Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу

Федотова, Марина Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу"

На правах рукописи

ФЕДОТОВА Марина Валентиновна

РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В АДАПТАЦИИ ESCHERICHIA COLI К СУПЕРОКСИДНОМУ СТРЕССУ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2007

003059106

Работа выполнена в лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ткаченко Александр Георгиевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Пшеничнов Роберт Алексеевич доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна

Ведущая организация:

Институт биохимии им А Н Баха РАН, Москва

диссертационного совета Д 004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, Пермь, ул Голева, 13 Факс (342) 244 67 11

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН http //www iegm ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан " " at Г 2007 г

Защита состоится "JO " 2007 г в /<t

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, чл -корр РАН

Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение последнего десятилетия проблема окислительного стресса привлекает все большее внимание как со стороны исследователей в области фундаментальных биологических наук, так и со стороны специалистов практической медицины Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что окислительный стресс является непосредственной причиной возникновения различных болезней человека, в том числе злокачественных новообразований, а также процессов старения организма (Ашев е( а1, 1993, МсСогс!, Е<1еаз, 2005) Общность основных механизмов защиты клеток про- и эукариот от окислительного стресса делает актуальным использование микроорганизмов в качестве модели для изучения повреждающих воздействий активных форм кислорода (АФК), а также защитных механизмов клетки от этих повреждений (81§1ег е1 а1, 1999) В то же время, изучение специфичности адаптивных реакций прокариотических клеток к действию окислительного стресса могло бы способствовать решению проблемы лечения бактериальных инфекций, поскольку механизм действия некоторых антибиотиков основан на индукции окислительного стресса (Соэ'Л'агт а а1, 2006) Проблема окислительного стресса имеет также тесную связь с вопросами иммунитета, поскольку продукция АФК фагоцитами является важным защитным механизмом, лежащим в основе неспецифического иммунитета (Бюгг, 1ш1ау; 1999)

В настоящее время интенсивные исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении генов и белков, участвующих в адаптации бактериальных клеток к окислительному стрессу (Оетр1е, 1999) В то же время малоизученным остается вопрос о роли метаболических факторов, которые, как известно, принимают активное участие в адаптивных реакциях клеток на стресс, обеспечивая наиболее адекватное и экономичное приспособление клетки к условиям среды (Нег^еАгошя е; я/, 1996) Среди таких факторов особый интерес представляют биогенные полиамины, поликатионная природа которых обусловливает возможность их взаимодействия с отрицательно заряженными группами биополимеров клетки (^агазЬ еь а1, 2000) Результатом таких взаимодействий является значительное влияние полиаминов на клеточные процессы как про- так и эукариот, что дает основание рассматривать их как универсальные клеточные регуляторы

(Igarashi, Kashiwagi, 2000) В последнее время появляется все больше сведений о существенной роли этих соединений в адаптации микроорганизмов к различным видам стресса (Ткаченко и др., 1997, 1998, Reis et al, 1999) В том числе имеется ряд публикаций об участии полиаминов в защите клеток Е coli от действия активных форм кислорода (Chattopadhyay et al, 2002, Jung et al, 2003) Однако в литературе лишь немногочисленные работы посвящены исследованию механизмов протекторного действия этих соединений К их числу относятся статьи, посвященные изучению роли полиаминов в адаптации Е coli к действию перекиси водорода ( Tkachenko et al, 2001, Ткаченко и др , 2001,2003) В то же время, в литературе практически отсутствуют данные о механизмах защитного действия полиаминов при окислительном стрессе, вызванном супероксидными радикалами

Цель настоящей работы - выяснение роли полиаминов в адаптации Е coli к условиям супероксидного стресса, индуцированного паракватом

Основные задачи исследования

1 Исследовать активность основных ферментов синтеза полиаминов в условиях супероксидного стресса

2 Изучить антиоксидантные свойства полиаминов и их роль в защите клеток от действия супероксидных радикалов

3 Выяснить характер и механизмы влияния полиаминов на экспрессию генов soxRS регулона

4 Проследить топологические перестройки молекулы ДНК при супероксидном стрессе и оценить действие полиаминов на топологию ДНК в данных условиях

5 Изучить влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов, частоту мутаций и количество жизнеспособных клеток в культуре Е coli, подвергнутой супероксидному стрессу

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы. Установлено, что в ответ на супероксидный стресс в клетках Е coli происходит возрастание активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и их конечных продуктов Впервые показана способность полиаминов нейтрализовать супероксидные радикалы in vitro в системе феназинметасульфат-NADH, а также их участие в поддержании гомеостатического уровня супероксидных радикалов в клетках Е coli Выявлена роль путресцина как положительного транскрипционного

модулятора экспрессии генов soxRS регулона Установлена роль путресцина как модулятора топологического состояния в транскрипционной регуляции генов soxRS регулона. Обнаружен положительный эффект путресцина на активность адаптивных ферментов в клетках Е coli в условиях сильного стресса

Полученные результаты расширяют представления о механизмах, лежащих в основе защитных функций полиаминов от действия активных форм кислорода

Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета Основпые положения, выносимые на защиту

1 В ответ на супероксидный стресс в клетках Е coli индуцируется активность ферментов синтеза полиаминов, которые функционируют как антиоксиданты, нейтрализующие супероксидные радикалы

2 В адаптации Е coli к супероксидному стрессу полиамины выполняют две функции нейтрализаторов супероксидных радикалов и положительных модуляторов генной экспрессии. Преобладание той или иной функции определяется силой стрессорного воздействия

3 В условиях супероксидного стресса полиамины участвуют в регуляции топологического состояния ДНК Модулирующая активность путресцина в отношении топологии ДНК оказывает положительное влияние на экспрессию генов soxRS регулона

4 Функционирование полиаминов как положительных транскрипционных модуляторов генов soxRS регулона способствует возрастанию в клетках Е coli активности адаптивных ферментов и повышению жизнеспособности клеток

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены в тезисах на Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград-Пермь, 2001, 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 2002, 8-й Пущинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 2004, Международной конференции «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» Пермь, 2005, в докладе на 9-й Пущинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 2005

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ¿i/страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 20 рисунками Список литературы включает^^^аименований работ, из них/ротечественных и/г££7зарубежных авторов

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу», индекс приоритетного направления 5.19, 5 21, 5 24, номер госрегистрации 01 2 01 2 00 3 06932. Исследования поддержаны грантами РФФИ (04-0497501, 05-04-48091, 04-04-96062)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали различные штаммы Escherichia cob (табл. 1) Эксперименты проводили на синтетической питательной среде М-9 Культуру бактериальных клеток выращивали в колбах в условиях термостатируемого шейкера при температуре 37°С Биомассу клеток оценивали на спектрофотометре СФ-46 (JTOMO, Россия) по оптической плотности (OD6oo) после предварительного разведения При определении активности ферментов синтеза полиаминов проводили культивирование в ферментере аппарата АНКУМ-2, СКБ БП РАН, Пущино. Супероксидный стресс воспроизводили добавлением параквата до конечной концетрации 10-20 мкг/мл при воспроизведении слабого стресса и 30-80мкг/мл для индукции умеренного и сильного стрессов

Таблица 1

Штаммы Е. coli, использованные в работе

Штамм Генотип Источник получения

К-12 ЕН40 GC4468 Дикий тип GC4468, но X[soxS lacZ\ (SoxRS+) К12 ipsL thi soxR+ soxS+ BKM, Москва В Demple, USA

N9210 8452, но \\fpr lacZ\ R G Martin, USA

N9211 8452, но k\fumC lacZ]

N9212 N9213 8452, но ЦmicF lacZ] 8452, но ),[nfo lacZ] R G Martin, USA

N9086 7840, но \[sodA lacZ]

N9211 N 9211/ pBR322 Данная работа

(pBR322)

N8452 rob', mar, sox+, устойчив к kan R G Martin, USA

N7840 mar, rob*, sox+, чувствителен к kan R G Martin, USA

плазмида pBR 322 pBR 322 Б НИИ СПГУ, С.-Петербург

Примечание. Авторы выражают благодарность профессорам Брюсу Демплу из Гарвардской школы здоровья (Бостон, США) и Роберту Мартину из Национального института здоровья (Бесезда, США) за предоставленные штаммы

Трансформацию плазмиды pBR 322 осуществляли методом, основанном на использовании СаС12 (Маниатис и др, 1984) Выделение плазмидной ДНК проводили традиционным методом щелочного гидролиза (Харди, 1989) Выделенную плазмидную ДНК использовали для определения топологических характеристик после разделения методом горизонтального электрофореза (Маниатис и др, 1984) Интенсивность свечения полос плазмидной ДНК, окрашенной бромистым этидием, измеряли после предварительного фотографирования гелей на цифровую камеру с помощью компьютерного денситрометрирования изображений в программе Adobe Photoshop 5 О Степень суперспирализации ДНК оценивали по средним значениям Lk (Van Workum et al, 1996) Для определения свойств полиаминов как соединений, участвующих в подавлении свободнорадикальных реакций, использовали систему генерации супероксидных радикалов in vitro, содержащую феназинметосульфат (ФМС) - NADH (Liu et al, 1997) Содержание АФК в клетках оценивали с помощью модифицированного

спектрофлуориметрического метода с использованием 2,7-дихлорофлуоресцина диацетата (DCFH-DA) ("Sigma" Германия) (Balasubramaniam et al, 2003) Измерение флуоресценции окрашенных образцов осуществляли на спектрофлуориметре RF- 1501 («Shimadzu»

Япония) Активность глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы и фумаразы С определяли спектрофотометрическим методом (Као, Hassan, 1985, Liochev, Fndovich, 1992) Для определения содержания полиаминов использован метод тонкослойной хроматографии их дансилированных производных (Чудинов и др, 1984) Определение активности ферментов системы синтеза полиаминов осуществляли методом, основанным на измерении количества полиаминов, синтезированных in vitro в декарбоксилазной реакции (Ткаченко и др, 1989) Содержание белка определяли методом Лоури (Lowry et al, 1951) Уровень экспрессии исследуемых генов в штаммах, несущих слияние промотора соответствующего гена с геном lacZ, оценивали по активности ß-галактозидазы методом Миллера (Miller, 1972) Частоту спонтанных мутаций определяли по признаку устойчивости к рифампицину (Gonzales-Flecha, Demple, 1997) Содержание живых клеток в культуре определяли методом высева на чашки с LB-агаром и подсчетом выросших колоний

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы "Statistica for Windows 5,0" (StatSoft, Inc, 1995) Ha рисунках приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех) Вертикальными отрезками обозначена величина среднего квадратического отклонения Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента Различия считались значимыми при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Окислительный стресс возникает при воздействии на клетку активных форм кислорода (АФК), основными среди которых являются супероксидный радикал и перекись водорода Защиту клеток Е coli от действия данных АФК осуществляют гены, организованные, соответственно, в soxRS и oxyR регулоны Активные формы кислорода постоянно образуются в клетках аэробных микроорганизмов как побочные продукты работы дыхательной цепи и представляют собой потенциальный источник эндогенного окислительного стресса В условиях эксперимента для воспроизведения супероксидного стресса обычно используют редоксциклирующие соединения, такие как паракват, менадион, плюмбагин, которые вызывают циклический процесс одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода до супероксидного радикала за счет окисления редоксферментов клетки (Störs,

Imlay, 1999).

Исследование роли полиаминов как регуляторов количества свободных радикалов кислорода в клетках Е. coli. Для первичной оценки вовлеченности полиаминов в адаптивный ответ клетки исследовано влияние супероксидного стресса на активность ключевых ферментов синтеза полиаминов в экспоненциальной культуре Е. coli.

Установлено, что а условиях супероксидного стресса во всех исследованных штаммах Е, coli происходит индукция активности орнитинде карбоксил азы, что приводит к возрастанию количества путресцина в клетках (рис. 1). Некоторые отличия в степени индукции между различными штаммами, по-видимому, связаны с начальным уровнем активности фермента, значения которого определяются индивидуальными особенностями штаммов (Tabor, et al„ 1983).

Исследование активности лизиндекарбоксилазы также показало приблизительно 40% ее индукцию. При этом внутриклеточный пул кадаверина, который практически отсутствовал В клетках в нормальных условиях, возрастал до 1,5 нмоль/ мг АСБ (рис. 2).

N9213 N9211 N9086 Штамм

Рис. I. Изменение активности орнитиндекарбокенлазы (ОДК) и содержания путресцина в клетках Е, colt в условиях супероксндного стресса.

1- активность ОДК в клетках, не подвергутых стрессу; 2- при супсроксидном стрессе; 3- возрастание путресцина в клетках (% от контроля). Пробы взяты через 2 часа после индукции стресса. *- р<0,05 относительно культуры, не подвергнутой стрессу (1).

ч к о

v§ £

370

Св

к «3 й- м

ч: к

5 J 320 к vo

со Я

4 >4

5 со К н

ы <

270

220

Время, мин

Рис 2 Изменение активности лизнндекарбоксилазы (ЛДК) и содержания кадаверина в клетках Е. coli К-12 при супероксидном стрессе.

1- активность ЛДК, 2- количество кадаверина Стрелкой обозначен момент внесения параквата

Возрастание активности ферментов синтеза полиаминов в ответ на супероксидный стресс свидетельствует о вовлеченности этих соединений в стрессовый ответ и обосновывает дальнейшее изучение их роли в адаптации клеток Е coli к действию супероксидных радикалов

Постоянное присутствие активных форм кислорода в клетках делает необходимым непрерывное функционирование систем антиоксидантной защиты, осуществляющих гомеостатический контроль уровня свободных радикалов в клетке (Halhwell, Guttendge, 1995) Анализ данных литературы позволил предположить, что полиамины также могут участвовать в регуляции уровня свободных радикалов, в частности супероксида, в клетках Е coli в условиях аэробного роста (На et al, 1998, Chattopadhyay et al, 2002, Jung et al, 2003)

Показанная нами в экспериментах in vitro способность полиаминов ингибировать реакцию восстановления тетразолия супероксидными радикалами, образующимися в системе NADH-феназинметасульфат подтверждает наличие у этих соединений свойств нейтрализаторов супероксидных радикалов (рис 3) Возможность взаимодействия

полиаминов с АФК, в частности с гидроксильными радикалами, связывают с наличием у этих соединений аминогрупп (На е/ а/, 1998) Более выраженные антиоксидантные свойства спермидина, по-видимому, обусловлены наличием трех аминогрупп в его составе, тогда как кадаверин и путресцин, имеющие по две аминогруппы, проявляют практически равные антиоксидантные возможности

Рис 3 Влияние полиаминов на реакцию восстановления тетразолия супероксидными радикалами в системе NADH-феназинметасульфат. Все

полиамины вносились в систему в концентрации 5мМ

С целью изучения антиоксидантных функций полиаминов in vivo нами исследована экспрессия гена soxS экспоненциальной культуры Е coli в условиях пониженного содержания полиаминов в клетках, вызванного ингибитором орнитиндекарбоксилазы 1,4-диамино-2-бутаноном (ДАБ) (Reis et al, 1999) Экспрессия данного гена находится под контролем транскрипционного активатора SoxR, который в условиях стресса окисляется непосредственно супероксидом и активирует транскрипцию soxS (Störs, Imlay, 1999) Обнаруженный в результате проведенных экспериментов повышенный уровень экспрессии soxS в условиях дефицита полиаминов свидетельствует о возрастании в клетках количества супероксидных радикалов, а снижение экспрессии soxS до исходного уровня при добавке путресцина подтверждает его способность регулировать количество супероксидных радикалов в клетках Е coli (рис 4)

401

Путресцин Кадаверин Спсрмидин

80 и

«оЧ

пут-ресцин

500

450 I

400 S

350 § « § &

зоо 2 n

1 n

m s

250 л S

Ö ч 200 о u

к и

150 g

100 50

И <

0 60 120 180 240

Время, мин

Рис 4 Влияние ингибитора орнитиндекарбоксилазы (ДАБ) на уровень экспрессии soxS и концентрацию путресцина в клетках экспоненциальной культуры Е coli ЕН40.

Количество полиаминов в клетках 1- в отсутствие ДАБ, 2- в присутствии 0,3 мг/мл ДАБ Уровень экспрессии soxS 3 - в присутствии 0,3 мг/мл ДАБ, 4 - в отсутствие ДАБ, 5- в присутствии 0,3 мг/мл ДАБ и ЮмМ путресцина, 6 - в присутствии ЮмМ путресцина *- р<0,05 относительно количества путресцина в культуре без добавки ДАБ (2), **- р<0,05 относительно уровня экспрессии soxS в культуре без добавки ДАБ(4)

Определение содержания АФК в клетках, которое оценивали по

значению эмиссии после их окрашивания флуоресцентным красителем,

показало в среднем 20% возрастание количества АФК в клетках с

пониженным содержанием полиаминов, обработанных ингибитором, по

сравнению с интактными клетками Е. coli (рис.5)

Таким образом, показанная нами индукция активности ферментов

синтеза полиаминов в ответ на супероксидный стресс и возрастание их

количества в клетках Е coli достоверно свидетельствуют о вовлеченности

данных соединений в стрессовый ответ клетки В условиях аэробного роста

полиамины совместно с другими системами антиоксидантной защиты

участвуют в регуляции количества супероксидных радикалов клетках Е coli

350

у—N

К 300

CN 12, 250

5 200

о s

г, 150 0) s

5 ioo

В" cj X

со 50

1 2

Рис 5 Влияние ДАБ на количество АФК в клетках Е. coli ЕН40.

1- количество АФК в интактных клетках, 2- в клетках, обработанных ДАБ *- р<0,05 относительно интактных клеток

Изучение роли полиаминов в регуляции экспрессии генов soxRS регулона. Возросшее в последнее время число публикаций о существенной роли полиаминов в регуляции генной экспрессии (Ткаченко и др , 2003, Yoshida et а/,2004, Igarashi et al, 2006) послужило основанием для изучения подобного действия этих соединений в отношении генов soxRS регулона Индукция этих генов находится под контролем транскрипционных регуляторов SoxR и SoxS Окисление супероксидными радикалами [2Fe-2S]-кластеров SoxR делает его способным индуцировать экспрессию SoxS, который, в свою очередь, является транскрипционным активатором генов-мишеней soxRS регулона (Störs, Imlay, 1999)

В результате проведенных экспериментов установлено, что влияние полиаминов на экспрессию soxS носит двойственный характер и зависит от силы стрессорного воздействия, которую оценивали по степени подавления паракватом удельной скорости роста (р.) культуры Е coli (рис 6, 7) В условиях слабого стресса (5-15% снижение ¡1) наблюдалось приблизительно 15-20% снижение экспрессии soxS при добавке 5мМ путресцина или кадаверина и в среднем 30% снижение при добавке 2мМ спермидина в культуру Е сок Обнаруженный эффект, по- видимому, является следствием способности данных соединений нейтрализовать супероксидные радикалы в клетках Е coli (см рис 3, 4) В пользу этого свидетельствует также

дифференцированное влияние полиаминов на экспрессию soxS в данных условиях, которое хорошо коррелирует с антиоксидантными свойствами этих соединений (см рис 3) Стимулирование путресцином экспрессии soxS в условиях умеренного (15-30% снижение ß) и сильного (50% и выше снижение ц) супероксидного стресса свидетельствует о наличие у него свойств положительного транскрипционного модулятора (рис 6) Показано, что SoxS может ограничивать собственную транскрипцию (Nunoshiba et al, 1993) Возможно, одним из механизмов транскрипционной активации soxS путресцином в этих условиях может быть вытеснение данным полиамином SoxS из промоторной области гена, подобно его действию на /ас-репрессор (Bryans et al, 1996) Значительное падение экспрессии soxS при сильных стрессорных воздействиях предположительно связано с разрушением [2Fe-2S]- кластеров SoxR (Tang et al, 2002)

я" я

ПС

к я ►а я и в о о* >Г

1 2 ' 5-15

1 2 * 15-30

1 2 30-50

1 2 * 50 и выше

Снижение удельной скорости роста ( % от контроля)

Рис 6 Зависимость уровня индукции soxS от силы супероксидного стресса (1). Влияние путресцина на уровень индукции soxS в зависимости от силы супероксидного стресса (2). Уровень индукции -отношение величины генной экспрессии при окислительном стрессе к уровню экспрессии в отсутствие стресса *- р<0,05 относительно индукции soxS в отсутствие путресцина (1)

Исследование влияния других полиаминов Е coli на экспрессию soxS при сильном стрессе показало специфичность их действия (рис 7В) Спермидин, подобно путресцину, стимулировал экспрессию soxS, тогда как в

присутствии кадаверина ее уровень оставался близким к контрольному. Наблюдаемые отличия в воздействии полиаминов на экспрессию soxS, по-видимому, связаны с особенностями их молекулярной структуры Расположение положительно заряженных аминогрупп спермидина и путресцина оптимально для взаимодействия с отрицательными зарядами на ДНК (Abraham, Pihl, 1981), а кадаверин известен как эффективный регулятор работы пориновых каналов внешней мембраны (Samartzidou, Delcour, 1999)

Двойственный характер влияния полиаминов на экспрессию soxS, по-видимому, обусловлен двумя функциями, выполняемыми данными соединениями в процессе адаптации клеток Е coli к супероксидному стрессу, преобладание которых зависит от силы стрессорных воздействий В условиях слабого стресса антиоксидантные функции полиаминов способствуют снятию стресса и снижению уровня генной экспрессии, тогда как при сильных стрессорных воздействиях преобладают свойства этих соединений как положительных транскрипционных модуляторов

Время, мин Время, мин

Рис 7 Влияние полиаминов Е. coli на экспрессию soxS в условиях слабого (А) и сильного (В) супероксидного стресса.

1- в контрольной культуре в отсутствие стресса, 2 — в культуре, подвергнутой стрессу, в присутствии 2мМ спермидина, 3 - в присутствии 5мМ кадаверина, 4- в культуре без добавок Стрелкой показан момент внесения параквата *- р<0,05 относительно экспрессии soxS в отсутствие полиаминов (4)

Подтверждение данного предположения было получено в экспериментах с использованием ингибитора орнитиндекарбоксилазы, ДАБ При этом дефицит полиаминов в условиях слабого стресса приводил к 1520%- ному возрастанию экспрессии soxS, а при сильном стрессе вызывал

приблизительно 20%- ное снижение ее уровня.

Исследование индукции генов-мишеней soxRS регулона при сильном стрессе также показало ее возрастание в присутствии путресцина (рис. 8). Незначительная стимуляция (40-50%) soáÁ, кодирующего Мп-супероксиддисмутазу, по- видимому, связана с изначально высоким уровнем экспрессии данного гена, что обусловлено постоянным образованием супероксида в клетке. Максимальный эффект (120-130%) путресцип оказывал на экспрессию nfo и fpr, кодирующих, соответственно, фермент репарации ДНК эвдоиуклеазу IV и ферредоксинредуктазу, которая позволяет поддерживать восстановленное состояние Fe-S кластеров ферментов (Hidalgo, Demple 1996). Промежуточный эффект (60-70%) путресцина наблюдался в отношении fumC, кодирующего устойчивый к действию супероксида изофермент фумаразы, и micF, продукт которого участвует в регуляции работы пориновых каналов. Стимулирующее влияние данного поляамина на экспрессию генов-мишеней soxRS регулона может быть как прямым, так и опосредованным, через его действие на экспрессию soxS.

Рис. 8. Влияние путресцина на индукцию генов- мишеней soxRS регулона E.coli в условиях сильного супероксидною стресса.

1 - уровень индукции гена в отсутствие путресцина; 1 - ь присутствии 5мМ путресцина; 3 - степень стимуляции уровня индукции путресцином. Уровень индукции - отношение максимальной величины генной экспрессии при окислительном стрессе к уровню экспрессии в отсутствие стресса. *- р<0,05 относительно индукции в отсутствие путресцина (1).

НО

1 23 123 1 23 1 2 3 1 23 обозначен.« N90S6 N9212 N9211 N9213 N9210 штамма sodA micF fiimC nfo fpr ген

Таким образом, в адаптации клеток Е coli к супероксидному стрессу полиамины выполняют двойную функцию В условиях слабого стресса они функционируют как «ловушки» активных форм кислорода, уменьшая силу стрессового воздействия и, соответственно, адаптивный ответ клетки В условиях сильного стресса данные соединения выступают в качестве положительных транскрипционных модуляторов генов soxRS регулона

Исследование роли полиаминов как топологических модуляторов ДНК в регуляции уровня экспрессии генов soxRS регулона. Известно, что уровень генной экспрессии зависит от топологического состояния ДНК, которое определяется совокупным действием различных факторов (Heon et al, 2003) Одними из таких факторов, как известно, являются полиамины (Bloomfield, 1996, Ткаченко и др, 1999, 2001) Показанное нами возрастание их количества в клетках при супероксидном стрессе (см рис 1, 2) послужило основанием для исследования роли основного полиамина Е coli путресцина в регуляции топологического состояния ДНК в условиях супероксидного стресса

Исследования показали, что топологические изменения ДНК при действии супероксидного стресса носят фазовый характер (рис 9) Первая фаза характеризуется резким сдвигом количественного распределения топоизомеров в сторону меньших значений Lk, отражающим падение отрицательной суперспирализации ДНК как следствие разрыва полинуклеотидных цепей и релаксации в результате повреждения АФК Период релаксации сменялся возрастанием суперспирализации ДНК, что, по-видимому, обусловлено включением репарационных систем клетки (Urios et al, 1990), создающих предпосылки не только к возвращению, но и превышению предстрессового уровня суперспирализации Влияние путресцина на топологию ДНК в первой фазе окислительного стресса выражалось в значительном (30%) снижении степени релаксации (рис 9), что хорошо согласуется с его ДНК-протекторным действием, за счет компактизации молекулы ДНК (Douki et al, 2000) Другим возможным механизмом защиты может быть, описанное для спермина, улавливание свободных гидроксильных радикалов (На et al, 1998) «Тушение» супероксидных радикалов (см рис 3, 4) может оказывать протекторное действие на Fe-S кластеры ферментов, снижая содержание в клетке свободного двухвалентного железа как источник электронов в реакции

образования гидроксильныХ радикалов (Störs et al., 1999). Кроме того, известно, что пугресцин способен ингибировать активность р ел актирующего фермента топоизомёразы I (Basu et al., 1997). Разнообразие возможных механизмов воздействия полиаминов на топологию ДИК способствует более быстрому возрастанию суперспирализации ДНК и более высокому ее конечному уровню. Полученные данные хорошо согласуются со стимулирующим эффектом путресципа па экспрессию генов soxRS регулона (см. рис. 6, 8) что указывает на взаимосвязь этих явлений и возможность опосредованного влияния данного полиамина на индукцию генов через топологию ДНК,

В отсутствие В присутствии путресципа 5мМ путрссцина 123456 123456

1 ..

Ii1 tf-

ж-

л I 0 60 120 180 240 300

Щ PVW -I'k=13 Время, чин

Рис. 9 Влияние путресципа на топологии ДНК В. coli N9211 (pBR322) при супероксидном стрессе. А-э д сктр оф о ре гра м м а плазмидной ДНК; В-графнческое изображение.

1 - в присутствии 5мМ путресципа; 2 - в отсутствие путресципа. Номерами обозначены пробы ДНК на электрофореграмме и рассчитанные на их основе значения Lk, отложенные в виде точек на кривой. Стрелкой обозначен момент внесения параквата.

Подтверждение данноого предположения было получено нами в экспериментах с использованием ингибитора ДНК-гиразы, фермента, ответственного за образование супервитков на ДНК. Добавка ингибитора, налидиксовой кислоты, в культуру Е. coli, подвергнутую супероксидному стрессу, сопровождалась двукратным снижением экспрессии soxS (рис. 10). Внесение в среду путрссцина не только восстанавливало контрольный уровень экспрессии культуры, но и приводило к 50% его стимуляции (рис. 10).

Показано (цит. Hatfield, Benham, 2003), что максимальная активность промоторов, у которых расстояние между -10 и -35 последовательностями больше 17 пар оснований, проявляется в условиях высокого уровня суперспирализации ДНК Установлено (Ding et al, 1996), что длина спейсера в soxS промоторе составляет 19 пар оснований, что обусловливает возрастание его экспрессии при высоких значениях суперспирализации ДНК. Это предположение подтверждает результаты наших экспериментов В данном случае путресцин, действуя как антагонист налидиксовой кислоты, повышал уровень суперспирализации ДНК, что способствовало возрастанию экспрессии soxS Повышенный уровень суперспирализации ДНК во второй фазе супероксидного стресса (см рис 9), по-видимому, является необходимым условием для максимальной экспрессии гена транскрипционного активатора soxS, а также генов-мишеней soxRS регулона

со

н о о Я а

1800 1600 1400 1200

Л 1000 J 800

w 600

400 200 0

30 60 90

120 150 180 Время, мин

Рис 10 Влияние налидиксовой кислоты на экспрессию soxS в культуре Е. coli ЕН40 при супероксидном стрессе.

1 - экспрессия soxS в присутствии 70мкг/мл налидиксовой кислоты, 2 - в отсутствие добавок, 3 - в присутствии 70мкг/мл налидиксовой кислоты и ЮмМ путресцина Стрелкой обозначен момент внесения параквата *- р<0,05 относительно экспрессии soxS в отсутствие добавок (2)

Известно (Nunoshiba et al, 1999), что повреждения ДНК сопровождаются

возрастанием частоты мутаций Наличие у путресцина ДНК-протекторных

свойств (Douki et al, 2000) позволили предположить его способность снижать

частоту мутаций Полученные нами результаты подтвердили наличие у путресцина антимутагенных свойств, показав, что в присутствии этого диамина мутационные изменения в клетках Е coli при супероксидном стрессе сведены к минимуму (рис 11) Наблюдаемый эффект путресцина, по-видимому, является следствием как его ДНК-протекторного действия, так и значительной стимуляции гена п/о, кодирующего эндонуклеазу IV (см рис 8)

Рис. 11 Влияние путресцина на частоту мутаций при супероксидном стрессе.

1 - в отсутствие путресцина, 2 - в присутствии 5мМ путресцина Стрелкой обозначен момент внесения параквата

Таким образом, в условиях супероксидного стресса путресцин участвует

в регуляции топологии ДНК, оказывая положительное влияние на экспрессию

адаптивных генов, и способен снижать частоту мутаций в клетках Е cok

Изучение влияния полиаминов на активность адаптивных

ферментов в условиях супероксидного стресса. В процессе адаптации

происходит усиленный синтез специфических белков, контроль которого

осуществляется, в основном, на уровне генной экспрессии Поэтому в

качестве альтернативного подхода к изучению участия полиаминов в

регуляции генной экспрессии нами было исследовано влияние путресцина на

содержание в клетках генных продуктов, которое оценивали по активности

адаптивных ферментов в экстракте клеток, выращенных в соответствующих

условиях

0,54

ОТ

0,24

О 60 120 180 240 300 360

Время, мин

Продуктом fumC является изофермент цикла Кребса фумаразаС (FumC) Данный фермент, в отличие от других его изоформ, не инактивируется супероксидными радикалами, поскольку не содержит Fe-S- кластеров, что позволяет клетке поддерживать нормальный уровень метаболизма в условиях стресса ( Storz et al, 1999)

Результаты проведенных экспериментов показали, что эффект путресцина на активность FumC (рис 12) аналогичен его влиянию на экспрессию soxS (рис 6) Некоторое снижение активности FumC в клетках Е coli в присутствии путресцина при слабом стрессе является результатом ослабления стрессового воздействия за счет улавливания АФК путресцином и, как следствие, ослабления экспрессии soxS В то же время, стимулирование путресцином экспрессии как soxS, так и fumC, и возрастание количества FumC в его присутствии, при сильном стрессе, доказывают наличие у полиаминов свойств положительных транскрипционных модуляторов экспрессии, преобладающих в этих условиях.

0 06i

слабый стресс сильный стресс

Рис 12 Влияние путресцина на активность фумаразы С в клетках Е. coli ЕН40 в зависимости от силы супероксидного стресса.

1 - активность фермента в отсутствие стресса, 2 - в условиях стресса без путресцина; 3 - в присутствии 5мМ путресцина Представленные данные соответствуют 2 часам после индукции супероксидного стресса *- р<0,05 относительно активности в отсутствие путресцина (2)

Стимуляция путресцином на 15-20% ферментативной активности была также показана нами в отношении глюкозо- 6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ), кодируемой геном zwf (Sigler et al, 1999) Продукт данного фермента, NADPH, является источником электронов для антиоксидантных

систем клетки при действии супероксидного стресса

Влияние путресцина на генную экспрессию через топологию ДНК подтверждено также на уровне генных продуктов Было показано, что добавка налидиксовой кислоты снижает активность Г6ФДГ и FumC (в среднем на 30% и 60 % соответственно), а путресцин способствует возрастанию активности данных ферментов в клетках Е coli

Скорость синтеза и количество стрессовых белков в клетке являются определяющими факторами выживания микроорганизмов в экстремальных условиях Позитивный эффект путресцина на активность адаптивных ферментов предполагает его положительное влияния на содержание жизнеспособных клеток в культуре Е coli, подвергнутой супероксидному стрессу

Результаты экспериментов показали, что добавка ингибитора орнитиндекарбоксилазы (ДАБ) вызывала 45-50%-ное снижение численности живых клеток в культуре Е coli, подвергнутой стрессу (рис 13), а внесение путресцина повышало выживаемость клеток, что является следствием его положительного влияния на генную экспрессию и активность адаптивных ферментов

300

Рис 13 Влияние путресцина на количество жизнеспособных клеток в культуре Е. соИ ЕН40 в условиях супероксидного стресса.

1 - культура без добавок, 2 - в присутствии ДАБ (0,3 мг/мл), 3 - в присутствии ДАБ (0,3 мг/мл) и ЮмМ путресцина. Представленные данные соответствуют 3 часам после индукции супероксидного стресса *- р<0,05 относительно культуры без добавок (1), **- р<0,05 относительно культуры с добавкой ДАБ (2)

Таким образом, в условиях сильного супероксидного стресса функционирование полиаминов как транскрипционных активаторов и модуляторов топологического состояния ДНК ведет к возрастанию в клетках количества ферментов антиоксидантной защиты, в частности Г6ФДГ и фумаразы С, и повышению жизнеспособности микроорганизмов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования показали, что полиамины играют значительную роль в защите клеток Ecoli от действия супероксидных радикалов Возрастание количества этих соединений в клетках в условиях супероксидного стресса имеет важное адаптивное значение. Совместно с другими антиоксидантными системами полиамины участвуют в нейтрализации супероксидных радикалов в клетке, что в условиях слабых стрессовых воздействий ослабляет действие стресса и, соответственно, уменьшает адаптивный отклик клетки со стороны антиоксидантных генов В условиях интенсивного образования супероксидных радикалов полиамины преимущественно выполняют функции положительных транскрипционных модуляторов экспрессии генов soxRS регулона Стабилизация полиаминами топологического состояния ДНК оказывает положительный эффект на экспрессию адаптивных генов, а также снижает частоту мутаций В результате в клетках возрастает активность адаптивных ферментов, что усиливает защитный потенциал клеток и повышает количество живых клеток в культурах Е coli, подвергнутых воздействию супероксидного стресса

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в ответ на супероксидный стресс в клетках Е coli значительно индуцируется активность ключевых ферментов синтеза полиаминов, следствием чего является возрастание внутриклеточного пула этих соединений

2 Обнаружено, что в защите Е coli от супероксидного стресса полиамины выполняют две функции, нейтрализаторов супероксидных радикалов и положительных транскрипционных модуляторов, преобладание которых зависит от силы стрессорных воздействий

3 Установлено, что одним из механизмов положительного влияния полиаминов на генную экспрессию является их модулирующая активность в отношении топологических свойств ДНК Посредством стимуляции отрицательной суперспирализации, полиамины усиливают промоторную активность адаптивных генов

4 Выявлено, что протекторное действие путресцина в отношении ДНК способствует снижению частоты мутаций в клетках Ecoli, подвергнутых супероксидному стрессу

5 Показано, что функционирование полиаминов как положительных транскрипционных и топологических модуляторов экспрессии генов soxRS регулона в условиях сильного стресса способствует возрастанию в клетках активности адаптивных ферментов и повышению жизнеспособности клеток Е coli

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Ткаченко А Г , Пшеничнов М Р , Нестерова JIЮ , Федотова М В Структурно- функциональные свойства ДНК как объект защитных функций путресцина в адаптации Escherichia coli к окислительному стрессу//В кн Проблемы загрязнения окружающей среды Тез докл Междунар конф -Пермь,2001 -С 99

2 Нестерова J1Ю , Федотова М В , Ткаченко А Г Путресцин как регулятор экспрессии генов oxyR регулона Escherichia coli при окислительном стрессе//В кн Биология - наука XXI века Тез докл 6-й Пущинской школы-конф мол ученых - Тула, 2002 - Т 1 - С 290

3 Федотова М В Роль путресцина в регуляции экспрессии генов soxRS регулона и количества (активности) их продуктов в клетках Escherichia coli при супероксидном стрессе //В кн Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии - Пермь, 2004 - С 38-47

4 Федотова М В Снижение уровня полиаминов в клетках Escherichia coli как фактор индукции супероксидного стресса//В кн Биология - наука XXI века Устн докл 9-й Пущинской школы-конф мол ученых - Пущино, 2005 -С 101

5 Федотова М В, Ткаченко А Г Механизмы защитных функций полиаминов Escherichia coli при супероксидном стрессе//В кн Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал Тез докл Междунар конф - Пермь, 2005 - С 103

6 Ткаченко А Г, Федотова М В Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от стрессорных воздействий супероксидных радикалов/ЛБиохимия -2007 -Т 72, вып 1 -С 128-136

Подписано в печать 27.04.2007. Тираж 110 экз Формат 90X60/16. Усл. печ. л. 1,5 Бумага ВХИ Набор компьютерный Заказ № 263-к/2007

Издательский дом "Пресстайм" Адрес: 614025, г Пермь, ул. Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федотова, Марина Валентиновна

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Механизмы образования активных форм кислорода и их токсическое действие на основные компоненты клетки.

1.1.1. Пути образования и характеристика АФК.

1.1.2. Повреждающее действие АФК на компоненты клетки.

1.2. Механизмы адаптивного ответа микроорганизмов на окислительный стресс.

1.2.1. Общие регуляторные механизмы адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям.

1.2.2. Регулоны защиты микроорганизмов от действия окислительного стресса.

1.2.3. Механизмы защиты микроорганизмов от действия АФК.

1.3. Полиамины и их физиологическая роль.

1.3.1. Пути биосинтеза полиаминов.

1.3.2. Влияние полиаминов на процессы жизнедеятельности клетки.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования и условия культивирования.

2.2. Определение активности Р-галактозидазы.

2.3. Выделение плазмидной ДНК из клеток Escherichia coli.

2.4. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК.

2.5. Определение степени суперспирализации ДНК.

2.6. Определение содержания полиаминов в клетках.

2.7. Определение активности ферментов синтеза полиаминов.

2.8. Определение содержания свободных радикалов кислорода в клетках Е. coli.

2.9. Определение активности глюкозо-6 фосфат дегидрогеназы.

2.10. Определение активности фумаразы.

2.11. Определение содержания белка.

2.12. Определение антиоксидантных свойств полиаминов in vitro.

2.13. Определение частоты мутаций.

2.14. Подсчет числа живых клеток.

2.15. Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 3. Полиамины как регуляторы количества свободных радикалов кислорода в клетках Escherichia coli.

3.1. Влияние супероксидного стресса на активность ключевых ферментов синтеза полиаминов.

3.2. Антиоксидантные свойства полиаминов in vitro.

3.3. Антиоксидантные функции полиаминов in vivo.

ГЛАВА 4. Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов soxRS регулона Escherichia coli.

4.1. Влияние полиаминов на экспрессию гена soxS в условиях супероксидного стресса.

4.2. Влияние пониженного содержания полиаминов в клетке на уровень экспрессии soxS в условиях супероксидного стресса.

4.3. Функции полиаминов как положительных транскрипционных модулятров экспрессии генов-мишеней SoxS.

ГЛАВА 5. Роль полиаминов как топологических модуляторов ДНК в регуляции уровня экспрессии генов soxRS регулона.

5.1. Влияние путресцина на топологию ДНК в условиях супероксидного стресса.

5.2. Роль путресцина как топологического модулятора в регуляции генной экспрессии.

5.3. Влияние путресцина на частоту мутаций при супероксидном стрессе

ГЛАВА 6. Влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов в клетках Escherichia coli.

ГЛАВА 7. Обсуждение результатов.

7.1. Полиамины как регуляторы количества свободных радикалов кислорода в клетках Escherichia coli.

7.2 Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов soxRS регулона Escherichia coli.

7.3. Роль полиаминов как топологических модуляторов ДНК в регуляции уровня экспрессии генов soxRS регулона.

7.4. Влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов в клетках Escherichia coli.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу"

Актуальность проблемы. В течение последнего десятилетие проблема окислительного стресса привлекает все большее внимание как со стороны исследователей в области фундаментальных биологических наук, так и со стороны специалистов практической медицины. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что окислительный стресс является непосредственной причиной возникновения различных болезней человека, в том числе злокачественных новообразований, а также процессов старения организма (Атеэ е( а.1, 1993). Общность основных механизмов защиты клеток про- и эукариот от окислительного стресса делает актуальным использование микроорганизмов в качестве модели для изучения повреждающего эффекта активных форм кислорода (АФК) на клетку, а также защитных механизмов клетки от этих повреждений (81§1ег а\., 1999). В то же время, изучение специфичности адаптивных реакций прокариотических клеток к действию окислительного стресса может способствовать решению проблемы лечения бактериальных инфекций (Островский Д.Н., 1997), поскольку продукция АФК фагоцитами является важным защитным механизмом, лежащим в основе неспецифического иммунитета ^огг, 1ш1ау, 1999). Кроме того, механизм действия некоторых антибиотиков основан на индукции окислительного стресса (Ооздуагш а\., 2006).

В настоящее время интенсивные исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении - генов и белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к окислительному стрессу (а Оешр1е, 1999). В то же время малоизученным остается вопрос о роли метаболических факторов, которые, как известно, принимают активное участие в адаптивных реакциях клеток на стресс, обеспечивая наиболее адекватное и экономичное приспособление клетки к условиям среды (HengeAronis ей., 1996). Среди таких факторов особый интерес представляют биогенные полиамины, поликатионная природа которых обусловливает возможность их взаимодействия с отрицательно заряженными группами биополимеров клетки (Igarashi et al., 2000). Результатом таких взаимодействий является значительное влияние полиаминов на клеточные процессы как про-так и эукариот, что дает основание рассматривать их как универсальные клеточные регуляторы (Tabor et al, 1985). В последнее время появляется все больше сведений о существенной роли этих соединений в адаптации микроорганизмов к различным видам стресса (Ткаченко и др., 1997, 1998). В том числе имеется ряд публикаций о возможном участии полиаминов в защите клеток от действия АФК (Chattopadhyay et al, 2003; Jung et al, 2003). Однако в литературе лишь немногочисленные работы посвящены исследованию механизмов протекторного действия этих соединений. К их числу относятся статьи, посвященные изучению роли полиаминов в адаптации Е. coli к действию перекиси водорода (Ткаченко и др., 2001, 2003). В то же время в литературе практически отсутствуют данные о механизмах защитного действия полиаминов при окислительном стрессе, вызванном супероксидными радикалами.

Цель настоящей работы - выяснение роли полиаминов в адаптации Е. coli к условиям супероксидного стресса, индуцированного паракватом.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать активность ферментов системы синтеза полиаминов в условиях супероксидного стресса.

2. Изучить антиоксидантные свойства полиаминов и их роль в защите клеток от действия супероксидных радикалов.

3. Выяснить характер и механизмы влияния полиаминов на экспрессию генов soxRS регулона.

4. Проследить топологические перестройки молекулы ДНК при супероксидном стрессе и оценить действие полиаминов на топологию ДНК в данных условиях.

5. Изучить влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов, частоту мутаций и количество жизнеспособных клеток в культурах Е. coli, подвергнутых супероксидному стрессу.

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, что в ответ на супероксидный стресс в клетках Е. coli происходит возрастание активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и их конечных продуктов.Впервые показана способность полиаминов нейтрализовать супероксидные радикалы in vitro в системе феназинметосульфат-NADH, а также их участие в поддержании гомеостатического уровня супероксидных радикалов в клетках Е. coli. Выявлена роль полиаминов как положительных транскрипционных модуляторов экспрессии генов soxRS регулона. Установлена роль путресцина как модулятора топологического состояния в транскрипционной регуляции генов soxRS регулона. Впервые описана зависимость характера защитных функций полиаминов от силы стрессорных воздействий. Обнаружен положительный эффект путресцина на активность адаптивных ферментов в клетках Е. coli в условиях сильного стресса.

Полученные результаты расширяют представления о механизмах, лежащих в основе защитных функций полиаминов от действия активных форм кислорода.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В ответ на супероксидный стресс в клетках Е. coli индуцируется активность ферментов синтеза полиаминов, продукты которых, функционируют как антиоксиданты, нейтрализующие супероксидные радикалы.

2. В адаптации Е. coli к супероксидному стрессу полиамины выполняют две функции: нейтрализаторов супероксидных радикалов и положительных модуляторов генной экспрессии. Преобладание той или иной функции определяется силой стрессорного воздействия.

3. В условиях супероксидного стресса полиамины участвуют в регуляции топологического состояния ДНК. Модулирующая активность путресцина в отношении топологии ДНК оказывает положительное влияние на экспрессию генов soxRS регулона.

4. Функционирование полиаминов как положительных транскрипционных модуляторов генов soxRS регулона способствует возрастанию в клетках Е. coli активности адаптивных ферментов и повышению жизнеспособности клеток.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Федотова, Марина Валентиновна

выводы

1. Показано, что в ответ на супероксидный стресс в клетках Е.соИ значительно индуцируется активность ключевых ферментов синтеза полиаминов, следствием чего является возрастание внутриклеточного пула этих соединений.

2. Обнаружено, что в защите клеток Е.соИ от супероксидного стресса полиамины выполняют две функции, нейтрализаторов супероксидных радикалов и положительных транскрипционных модуляторов, преобладание которых зависит от силы стрессорных воздействий.

3. Установлено, что одним из механизмов положительного влияния полиаминов на генную экспрессию является их модулирующая активность в отношении топологических свойств ДНК. Посредством стимуляции отрицательной суперспирализации полиамины усиливают промоторную активность адаптивных генов.

4. Выявлено, что протекторное действие путресцина в отношении ДНК способствуют снижению частоты мутаций в клетках Е.соИ, подвергнутых супероксидному стрессу.

5. Показано, что функционирование полиаминов как положительных транскрипционных и топологических модуляторов экспрессии генов зохЯЗ регулона в условиях сильного стресса способствуют возрастанию в клетках активности адаптивных ферментов и повышению жизнеспособности клеток Е.соИ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В условиях супероксидного стресса наблюдается значительная индукция активности ферментов синтеза полиаминов, в результате чего повышается количество данных соединений в клетках E.coli. Это является одним из признаков участия полиаминов в адаптации E.coli к супероксидному стрессу.

В экспериментах in vitro показана способность полиаминов ингибировать реакцию восстановления тетразолия, препятствуя переносу электронов от супероксидного аниона на тетразолий, что доказывает наличие у этих соединений способности нейтрализовать свободные радикалы супероксида. Наиболее выраженными антиоксидантными свойствами обладает спермидин, тогда как путресцин и кадаверин имеют одинаковые более низкие антиоксидантные возможности.

В условиях нормального аэробного роста добавка ингибитора орнитиндекарбоксилазы к клеткам E.coli вызывает возрастание экспрессии soxS. Величина индукции данного гена обратно пропорциональна количеству полиаминов в клетках E.coli. В условиях дефицита полиаминов, в результате действия ингибитора, в клетках обнаруживается повышенное содержание активных форм кислорода. В совокупности полученные данные свидетельствуют об участии полиаминов в регуляции количества супероксидных радикалов в клетках E.coli в условиях аэробного роста.

В условиях супероксидного стресса полиамины оказывают влияние на уровень экспрессии гена транскрипционного активатора soxS, характер которого зависит от силы стрессового воздействия. При слабом стрессе данные соединения понижают уровень экспрессии soxS в результате их аниоксидантного действия. При интенсивном образовании супероксидных радикалов путресцин и спермидин стимулируют экспрессию, а кадаверин не оказывает существенного влияния на экспрессию soxS. Противоположный характер действия полиаминов на экспрессию soxS в зависимости от силы стрессорных воздействий, обусловлен двойственностью функций полиаминов. В условиях слабого стресса они функционируют преимущественно как ловушки супероксидных радикалов, тогда как при умеренном и, в особенности, при сильном стрессовом воздействии, преобладающими становятся их функции как положительных транскрипционных модуляторов экспрессии. Данное положение подтверждают эксперименты с использованием ингибитора орнитиндекарбоксилазы.

В условиях сильного супероксидного стресса путресцин стимулирует экспрессию генов- мишеней яохЯЗ регулона. Дифференцированное влияние путресцина как транскрипционного активатора на гены-мишени свидетельствуют об участии полиаминов в тонкой настройке стрессового ответа клетки на генетическом уровне.

При действии супероксидного стресса наблюдаются двухфазные изменения топологии ДНК. В первой фазе имеет место релаксация ДНК, вторая характеризуется возвратом исходных значений суперскрученности и их значительным превышением. В топологических перестройках ДНК принимают участие полиамины, в частности путресцин, который, во-первых, снижает падение суперспирализации в фазу релаксации, во-вторых, играет роль положительного модулятора топологии ДНК во второй фазе стресса.

Установлена прямая зависимость между уровнем суперспирализации молекулы ДНК и экспрессией гена/итС, что говорит о значительном влиянии топологического состояния ДНК на уровень экспрессии адаптивных генов. Топологическая активность путресцина в этих условиях реализуется в более быстром возрастании экспрессии и более высоком ее уровне. Влияние полиаминов на уровень генной экспрессии посредством топологической активности подтверждается экспериментами с использованием ингибитора ДНК-гиразы, присутствие которого значительно снижает экспрессию яохБ .В этих условиях путресцин, повышая уровень суперспирализации ДНК, стимулирует экспрессию гена.

Протекторные свойства путресцина в отношении ДНК способствуют снижению частоты мутаций в клетках Е.соИ, подверженных супероксидному стрессу.

Влияние полиаминов на уровень экспрессии адаптивных генов сказывается на содержании в клетках соответствующих генных продуктов. В условиях слабого стресса функционирование полиаминов как ловушки супероксидных радикалов, сообразно их влиянию на экспрессию soxS„ вызывает снижение активности адаптивных ферментов, в частности FumC. В условиях сильного стресса, функции этих соединений как положительных транскрипционных модуляторов экспрессии генов soxRS регулона способствуют возрастанию активности адаптивных ферментов (Г6ФДГ и FumC).

Влияние путресцина на активность адаптивных ферментов в условиях ингибирования ДНК- гиразы при супероксидном стрессе является следствием его влияния на генную экспрессию в данных условиях, что подтверждает регуляторное действие полиаминов на генную экспрессию посредством изменения топологии ДНК.

Результатом участия полиаминов в адаптации клеток E.coli к супероксидному стрессу является возрастание количества жизнеспособных микроорганизмов в культурах, подвергнутых стрессу.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что полиамины играют значительную роль в защите клеток E.coli от воздействия супероксидных радикалов. Возрастание количества этих соединений в клетках при действии стресса имеет важное адаптивное значение. Нейтрализуя супероксидные радикалы, полиамины снижают их содержание в клетках, что в условиях слабых стрессовых воздействий практически снимает действие стресса и, соответственно, уменьшает адаптивный отклик клетки. В условиях интенсивного образования супероксидных радикалов полиамины преимущественно выполняют функции положительных транскрипционных модуляторов экспрессии генов soxRS регулона. Стабилизация полиаминами топологического состояния ДНК также оказывает положительный эффект на экспрессию адаптивных генов, а также снижает частоту мутаций. В результате в клетках возрастает активность адаптивных ферментов, что усиливает защитный потенциал клеток и повышает количество живых микроорганизмов в культурах Е.соИ, подвергнутых воздействию супероксидного стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федотова, Марина Валентиновна, Пермь

1. Грагеров А.И. Влияние сверхспирализации ДНК на основные генетические процессы у прокариот / А.И. Грагеров, С.М. Миркин//Мол. Биол.- 1980.-Т. 14.-С. 8-34.

2. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак//Биохимия. 2001. - Т. 66. - N. 5. - С. 592-609.

3. Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сембрук/ТМосква: Мир, 1984. С. 157-175.

4. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Д. Перт. Москва: Мир, 1978. - С. 930.

5. Островский Д. Н. Третья линия обороны / Д. Н. Островский//Химия и жизнь XXI век. - 1997. - N. 5. - С. 35-46.

6. Ткаченко А.Г. Роль внутриклеточного пула полиаминов в регуляции конструктивного обмена Escherichia coli в процессе аэробно-анаэробных переходов / А.Г. Ткаченко, А.А. Чудинов, Н.С. Чурилова//Микробиология. 1989. - Т. 58. - N 5. - С. 709-715.

7. Ткаченко А.Г. Обмен путресцина и калия между клеткой и средой как фактор адаптации Eschirichia coli к гиперосмотическому шоку / А.Г. Ткаченко, О.Я. Салахетдинова, М.Р. Пшеничнов//Микробиология. -1997.-Т. 4.-N.3.-C. 329-334.

8. Ткаченко А.Г. Путресцин как фактор защиты Escherichia coli от окислительного стресса / А.Г. Ткаченко, М.Р. Пшеничнов, Л.Ю. Нестерова// Микробиология. 2001. - Т. 70. - N. 4. - С. 487-494.

9. Ткаченко А.Г. Полиамины как модуляторы экспрессии генов окислительного стресса у Escherichia coli / А.Г. Ткаченко, Л.Ю. Нестерова// Биохимия. 2003. - Т. 68. - вып. 8 - С. 1040-1048.

10. Харди К.Дж. Выделение бактериальных плазмид//Плазмиды. Методы / К.Дж. Харди. Москва: Мир, 1989. - С. 11-18.

11. Чудинов A.A. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале / A.A. Чудинов., Л.А. Чудинова, В.П. Коробов//Вопросы мед. химии. 1984. - Т. 30. - N 4. - С. 127132.

12. Abraham К.A. Role of polyamines in macromolecular synthesis / K.A. Abraham., A. Pihl//Trends Biochem Sei. -1981. P. 106-107.

13. Adhya S. The lac and gal operons today//Regulation of gene expression in Escherichia coli / S. Adhya//ed. by E.C.C. Lin and A.S. Linch, R.G. Landes Company. 1996. - P. 181-200.

14. Almeida C.E.B. Copper ions mediate the lethality induced by hydrogen peroxide in low iron conditions in Escherichia coli / C.E.B. Almeida., R.S. Galhardo, D.L. Felicio, et al.//Mutation research. 2000. - V. 460. - P. 61-67.

15. Altuvia S. A small, stable RNA induced by oxidative stress: role as a pleotropic regulator and antimutator / S. Altuvia, D. Weinstein-Finkel, A. Zhang, et al.//Cell. 1997. - V. 90. - P. 43-53.

16. Amabile-Cuevas C.F. Molecular characterization of the ¿mRS genes of Escherichia coli: two genes control a superoxide stress regulon / C.F. Amabile-Cuevas, B. Demple//Nucleid. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 4479-4484.

17. Ames B.N. Oxidants, antioxidants and degenerative disease of aging / B.N. Ames, M.K. Shigenaga, T.M. Hagen//Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1993. -V. 90.-P. 7915-7922.

18. Ames B.M. Oxidants are the major contributor to aging / B.N. Ames, M.K. Shigenaga//Ann. New York Acad. Sei. 1992. - V. 663. - P. 85-96.

19. Andrews S.C. Bacterial iron homeostasis / S.C. Andrews, A.K. Robinson, F. Rodriguez-Quinones//FEMS Microbiology Reviews. 2003. - V. 27. -P. 215-237.

20. Applebaum D. M. Comparison of the biosynthetic and biodegradative ornithine decarboxylases of Escherichia coli / D. M. Applebaum, J. C. Dunlap, D. R. Morris//Biochemistry 1977. - V. 16. - P. 1580-1584.

21. Arfin S.M. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12 / S.M. Arfin, A.D. Long, E.T. Ito, et al.//J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - N. 38. -P. 29672-29684.

22. Asad L.M.B.O. Role of SOS and OxyR systems in the repair of Escherichia coli submitted to hydrogen peroxide under low iron condition / L.M.B.O. Asad, N.R. Asad, A.B. Silva//Biochemie. 1997. - V. 79. - P. 359-364.

23. Bachrach U. Function of naturally occurring polyamines / U. Bachrach//Academic N.Y. 1973.

24. Bahloul A. Role of Escherichia coli histone-like protein HU in DNA replication: HU-beta suppresses the termosensitivity of dnaA46ts / A. Bahloul, F. Boubrik, J. Rouviere-Yaniv//Biochemie. 2001.- V. 83. - P. 219-229.

25. Barr D.P. ESR spin trapping of a protein-derived tyrosyl radicalfrom the reaction cytochrome c with hydrogen peroxide / D.P. Barr, M.R. Gunther, LJ. Deterling, et al.//J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 15498-15505.

26. Basu A.K. Genetic effects of thymine glycols: site specific mutagenesis and molecular modeling studies / A.K. Basu, E.L. Loechler, L.A. Leadon, et al.//J. Biol. Chem. 1989. - V. 86. - P. 7677-7681.

27. Beinert H. Fe-S protein in sensing and regulatory function / H. Beinert, P.J. Kiley//Current Opinion in Microbiol. 1999. - V. 3. - P. 152-157.

28. Benov L.T. Escherichia coli expresses a copper- and zinc-containing superoxide dismutase / L.T. Benov, I. Fridovich//J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. -P. 25310-25314.

29. Benov L. Induction of the sox RS regulon of Escherichia coli by glycolaldehyde / L.T. Benov, I.Fridovich//Archives of Biochemistry and Biophisics. 2002. - V. 407. - P. 45-47.

30. Bloomfield U.A. R.W. Wilson Interaction of polyamines with polynucleotides / U.A. Bloomfield, R.W. Wilson//Polyamines in biology and medicine. Eds. Morris D.R., Marton L.J., N.Y.: Marcel Dekker Inc., 1987. - P. 183-206.

31. Bloomfield V.A. DNA condensation / V.A. Bloomfield//Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. - V. 6. - P. 334-341.

32. Bowman W.H. Spermidine biosynthesis. Purification and properties of propilamine transferase from Escherichia coli / W.H. Bowman, H. Tabor//J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - N. 7. - P. 2480-2486.

33. Braun V. Iron uptake by Escherichia coli / V. Braun//Front Biosci. -2003.-V. 8.-P. 1409-1421.

34. Bryans M. Elevated cellular polyamine levels enhance promoter activity in vivo / M. Bryans, E. Harley, S.K. Gilmour//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 226. - P. 618-625.

35. Cadet J. Recent aspects of oxidative DNA damage: guanine lesions, measurement and substrate specificity of DNA Repair Glucosylases / J. Cadet., S. Bellon, M. Berger, et al.//Biol. Chem. 2002. - V.383. - P. 933-943.

36. Candeias L.P. Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophil-derived species superoxide anion and hipochlorous acid / L.P. Candeias, K.B. Patel, M.R.L. Stratford, et al//FEBS Lett. 1993. - V. 333. - P. 151-153.

37. Carlioz A. Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life? / A.Carlios, D. Touati//EMBO. 1986. - V. 5. - P. 623-630.

38. Champoux J.J. DNA topoisomerases: structure, function and mechanism / J.J. Champoux//ANNU Rev. Biochem. 2001. - V. 70. - P. 369-413.

39. Chattopadhyay M. K. Polyamines protect Escherichia coli cells from the toxic effect of oxygen / M. K. Chattopadhyay, C. W. Tabor, H. Tabor//Lab. Of Biochem. and Genet. 2003. - V. 100. -N.5. - P. 2261-2265.

40. Conter A. Role of DNA supercoiling and RpoS sigma factor in the osmotic and growth phase-dependent induction of the gene osmE of Escherichia coliK12 / A. Conter, C. Menchon, C. Gutierrez//J.Mol.Biol. 1997. - V.273. - N.l. -P. 75-83.

41. Cooke M. S. Oxidative DNA Damage: mechanisms, mutation and disease / M. S. Cooke, M. D. Evans, M. Dizdaroglu, J. Lunec//The FABES J. -2003.-V.17.-P. 1195-1214.

42. Davis R.H. Sequestered end products and enzyme regulation: the case of ornithine decarboxylase / R.H. Davis, D.R. Morris, P. Coffino//Microbiol. Rev. 1992. - V. 56. - P. 280-290.

43. Delkour A.H. Solute uptake through general porins / A.H. Delcour//Frontiers in Bioscience. 2003. - V. 8. - P. 1055-1071.

44. Devies M.J. Radical mediated Protein oxidation / M.J. Devies, R.T. Dean//Chemistry to medicine.-Oxford University Press. 1997.

45. Ding H. The redox state of the 2Fe-2S. clusters in SoxR protein regulates its activity as a transcription factor / H. Ding, E. Hidalgo, B. Demple//Biol. Chem. 1996. - V. 52. - P. 33173-33175.

46. Ding H. Thiol-mediated disassembly and reassembly of 2Fe-2S. clusters in the redox-regulated transcription factor SoxR. / H. Ding, B. Demple//Biochem. USA. 1998. - V. 37. - P. 17280-17286.

47. Douki T. Protection against radiation-induced degradation of DNA bases by polyamines / T. Douki, Y. Bretonniere, J. Cadet//Radiation Research. -2000.-V. 153.-P. 29-35.

48. Drlica K. Biology of bacterial deoxyribonucleic acid topoisomerases / K. Drlica/ZMicrobiological Reviews. 1984. - V. 48. - N. 4. - P. 273-289.

49. Dukan S. Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells / S. Dukan, T. Nyström//The Journal of Biological Chemistry. 1999.-V. 274. - N. 37. - P. 26027-26032.

50. Dukan S. Protein oxidation in response to increased transcriptional or translational errors / S. Dukan, A. Farewell, M. Ballesteros, F. Taddei, M. Radman, T. Nystrom//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. - V. 97. - P. 5746-5749

51. Eisenstark A. Role of Escherichia coli rpoS and associated genes in defense against oxidative damage / A. Eisenstark, M.J. Calcutt, M. Becker-Hapak, et al.//Free Rad. Biol. Med. 1996. - V. 21. - P. 975-993.p

52. Erickson J.W. Identification of the a subunit of Escherichia coli RNA polymerase: a second alternate a factor involved in high-temperature gene expression / J.W. Erikson, C.A. Gross//Genes Dev. 1989. - V. 3. - P. 1462-1471.

53. Escolar L. Opening the iron box: transcriptional Metalloregulation by the Fur protein / L. Escolar, J. Perez-Martin, V. de Lorenzo//J. Bacteriol. -1999.-P. 6223-6229.

54. Esposito D. Interactions with natural polyamines and thermal stability of DNA. A DSC study and a theoretical reconsideration / D. Esposito, P. Del Vecchio, G. Barone//J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 2606-2613.

55. Fabret C. Two-component signal tranduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world / C. Fabret, V.A. Feher, J.A. Hoch//J. Bacteriol. -1999.-P. 1975-1983.

56. Farr S.B. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella tiphimurium / S.B. Farr, T. Kogoma//Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. -P. 561-585.

57. Fischer D. The general stress sigma factor as of Escherichia coli is induced during diauxic shift from glucose to lactose / D. Fischer, A. Teich, P. Neubauer, et al.//J. Bacteriol. 1998 (Dec.). - V. 180. - N 3. - P. 6203-6206.

58. Flint D. The inactivation of Fe-S cluster containing hudro-lyases by superoxide / D. Flint, J. Tumminello, M. Emptage//J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 22369-22376.

59. Franc E. G. Targeting of the UmuD, UmuD and MucA mutagenesis proteins to DNA by RecA protein / E. G. Franc, J. Hauser, A.S. Levine, R. Woodgate//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. - V. 90. - P. 8169-8173.

60. Fridberg E.C. DNA repair of mutagenesis / E.S. Fridberg, G.C. Walker, W. Siede//ASM Press, Washington. 1995.

61. Friedman S. N. DNA supercoiling in a thermotolerant of Escherichia coli / S. N. Friedman, M. Malik, K. Drlica//Mol. Gen. Genet. 1995. - V. 248. - P. 417-422.

62. Fridovich I. The biology of oxygen radicals /1. Fridovich//Science. -1978.-V. 201.-P. 875-880.

63. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases / I. Fridovich//Ann. Rev. Biochem. 1995. - V. 64. - P. 97-112.

64. Gardner P. Superoxide sensitivity of the Escherichia coli aconitase f P. Gardner, I. Fridovich//J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 19328-19333.

65. Gaudu P. SoxR, a 2Fe-2S. transcription factor, is active only in its oxidize form / P. Gaudu, B. Weiss//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. - V. 93. -P. 10094-10098.

66. Geiger L. E. Stimulation of deoxyribonucleic acid replication fork movement by spermidine analogs in polyamine-deficient Escherichia coli / L. E. Geiger, D.R. Morris//J. Bacteriol. 1980. - V. 141. - P. 1192-1198.

67. Godsey M.H. Structural biology of bacterial multidrug resistens / M.H. Godsey, E.E.Z. Heldwein, R.G. Brennen//2002. V. 277. - N. 43. - P. 4016940172.

68. Gonzalez-Gil G. FIS is a regulator of metabolism in Escherichia coli / G. Gonsales-Gil, P. Bringman, R. Kahmann//Molecular Microbiology. 1996. -V. 22 .-N.1.-P. 21-29.

69. Gort A.S. The regulation and role of the periplasmic copper, zinc superoxide dismutase of Escherichia coli / A.S. Gort, M. Ferber, A. Imlay//Molecular Microbiology. 1999. - V. 32. - N. 1. - P. 179-191.

70. Gort A. Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defenses / A. Gort, J. Imlay//Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 14021410.

71. Goswami M. Involvent of reactive oxygen species in the action of ciprofloxacin against Escherichia coli / M. Goswami, S. H. Mangali and N. Jawali//Antimicrob. Agents Chemother. 2006. - V. 50. - P. 949-954.

72. Goudreau P.N. Signal transduction in bacteria: molecular mechanisms of stimulus-response coupling / A.M. Stock//Current Opinion in Microbiology. 1998. - V. 1. - P. 160-169.

73. Grant C. M. synthesis and role of glutation in protection against oxidative stress in yeast / C. M. Grant, I. W. Dawes// redox Report. 1996. - V. 2. -P. 223-229.

74. Grkovic S. Regulation of bacterial drug export system / S. Grcovic, M.H. Brown, A. Skurray//MicrobioIogy and Molecular Biology Reviews. 2002. -P. 671-701.

75. Gross R. Families of bacterial signal-transducing proteins / R. Gross, B. Arico, R. Rappuoli//Mol. Microbiol. 1989. - V. 3. - P. 1661-1667.

76. Grossowicz N. Mechanism of protection of cells by spermine against lisozyme-induced lysis /N. Grossowicz, M. Ariel//J. Bacteriol. 1963. - V. 85. - P. 293-300.

77. Ha H.C. The natural polyamine spermine function directly as a free radical scavenger / H. C. Ha, N.S. Sirisoma, P. Kuppusamy, et al.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 11140-11145.

78. Hakenbeck R. Analysis of tow-component signal transduction systems involved in transcriptional regulation / R. Hakenbeck, J.B. Stock//Methods in Enzymol. 1996. - V. 273. - P. 281-300.

79. Halliwell B. Free radicals in Biology and Medcine (2nd ed.) / B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, Oxford: Clarendon Press., 1989.

80. Halliwell B. The definition and measurements of antioxidants in biological system / B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge// Free Radicals Biol. Med. -1995.-V. 18.-P. 125-126.

81. Hassan M. Biosynthesis and regulation of superoxide dismutases / M. Hassan//Free Rad. Biol. Medicine. 1988. - V. 2. - P. 377-385.

82. Hatfield G. W. DNA topology-mediated control of global gene exspression in Escherichia coli / G. W. Hatfield, C. J. Benham//Annu Rev. Genet.- 2003.-V. 36.-P. 175-203.

83. Hausladen A. Superoxide and peroxinitrite inactive aconitases, but nitric oxide does not / M. Hausladen, I. Fridovich//Biol. Chem. 1994. - V. 269. -P. 29405-29408.

84. Hawkins C. L. Generation and propagation of radical reaction on proteins / C. L. Hawkins, M. J. Davies//Biochim. Biophis. Acta. 2001. - V. 1504. -P. 196-219.

85. Hengge-Aronis R. Back to log phase: sigma S as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli / R. Hengge-Aronis//Mol. Microbiol. 1996. - V. 21. - P. 887-893.

86. Hengge-Aronis R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the aS (RpoS) subunit of RNA polymerase / R. Hengge-Aronis//Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2002. - P. 373-395.

87. Henle E.S. Formation, prevention, and repair of DNA damage by iron/hydrogen peroxide / E. S. Henle, S.Linn//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - N. 31.-P. 19095-19098.

88. Heon M. L. Effect of varying the supercoiling of DNA on transcription and its regylation / M. L. Heon, Dale E. A. Lewis, H. J. Lee, M. Liu, S. Anhya//Biochem. 2003. - V. 42. - P. 10718-10725.

89. Herbst E.J. Putrescine as a growth factor for Haemophilus parainfluenzae / E.J. Herbst, E. E. Snell//J. Biol. Chem. 1948. - V. 176. - P. 989990.

90. Herbst E.J. The gram reaction and cell composition: diamines and polyamines / E.J. Herbst, R.H. Weaver, D.L. Keister//Arch. Biochem. Biophys. -1958.-V. 75.-P. 171-177.

91. Herman C. Proteolysis and chaperones: the destruction / reconstruction dilemma / C.Herman, R. D'Ari//Current Opinion in Microbiology. -1998.-V. l.-P. 204-209.

92. Hidalgo E. Binuclear 2FE-2S. clusters in Escherichia coli SoxRS protein and role of the metal centers in transcription / E. Hidalgo, J.M. Bollinger, T.M. Brandley, C.T. Walsh, B. Demple//J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 20908-20914.

93. Hidalgo E. Adaptive responses to oxidative stress: The soxRS and oxyR regulons in regulation of gene expression in Escherichia coli / E. Hidalgo, B. Demple//Lin E.C.C. and Lynch A.S., eds., R.G. Landes, Texas, 1996. P. 435-452.

94. Hidalgo E. Redox signal transduction: mutations shifting 2Fe-2S. centers of the SoxR sensor-regulator to the oxidized form / E. Hidalgo, H. Ding, B. Demple//Cell.-1997. V. 88. - P. 121-129.

95. Hidalgo E. The redox-regulated SoxR protein acts from a single DNA site as a repressor and an allosteric activator / E. Hidalgo, V. Leautaud, B. Demple//EMBO J. 1998. - V. 17. - N. 9. - P. 2629-2636.

96. Hoch J.A. Initiation of bacterial development / J. A. Hoch//Current Opinion in Microbiol. 1998. - V. 1. - P. 170-174.

97. Hoch J.A. Two-component and phosphorelay signal transduction / J.A. Hoch//Current Opinion in Microbiol. 2000. - V. 3. - P. 165-170.

98. Hoffer S.M. Autoamplification of a two-component regulatorysystem results in "learning" behavior / S.M. Hoffer, H.V. Westerhoff, K.J. Hellingwerf, et al.//J. Bacteriol. 2001. - P. 4914-4917.

99. Imlay J.A. Assay of metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli / J. Imlay, I. Fridovich//J. Biol. Chem. -1991.-V. 266.-P. 6957-6965.

100. Imlay J.A. Pathways of oxidative damage / Imlay J.A.//Annu. Rev. Microbiol. 2003. - V. 57. - P. 395-418.

101. Ishihama A. Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase / A. Ishihama//Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 499-518.

102. Iuchi S., Cellular and molecular physiology of Escherichia coli in the adaptation to aerobic environments / S. Luchi,L. Weiner//J. Biochem. 1996. -V. 120.-P. 1055-1063.

103. Iyer R. Complex inhibition of OmpF and OmpC bacterial porins by polyamines / R. Iyer, A.H. Delcour//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 1859518601.

104. Jameison D. Transcriptional regulators of oxidative stress responses / D. Jamieson, G. Storz//Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses (ed. Scandalios J.) NY: Cold Spring Harbor Laboratory. -1997.-P. 91-115.

105. Jenkins D.E. Role of RpoH, a heat shock regulator protein, in Escherichia coli carbon starvation protein synthesis and survival / D.E. Jenkins, E. Auger, A. Matin//J. Bacteriol. -1991. V. 173. - P. 1992-1996.

106. Jenkins D.E. Starvation-induced cross protection againnst osmotic challenge in Escherichia coli / D.E. Jenkins, S.A. Chaisson, A. Matin//J. Bacteriol. 1990. - V. 172.-P. 2779-2781.

107. Jishage M. Mapping of the Rsd contact site on the sigma 70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase / M. Jishage, D. Dasgupta, A. Ishihama//J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -N. 9. - P. 2952-2956.

108. Jishage M. A stationary phase protein in Escherichia coli with binding activity to the major a subunit of RNA polymerase / M. Jishage, A. Ishihama//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. - V. 95. - P. 4953-4958.

109. Jishage M. Transcriptional organization and in vivo role of the Escherichia coli rsd gene, encoding the regulator of RNA polymerase Sigma D / M. Jishage, A. Ishihama//J. Bacteriol. 1999. - P. 3768-3776.

110. Jung II L. Abnormal growth of polyamine-deficient Escherichia coli mutant is partially caused by oxidative stress-induced damage /1. L. Jung, T. J. Oh, I. G. Kim// Arch. Biochem. Biophys. 2003. - V. 418. - P. 125-132.

111. Kamashev D, Rouviere-Yaniv J. The histone-like protein HU binds specifically to DNA recombinationand repair intermediates / D.Kamashev, J. Rouviere-Yaniv//The EMBO Journal. 2000. - V. 19. - N. 23. - P.6527-6535.

112. Kao S. M. Biochemical characterization of a paraquat-tolerant mutant of Escherichia coli / S. M. Kao, H. M. Hassan//J. Biolchem. 1985. - V. 260. -N. 19. - P. 10478-10481.

113. Kappus H. Lipid peroxidation: mechanisms, analisis, ensymology and biological relevance / H. Kappus//In: Oxidative stress, Sies H., (Ed.) New York: Acad. Press, 1985. P. 273-310.

114. Keyer K. Inactivation of degydrotase 4Fe-4S. clusters and discriptuon of iron homeostasis upon of cell exposure peroxynitrite / K. Keyer, J.A. Imlay//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 27652-27659.

115. Khan A.U. Reactive oxygen species as a cellular messengers / A.U. Khan, T. Wilson//Chem. Biol. 1995. - V. 2. - P. 437-445.

116. Killik I. Mutational and lysis of the redox-sensitive transcriptional regulator OxyR: regions important for oxidation and transcriptional activation /1. Killik, M. Toledano, Tartaglia, G. Storz//Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 12751284.

117. Kim I.G. SOS induction of recA by UV-,y-irradiation and mitomicin C is mediated by polyamines in Escherichia coli K-12 / I.G. Kim, T.J. Oh//Toxicol. Lett.- 2000. V. 116. - P. 143-149.

118. Kim S.-N. Identification of the polyamine induced proteins in Escherichia coli I S.-N. Kim, J.-H. Lee, D.-K. Rhee//Molecules and Cells. 1999. -V. 9.-N. 2. -P. 219-224.

119. Kimura T. Intracellular generation of superoxide by copper sulphate in Escherichia coli / T. Kimura, H. Nishioka//Mutation Research. 1997. - V. 389. - P.23 7-242.

120. Kobayashi K. Comprehensive DNA microarray analysis of Bacillus subtilis two-component regulatory systems / K. Kobayashi, M. Ogura, H. Yamaguchi, et al.//J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - N. 24. - P. 7365-7370.

121. Korshunov S. Detection and quantification of superoxide formed within the periplasm of Escherichia coli / S. Korshunov, J. A. Imlay//J. of Bacteriol. 2006. - P. 6326-6334.

122. Kumar A. Recent advances in polyamine research / A. Kumar, T. Altabella, M.A. Teylor, et al.//Trends Plant Sci. 1997. - V. 2. - P. 124-130.

123. Kuo C. a,P- dihydroxyisovalerate dehydratase: a superoxidesensitive enzyme / C. Kuo, T. Mashino, I. Fridovich//J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 4724-4727.

124. Lee Y.S. The Arc two-component signal transduction system inhibits in vitro Escherichia coli chromosomal initiation / Y.S. Lee, J.S. Han, Y. Jeon//J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - N. 13. - P. 9917-9923.

125. Levine R.L. Methionine residues may protect proteins from critical oxidative damage / R.L. Levine, B.S. Berlett, J. Moskowitz, et al.//Mechan Ageing. Develop. 1999. - V. 107. - P. 323-232.

126. Liebart J.C. The expression of the DNA ligase gene of Escherichia coli is stimulated by relaxation of chromosomal supercoiling / J.C. Liebart, L. Paolozzi, M.G. Camera, et al.//Mol. Microbiol. 1989. - V. 3. - P. 269-273.

127. Liquori A.M., Complexes between DNA and polyamints: a molecular model / A.M. Liquori, L. Constantino, V. Cresconzi, E. Giglio, R. Puliti, M. De Santis Savino, V. Vitagliano//Mol. Biol. 1967. - V. 24. - P. 113-122.

128. Liochev S.I. Modulation of the fumarases of Escherichia coli in response to oxidative stress / S.I. Liochev, I. Fridovich//Archives of Biochemistry and Biophysics. 1993. - V. 301. - N. 2. - P. 379-384.

129. Liochev S.I. Superoxide and Iron: partners in crime / S.I. Liochev, I. Fridovich//JUBMB Life. 1999. - V. 48. - P. 157-161.

130. Little J.W. The SOS regulatory system: control of its state by the level of RecA protease / J.W. Little//Mol. Biol. 1983. - V. 167. - P. 791-808.

131. Liu F. Free radical scavenging activities of mushroom polysaccharide extracts /F. Liu, V. E. C. Ooi, S. T. Chang//Life Sciences. 1997. -V. 60.-N. 10.-P. 763-771.

132. Loewen P.C. The role of the sigma-factor sigma S (KatF) in bacterial global regulation / P.C. Loewen, R. Hengge-Aronis//Annu. Rev. Microbiol. 1994. - V. 48. - P. 53-80.

133. Loewen P.C. Regulation in the RpoS regulon of Escherichia coli / P.C. Loewen, B. Hu, J. Strutinsky, et al.//Can. J. Microbiol. 1998. - V. 44. - P. 707-717.

134. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Farr, et al.//J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. -P. 265-275.

135. Lu C. H. Quantitative and kinetic study of oxidative stress regylons using green fluorescent protein / C. H. Lu, C. R. Albano, W. E. Bentley, G. V. Rao//Biotechnol. Bioeng. 2005. - V. 89. - P. 574-587.

136. Lupo S. Tirosine is involved in protection from oxidative stress in S. cerevisiae / S. Lupo, C. Aranda, L. Miranda-Ham, et al.//Can. J. Microbiol. 1997. -V. 43.-P. 453-463.

137. Lusetti S.L. The bacterial RecA Protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks / S.L.Lusetti, M.M. Cox//Annu. Rev. Biochem. 2002. - V. 71. - P. 71-100.

138. Ma D. The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals / D. Ma, M. Alberti, C. Lynch, et al.//Molecular Microbiology. 1996. - V. 19. - N. 1. - P. 101112.

139. Martin R.G. Complex formation between activator and RNA polymerase as the basis for transcriptional activation by MarA and SoxS in

140. Escherichia coli / R.G. Martin, W.K. Gillette, N.I. Martin, et al.//Molecular Microbiology. 2002. - V. 43. - N. 2. - P. 355-370.

141. Martin R.G. Autoactivation of the marRAB multiple antibiotic resistance operon by the MarA transcriptional Activator in Escherichia coli / R.G. Martin, K.-W. Jair, R.E. Wolf, et al.//Journal of Bacteriology. 1996. - P. 22162223.

142. Martinez A. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps / A. Martines, R. Kolter//Journal of Bacteriology. 1997. - P. 5188-5194.

143. McCormick M.L. Endogenous superoxide dismutase levels regulate iron-dependent hydroxyl radical formation in Escherichia coli exposed to hydrogen peroxide / M.L. McCormick, G.R. Buettner, B.E. Britigan//J. Bacteriol. -1998.-P. 622-625.

144. Mencel R. Regulation of genes for E.coli DNA gyrase: homeostatic control of DNA supercoiling / R. Mencel, M. Gellert//Cell. 1983. - V. 34. - P. 105-113.

145. Michaels M.L. The GO system protects organisms from the mutagenic effects of the spontaneous lesion 8-hydroxy-guanine (7,8- Dihydro-8-oxoguanine) / M.L. Michaels, J.H. Miller//J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 63216325.

146. Miller J.H. Experiments in molecular genetics / J.H. Miller//Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1992.

147. Minton K.M. Paraquat toxicity is increased in Escherichia coli defective in the synthesis of polyamines / K. M. Minton, H. Tabor, C.W. Tabor//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 87. - P. 2851-2855.

148. Mizushima T. Increase in negative supercoiling of plasmid DNA in Escherichia coli exposed to cold shock / T. Mizushima, K. Kataoka, Y. Ogata, et al.//Mol. Microbiol. 1997. - V. 23. - N. 2. - P. 381-386.

149. Mlacar A. 2-Hydroxysuccinaldehyde, a lipid peroxidation product proving that polyunsaturated fatty acid are able to react with three molecules of oxygen / A. Mlacar, G. Spiteller//Free Radicals Ree. 1997. - V. 26. - P. 57-60.

150. Moody C.S. Mutagenicity of oxygen free radicals / C.S, Moody, H.M. Hassan//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1982. - V. 79. - P. 2855-2859.

151. Morel-Deville F. Identification by PCR of genes encoding multiple response regulators / F. Morel-Deville, D. Ehrlich, P. Morel//Microbiol. 1997. -V. 143.-P. 1513-1520.

152. Morris D.R. Biosynthetic and biodegradative ornithine and arginine decarboxylases from Escherichia coli / D.R. Morris, E.A. Boeker//Methods in Enzymology. 1983. - V. 94. - P. 125-134.

153. Morris D.R. Putrescine biosynthesis in Escherichia coli regulation through pathway selection / D.R. Morris, K.L. Koffron//J. Biol. Chem. 1969. - V. 244. - P. 6094-6099.

154. Muffler A. Heat shock regulation of gs turnover: a role for DnaK and relationship between stress responses mediated by a and a in Escherichia coli / A. Mufflar, M. Barth, C. Marschall, et al.//J. Bacteriol. 1997 (Feb.). - V. 179.-N2.-P. 445-452.

155. Munro G.F. Dependence of the putrescine content of Escherichia coli on the osmotic strength of the medium / G.F. Munro, K. Hercules, J. Morgan, et al.//J. Biol. Chem. 1972. - V. 247. - P. 1272-1280.

156. Neumann S. Discoordinate gene expression of gyr A and gyr B in response to DNA gyrase inhibition in E. coli / S. Neumann, A. Quinones// J. Basic Microbiol. 1997. - V. 37(1). - P. 53-69.

157. Newcomb T.G. Oxidative DNA damage and mutagenesis / T.G. Newcomb, L.A. Loeb//From: DNA damage and repair, Ed. by: Nickoloff and Hockstra. Humana Press Inc., Totowa. NJ, 1998. P. 65-83.

158. Nikaido H. Escherihia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology / H. Nikaido//eds. Neidhardt F.C. et al., Washington. D.C., 1996. P. 29-47.

159. Nikaido H. Multiple antibiotic resistance and efflux / H. Nikaido//Current opinion in microbiology. 1998. - V. 1. - P. 516-523.

160. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited / H. Nikaido//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - V. 67. -N. 4. - P. 593-656.

161. Nunoshiba T. Role of iron and superoxide for generation of hydroxyl radical, oxidative DNA lesions, and mutagenesis in Escherichia coli / T. Nunushiba, F. Obata, A.C. Boss, et al.//Boil. Chem. 1999. - V. 274. - P. 3483234837.

162. Park S. High levels of intracellular cysteine promote oxidative DNA damage by driving the Fenton reaction / S. Park, J. A. Imlay//J. Bacteriol. 2003. -V. 185.-P. 1942-50.

163. Paulsen I.T. Proton-dependent multidrug efflux systems / I.T. Paulsen, M.H. Brown, et al.//Microbiological Reviews. 1996. - V. 60. - N. 4. - P. 575-608.

164. Peter H.W. Influence of polyamines on the bivalent-cation-activited ATPases / H.W. Peter, H.U. Wolf, N. Seiler//Hope-Seyler's Z. Physiol. Chem. -1973. V. 354.-P. 1146-1148.

165. Pirrung M.C. Histidin kinases and two-component signal transduction systems / M.C. Pirrung//Chemistry & Biology. 1999. - V. 6. - P. 167-175.

166. Pomposiello P. J. Genom- wide transcriptional profiling of the Escherichia coli responses to superoxide stress and sodium salicylate / P. J.

167. Pomposiello, Marjon H. J. Bennik, B. Demple//J. Bacteriol. 2001. - P. 38903902.

168. Pratt L.A. Porin regulon of Escherichia coli. In Tow-component Signal Transduction / L.A. Pratt, T.J. Silhavy//eds. by Hoch J.A., Silhavy T.J. Washington, D.C.: ASM Press, 1995. P. 105-127.

169. Räch I. Paraquat resistance of Horseweed (Erigeron canadensis L.) is not caused by polyamines / I. Räch, D. Lasztity, E. Darco, et al.//Pesticide Biochemistry and Physiology. 2000. - V. 68. - P. 1-10.

170. Rase Evans C. Why do we expect carotenoids to be antioxidants in vivo? / C. Rase Evans, J. Sampson, P.M. Bramley, D.E. Holloway//Free Radicals Res. 1997.-V. 26. - P. 381-398.

171. Reis I.A. Inhibition of polyamine synthesis arrests trichomonad growth and induces destruction of hidrogenosomes / I.A. Reis, M.P. Martines, N. Yarlett, et al.//Antimicrob Agents Chemother. 1999. - V. 43. - P. 1919-1923.

172. Rilley W. D. Histidine decarboxylase of Lactobacillus 30a IV. The presence of covalently hound pyruvate as the prostetic group / W. D. Rilley, E. E. Snell// Biochem. 1968. -V.l.- P. 3520- 3528.

173. Robertson K.M. Molecular basis of voltage gating of OmpF porin / K.M. Robertson, D.P. Tieleman//Biochem. Cell Biol. 2002. - V. 80. - P. 517-523.

174. Samartzidou H. Excretion of endogenous cadaverine leads to decrease in porin-mediated outer membrane permeability / H. Samartzidou, A.H. Delcour//J. Bacteriol. 1999. V. 181. - P. 791-798.

175. Schneider R. FIS modulates growth phase-dependent topological transitions of DNA in Escherichia coli / R. Schneider, A. Travers, G. Muskhelishvili//Mol. Microbiol. 1997. - V. 28. - N. 3. - P. 519-530.

176. Schröder O. The bacterial DNA-binding protein H-NS represses ribosomal RNA transcription by trapping RNA Polymerase in the initiation complex / O. Schröder, R. Wagner//J. Mol. Biol. 2000. - V. 298. - P. 737-748.

177. Schumacher M.A. Structural mechanisms of multidrug recognition and regulation by bacterial multidrug transcription factors / M.A. Schumacher, R.G. Brennan//MolecuIar Microbiology. 2002. - V. 45. - N. 4. - P. 885-893.

178. Sechi A.M. Ingibition of phospholipase A-2 and phospholipase C by polyamines / A.M. Sechi, L. Cabrini, L. Landi, et aI.//Arch. Biochem. Biophys. -1977.-V. 186.-P. 248-254.

179. Sies H. Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants / H. Sies//Acad. Press, London. -1993.

180. Sies H. Impaired endothelial and smooth muscle cell function in oxidative stress /H. Sies//Exp. Physiol. 1997. - V. 82. - P. 291-295.

181. Sigler K. Oxidative stress in microorganisms-I / K. Sigler, J. Chaloupka, J. Brozmanova, et al.//Folia Microbiol. 1999. - V. 44. - N. 6. - P. 587624.

182. Smith K. Glutathionylspermidine metabolism in Escherichia coli / K. Smith, A. Borges, M.R. Ariyanayagam, A. H. FairIamb//Biochem. J.- 1995. -V. 312.-P. 465-469.

183. Sneath P.H.A. Putrescine as an essential growth factor for a mutant of Aspergillus nidulans / P.H.A. Sneath//Nature (London). 1955. - V. 175. - P. 818.

184. Sohal R. S. Oxidative stress as a causal factor in differentiation and aging a unifying hypothesis / R. S. Sohal, R. G. Alen//Exp. Gerontol. 1990. - V.25. P. 499-522.

185. Spathas D. H. A poliamine- sencitive mutant of Aspergillus nidulans / D. H. Spathas, A. J. Clutterbuck, J. A. Pateman//J. Gen. Microbiol. 1983. - V. 129.-P. 1865- 1871.

186. Stevart E. J. Disulfide bond formation in Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins / E. J. Stevart, F. Aslund, L. Beckwith// EMBO. 1998. - V. 17. - P. 5543-5550.

187. Stevens L. Studies on the interaction of homologues of spermin with deoxyribonucleic acid and with bacterial protoplasts / L. Stevens//! Biochem. -1967.-V. 103.-P.811-815.

188. Stock J.B. Protein phosphorilation and regulation of adaptive responses in bacteria / J.B. Stock, A.J. Ninfa, A.M. Stock/ZMicrobiol. Rev. 1989. -V.53.-P. 450-490.

189. Storz G. Oxidative stress / G. Storz, J.A. Imlay//Current opinion in microbiology. 1999. - V. 2. - P. 188-194.

190. Storz G. Bacterial defenses against oxidative stress / G. Storz, L.A. Tartaglia, S.B. Farr, et al.//Trends Genet. 1990.-V. 6. - P. 363-368.

191. Sullivan K.M. Influence of cation size and charge on the extrusion of a salt-dependent cruciform / K.M. Sullivan, M.J. Lilley//J. Mol. Biol. 1987. - V. 193. - P. 397-404.

192. Tabor H. The biosynthesis of spermidine and spermine from putrescine and methionine / H. Tabor, S.M. Rosenthal, C.W. Tabor//J. Biol. Chem. 1958. - V. 233.-P. 907-914.

193. Tabor C.W. Transport systems for 1,4-diaminobutane, spermidine and spermine in Escherichia coli / C.W. Tabor, H. Tabor//J. Biol. Chem. 1966. -V. 241.-P. 3714-3723.

194. Tabor C.W. Polyamines in microorganisms / C.W. Tabor, H. Tabor//Microbiol. Rev. 1985. - V. 49. - P. 81-99.

195. Tamarit J. Identification of the major oxidatively damaged proteins in Escherichia coli cells exposed to oxidative stress / J. Tamarit, E. Cabiscol, J. Ros//Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 3027-3032.

196. Tang Y. Escherichia coli aconitases and oxidative stress: post-transcriptional regulation of sodA expression / Y. Tang, M.A. Quail, P.J. Artymiuk, et al.//Microbiology. 2002. - V. 148. - P.1027-1037.

197. Termini J. Hydroxiperoxide-indused DNA damage and mutations / J. Termini//Mutation Research. 2000. - V. 450. - P. 107-124.

198. Thomas T.J. Structural specifity of polyamines in left-handed Z-DNA formation. Immunological and spectroscopic studies / T.J. Thomas, R.P. Messner//J. Mol. Biol. 1988. - V. 201. - P. 463-467.

199. Thomas T. Polyamine metabolism and cancer / T. Thomas, T. J. Thomas//J. Cell. Mol. Med. 2003. - Vol. 7. - № 2 - P. 113-126.

200. Toledano M.B. Redox-dependent shift of OxyR DNA contacts along an extended DNA-binding site: a mechanism for differential promoter selection / M.B. Toledano, I. Kullik, F. Trinh, et al.//Cell. - 1994. - V. 78. - P. 897909.

201. Tseng C.-P. Oxygen- and growth rate dependent regulation of Escherichia coli fumarase (FumA, FumB, and FumC) activity / C.-P. Tseng, C.-C. Yu, H.-H. Lin, et al.//J. Bacteriol. 2001. - P. 461-467.

202. Wallace S.S. Biological consequences of free radical-damaged DNA bases / S.S. Wallace//Free Radical Biology & Medicine. 2002. - V. 33. - N. 1. -P. 1-14.

203. Wang D. Mutagenesity and repair of oxidative DNA damage: insights from studies using defined lesions / D. Wang, D.A. Kreutser, J.M. Essigmann//Mutation research. 1998. - V. 400. - P. 99-115.

204. Wang J.Y. DNA twist as a transcriptional sensor for environmental changes / J. Y. Wang, M. Syvanen//Mol. Microbiol. 1992. - V. 6. - P. 1861-1866.

205. Weinstein-Fisher D. Escherichia coli response to hydrogen peroxide: a role for DNA supercoiling, Topoisomerase I and Fis / D. Weinstein-Fisher, M. Elgrably-Weiss, A. Shoshy//Molrcular Microbiology. 2000. - V. 35. - N.6. -P.1413-1420.

206. Woodmansee A.N. Reduced flavins promote oxidative DNA Damage in NON-respiring Escherichia coli by delivering electrons to intracellular free iron / A.N. Woodmansee, J.A. Imlay//J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - N. 37. - P. 34055-34066.

207. Wösten M.M. Eubacterial sigma-factors / Wösten M.M.//FEMS Microbiol. Rev. 1998. - V. 22. - P. 127-150.

208. Wu W. H. Biosyntetic arginindecarboxylase from Escherichia coli. Subunit interactions and the role of magnesium ion / W. H. Wu, D. R. Morris//J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 1696- 1699.

209. Wu J. Two divergently transcribed genes, s<xtR and joxS, control a superoxide response regulon of Escherichia coli / J. Wu, Weiss B.//Bacteriol. -1991.-V. 173.-P. 2864-2871.

210. Yoshida M. Poliamine stimulation of the Synthesis of oligopeptide-binding protein (OppA) / M. Yoshida, D. Meksuriyen, K. Kashiwagi, et al.//The Journal of Biological Chemistry. 1999. - V. 274. - N. 32. - P. 22723-22728.

211. Zamocky M. Understanding the structure and function of catalases: clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis / M. Zamocky, F. Koler//Progress in Biophisics & Molecular Biology. 1999. - V. 72. - P. 19-66.

212. Zechiendrich E.L. Role of topoisomerase in maintaining steady-state DNA supercoaling in Escherichia coli / E.L. Zechiendrich, Khodurshy A.B., S. Bachellier, et al.//J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - N. 11. - P. 8101-8113.

213. Zheng M. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation / M. Zheng, F. Asland, G. Storz//Science. 1998. -V. 279.-P. 1718-1721.

214. Zhou D. Global analysis of gene transcription regylation in prokaryotes / D.Zhou, R. Yang//Cell. Mol. Life Sci. 2006. - V. 63. - P. 22602290.

Информация о работе

Федотова, Марина Валентиновна
кандидата биологических наук
Пермь, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федотова, Марина Валентиновна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Федотова, Марина Валентиновна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федотова, Марина Валентиновна, Пермь

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология