Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12"

На правах рукописи

Самсонова Наталья Николаевна

Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coliK12.

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004 г.

Работа выполнена в лаборатории №2 Научно-исследовательского института Аджиномото-Генетика (ЗАО "АГРИ").

Научный руководитель: кандидат химических наук Л. Р. Птнцын

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. С. Миронов

кандидат биологических наук Л. В. Генинг

Ведущая организация: Центр биоинженерии РАН

Защита состоится " ^ " 2004 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного

совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 11754S, г.Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан " " апреля 2004 г

Ученый секретарь

Диссертационного Совета кандидат биологических наук

^/Х В И Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Полиамины присутствуют практически во всех видах биологических организмов, от бактерий и вирусов до человека, и участвуют в огромном количестве разнообразных биологических и биохимических реакций, включая синтез ДНК, РНК и белков [Abraham, 1968; Frydman et al., 1992]. Исследование клеток прокариот и эукариот показало, что в различных организмах не только функционируют одинаковые соединения полиаминов (чаще всего это путресцин, спермидин, спермин и, существенно реже, кадаверин), но также универсальны и многие этапы биосинтеза этих поликатионов [Tabor et al., 1985; Pegg, 1986]. Хотя не вызывает сомнений тот факт, что полиамины выполняют важные физиологические функции и совершенно необходимы для обеспечения нормального клеточного роста, было показано, что избыточное накопление полиаминов в клетке ингибирует синтез белков, вызывает замедление роста, а в некоторых случаях приводит к гибели организма [Не et al., 1993]. Ацетилирование полиаминов по так называемому ацетилазному пути деградации, помогает предотвратить эффект токсичности полиаминов как в про-, так и в эукариотах [Matsui et al., 1982]. Образующиеся при этом ацетилпроизводные полиаминов далее окисляются полиаминооксидазами, деацетилируются, либо экскретируются из клетки [Ignatenko et al., 1996]. У некоторых микроорганизмов охарактеризован также альтернативный аминотрансферазный путь деградации полиаминов.

Наиболее подробно изучен аминотрансферазный путь деградации путресцина в клетках Escherichia coli. Показано, что трансаминирование путресцина, катализируемое путресцин аминотрансферазой (КФ 2.6.1.29), и последующее декарбоксилирование образующегося аминобутиральдегида приводят к образованию у-аминобутирата (GABA), который в дальнейшем преобразуется в сукцинат, включаясь в цикл Кребса [Snaibe et al., 1985]. Совокупность реакций биосинтеза путресцина из аргинина и его деградации до сукцината образуют так называемый аргинин декарбоксилазный путь деградации аргинина (ADC) Ecoli. Было показано, что все ферменты ADC пути, за исключением аргинин декарбоксилазы, индуцируются в условиях азотного голодания [Snaibe et al., 1985]. Однако, несмотря на то, что ADC путь деградации Ecoli довольно хорошо охарактеризован как биохимически, так и генетически, еще не все гены этого пути картированы. Так до сих пор не были локализованы гены, кодирующие ключевые ферменты деградации путресцина - пиридоксальфосфат (PLP) - зависимую путресцин:<х-кетоглутарат аминотрансферазу (ПАТазу) и аминобутиральдегид дегидрогеназу.

Вследствие того, что уровень активности ПАТазы даже в индуцирующих условиях азотного голодания чрезвычайно низкий, изучение этого фермента до сих пор проводилось только в мутантных по утилизации полиаминов и GABA штаммах Ecoli. Возможно, по этой причине в независимо выполненных работах Kim [Kim, 1964] и Prieto-Santos [Prieto-Santos et al., 1986] приведены противоречивые биохимические характеристики частично очищенных пр

БИБЛИОТЕКА СПетц 43

UlbHAH] ЕКА I

¡Ж

В этой связи актуальной является задача идентификации гена E.coli, кодирующего ПАТазу, с использованием методов биоинформатики и генетической инженерии, выделение нативного фермента и изучение его свойств современными методами молекулярной биологии.

Цель и задачи работы.

Целью представленной работы являлась идентификация гена Kcoli, кодирующего ПАТазу, конструирование плазмид, обеспечивающих достаточно высокий уровень продукции фермента, а также определение основных физических и кинетических параметров очищенного препарата ПАТазы.

В процессе работы были решены следующие задачи:

• Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма£со// К12 (ген ygjG)\

• Изучение Ntr-зависимой регуляции экспрессии гена^'С?;

• Конструирование экспрессионных плазмид, обеспечивающих эффективную продукцию ПАТазы как в виде "слитого" белка с his6-tag лидерным пептидом (Ht-YgjG), так и нативного белка (YgjG);

• Разработка лабораторного метода выделения белка YgjG из растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантного штамма Е.соН;

• Исследование и сравнительная характеристика каталитических активностей и некоторых основных физических и кинетических параметров очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые • идентифицирован и клонирован ген (ygjG), кодирующий путресцин аминотрансферазу в клетках Escherichia coli К12. Изучена его структурная организация и выявлены регуляторные последовательности, обеспечивающие о54 - зависимую индукцию экспрессии ygjG в условиях азотного голодания.

Разработана методика получения высокоочшценного препарата каталитически активного белка из биомассы рекомбинантного штамма Е. coli.

Показано, что фермент эффективно катализирует путресцин:а-КГ аминотрансферазную реакцию, а также может использовать кадаверин и, с меньшей эффективностью, спермидин в качестве доноров аминогрупп. Фермент термостабилен, активен только в щелочном диапазоне значений рН и проявляет максимум активности при рН 9.0 и температуре 70 °С. Интересной особенностью фермента является его способность катализировать глутамагпируват аминотрансферазную реакцию (GPT, КФ 2.6.1.2). Ни одна из известных к настоящему времени полиамин аминотрансфераз не проявляет GPT активности. Субстратная специфичность YgjG и зависимость активности

фермента от рН совпадают с параметрами ПАТазы, выделенной Kim [Kim, 1964] из мутантного по утилизации путресцина штамма Rcoli B6.

Сравнение свойств очищенных препаратов YgG и Ht-Yg'G, несущего дополнительную his6-tag лидерную последовательность на N-конце белка, показало, что данная модификация • N-концевой последовательности влияет на субстратную специфичность и ферментативную активность препарата. Кроме того, элиминация первых 30 аминокислот YgG приводит практически к полной потере активности фермента.

Полученные в работе данные могут быть использованы для исследования полиамин аминотрансфераз других микроорганизмов и для дальнейшего изучения путей метаболизма полиаминов в E.coli.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на Пущинской школе молодых ученых (Пущино, 15-19.05.02), на Научной сессии МИФИ-2003 (Москва, 12-16.01.03), на XV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 12-19.02.03), на первом FEMS конгрессе европейских микробиологов (1st FEMS Congress of European Microbiologists, Slovenia, Lubliana, 29.06-03.07.2003).

Публикации.

По результатам исследований опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы.

Во Введении обоснована актуальность работы и сформулирована ее цель и практическая значимость. В Обзоре литературы рассмотрены современные представления об основных функциях полиаминов in vivo, описаны известные пути биосинтеза и катаболизма основных соединений полиаминов в микроорганизмах. Приведены сведения о полиамин аминотрансферазах, известных к настоящему времени. В разделе Результаты и обсуждение изложены результаты исследования структурной и функциональной организации гена ygj'G, приведены физические и кинетические параметры исследованного фермента. В разделе Материалы и методы приведены материалы и методики, а также оборудование, использованные при проведении работы.

Диссертация изложена на 109 страницах, содержит 24 рисунка, 12 таблиц и список цитированной литературы из 179 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма Kcoli K12

Исходя из принадлежности путресцина, содержащего дистальную аминогруппу в (в положении углеродной цепи, к классу субстратов для PLP-зависимых аминотрансфераз (АТаз) III группы [Mehta et al., 1993] и литературных данных о Ntr-зависимой экспрессии НАТазы Exoli [Snaibe et al., 1985] был осуществлен поиск гипотетических открытых рамок считывания (ORF) Exoli: а) обладающих существенной гомологией с консенсусной последовательностью аминотрансфераз III групп PF00202, б) экспрессия которых индуцируется в условиях азотного голодания. Проведенный нами анализ банка данных аминокислотных последовательностей E.coli K12 [Blattner et al., 1997] выявил единственную последовательность, удовлетворяющую обоим критериям — последовательность YgjG (SWISS-PROT Database accession number Q8XAN1) размером 496 аминокислотных остатков (а.к.о.), аннотированную как предполагаемая (putative) орнитин аминотрансфераза (ОАТаза, КФ 2.6.1.13). Найденная последовательность обладает существенной гомологией и высокой степенью схожести с

консенсусной последовательностью трансаминаз III группы, а индукция соответствующей мРНК в условиях азотного голодания, согласно данным DNA-array [Zimmer et al., 2000], составляет от 3 до 5 раз. На основании полученных результатов нами было предположено, что YgjG может обладать ПАТ активностью.

Кодирующая YgG последовательность гена ygjG (Ь3073, Blattner; GenBank accession number gi| 1789454), размером 1491 п.н. расположена на 69,35 минуте хромосомы Ecoli ниже аег гена (Рис. 1). Для установления типа ферментативной активности полипептида YgG и проверки данных о Ntr-зависимой индукции, 1791-п.н. фрагмент, включающий последовательности ygjG и aer-ygjG межгенную область, был получен ПЦР-амплификацией соответствующего района хромосомы штамма Escherichia coli K12 MG1655 с использованием олигонуклеотидов 5'-

TTGGATCCGATTAATTTGATTTAGATCGCA-3' и 5'-TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGC GTCG -3' в качестве праймеров (Рис. 1). В результате амплификации фрагмент был фланкирован сайтами для рестриктаз ВатШ и Pstl. Полученный ВатШ-Psil фрагмент был клонирован под контролем промотора Pucuvs в составе мультикопийного вектора pUC18 и нуклеотидная последовательность вставки в полученной плазмиде pUC18-ygG была секвенирована для подтверждения правильной структуры фрагмента.

Клетки Ecoli TGI были трансформированы плазмидой pUC18-ygG и плазмидой pUC18, использовавшейся в качестве контроля. Для индукции биосинтеза полипептида YgG штаммы культивировали в следующих условиях: а) на богатой LB среде (индукция 1 мМ изопропилтиогалактозидом (IPTG), 2 ч); б) на минимальной среде М9, содержащей пролин вместо аммония в качестве единственного источника азота (в условиях азотного голодания). Тестирование аминотрансферазной активности в клеточных лизатах проводили, используя в качестве доноров аминогрупп следующие соединения с дистальными аминогруппами: путресцин, орнитин, ацетилорнитин (АсО), GABA, диаминопропан (DAP) и некоторые аминокислоты. В качестве возможных акцепторов

были проверены а-КГ, пируват, а-кетобутират. Продукты реакции трансаминирования кетокислот анализировали при помоши тонкослойной хроматографии. Специфическая аминотрансферазная активность была обнаружена только в случае пары путресцин-а-КГ при щелочных значениях рН в штамме TGl(pUC18-ygjG). При этом наблюдалась существенная индукция ПАТ активности (около 10 раз) при росте TGl(pUC18-ygG) в условиях азотного голодания (47 нмоль мин"1 мг'1) по сравнению с ростом на богатой среде (5 нмоль мин'1 мг"1). В контрольном штамме TGl(pUC18) данная активность не детектировалась ни на богатой среде, ни в условиях азотного голодалния (т.е. была меньше нижнего предела разрешения методики измерения -1 нмоль мин"1 мг'1). Орнитин аминотрансферазная (О AT) активность, аннотированная для YgG, также не детектировалась ни в одном штамме.

Таким образом, на данном этапе нашей работы было установлено, что амплификация 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего последовательность ygjG, в составе мультикопийной плазмиды действительно приводит к появлению специфической ПАТазной активности, которая индуцируется при выращивании клеток в условиях лимитации по неорганическому азоту. В связи с чем, было признано целесообразным дальнейшее изучение и проведение подробного анализа нуклеотидной последовательности клонированного 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего последовательность гена ПАТазы -ygjG (pat).

aer ygjG

obg-I olig-2

r

5s

t, Г A

ygjG

ATG

(237)

ATG (438)

orfl

TAA (1725)

Рис. 1. Схема фрагмепта хромосомы Escherichia coli K12 MG16S5, содержащего vtnygjG и aer-ygjG межгенную область.

Стрелками показаны расположение и ориентация генов ygjG (gi| 1789454) и aer, и участки гомологии для олигонуклеотидов olig-1 и olig-2, использованных при ПЦР амплификации фрагмента, содержащего ygjG и aer-ygjG межцистроняый район. На схеме амплифицированного ВатШ-Pstl фрагмента указаны две анонсированные открытые рамки считывания ygjG (Ь3073, gi| 1789454) и orfl (gi|U71884), локализация предполагаемых о70- и ом-зависимых промоторов, инициирующих кодонов и стоп кодона, а также - сайты рестриктаз, использованных при клонировании.

2. Функциональное изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и последовательность гена ПА Тазы

2.1. Анализ нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygjG межцистронного района

Как результат компьютерного анализа нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygjG межцистронного района в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) приведены две предполагаемые промоторные последовательности специфичные для о70 и сг54 субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы Kcoli, соответственно, а также сайт связывания регуляторного белка FIS (Рис. 2). Следует отметить, что если а70-зависимый промотор локализован в регуляторной области гена, то промотор о54 - в 5' кодирующей последовательности ygjG. В соответствии с этим данными были аннотированы две рамки считывания для потенциального продукта трансляции мРНК (Рис. 1, 2). Первая из них, описанная выше как ygjG, кодирует полипептид размером 496 а.к.о., биосинтез которого возможен только в случае инициации транскрипции соответствующей мРНК с а70-зависимого промотора. Нуклетотидная последовательность ygjG будет обозначаться ниже как orf. Инициация транскрипции другой рамки - одноименного гена (gi|1171884) размером 1290 п.н. (обозначенной нами как orfl), кодирующей полипептид размером 429 а.к.о. (Р42588), возможна с любого из промоторов. Обе рамки имеют классический стартовый кодон AUG.

Проведенный нами дополнительный анализ нуклеотидной последовательности района, расположенного слева от предполагаемой последовательности [Reitzer et al., 2001], выявил потенциальный сайт связывания регуляторного белка IHF и два сайта связывания белка-регулятора Ntr-ответа NRI, участие которых, как известно, необходимо для обеспечения инициации транскрипции «^-зависимой РНК полимеразой Exoli в условиях азотного голодания [Magasanik, 1996]. Нуклеотидные последовательности предполагаемых промоторных последовательностей, а также сайты связывания регуляторных белков и соответствующие им консенсусные последовательности указаны на Рис.2. Также при анализе нуклеотидной последовательности, расположенной справа от а^-промотора была выявлена еще одна возможная рамка считывания, обозначенная нами как окр (Рис.2). Эта рамка кодирует полипептид размером 459 а.к.о., экспрессия которого возможна при инициации транскрипции с каждого из промоторов. Трансляция orf2 должна инициироваться с редко используемого стартового кодона UUG, что, как правило отражает механизм регуляции скорости биосинтеза белка на трансляционном уровне [Parsons et al, 1988].

Рамки считывания orfl и orf2 имеют легко узнаваемые потенциальные SD (Shine-Dalgamo) последовательности (Рис. 2), расположенные на функционально значимом расстоянии (5-13 оснований) от инициирующего кодона [Makrides, 1996], однако, теоретически каждая из трех рамок считывания может транслироваться in vivo.

(-312) ggatccgatraatttgatttagatcgcaatttgcg

JB«mHI

IHF

TCTAA----TTGATT o"

-277 atttaaacacaaatctaattcc^tgat^raaaatäctttcactctrgttacfratacgaaaacgttaataat

NRi HRi

tgcacca---tggtgca tgcacca---tggtgca

-207 tatcttgcccaaaaatcaisgcaattattgccctgaaaacgtgcatttgcgcagcaatcatcaaatccata

_FIS__start

-137 cccgacaaaaaccgtgcaaaataacaacaaatgttaacagatagcattaaatattgcacaaatgataacc

ygjG (orf)-

o54

tggcacaa---ttgcaat +1

-67 gaatitgtgtttatcccgattttcgcgatcgcagccggagtggcgcaatccctgcaatacttaaatcGgt

Bgll

SD Start

+4 atcatgtgatacgcgagcctcçggagcatattttgaacaggttaccttcgagcgcatcggctttagcgtg AecIII orf2 >"

SD start

+74 cagcgcccacgccctgaatctcattgagaagcgaacgctggatcatgaggagatgaaagcacttaaccga

orfl-

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность 5'-концевой . области ygjG и aer-ygjG межгеипой области.

Нумерация нуклеотидов приведена относительно положения " +1 " старта мРНК выделенного курсивом (см. Раздел 2.3 и Рис.4). Анонсированные последовательности «10» и «-35» предполагаемого а промотора выделены рамкой, а возможный сайт связывания FIS подчеркнут сверху. Сайты рестриктаз подчеркнуты волнистой линией. Последовательности а34 промотора и предполагаемых сайтов связывания NRi и IHF выделены жирным шрифтом, выше приведены соответствующие консенсусные последовательности. SD последовательности подчеркнуты сверху. Три вероятных стартовых кодона трансляции рамок ygjG iprf), orfl и or/2 выделены жирным шрифтом.

22. Изучение регуляции экспрессии гена ПАТ азы.

Для экспериментальной проверки функциональности промоторов а70 И О54 были

сконструированы три «гибридные» экспрессионные кассеты, в которых различные

участки фрагмента ВатHI-AccШ (Рис. 1) регуляторной области гена ПАТазы, были

слиты со структурной частью гена-репортера lacZ (Рис 3). При этом в разных

конструкциях эффективность экспрессии гена определялась: а) в случае

кассеты I, содержащей полноразмерный фрагмент регуляторной области ПАТазы ВатШ-

Acclll, - силой обоих промоторов; б) в случае кассеты II (фрагмент BgR-AccIII) - только

активностью промотора а54; в) в случае кассеты III (фрагмент BamHI-Bgll) - только

активностью промотора о70. Экспрессионные кассеты были клонированы в составе

плазмиды pBRP [Ptitsyn et al., 1990], полученной из pBR322, путем замены EcoRl-Sphl

фрагмента ДНК, содержащего промотор Р^д вместе с 5'-дистальной частью гена

устойчивости к тетрациклину tet4, на соответствующий EcoBl-Sphl фрагмент

полилинкера плазмиды pUC18. В качестве контрольной плазмиды использовали pBR-O-lacZ, полученную при клонировании в векторе pBRP только структурной части гена lacZ.

&

pUC18-ygjG

pBR-lacZ-3 pBR-o54lacZ-l pBR-oMlacZ-2

J"

_70

е»

Я"

NRI-NRI III

I

_CL

orfl

lacZ

Рис. 3. Схема конструирования плазмид pBR- n54lacZ-l, pBR- <t54lacZ-2 и pBR-lacZ-3. Три различных участка регуляторной области гена ПАТазы (обозначенные как I, II, III и содержащие: предполагаемые последовательности о70, о54 промоторов и сайтов связывания NRI) клонированы в виде слитых с lacZ генов в составе векторной плазмиды pBRP.

Таблица 1. Уровень экспрессии 1ас2 в рекомбинантных штаммах при различных условиях роста.

Активность р-галактозидазы, MU'

Штамм LB6 M9 M9, без аммонийных

солей, плюс пролин

TG 1 (pBR-oi4/acZ-1) 190 3,500 22,500

TG 1 (pBR-o^/acZ-i) 140 400 800

TG 1 (pBR-/acZ-3) 110 130 170

TG 1 (pBR-O-ZacZ) 140 190 220

" в единицах Миллера,

6 условия культивирования штаммов описаны в работе [Samsonova et ai, 2003], измерение активности Р-галактозидазы проводили по методу Миллера [Miller, 1972].

Клетки КсвИ TG1 были трансформированы полученными плазмидами. Рекомбинантные штаммы культивировались в различных (по содержанию азота) условиях роста: на богатой LB среде, на минимальной среде М9 и в описанных выше условиях азотного голодания.

Измерение активности р-галактозидазы в лизатах штаммов проводили по стандартной методике [МШег, 1972]. Во всех четырех штаммах при росте на богатой среде ТВ, а также в штамме, несущем плазмиду рВК-1ас2-3 и контрольную плазмиду рВЯ-О-1ас2, при росте во всех трех средах, уровень экспрессии р-галактозидазы был

чрезвычайно низок (порядка 200 единиц Миллера) (Таблица 1), что свидетельствовало, во-первых, о практически полном отсутствии экспрессии гена ПАТазы при росте на богатой среде, и, во-вторых, об отсутствии промоторных последовательностей в 287-п.н. фрагменте BamW-BgR

В штамме, несущем плазмиду pBR-a'MacZ^, уровень экспрессии lacZ на стандартной среде М9, а также в условиях азотного голодания, был в 3 — 6 раз выше, чем в штамме с pBR-lacZ-3, что соответствует данным литературы о чрезвычайно низком уровне транскрипции с ст^-зависимых промоторов при отсутствии NRI энхапсера [Magasanik, 1996]. Pia основании этих результатов нами был сделан вывод о том, что 56-п.н. BgR-Acc\ü фрагмент действительно содержит последовательность а34 промотора, который является основным для экспрессии ПАТазы.

Рост штамма TG 1 (pBR-aS4-lacZ-1) на бедных средах, особенно в условиях азотного голодания, сопровождался существенным возрастанием активности Р-галактозидазы. По сравнению со штаммом TG 1 (pBR-c^-lacZ^), уровень экспрессии lacZ в lacZ-1) увеличился в 9 раз на М9 среде и в 28 раз на безазотной среде с пролином. В случае использования в качестве альтернативного источника азота других аминокислот — аланина, орнитина или аргинина, увеличение активности в этих

штаммах в условиях азотного голодания составило 22,5 раза, если в качестве альтернативного источника азота использовался аргинин или орнитин, и 19,5 раза в случае использования аланина. Следовательно, BamHI-Bgli фрагмент чрезвычайно важен для экспрессии гена ПАТазы в условиях роста на М9 и в условиях азотного голодания, что обусловлено, по-нашему мнению, наличием в составе этого фрагмента сайтов связывания NRI и, возможно, IHF сайта. Учитывая не характерное для Ntr-зависимой регуляции расположение IHF левее сайтов NRI, нельзя исключать вероятность того, что IHF участвует не в регуляции гена ПАТазы, а в регуляции соседнего противоположно ориентированного гена aer [Rebbapragada ct al., 1997].

Таким образом, результаты данных экспериментов позволяют сделать вывод о том, что транскрипция мРНК гена ПАТазы инициируется только с54 промотором при росте штаммов на минимальной среде М9, достигая максимума в условиях азотного голодания, и строго репрессируется на богатой LB среде.

2.3. Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы

Для подтверждения функциональности а54 промотора было проведено определение положения старта транскрипции мРНК ПАТазы. Для этих экспериментов были выделены препараты мРНК штамма TGl(pUC18-ygjG), выращенного на всех трех средах (описанных в Разделе 2.2). В качестве контроля использовали препарат мРНК штамм TGl(pUC18). Реакции синтеза кДНК проводили, используя радиоактивно меченый олигонуклеотид 54XXjiiuicAATGAGATIC^jGGOCjIGG-3', комплементарный

последовательности «+88» - «+115» относительно 3'-фланкирующего нуклеотида а54 промотора, выделенные препараты мРНК и рекомбинантную обратную транскриптазу

Omniscnpt (Qiagen). Синтезированные фрагменты кДНК анализировали в 6% ПААГ, визуализацию и количественную оценку радиоактивных сигналов проводили с использованием мультифункционального сканера Typhoon 9210 (Amersham-Pharmacia) и программы ImageQuant (V 5 0). Анализ данных (Рис. 4) позволил идентифицировать в качестве возможного первого основания мРНК — гуанозин (G), локализованный на расстоянии 10 нуклеотидов относительно 3'-фланкирующего нуклеотида О54 промотора. Соответствующий кДНК транскрипт детектировался только для препаратов РНК, полученных из клеток, выращенных на стандартной М9 среде и в условиях азотного голодания, причем количественное соотношение транскриптов в этих препаратах составило 1:4, соответственно.

Рис 4. Определение положения старта инициации транскрипции у&О.

Полученные по методу достройки радиоактивно-меченого праймера препараты кДНК, а также сиквенсовые реакции, анализировали в 6% ПААГ. препараты кДНК полученные из мРНК штамма Т01(риС18-уа'О) выращенного: в условиях азотного голодания - дорожка 1; - в минимальной среде М9 - дорожка 2, - в ЬБ -дорожка 3. На 4 дорожке нанесен препарат кДНК полученный из мРНК штамма Т01(риС18), выращенного в условиях азотного голодания.

Таким образом, полученные результаты подтверждают факт инициации

транскрипции мРНК только с о^-специфичного промотора, что соответствует

результатам эксперимента с использованием гена-репортера lacZ (Таблица 1) и

результатам измерения активности ПАТазы в клетках штамма TGl(pUC18-ygjG) при

различных условиях выращивания (см. Раздел 1) Следует также отметить, что наши

эксперименты показывают некорректность анонсирования ORF ygjG (gl789454, Ь3073)

как гена размером 1491 п н, кодирующего полипептид размером 496 а к.о. (SWISS-PROT

.то .

Database, Q8XAN1). Анонсированный для этой ORF а -зависимый промотор также не

функционирует при выращивании клеток ни на богатой LB среде, ни на минимальной среде М9, ни в условиях азотного голодания.

2.4. Анализ продуктов трансляции orfl и ог/2

Как уже было отмечено выше, установление факта инициации транскрипции гена ygjG с промотора о54 ограничивает выбор ORF, кодирующей активную ПАТазу только двумя альтернативными вариантами - orfl или orfl. Для анализа продуктов трансляции orfl и orfl мы воспользовались общепринятым для подобного рода исследований подходом: конструированием экспрессионных плазмид, обеспечивающих биосинтез полипептидов, кодируемых этими рамками считывания, в виде гибридных белков «слитых» с лидерным пептидом his^-tag. Последовательности обеих рамок считывания были ГЩР амплифицированы с использованием "прямых" праймеров 5'-CCGATATCATGAAAGCACTTAACCGAGAG- 31 для orfl и 5'-

CCGATATCTTGAACAGGTTACCTTCGAG-31 для orfl, "обратного" праймера 5'-TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGCGTCG-3' и плазмиды pUC18-ygjG. Полученные фрагменты были клонированы в составе вектора pET-15b(+) (Novagen, США). При этом S'-концевые последовательности orfl и orfl были слиты с his6-tag лидерной последовательностью вектора с сохранением рамки считывания (Рис 5).

Рис. 5. Структура регуляторных областей экспрессионных плазмид рЕТ15Ъ-Ш-ОКИ и рЕТ15Ь-Ш-ОКР2.

Показаны основные структурные элементы экспрессионной кассеты вектора рЕТ15Ь(+): поздний фаговый промотор фага Т7 (Т7), участок связывания рибосом гена 10 фага Т7 (КВЗц), лидерпый пептид (Ызб-1а§). Приведена первичная структура ДНК областей сопряжения трансляционных рамок оф и оф и лидерного пептида Мв«-^, а также N концевые аминокислотные последовательности белков Ht-ORFl и Ht-ORF2.

Клетки БЬ21(БЕ3) трансформировали полученными плазмидами рЕГ15Ь-Н1-ОКР1, рЕТ15Ъ-Н1-ОКР2 и контрольной плазмидой рЕТ15Ь. Биосинтез целевых белков в рекомбинантных штаммах индуцировали добавлением 1 мМ 1РТО и тестировали полученные лизаты штаммов на присутствие активности ПАТазы. ПАТ активность в штаммах ВЬ21(0ЕЗ)[рЕТ15Ь-Ш-01Ш] и ВЬ21 (Т)ЕЗ)[рЕТ 15Ь-№-СЖР2] составила 0,05 и 2,16 мкмоль мин"'мг''. В контрольном штамме БЬ21(БЕ3)[рЕТ15Ъ] ПАТ активность не детектировалась. Электорофоретический анализ белков из клеточных лизатов штаммов показал, что спустя два часа после индукции синтеза слитых белков их удельное содержание в растворимой фракции клеточных белков составило 2,4 % для Ht-OR.F1 и 8,5 % для Ht-ORF2 соответственно (Рис.6).

Рис. 6. Биосинтез Ht-ORFl и Ht-ORF2 в клетках К соГи Очистка этих белков методом IMAC хроматографии 1 -маркер молекулярных масс; 2,3,4 — растворимая фракция клеточного лизата штаммов BL21(DE3) [pET15b], BL21(DE3)[pET15b-Ht-ORF2] и BL21 (DE3)[pETl 5b-Ht-ORF 1 ], соответственно, через 2 часа после индукции синтеза слитых белков; 5,6-препараты Ht-ORF2 (3,5 мкг) и Ht-ORFl (4 мкг) соответственно.

Для сравнения удельных активностей Ht-ORFl и Ht-ORF2 были получены очищенные препараты слитых белков. Наличие полигистидиновых последовательностей в N-концевой части гибридных белков Ht-ORFl и Ht-ORF2 позволило использовать для их эффективной очистки IMAC хроматографию (immobilized-metal-affinity chromatography). Выход полипептида Ht-ORF2 составил около 80%. Было получено 4,5 мг препарата, содержащего, по результатам сканирования SDS-электрофорезного геля, до 95% целевого белка (Рис. 6). Напротив, выход препарата Ht-ORFl составил менее 20%, что, по нашему мнению, было вызвано протеолитической деградацией рекомбинантного белка как на стадии его биосинтеза, так и в процессе его очистки. Содержание целевого белка Ht-ORFl в полученном препарате по результатам сканирования SDS-электрофорезного геля (Рис. 6) не превышало 65%. Молекулярные массы выделенных полипептидов Ht-ORFl (48 kDa) и Ht-ORF2 (52 kDa) соответствовали сумме расчетных значений лидерного пептида - 2,1 Ша, соответственно.

Анализ ПАТ активности очищенных препаратов Ht-ORFl и Ht-ORF2, показал, что удельная активность Ht-ORF2 составляет 11,7 мкмоль мин"' мг"1, в то время как

активность Ht-ORFl - только 0,2 мкмоль МИН'1 МГ"1. По-видимому, элиминация первых 30 N-концевых аминокислот практически инактивирует фермент. Полученный результат функционального анализа продуктов трансляции Ht-ORFl и Ht-ORF2 свидетельствует о том, что orf2 является истинной рамкой гена ygj'G, кодирующей биологически активный белок YgjG (ПАТазу) размером 459 а.к.о.

3. Характеристика каталитической активности YgjG (ПАТазы) E.colL

Любые модификации аминокислотной последовательности белка могут оказывать влияние на его биологическую активность. Такое влияние, однако, проявляется не всегда, или может быть выражено слабо. Согласно результатам, полученным нами при функциональном анализе продуктов трансляции orfl и ог/2, N-концевая кодирующая последовательность ПАТазы имеет решающее значение в процессе формирования каталитически активного белка (факт интенсивного протеолиза Ht-ORFl также можно рассматривать как косвенное свидетельство в пользу этой гипотезы). Поэтому, чтобы охарактеризовать каталитическую активность YgjG, а также проверить соответствие синтезирующегося in vivo белка ПАТазы продукту трансляции orfl, мы сочли необходимым выделить нативный препарат YgjG.

3.1. Экспрессия и разработка метода выделения белка YgjG

С этой целью нами была реализована схема экспрессии активной ПАТазы на мультикопийном плазмидном векторе, с заменой NtrC-регулируемого промотора О5* на сильный промотор фага Т7. Для эффективной экспрессии YgjG фрагмент плазмиды pUC18-ygjG, первичная структура которого включала в себя последовательность orfl (а также и более короткую последовательность orfl) вместе с предполагаемым сайтом связывания рибосом, был ПЦР-амплифицирован с использованием праймеров 5'-ACTT CTAGACCTCCG GAGCATATTTT GAAC - 3' и 5'-

TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGCGTCG-3' и клонирован в составе плазмидного вектора рЕТ22Ь(+) (Рис. 7). Анализ ПАТ активности в клеточном лизате штамма BL21(DE3) трансформированного полученной плазмидой pET22b-ORF2 показал, что спустя два часа после индукции синтеза ПАТазы ее активность составляла порядка 340 нмоль мин'1 МГ'1.

Разработанная нами процедура очистки YgjG из растворимой фракции тотального клеточного белка штамма BL21(DE3)[pET22b-ORF2] включала стадии фракционирования, в растворе- обогащения при высокотемпературной

инкубации и три хроматографических стадии очистки (Таблица 2). Все этапы очистки проводили при 4 °С. Присутствие 10 цМ PLP в буферных растворах на всех этапах очистки способствовало сохранению ПАТ активности фермента. Высокий уровень термостабильности YgjG (см. ниже) позволил ввести этап очистки с помощью термоинкубации при 60°С. Хроматографическая очистка препарата на ДЕАЕ-сефарозе и гидроксилапатите (ГАП) позволили достичь 95% чистоты YgjG (Рис. 8) с выходом 36%.

Bghl

T7

Л

Xbal

Л/1

RBS„rtj 0132 I

4- Г.Л1!!ПТ!У^^"шин^шп^

Ш SD о//2 Start ORF2

5 ' tctagacctccgsrscatattjgt^aacaggttaccttcgagcgcatcggcittagcgtgcagcg mnrlpssasalacs 0RF2 —>

SD arfl, Start ORF1

cccacgccctgaatctcattgagaagcgaacgct®tcatgaggagbbaaagcacttaaccga-3' ahalnliqkrtldhee m к a l n r

ORF1 -

Рис. 7. Структура экспрессионной кассеты плазмиды pET22b- ORF2. Показаны: промотор фага Т7 (Т7), предполагаемые SD оф и SD оф., инициирующие стартовые кодоны (Start ORF1 и Start ORF2), а также N-концевые аминокислотные последовательности ORF2 и ORF1 (подчеркнута). Направление трансляции показано • стрелками.

Таблица2. Очисткарекомбинантного препарата YgjG изE.coliKXI.

Этап очистки Белок (мг) PAT активность (мкмоль мин"1) Удельная PAT активность (мкмоль мин"1 мг"1) Выход Степень (%) очистки'

Лизат 41 13.93 0.34 100 1

(NH4bS04 (35-65%) 21.3 12.98 0.61 93 1.8

Температурная 5.3 12.87 2.41 92 7.1

инкубация

Гидроксилапатит (Iй) 1.2 10.94 9.12 79 26.8

ДЕАЕ-сефароза 0.6 7.11 11.85 51 34.9

Гидроксилапатит (2м) 0.36 5.08 14.1 36 41.5

kDa 116 66

•45

•35

■ 18

Рис. 8. БОв-РАвЕ электрофорез этапов > очистки препарата У^б

1 - растворимая фракция клеточного лизата (12 мкг белка), 2 - очистка сульфатом аммония (10 мкг), 3 - температурная обработка (2 мкг), 4 - препарат УдО после первого этапа ГАП хроматографии (6 мкг), 5 - препарат Удв после последовательно проведенных ДЕАЕ и второй ГАП хроматографии (2 мкг), 6 - маркер молекулярных масс.

Удельная ПАТ активностью очищенного препарата YgjG составила 14,1 мкмоль мин-1мг'1 (Таблица 2). Полученный препарат был достаточно стабилен, сохраняя 90% активности в течение двух суток при +4 °С либо в течение 2 месяцев при -70 °С.

Молекулярная масса выделенного белка YgjG по данным SDS-электрофореза составила около 50 kDa, что согласуется с расчетным значением и подтверждает сделанное нами ранее заключение о том, что каталитически активный препарат YgjG (ПАТаза) является продуктом трансляции orf2.

Молекулярная масса препарата нативного YgjG, определенная с помощью гель-фильтрации на колонке Сефакрил S-300, составила 203,4±9,3 kDa, что свидетельствует о тетрамерной структуре белка в растворе при нейтральном рН.

32. Характеристика субстратной специфичности и основных физических и кинетических параметров препаратов Ht-YgjG и YgjG

С целью определения влияния N-концевой гексагистидиновой последовательности на биологическую активность нативного белка YgjG мы сочли интересным провести параллельное исследование субстратной специфичности, основных физических и кинетических параметров как нативного белка YgjG так и его производного - Ht-YgjG.

Определение субстратной специфичности очищенных препаратов Ht-YgjG и YgjG проводили, используя в качестве доноров аминогрупп следующие соединения с дистальными аминогруппами: путресцин, кадаверин, спермидин, спермин, агматин, L-орнитин, ацетилорнитин, GABA, DAP, Р-аланин, а также основные L-аминокислоты. В качестве возможных акцепторов были проверены фенилпируват,

Было показано, что оба фермента проявляют схожую субстратную специфичность (Таблица 3). Для обоих ферментов максимальные значения активности достигались при использовании в качестве акцептора аминогрупп - а в качестве доноров

аминогрупп - путресцина (100%) или кадаверина (95-97%). Полученный результат показывает, что YgjG, также как и ПАТаза, выделенная Kim [Kim, 1964] из мутантного штамма E.coli, является диамин аминотрансферазой. Гораздо менее эффективно в качестве донора аминогрупп препараты YgjG и Ht-YgjG используют спермидин (2732%). Практически не активны в качестве доноров L-аланин, агматин и L-орнитин (14%). Ферментативная активность не обнаруживалась в присутствии таких полиаминов как спермин и DAP. ß-алакин, GABA; ацетилорнитин и орнитин также не активны в реакциях, катализируемых YgjG и Ht-YgjG.

Следует отметить, что YgjG также достаточно эффективно катализировал перенос аминогруппы глутамата на пируват, проявляя тем самым глутамат:пируват аминотрансферазную (GPT) активность. GPT активность препарата Ht-YgjG значительно ниже. Ни одна из известных к настоящему времени аминотрансфераз III группы не проявляет GPT активности, хотя присутствие вРТазы (КФ 2.6.1.2), способной катализировать синтез L-аланина в грубых экстрактах клеток Exoli, ранее было обнаружено [Reitzer, 1996]. Фрагмент ДНК, который, как полагали, содержит ген aJaB,

кодирующий GPTa3y, был клонирован на мультикопийном векторе [Wang, 1987]. Однако приведенные в работе данные рестрикционного анализа клонированного фрагмента [Wang, 1987] не совпадают с рестриктной картой гена ygjG, что свидетельствует о том, что авторами был клонирован отличающийся от нашего фрагмент хромосомы Exoli.

Таблица 3. Субстратная специфичность очищенных препаратов Ht-YgjG и YgjG • с различными донорами и акцепторами аминогрупп.

Субстрат* Ht-YgjG YgjG

Донор аминогрупп 6 Относительная активность (%)'

Путресцин 100 100

Кадаверин 97 95

Спермидин 32 27

L-Аланин 4 4

Агматин 2 2

L-Орнитин 2 1

L-Глутамат'' 21 30

Акцептор аминогрупп"

а-Кетоглутарат 100 100

а-Кетобутират 12 23

Пируват 38 34

* определение субстратной специфичности проводилось в линейном диапазоне

концентраций детектируемого продукта реакции при насыщающих концентрациях

6 в качестве акцептора во всех реакциях, за исключением GPT, использовался а-КГ.

1 PAT активность с а-КГ была принята за 100%.

дв качестве донора аминогрупп во всех реакциях использовался путресцин.

Способность кетокислот выступать в качестве акцепторов аминогрупп исследовали с использованием путресцина в качестве донора аминогрупп. Было показано, что YgjG и Ht-YgjG осуществляют перенос аминогруппы на пируват и а-кетобутират. Однако, эффективность этого процесса существенно ниже, чем в случае а-КГ. Такие кетокислоты, как фенилпируват, а-кетоизовалериат, а-кетоизокапроат и а-были полностью инертны в качестве акцепторов.

Сравнение основных физических параметров препаратов YgjG и Ht-YgjG (Рис. 9) показало, что оба белка активны в диапазоне щелочных значений рН и проявляют максимальную активность при активность препаратов значительно

снижается (в 5 - 6 раз). Эти результаты достаточно хорошо согласуются с данными Kim [Kim, 1964], полученными для препарата ПАТазы, выделенного из мутантного по утилизации путресцина штамма Exoli В (способного использовать путресцин в качестве единственного источника азота и углерода). Однако согласно другим данным, оптимум

активности препарата ПАТ азы, выделенного из мутантного по утилизации GABA и путресцина штамма Е.соН К-12, наблюдался при рН 7.2 [Pгieto-Santos et в1., 1986]. Возможно, это несоответствие вызвано существованием отличного от YgjG фермента, также катализирующего ПАТ реакцию с максимальной активностью при рН 7.2.

Изучение температурных зависимостей ПАТ активностей очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG показало, что максимум активности для Ht-YgjG наблюдается при 60 °С, а для YgjG - при 70 °С (Рис. 9,Б). При физиологических значениях температур (в диапазоне 20 - 40°С) удельные активности обоих препаратов практически совпадали. При высоких температурах, 80 - 90°С, активности препаратов снижаются (до 30-40% от максимальной). Также было показано, что падение активности рекомбинантного препарата Ht-YgjG за 50 мин. инкубации при 80 *С составляет 16%, а для препарата нативного белка — только 5%, что свидетельствует о достаточно высокой термостабильности изучаемых препаратов. При этом препарат YgjG более стабилен при высоких температурах, чем Ht-YgjG, содержащий ^концевую гексагистидиновую последовательность.

70 7Я &0 в.! 90 0,5 100 рН

температура (°С)

Рис. 9. Зависимость относительной ПАТ активности1 очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG от рН (А) и температуры (Б).

максимальная активность каждого препарата при

Для определения кинетических параметров ПАТ реакции, протекающей по механизму с замещением фермента ("пинг-понг-би-би" механизм) были. исследованы зависимости начальных скоростей реакции от концентрации одного из субстратов при насыщающей концентрации второго субстрата [Корниш-Боуден, 1979]. Для каждой из исследованных пар сопряженных субстратов с помощью регрессионного анализа экспериментальных данных определялись, кажущиеся значения параметров и

После чего, на основе известных теоретических зависимостей [Корниш-Боуден, 1979], рассчитывались значения максимальной начальной скорости реакции и

констант Михаэлиса К„ для соответствующих субстратов. Значения каталитической константы (числа оборотов фермента) были определены на основании расчетных

значений и Мг белка. Полученные кинетические параметры (Кт, Утю,, ксо, ^сч^пд ПАТ реакции, катализируемой препаратами УдО и Ш-УдО представлены в Таблице 4. Для нативного белка дополнительно были определены кинетические параметры реакции трансаминирования кадаверина и спермидина.

Таблица 4. Основные кинетические параметры* Ht-YgjG и YgjG.

Фермент Мг, kDa Субстрат к„ мМ V r maxt цмоль мин"1 мг'1 с1 hcaJКт с1 мМ"1

а-Кетолутарат 4,2 ±0,5 20,1 ± 0,8 16,8 4,0

YgjG 50 Путресцин 1,9 ±0,3 17,1 ±0,9 14,3 7,5

Кадаверин 6,1 ±0,3 14,6 ±0,3 12,2 2,0

Спермидин 26,1 ± 6,2 12,8 ±1,9 10,7 0,4

Ht-YgjG 52 а-Кетолутарат 7,2 ±1,5 22,5 ±2,0 23,3 3,2

Путресцин 4,8 ±0,9 19,6 ±1,3 173 3,6

" Приводятся расчетные значения кинетических параметров У^а и К,

Анализ значений kctJK„ для трех основных доноров YgjG - путресцина, кадаверина и спермидина, показывает, что путресцин является наиболее предпочтительным субстратом, и свидетельствует о том, что белок действительно является путресцин:а-КГ аминотраисферазой. Кадаверин также может служить донором аминогрупп, хотя сродство YgjG к этому субстрату в три раза ниже, чем к путресцину, а отношение кс/К,, -в четыре раза ниже. Для спермидина соответствующие параметры на порядок ниже.

Сравнение кинетических параметров YgjG и Ht-YgjG, показывает, что хотя значения для них достаточно близки, сродство к субстратам у YgjG примерно в два раза выше. При этом, значения кса/Кпддя путресцина также отличаются в два раза, а для О-КГ практически совпадают. На основании приведенных данных можно заключить, что наличие дополнительного N-концевого пептида в Ht-YgjG, не сильно сказываясь на физических свойствах белка, изменяет его кинетические параметры по сравнению с YgjG. Выше мы отмечали, что элиминация первых 30 N-концевых аминокислот практически инактивируст фермент (см. Раздел 2.4). Следовательно, N-концевая область YgjG существенна для его ферментативной активности.

Определенные значения кинетических параметров препарата YgjG могут показаться достаточно высокими, однако известно что для многих

ферментов, принадлежащих к подгруппе III PLP-зависимых аминотрансфераз, значения характеризуются как микромолярными, так и миллимолярными величинами (например - 2,5 мМ для а-КГ и 0,48 мМ для ацетилорнитина в случае ацетилорнитин-АТазы E.coli).

4. Влияние аллельного состояния гена ygjG на утилизацию путресцина

Согласно литературным данным большинство штаммов Rcoli, в том числе и широко используемый лабораторный штамм Rcoli К12 MG1655 [Tabor et al, 1985; Tkachenko et al, 1996], не способны использовать путресцин в качестве альтернативного источника азота. При изучении путей деградации путресцина в E.coli, как правило, использовались мутантные штаммы, утилизирующие путресцин [Dover et al, 1972; Snaibe et al, 1985]. Нами был получен штамм MG1655 ptr*, способный расти на путресцине в качестве единственного источника азота (Рис.1 ОД) и стабильно наследующий этот фенотип. Мутация ptT+ была картирована в районе 80 мин хромосомы при помощи in vivo клонирования фрагментов хромосомальной ДНК на фагмиде (xd5005 [Groismanetal, 1986].

С целью изучения влияния аллельного состояния гена ygjG на фенотип клеток Rcoli мы инактивировали ygjG на хромосоме штамма MG1655ptr+, путем замены нативного аллеля ygjG на ПЦР фрагмент, содержащий ген cat антибиотической устойчивости к хлорамфениколу при помощи Red рекомбиназы фага X [Datsenko et al, 2000]. Таким образом, был получен штамм MG1655 ptr^ygjG. Делеция ygjG не является летальной для клеток, что соответствует литературным данным [Schneider et al, 2002]. Анализ кривых роста штаммов MG165 5 ptr+ ygjGn MG1655 на безазотной среде М9 с путресцином показал (Рис. 10,А), что элиминация ygjG приводит к неспособности штамма утилизировать путресцин.

О 10 20 304050 о 10 20 30 40 50

д время, ч g время, ч

Рис 10. Кривые роста штаммов Kcoli на среде с путресцином в качестве единственного источника азота

Влияние амплификации гена ygjG на способность Е coli утилизировать путресцин определяли на примере штамма MG1655ptr+ ygjG трансформированного плазмидой pUC18-ygjG. Наличие природной регуляторной области перед геном ygjG в составе плазмиды pUC18-ygjG, обеспечивало индукцию экспрессии ygjG в условиях азотного голодания (см. Раздел 1), в результате чего полученный штамм приобрел способность

утилизировать путресцин (Рис.10,Б). Однако рост штамма MG1655ptr+ ygjG [pUC18-ygjG] на безазотной среде М9, содержащей путресцин в качестве единственного источника азота, был очень медленным (время удвоения около 36 ч). Трансформация исходного штамма MG1655ptT* плазмидой pUC18-ygjG также привела к увеличению времени удвоения штамма на среде с иутресцином с 4,5 ч. до 29 ч. При этом время удвоения MG1655ptr\ трансформированного контрольной плазмидой pUC18, по-прежнему, составляло 4,5 ч, что свидетельствует об ингибирующем эффекте от введения мультикопийной плазмиды pUC18-ygjG, вызванном, по-видимому, высокой дозой гена ygjG и, как следствие, синтезом значительного количества продукта переаминирования путресцина - Д'-Пирролина, который, как известно, токсичен для клеток Kcoli [Cooper et al, 1980].

Таким образом, на основании описанных выше результатов элиминации и амплификации ygjG, можно заключить, что кодируемый этим геном фермент - ПАТ аза «отвечает» в клетках Ecoli за утилизацию путресцина в качестве альтернативного источника азота.

5. Поиск гомологов белка YgjG

Изучение основных кинетических параметров YgjG подтвердило (см. Раздел 3.2), что фермент является ПАТазой, катализируя путресцин:а-КГ аминотрансферазную реакцию. Согласно литературным данным, в настоящее время обнаружена единственная ПАТаза, также использующая а-КГ в качестве акцептора - ПАТ аза Klebsiella pneumoniae [Friedrich et al., 1979]. Однако ни аминокислотная последовательность, ни кинетические параметры этого фермента не охарактеризованы. Другие известные полиамин аминотрансферазы Pseudomonas aeruginosa [Lu et al., 2002] и Arthrobacter sp. TMP-1 [Yorifuji et al., 1997] используют в качестве акцептора пиру ват. Единственной путресцин аминотрансферазой с секвенированной в настоящее время последовательностью является фермент из Pseudomonas aeruginosa, кодируемый геном spuC. Однако, несмотря на схожую ферментативную активность, число идентичных аминокислотных остатков и консервативных замен в аминокислотных последовательностях SpuC (PA0299) и YgjG составляет только 27 % и 43 %, соответственно.

При проведении анализа генома Kcoli K12 [Blattner et al, 1997] были выявлены шесть белков гомологичных YgjG. Это ферменты, принадлежащие группе III АТаз с изученными каталитическими активностями, что позволяет с высокой долей вероятности утверждать, что YgjG - единственная ПАТаза в геноме Kcoli. Паралогами YgjG являются АсОАТазы, кодируемые генами argD (gi| 1789759) и cstC (gi| 1788044), GABAATa3bi, кодируемыеgoaG (gi|1787560) и gabT(gi\ 1789016), ОАРАТаза (gi|1786991) и глутамат-1 -полуальдегид АТаза (gi| 1786349). Число идентичных аминокислотных остатков и консервативных замен в аминокислотных последовательностях этих белков составляет - 36/54%, 34/49%, 34/53%, 34/52%, 33/51% и 29/47%, соответственно, что характерно для АТаз.

Среда ортологов YgjG с установленными каталитическими активностями максимальной гомологией обладает ОАТаза Bacillus subtilis RocD (gi| 16081086). Число идентичных аминокислотных остатков и консервативных замен в аминотрансферазах YgjG и RocD составляет соответственно 33 и 56%. Существенной гомологией с ПАТазой Exoli обладают также OAT (gi| 11968102) Rattus norvegicus, AcOAT (gi|6324432) Saccharomyces cerevisiae, OAT (gi|3319072) Human, OAT (gi|23485730) Plasmodium yoelii, DAPAT (gi|2340815, 32/51) Acinetobacter baumannii и последовательности АТаз 1П группы из других организмов. Множественное выравнивание гомологичных YgjG полипептидов выявило в составе YgjG наличие консервативных последовательностей (Рис. 11) и позволило локализовать четыре инвариантных аминокислотных остатка (Gly-245, Asp-271, Lys-ЗОО и Arg-426), отвечающих за связывание с субстратами и коферментом PLP. Интересно, что YgjG обладает наиболее протяженной N-концевой последовательностью, что, по нашему мнению, также свидетельствует о существенной роли N-концевой структуры для каталитической активности этого фермента.

Представляется целесообразным выделить в геномах других штаммов E.coli и родственных микроорганизмов гипотетические последовательности, имеющие около 9499 % идентичных а.к.о. с YgjG. Это 496 а.к.о. последовательности, кодируемые одноименными генами ygjG - (gi| 15803614) и (gi|26249659) штаммов Exoli 0157:117 EDL933 и CFT073, соответственно. Три 429 а.к.о. последовательности: Salmonella enterica serovar Typhi СП 8 STY3396 (gi| 16504294), Salmonella typhimurium LT2 oat (gi| 16421775) и YgjG (gi|30064418) штамма Shigella flexneri 2a str.2457T. А также последовательность размером 496 а.к.о., кодируемая геном ygjG (gi|24114370) другого штамма Shigella flexneri 2a - str.301. По-видимому, для этих последовательностей, как и в случае исследованной нами ПАТазы Exoli К12, имеет место ошибочная локализация ORF и истинной каталитически активной рамкой в каждом случае является полипептид размером 459 а.к.о., обладающий ПАТ активностью. В составе геномов не родственных Exoli организмов также были обнаружены гомологичные YgjG гипотетические последовательности, что свидетельствует о важной роли путресцин-аминотрансферазы в клеточном метаболизме азота и обуславливает целесообразность более подробного изучения этих ферментов.

RocD_B3

QAT_Hm

AcOAT_Sc

YgjS_Eo

ArgDJSc

GabT EC

RocD_Bs

OAT_Hm

AcOAT_Sc

YgjG_Ec

ArgD_Ec

GabT Ec

RocD_Bs

OAT_Hm

AcOAT_Sc

YgjG_Ec

ArgD_Ec

GabT Ec

RocD_Bs

OAT_Hm

AcOATSc

YgjG_Ec

ArgD_Ec

GabT Ec

RocD_Bs

OAT_Hm

AcOAT_Sc

YgjG_Eo

ArgD^Ec

GabT Ec

RocD_Bs

CATJfcn

AcOAT_Sc

YgjG_Ec

ArgD~Ec

GabT Ec

RocD_Bs

OAT_Hm

AcCAT_Sc

YgjG_Ec

ArgD~Ec

GabT Ec

RocD_B3 OAT_Hra AcOAT Sc YgjG_Ec ArgD_Ec GabT Ec

( 1) -----------------MTALSKSKEIIDQTSHYGANN---Y—HPLPIVIS--------

( 1) ---------------------xtsddifereykygahn---y—hplpvale-------r

( 1) -----------MFKRYLSSTSSRRFTSILEEKAFQVTT---Y---SRPEDLC----IT-R

( 1) InrlpssasalACSAHALNLIEKRTLDHEEMKALNREVieyFKEHVNPGFLEyRKSVTAG

( 1) --------------------------MAIEQTAITRAT---FDEVILPIYAP-AEFIPVK

( 1) -----------------MN--SNKELMQRRSQAIPRGV-----GQIHPIFAD-------R

++ +. .* . •.+*+*♦+•+.+++++. + .**.**+++.+++.*..++____+

( 31) -E-ALGAW-------VKDPEGNEYMDMLSAYSAVKQGHRHPKIIQALKDQADKITLTS-R

( 28) GK-GIYLW---------DVEGRKYFDFLSSYSAVNQGHCHPKIVNA1KSQVDKLTLTS-R

( 39) GK-NAKLY--------DDVNGKEYIDFTAGIAVTALGHANPKVAEILHHQANKLVHSS-N

( 61) GDyGAVEWqagslntLVDTQGQEFIDCLGGFGIFNVGHRNPVWSAVQNQLAK------Q

( 31) GO-GSRIW---------DQOGKEYVDFAGGIAVTALGHCHPALVNALKTQGETLWHIS-N

( 30) AE-NCRVW---------DVEGREYLDFAGGIAVLNTGHLHPKWAAVEAQLKKtSHTCfQ

.+.....*.......+ . .... + .+*+*+*+.♦.*.*.**.........

( 81) AFHNDQ-LGPFYEKTAKLT-----GKEMILPKNTGAEAVESAVKAARRWAYEVKGVADN

( 77) AFYNN-VbGEYEEYITKLF-----NYHKVLPMNTGVEAGETACKLARKWGYTVKGIQKY

( 89) LYFTKECLDLSEKlVEXTKQFGGOHDASRViXCNSGTEANEAALKEAKKHG---IMKNPS

(115) PLHSQELLDPLRAMLAKTLAALTPGKLKYSFFCNSGTESVEAALKLAKAYQ-----SPRG

( 80) VFTNEPALRLGRKLIEATF-------AERWFMNSGTEANETAFKLARHYA—CVRHSPF

( 80) VLAYEPYLELCEIMNQKVP----GDFAKKTLLVTTGSEAVENAVKIARAAT--------К

(134)

(130) (146) (170)

(131) (128)

(182)

(178) (195) (218)

(179) (187)

(236) (233) (252) (278) (233) (246)

(292) (289) (309) (336) (288) (301)

(348)

(345) (368) (395)

(346) (360)

+..+*+..+.****+. +++.+.. ..*..+*++..*+ + ++.+• +.+

OAEIIACVGNFHGRTMIAVSLSSE-EEYKRGFGPMLPG-I---------KLIPYGD-VEA

KAKIVFAAGNFWGRTLSAISSSTDPTSY-DGFGPFMPG-F---------DIIPYND-LPA

KQGIVAFENSFHGRTMGALSVTWN-SKYRTPFGDLVPH-V---------SFLNLNDEMTK

KFTFIATSGAFHGKSLGALSATAK-STFRKPFMPLLPG-F---------RKVPFGN-IEA

KTKIIAFHNAFHGRSLFTVSVGGQ- PKYS DGFGP-KPADI---------IHVPFND-LHA

RSGTlAFSGAYHGRTHYTLALTGKVNPYSAGMG-LMPGHVyralypcplHGISEDDAIAS

+ .. .+■......++++.++«***"+l+... . + .+♦ . ■ ++.+*.++.++.,,,.B*"+*+

lrqai-----t-pntaaflfepiqgea|ivippegflqeaaaickeenvlfia|eiqtgi.

LERAL----QD-PiTVMEMVEPIQGEAlVVVPDPGYLMGVRELCTRHQVLFrASEIQTGL

LQSYI-ETKKD—EIAGlIVEPIQGEGivFPVEVEKLTGLKKICQDNDVIVIKiEIQCGL ^TALNECKKTgDDVAAVILEPIQGEGi^ILPPPGYLTAVRKLCDEFGALMILfiSVQTGM

VKAVM-----D-DHTCAVVVEPIQGEGEVTAATPEFLQGLRELCDQHQALLVFEEVQCGM

rHRIFKNDAAP-EDIAAIVIEPVQGEC5FYASSPAFMQRLRALCDEHGIMLIA|EVQSGA

*♦»*. .+*..+ .++ ♦*+.. .+It*+**.+*+++.....+*.....•+.*»+«**

GRTGKTFACDW—DGIVPDMYILGJ1ALGGGVFPISCIAADREILGV—FNPCSHGSTFGG ARTGRWLAVDY—ENVRPDIVLLCHALSGGLYPVSAVLCDDDIKLT—IKPGEHGSTYGG GRSGKLWAHAYlpSEAHPDIFTSAeALGNG-FPIAATIVNEKVNKA—LRVGDHGTTYCG GRTGKMFACEH—ENVQPDILCLAMALGGGVMPIGATIATEEVFSVlfDNPFLHTTTFGG GRTGDLFAYMH—YGVTPDILTSA1ALGGG-FPISAMLTTAEIASA—FHPGSHGSTYGG GRTGTLFAMEQ—MGVAPDLTTFAgSIAGG-FPLAGVTGRAEVMDA—VAPGGLGGTYAG

*"+*.++...++++.++.+.......+ .. + .4. + .. + .. .++..+..+**.*++.+++

NPLACAVSIASLEVLEDEKIADRSLELGEYFKSELESIDS--P-VIKEVRGRGLFIGVE-

NPLGCRVAIAALEVLEEENLAENADKLGIILRNELMKLPS---DWTAVRGKGLLNAIV-

NPLACSVSNYVLDTIADEAFLKQVSKKSDILQKRLREIQAKYPNQIKTIRGKGLMLGAE-NPLACAAALATINVLLEQNLPAQAEQKGDMLLDGFRQLAREYPDLVQEARGKGMLMAIE-NPLACAVAGAAFDIINTPEVLEGIQAKRQRFVDHLQKIDQQYD-VFSDIRGMGLLIGAE-NPIACVAALEVLKVFEQENLLQKANDLGQKLKDGLLAIAEKHP-EIGDVRGLGAMIAIE1

. .+. .. .+____+..+.*++......

----------LTEAARPYCERLKEEGLLCKETHD-

-I-----KETKDWDAWKVCLRLRDNGLLAKPTHG-

FV-----EP-----PTEVIKXARELGLLIITAGK—

FV— D-NEIGYNFASEMFRQRVLVAGTL—NNAK-

------LKPQYKGRAROFLYAGAEAGVMVLNAGP-

FEdgDhNKPDAKLTAE-IVARARDKGLILLSCGPy

■TVI RFAPPLI ISKEDLDWAIEKIK -DIIBFAPPLVIKEDELRESIEIIN ■STVHEVPALTIEDELIEEGMDAFE —TlilEPPLTLTIEQCELVIKAAR ■DVfflFAPSLWEDADIDEGMQRFA rNVLgiLVPLTIEDAQIROGLEIIS

Рис. 11. Множественное выравнивание последовательности YgjG E-coli K-12 и аминшраисфераз Ш группы. RocD_Bs - ОАТаза Bacillus subtilis, OAT_Hm -ОАТаза Human, AcOAT_Sc - АсОАТаза Saccharomyces cerevisiae, ArgD_Ec - AcOAT Kcoli K-12, GabT_Ec -GABAATa3a ELcoli K-12. Консервативные аминокислотные астатки (G, D, К, R) данной группы аминотрансфсраз выделены рамкой, звездочками отмечены одинаковые аминокислоты.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген ygjG Kcoli K12 MG1655 и показано, что аннотированная как орнитин аминотрансфераза ORF ygj'G кодирует ПАТазу - белок, обладающий путресцин:а-кет0глутарат аминотрансферазной активностью и эффективно катализирующий реакцию переаминирования кадаверина.

2. Показано, что аИ-зависимая экспрессия ygjG индуцируется в условиях азотного голодания. Определен старт транскрипции мРНК ygjG и стартовый кодон (UUG) трансляции YgjG.

3. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие эффективную продукцию YgjG как в виде слитого с лидером полипептида (Ht-YgjG) так и в виде нативного белка. Разработан метод выделения и очистки нативного белка и получены высокоочищенные препараты YgjG и Ht-YgjG.

4. Исследованы субстратная специфичность обоих белков и их основные кинетические параметры в реакциях трансаминирования с использованием путресцина, кадаверина и спермидина в качестве доноров и в качестве акцептора аминогрупп. Определены рН и температурная зависимости ферментативной активности ПАТазы YgjG.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Samsonova N.N., Smirnov S.V., Altman I.B., Ptitsyn L.R. «Molecular cloning and characterization of Escherichia coli K12ygjG gene» //BMC Microbiology, 3:2, (2003).

2. Samsonova N.N., Smirnov S.V., Altman I.B., Ptitsyn L.R. «Characterization of Escherichia coli YgjG protein as putrescine:2-oxoglutarate aminotransferase with broad substrate specificities» //FEMS Letters, v. 222(S), p.346, (2003).

3. Самсонова Н.Н., Смирнов СВ., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Идентификация гена Escherichia coli К12, кодирующего путресцин аминотрансферазу» //XV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тез. докл. и стенд, сообщений, с.31, Москва, (2003).

4. Самсонова Н.Н., Смирнов СВ., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Идентификация гена Escherichia coli K12, кодирующего путресцин аминотрансферазу» //Научная сессии МИФИ-2003. Сборник научных трудов, том 5, с.32-33, Москва, (2003).

5. Самсонова Н.Н., Смирнов СВ., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Изучение регуляции транскрипции и функциональная характеристика продукта трансляции гена ygjG Exoli К12» //6-я Путинская школа конференция молодых ученых. Тез. докл., с.315, Москва, (2002).

Принято к исполнению 26/04/2004 Исполнено 27/04/2004

Заказ № 160 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

9< 960 ^

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Самсонова, Наталья Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12"

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.6

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.8

1.1. Полиамины в Escherichia coli.8

1.1.1. Эффекты полиаминов in vivo и in vitro.8

1.1.2. Полиамины, представленные в E.coli.11

1.1.3. Влияние полиаминов на адаптацию Е. coli в условиях стрессов.12

1.1.4. Биосинтез полиаминов.15

1.1.5. Катаболизм полиаминов.20

1.1.6. Транспортные системы полиаминов.27

1.2. Ntr-ответ E.coli.30

1.2.1. Два пути ассимиляция азота в Е. coli.30

1.2.2. GS активность. Механизм регуляции Ntr-ответа.32

1.2.3. Роль глутамина и а-кетоглутарата.33

1.2.4. Вклад GlnK и AmtB в регуляцию Ntr-ответа.35

1.2.5. Особенности а54 - зависимой транскрипции.36

1.2.6. Последовательности ст54-зависимых промоторов и сайтов связывания NRI39

1.3. PLP-зависимые аминотрансф еразы.41

1.3.1. Группы PLP-зависимых аминотрансфераз.42

1.3.2. Инвариантные аминокислотные остатки аминотрансфераз.44

1.3.3. Эволюционные взаимосвязи между PLP - зависимыми ферментами.45

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.48

2.1 Бактериальные штаммы.48

2.1.1 Получение штамма MG1655 ptr+.48

2.1.2 Получение штаммов MG1655 ygjG и MG1655 ptr+ ygjG.48

2.2 Среды, условия культивирования штаммов и приготовление лизатов клеток.49

2.3 Эксперименты с рекомбинантной ДНК.50

2.3.1 Генно-инженерные мето дики.50

•

2.3.2 Конструирование рекомбинантных плазмид.51

2.4 Определение старта транскрипции мРНК гена ygjG.54

2.5 Выделение и очистка белков.55

2.5.1 Основные методики оценки препаратов белков.55

2.5.2 Выделение препаратов Ht-ORF 1 и Ht-ORF2.55

2.5.3 Выделение нативного препарата YgjG.56

2.5.4 Определение олигомерной структуры нативного YgjG.57

2.6 Измерение энзиматических активностей.57

2.6.1 Методы измерения энзиматических активностей.57

2.6.2 Определение основных физических и кинетических параметров препаратов ПАТаз .58

2.7 Программы, использованные для компьютерного анализа.59

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.61

3.1 Идентификация и клонирование гена pat Escherichia coli К12, кодирующего путресцин:а-кетоглутарат аминотрансферазу.61

3.1.1 Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме Е. coli К12.61

3.1.2 Амплификация 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего структурную последовательность гена ygjG, в составе мультикопийной плазмиды.63

3.2 Изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и кодирующую последовательность гена ПАТазы.65

3.2.1 Анализ нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygjG межцистронного района .65

3.2.2 Изучение регуляции экспрессии гена ПАТазы.68

3.2.3 Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы.71

3.2.4 Анализ продуктов трансляции orfl и orf2.74

3.3 Характеристика каталитической активности YgjG (ПАТазы) E.coli.77

3.3.1 Экспрессия и разработка метода выделения белка YgjG.78

3.3.2 Определение олигомерной структуры ПАТазы Е. coli.80

3.3.3 Характеристика субстратной специфичности и основных физических и кинетических параметров препаратов Ht-YgjG и YgjG.81

3.4 Влияние аллельного состояния гена ygjG на утилизацию путресцина.88

3.5 Поиск гомологов белка YgjG.90

ВЫВОДЫ.95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.96

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ptr - путресцин п.н. - пара нуклеохидов а.к.о. - аминокислотный остаток

RNAP - РНК-полимераза

RBS - участок связывания рибосом

SD последовательность Shine-Dalgarno

ORF - открытая рамка считывания а-КГ - а-кетоглуторат

GABA - у-аминобутират

ABAD - аминобутиральдегид

PLP - пиридоксальфосфат

АТаза - аминотрансфераза

ПАТаза - путресцин аминотрансфераза

ABADDHa3a - аминобутиральдегид дегидрогеназа

GABAATa3a - у-аминобутират трансаминаза

SDHa3a - сукцинат дегидрогеназа

IPTG - изопропил - p-D-тиогалактопиранозид

Мг-молекулярная масса

SDS - додедилсульфат натрия

АТР - аденозин 5'- трифосфат

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

DTT - дитиотреитол (трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан) dNTP - дизоксинуклеотид сАМР - циклоаденозинмонофосфат

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Полиамины присутствуют практически во всех видах биологических организмов, от бактерий и вирусов до человека, и участвуют в огромном количестве разнообразных биологических и биохимических реакций, включая синтез ДНК, РНК и белков [1-3]. Исследование клеток прокариот и эукариот показало, что в различных организмах функционируют не только одинаковые соединения полиаминов (чаще всего это путресцин, спермидин, спермин и, существенно реже, кадаверин), но также универсальны и многие этапы биосинтеза этих поликатионов [4,5]. Хотя не вызывает сомнений тот факт, что полиамины выполняют важные физиологические функции и совершенно необходимы для обеспечения нормального клеточного роста, показано, что избыточное накопление полиаминов в клетке ингибирует синтез белков, вызывает замедление роста, а в некоторых случаях приводит к гибели организма [6]. Ацетилирование полиаминов по так называемому ацетилазному пути деградации, помогает предотвратить эффект токсичности полиаминов как в про-, так и в эукариотах [4,7]. Образующиеся при этом ацетилпроизводные полиаминов далее окисляются полиаминоксидазами, деацетилируются, либо экскретируются из клетки [4,8]. У некоторых микроорганизмов охарактеризован также альтернативный аминотрансферазный путь деградации полиаминов.

Наиболее подробно изучен аминотрансферазный путь деградации путресцина в клетках Escherichia coli. Показано, что трансаминирование путресцина, катализируемое путресцин аминотрансферазой (КФ 2.6.1.29), и последующее декарбоксилирование образующегося аминобутиральдегида приводят к образованию у-аминобутирата (GABA), который в дальнейшем преобразуется в сукцинат, включаясь в цикл Кребса [9]. Совокупность реакций биосинтеза путресцина из аргинина и его деградации до сукцината образуют так называемый аргинин декарбоксилазный путь деградации аргинина (ADC) E.coli. Было показано, что все ферменты ADC пути, за исключением аргинин декарбоксилазы, индуцируются в условиях азотного голодания. Однако, несмотря на то, что ADC путь деградации E.coli достаточно хорошо охарактеризован как биохимически, так и генетически, еще не все гены этого пути картированы. Так до сих пор не были локализованы гены, кодирующие ключевые ферменты деградации путресцина -пиридоксальфосфат (PLP) - зависимую путресцин:а-кетоглутарат (а-КГ) аминотрансферазу (ПАТазу) и аминобутиральдегид дегидрогеназу (ABADDHa3y). Вследствие того, что уровень активности ПАТазы даже в индуцирующих условиях азотного голодания чрезвычайно низкий, изучение этого фермента до сих пор проводилось только в мутантных по утилизации полиаминов и GABA штаммах E.coli. Возможно, по этой причине в независимо выполненных работах Kim [10] и Prieto-Santos [11] приведены противоречивые биохимические характеристики частично очищенных препаратов ПАТаз.

В этой связи актуальной является задача идентификации гена E.coli, кодирующего ПАТазу, с использованием методов биоинформатики и генетической инженерии, выделение нативного фермента и изучение его свойств современными методами молекулярной биологии

ЦЕЛЬ И ЗАДА ЧИ РАБОТЫ

Целью представленной работы являлась идентификация гена E.coli, кодирующего ПАТазу, а также конструирование плазмид, обеспечивающих достаточно высокий уровень продукции этого фермента и определение основных физических и кинетических параметров очищенного препарата ПАТазы. В процессе работы были решены следующие задачи:

Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма E.coli К12 (ген ygjG)-,

Изучение Ntr-зависимой регуляции экспрессии генаygjG;

Конструирование экспрессионных плазмид, обеспечивающих эффективную продукцию ПАТазы как в виде слитого белка с his6-tag лидерным пептидом (Ht-YgjG), так и нативного белка (YgjG);

Разработка лабораторного метода выделение белка YgjG из растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантного штамма E.coli;

Исследование и сравнительная характеристика каталитических активностей и некоторых основных физических и кинетических параметров очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Впервые идентифицирован и клонирован ген (ygjG), кодирующий путресцин аминотрансферазу в клетках Escherichia coli К12. Изучена его структурная организация и выявлены регуляторные последовательности, обеспечивающие о54 -зависимую индукцию экспрессии ygjG в условиях азотного голодания.

Разработана методика получения высокоочшценного препарата каталитически активного белка YgjG из биомассы рекомбинантного штамма E.coli.

Показано, что фермент эффективно катализирует путресцин :а-КГ аминотрансферазную реакцию, а также может использовать кадаверин и, с меньшей эффективностью, спермидин в качестве доноров аминогрупп. Фермент термостабилен, активен в щелочном диапазоне значений рН и проявляет максимум активности при рН 9.0 и температуре 70 °С. Интересной особенностью фермента является его способность катализировать глутамат:пируват (GPT, КФ 2.6.1.2) аминотрансферазную реакцию. Ни одна из известных к настоящему времени полиамин аминотрансфераз не проявляет GPT активности. Субстратная специфичность и рН зависимость активности YgjG совпадают с параметрами ПАТ азы, выделенной Kim [10] из мутантного по утилизации путресцина штамма E.coli В6.

Сравнение свойств очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG, несущего дополнительную his6-tag лидерную последовательность на N-конце белка, показало, что данная модификация N-концевой последовательности влияет на субстратную специфичность и ферментативную активность препарата. Также, элиминация первых 30 аминокислот YgjG приводит к практически полной потере активности фермента.

Полученные в работе данные могут быть использованы для исследования полиамин аминотрансфераз других микроорганизмов и для дальнейшего изучения путей метаболизма полиаминов в E.coli.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Самсонова, Наталья Николаевна

выводы

1. Клонирован ген ygjG E.coli К12 MG1655 и показано, что аннотированная как орнитин аминотранефераза ORF ygjG кодирует ПАТазу - белок, обладающий путресцин:а-кетоглутарат аминотрансферазной активностью и эффективно катализирующий реакцию переаминирования кадаверина.

2. Показано, что а54 -зависимая экспрессия ygjG индуцируется в условиях азотного голодания. Определен старт транскрипции мРНК ygjG и стартовый кодон (UUG) трансляции YgjG.

3. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие эффективную продукцию YgjG как в виде слитого с his6-tag лидером полипептида (Ht-YgjG) так и в виде нативного белка. Разработан метод выделения и очистки нативного белка и получены высокоочищенные препараты YgjG и Ht-YgjG.

4. Исследованы субстратная специфичность обоих белков и их основные кинетические параметры в реакциях трансаминирования с использованием путресцина, кадаверина и спермидина в качестве доноров и а-кетоглутарата в качестве акцептора аминогрупп. Определены рН и температурная зависимости ферментативной активности ПАТазы YgjG.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самсонова, Наталья Николаевна, Москва

1. Abraham КА: Studies on DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli. 1. The mechanism of polyamine induced stimulation of enzyme activity.

2. Eur JBiochem 1968, 5: 143-146.

3. Frydman L, Rossomando PC, Frydman V, Fernandez CO, Frydman B, Samejima K; Interactions between natural polyamines and tRNA: an 15N NMR analysis. Proc Natl Acad Sci USA 1992,1: 9186-9190.

4. Igarashi K, Kashiwagi K: Polyamines: mysterious modulators of cellularfunctions. Biochem Biophys Res Commun 2000, 271: 559-564.

5. Pegg AE: Recent advances in the biochemistry of polyamines in eukaryotes.

6. Biochem J1986,234: 249-262.

7. Tabor CW, Tabor H: Polyamines in microorganisms. Microbiol Rev 1985, 49: 81-99.

8. He Y, Kashiwagi K, Fnkuchi J, Terao K, Shirahata A, Igarashi K: Correlation between the inhibition of cell growth by accumulated polyamines and the decrease of magnesium and ATP. Eur J Biochem 1993, 217: 89-96.

9. Matsui I, Kamei M, Otani S, Morisawa S, Pegg AE: Occurence and induction of spermidine iVl-acetyltransferase in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 1982, 106: 1155-1160.

10. Ignatenko NA, Fish JL, Shassetz DP, Woolridge DP, Gerner EW: Expression of the human spermidine/spermine iVl-acetyltransferase in spermidine acetylation-deficient Escherichia coli. Biochem J1996, 319: 435-440.

11. Snaibe E, Metzer E, Halpern YS: Metabolic pathway for the utilization of L-arginine, L-ornithine, agmathine, and putrescine as nitrogen sourses in

12. Escherichia coliK-12. JBacteriol 1985,163: 933-937.

13. Kim KH: Purification and properties of a diamine a-ketoglutarate transaminase from Escherichia coli. J Biol Chem 1964, 239: 783-786.

14. Prieto-Santos MI, Martin-Checa J, Balana-Force R, Garrido-Pertierra A: A pathway for putrescine catabolism in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1986, 880: 242-244.

15. Tabor H, Tabor CW: Biosynthesis and metabolism of 1,4-diaminobutane, spermidine, spermine and related amines. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1972, 36: 203-268.

16. Капо K, Oka T: Polyamine transport and metabolism in mouse mammary gland. General properties and hormonal regulation. J Biol Chem 1976, 10: 2795-2800.

17. Kakinuma Y, Hoshino K, Igarashi K: Characterization of the inducible polyamine transporter in bovine lymphocytes. Eur JBiochem 1988,15: 409414.

18. Tabor H, Hafner EW, Tabor CW.: Construction of an Escherichia coli strain unable to synthesize putrescine, spermidine, or cadaverine: characterization of two genes controlling lysine decarboxylase. JBacteriol 1980,144: 952-956.

19. Tabor H, Hafner EW, Tabor CW: Mutants of Escherichia coli that do not contain 1,4-diaminobutane (putrescine) or spermidine. J Biol Chern 1979, 254: 12419-12426.

20. Algranati ID, Echandi G, Goldemberg SH, Cunningham-Rundles S, Maas WK: Ribosomal distribution in a polyamine auxotroph of Escherichia coli. J

21. Bacteriol 1975,124: 1122-1127.

22. Algranati ID, Goldemberg SH: Initiation, elongation and termination of polypeptide synthesis in cell-free systems from polyamine-deficient bacteria.

23. Biochem Biophys Res Commun 1981,103: 8-15.

24. Goldemberg SH, Fernandez-Velasсо JG, Algranati ID: Differential binding of streptomycin to ribosomes of polyamine-deficient bacteria grown in the absence and presence of putrescine. FEBSLet 1982,142: 275-279.

25. Goldemberg SH, Algranati ID: Polyamine requirement for streptomycin action on protein synthesis in bacteria. Eur J Biochem 1981,117: 251-255.

26. Mitsui K, Igarashi K, Kakegawa T, Hirose S: Preferential stimulation of the in vivo synthesis of a protein by polyamines in Escherichia coli'. purification and properties of the specific protein. Biochemistry 1984, 23: 2679-2683.

27. Mitsui K, Ohnishi R, Hirose S, Igarashi K: Necessity of polyamines for maximum in vivo synthesis of beta beta' subunits of RNA polymerase.

28. Biochem Biophys Res Commun 1984,123: 528-534.

29. Raina A, Janne J: Polyamines as cellular regulators. Med Biol 1981, 59: 461.

30. Sakai TT, Cohen SS: Effects of polyamines on the structure and reactivity of tRNA. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1976,17: 15-42.

31. Abraham AK: Effect of polyamines on the fidelity of macromolecular synthesis. Med Biol 1981, 59: 368-373.

32. Geiger LE, Morris DR: Stimulation of deoxyribonucleic acid replication fork movement by spermidine analogs in polyamine-deficient Escherichia coli. J

33. Bacteriol 1980,141: 1192-8-1198.

34. Jorstad CM, Harada JJ, Morris DR: Structural specificity of the spermidine requirement of an Escherichia coli auxotroph. J Вacteriol 1980,141: 456-463.

35. Gorini L: The contrasting role of strA and ram gene products in ribosomal functioning. Quant Biol. 101-109.

36. Schiller D, Kruse D, Kneifel H, Kramer R, Burkovski A.: Polyamine transport and role of potE in response to osmotic stress in Escherichia coli. JBacteriol 2000,182: 6247-6249.

37. Bachrach U, Persky S, Razin S: Metabolism of amines. Biochem J1960, 76: 306310.

38. Tabor H, Tabor CW: Formation of 1,4-diaminobutane and of spermidine by an ornithine auxotroph of Escherichia coli grown on limiting ornithine or arginine. J Biol Chem 1963, 244: 2286-2292.

39. Goldemberg SH: Lysine decarboxylase mutants of Escherichia coli: evidence for two enzyme forms. J Bacteriol 1980,141: 1428-1431.

40. Dover S, Halpern YS: Utilization of y-aminobutyric acid as the sole carbon and nitrogen source by Escherichia coli K-12 mutants. J Bacteriol 1972,109: 835-843.

41. Tkachenko AG, Salakhetdinova Ola, Pshenichnov MR: Role of putrescine and potassium transport in the adaptation of Escherichia coli to ammonium starvation. Mikrobiologiia 1996, 65: 740-744.

42. Balke VL, Gralla JD: Changes in the linking number of supercoiled DNA accompany growth transitions in Escherichia coli. J Bacteriol 1987,169: 44994506.

43. Tkachenko AG, Pshenichnov MR, Nesterova Liu: Putrescine as an oxidative stress protecting factor in Escherichia coli. Mikrobiologiia 2001, 70: 487-494.

44. Tkachenko AG, Nesterova Liu: The role of putrescine in of oxidative stress defense genes expression regulation in Escherichia coli. Mikrobiologiia 2001, 70: 168-173.

45. Ha HC, Yager JD, Woster PA, Casero RA Jr: Structural specificity of polyamines and polyamine analogues in the protection of DNA from strand breaks induced by reactive oxygen species. Biochem Biophys Res Commun 1998, 244: 298-303.

46. Lin J, Smith MP, Chapin КС, Baik HS, Bennett GN, Foster JW: Mechanisms of acid resistance in enterohemorrhagic Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 1996, 62: 3094-3100.

47. Blankenhorn D, Phillips J, Slonczewski JL: Acid- and base-induced proteins during aerobic and anaerobic growth of Escherichia coli revealed by two-dimensional gel electrophoresis. J Bacterial 1999,181: 2209-2216.

48. Stancik LM, Stancik DM, Schmidt B, Barnhart DM, Yoncheva YN, Slonczewski JL: pH-dependent expression of periplasmic proteins and amino acid catabolism in Escherichia coli. J Вacteriol 2002,184: 4246-4258.

49. Zilberstein D, Agmon V, Schuldiner S, Padan E: Escherichia coli intracellular pH, membrane potential, and cell growth. J В acteriol 1984,158: 246-252.

50. Booth IR: Regulation of cytoplasmic pH in bacteria. Microbiol Rev 1985, 49: 359-378.

51. Tkachenko AG, Chudinov AA, Nagorskikh TG: Role of the energy status and putrescine transport in the maintenance of the intracellular pH homeostasis in the course of alkaline and acidic shifts in Escherichia coli. Mikrobiologiia 1993, 62: 37-45.

52. Meng SY, Bennett GN: Regulation of the Escherichia coli cad operon: location of a site required for acid induction. J В acteriol 1992,174: 2670-2678.

53. Samartzidou H, Delcour AH.: Excretion of endogenous cadaverine leads to a decrease in porin-mediated outer membrane permeability. JBacteriol 1999, 181: 791-798.

54. Samartzidou H, Delcour AH: Distinct sensitivities of OmpF and PhoE porins to charged modulators. FEBS Lett 1999, 444: 65-70.

55. Glansdorff N: Biosynthesis of arginine and polyamines. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt FC, Curtiss R, Ingraham JL, Lin EC, Low KB, Magasanik В et al. Washington, DC: ASM Press; 1996.

56. Morris DR, Boeker EA: Biosynthetic and biodegradative ornithine and arginine decarboxylases from Escherichia coli. Methods Enzymol 1983, 94: 134.

57. Davis RH, Morris DR, Coffino P: Sequestered end products and enzyme regulation: the case of ornithine decarboxylase. Microbiol Rev 1992, 56: 280290.

58. Blethen SL, Boeker EA, Snell EE: Arginine decarboxylase from Escherichia coli. I. Purification and specificity for substrates and coenzyme. J Biol Chem 1968, 243: 1671-1677.

59. Nowak S, Boeker EA: The inducible arginine decarboxylase of Escherichia coli B: activity of the dimer and the decamer. Arch Biochem Biophys 2003, 207: 110-116.

60. Morris DR, Fillingame RH: Regulation of amino acid decarboxylation. Anna Rev Biochem 1974, 43: 303-325.

61. Boeker EA, Fischer EH, Snell EE: Arginine decarboxylase from Escherichia coli. 3. Subunit structure. J Biol Chem 1969, 244: 5239-5245.

62. Boyle SM, Markham GD, Hafner EW, Wright JM, Tabor H, Tabor CW: Expression of the cloned genes encoding the putrescine biosynthetic enzymes and methionine adenosyltransferase of Escherichia coli (speA, speB, speC and metK). Gene 1984, 30: 129-136.

63. Wu WH, Morris DR: Biosynthetic arginine decarboxylase from Escherichia coli. Purification and properties. J Biol Chem 2003, 248: 1687-1695.

64. Wu WH, Morris DR: Biosynthetic arginine decarboxylase from Escherichia coli. Subunit interactions and the role of magnesium ion. J Biol Chem 1973, 248: 1696-1699.

65. Morris DR, Jorstad CM: Growth and macromolecular composition of a mutant of Escherichia coli during polyamine limitation. JBacteriol 1973,113: 271277.

66. Satishchandran C, Boyle SM: Purification and properties of agmatine ureohydrolyase, a putrescine biosynthetic enzyme in Escherichia coli. J

67. Bacteriol 1986,165: 843-848.

68. Morris DR, Koffron KL: Urea production and putrescine biosynthesis by Escherichia coli. J Bacteriol 1967, 94: 1516-1519.

69. Tabor CW, Tabor H: Methionine adenosyltransferase (S-adenosylmethionine synthetase) and S-adenosylmethionine decarboxylase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1984, 56: 282.

70. Tabor CW, Tabor H: Putrescine aminopropyltransferase (Escherichia coli).

71. Methods Enzymol 1983, 94: 265-270.

72. Sabo DL, Boeker EA, Byers B, Waron H, Fischer EH: Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry 1974,13: 662-670.

73. Igarashi K, Kashiwagi K, Hamasaki H, Miura A, Kakegawa T, Hirose S et al.: Formation of a compensatory polyamine by Escherichia coli polyamine-requiring mutants during growth in the absence of polyamines. J Bacteriol 1986,166: 128-134.

74. Dubin DT, Rosenthal SM: 1960. The acetylation of polyamines in E.coli. J Biol Chem 1960, 235: 776-782.

75. Tabor CW, Dobbs LG: Metabolism of 1,4-diaminobutane and spermidine in Escherichia coli: the effects of low temperature during storage and harvesting of cultures. J Biol Chem 2003, 245: 2086-2091.

76. Kashiwagi K, Hosokawa N, Furuchi T, Kobayashi H, Sasakawa C, Yoshikawa M et ah: Isolation of polyamine transport-deficient mutants of Escherichia coli and cloning of the genes for polyamine transport proteins. J Biol Chem 1990, 165: 20893-20897.

77. Matsui I, Kamei M, Otani S, Morisawa S, Pegg AE; Occurrence and induction of spermidine-Nl-acetyltransferase in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 1982, 106: 1155-1160.

78. Fukuchi J, Kashiwagi K, Takio K, Igarashi K: Properties and structure of spermidine acetyltransferase in Escherichia coli. J Biol Chem 1994, 269: 22581-22585.

79. Kwon DS, Lin CH, Chen S, Coward JK, Walsh CT, Bollinger JM Jr: Dissection of glutathionylspermidine synthetase/amidase from Escherichia coli into autonomously folding and functional synthetase and amidase domains. J Biol Chem 1997, 272: 2429-2436.

80. Smith K, Borges A, Ariyanayagam MR, Fairlamb AH: Glutathionylspermidine metabolism in Escherichia coli. Biochem J1995, 312: 465-469.

81. Dover S, Halpern YS: Utilization of y-aminobutyric acid as the sole carbon and nitrogen source by Escherichia coli K-12 mutants. J Вacteriol 1972,109: 835-843.

82. Michaels R, Kim KH: Comparative studies of putrescine degradation by microorganisms. Biochim Biophys Acta 1966,115: 59-64.

83. Friedrich B, Magasanik B: Enzymes of agmatine degradation and the control of their synthesis in Klebsiella aerogenes. JBacteriol 1979,137: 1127-1133.

84. Yonaha K, Suzuki K, Minei H, Toyama S: Distribution of «-amino acid: pyruvate transaminase and aminobutyrate: a-ketoglutarate transaminase in microorganisms. Agric Biol Chem 1983, 47: 2257-2265.

85. Lu CD, Itoh Y, Nakada Y, Jiang Y: Functional analysis and regulation of the divergent spuABCDEFGH-spul operons for polyamine uptake and utilization in Pseudomonas aeruginosa PAOl. J В acteriol 2002,184: 3765-3773.

86. Yorifuji T, Kondo S, Shimizu E, Naka T, Ishihara T: Purification and characterization of polyamine aminotransferase of Arthrobacter sp. TMP-1. J

87. Biochem (Tokyo) 1997,122(3):537-43.

88. Prieto MI, Martin J, Balana-Fouce R., Garrido-Pertierra A.: Properties of y-aminobutyraldehyde dehydrogenase from Escherichia coli. Biochimie 1987, 69: 1161-1168.

89. Cooper RA, Skinner MA: Catabolism of 3- and 4-hydroxyphenylacetate by the 3,4-dihydroxyphenylacetate pathway in Escherichia coli. J В acteriol 1980, 143: 302-306.

90. Metzer E, Levitz R, Halpern YS: Isolation and properties of Escherichia coli К-12 mutants impaired in the utilization of gamma-aminobutyrate. JBacteriol 1979,137: 1111-1118.

91. Donnelly MI, Cooper RA: Succinic semialdehyde dehydrogenases of Escherichia coli'. their role in the degradation of hydroxyphenylacetate and gamma-aminobutyrate. Eur J В iochem 1981,113: 555-561.

92. Bacteriol 1990,172: 7035-7042.

93. Niegemann E, Scliulz A, Bartsch K: Molecular organization of the Escherichia coli gab cluster: nucleotide sequence of the structural genes gabD and gabP and expression of the GABA permease gene.Arch Microbiol 1993,160: 454460.

94. Schneider BL, Ruback S, Kiupakis AK, Kasbarian H, Pybus C, Reitzer L: The Escherichia coli gabDTPC operon: specific gamma-aminobutyrate catabolism and nonspecific induction. J Bacteriol 2002, 184: 6976-6986.

95. Snaibe E, Metzer E, Halpern YS: Control of utilization of L-arginine, L-ornithine, agmathine, and putrescine as nitrogen sources in Escherichia coli K-12. J Bacteriol 1985,163: 938-942.

96. Zimmer DP, Soupene E, Lee HL, Wendisch VF, Khodursky AB, Peter В J et al.: Nitrogen regulatory protein C-controlled genes of Escherichia coli: scavenging as a defense against nitrogen limitation. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97: 14674-14679.

97. Zaboura M, Halpern YS: Regulation of gamma-aminobutyric acid degradation in Escherichia coli by nitrogen metabolism enzymes. J Bacteriol 1978,133: 447-451.

98. Ullman A, Danchin A: Role of cyclic AMP in bacteria. Adv Cycl Nucl Rec 1983, 15: 1-53.

99. McFall E, Newman EB: Amino acids as carbon sources. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Edited by Lin EC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M et al. Washington, D. C.: ASM Press; 1996.

100. Large PJ: Enzymes and pathways of polyamine breakdown in microorganisms. FEMS Microbiol Rev 1992, 88: 249-262.

101. Kashiwagi K, Igarashi K: Adjustment of polyamine contents in Escherichia coli. J Bacteriol 1988,170: 3131-3135.

102. Kashiwagi K, Hosokawa N, Furuchi T, Kobayashi H, Sasakawa C, Yoshikawa M et al.: Isolation of polyamine transport-deficient mutants of Escherichia coli and cloning of the genes for polyamine transport proteins. J Biol Chem 1990, 265: 20893-20897.

103. Pistocchi R, Kashiwagi K, Miyamoto S, Nukui E, Sadakata Y, Kobayashi H et al.: Characteristics of the operon for a putrescine transport system that maps at 19 minutes on the Escherichia coli chromosome. J Biol Chem 1993, 268: 146152.

104. Furuchi T, Kashiwagi K, Kobayashi H, Igarashi K: Characteristics of the gene for a spermidine and putrescine transport system that maps at 15 min on the

105. Escherichia coli chromosome. J Biol Chem 1992, 266: 20928-20933.

106. Igarashi K, Kashiwagi K: Polyamine transport in bacteria and yeast. Biochem J 1999, 344: 633-642.

107. Kashiwagi K, Miyamoto S, Suzuki F, Kobayashi H, Igarashi K: Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by thepotE gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 4529-4533.

108. Kashiwagi K, Suzuki T, Suzuki F, Furuchi T, Kobayashi H, Igarashi K: Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem 2003, 266: 20922-20927.

109. Vassylyev DG, Tomitori H, Kashiwagi K, Morikawa K, Igarashi K: Crystal structure and mutational analysis of the Escherichia coli putrescine receptor. Structural basis for substrate specificity. J Biol Chem 1998, 273: 17604-17609.

110. Kashiwagi K, Kuraishi A, Tomitori H, Igarashi A, Nishimura K, Shirahata A et al.: Identification of the putrescine recognition site on polyamine transport protein PotE. J Biol Chem 2000,275: 36007-36012.

111. Meng SY, Bennett GN: Regulation of the Escherichia coli cad operon: location of a site required for acid induction. J Bacteriol 1992,174: 2670-2678.

112. Gong S, Richard H, Foster JW: YjdE (AdiC) is the arginine:agmatine antiporter essential for arginine-dependent acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol 2003,185: 4402-4409.

113. Iyer R, Williams C, Miller C: Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol 2003,185: 6556-6561.

114. Molenaar D, Bosscher JS, ten Brink B, Driessen AJ, Konings W: Generation of a proton motive force by histidine decarboxylation and electrogenic histidine/histamine antiport in Lactobacillus buchneri. J Bacteriol 1993,175: 2864-2870.

115. Meng SY, Bennett GN: Nucleotide sequence of the Escherichia coli cad operon: a system for neutralization of low extracellular pH. J Bacteriol 1992, 174: 2659-2669.

116. Takayama M, Ohyama T, Igarashi K, Kobayashi H: Escherichia coli cad operon functions as a supplier of carbon dioxide. Mol Microbiol 1994,11: 913-918.

117. Reitzer LJ: Sources of nitrogen and their utilization. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology . Edited by Lin EC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M et al. Washington, D.C.: ASM Press; 1996.

118. Magasanik В: Regulation of nitrogen utilization. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Edited by Lin EC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M et al. Washington, D.C.: ASM Press; 1996:1344-1356.

119. Reitzer L, Schneider BL: Metabolic context and possible phisiological thermesof c54-dependent genes in Escherichia coli. Microbiology and molecular biology reviews 2001, 65: 422-444.

120. Meers JL, Tempest DW, Brown CM: Glutamine(amide):2-oxogIutarate amino transferase oxido-reductase (NADP); an enzyme involved in the synthesis of glutamate by some bacteria. J Gen Microbiol 1970, 64: 187-194.

121. Jiang P, Peliska JA, Ninfa AJ: The regulation of Escherichia coli glutamine synthetase revisited: role of a-ketoglutarate in the regulation of glutamine synthetase adenylylation state. Biochemistry 1998, 37: 12802-12810.

122. Rustu S, Hirschman J, Burton D, Jelesko J, Meeks JC: Covalent modification of bacterial glutamine synthetase: physiological significance. Mol Gen Genet 1984, 197: 309-317.

123. Adler SP, Punch D, Stadtman ER: Cascade control of Escherichia coli glutamine synthetase. Properties of the PII regulatory protein and the uridylyltransferase-uridylyl-removing enzyme. J Biol Chem 1975, 250: 62646272.

124. Jiang P, Peliska JA, Ninfa AJ.: Reconstitution of the signal-transduction bicyclic cascade responsible for the regulation of Ntr gene transcription in

125. Escherichia coli. Biochemistry 1998, 37: 12795-12801.

126. Microbiol 1996, 21: 133-146.

127. Atkinson MR, Ninfa AJ: Characterization of the GlnK protein of Escherichia coli. Mol Microbiol 1999, 32: 301-313.

128. Atkinson MR, Blauwkamp ТА, Bondarenko V, Studitsky V, Ninfa AJ: Activation of the glnA, glnK, and nac promoters as Escherichia coli undergoes the transition from nitrogen excess growth to nitrogen starvation. J В acteriol 2002,184: 5358-5363.

129. Blauwkamp ТА, Ninfa AJ: Physiological role of the GlnK signal transduction protein of Escherichia coli: survival of nitrogen starvation. Mol Microbiol 2002, 46: 203-214.

130. Soupene E, Lee H, Kustu S: Ammonium/methylammonium transport (Amt) proteins facilitate diffusion of NH3 bidirectionally. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99: 3926-3931.

131. Blauwkamp ТА, Ninfa AJ: Antagonism of PII signalling by the AmtB protein of Escherichia coli. Mol Microbiol 2003, 48: 1017-1028.

132. Coutts G, Thomas G, Blakey D, Merrick M. Membrane sequestration of the signal transduction protein GlnK by the ammonium transporter AmtB.1. EMBO J 21, 536-545. 2002.

133. Buck M, Gallegos M-T, Studholme DJ, Guo Y, Gralla JD: The bacterial enhancer-dependent o54 (oN) transcription factor. JBacteriol 2000,182: 41294136.

134. Wang YP, Kolb A, Buck M, Wen J, O'Gara F, Buc H: CRP interacts with promoter-bound sigma54 RNA polymerase and blocks transcriptional activation of the dctA promoter. EMBOJ1998,17: 786-796.

135. Popham DL, Szeto D, Keener J, Kustu S: Function of a bacterial activator protein that binds to transcriptional enhancers. Science 1989, 243: 629-635.

136. Wang L, Gralla JD: Multiple in vivo roles for the -12-region elements of o54promoters. J Bacteriol 1998,180: 5626-5631.

137. Guo Y, Gralla JD: Promoter opening via a DNA fork junction binding activity.

138. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95: 11655-11660.

139. Barrios H, Valderrama B, Morett E: Compilation and analysis of sigma(54)-dependent promoter sequences. Nucleic Acids Res 1999, 27: 4305-4313.

140. John RA: Pyridoxal phosphate-dependent enzymes. Biochim Biophys Acta 1995,1248: 81-96.

141. Alexander FW, Sandmeier E, Mehta PK, Christen P: Evolutionary relationships among pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes. Regio-specific alpha, beta and gamma families. Eur J Biochem 1994, 219: 953-960.

142. Gribskov M, McLachlan AD, Eisenberg D: Profile analysis: detection of distantly related proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84: 4355-4358.

143. Mehta PK, Hale TI, Christen P: Aminotransferases: demonstration of homology and division into evolutionary subgroups. Eur J Biochem 1993, 214: 549-561.

144. Luthy R, Xenarios I, Bucher P: Improving the sensitivity of the sequence profile method. Protein Sci 1994, 3: 139-146.

145. Ovchinnikov YA, Egorov CA, Aldanova NA, Feigina MY, Lipkin VM, Abdulaev NG et al.: The complete amino acid sequence of cytoplasmic aspartate aminotransferase from pig heart. FEBS Lett 1973, 29: 31-34.

146. Kirsch JF, Eichele G, Ford GC, Vincent MG, Jansonius JN, Gehring H et al.: Mechanism of action of aspartate aminotransferase proposed on the basis of its spatial structure. JMolBiol 1984,174: 497-525.

147. McPhalen CA, Vincent MG, Picot D, Jansonius JN, Lesk AM, Chothia C: Domain closure in mitochondrial aspartate aminotransferase. J Mol Biol 1992, 227: 197-213.

148. Shen BW, Hennig M, Hohenester E, Jansonius JN, Schirmer T: Crystal structure of human recombinant ornithine aminotransferase. J Mol Biol 1998,227: 81102.

149. Gallagher T, Snell EE, Hackert ML: Pyruvoyl-dependent histidine decarboxylase. Active site structure and mechanistic analysis. J Biol Chem 1989, 264:12737-12743.

150. Ziak M, Jager J, Malashkevich VN, Gehring H, Jaussi R, Jansonius JN et al.: Mutant aspartate aminotransferase (K258H) without pyridoxal-5'-phosphate-binding lysine residue. Structural and catalytic properties. Eur J Biochem 1993, 211: 475-484.

151. Ziak M, Jaussi R, Gehring H, Christen P: Aspartate aminotransferase with the pyridoxal-5'-phosphate-binding lysine residue replaced by histidine retains partial catalytic competence. Eur J Biochem 1990,187: 329-333.

152. Jansonius JN, Eichele G, Ford GC, Kirsch JF, Picot D, Thaller С et al.: Crystallographic studies on the mechanism of action of mitochondrial aspartate aminotransferase. Prog Clin Biol Res 1984,144: 195-203.

153. Picot D, Sandmeier E, Thaller C, Vincent MG, Christen P, Jansonius JN: The open/closed conformational equilibrium of aspartate aminotransferase. Studies in the crystalline state and with a fluorescent probe in solution. Eur J

154. Biochem 1991,196: 329-341.

155. Cronin CN, Kirsch JF: Role of arginine-292 in the substrate specificity of aspartate aminotransferase as examined by site-directed mutagenesis.

156. Biochemistry 1988, 27: 4572-4579.

157. Inoue Y, Kuramitsu S, Inoue K, Kagamiyama H, Hiromi K, Tanase S et al.: Substitution of a lysine residue for arginine 386 of Escherichia coli aspartate aminotransferase. J Biol Chem 1989, 264: 9673-9681.

158. Danishefsky AT, Onnufer JJ, Petsko GA, Ringe D: Activity and structure of the active-site mutants R386Y and R386F of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochemistry 1991, 30: 1980-1985.

159. Hyde CC, Ahmed SA, Padlan EA, Miles EW, Davies DR: Three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 multienzyme complex from Salmonella typhimurium. J Biol Chem 1988, 263: 17857-17871.

160. Pan P, Jaussi R, Gehring H, Giannattasio S, Christen P: Shift in pH-rate profile and enhanced discrimination between dicarboxylic and aromatic substrates in mitochondrial aspartate aminotransferase Y70H. Biochemistry 1994, 33: 2757-2760.

161. Hayashi H, Kuramitsu S, Inoue Y, Morino Y, Kagamiyama H: Arg292—ValJ or [Arg292—Leu. mutation enhances the reactivity of Escherichia coli aspartate aminotransferase with aromatic amino acids. Biochem Biophys Res Commun 1989, 159: 337-342.

162. Pan P, Jakob CA, Sandmeier E, Christen P, Gehring H: Modulation of the activity of mitochondrial aspartate aminotransferase H352C by the redoxstate of the engineered interdomain disulfide bond. J Biol Chem 1994, 269: 25432-25436.

163. Guyer MS, Reed RR, Steitz JA, Low KB: Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1981, 45: 135-140.

164. Maniatis T, Fritsch E, Sambrook T: Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory; 1982.

165. Studier FM, Rosenberg AH, Dunn JJ, Dubendorff JM: Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned gene. Meth Enzymol 1990,185: 6089.

166. Datsenko KA, Wanner BL: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 2000,97: 6640-6645.

167. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Moleccular cloning: a laboratory manual., 2nd ed. edn. Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989.

168. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR: DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467.

169. Groisman EA, Casadaban MJ: Mini-mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing. J Bacteriol 1986, 168: 357-364.

170. Ptitsyn LR, Fatova MA, Stepanov Al: Expression of the bioluminescence system of Photobacterium leiognathi in E. coli. Mol Gen Mikrobiol Virusol Russian 1990,16: 26-29.

171. Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assemblay of the head of bacteriophage T4. Nature Landon 1970, 227: 680-685.

172. Bradford MM: A rapid and sensitive method of for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

173. Anal Biochem 1976, 72: 248-254.

174. Miller J: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor, N. Y: 1972.

175. Brenner M, Niederwieser A, Pataki G: Thin layer chromatography. Aminoacids and derivatives. In Laboratory handbook (E.StahlrEds.). New York: Springer-Verlag; 1969:730-786.

176. SamsonovaN.N., Smirnov S.V., Altman I.B., Ptitsyn L.R.: Molecular cloning and characterization of Escherichia coli K12 ygjG gene. BMC Microbiol 2003, 3:2.

177. Jakoby WB, Fredericks J: Pyrrolidine and putrescine metabolism: j-aminobutyraldehyde dehydrogenase. J Biol Chem 1959, 234: 2145-2150.

178. Madduri К, Stuttard С, Vining LC: Lysine catabolism in Streptomyces spp: is primarily through cadaverine: beta-lactam producers also make alpha-aminoadipate. J Bacteriol 1989,171: 302.

179. Cornish-Bowden A.: Principles of enzyme kinetics. In Lecturer in biochemistry, University of Birmingham. Edited by Phil D. Sydney-Willington-Durban-Toronto: Butterworths.; 1979.

180. Blattner F.R., Plunkett III G., Bloch C.A., Perna Т., Burland V., Riley M. et at.: The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 1997, 277: 1453-1474.

181. Marquardt DW. An algorithm for list squares estimation of parameters. J Soc Ind Appl Math 11, 431-441.1963.

182. Edwards JS, Pals son BO: The Escherichia coli MG1655 in silico metabolic genotype: its definition, characteristics, and capabilities. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97: 5528-5533.

183. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ: Basic local alignment search tool.JMolBiol 1990, 215: 403-410.

184. Riley M., Serres M.H. : Interim report on genomics of Escherichia coli. Annu Rev Microbiol 2000, 54: 341-411.

185. Parsons GD, Donly ВС, Mackie GA: Mutations in the leader sequence and initiation codon of the gene for ribosomal protein S20 (rpsT) affect both translational efficiency and autoregulation. J Bacteriol 1988,170: 2485-2492.

186. Makrides SC: Strategies for achievning high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev 1996, 60: 512-538.

187. Studier FW, Moffatt BA: Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes .JMolBiol 1986,189: 113-130.

188. Wang MD, Buckley L, Berg CM: Cloning of genes that suppress an Escherichia coli K-12 alanine auxotroph when present in multicopy plasmids.

189. J Bacteriol 1987,169: 5610-5614.