sodA, кодирующего супероксиддисмутазу А, в то же время роль других компонентов антиоксидантной защиты изучена недостаточно. Нет ясности в вопросе о роли в устойчивости бактерий к антибиотикам и лекарственным препаратам такого важного антиоксиданта как глутатион, играющего в эукариотических клетках ключевую роль в защите от оксидантов и ксенобиотиков. Мало данных о влиянии такого широко распространенного препарата как ацетамидофенол (парацетамол) на активность антиоксидантных систем и их роль при действии этого препарата на бактерии. В совокупности анализ научной литературы показывает, что данные о роли этих систем в ответе бактерий Е. coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола немногочисленны и противоречивы. В этой связи выявление роли антиоксидантных систем на действие антибиотиков и ацетамидофенола является актуальной задачей.

Цель настоящего исследования — изучение роли антиоксидантных систем в ответе растущих бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков, обладающих разным механизмом действия, и ацетамидофенола.

Основные задачи исследований:

1. Используя штаммы со слияниями генов, кодирующих компоненты антиоксидантных систем с геном /?-галактозидазы, изучить влияние грамицидина, хлорамфеникола, рифампицина и ацетамидофенола на экспрессию антиоксидантных генов.

2. Изучить влияние антибиотиков и ацетамидофенола на внутри- и внеклеточный статус глутатиона.

5. Исследовать комбинированное действие антибиотиков и ацетамидофенола на рост Е. coli.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние антибиотиков с разным механизмом действия (грамицидина, хлорамфеникола, рифампицина) и ацетамидофенола на уровень внутри- и внеклеточного восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона и соотношение GSH:GSSG в растущих бактериях Escherichia coli. Обнаружено, что обработка бактерий такими соединениями как грамицидин и ацетамидофенол приводит к снижению концентрации внутриклеточного глутатиона и к одновременному повышению внеклеточного глутатиона. В то же время, обработка рифампицином вызывает повышение уровня внутриклеточного глутатиона при одновременном снижении внеклеточного глутатиона. Таким образом, показано, что антибиотики с разным механизмом действия способны влиять на концентрацию глутатиона внутри и снаружи клетки.

Обнаружена существенная роль глутатиона в устойчивости к грамицидину, рифампицину и ацетамидофенолу.

Показано, что обработка бактерий грамицидином и ацетамидофенолом приводит к изменениям в активности антиоксидантных систем, характерным для окислительного стресса.

Обнаружено, что при совместном действии исследуемых антибиотиков с ацетамидофенолом ингибирующее действие этих соединений на рост носит аддитивный характер.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в этой работе данные расширяют наше представление о роли антиоксидантных систем в жизнедеятельности микроорганизмов и понимание механизмов, контролирующих адаптацию бактерий к различным стрессам, в том числе, к действию антибиотиков и других лекарственных веществ.

Ацетамидофенол является основой популярных и широко применяемых в терапии лекарств (парацетамола, панадола, солпадеина и т.п.) Данные о действии ацетамидофенола на бактерии, а также комбинированного действия ацетамидофенола и антибиотков могут иметь практическое значение, поскольку затрагивают актуальные проблемы медицины и экологии микроорганизмов, связанные с воздействием антибиотиков и других лекарственных препаратов на нормальную микрофлору кишечника. Известно, что неконтролируемое применение антибиотиков и других лекарственных веществ часто приводит к побочным эффектам, связанным с подавлением нормальной микрофлоры и дисбактериозам. Наши исследования свидетельствуют о том, что одновременное применение ацетамидофенола и антибиотиков может потенциально усиливать их ингибирующее действие на рост и развитие Е. coli, являющейся представителем нормальной микрофлоры человека и животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Глутатион вносит вклад в защиту растущих бактерий Escherichia coli от грамицидина, рифампицина и ацетамидофенола.

2. Обработка клеток Е. coli грамицидином, рифампицином и ацетамидофенолом приводит к изменениям, характерным для окислительного стресса.

3. Обнаруживается выраженное сходство в действии грамицидина и ацетамидофенола на растущие клетки Е. coli.

4. При комбинированной обработке ингибирующее действие ацетамидофенола и испытуемых антибиотиков на рост и накопление биомассы носит аддитивный характер.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 162 страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и 37 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 265 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Торхова, Оксана Александровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что обработка растущих аэробно бактерий Escherichia coli грамицидином приводит к изменениям в активности антиоксидантных систем, характерным для окислительного стресса. Об этом свидетельствует снижение уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSH) и соотношения GSH:GSSG, повышение экспрессии антиоксидантных генов sodA, soxS и gor, а также повышение чувствительности к грамицидину мутантов, дефицитных по синтезу GSH и супероксиддисмутаз SodA и SodB.

2. Выявлено, что обработка растущих аэробно бактерий Escherichia coli ацетамидофенолом также приводит к изменениям, характерным для окислительного стресса: снижению уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSH) и соотношения GSH:GSSG и повышению экспрессии антиоксидантных генов sodA и soxS и повышению чувствительности к ацетамидофенолу мутантов, дефицитных по синтезу GSH.

3. Не выявлено существенных изменений в статусе глутатиона и экспрессии гена gor при обработке клеток Escherichia coli хлорамфениколом. Отмечено 'повышение устойчивости к хлорамфениколу мутантов, дефицитных по синтезу супероксиддисмутаз SodA и SodB.

4. Показано, что обработка клеток рифампицином приводит к повышению уровня внутриклеточного глутатиона и экспрессии гена sodA. Отмечено повышение чувствительности к рифампицину мутантов, дефицитных по синтезу GSH и каталазы-гидропероксидазы HPI.

5. Обнаруживается выраженное сходство в действии грамицидина и ацетамидофенола: при обработке бактерий этими соединениями шесть исследуемых параметров изменялись в одинаковом направлении. Полученные данные указывают на важную роль глутатиона в устойчивости к грамицидину и ацетамидофенолу.

6. При комбинированной обработке ингибирующий действие ацетамидофенола и испытуемых антибиотиков на рост и накопление биомассы носит аддитивный характер.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Грамицидин.

Одним из главных признаков окислительного стресса в живых системах и, в частности, бактерий является повышение уровня экспрессии антиоксидантных генов. Многие из этих генов у бактерий являются индуцибельными и их экспрессия усиливается в ответ на повышение уровня таких оксидантов как перекись водорода или супероксидный анион (Storz, Imlay, 1999; Pomposiello, Demple, 2002). В наших экспериментах обработка грамицидином растущих аэробно клеток Е. coli приводила к заметному повышению экспрессии трех антиоксидантных генов: soclA, soxS и gor. Первые два гена имеют важное значение в защите клеток от повреждающего действия супероксидного аниона, а последний - участвует в поддержании антиоксиданта глутатиона в восстановленном состоянии, что также имеет немаловажное значение в защите клеток от окислительного стресса.

Известно, что sodA находится под контролем нескольких факторов, в том числе, под контролем двухгенной системы soxRS, одним из главных индукторов которой является супероксидный анион (Compan, Touati, 1993; Touati, 1997). Повышение экспрессии одновременно обоих генов {sodA и soxS) свидетельствует о том, что в данном случае активация sodA может быть следствием повышения уровня АФК.

Примечательно, что не обнаружено существенного влияния обработки грамицидином на индукцию гена katG, кодирующего такой важный антиоксидантный фермент как каталаза-гидропероксидаза HPI. Известно, что в контроле над экспрессией двух генов gor и katG, принимает участие регуляторный фактор транскрипции OxyR, контролирующий ответ бактерий на действие перекиси водорода (Storz, Imlay, 1999; Pomposiello, Demple, 2002). Возможно, что основным оксидантом, образующимся при действии грамицидина на клетки Е. coli, является супероксидный анион, но повышение экспрессии gor указывает на возможный вклад перекиси водорода. В клетках дикого типа базовый уровень активности каталазы-гидропероксидазы HPI может быть достаточен для нейтрализации тех количеств перекиси водорода, которые образуются при действии грамицидина либо прямо, либо вследствие дисмутации супероксидного аниона. В мутантах по katG отсутствие HPI может компенсироваться повышением активности другого компонента антиоксидантной защиты.

Это предположение подтверждается результатами опытов с мутантами, дефицитными по активности антиоксидантных генов. Вместе с тестом на экспрессию антиоксидантных генов исследование поведения таких штаммов дает дополнительную информацию о наличии признаков окислительного стресса у бактерий. Если в определенных условиях мутанты, дефицитные по активности антиоксидантных генов, растут хуже, чем клетки дикого типа с нормальной активностью таких генов, то это может свидетельствовать о наличии признаков окислительного стресса в данной ситуации. В наших условиях ростовые характеристики клеток, дефицитных по каталазе-гидропероксидазе HPI, и клеток родительского типа, обработанных грамицидином, существенно не отличались. В то же время, клетки, дефицитные по содержащей Мп супероксиддисмутазе (МпСОД), были заметно чувствительнее к обработке грамицидином, чем клетки родительского типа.

Если увеличение экспрессии антиоксидантных генов и повышение чувствительности мутантов при обработке клеток грамицидином связано с повышением внутриклеточного уровня оксидантов, то возникает вопрос о причине, вызывающей такое повышение. Вероятнее всего, такое повышение может быть следствием косвенного действия грамицидина, так как сам антибиотик, учитывая его свойства, не может служить в качестве оксиданта прямого действия. Известно, что основное действие грамицидина на Е. coli связано с его воздействием на мембранные структуры и изменением их проницаемости вследствие образования каналов для К , Na и При этом происходит нарушение трансмембранных ионных потоков, о чем свидетельствует потеря части внутриклеточного калия (Katsu et al., 1986 и наша работа), изменения во внутриклеточном рН и электрическом мембранном потенциале (Katsu et al., 1986; Скулачев, 1989). Показано, что у р аэробно растущих бактерий одним из источников активных форм кислорода является дыхательная цепь (редокс-цепь), локализованная на цитоплазматической мембране (Imlay, Fridovich, 1991а; Imlay, Fridovich, 4

1991b; Gonzalez-Flecha, Demple, 1995; Messner, Imlay, 1999). Предполагается, что нарушения структуры цитоплазматической мембраны и ее нормального функционирования могут вести к увеличению продукции АФК. Возможно, что изменения свойств цитоплазматической мембраны при воздействии грамицидина могут быть одной из причин повышенной продукции АФК.

В этой работе показано также, что наибольшей чувствительностью к грамицидину обладали, клетки Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона. В этой связи следует обратить внимание на данные об изменении уровня и редокс-статуса внутри- и внеклеточного глутатиона при действии * грамицидина на растущие клетки Е. coli. Обработка клеток грамицидином приводила к заметному снижению уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSH) и существенному снижению т соотношения GSH-.GSSG. Каковы возможные причины снижения уровня внутриклеточного GSH? В клетках эукариот снижение внутриклеточного глутатиона считается следствием окислительного стресса и его надежным . индикатором (Sies, 1999). В этих клетках снижение глутатиона при окислительном стрессе связано с тем, что большое количество GSH расходуется на деструкцию перекиси водорода, катализируемую ферментом глутатион-зависимой пероксидазой. Клетки Е. coli не проявляют глутатион-зависимой пероксидазной активости (Farr, Kogoma, 1991). Перекись водорода и другие оксиданты могут прямо взаимодействовать с восстановленным глутатионом, но скорость этой реакции намного ниже, чем той, которая катализируется ферментом. Тем не менее, прямое взаимодействие GSH с оксидантами может вносить некоторый вклад в наблюдаемое нами снижение внутриклеточного глутатиона при действии грамицидина. Ранее снижение внутриклеточного GSH и соотношения GSH:GSSG наблюдали в аэробно растущих Е. coli при окислительном стрессе, вызванном обработкой клеток генератором супероксид-аниона менадионом (Smirnova et al., 2000). Однако падение уровня GSH при действии менадиона сопровождалось увеличением окисленного глутатиона (GSSG), чего не наблюдалось при стрессах в настоящей работе. Это указывает на то, что наряду с повышением АФК, другие факторы могут вносить вклад в снижение уровня внутриклеточного глутатиона при действии грамицидина. Такими факторами могут быть снижение биосинтеза глутатиона при падении внутриклеточного рН, возрастание скорости деструкции или образование конъюгатов. Сравнение изменений внутри- и внеклеточного глутатиона при действии грамицидина (табл. 3-8), показывает что еще одной причиной снижения уровня глутатиона внутри клетки может быть также экспорт глутатиона во внеклеточную среду.

Следует отметить, что при физиологических значениях рН глутатион находится в анионной форме и вследствие этого может быть вовлечен в I трансмембранные ионные потоки и участвовать в поддержании ионного баланса.

Предполагается, что у бактерий, как и в клетках эуариот, глутатион может играть определенную роль в редокс-регуляции. Ранее было показано, что дефицит глутатиона в мутантах Е. coli по gsh стимулирует экспрессию антиоксидантных генов soxS, katG и katE (Ding, Demple, 1996; Oktyabrsky et ah, 2001). Включение глутатиона в регуляцию этих генов может опосредоваться как через взаимодействие с редокс-чувствительными сайтами в регуляторных белках, так и через его влияние на внутриклеточный уровень оксидантов

Oktyabrsky et al, 2001; Zheng et al.,. 1998). Эти данные позволяют предположить, что наблюдаемая при действии грамицидина активация антиоксидантных генов может быть следствием снижения уровня внутриклеточного глутатиона.

В совокупности данные об изменениях уровня и редокс-статуса внутри- и внеклеточного глутатиона, поведении штаммов, дефицитных по синтезу глутатиона, и экспрессии гена gor, кодирующего глутатионредуктазу, указывают на важную роль глутатиона в защите Е. coli от действия грамицидина. Оказывая положительное влияние на устойчивость Е. coli к грамицидину, глутатион может играть несколько взаимосвязанных ролей, выступая одновременно как антиоксидант, редокс-регулятор и компонент системы регуляции ионного баланса.

Одним из косвенных признаков окислительного стресса является более высокая чувствительность к воздействию некоторого фактора бактерий, растущих в аэробных условиях, по сравнению с теми, которые растут в анаэробных условиях. Однако анализ литературы по этой проблеме показывает, что это относится скорее к ситуациям, в которых окислительный стресс связан с прямым действием оксидантов, таких как перекись водорода или супероксидный анион. В наших условиях аэробно растущие клетки были более чувствительны к грамицидину при 42°С, чем при 37°С. Примечательно, что эукариотические клетки также показывают более высокую чувствительность к факторам, вызывающим окислительный стресс, при повышенных температурах. Более того, считается, что одной из главных причин гибели аэробно растущих клеток разных типов (как эукариот, так и бактерий) при повышенных температурах является окислительный стресс (Lee et al. 1983; Freeman et al, 1990).

Хлорамфеникол

Как указывалось выше, бактерии Е. coli в ответ на обработку такими оксидантами как перекись водорода или генераторы супероксидного аниона активируют генетически программируемые антиоксидантные системы в результате чего происходит повышение синтеза определенных белков (каталазы-пероксидазы HPI, Mn-содержащей супероксиддисмутазы и др.). Из этого следует, что предварительная обработка бактериальных клеток такими ингибиторами синтеза белка как хлорамфеникол или тетрациклин должна предотвращать индуцибельный ответ бактерий на действие экзогенных оксидантов и снижать их выживаемость в этих условиях окислительного стресса, что и наблюдалось уже в первых исследованиях по окислительному стрессу (Christman et al., 1985). Однако большая часть исследований в этом направлении была посвящена действию ингибиторов синтеза белка при действии экзогенных оксидантов. В наших исследованиях основное внимание было уделено изучению роли антиоксидантных систем при обработке хлорамфениколом в отсутствие экзогенных оксидантов. Кроме того, эти исследования были необходимы как первый этап для последующего изучения комбинированного действия хлорамфеникола и ацетамидофенола.

Анализ изменений измеряемых нами параметров показывает, что, в отличие от грамицидина, обработка клеток Е. coli хлорамфениколом не приводила к появлению выраженных признаков окислительного стресса. В то же время, обработка этим антибиотиком заметно индуцировала экспрессию sodA::lacZ. Однако в данном случае, это не обязательно свидетельствует о повышении уровня АФК и наличии окислительного стресса. Как отмечалось выше, ген sodA, кодирующий Mn-сод ержащую супероксиддисмутазу, находится под контролем нескольких факторов, и увеличение внутриклеточной концентрации супероксидного аниона - является лишь одним и этих факторов (Compan, Touati, 1993; Touati, 1997).

В этом случае активация sodA опосредуется через активацию системы soxRS, одним из главных индукторов которой является супероксидный анион (Farr, Kogoma, 1991). В отличие от грамицидина, при действии хлорамфеникола не наблюдалась активация soxRS. Другой путь активации sodA находится под контролем транскрипционного активатора МагА, играющим важную роль в резистентности бактерий к антибиотикам, в том числе, и к хлорамфениколу (Alekshun, Levy, 1997). Таким образом, наблюдаемое нами повышение экспрессии sodA при обработке Е. coli хлорамфениколом, подтверждает опубликованные ранее данные по этому вопросу.

В экспериментах с мутантными штаммами Е. coli было обнаружено интересное явление: после обработки хлорамфениколом мутанты sodAsodB, дефицитные по активности двух супероксиддисмутаз, росли лучше, чем клетки родительского типа в этих же условиях. Возможно, это связано с тем, что скорость роста родительского штамма до добавления антибиотика была значительно выше, чем у мутантных клеток. Известно, что на клетки, находящиеся в стационарной фазе или лимитированные по какому- либо фактору, некоторые антибиотики действуют значительно слабее, чем на активно растущие культуры. Однако возможно и другие факторы могут играть роль в большей устойчивости к хлорамфениколу мутантов sodAsodB.

Следует иметь в виду, что в обычных условиях супероксидный анион, продуцируемый в клетках как в процессе нормального аэробного метаболизма, так и в присутствии генераторов О2', превращается в перекись водорода в процессе, катализируемом супероксиддисмутазами. Внутриклеточное накопление перекиси водорода до токсических концентраций предотвращается разложением Н2О2 каталазами. Если активность супероксиддисмутаз повышается, а активность каталаз снижается, перекись водорода будет накапливаться до токсических уровней. Приведенные выше данные указывают на то, что потенциально такая ситуация может наблюдаться в клетках дикого типа, обработанных хлорамфениколом. В мутантных клетках sodAsodB вследствие снижения супероксиддисмутазной активности продукция перекиси водорода резко снижена и как следствие ингибирование каталазной активности при обработке хлорамфениколом не ведет к накоплению Н2О2. Примечательно, что мутанты Е. coli, синтезирующие супероксиддисмутазу в повышенных количествах, растут хуже, чем клетки родительского типа (Farr, Kogoma, 1991). Требуются более детальные исследования, чтобы проверить истинность нашего предположения.

Рифампицин

Анализ изменений измеряемых нами параметров показывает, что обработка клеток Е. coli рифампицином приводит к появлению признаков окислительного стресса, хотя и выраженных в умеренной степени. К их числу относятся: более высокая чувствительность к этому антибиотику мутантов Е. coli, дефицитных по синтезу каталазы-гидропероксидазы HPI и синтезу глутатиона и повышение экспрессии гена sodA, кодирующего супероксиддисмутазу А. Экспрессия sodA в ответ на обработку рифампицином обнаруживалась и в мутанте тагчто свидетельствует о том, что такое повышение было следствием увеличения уровня АФК. Учитывая рассмотренные в предыдущих разделах литературные данные, более высокая чувствительность к рифампицину аэробных клеток, растущих при 42°С, может рассматриваться как косвенный признак наличия окислительного стресса.

Обнаружено также увеличение уровня внутриклеточного глутатиона и повышение соотношения GSHin:GSSGi„ при одновременном снижении внеклеточного глутатиона. Учитывая тот факт, что мутанты, дефицитные по синтезу глутатиона менее устойчивы к действию рифампицина, чем клетки родительского типа, можно предположить, что глутатион играет определенную роль в адаптации бактерий Е. coli к действию рифампицина, а изменения его статуса при действии этого антибиотика являются частью такого адаптивного ответа.

Ацетамидофенол

Как указывалось выше, гепатотоксическое действие ацетамидофенола на клетки печени при его передозировке связывается с окислительными повреждениями гепатоцитов. Наши результаты свидетельствуют о том, что обработка растущих аэробно клеток Е. coli ацетамидофенолом также может приводить к окислительному стрессу. На это указывает одновременное увеличение экспрессии sodA и soxS. То, что такое повышение экспрессии этих генов может быть связано с увеличением внутриклеточного уровня АФК, а именно супероксидного аниона, подтверждается снижением содержания глутатиона внутри клеток и соотношения GSHin:GSSGjn. Как указывалось выше такое снижение может быть результатом превышения внутриклеточного уровня АФК (Smirnova et al., 2000). Косвенным признаком окислительного стресса при действии ацетамидофенола является более высокая чувствительность аэробных культур Е. coli к ацетамидофенолу при 42°С, чем при 37°С. В то же время, следует иметь в виду, что ацетамидофенол может индуцировать транскрипцию marRAB оперона (Cohen et al., 1993) и через этот путь также индуцировать экспрессию sodA.

Примечательно, что ацетамидофенол ингибировал экспрессию генов katG и katE. Вопрос о причинах такого явления остается открытым. Однако ясно, что в аэробных условиях это должно приводить к снижению каталазной активности и накоплению внутриклеточной концентрации перекиси водорода и еще более усиливать окислительный стресс. С другой стороны, снижение экспрессии katG и katE объясняет, почему мутанты по этим генам при обработке ацетамидофенолом ведут себя так же, как клетки дикого типа. В обоих случаях, независимо от того, чем вызвано ингибирование каталазной активности, клетки обоих штаммов фенотипически ведут себя одинаково.

Представляется похожим, что действие ацетамидофенола на бактерии Е. coli носит сложный характер, и наличие признаков окислительного стресса является лишь одним из проявлений действия этого соединения на бактерии.

Наши данные указывают также на то, что в действии ацетамидофенола на клетки эукариот и бактерий есть общие черты: в том и другом случае отмечаются признаки окислительного стресса, в том числе, падение уровня внутриклеточного глутатиона. В клетках обоих типов присутствие глутатиона сообщает клеткам большую устойчивость к ацетамидофенолу.

В таблице 10 суммированы основные результаты исследований. Наибольшее число показателей, которые подверглись существенным изменениям (8 из 11), выявлено при действии грамицидина и ацетамидофенола. Обнаруживается также большое сходство в действии этих веществ: 6 параметров изменялись в одинаковом направлении. К ним относятся снижение концентрации внутриклеточного глутатиона, повышение экспрессии генов sodA и soxS, повышенная чувствительность мутантов, дефицитных по глутатиону, снижение внутриклеточного уровня калия и повышение концентрации внеклеточного глутатиона. Из них четыре первых могут быть отнесены к признакам окислительного стресса или к функциям антиоксидантных систем. Примечательно, что действие обоих соединений приводило к падению уровня внутриклеточного глутатиона и сочеталось с повышенной чувствительностью мутантов по синтезу глутатиона к обработке этими соединениями. Это еще раз подчеркивает важную роль глутатиона в устойчивости к грамицидину и ацетамидофенолу.

Хлорамфеникол и рифампицин оказывали наименьшее воздействие на исследуемые параметры, изменялись 6 из 11 параметров у рифампицина и 4 из И - у хлорамфеникола. Примечательно, что единственный параметр, который изменялся при действии всех испытуемых веществ в одном направлении это экспрессия гена sodA. Все испытанные вещества в той или иной стимулировали экспрессию этого гена.

Известно, что глутатион может участвовать в регуляции внутриклеточного уровня калия, посредством контроля над К+-выходными каналами. Данные, представленные в таблице указывают на отсутствие выраженной корреляции между статусом внутриклеточного глутатиона и уровнем калия при действии испытуемых веществ. Возможно, что это связано с разными путями воздействия этих веществ на внутриклеточный пул калия. Так грамицидин как мембранотропный агент оказывает прямое действие на трансмембранные потоки калия, а остальные вещества -косвенное. Кроме того, возможно, нужны более высокие дозы испытуемых веществ, чтобы вызвать значительные изменения статуса глутатиона и, соответственно, внутриклеточного калия.

Комбинированное действие ацетамидофенола и антибиотиков

Выше отмечалось, что ацетамидофенол может индуцировать экспрессию marRAB регулона (Cohen et al., 1993), что потенциально должно увеличивать устойчивость к другим применяемым нами соединениям (хлорамфениколу и рифампицину). Однако анализ ростовых параметров при комбинированном действии ацетамидофенола и антибиотиков свидетельствует об аддитивном характере их совместного действия. В наибольшей степени это выражено при совместном действии ацетамидофенола и грамицидина или рифампицина и в наименьшей - при действии ацетамидофенола и хлорамфеникола. Принято считать, что при аддитивном действии испытуемые соединения воздействуют на разные мишени. Это должно быть справедливо и. в нашем случае, поскольку главные мишени, определяющие бактериостатическое и бактерицидное действие исследуемых веществ, также сильно различаются.

Грамицидин является мембранотропным антибиотиком, хлорамфеникол ингибирует синтез белка на уровне рибосом, а рифампицин — синтез РНК на уровне РНК-полимеразы. Вопрос о том, почему предобработка ацетамидофенолом не вызывала адаптивного ответа остается открытым и требует дальнейших исследований.

Поскольку ацетамидофенол является основой популярных и широко применяемых в терапии лекарств (парацетамола, панадола и т.п.), его действие на клетки животных изучено достаточно подробно. В то же время, гораздо меньше известно о влиянии ацетамидофенола на нормальную микрофлору кишечника животных, в том числе, и человека. Исследования комбинированного действия ацетамидофенола и антибиотков могут иметь практическое значение, поскольку затрагивают актуальные проблемы медицины и экологии микроорганизмов, связанные с воздействием антибиотиков и других лекарственных препаратов на нормальную микрофлору кишечника. Известно, что неконтролируемое применение антибиотиков часто приводит к побочным эффектам, связанным с подавлением нормальной микрофлоры и дисбактериозам. Наши исследования свидетельствуют о том, что одновременное применение ацетамидофенола и антибиотиков может потенциально усиливать их ингибирующее действие на рост и развитие Е. coli, являющейся представителем нормальной микрофлоры человека и животных. В то же время, учитывая условия наших экспериментов, применяемые антибиотики и действующие дозы, следует признать, что наши исследования совместного действия ацетамидофенола и антибиотков представляют лишь приближенную модель и требуются более детальные исследования этого явления.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Торхова, Оксана Александровна, Пермь

1. Герольд М. Антибиотики / М. Герольд, М. Вондрачек., Я. Нечасек, И. Доскочил. Москва: Медицина, 1966. - 407 с.

2. Гершанович В.Н. Биохимия и генетика транспорта ионов у бактерий / В.Н. Гершанович. Москва: Медицина, 1980. - 176 с.

3. Дильман В.М. Большие биологические часы / В.М. Дильман. Москва: Знание, 1986.-256 с.

4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. — Москва: Наука, 1979.-455 с.

5. Запруднов A.M. Парацетамолсодержащие препараты в педиатрической практике / A.M. Запруднов, Л.А. Харитонова // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1999. — Вып .3. - С. 44-48.

6. Кукес. В.Г. Клиническая фармакология / В.Г. Кукес. Москва: Медицина, 1999.-517 с.

7. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак // Биохимия. 2001. - Т. 66, Вып. 5. - С. 592-609.

8. Маркова И.В. Педиатрическая фармакология / И.В. Маркова, В.И. Калиничева. Ленинград: Медицина, 1987. - 329 с.

9. Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биол. 1997. - Т. 117, Вып. 2. -С. 155-171.

10. Ю.Островский Д.Н. Окислительный стресс у бактерий / Д.Н. Островский // 53 Баховское чтение. РАН. 1997. - 23 с.

11. И.Пескин А.В. Окислительный стресс как критерий оценки окружающей среды / А.В. Пескин, С.Д. Столяров // Серия биологич. 1994. — N. 4. -С. 588-595.

12. Сандаков П.А. Антибиотики и другие противомикробные химиотерапевтические средства / П.А. Сандаков, В.П. Котегов, О.Н. Ершов, Н.А Зубарева. Пермь, 1999. - 45 с.

13. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран / В.П. Скулачев. -Москва: Наука, 1989. 564 с.

14. Смирнова Г.В. Изменение количества SH-соединений в культурах Escherichia coli и Bacillus subtilis / Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский // Микробиология. 1990. - Т. 59, Вып. 3. - С. 387-393.

15. Смирнова Г.В. Отклик Escherichia coli на действие проникающего и непроникающего оксидантов / Г.В.Смирнова, Н.Г. Музыка, М.Н Глуховченко, О.Н. Октябрьский // Биохимия. 1997. - Т. 62, N. 5. - С.563-569.

16. Смирнова Г.В. Перекись водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia coli / Г.В.Смирнова, Н.Г. Музыка, М.Н. Глуховченко, О.Н. Октябрьский // Микробиология. 1998. - Т. 67, N. 5. - С. 594-600.

17. Смирнова Г.В. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на тепловой шок / Г.В. Смирнова, О.Н. Закирова, О.Н. Октябрьский //Микробиология. 2001. - Т. 70, Вып. 5. - С. 595-601.

18. Ткаченко А.Г. Роль путресцина и энергетического состояния Escherichia coli в регуляции топологии ДНК при адаптации к окислительному стрессу / А.Г Ткаченко, М.Р. Пшеничнов, О.Я Салахетдинова, Л.Ю Нестерова. // Микробиология. 1999. - Т. 68. - С. 27-32.

19. Фрейдлин И.С. Некоторые проявления иммунотропной активности панадола / И.С. Фрейдлин, П.Г Назаров, Р.П. Огурцов, А.В. Полевщиков // Клиническая фармакология и терапия. 1996. - Вып. 5. - С. 42-46.

20. Akdeniz H. Central nervous system brucellosis: presentation, diagnosis and treatment / H. Akdeniz, H. Irmak, O. Anlar, A.P. Demiroz // J. Infect. 1998. -Vol.36.-P. 297-301.

21. Alekshun M.N. Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: the Mar regulon / M.N. Alekshun, S.B. Levy // Antimicrob. Agents Chemother. 1997. - Vol. 41. - P. 2067-2075.

22. Allocati N. Effect of anaerobic environment on the glutathione transferase isoenzymatic pattern in Proteus mirabilis / N. Allocati, A. Aceto, L.Cellinizzellietal.//FEMS Lett. 1997.-Vol. 147.-P. 157-162.

23. Amabile-Cuevas C.F. Molecular characterization of the soxRS genes of Escherichia coli: two genes control a superoxide stress regulon / C. F. Amabile-Cuevas, B. Demple. //Nucl. Acids. Res. 1991. - Vol. 19. - P. 4479-4484.

24. Apontoweil P. Glutathione biosynthesis in Escherichia coli K12: properties of the enzymes and regulation / P. Apontoweil, W. Berends // Biochim. Biophys. Acta. 1975a. - Vol. 399. - P. 1-9.

25. Apontoweil P. Isolation and initial characterization of glutathione-deficient mutants of Escherichia coli K12 / P. Apontoweil, W. Berends // Biochim. Biophys. Acta. 1975b. - Vol. 399. - P. 10-22.

26. Area P. Formation of an adduct between fosfomycin and glutathione: a new mechanism of antibiotic resistance in bacteria / P. Area, M. Rico, A.F. Brana et al. // Antimicrob. Agents Chemother. -1988. Vol. 32(10). - P. 1552-1556.

27. Ariza R.R. Activation of multiple antibiotic resistance and binding of stress-inducible promoters by Escherichia coli Rob protein. / R.R. Ariza, Z. Li, N. Ringstad, B. Demple // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 1655-1661.

28. Ariza R.R. Repressor mutation in the marRAB operon that activate oxidative stress genes and multiple antibiotic resistance in Escherichia coli / R.R. Ariza, S.P. Cohen, N. Bachhawat et al. // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - P. 143-148.

29. Arscott L.D. Inactivation-reactivation of two-electron reduced Escherichia coli glutathione reductase involving a dimer-monomer equilibrium / L.D. Arscott, D.M. Drake, J.C.H. Williams // Biochem. 1989. - Vol. 28. - P. 3591-3598.

30. Aslund F. Regulation of the OxyR trascription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol-disulfide status / F. Aslund, M. Zheng, J. Beckwith, G. Storz // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. - Vol. 96. - P. 6161-6165.

31. Babior B.M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes / B.M. Babior //New. Engl. J. Med. -1978. Vol. 298. - P. 656.

32. Bachan B.J. Recalibratted linkage map of E. coli K-12 / B.J. Bachan, K.B. Low, A.L. Taylor//Microbiol. Rev. 1976. - Vol. 40.-P. 116-167.

33. Ваккег E.P. Evidence for multiple K+ export systems in Escherichia coli / E.P. Bakker, I.P. Booth, U. Dinnbier et al. // J. Bacteriol. 1987. - Vol. 169. -P. 3743-3749.

34. Basaga H.S. Biochemical aspects of free radicals / H.S. Basaga // Biochem. Cell. Biol. 1990. - Vol. 68. - P. 989-998. •

35. Benov L.T. Superoxide dismutase protect against aerobic heat shock in Escherichia coli / L.T. Benov, I. Fridovich // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. -P. 3344-3346.

36. Berglin E.H. Potentiation by L-cysteine of the bactericidal effect of hydrogen peroxide in Escherichia coli / E.H. Berglin, M.B.K. Edlund, G.K. Nyberg, J. Carlsson//J. Bacteriol. 1982. - Vol. 152. - P. 81-88.

37. Bloomfield V.A. DNA condensation / V.A. Bloomfield // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. - Vol. 6. - P. 334-341.

38. Blount P. Mutations in a bacterial mechanosensitive channels change the cellular response to osmotic stress / P. Blount, M.J. Schroeder, C. Kung // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 32150-32157.

39. Bochner B.R. AppppA and related adenylated nucleotides are syntesized as a consequence of oxidative stress / B.R. Bochner, P.C. Lee, S.W. Wilson et al. // Cell. 1984. - Vol. 37. - P. 225-232.

40. Booth I.R. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria / I.R. Booth // Microbiol. Rev. 1985. - Vol. 49. - P. 359-378.

41. Brigelius R. Mixed disulfides: biological functions and increase in oxidative stress / R. Brigelius // In: Sies H. (Ed.) Oxidative stress. London: Acad. Press. -1985.-P. 243-272.

42. Burkhart B.M. Gramicidin D conformation, dinamics, and membrane ion transport / B.M. Burkhart, R.M. Gassman, D.A. Langs et al. // Biopolymers. -1999.-Vol. 51.-P. 129-144.

43. Burkhart B.M. The conducting form of gramicidin A is a right-handed double-stranded double helix / B.M. Burkhart, N. Li, D.A. Langs et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 12950-12955.

44. Bussiere D. Crystal structure of ErmC', and rRNA methyltransferase which mediates antibiotic resistance in bacteria / D. Bussiere // Biochemistry. 1998. -Vol. 37.-P. 7103-7112.

45. Campbell E.A. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase / E.A. Campbell, N. Korzheva, A. Mustaev et al. // Cell. 2001. -Vol. 104(6). - P. 901-912.

46. Carlioz A. Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life? / A. Carlioz, D. Touati // EMBO J. 1986. - Vol. 5. - P. 623-630.

47. Chance B. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs / B. Chance, H. Sies, A. Boveris // Physiol. Rev. 1979. - Vol. 59. - P. 527-605.

48. Chen L. Alkilhydroperoxide reductase subunit С (AhpC) protects bacterial and human cells against reactive nitrogen intermediates / L. Chen, Q. Xie, C. Nathan // Mol. Cell. 1998. - Vol. 1 - P. 795-805.

49. Cheng H.M. Role of glutathione in the morphogenesis of the bacterial spore coat / H.M. Cheng, A.I. Aronson, S.C. Holt // J. Bacteriol. 1973. - Vol. 113. -P. 1135-1143.

50. Chesney J.A. Bacterial glutathione: a sacrificial defense against chlorine compounds / J.A. Chesney, J.W. Eaton, J.R. Mahoney // J. Bacteriol. 1996. -Vol. 178. - P. 2131-2135.

51. Choi H. Structural basis of the redox switch in the OxyR transcription factor / H. Choi, S. Kim, P. Mukhoparadhyay et al. // Cell. 2001. - Vol. 105. -P. 103-113.

52. Christman M.F. Positive control of a regulon for defenses against oxidative stress and some heat-shock proteins in Salmonella typhimurium / M.F. Christman, R.W. Morgan, F.S. Jacobson, B.N. Ames // Cell. 1985. - Vol. 41. -P. 753-762.

53. Claiborne A. Purification of the orthodianisidine peroxidase from Escherichia coli / A. Claiborne, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 254. - P. 1166411668.

54. Cohen S.P. Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (Mar) locus in Escherichia coli / S.P. Cohen, H. Hachler, S.B. Levy // J. Bacterid. 1993a. - Vol. 175. - P. 1484-1492.

55. Cohen S.P. Salicilate induction of antibiotic resistance in Escherichia coli: activation of the mar operone and /иаг-independent pathway / S.P. Cohen, S.B. Levy, J. Foulds, J.L. Rosner I I J. Bacteriol. 1993b. - Vol. 175. - P. 7856-7862.

56. Сотрап I. Interaction of six global transcriptional regulators in expression of manganese superoxide dismutase in Escherichia coli K-12 / I. Compan, D. Touati // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 1687-1696.

57. Davies K.J.A. Degradation of oxidatively denatured proteins in Escherichia coli / K.J.A. Davies, S.W. Lin // Free. Radic. Biol. Med. 1988. - Vol. 5. - P. 215223.

58. Davies К ,J. A. Protein damage and degradation by oxygen radicals / K.J .A. Davies // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262. - P. 9902-9907.

59. De Ray-Paylhade J. Nouvelles recherches physiologiques sur la substance or-ganique hydrogenant le soufre a froid / J. De Ray-Paylhade // J. Compt. Acad. Sci. (Paris). 1888. - Vol. 107. - P. 43-44.

60. Demple B. Inducible repair of oxidative DNA damage in Escherichia coli / B. Demple, J. Halbrook // Nature (London). 1983. - Vol. 304. - P. 466-468.

61. Demple B. Radical ideas: genetic responses to oxidative stress / B. Demple // Clinic. Experim. Pharmocol. Physiol. 1999. - Vol. 26. - P. 64-68.

62. Demple В. Redox redux: the control of oxidative stress responses / B. Demple, F. Carlos // Cell. -1991. Vol. 67. - P. 837-839.

63. Demple B. Regulation of bacterial oxidative stress genes / B. Demple // Annu. Rev. Genet. 1991. - Vol. 25. - P. 315-337.

64. Ding H. Glutathione-mediated destabilization in vitro of 2Fe-2S. centers in the SoxR regulatory protein / H. Ding, B. Demple // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. Vol. 93. - P. 9449-9453.

65. Ding H. The redox state of the 2Fe-2S. clusters in SoxR proteine regulates its activity as a transcription factor / H. Ding, E. Hidalgo, B. Demple // J. Biol. Chem. -1996. Vol. 271. - P. 33173-33175.

66. Dukan S. Hypochlorous acid stress in Escherichia coli: Resistance, DNA damage, and comparison with hydrogen peroxide stress / S. Dukan, D. Touati // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 6145-6150.

67. Duwat P. The recA gene of Lactococcus lactis: characterization and involvement in oxidative and thermal stress / P. Duwat, S.D. Ehrlich, A. Gruss // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17. - P. 1121-1131.

68. Eisenstark A. Role of Escherichia coli rpoS and associated genes in defense against oxidative damage / A. Eisenstark, M.J. Calcutt, M. Becker-Hapak, A. Ivanova // Free. Radic. Biol. Med. 1996. - Vol. 21. - P. 975-993.

69. Elmore M.J. Activation of potassium efflux from Escherichia coli by glutathione metabolites / M.J. Elmore, A.J. Lamb, G.Y. Ritchie et al. // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4. - P. 405-412.

70. Epstein W. Multiple mechanisms, role and controls of K+ transport in Escherichia coli / W. Epstein, E. Buurman, D. McLaggan, J. Naprstek // Biochem. Soc. Trans. 1993. - Vol. 2. - P. 1006-1010.

71. Epstein W. Osmoregulation by potassium-transport in Escherichia coli / W. Epstein // FEMS Microbiol. Rev. 1986. - Vol. 39. - P. 73-78.

72. Epstein W. Potassium-dependent mutants of E. coli / W. Epstein, M. Davies // J. Bacterid. 1970. - Vol. 101. - P. 836-843.

73. Epstein W. Potassium transport loci in E. coli K-12 / W. Epstein, B.S. Kim // J. Bacteriol. 1971. - Vol. 108. - P. 639-644.

74. Fahey R.C. Occurrence of glutathione in bacteria / R.C. Fahey, W.C. Brown, W.B. Adams, M.B. Worsham // J. Bacteriol. -1978. Vol. 33. - P. 1126-1129.

75. Fanton J.C. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukocyte dependent inflammatory reactions / J.C. Fanton, P.A. Ward // Am. J. Pathol. -1982. Vol. 107. - P. 397-418.

76. Farr S.B. Effects of oxygen stress on membrane functions in Escherichia coli: role of HPI catalase / S.B. Farr, D. Touati, T. Kogoma // J. Bacteriol. 1988. -Vol. 170. - P. 1837-1842.

77. Farr S.B. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium / S.B. Farr, T. Kogoma // Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 55. -P. 561-585.

78. Ferguson G.P. Survival during exposure to the electrophilic reagent N-ethylmaleimide in Escherichia coli'. role of KefB and KefC potassium channels / G.P. Ferguson, Y. Nikolaev, D. Mclaggan et al. // J. Bacteriol. -1997. Vol. 179. - P. 1007-1012.

79. Ferrante A. Cloning of an organic solvent-resistance gene in Escherichia coli: the unexpected role of alkilhydroperoxide reductase / A. Ferrante, J. Augliera, K. Lewis, A. Klibanov // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. -P. 7617-7621.

80. Freeman M.L. Does heat shock enhance oxidative stress? Studies with ferrous and ferric iron / M.L. Freeman, D.S. Spitz, M.J. Meredith // Radiat. Res. 1990. - Vol. 124. - P. 288-293.

81. Fridovich I. Superoxide dismutases /1. Fridovich // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 7761-7764.

82. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases / I. Fridovich // Annu. Rev. Biochem. 1995. - Vol. 64. - P. 97-112.

83. Fridovich I. The biology of oxygen radicals / I. Fridovich // Science. 1978. -Vol. 201. - P. 875-880.

84. Fuchs J.A. Isolation of an Escherichia coli mutant deficient in glutathione synthesis / J.A. Fuchs, H.R. Warner // J. Bacteriol. 1975. - Vol. 124. - P. 140148.

85. Gambino L. Overexpression of the MarA positive regulator is sufficient to confer multiple antibiotic resistance in Escherichia coli / L. Gambino, S.J. Gracheck, P.F. Miller I I J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 2888-2894.

86. Gardner P.R. Superoxide sensitivity of the Escherichia coli aconitase / P.R. Gardner, I. Fridovich I I J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - P. 19328-19333.

87. Gaudu P. Regulation of the SoxRS oxidative stress regulon: reversible oxidation of the shifting Fe-S. centers of SoxR et al. / P. Gaudu, N. Moon, B. Weiss // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 5082-5086.

88. Gaudu P. SoxR, a 2Fe-2S. transcriptional factor, is active only in its oxidized form / P. Gaudu, B. Weiss // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. -P. 10094-10098.

89. Giri A.K. The genetic toxicology of paracetamol and aspirin / A.K. Giri // Mutation Research. 1993. - Vol. 296(3). - P. 199-210.

90. Glammanco G. Interet taxonomique de la recherche de la y-glutamiltransferase chez les Enterobacteriaceae / G. Glammanco, J. Buissieres, M. Toucas et al. //Annu. Microbiol. 1980. - Vol. 131 A. - P. 181-187.

91. Gonzalez-Flecha B. Metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli / B. Gonzalez-Flecha, B. Demple // J. Biol. Chem. -1995. Vol. 270. - P. 13681-13687.

92. Gort A. Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defenses / A. Gort, J. Imlay // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - P. 1402-1410.

93. Cowie D.B. Metabolic pools and the biosynthesis of proteines / D.B. Cowie // Amino Acid Pools. 1962. - P. 633-645.

94. Graf E. Phytic acid a natural antioxidant / E. Graf, K. Empson, J. Eaton //J.Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262. - P. 11647-11650.

95. Greenberg J.T. A global response induced in Escherichia coli by redox-cycling agents overlaps with that induced by peroxide stress / J.T. Greenberg, B. Demple // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171. - P. 3933-3939.

96. Greenberg J.T. Glutathione in Escherichia coli is dispensable for resistance to H202 and gamma radiation / J.T. Greenberg, B. Demple // J. Bacteriol. 1986. -Vol. 168.-P. 1026-1029.

97. Greenberg J.T. Overproduction of peroxide-scavenging enzymes in Escherichia coli suppresses spontaneous mutagenesis and sensitivity to redox-cycling agents in oxyR mutants / J.T. Greenberg, B. Demple // EMBO J. 1988. -Vol.7.-P. 2611-2617.

98. Greenberg J.T. Positive control of global antioxidant defense regulon activated by superoxide-generating agents in Escherichia coli / J.T. Greenberg, P.A. Monach, J.H. Chou et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. -P. 6168-6185.

99. Greer S. Glutathione reductase from Escherichia coli: cloning and sequence analysis of the gene and relationship to other flavoprotein disulfide oxidoreductases / S. Greer, R.N. Perham // Biochem. 1986. - Vol. 25. -P. 2736-2742.

100. Gregory E.M. Induction of superoxide dismutase by molecular oxygen / E.M. Gregory, I. Fridovich // J. Bacteriol. 1973. - Vol. 114. - P. 543-548.

101. Gushima H. Purification and characterization of glutathione synthetase from Escherichia coli В / H. Gushima, T. Miya, K. Murata, A. Kimura // J. Appl. Biochem. 1983. - Vol. 5. - P. 210-218.

102. Ha H.C. Structural specificity of poliamine analogues in the protection of DNA from strand breaks induced by reactive oxigen species / H.C. Ha, J.D. Yager, P.M. Woster, R.A. Casero // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998a. - Vol. 244. - P. 298-303.

103. Ha H.C. The natural poliamine spermine functions directly as a free radical scavenger / H.C. Ha, N.S. Sirisoma, P. Kuppusamy et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998b. - Vol. 95. - P. 11140-11145.

104. Hachler H. marA, a regulated locus which controls expression of chromosomal multiple antibiotic resistance in Escherichia coli / H. Hachler, S.P. Cohen, S.B. Levy // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 5532-5538.

105. Halliwell В. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview / B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge // Meth. Enzymol. 1990. - Vol. 186. - P. 1-85.

106. Hancock R.E.W. Peptide antibiotics / R.E.W. Hancock, D.S. Chappie // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 1317-1323.

107. Harington A.A. Oxidation of methanol and formaldehyde by Pseudomonas methanica / A.A. Harington, R.E. Kallio // Can. J. Microbiol. 1969. - Vol. 6. -P. 1-7.

108. Harold F.M. Cation transport in bacteria: K+, Na+, and H+ / F.M. Harold, K. Altendorf // Curr. Top. Membr. Transp. 1974. - Vol. 5. - P. 1-50.

109. Harrop H.A. The oxygen effect: variation of the K-value and lifetimes of O2-dependent damage in some glutathione-deficient mutants of Escherichia coli / H.A. Harrop, K.D. Held, B.D. Michael // Int. J. Radiat. Biol. 1991. - Vol. 59. -P. 1237-1251.

110. Hassan H.M. Regulation of the synthesis of superoxide dismutase in Escherichia coli: induction by methyl viologen / H.M. Hassan, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252. - P. 7667-7672.

111. Hausladen A. Nitrosative stress: activation of the transcription factor OxyR / A. Hausladen, C. Privalle, T. Keng et al. // Cell. 1996. - Vol. 86. - P. 719729.

112. Hidalgo E. Adaptive responses to oxidative stress: the SoxRS and OxyR regulon / E. Hidalgo, B. Demple // In Regulation of Gene Expression in Escherichia coli. Edited by Lin E., Linch A. Austin: R.G. Landes Company. -1996. P. 435-452.

113. Hidalgo E. Binuclear 2Fe-2S. clusters in the Escherichia coli SoxR protein and role of the metal centers in transcription / E. Hidalgo, J.M. Bollinger, T.M. Bradleyet al. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 20908-20914.

114. Hidalgo E. Redox signal transduction: mutations shifting 2Fe-2S. centers of the SoxR sensor-regulator to the oxidized form / E. Hidalgo, H. Ding, B. Demple // Cell. -1997. Vol. 88. - P. 121-129.

115. Hidalgo E. The redox-regulated SoxR protein acts from a single DNA site as a repressor and an allosteric activator / E. Hidalgo, V. Leautaud, B. Demple // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - P. 2629-2636.

116. Hochman A. Programmed cell death in prokaryotes / A. Hochman // Critical Rev. Microbiol. -1997. Vol. 23. - P. 207-214.

117. Holmgren A. Glutathione-dependent synthesis of deoxyribonucleotides / A. Holmgren // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254. - P. 3661-3669.

118. Holmgren A. Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleoside-diphosphate reductase dependent upon glutathione / A. Holmgren // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - Vol. 179. - P. 2275-2279.

119. Jacobson F.S. An alkilhydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium involved in the defense of DNA against oxidative damage / F.S. Jacobson, R.W. Morgan, M.F. Christman, B.N. Ames // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 1488-1496.

120. Jakob U. Chaperone activity with a redox switch / U. Jakob, W. Muse, M. Eser, J. Bardwell // Cell. 1999. - Vol. 96. - P. 341-352.

121. Jamieson D.J. Saccharomyces cerevisiae has distinct adaptive responses to both hydrogen peroxide and menadione / D.J. Jamieson // J. Bacteriol. 1992. -Vol. 174. - P. 6678-6681.

122. Jamieson D. Transcriptional regulators of oxidative stress responses / D. Jamieson, G. Storz // In Oxidative Stress and the Molecular Biology of

123. Antioxidant Defenses. Edited by. Scandalios J. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. 1997. - P. 91-115.

124. Kappus H. Lipid peroxidation: mechanisms, analysis, enzymology and biological relevance / H. Kappus // In: Oxidative stress. Sies H. (Ed.). New York, Acad. Press. 1985. - P. 273-310.

125. Katsu T. Mode of action of gramicidin S on Escherichia coli membrane / T. Katsu, H. Kobayashi, F. Yuzaburo // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - Vol. 860. - P. 608-619.

126. Keyer K. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels / K. Keyer, J.A. Imlay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. -P. 13635-13640.

127. Keyer K. Superoxide and the production of oxidative DNA damage / K. Keyer, A.S. Gort, J.A. Imlay // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 67826790.

128. Koh Y. Dual regulation of the paraquat-inducible gene pqi-5 by the SoxS and RpoS in Escherichia coli / Y. Koh, J. Roe // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 22. -P. 53-61.

129. Koh Y. Regulation of the rib A gene encoding GTP glycohydrolase II by the SoxRS locus in Escherichia coli / Y. Koh, H. Choih, J. Lee, J. Roe // Mol. Gen. Genet. 1996. - Vol. 251. - P. 591-598.

130. Kondejewski L.H. Modulation of structure and antibacterial and hemolitic activity by ring size in cyclic gramicidin S analogs / L.H. Kondejewski, S.W. Farmer, D.S. Wishart et al. // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 2526125268.

131. Koo S.P. Diversity in antistaphylococcal mechanisms among membrane-targeting antimicrobial peptides / S.P. Koo, A.S. Bayer, M.R. Yeaman // Infec. Imm. 2001. - Vol. 69. - P. 4916-4922.

132. Koprowski P. Glutathione (GSH) reduces the open probability of mechanosensitive channels in Escherichia coli protoplasts / P. Koprowski, A. Kubalski // Pfliigers Arch.-Eur. J. Physiol. 1999. - Vol. 438. - P. 361-364.

133. Kosower N.S. The glutathione status of cells / N.S. Kosower, E.M. Kosower // Int. Rev. Cytol. -1978. Vol. 54. - P. 109-160.

134. Kroll R.G. The role of potassium transport in the generation of a pH gradient in Escherichia coli / R.G. Kroll, I.R. Booth // Biochem. J. 1981. - Vol. 198. -P. 691-698.

135. Kullik I. Mutation analysis of the redox-sensitive transcriptional regulator OxyR: region important for oxidation and transcriptional activation / I. Kullik, M. Toledano, L. Tartaglia, G. Storz // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 12751284.

136. Lee J. Adaptive response of Schizosaccharomyces pombe to hydrogen peroxide and menadione / J. Lee, I.W. Dawes, J.-H. Roe // Microbiol. 1995. -Vol. 141.-P. 3127-3132.

137. Lee P.C. AppppA, heat shock stress, and cell oxidation / P.C. Lee, B.R. Bochner, B.N. Ames // Proc. Natl. Acad. Sci. 1983. - Vol. 80. - P. 7496-7500.

138. Levy S.B. Active efflux mechanisms for antibacterial resistance / S.B. Levy // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. - Vol. 36. - P. 695-703.

139. Loewen P.C. Catalases HPI and HPII in Escherichia coli are induced independently / P.C. Loewen, J. Switala, B.L. Triggs-Raine // Arch. Biochem. Biophys. 1985. - Vol. 243. - P. 144-149.

140. Loewen P.C. Genetic mapping of katG, a locus that affects synthesis of the bifunctional catalase-peroxidase hydrogenase I in Escherichia coli / P.C.1.ewen, B.L. Triggs, C.S. George, B. Hrabarchuk // J. Bacteriol. 1985. - Vol. 162. - P. 661-667.

141. Loewen P.C. Levels of glutathione in Escherichia coli / P.C. Loewen // Can. J. Biochem. 1979. - Vol. 57. - P. 107-111.

142. Loewen P.S. The role of the sigma factor S (KatF) in bacterial global regulation / P.S. Loewen, R. Hengge-Aronis // Annu. Rev. Microbiol. 1994. -Vol. 48. - P. 53-80.

143. Lopez-Barea J. Redox control of glutathione and thioredoxin reductase / J. Lopez-Barea, J.A. Barcena // In: Plasm. Membr. Oxidoreduct. Control Anim. Plant Growth. Proc. NATO Adv. Res. Worthshop. Cordowa, March 2125. 1988. - New York-London.

144. Martin R.G. Binding of purified multiple antibiotic resistance repressor proteine (MarR) to mar operator sequences / R.G. Martin, J.L. Rosner I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. Vol. 92. - P. 5456-5460.

145. Martin R.G. Promoter discrimination by the related transcriptional activators MarA and SoxS: differential regulation by differential binding / R.G. Martin, W.K. Gillette, J.L. Rosner // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 35(3). - P.623-634.

146. Mata A.M. Purification by affinity chromatography of glutathione reductase (EC 1.6.4.2) from Escherichia coli and characterization of such enzyme / A.M. Mata, M.C. Pinto, J. Lopez-Barea // Z. Naturforsch 39C. 1984. - P. 908-915.

147. McCormick J.P. Characterization of a cell lethal product from the photooxidation of tryptophan: hydrogen peroxide / J.P. McCormick, R.J. Fischer, J.P. Pachlatko, A. Eisenstark // Science. 1976. - Vol. 191. - P. 468469.

148. McElhaney R. The effects of membrane lipids on permeability and transport in prokaryotes / R. McElhaney // Struc. Proper. Cell. Membr. 1985. - P. 75-91.

149. Meister A. Glutathione / A. Meister, M.E. Anderson // Annu. Rev. Biochem. -1983. Vol. 52. - P. 711-760.

150. Meister A. On the cycles of glutathione metabolism and transport / A. Meister // Curr. Top. Cell Regul. 1981. - Vol. 18. - P. 21-58.

151. Meury J. Glutathione and the gated potassium channels of Escherichia coli / J. Meury, A. Kepes // EMBO J. 1982. - Vol. 1. - P. 339-343.

152. Meury J. Glutathione-gated K+ channels of Escherichia coli carry out K+ efflux controlled by the redox state of the cell / J. Meury, A. Robin // Arch. Microbiol. 1990. - Vol. 154. - P. 475-482.

153. Meury J. The regulation of potassium fluxes for the adjustment and maintenance of potassium levels in Escherichia coli / J. Meury, A. Kepes // Eur. J. Biochem. 1981. - Vol. 119. - P. 165-170.

154. Michan C. In vivo transcription of the Escherichia coli oxyR regulon as a function of growth phase and in response to oxidative stress / C. Michan, M. Manchado, G. Dorado, C. Pueyo // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. -P. 2759-2764.

155. Milbauer R. y-Glutamyl transfer reactions in bacteria / R. Milbauer, N. Grossowitz // J. Gen. Microbiol. 1965. - Vol. 41. - P. 185-194.

156. Miller J.H. Experiments in molecular genetics / J.H. Miller // Cold Spring Harbor. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1972.

157. Miller P.F. Genetic relationship between SoxRS and Mar loci in promoting multiple antibiotic resistance in Escherichia coli / P.F. Miller, L.F. Gambino, C. Sulavik, S.J. Gracheck // Antimicrob. Agents Chemotherapy. 1994. - Vol. 38. - P. 1773-1779.

158. Miller P. Overlaps and parallels in the regulation of intrinsic multiple-antibiotic resistance in Escherichia coli / P. Miller, M. Sulavik // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 21. - P. 441-448.

159. Mitchell J. Thiols, thiol depletion and thermosensitivity / J. Mitchell, A. Russo // Radiat. Res. -1983. Vol. 95. - P. 471-485.

160. Morgan R.W. Hydrogen peroxide-inducible proteins in Salmonella typhimurium overlap with heat shock and other stress proteins / R.W. Morgan, M.F. Christman, F.S. Jacobson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. -Vol. 83. - P. 8059-8063.

161. Moscovitz J. Escherichia coli peptide methionine sulfixide reductase gene: regulation of expression and role in protecting against oxidative damage / J. Moscovitz, M. Rahman, J. Strassman et al. // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. P. 502-507.

162. Mustaev A. Topology of RNA polymerase active center probed by chimeric rifampicin-nucleotide compounds / A. Mustaev, E. Zaychikov, K. Severinov, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 12036-12040.

163. Nakajima H. soxRS gene increased the level of organic solvent tolerance in Escherichia coli / H. Nakajima, H. Kobayashi, T. Negishi, R. Aono // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. - Vol. 59. - P. 1323-1325.

164. Nakayama R. Leakage of glutathione from bacterial cells caused by inhibition of y-glutamiltranspeptidase / R. Nakayama, H. Kumagai, T. Tochikura // Appl. Enviromental Microbiol. 1984. - Vol. 47. - P. 653-657.

165. Nathan C.F. Secretory products of macrophages / C.F. Nathan // J. Clin. Invest. 1987. - Vol. 79. - P. 319-326.

166. Neu H.C. The crisis in antibiotic resistance / H.C. Neu // Science. 1992. -Vol. 257. - P. 1064-1073.

167. Newton G.L. y-Glutamylcysteine and thiosulfate are the major low-molecular-weight thiols in halobacteria / G.L. Newton, B. Javor // J. Bacteriol. 1985. -Vol. 161. - P. 438-441.

168. Newton G.L. Low-molecular weight thiols in Streptomyces and their potential role as antioxidants / G.L. Newton, R.C. Fahey, G. Cohen, Y. Aharonowitz // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 2734-2742.

169. Newton Y. Distribution of thiols in microorganisms: mycothiol is a major thiol in most actinomyces / Y. Newton, K. Arnold, M.S. Price et al. // J. Bacteriol. -1996. Vol. 178. - P. 1990-1995.

170. Noctor G. Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants / G. Noctor, A.C.M. Arisi, L. Jouanin et al.//J. Exp. Bot. 1998. - Vol. 49. - P. 623-647.

171. Noriega G.O. Effect of acetaminophen on heme metabolism in rat liver / G.O. Noriega, J.O. Ossola, M.L. Tomaro, A.M.D. Batlle // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2000. - Vol. 32. - P. 983-991.

172. Paulsen I.T. Proton-dependent multidrug efflux system / I.T. Paulsen, M.H. Brown, R.A. Skurray // Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 60. - P. 575-608.

173. Penninckx M.J. On the role of glutathione in microorganisms / M.J. Penninckx, C.J. Jaspers // Bull. Inst. Pasteur. 1982. - Vol. 80. - P. 291-301.

174. Philippon A. Extended spectrum beta-lactamases / A. Philippon, R. Labia, G. Jacoby // Antimicrob. Agents Chemother. 1985. - Vol. 38. - P. 302-307.

175. Pizzaro R.A. UVA oxidative damage modified by environmental conditions in Escherichia coli / R.A. Pizzaro I I Int. J. Radiat. Biol. 1995. - Vol. 68. - P. 293299.

176. Plummer J.L. Chemical depletion of glutathione in vivo / J.L. Plummer, B.R. Smith, H. Sies, J.R. Bend // Meth. Enzymol. 1981. - Vol. 77. - P. 50.

177. Pomposiello P.J. Genome-wide transcriptional profiling of the Escherichia coli responses to superoxide stress and sodium salicylate / P.J. Pomposiello, M.H.J. Bennik, B. Demple // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 3890-3902.

178. Pomposiello P.J. Global adjustment of microbial physiology during free radical stress / P.J. Pomposiello, B. Demple // Adv. Microb. Physiol. 2002. -Vol. 46. - P. 319-341.

179. Price C.T. The efflux of salicylate on bacteria / C.T. Price, I.R. Lee, J.E. Gustafson // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2000. - Vol. 32. - P. 1029-1043.

180. Privalle C.T. Induction of superoxide dismutase in Escherichia coli by heat shock / C.T. Privalle, I. Fridovich // Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. - Vol. 84. -P. 2723-2726.

181. Pryor W. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes and reactions / W. Pryor // Annu. Rev. Physiol. 1986. - Vol. 48. - P. 657-667.

182. Ramasarma T. H2C>2 has a role in cellular regulation / T. Ramasarma // Indian J. Biochem. Biophys. 1990. - Vol. 127. - P. 269-274.

183. Rao N. Inorganic polyphosphate supports resistance and survival of stationary phase Escherichia coli / N. Rao, A. Kornberg // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 1394-1400.

184. Reed D.J. Biosynthesis and regulation of glutathione: toxicological implications / D.J. Reed, P.W. Beatty // Rev. Biochem. Toxicol. 1980. - Vol. 2. - P. 213-241.

185. Reijo L. But three is oxidized glutathione in Streptococcus faecalis / L. Reijo, P. Vuorinen, M. Suonpaa // Acta Chem. Scand. 1982. - Vol. 36B. - P. 109112.

186. Rhoads D.B. Cation transport in Escherichia coli. VIII / D.B. Rhoads, F.B. Waters, W. Epstein I I J.Gen. Physiol. 1976. - Vol. 67. - P. 325-341.

187. Rhoads D.B. Energy coupling to net K+ transport in E. coli K-12 / D.B. Rhoads, W. Epstein// J. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252. - P. 1394-1401.

188. Romero M.J.M. The evaluation of Escherichia coli as a model for oxidant stress in mammalian hepatocytes: role of glutathione / M.J.M. Romero, A.T. Canada // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1991. - Vol. 111. - P. 485-495.

189. Rose Z.B. Formaldehyde dehydrogenase from baker's yeast / Z.B. Rose, E. Racker // J. Biol. Chem. 1962. - Vol. 237. - P. 3279-3283.

190. Rosner J. Dual regulation of inaA by the multiple antibiotic resistance (Mar) and superoxide (SoxRS) stress response systems of Escherichia coli / J. Rosner, J. Slonczewski // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - P. 6262-6269.

191. Rosner J.L. Nonheritable resistance to chloramphenicol and other antibiotics induced by salicylate and other chemotactic repellents in Escherichia coli K-12 / J.L. Rosner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol. 82. - P. 87718774.

192. Rosner J.L. Regulation of bacterial responses to oxidative stress / J.L. Rosner, G. Storz // Curr. Top. Cell. Regul. -1997. Vol. 35. - P. 163-177.

193. Sakuda S. Structure of novel disulfide of 2-(N-acetylcysteinyl)amino-2-deoxy-/2-D-glucopyranosyl-myo-inositol produced by Streptomyces sp. / S. Sakuda, Z.-Y. Zhou, Y. Yamada // Biotech. Biochem. 1994. - Vol. 58. - P. 1347-1348.

194. Schaller A. Salicylate reduces susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to multiple antituberculosis drug / A. Schaller, Z. Sun, Y. Yang et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46. - P. 2636-2639.

195. Schellhorn H.E. Transcriptional regulation of katE in Escherichia coli K-12 / H.E. Schellhorn, H.M. Hassan // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170. - P. 42864292.

196. Seaver L.C. Alkyl hydroperoxide reductase is the primary scavenger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli / L.C. Seaver, J. Imlay // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 7173-7181.

197. Seoane A.S. Characterization of MarR, the repressor of the multiple antibiotic resistance (mar) operon of Escherichia coli / A.S. Seoane, S.B. Levy //J. Bacteriol. 1995a. - Vol. 177. - P. 3414-3419.

198. Seoane A.S. Identification of new genes regulated by the marRAB operon in Escherichia coli / A.S. Seoane, S.B. Levy // J. Bacteriol. 1995b. - Vol. 177. -P. 530-535.

199. Shigenaga M.K. Assays for 8-hydroxy-2-deoxyguanosine: a biomarker of in vivo oxidative DNA damage / M.K. Shigenaga, B.N. Ames // Free Rad. Biol. Med. 1991. - Vol. 10. - P.211.

200. Shultz S.G. A bacterial mutant with impares potassium transport / S.G. Shultz, A.K. Solomon // Nature. 1961. - Vol. 187. - P. 802-804.

201. Sies H. Biochemistry of oxidative stress / H. Sies // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986. - Vol. 25. - P. 1058-1071.

202. Sies H. Glutathione and its role in cellular functions. / H. Sies // Free Radic. Biol. Med. 1999. - Vol. 27. - P. 916-921.

203. Slater A.F.G. Intracellular redox changes during apoptosis / A.F.G. Slater, C. Stefan, I. Nobel et al. // Death Differential. 1996. - Vol. 3. - P. 57-62.

204. Smirnova G.V. Betaine modulates intracellular thiol and potassium levels in Escherichia coli in medium with high osmolarity and alkaline pH / G.V. Smirnova, O.N. Oktyabrsky //Arch. Microb. 1995. - Vol. 163. - P. 76-78.

205. Smirnova G.V. Effects of menadione and hydrogen peroxide on glutathione status in growing Escherichia coli / G.V. Smirnova, N.G. Muzyka, M.N.

206. Glukhovchenko, O.N. Oktyabrsky // Free Radic. Biol. Med. 2000. - Vol. 28. -P. 1009-1016.

207. Smirnova G.V. Near-ultraviolet radiation and hydrogen peroxide modulate intracellular levels of potassium and thiols in Escherichia coli / G.V. Smirnova, O.N. Oktyabrsky // Curr. Microbiol. 1994. - Vol. 28. - P. 77-79.

208. Storz G. Oxidative stress / G. Storz, J.A. Imlay // Curr. Opin. Microbiol. -1999. Vol. 2. - P. 188-194.

209. Storz G. Transcriptional regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation by oxidation / G. Storz; L.A. Tartaglia, B. Ames // Science. 1990. -Vol. 248. - P. 189-194.

210. Sulavik M.C. The Salmonella typhimurium Mar locus: molecular and genetic analyses and assessment of its requirement for virulence / M.C. Sulavik, M. Dazer, P.F. Miller // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 176. - P. 1857-1866.

211. Sundquist A.R. Evolution of antioxidant mechanisms: thiol-dependent peroxidases and thioltransferase among procariotes / A.R. Sundquist, R.C. Fahey // J. Mol. Evol. -1989. Vol. 29. - P. 429-435.

212. Suzuki H. DNA sequence of the Escherichia coli K12 y-glutamyltranspeptidase gene, ggt / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, T. Tochikura // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171. - P. 5169-5172.

213. Suzuki H. y-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K12: formation and localization / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Tochikura // J. Bacteriol. 1986b. -Vol. 168. - P. 1332-1335.

214. Suzuki H. y-Glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K12: purification and properties / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Tochikura // J. Bacteriol. 1986a. -Vol. 168. - P. 1325-1331.

215. Suzuki H. Isolation, genetic mapping and characterization of Escherichia coli K12 mutants lacking y-glutamyltranspeptidase / H. Suzuki, H. Kumagai, T. Tochikura // J. Bacteriol. 1987. - Vol. 169. - P. 3926-3931.

216. Tabor H. The complete conversion of spermidine to a peptide derivative in Escherichia coli / H. Tabor, C.W. Tabor // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1979.-Vol. 41.-P. 232-238.

217. Tao K. OxyR-dependent induction of Escherichia coli grx gene expression by peroxide stress / K. Tao // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 5967-5970.

218. Tartaglia L.A. Identification and molecular analysis of oxy/?-regulated promoters impotant for the bacterial adaptation to oxidative stress. / L.A. Tartaglia, G. Storz, B.N. Ames // J. Mol. Biol. -1989. Vol. 210. - P.709-719.

219. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Application to mammalian blood and other tissues / F. Tietze // Anal. Biochem. 1969. - Vol. 27. - P. 502-522.

220. Touati D. Superoxide dismutase in bacteria and pathogen protists / D. Touati // Oxid. Stress Molecul. Biol. Antioxid. Defenses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1997. - P. 447-493.

221. Triggs-Raine B.L. Physical characterization of katG encoding catalase HPI of Escherichia coli / B.L. Triggs-Raine, P.C. Loewen // Gene. 1987. - Vol. 52. -P. 121-128.

222. Tsaneva I. soxR, a locus governing a superoxide response regulon in Escherichia coli K-12. / I. Tsaneva, B. Weiss I I J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - P. 4197-4205.

223. Tsuchida S. Glutathione transferases / S. Tsuchida // In: Encyclopaedia of Cancer. San Diego: Acad. Press. 1997. - Vol. II. - P. 733-743.

224. Tuggle C.K. Glutathione reductase is not required for maintenance of reduced glutathione in Escherichia coli K-12 / C.K. Tuggle, J.A. Fuchs // J. Bacteriol. -1985. Vol. 162. - P. 448-450.

225. Vuilleumier S. Bacterial glutathione ^-transferases: what are they good for? / S. Vuilleumier // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 1431-1441.

226. Walker G.C. Mutagenesis and inducible responses to DNA damage in Escherichia coli /G.C. Walker // Microbiol. Rev. 1984. - Vol. 48. - P. 60-93.

227. Walkup L.K.B. Escherichia coli proteins inducible by oxidative stress mediated by the superoxide radical / L.K.B. Walkup, T. Kogoma // J. Bacteriol.- 1989. Vol. 171. - P. 1476-1484.

228. Walsh C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance / C. Walsh // Nature. 2000. - Vol. 406. - P. 775-781.

229. Wegrzyn A. Differential inhibition of transcription from o^cr^-dependent promoters by rifampicin / A. Wegrzyn, A. Szalewska-Palasz, A. Blaszczak, et al. // FEBS Lett. 1998. - Vol. 440. - P. 172-174.

230. Wendel A. Glutathione peroxidase / A. Wendel // Enz. Basis Detox. 1980. -Vol. 1. - P. 333-353.

231. Wu J. Two divergently transcribed genes, soxR and soxS, control a superoxide response of Escherichia coli / J. Wu, B. Weiss // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173.- P. 2864-2871.

232. Yamasaki K. Uptake and extrusion of K+ regulated by extracellular pH in Escherichia coli / K. Yamasaki, Y. Moriyama, M. Futai, T. Tsuchiya // FEBS Lett. 1980. - Vol. 120. - P. 125-127.

233. Zheng M. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation / M. Zheng, F. Aslund, G. Storz // Science. 1998. - Vol. 279. -P. 1718-1721.

234. Zheng M. DNA microarray-mediated transcriptional profiling of th Escherichia coli response to hydrogen peroxide / M. Zheng, X. Wang, L., Templeton et al. // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 4562-4570.

Информация о работе

Торхова, Оксана Александровна
кандидата биологических наук
Пермь, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Роль антиоксидантных систем в ответе бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы